环境样品中微生物的纯种分离.pdf

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1、环环境境微微生生物物实实验验中国海洋大学环境科学与工程学院2008.05.011目录实验一培养基的制备及灭菌…………………………………2实验二环境样品中微生物的纯种分离、培养和接种技术…4实验三显微镜的操作和细菌的染色及其形态观察…………9实验四显微镜测微技术及微生物的直接计数实验五细菌生长曲线的测定实验六环境中细菌菌落总数的测定…………………………8实验七水体中大肠菌群的测定实验八微型浮游植物和浮游动物的培养和计数实验九活性污泥样品采集及生物活性的检测2实验一培养基的制备及灭菌一、实验目的1.明确培养基的配制原理，掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.掌握高压蒸气灭菌的基

2、本原理、基本方法和应用范围。二、基本原理(牛肉膏蛋白胨培养基)培养基制备：牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨培和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时融化，在40℃时凝固，通常不被微生物分解和利用。微生物的生长繁殖除需要一定的营养物质外，还需要适当的pH范围，不同微生

3、物对pH要求不同，霉菌和酵母菌培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌培养基的pH为中性或微碱性，所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到适当的范围，以利于微生物的生长和繁殖。此外，由于配制培养基的各成分和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必需立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而带来不利的影响。灭菌：消毒与灭菌两者的意义有所不同，消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。加热法又分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭

4、菌有火焰烧灼和热空气（常用烘箱）灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等，在热空气160-170℃下保温2小时进行灭菌。湿热灭菌有高压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒法。高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧的将锅内的冷空气从排气阀中驱进，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀伤力比干热大。原因有三：一是湿热中的细菌吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，

5、二是湿热得穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的能量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌的效力。3使用高压蒸气灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当灭菌锅内含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。一般培养基用0.1Mpa，121.5℃，15-30Min可达到彻底灭菌的目的。灭菌温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa，112.6℃灭菌15Min，但为了保证效果，可将其他成分

6、先行121.3℃，20Min灭菌，然后以无菌操作手续加灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa，121.5℃灭菌20Min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30Min。三、操作步骤牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂粉15-20g（不加琼脂粉为液体培养基），水1000ml，pH7.4-7.61.称量按培养基的配方比例依次准确称量牛肉膏、蛋白胨、Nacl溶于蒸馏水中。（*配制培养基时，不可用铜锅或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基，影响细菌生长。）2.调节pH用NaoH调节pH至7.4—7.6

7、。PH调节不应过头，以便影响培养基中各离子的浓度。配制低pH的琼脂培养基的时候，若预先调节好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固因此培养基成分应和琼脂成分分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH值。3.加热溶解将以上溶液加热，边搅拌边加入称量好的琼脂，继续加热溶化。在琼脂加热过程中应控制火力，以防培养基沸腾而溢出容器。同时应不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。4.分装（1）试管斜面培养基每组分装试管12支，分装试管以试管高度的1/3为宜。（若要分装液体培养基，分装高度以试管高度的1/4为宜。）(2)余培养基倒入葡萄