[精品]人瘢痕角质形成细胞原代培养中胰酶配方及浓度的探讨.doc

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1、人瘢痕角质形成细胞原代培养中胰酶配方及浓度的探讨人瘢痕角质形成细胞原代培养中胰酶配方及浓度的探讨［摘要］目的：研究不同配方及浓度的胰蛋白酶对人瘢痕角质形成细胞(Keratinocyte,K)生物活性影响。探索一种史适于瘢痕角质形成细胞原代培养消化的方法。方法:温消化法分离瘢痕组织表皮、真皮后，分别采用0.1%胰蛋白酶和0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA对表皮片进行消化，培养角质形成细胞，用台盼蓝染色法和24h细胞贴壁率观察K存活率及细胞活性。结果：两种配方胰酶消化K,细胞存活率均达80%以上，结

2、果无统计学差异(P>0.05)o与单独使用胰蛋白酶相比，经胰蛋白酶-EDTA组消化后的细胞贴壁率增加，结果有统计学差异(P<0.05)o结论：胰蛋白酶-EDTA能较温和地消化角质形成细胞，较大程度地保留细胞活性，与胰蛋白酶消化法相比，此方法更适合K的消化及培养。［关键词］角质形成细胞；胰蛋白酶；乙二胺四乙酸［中图分类号JQ813.1［文献标识码］A［文章编号］1008-6455(2012)05-0762-02Effectofdifferentdigestionmethodsonthehypertrop

3、hicscarderivedkeratinocytescultureJTANGCai-li,N0NGXiao-1in(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,CollegeofStomatology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,Guangxi,China)Abstract:ObjectiveToresearchtheeffectofdifferentdigestionmethodsactedonkeratinoc

4、ytesandobtainabetterone.MethodsCulturedkeratinocytesderivedfromhypertrophicscarusingdigestion0.1%trypaseand0・05%trypasewith0.025%ethlenediaminetetraceticacid(EDTA)・Cellvigorwasobservedwithteypanebluestainedandcalculatedtheadhereneeratein24hours・ResultsK

5、eratinocytesdigestedbydifferenttrypaseshowedover80%surviva.lrate.However,asignificantdiffereneewasfoundonadherenceratein24hours(P<0.05).ConelusionDigestionwith0.05%trypasemixed0.025%EDTAwasbetterforcultivationofkeratinocytecomparedwith0.l%trypaseusingal

6、one.Keywords:Keratinocyte；Trypase；EDTA在瘢痕研究中，笔者比较了两种不同的消化酶在培养原代瘢痕角质形成细胞吋的效果，报道如下。1材料和方法1.1材料与试剂：胰蛋白酶、DMEM、角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)、含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素双抗，购自Gibco公司。胎牛血清(FCS),购自Hyclone公司。乙二胺四乙酸(EDTA),购自Sigma公司。DispaseII,购自ROCHE公司。台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(购自BOSTER公司

7、)。1.2标本来源：均來自于广西医科大学整形外科行瘢痕整复术的患者，取材局部未使用瘢痕抑制药物，不伴有肿瘤或其他严重疾病。取材前经患者知情同意。1.3实验方法1.3.1瘢痕角质形成细胞的分离与培养：手术切除的瘢痕标本保存于含有500U/ml青霉素和500mg/ml链霉素的PBS中，4°C无菌条件下运送到超净工作台，取出标本，75%酒精浸泡30s,以含lOOU/ml青霉索和100mg/ml链霉索的PBS反复漂洗5次，剪弃皮下脂肪及结缔组织。将皮肤瘢痕修剪为3mmX20mm长条状，移入DispaseII(

8、2.4U/m1)中,37°C3ho从瘢痕组织中剥离表皮片,分别放入含0.1%胰蛋白酶的PBS消化液屮，37°C培养箱屮10min,轻柔吹打5min,和已预热至37°C含0.05%胰蛋口酶-0.025%EDTA的PBS消化液中,轻柔吹打5min。加入等体积含10%FCS的DMEM培养液中止消化，200目不锈钢筛网过滤，1OOOrpm离心lOmin,弃上清收集细胞,培养基洗脱两次，以K-SFM重悬沉淀成均匀细胞悬液。实验分为：0・1%胰蛋口酶消化组和0.05