小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备.pdf

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1、动物医学进展。201l，32(12)：67—69ProgressinVeterinaryMedicine小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备赵文婧，鲁承，杜秋明，高旭，高建伟，申峰勇，张颖，袁娜，房靖添(延边大学农学院动物医学系，吉林延吉133000)摘要：采用杂交瘤技术，用纯化的鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)VP3蛋白免疫Balb／c小鼠制备单克隆抗体(mAb)，经间接ELISA方法筛选和有限稀释法进行3次亚克隆后获得一株抗鹅细小病毒VP3蛋白杂交瘤细胞株(4E5)。经鉴定，该mAb为IgG1亚型，轻

2、链为K链。Westernblot试验结果表明，获得的4E5mAb可特异性地识别鹅细小病毒VP3蛋白。本试验成功制备了抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体，为研究鹅细小病毒病诊断方法奠定了基础。关键词：鹅细小病毒；单克隆抗体；VP3蛋白中图分类号：$852．659．2；S858．33文献标识码：A文章编号：1007-5038(2011)12—0067—03鹅细小病毒病俗称为小鹅瘟，是由鹅细小病毒剂、HAT培养基(hypoxantinaminopterinthymidin(Gooseparvovirus，GPV)引起的主要侵害413龄～m

3、edium)、HT培养基(hypoxantinthymidinmedi-2o日龄雏鹅和雏番鸭的一种烈性传染病。由于该urn)、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、单克隆抗病病程短，传播速度快，病死率高[1]，严重危害养鹅体亚类鉴定试剂盒为Sigma公司产品。业的发展。GPV结构多肽有3种，即VP1、VP2、1．2方法VP3L2]，分子质量分别为85、61、57．5ku，其中VP31．2．1抗原制备鹅细小病毒VP3基因原核表达为主要结构多肽r引。研究发现VP3基因是鹅细小蛋白经亲和层析法进行蛋白纯化。取含10mg的融病毒核衣壳的主要成

4、分，约占总蛋白含量的8O，合蛋白溶液加入1mL已平衡好的500g／L的谷胱具有较高的保守性，能够诱导机体产生中和抗体，是甘肽Sepharose4B溶液中，室温搅拌1h，500r／minGPV主要保护性抗原[4_。虽然GPV最早是由我离心5min，弃上清。用l0倍于Sepharose4B的国学者分离获得，但我国对GPV分子生物学方面的PBS洗涤，500r／min离心5min，弃上清，重复2次。研究却起步较晚[7]。本试验制备了抗GPVVP3单按照1；1的比例加入还原性谷胱甘肽洗脱液(50克隆抗体，为研究快速、简便、特异的鹅细小病毒病

5、mmol／LTris-HC1、10mmol／L还原性谷胱甘肽，诊断方法奠定基础pH8．O)，室温孵育10min，500r／min离心5min，1材料与方法吸取上清，重复2次。进行SDS-PAGE电泳检测蛋1．1材料白纯化情况。GPV标准株来自中国兽医药品监察所，GPV1．2．2动物免疫按1：1比例将抗原与弗氏完延边株、鹅副黏病毒(Gooseparamyxovirus，全佐剂乳化后，皮下多点注射6周龄～8周龄Balb／cGPMV)和鹅细小病毒VP3基因原核表达蛋白由延小鼠(0．2mL／只)进行初次免疫，分别在14d、21d边大学农学

6、院预防兽医实验室提供，鼠抗GPV阳性将抗原与弗氏不完全佐剂进行乳化，进行二免及三血清为延边大学农学院预防兽医实验室用标准株免免。在取小鼠脾脏细胞进行细胞融合的前3d尾静疫制备；Balb／c小鼠购自吉林大学实验动物中心；骨脉加强免疫(50g／只)。髓瘤细胞SP2／0为延边大学农学院预防兽医实验室1．2．3融合用骨髓瘤细胞的制备从液氮中取出保存；RPMI一1640培养液为Invirogen公司产品；聚冻存的骨髓瘤细胞进行复苏，加入5mL完全培养乙二醇(MW1450)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐液，置于37℃、体积分数为5CO。培养箱中

7、培养。收稿日期：2011—08—31基金项目：吉林省牧业管理局项目(200902)作者简介：赵文婧(1986一)，女，吉林通化人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究。*通讯作者赵文婧等：小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备69进行处理，防止细胞返祖，并加强了细胞对HAT的敏感性，利于融合。本试验在融合剂的选择上，选用了对细胞的毒性较小的PEG1450，这更利于细胞融合后的生长。通过ELISA法检测及有限稀释法多次亚克隆，便能得到我们所需要的能稳定分泌抗体的单克隆融合细胞。目前检测鹅细小病毒的方法有中和试验、免疫荧光试验、琼

8、脂扩散试验、酶联免疫吸附试验以及普通PCR等方法[1引，检测方法较繁琐，耗时长。快速的检测方法有待研制，如胶体金诊断试纸条，单克隆M．蛋自分子质量标准；1．阴性尿曩液l2．GPMV；3．GPV-VP3蛋抗体的制备为该检测方法研制奠定了基础。白；4．