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1、·1250·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2007Sep;23(9):1250～3◇实验方法学◇二烯丙基二硫启动人白血病HL260细胞凋亡模型的建立易岚,曾希,苏琦,周建国,葛玲,解娜,黄炎,石莺(南华大学肿瘤研究所,湖南衡阳421001)中国图书分类号:R329124;R329125;R732351;R733170212;导胃癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤细胞的凋亡,其机制可能是R91614通过影响肿瘤细胞的生长周期、影响癌基因与抑癌基因的表[1～3]文献标识码:
2、A文章编号:1001-1978(2007)09-1250-04达,改变酶活性以及改变细胞内钙离子浓度等,但确切摘要:目的寻找二烯丙基二硫(diallyldisulfide,DADS)诱机制尚未清楚。本实验室先前研究也已经证实,DADS可通导人白血病HL260细胞凋亡的启动点,建立DADS启动HL2过抑制ERK通路和激活p38MAPK、JNK通路诱导人白血60细胞凋亡模型。方法实验设未处理组、处理组和撤药病HL260细胞凋亡,另外,DADS诱导人白血病HL260细胞[4]组,分别采用细胞计数、流式细胞术、D
3、NA凝胶电泳、Western凋亡与Bcl22表达减弱,Bax表达增强有关。本文旨在通[5]blot等方法,绘制生长曲线,检测凋亡率、活化的caspase23表过DADS处理及撤药实验,寻找DADS诱导人白血病细胞达率以及DNALadder、凋亡相关蛋白的检测。结果316mgHL260细胞凋亡的启动点,建立DADS启动人白血病细胞早·L-1DADS作用HL260细胞1d,与对照组相比,细胞数没期凋亡模型,为进一步了解启动凋亡阶段蛋白的改变打下基有明显变化,而作用2～6d,细胞数分别减少2411%、础。361
4、5%、4412%、52%、5316%。DADS作用1、2d,凋亡率分1材料与方法别为311%、413%,与未处理组(310%)差异无显著性,而作1.1药品及试剂DADS为Fluka公司产品。DADS与用3～5d的凋亡率分别达到815%,1512%,2714%,均高于Tween80以1∶2的比例充分溶解后,加入体积分数为未处理组(P<0105)。DADS作用2～5d撤药后再培养至0190%的生理盐水稀释100倍,震荡混匀,作为母液保存于d6,凋亡率分别为719%,1214%,1615%,1818%,高于未处
5、-20℃冰箱中,临用时将此母液稀释至所需浓度,凋亡细胞DNAladder检测试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有理组的313%(P<0105)。处理2～5d后,活化的caspase23限公司,异硫氰酸盐结合的单克隆活化的caspase23抗体凋的表达率分别为1010%、1014%、1419%、1713%,均高于未亡试剂盒购自BDPharMingen公司,Bcl22、caspase23等一抗处理组514%(P<0105)。处理组中DADS处理4d后DNA以及相应二抗、化学发光试剂盒为Santa公司产品。凝胶
6、电泳出现梯状条带,而DADS作用2～5d撤药后再培1.2细胞培养及分组人急性髓性白血病HL260细胞系,养至d6均出现明显梯状条带。Westernblot结果表明,从作从中南大学细胞中心引进。采用常规细胞培养,用含10%用2d起,caspase23表达开始上调,而Bcl22表达开始下调。-1小牛血清的RPMI1640培养基,在37℃,饱和湿度,5%CO2结论316mg·LDADS诱导人白血病HL260细胞凋亡的孵箱中培养,每3～4d换液传代。取对数生长期细胞用于启动点为处理2d。8-1实验,DADS处理时
7、,细胞数为2×10·L,DADS用培养基稀释到所需浓度。实验分3组:对照组,实验过程中未加入关键词:二烯丙基二硫;启动;HL260细胞;凋亡模型-1任何处理因素;处理组:316mg·LDADS作用HL260细胞-11、2、3、4、5d;撤药组:HL260细胞加入316mg·LDADS,分细胞凋亡是依赖于细胞内外大量刺激因素推动的过程,别于用药1、2、3、4、5d后,将细胞离心,PBS洗3次,换上不细胞凋亡的启动点犹如细胞周期中的“限制点”,决定细胞含DADS的新鲜培养基,继续培养至d6。不可逆走向凋亡的命
8、运,因此,凋亡启动点的研究已成为整1.3细胞计数取对数生长期细胞,接种于24孔平底培养个凋亡研究中的重点之一。大蒜的有效成分二烯丙基二硫板,加入处理因素,每24h取3复孔细胞计数,每孔计数4(diallyldisulfide,DADS)作为一种很有潜力的抗肿瘤药物已次,然后求出3孔细胞的均值及标准差,连续计数6d,绘制日益受到关注。国内外许多研究表明,DADS可在体内外诱细胞生长曲线。收稿日期:2007-03-13,修回日期:
