抗鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其识别抗原表位的初步鉴定

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摘要摘要鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)属于细小病毒科(parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)，是鹅纲小病毒瘸(Gooseparvovirus)酶病原体。鹅细小病毒病又称小鹅瘟(GoslingplagueGP)，其主要侵害30日龄以内的各种雏鹅和雏番鸭，是一种急性、高度接触性、败血性传染病。该瘸具有传染性强、瘸死率高的特点，以目前仍是危害养鹅业发展的最主的要传染病之一。由予本病长期困扰着养鹅监，因此建立一种准确、简便的诊鞭方法懿对该瘸作出早期的诊断已成为迫切的需要。细小病毒具有基因组短小，衣壳结构简单的特点，所以它{|’】的无关抗原成分更易于筛除，并利于将其制造成亚单位疫苗和重组诊断抗原。鹅细小病毒VPI蛋白(GPuVPl)是鹅细小病毒的主要结构蛋白，它在病毒感染细胞的过程中起着重要的作用，通过单克隆抗体技术对GPV．VPl的抗原表位进行研究，不仅有助于了解其抗原结构与功麓的关系，琵显对该瘸的诊断以及设计安全有效的基因工程袭位疫苗等具有重要的意义。本研究首先构建了带有表达载体pET30a(+)的重组GPV-VPl，在大肠杆菌原核表达系统中避行了表达，裁用GPV感染鹅的盘清对表达产豹进行Westernblot分橱，证实表达的融合蛋囱具有较好的反应活性。然后以纯化后的GPV-VPl融合蛋白为免疫抗原，免疫BALB，c小鼠，并以其作为为筛选抗原，建悫检测抗GPV-VPl蛋白单克隆抗体的ELISA方法。按常规方法进行敲合，间接ELISA方法进行筛选，采焉有限稀释法，经过三次竞隆，最终共获得了5株针对VPl蛋白的杂交瘤细胞系(命名为3A8、3G4、481l、5G6、5C11)，平均染色体数为9l圭7对，分泌的单巍隆抗体亚型分别为19A、IgGl、IgG2b、IgGl、lgGl型，轻链均为1c链。用5株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别与纯化后的重组融合蛋白GPV-VPl进行Westernblot试验，在GPV-VPl蛋良处均出现明显的特异性条带，说明这5株单抗识别的抗原表位为线性抗原表位。为了进一步分析这5株单抗的抗原表位，用本实验室制备的GPV-VPl截短表达的19个重组鬣自，分舅|l进行Westemblot的鉴定，结栗显示有3株单抗麓够特异性识别VP(81．136)，1株单抗能够特异性识别VP(124．161)，另一株既能识别VP(81．136)又能识别VP(124。161)。利用覆盖VP(81．161)氮基酸序列进一步截短表达的重组蛋白对这5株肇抗再次进行鉴定，根据结果初步确定了5株单抗抗原表位的主要功能区域。本研究制备了针对GPV结构蛋白的单抗，并初步对其相应抗原表位区域进行了鉴定，对进一步了解GPV的分子抗原特性，建立基于抗原表位水平的特异性诊断方法以及设计新型的GPV亚单位疫苗等其有重要意义。关键词：鹅细小病毒；VPl蛋白；单克隆抗体；抗原表位 东北农业大学农学硕：仁学位论文ofthereactedproteinstodetectthesefiveMcAbs．ThenwedefinitedthemaindomainsoftheepitopesIthesefiveMcAbs．TheoverlappingregionVPI(81—161)werethendividedintofagments．OnthebasisdfttWesternblotresultswithmulticlonalantibodyserumoncewehaddone．couldalSOshowtheseantigcepitopeshadbetterdominantpositionwhenitWasinfectedbyGPV．ThisstudyhaspreparedMcABsagainstproteinGPV-1旧1，anddetectedtheepitopesofthem．Itcanhe：UStobettercomprehendthecharacteristicsofitsantigen，andhasasignificantmeaningfordiagnosingardesigningthesafeandeffectivegeneticengineeringepitidevaccineagainstGPVonthebasisofthemoleculevelofepitopes．Keywords：GPV；VPl；MAbs；epitopesCandidate：LiLiSpeciality：PreventiveVeterinaryMedicineSupervisor：Prof．WangJunwei 独创声，明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过豹研究成果，也不包含未获得——(洼L如遗赢墓丝益噩缱别童盟的：查拦互窒L或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一厩工作的厕志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：力气髟日期：渺耋年◆厂胪霉学位论文版权使用授权书本学缀论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。+本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：终也聊日期：凼舯年名月神E1日期：≯胡年名月如日 引言1引言鹅细小病毒感染(GooseParvovirusInfeotion)又称为小鹅瘟(Gooseplaque)、鹅肝炎(virushepatitisofgeese．virusenteritisofgoslings)、鹅传染性心肌炎和鹅腹水性肝肾炎，是由鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)己Jl起，主要侵害20日龄以内雏鹅和雏番鸭(Cairinamoschata)的一种急性、高度接触性、败血性传染病，传染性强且死亡率高。雏鹅以全身急性败血病变和渗出液或伪膜性肠炎、心肌炎为特征。目前，该病每年都有不同程度地流行，给养禽业造成巨大经济损失，而引起国内外学者的广泛重视。该病最早是1956年由我国学者方定一在扬州首次报道发现的，于1961年用鹅胚分离到该病毒，并将其所致疾病称为小鹅瘟。小鹅瘟的发现常被我国引以为兽医学界的巨大成就。自1965年以后许多国家也相继报道了类似小鹅瘟的疾病，如德国、荷兰、前苏联、匈牙利、意大利、英国、法国、以色列、南斯拉夫和越南等许多国家。1966年匈牙利的Derzsy用鹅胚也分离到该病毒，他是国外第一个用鹅胚分离该病毒的学者，但当时他却把该病误认为是流感。该病在一段时期内，被欧洲养殖鹅和番鸭的国家赋予多种病名。直至1971年Schettler确定这种病是由细小病毒引起的。1974年国际禽病学会(WPSA)将该病正式命名为Derzsy’S病。1978年WPA又建议把这种病称为鹅细小病毒感染。从20世纪60年代到90年代，我国江苏、广西、广东、浙江、山东、安徽、四川、内蒙古、河北，辽宁等省、市、自治区都相继报道过此病的流行，并由试验得出结论：我国的小鹅瘟是由同一种病毒所引起的，与新城疫病毒、鸭瘟病毒和雏鹅肝炎病毒无抗原关系。1989年，吴建明等通过人工感染试验，结合光镜和扫描电镜在观察各器官病变的基础上，着重研究感染鹅小肠的动态病理学变化，揭示了小鹅瘟的病理发生和发展规律。1990年，李茂祥等测定了扬州株SYG61的部分理化特性。后来的许多学者在病毒的核酸和蛋白质等方面，对病毒作了相关研究。目前，该病仍为养鹅业和集约化养殖番鸭的国家中最主要的传染病之一，能造成重大危害。野生禽类的迁徙已成为北欧一些国家(如英国)发生本病的隐患。1．1鹅细小病毒的生物学特性研究进展1．1．1病毒形态特征及理化特性鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)GPV最初依据其形态、生化及培养特性被划归为细小病毒科细小病毒属。然而，GPV在核酸水平上更接近腺相关病毒2型(AAV2)，因此，GPV最近已经被分类为细小病毒科(parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)。其病毒粒子外观呈球形或六角形，无囊膜，呈二十面体对称，病毒粒子直径为20—22nm，内含单链DNA，基因组长约5．2kb；在氯化艳、蔗糖和氯化钠溶液中的浮密度分别为1．31—1．359／mL、1．0810—1．179／mL和1．41．1．439／mL。