生物化学实验技术.ppt

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1、生物化学实验技术主要内容：技术理论10学时第一章生物化学样品制备技术第二章沉淀技术第三章膜分离技术第四章色谱技术第五章分光光度技术第六章离心技术第七章电泳技术第八章印迹技术实验50学时第一章生物化学样品制备技术第一章生物化学样品制备技术概念从生物材料中获得某一组分的方法称为生物化学制备技术。它是生化工程、生化制药及生化分析的基础。意义生物分子制备是研究生物分子特别是生物大分子的前提。第一节生物化学样品制备特点与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的

2、步骤繁多，流程长。⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。第一节生物化学样品制备特点(5)为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行。常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种分离方法，才能达到纯化目的。(6)生化分离方法的最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，其均一性的评定常常是有条件的或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对的“均一性”

3、结论。第二节生化分离制备实验设计生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备的生物大分子的目的和要求：是进行科研、开发还是要发现新的物质。②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。④生物材料的破碎和预处理。⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。⑦产物的浓缩，干燥和保存。分析方法分析测定方法有两类：生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的

4、各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。掌握生物分子的物理、化学性质要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定

5、性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力。利用性质差异设计纯化方法制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。第三节生物大分子的提取一、选

6、择材料及预处理二、细胞的破碎三、抽提一、选择材料及预处理材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。1.动物组织：选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品得率。常用的脱脂方法有：人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热（50

7、℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。1.动物组织：保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：-10℃的冰箱内；长期保存：-70℃低温冰箱内。b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后长期保存。冰箱的除霜循环，可能对細胞造成伤害，要特別小心。解冻時要越快越