实验二溶血空斑meng

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1、实验二血清分离（眼球取血）脾细胞制备(吹气球法)溶血空斑试验血清分离眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-0.1mL。【操作方法】眼球采血将血液保存于1.5mlEp管中，4℃静置24H10000rpm/10min，收集血清；-20℃保存待抗体水平检测。同时采集正常小鼠血清作为对照。小鼠B细胞溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种

2、体外试验方法，经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。【试剂与器材】1.健康小鼠（约18～20克重）。2.绵羊红细胞悬液（2.5%）。3.指示细胞悬液：含10%绵羊红细胞悬液0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml，Hank′s液2.0ml。4.Hank′s液（pH7.2）。5.动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、中试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、6.盖玻片、双

3、面胶、微量进样器和离心机等。【操作方法】免疫动物取2.5%绵羊红细胞悬液2ml，无菌操作注射于小鼠腹腔内。（4天后追加一次免疫效果更佳）。见试验一，已做制备脾细胞悬液1.将免疫后7天的小鼠颈椎脱位处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；2.在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；3.在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5mlHanks液的培养皿中；4.左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用5ml的注射器抽取平皿内液体(4～５ml)缓缓注入脾脏内，

4、将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用少量Hank′s液冲洗脾脏及平皿内残留的细胞，移入试管内。离心1000转/分5～10分,弃上清，加5ml冷红细胞裂解液（NH4Cl3.735g/450ml双蒸水+Tris1.3g/50ml双蒸水pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每2分钟摇动1次，裂解10分。离心（1000转/分）5～10分。弃上清，用Hank′s液洗2次，离心（1000转/分）5～10分钟。弃上清。用Hanks悬浮细胞，调细胞浓度到2×l06/m1。6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸

5、取此悬液0.1ml放小试管中，再加0.9mlHank′s液，即为500倍稀释的脾细胞悬液。眼球取血→处死小鼠→取脾→用10ml洗液冲脾→离心2000r/min8min→弃上清，加裂解液2ml，混匀，2min后离心（转数、时间同上）→弃上清加洗液10ml，混匀，离心（同上）弃上清加4.9ml洗液混匀取0.1ml脾细胞悬液+0.9ml洗液（A液），混匀取0.1ml（A液）+0.1ml指示系统，混匀取50ul加入玻片小室（约用30ul）细胞计数板（Hemacytometer）血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成

6、两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。示意图细胞计数板的使用ABDC1mm1mm1ml=1cm3=1000mm3细胞数=A+B+C+D4104稀释倍数Concentration/ml=(DilutionFactor)(Coun

7、tin4squares/4)X104细胞数=A+B+C+D4104稀释倍数红细胞计数Concentration/ml=(DilutionFactor)(Countin5squaresX5)X104加样10ul细胞悬液玻片小室的制作取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm和一条10mm的双面胶，然后用小镊子取二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。细胞混悬液的配制及灌注1.取小试管一支，用1ml吸管取0.2ml指示细胞悬液；0.2ml500倍稀释的脾细胞悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。2.用100μl的微量进样器吸取被检细胞混

8、合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个小室。记录实际注入的悬液微升数