GPV对外界因素具有抵抗力，据Schettle等人报道，病毒粒子能抵抗各种化学物质如氯仿、乙醚、脱氧胆酸钠盐、n-丁醇、0．5％酚、1：1000福尔马林等的处理，在pH3溶液中不被致弱，且对热较稳定。据方定一报道，我国GPV分离株以56℃ 东北农业大学农学硕士学位论文皇詈鼍嬲皇詈詈量皇攀皇!!!鼍嬲葛暑曼!皇蠛鲁量暑詈篁鼍皇!!!黧1111．．．．．IIIIIIIIIl加热3h，仍能使鹅胚死亡，不过死亡时间较不处理的延长120h。50℃下经3h，在37℃下缀7d，对感染滴度无影嘀。经上述处理的病毒接种鸡胚后，与未经处理的病毒没有差异。该瘸毒W在鹅及番鸭胚上或鹅及番鸭的成纤维细胞上增值。GPV与本属其它成员显著不同的特点是不能凝集哺乳动物和禽类的红细胞，但能凝集黄牛精子，并可用抗血清作凝集抑制实验。GPV只有一个纛清型，仅与MDPV有交叉反应性。在一些人的盘瀵中发现有GPV的抗体，可能与人的肝炎有。到目前为止，国内外所有GPV分离株在抗原性上基本相同或相近，与MDPV有共同的抗原成分，而与鸡和哺乳动物细小病毒无抗原相关性。{。1。2病毒培养特性GPV对体终缨胞培养物的专～性缀强，对GPV迸季亍初戗分离只能用鹅胚和鬻鹃胚，其它禽胚和细胞培养物均不能使病毒增殖。病毒初次分离时，将病料制成悬液接种于12．14日龄易感鹅胚绒尿腚或绒尿膜内，鹅胚在接种羼5-8灭发生半数死亡，在鹅胚中连续逶过千凡代后，对Jj丕胎致死时间可以稳定在3．5天，这种病毒对雏鹅的毒力明显减弱。GPV的增殖也需要细胞处于有丝分裂期，因此必须在细胞形成单层以前进行早期接毒。本病毒对钵外细胞培养物专一性强，只有鹅胚适应株可能会在鹅题组织培养缨胞内增殖，丽在鸡胚成纤维细胞、兔肾上皮细胞、兔睾丸细胞、小白鼠胚胎成纤维细胞、小白鼠肾上皮细脆、遣鼠胚胎缁胞及肾上皮细胞和睾丸细胞、猪肾上皮维胞及睾丸细德、PKl5细胞内均来见增殖。2005年MertynMalkinson和ErnestWinocour研究发现腺伴随病毒2型可以增强鹅胚内的GPV复篱JJ(MertynMalkinson，ErnestWinocour,2005)。这是有关缨小病毒科的人辅助细胞依赖性成员能够为自主性细小病毒在自然宿主内提供协助细胞活性的第一次报道。1．1．3基因组结构小鹅癍病毒是一种单链、线性DNA病毒。含有正链DNA的病毒粒子和含有负链DNA的病毒粒子数露基本相等。在病毒核酸提取过程中，正链DNA和负链DNA狠容易发生退火形成互补的双链DNA，大小约为5．0kb。提取纯化病毒DNA可以作为模板在体外自发引发形成大小也为5．0kb的双链DNA。正负链DNA分子均有末端回文缔构，这是单链DNA分子易发生遐火的原因。这于0H砸缨小瘸毒和B19细小病毒所阐述熬情况梗月。剡目前为止，在世界生物基因数据库注册的GPV全长或部分基因序列有20条，其中基因组全序列有两条，由匈牙剩的ZadoriZ分别在1995年释2003年注麓，全长尧5】06却，有4个基汲。箕中3个基因分别是结构蛋白(病毒衣壳蛋白)VPl，VP2和VP3的基因，另一个为非结构蛋白，即REP的基因。GPV的基因组有两个开放阅读框架LORF与RORF，2个ORF间隔18个bp，并盛位于月一个读鹚框中，分剩编弼菲结构蛋自NSI、NS2和编码结构强皂VPl、VP2、VP3。GPV整个编码基因相互重叠，非结构基因和结构基因均有各自独立的起始子区域。编码非结构蛋白茅瓣结构蛋白的mRNAs共同终止在Poly(A)处。NSl的起始密码子ATG位于537bp处，NS2的起始密码子ATG位于1065bp处，NSl和NS2核前酸长度分别为1872bp和1353bp；编码VPI、VP3的起始密码子ATG分别位于2439bp和3033bp处，编码VP2的起始密码子为2 不典型的ACG，位T2874bp处。编码3种结构蛋白的终止密码子位点相同，位T4635bp处。VPl、VP2、VP3核昔酸全长分别为21")9bp、1764bp和1605bp。VPl与VP3核苷酸非重叠序列共594bp。11F，——#——L—一￥￥5±065’■●■■●■■■■●■■■■■●■■■■●■●●■●●■■■●■■■■■■■■■■■■■■■■■■■rrep。。。。。。。’1。—●jv口2。。。。。’’。’——’’’。。一vDi‘。。。。。。。。。。。’1。。。’。。’’’一up3～p2atre01onTRT札5ignaITRTR5ignaI·一TATAEi⋯ILegendt—CDS⋯⋯-一一otherfeat⋯—1—5}q⋯州r自9⋯t!houn闰I．