生化实验技术与方法

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1、糖的薄层层析实验原理薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。实验操作硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。1.2g硅胶H加4.0ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。2.板的处理：薄板的活化：105℃，0.5h

2、薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。3.点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10μl。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。4.展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。5.显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。20mm10mm30mm8mm苯丙氨酸解氨酶的提取纯化实验原理苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonialyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是

3、植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。仪器高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统试剂酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）固体硫酸铵0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/Lβ-巯基乙醇

4、）；DEAE纤维素52操作步骤酶液提取（1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。（2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。（3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样0.5ml。硫酸铵分级沉淀酶蛋白（1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L)（2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留

5、上清液于烧杯内。（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。（222g/L)（4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。（5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样0.5ml。透析脱盐酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样0.5ml。银杏叶2g+10ml酶提取液研磨4000rpm、30min取上清液加硫酸铵至饱和度38%9000rpm、15min取上清液加硫酸铵至饱和度75%9000rpm、15min取沉淀溶于2ml酶抽提液透析纯化离子交换层析-------DEAE

6、纤维素（1）称取DEAE纤维素52干粉1~1.5g，加20ml的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。（2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后，用2~3个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡该柱。（3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液2~3cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。（4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液）及B液（含1mol/L

7、NaCl的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱，按洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。苯丙氨酸解氨酶的活力测定PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。规定1h内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。

8、（单位：ml）试剂类型调零管（0号）待测管（1号）pH8.7的0.1mol/L硼酸缓冲液320.1mol/LL-苯丙氨酸溶液01样品（酶）溶液0.10.1将各管混匀，放入40℃恒温水浴保温1h（准确计时），到时各加0.2ml2mol/LHCl终止反应。紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml取试管8支，按下表加入各溶液：