槟榔基因组DNA提取及ISSR反应体系的优化.pdf

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1、湖南农业科学，（）：遗传育种·生物技术摈榔基因组提取及反应体系的忧化，，任军方，唐龙祥（中国热带农业科学院椰子研究所，海甫文昌；海甫大学农学院，海甫倍州；海甫省热带棕桐植物研究重点实验室（筹），海甫文昌）摘要：以摈榔为试验材料，用改良的法提取基因组，井设置不同梯度分别对每个反应因子做了相应的试验。结果表明：改良的法提取的摈榔基因组纯度高、质量好；同时，建立了适合摈榔反应体系，即反应体积中，模板浓度为，浓度为，聚合酶，浓度为，9物为浓度为。关键词：摈榔；提取；；体系优化中图分类号：文献标识码：文章编号：（）摈榔（）为棕桐科（或等提出。该技术结合了

2、和的）摈榔属（）常绿乔木，原产地马来西优点，与以往的分子标记相比，9物的碱基数量多，亚，主要分布于亚洲与美洲的热带地区。我国9种退火温度高，可重复性好，非特异性扩增少，能够提栽培摈榔已有年以上的历史，主要种植在供更多的基因组信息。近年来已广泛应用于烟草、海南和台湾两省，另外在广东、广西、福建以及云南果梅、茄子、荔枝等植物的遗传多样性研究和亲部分地区也有少量栽培。种子含单宁和多种生物缘关系分析，用于芒果、中国桑树等植物的遗传图碱，是我国四大南药之一，有重要的医用价值；热带谱构建和基因定位，以及水稻、杏、杨梅等植物居民常以嫩果作嗜好品。的品种鉴定和分类。目前有关摈榔的

3、分子方面的研（）又称为究国外已有报道，但在国内还未见报道。笔者以摈，称为简单重复序列区间，是一种新型的分榔为研究材料，对，，9物的浓度，子标记，于年由加拿大蒙特利尔大学的聚合酶，模板的用量以及循环次数等因素的最佳反应条件进行了梯度的实验筛选，为进一步进行收槁日期：中国的摈榔种质资源鉴定，遗传多样性分析等的研基金项目：国家科技基础条件平台重点项目（）；究提供依据。公益性行业（农业）科研专项（）作者简介：任军方（），女，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向为种质资源学。通讯作者：唐龙祥材料湖南农业科学第期武验材料采自海南省保亭黎族苗族自治呈薄片透明

4、状加入溶解。县的摈榔种子培育的幼苗。基因组的捡测将用去离子水主要武剂提取缓冲液，稀释，在紫外分光光度计上读取和（间间，（的间。取，加间间，琉基乙醇，，裂解缓冲液于琼脂糖凝胶电泳，电压，电泳（间间，，，于紫外透射仪下检测降解情况。待用（间间，琉基乙样品根据所测浓度稀释至，轻轻弹匀，放醇，，（间置备用。间，（间间，无水乙醇，异丙反应初始务件及程序经过前期初步醇，三氯甲烷，异戊醇，酚氯仿等。试验，扩增所用的反应体系为，包括、、（包含间；引物为浓度为均购自上海申能；酶，基因组博彩生物科技有限公司，为宝，去离子水补足。试验采用单因子设计法，每生物（间公

5、司产品，荧光染料个因子设置了不同的浓度梯度，旨在确定该参数对由赛百盛公司生产。摈榔中的影响。反应体系为，其所用引物是加拿大哥伦比亚大学公司公中，模板设、、、、个梯度；布的第套引物序列，此次试验选用引物聚合酶设、、、共个梯度；引物设，序列为：’’，、、、、共个梯度；设由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。、、、、共个梯度；设方法、、、、共个处理。的提取棕桐科植物含有大量的多扩增程序参照等，具体为：预糖、纤维、单宁等物质，为了克服这些物质的干扰，变性；变性，引物在筛选后的最佳退采取改良的法提取摈榔的基因组。火温度退火，延伸，共个循方法：取摈榔嫩叶片在液氮中研磨至

6、粉，将冻环，循环结束后延伸。扩增在粉迅速转入离心管中，加入预热公司的仪上进行。的提取缓冲液，轻轻摇匀置于冰上，反应户抽的捡测产物的检，，离心，丢弃上清液，再次加入测：反应产物在含有染料的预热的提取缓冲液，摇匀，，琼脂糖凝胶电泳中分离，用（间，离心，丢弃上清液；加入约预热作为相对分子量标记，以电压电泳，在的裂解缓冲液，摇匀，水浴，每隔紫外凝胶成像系统（间下观察照相。摇一次；加等体积的氯仿：异戊醇（间抽取液摇匀至乳浊状，，，离心；将上清液转入新的离心管，加入体积提取结果与检测乙酸钠（间间和倍体积的冰冻异丙醇，缓经过改良的法提取的摈榔基因组慢摇匀至有絮状聚

7、合沉淀析出，静置；呈白色絮状，自然吹干后为白色透明薄片状，加入，离心，倒掉上部液体，用琉基乙醇和，可避免多糖、多酚等酒精洗次，自然风干后加入物质的扰乱，有效防止褐变。经过分光光度计检测溶解；加入的，的间，其的比间都在水浴，加等体积的氯仿：异戊醇（间抽提液抽之间，说明该法能较完全地去除蛋白质、酚类提一次，以，，离心，上清液转及多糖等杂质，对残留的氯仿、无机盐等也能去除入新的离心管，加入体积的乙酸干净。适合对摈榔基因组的提取。钠（间间和倍体积的冰冻无水乙醇，放用的琼脂糖胶检测提取的的质量置，以，，离心，倒掉表明：用改良的法提取的摈榔基因组上部液体，用酒精洗次

8、，自然风干