IGPV基㈧组模式剀Fig1-IGenomestuctureofGPV14GPV基因组的转录和调节通过TATA盘搜寻，GPV存在3个可能的启动子，分别是P9．P19．P4I。它们分别启动NSI，NS2，vPI的起始密码子。GPV的P4I启动子是个非北型的“T1ⅥAA”序列．它的位点与AAV2的P40位点娄同，认为是由功能性的启动子。另外，在GPV的2732bp处有一个TATA盒译元．它位TRORF的第个ATG的下游，是否为功能性的TATA盒尚不清楚(Zoltanetal，1995)。GPV的多聚A(polyA)信号位于右侧ITR前的4655bp处。在GPV基田组2207bp处有一个剪接供体位点(splicedonorsite)其位置与AAV2的剪接供体位点相类同(['remperetal，1988)。在GPV的2423bp和2455饰处有2个剪接受体位点(spliceaeeeptorsite)比较这2个剪接受体位点核苷酸序列，问接受体位点2比付点l更有意义。剪接受体位点2在体山的转录和翻译过程中，以与AAV2的司接受体位点相类似的作用方式发挥作埔(Tremperetal，1988)。mRNA的转录产物LⅡ能在剪接受体位点2被剪接为VP2刊VP3，其中VP3为GPV主要的收壳蛋白(Chodoshetal1986)。GPV基因组中DNA结合蛋白的相黄结构域在ITR中的频率最高，说明JTR在GPV基因组转录和复制调解中起重要的作j；目。对转录因子结合何点的研究表明，E盒和Y盒结构序列同时也是转录田子MLTF和ATF／CREB的识别结合位点序列．GPV利MDPV宿土细胞中的一些调控闪子能够识别这些调控学元。GPVNSI在分r量大小、氩基酸序列、功能结构域上均与AAV非结构蛋白Rep78非常相似。在这两条肤链的中心区内，两者氮基醴序列吲原胜J矗高，为67％．而且此区间内，含有4个高度保守且NTP相结台具自解旋酶活件的能点，氲基术F∞R氮基酸序列同源阽为37％，除古青自醅氢醴富集区形成的结构域Y内与病毒DNA兆价Ⅲ着揎基末端阮氦基酸同源性母低仪为22％，但在此k山过岫种m结构蛋白都有‘锌指结FnGPV，MDPV，AAV2，B19都自这阿砷锌}日结构，而’I'}llRatvlrus—like群细小抽奇(包括猪、火、猫、炕熊、人鼠、小鼠1 农j￡农监大学农学硕士学位论文都没有这耪结构域。‘'PLoop”ATP／GTP结构域在细小瘸毒和乳多孔病毒氨基酸多肽链上具有离度保守J陡。结构域(GPATTGKT)GPVMDPV和AAV2的Rep蛋白氨基酸上位置一致。MVM非结构蛋白共价结合复制型DNAS寒端位点在GPV，MDPV窬感染脊推动物的Rep蛋自孛嗣样存在。GPVNS蛋白磷酸化蛋臼，它具有同AAV2的Rep78相似的生物学特征：A．DNA高度亲和序列组成最小的DNA复制区；B。NTP棱缎合的DNA解旋活性；C．双链线性DNA复制特异起始区。．研究证明特异的38bpDNA序列是GPVDNA复制最小区。GPVNSI蛋白还参与GPVDNA复制、病毒基因的表达及对细臆的毒性作用，NS2酉麓与癍毒DNA翻蛋白有效合成及病毒的增值有关。{。{。5童Jtt,l,病毒核衣壳蛋白的结构特征1．1．5．1细小病毒核衣壳蛋白的一级结构特征每个病毒粒子都是成熟的细小瘸毒粒子一般都是由2《种具有共瑟竣基端眨缨小病毒结构蛋I兰t(Strucmralviralproteins，VPs)构成(HuefferK，ParrishCR，2003)，GPV基因组编码3种结构蛋白：VPl、VP2、VP3，它们有共同的羧基端，在病毒粒子中的比值约为1．17：8。VPl、VP2、VP3的襁对分子量分舅|j秀81。3kDa、67．0kDa、60．0kDa，分裂由732个、587个、534个氨基酸组成。GPVVPl多肽的氨基酸序列与MDPVVPl相比，同源性为87．7％，与AAV2相比嗣源性为70．2％a。AA：V2与MDPVVPl氨基酸同源性为70。3％。在GPVVP1多肽56位氨基陂有相对保守酶PGY，GPV和MDPV之间结构蛋白差异较非结构畿白大，虽最大差异集中于162．178位氨基酸之间，即VP2．VP3起始密码子之间的区域。Zadori等认为这可能是宿主免疫压力所造成的，他认为VP3含有主要熬抗原决定簇，是GPV主要靛保护性抗原蛋白，能够诱导机体产生中和抗体(ZadoriZeta1．，]995)。1。l。5．2细小病毒核衣壳蛋白白}j--级结构特征每个病毒粒子都是由60个细小病毒亚单位构成，每个亚单位的二级缩构都含有8个13链(B，c，D，E，F，G，H，I链)，这8个13链形成两个D片层BIDG层和CHEF层)和穿插在13片层中的几个环状结构及一些螺旋结构(TsaoJetal。