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1、角质形成细胞原代培养的准备工作补充培养基的配制：（1）将0.5ml浓度为0.06M的CaCl2加入到500ml基础培养基中，则培养基中CaCb浓度为0.06mM；（2）将5mlHKGS（人的角质形成细胞生长添加剂）加入到基础培养基中。（3）向其中加入50ul双抗（100x）,使培养基中双抗比例为1%。胶原涂层培养瓶：（1）在超净台无菌操作下，向培养面积为25cm2的细胞培养瓶中先加入1.7m1稀释液，再向其中加入17ul胶原（培养面积为75cm2的培养瓶先加5ml稀释液，再加50ul胶原）；（2）来回剧烈摇晃使胶原蛋白均匀分布于培养瓶表面，拧紧瓶盖在室温下孵育30m
2、in；（3）从培养瓶中吸取出多余的胶原或稀释液；涂层后的培养瓶可立即使用，或者短时间内放置于2°C-8°C备用。消化液：0.025%胰酶+0.01%EDTA可用（0.25%月夷酶+0.1%EDTA）稀释十倍得到其中的百分比表示质量体积比，即0.25%胰酶表示0.25g胰酶溶于lOOmlPBS溶液；0.1%EDTA表示0.IgEDTA溶于lOOmlPBS溶液。终止消化液：含10%血清的DMEM或含10%血清的PBS溶液冻存比例：80%含细胞的培养基+10%血清+10%含DMSO的冻存液皮肤角质形成细胞的原代培养复苏（1）将装有皮肤角质形成细胞的冻存管从液氮中取出，迅速
3、置于37°C温水中来回摇动（将冻存管下半部分浸入温水中），使其在2min内完全融化。（2）用1ml移液枪将冻存管内已融化液体全部转移至15ml离心管中，再向冻存管中加入lml已配置好的补充培养基，用移液枪反复冲洗后也转移至离心管内。（3）进行1500r,5min离心;弃上清，加入补充培养基后，再次离心,反复两次；离心后可观察到离心管底部的细胞团。（4）向离心管中加入lml补充培养基，用移液枪反复吹打使细胞重悬，分散均匀；从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数器测定lml培养基中的活细胞数；用配置好的补充培养基稀释离心管中细胞数为1.25X10
4、4/ml,向培养面积为25cn?的已被胶原涂层细胞培养瓶里加入5ml细胞悬液。（5）轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2的细胞培养箱里培养，24h勿动，待细胞贴壁后可换液。换液刚复苏的细胞可在24h-36h后换液；随之在48h后换液；之后每隔…天换一次液，直至细胞覆盖培养瓶表面50%；—旦细胞覆盖培养瓶表面达到50%,则保持每天换液直至细胞覆盖培养瓶表面达到80%o传代(1)当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基。(2)向培养瓶中加入lml消化液(0.025%胰酶+0・01%EDTA),用1ml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再
5、向培养瓶中加入lml消化液(0.025%胰酶+0・01%EDTA),摇匀使培养瓶表面被覆盖。室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概4-5min,轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来。(3)向培养瓶中加入lml胰酶抑制剂(含10%血清的DMEM或PBS),然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中。(4)再向培养瓶中加lml胰酶抑制剂(含10%血清的DMEM或PBS),用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml离心管中。(5)进行1500r,5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清。(6)加入lml培养
6、基后重悬细胞，用lml的移液器反复吹打使细胞浓度均匀。(7)从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数仪测定1011培养基中的细胞数；计算好之后用补充培养基稀释细胞悬液，以细胞数为1.25X104/ml个进行传代。(8)轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2的细胞培养箱里进行培养。冻存（1）当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基。（2）向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0・01%EDTA）,用lml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA）,
7、摇匀使培养瓶表面被覆盖。室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概4-5min,轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来。（3）向培养瓶中加入lml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS）,然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中。（4）再向培养瓶中加lml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS）,用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml离心管中。（5）进行1500r,5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清。（6）加入lml培养基后重悬细胞，用lml的移液器反复吹打使细胞浓度均匀。（7）从离
