前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究-论文.pdf

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1、第34卷第1期内蒙古农业大学学报Vo1．34No．12013年1月JournalofInnerMongoliaAgriculturalUniversityJan．20l3前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究郭文秀，孙志，云华，陈宇飞(内蒙古国际旅行卫生保健中心，呼和浩特010020)摘要：纳豆激酶(nattokinase，简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶，该酶具有强烈溶栓活性。本研究从枯草芽胞杆菌中分离纯化得到基因组DNA作为模板，通过PCR扩增前纳豆激酶原基因，将其克隆到质粒pUC19中，构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌

2、DH5a，测序结果表明，所克隆片段全长1152bp，与GenBank中已报道序列同源性达100％。将目的基因片段与表达载体pBV220连接，构建重组表达质粒pBNK，转化大肠杆菌HB101。采用不同诱导时间、不同诱导温度(40℃、42~C和44~C)诱导表达，结果发现转化菌pBNK6一HB101在IJB培养基中经3O℃培养，42℃诱导表达7小时目的产物表达量达到最大，约占菌体总蛋白的25．35％，转化菌pBNK6一HB101在不同的培养基(LB和TB)中培养，无明显差异。关键词：前纳豆激酶原基因；枯草芽孢杆菌；克隆；表达中图分类号：Q785文献标识

3、码：A文章编号：1009—3575(2013)01—0066一O6CLONINGANDEXPRESSlONOFPRE—PRO—NATTOKINASEGENEGUOWen—xiu，SUNZhi，YUNHua，CHENYu—fei(InnerMongoliaInternationalHealthCareCenter，Huhhot010020，China)Abstract：Nattokinase．akindofsubtilisin，whichhasstrongfibrinolyticactivity，iSasefineprotease．Thepre—pr

4、o—nattokinasegeneWasamolifledbyPCRfromgenomicDNAofBacillussubtilisandclonedintovectorpUC19．Sequenceanalysisshowedthattheclonedgenewas1152bpandshared100％homologywiththereportedsequenceinGenBank．Theclonedgenewasconstructedintoex—pressionvectorpBV220．Therecombinantexpressionvecto

5、rspBNKwasthentransformedintoEscherichiacoliHB101．Theresultsshowedthattheexpressionamountreachedthebiggestlevelat42℃for7hbycomparisonofdifferentinducingtimeanddiferentindu—cingtemperature(40~C，42℃and44℃)indicatingpBNK6一HB101，expressionoftargetproteinreachedupto25．35％oftotalDrot

6、einwhilethetransformedbacteriaHB101．ThebiggestexpressionleveloftransformedbacteriainLBmediuminducedfor7hwassimilartothatinTBmediumculturedat30℃andinducedat42oC。Keywords：Nattokinasegene：Bacillussubtilis；clone；expression血栓病是严重危害人类健康的常见病、多发病。来源紧缺，价格昂贵，并发症多等缺陷，因此，寻找和目前临床上常用的一些预防和治

7、疗血栓的药物，如研制效果好、副作用小的溶栓治疗药物，对于更有效尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原激活剂(t—PA)地治疗严重危害人类健康的心脑血管疾病具有十分等由于存在有可能引起病人产生全身性内出血，重要的意义。}收稿日期：2012—09—12作喜者器简界介：赛郭萋文妻秀，女，硕耋士，高鑫级i工藿程师，从稳事茹微生物培22养；、检测、监测及分子生物学研究工作．·第1期郭文秀等：前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究67纳豆激酶(nattokinase简称NK)是在纳豆发酵1．2．1_1枯草芽孢杆菌基因组DNA提取将枯草过程中由枯草芽孢杆菌

8、(Bacillussubtilis)产生的一芽孢杆菌在斜面培养基中进行数次活化后接种人摇种单链多肽。1992年Nakamu