，1991．)。两个13片层存在于病毒衣壳结构的内部，其氨基酸组成相对保守，而穿插在其中的环状结构在不同的细，j、病毒问不论在插入的位置、空间构象及氨基酸组成等方面都存在很大差异，使每种细小病毒都形成了各自独有的表瑟特征。这些结构蛋自遥单位在一些分子作翊力之下，吸收了外界的能量，先形成三聚体、五聚体和二聚体在逐渐形成完整的细小病毒粒子。1．1。5。3圣Jtt,l,病毒核衣壳蛋白的高级结构特征．X．ray晶体衍射和低温电子显微技术展现了许多细小病毒的衣壳结构(Tsaoeta1．，1991；Agbanjeeta1．，1993；1994；Lamaseta1．，1997；Simpsoneta1．，1998；2002；李莉等．，2002；Xieeta1．，2002；Waitersetal。，2004；程凌鹏等。，2004)，这些病毒粒子内部结构的排列方式都缀相4 引言似，但外表面却有许多不同之处，它们的病毒粒子都具有按5．3．2对称的二十面体结构，在三聚体顶部有一个突出的峰(spike)，主要由环=(100p3)和环I四(100p4)构成，五聚体轴处有一个中空的圆柱形结构，由五聚体的五个B折叠部分形成，二聚体与三聚体轴峰之间有低凹区(depression)，圆柱结构的凹处有峡谷区((canyon)环绕。五聚体轴处狭窄的中空圆柱形孔道可能有两个功能：在病毒装配时，它是单链DNA进入衣壳的通道；在细小病毒感染宿主细胞时，它可以使位于VPl氨基端的细小病毒磷脂酶基序(parvoviralphospholipaseA2，pvPLA2)从病毒内部穿出，当pvPLA2区从病毒内部出现在病毒衣壳外表面，感染宿主细胞所必需的PLA2活性才能显现出来。GPV也含有该保守的PLA2同源性序列，它可能在GPV感染宿主细胞时与其它细小病毒的pvPLA2一样发挥着重要的作用。细小病毒复杂的感染过程至今尚未完全清楚，但pvPLA2可能发挥着重要的作用，这个相对保守的pvPLA2区域已经在多数细小病毒被识别．GPV也具有相似的序列。PLA2的活性可能表现在病毒粒子核周聚集之后但先于基因的早期表达，其功能是推迟并减少基因的早期表达。在对细胞接种CPV之前，向细胞质注入针对VPl非重合区的抗体就可以避免CPV的感染，说明VPl非重合区在细胞质中就能被抗体所识别。在体外未经处理的病毒粒子不能显现PLA2活性，但在经加热和酸处理后，能促使CPV和PPV显现PLA2活性(Agbandjeela1．，1993；Lieta1．，2001；Zadorieta1．，2001；Dorschela1．，2002；Girodeta1．，2002；Vihinenela1．，2002；Suikkanenela1．，2003)。由于病毒在进行低温电子显微呈像时VP蛋白的氨基端常常会出现晶体结构混乱而无法分辨的现象，所以到目前为止所有细小病毒的VPl和VP2氨基端都未精确定位。有证据说明某些细小病毒衣壳蛋白的氨基端会沿五聚体轴孔处穿出。在成熟的MVM粒子中，五聚体孔内有额外的x．ray密度。对含有DNA的CPV粒子进行精确到2．9A的结构分析，支持了这种额外的密度是由约13％的VPs氨基端占居了五聚体孔道所造成的。在CPV、MVM、AAV2的空衣壳(不含病毒DNA)中，针对VPs氨基端的抗体无法与这些病毒粒子结合AAV2的VPs氨基端很可能位于空衣壳内侧的二聚体轴处。经胰酶处理含DNA的CPV和MVM病毒粒子，其VP2的氨基端就能够被抗体所识别。在体外通过加热和尿素处理，VPl的氨基端就能够外露(Agbanjeeta1．，1993；Cotmoreela1．，1999；Canaanela1．，2004)。Suikkanen的研究显示，在体内vPl非重叠区的外露可能发生在溶菌酶囊泡(Lysosomalvesicles)中，但他并未证明时的衣壳是否完整或是已经被溶解破坏。Kronenberg通过比较野生型的AAV2和缺失了VPl或VP2的重组AAV2的低温电子显微结构，发现AAV2VPI和VP2的氨基端是构成全病毒及空病毒粒子二聚体轴内侧球状结构的组成部分，经有限的加热处理后，全病毒的VPl可能也包括VP2的氨基端会从全病毒粒子内部暴露于衣壳表面，同时全病毒内表面的球状结构也随之消失，但在空病毒中并没有出现这种构象的变化。他还建立了VPl氨基端通过五聚体轴孔道的原子模型，并讨论了这种经五聚体孔道外化的限制性因素(Kronenbergeta1．