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1、肺动脉平滑肌细胞原代培养原代培养肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程一、实验准备1、健康雄性SD人鼠一只，4周人，重约200go2、75%消毒用酒精2瓶,5%碘酒1瓶,无菌0.01MPBS溶液500ml,M199培养基100ml（含4mmol/L的谷氨酰胺、15%胎牛血清、20JjIU/L青霉索、20JjIU/L链霉素）。3、生物安全柜2个，解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿5个，培养瓶5个，lml吸管20根，弯头吹打管10根，眼科剪3把，眼科银3把,解剖蹑3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。二、操作步骤1、洗
2、手,戴口罩帽子及手套。2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1,放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）o3、处死人鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯'
3、«3rnin，碘酒酒精消毒解剖板（包括绳子），换手套，取出人鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1,打开紫灯消毒30min。4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2,于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科铁3把，屮间放培养皿4个（打开，共8个，其屮5个倒入PBS）,以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养1U1外均应装入消毒饭盒内防止污染。左侧放解剖钮1把（泡入酒精屮，取吸管
4、时用）。打开紫灯消毒30mina5、打开生物安全柜1,开吹风机lOmin,再一次消毒老鼠。6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖铁、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。7、打开生物安全柜2,开吹风机lOmin,放入装有心肺培养皿。8、换手套，川眼科剪眼科毁仔细分离岀肺动脉。9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基屮，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。10、在无PBS的培养皿中将肺动脉剪成lnim3人小的组织块（剪碎的
5、组织块常粘在一起，故应用十分锋利的眼科剪才好操作）。11、用弯头吹打管将剪好的组织块放入培养瓶的底部，分散成lcm2/块（注意培养瓶应干燥，事先不加入PBS或培养液）。12、旋紧瓶盖,放入37度的孵箱中1.5到2小时。13、取出培养瓶，翻转，使贴有组织的底血朝上，背血向下。于背血注入M199培养液5-7ml,再缓慢翻转培养瓶，使组织块浸入培养液屮（此时会有一些组织块漂起來，故动作应十分轻柔，只要有一块组织贴壁，就有成功的希望）o高糖DMEM+10%新生牛血清（华两哈里）；14、将培养瓶放入37度、5%CO2的孵箱中培养,3-5天换液一次。15、-般7天左右可观察到细胞从组织块
6、周围长出，如超过10天未见细胞生长则试验失败。三、注意事项1、应树立外科无菌术的观点，严格无菌操作，勤换手套，否则试验不易成功。2、生物安全柜内严禁使用酒精灯，因其会干扰正常气流，反而不利于无菌操作，并有引发火灾的危险。3、一•只老鼠可作2-4个培养瓶。建议1天只做1只老鼠，连做3-4天，木人也是到了第3、4只老鼠才成功。4、培养液应当选择比较好的。我用的是：M199培养基（美国Hyclone公司、液体、500ml/瓶），胎牛血清含量应为15%（Hyclone公司、原装进口、500ml/瓶，1680元,自己分装），青霉素、链霉索均为20JjIU/Lo5、分离肺动脉和将组织贴雖
7、于培养瓶这两部是决定成败的关键，应仔细、耐心。6、此操作可一人单独完成，但初次操作可请一名助手协助。肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程一、实验准备1、健康雄性SD人鼠一只，4周人，重约200go2、75%消毒用酒精2瓶,5%碘酒1瓶,无菌0.01MPBS溶液500ml,M199培养基100ml（含4mmol/L的谷氨酰胺、15%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。3、生物安全柜2个，解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿5个，培养瓶5个，lml吸管20根，弯头吹打管10根，眼科剪3把，眼科辍3把，解剖银3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸
8、头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。二、操作步骤1、洗手,戴口罩帽子及手套。2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1,放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3mim碘酒酒精消毒解剖板（包括绳子），换手套，取岀人鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1,打开紫灯消毒30mino4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2,于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科铁3把，屮间放培养皿4个（打开，共8