，2005)。1．2GPV流行现状的特点在自然情况下，小鹅瘟能感染各品种的鹅群，也可以感染雏番鸭，但对其它禽类和哺乳动物均不感染发病。20日龄以内的雏鹅和三周龄以内的雏番鸭常会发生鹅细小病毒感染，也被称为小鹅瘟或Derzsy。S病，传播速度快，常在2-3d内迅速蔓延至全群，发病率可达90％．100％。最早发病为2．5日龄，其死亡率高达95％以上；6．10日龄时，是发病率和死亡率5 东北农业大学农学硕士学位论义的高峰，雏鹅死亡率为70％．90％；11—15日龄死亡率为50％．70％；16。20日龄死亡率为30％-50％；21—30目龄死亡率为10％．30％；30日龄以上死亡率为lO％左右。说明随蓿雏鹅的瑟龄增长，其发病率翻死亡率下降，症状也较轻，病程延长。本瘸一年溜季均霹发生流行，但由于我国南方和北方养鹅季节不同、饲养方式不同等原因，小鹅瘟的流行发生时间也不同。如江苏流行季节为每年12月至次年7秀，东l艺、西=|艺地区为4—7月，醋j||省为每年ll蜀至次年6月，广东、广西等南方省份一年四攀都有发生。小鹅瘟病毒可经患病雏鹅的分泌物和排泄物污染环境，通过消化道感染，并迅速波及全群。小鹅瘟发生流行时，最初出炕的雏鹅经往不发病，病毒～里传入炕坊丽引起雏鹅发病，以J嚣出炕的雏鹅就会相继不断发瘸，造成大批死亡。成年鹅感染后，可能经卵将疾病传染下一代。但小鹅瘟的流行有一定的周期性，阑茺在大流行以后，当年余下的鹅群都获得主动免疫，使次年的雏鹅获得天然被动免疫力，因此本病不会在同一地区连续两年发生大流行。．目前，该病仍为养鹅业和榘约化养殖裔鸭的圈家中最主要传染病之～，能造成重大危害。野生禽类的迁徙己成为=|￡欧一些国家(如英国)发生本瘸的隐患(Hlinaketal。，1998；Gougheta1．，2005；Tsaieta1．，2006)。鹅细小病毒病的防制中，有使用强毒免疫种鹅的方法，这种方法效栗比较好，能够保证几年内不发瘸，成本也比较低，但后果难以控制，因戈成年鹅经接种后，各实质脏器内的病毒须经4．5d才能不被测出，肠内容物及肠组织中的病毒经8d才消失，大群成年鹅的饲养中病毒可能不断更换宿主，所以使整群鹅带毒时间很长，还可能从一群传至另一群，这样就会使大批种卵中有少数卵带有病毒，使鹅群孵化率大大降低。尤其是强毒渤家禽向野生禽类的传播，是野生禽通过迁徙将病毒传染到很远的无GPV地区，增加了该病的控制雉度。2004年英国爆发的鹅细小病毒感染据报可能与，|艺欧瓣野生禽类迂徙有关，这也是英国在1981年酋次发生鹅细小病毒感染20年后再度发生该病，从病料中分出的两株GPV，经部分基因纽测序发现这两株病毒在这一段基因组中仅有一个核苷酸变化，毽不引起氨基酸的变化，她l|、】都与1998年北欧鹅中分出的一株GPV有着密切的亲缘关系。除此以外，还有学者发现多次给鸡注射GPV也会引起鸡的适应，认为鸡也可能是GPV的潜在宿主。这些都对鹅细小病毒病的防治撬密了新的挑战。{．3小鹅瘟的症状及病理变化本瘸潜伏期一般为3—5d，以消化道和中枢神经系统紊乱为特征。其症状的表现与感染发病时雏鹅的圈龄密切相关。根据病程长短可分为最急性型、急性颦和豫急性型三种类型。最急性囊：常发生于一周龄戳内的雏鹅，一般不出现明显症状印倒地稳划死亡。肠道发生急性卡他性炎症。急性型；常发生子l艺周龄的雏鹅，患病鹅精神菱顿，食欲减少，行动迟缓且站立不稳，嘉蹲卧，排出灰自色或淡黄绿色稀粪并混有气泡秘纤维碎片。全身显示败血症变化：肝脏癖血肿大，肝细胞颗粒变性；肾略肿大，呈暗红色，内皮增生；胰腺肿胀呈淡黄色，偶尔可见到灰岛色小结节；心脏发生怠性心力衰竭；病死鹅瀵殖腔扩张，霾鼻滚出稀薄液体；结膜于燎，全身脱水，皮下组织显著充血。本瘸的特征性瘸变是小肠(空肠和回肠部分)呈急性卡他性、纤维索性坏死性肠炎。典型的变化是在小肠的中段和下段，特别憝靠近卵黄柄和回富部的肠段外观变得极度膨大，里淡灰白色，体积比正常肠段增大2．3倍，形如香肠，质地坚实，膨6 引言大部的肠腔内充塞着淡灰白色或淡黄色的栓子状物，将肠腔完全堵塞，肠壁变薄，不形成溃疡orLl亚急性型：亚急性型多出现于流行末期，雏鹅消瘦拉稀，病程在3．7d，少数幸存者在一段时间内生长不良。1．4GPV诊断研究进展1．4．1GPV诊断方法的研究进展目前已经建立了许多诊断方法；包括病原的分离与鉴定、病毒中和试验(Virusneu仃alimion，VN)(Kisary,1974；Gougheta1．，1984)、酶联免疫吸附试验(enzyme—linkedimmunosorbent琴sary,ELISA)(Kardieta1．，1996；邹叔和等．，1992)、聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)(Changeta1．，1996；娄华等．，2000；胡奇林等．，2001；布日额等．，2003；季芳等．，2003；胡桂学等．，2003；黄诚等．，2004；张守峰等．，2004；虞德屏等．，2004；刘洋等．，2006；李福伟等．，2006；姚笛等．，2006；刘家森等．，2007)，PCR-REFL(主要是用于鉴别GPv和MDPV)(Phontipeta1．，1998)和二重PCR检测方法(赵妍等，2008)。免疫荧光(immunofluorescence，IF)(潘玉民等．，1990；Takeharaeta1．，1999；)，免疫电镜(immunoelectro．microscopy，IEM)(Alexandroveta1．。1999)，反向间接血凝试验(孙怀昌等．，1989)，间接免疫酶组织化学法(周春宇等．，2006)等，1)地高辛标记的核酸探针和核酸斑点杂交法余兵和布日额等分别建立了为在抗体产生之前就作出早期诊断的地高辛标记的核酸探针和核酸斑点杂交法，但目前还没有广泛应用。2)琼扩试验是目前最广泛使用的诊断方法，针对该法对抗原和抗体要求高的问题，有学者开发了对流免疫电泳提高了抗原的纯度，又用单克隆抗体建立的免疫酶琼扩试验，将琼扩试验的敏感性提高了256倍左右。将高免血清稀释213倍仍可抑制沉淀线的出现，说明它适合于监测母源抗体水平，有很好的使用价值，但所用的显色剂DAB是剧毒致癌物，应该寻找更加绿色安全的物质取代。3)ELISA检测不但敏感，而且可以一次检大量的样品，竞争ELISA还可以定量，但假阳性的出现也比较多，ELISA96孔板用于检测鹅这种经济价值比较低的动物来说比较昂贵，所以该方法不易在鹅场普及。·4)直接透射电镜检测SPF鹅及SPF胚都比较难于得到，每年秋冬季鹅不产卵，所以需要鹅胚增殖病毒的检测方法如病毒的分离鉴定，中和试验等经典方法，无法常年进行。常国权以病鹅肠内容物或粪便提取物建立直接透射电镜检测，在病料送达实验室后lh就能得到初步诊断结果，但只能用于疾病的突发的初步检测。5)二重PCR法根据鸭瘟病毒DNA聚合酶基因和鹅细小病毒NS基因序列分别设计2对引物，应用这2对引物对混合样品中鸭瘟病毒和鹅细小病毒进行了二重PCR扩增。该二重PCR能够在一次扩增反应中检测两种病毒，为两种鹅病的病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。各种诊断方法都有其固有的优点和缺点。目前依据体外表达GPV衣壳蛋白制备的重组7 东北农业大学农学硕士学位论文诊断抗原作为新开发的诊断方法已经严重落后于细小病毒家族中其它很多病毒。有许多学者希望能通过多种GPV分离株序歹d的比对来确定GPV衣壳蛋白中有诊断意义或有可能作为亚单位疫蘸酶蛋白部分。剩用分段表达VP基因的方法取得可熊具有蘧要诊断和免疫意义的蛋白部分，并进～步检测和分析这些重组蛋白将可以使通过序列比较所作出的猜测获得确证，荠盈也霹以为我镌定位GPV的表经提供参考。{。4。2防治目前在GPV治疗方葱，除抗赢清乡}还没有有效的化学药物可以治疗小鹅痘，因此该病重在免疫预防。蘑蘸黧内多莱用攀l萼箍纯弱毒疫苗在产蛋前一个箕注射接种母鹅<流行严重地区免疫两次)，的主动免疫方式使雏鹅获得坚强的被动免疫。另外，以弱毒疫苗直接接种1日龄的雏鹅也有一定效果。另外，小鹅瘟抗赢清分为同源(鹅缸清)和异源(牛、羊等血清)抗血清两种，对感染小鹅瘟及受威胁的雏鹅群，可起到治疗和预防作用。抗小鹅瘟蛋黄抗体的用途同抗觑清相似也能起到预防及辅助治疗的作用。但对于严重的病例，血清治疗效果甚微。现在广泛使用兹有弱毒苗、灭活菌，对成年种鹅也有健矮强毒攻击豁。高免巍清或郛黄囊抗体可用于紧急防治，发病区可用弱毒苗气雾接种防_L￡病情的扩散。为了大批的生产疫苗，有学者开发了用生物反应器制备疫苗的方法以减少鹅胚连续传代所带来的不便。为了刺激枫体产生更快、更高、更持久的免疫反应，也有将病毒包裹在PLA／PLGA中。张保华，张福祥等从健康成年猪脾脏中用超滤法提取的转移因子(张保华等，1987)，对自然发生酶小鹅瘟和久工接种发病的小鹅痘均有～定的效果，治愈率与抗小鹅瘟高免盘清基本接近，可用于小鹅瘟早期病例的治疗。何日远、卢文贵等报道，用中革药赤桂五瘟散防治小鹅瘟也可_以取得较好的效果。赖国英等指出，中药防治畜禽疾病梳理之一在于调：诲帮谲动蜜禽体内的抗病力，所以中草药的防治效聚随病鹅日龄的增加而提高。1。5单克隆抗体技术及其在小鹅瘟病毒方面的研究单克隆抗体技术是近年来发展起来的生物学技术，它是由预定免疫小鼠的脾细胞与能在体外无限生长的骨髓瘤细胞形成的具有双亲特征的杂交瘸细胞产生的只针对一种抗原决定簇的单一抗体。单克隆抗体技术自阆世的30多年来发展迅猛，使这项技术和细胞工程与基因工程、酶工程、发酵工程并列为现代生物技术的四大工程。单抗技术目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学弱药物学等许多颁域的研究。在兽医学领域，单克隆对于疾病检测治疗发挥了重要作用。十几年来动物用单抗的研制在全世界范围内蓬勃展开，至今，国内外报道的动物单抗己达数百种。据不完全统计，针对畜禽瘸原体的单克隆抗体有163零申，几乎包括了国内外严重流行的大多数动物传染病。国内很多学者研制了动物细小病毒抗体，如抗犬细小病毒单抗、猪细小病毒单抗。由于单克隆抗体具有赢特异、赢纯度和亮效价等特点，在动物病原微生物的检测和动物疫病的诊断和治疗上，与多克隆血清相比较，具有绝对明照的优势，我国许多学者在对小鹅瘟病毒的相关毳珏究试验中都；露至l了抗小鹅瘟病毒靛单抗，如纷环毽等罔抗小鹅瘟单抗lgG致敏红细胞建立反向间接血凝试验，李新华用酶标记抗小鹅瘟单抗建立免疫酶斑点法对小鹅瘟进8 引言行检溅。李新华还对抗小鹅瘟瘸毒中糯饿单克隆抗体进行研制荠对其防治效果进行实验研究，试验分别以GPV强毒和弱毒作为免疫原研制出九株抗GPV强毒的单抗和两株抗GPV弱毒的单抗。徐建生等对小鹅瘟病毒单抗的防治效果进行了实验研究，发现单抗的治疗效果要高于目前常粥的常规抗血清。．1．6本研究的目的及意义小鹅瘟是一种雏鹅烈性传染病，箕传染性强，病程短且死亡率高，是目前我国养鹅业中主要的传染病，快速诊断是控制本病的有效途径。目前，全病毒疫苗可视为二种含有许多抗骧表位的复杂混合物，它虽可诱导宽范黧的保护健免疫答，健英中部分表位可能会造成枫体的免疫病理反应。由于蛋白质抗原的免疫原性主要是通过表位体现的，因此对病原体整体免疫的研究向表位水平研究过渡就成为了目前疫苗研制的发展方向。现代免疫理论认为有效的保护性免疫取决予～组合理缝会与搭配盼表位，瓤对数体液免疫反疲为主的GpV来说，鉴定其B细胞抗原表位更能揭示GPV体液免疫的本质。GPV-VPl蛋白在病毒侵染细胞并产生感染方颟起决定性作用，因此针对VPl蛋自制备出高度特异酶单克隆抗体在夸鹅瘟病毒的抗原位点功麓研究串具有重婺意义。本研究意隧制备出几株有效分泌抗重组GPV-VPl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并用本实验室先前制备出的可特异性识别感染GPV血清的分段表达的重组GPV-VPI多肽对制备的单抗进行筛选。制备出的单抗将对进一步研究GPV结构蛋自的抗原功能位点，并建立出～种快速简便高灵敏度的诊断方法提供了必要的物质材料支持。9 东北农业大学农学硕士学位论文2材料与方法2．1实验材料2．1．1细胞、质粒、蛋白及菌株SP2／0骨髓瘤细胞，由本实验室冻存；阳性质粒pGEX．6p．1．GPV-VPI和互相重叠10aa-25aa且覆盖整个GPV结构蛋白氨基酸序列的分段截短表达重组蛋白均由本实验室制作并保存；大肠杆菌EcoliRosetta菌株由本实验室保存。2．1．2实验动物清洁级BALB／c小鼠，4-6周龄，购自哈尔滨医大二院。2．1．3表达载体表达载体pET-30a由本实验室保存。2．1．4试剂2．1．4．1抗体制剂辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗NIgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。PEG3350为Serva产品，SBAClonotypingTMSystem／HRP(Cat．N05300-05)抗体亚类试剂盒(包括捕获抗体、抗lgM、lgGl、IgG2b、IgG2a、IgG3、[gA、1c{连、九链酶标二抗)购自SIG№公司。2．1．4．2培养液及培养基HAT选择性培养基、HT选择性培养基、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购白SIGMA公司；RPMll640培养基购自GJBCo公司：胎牛血清购自天津灏洋生物有限公司；细胞培养溶液：基础培养液为PRMll640培养基，补加O．2％的NaHC03，用lmol／LHCI调节PH至7．O，过滤除菌。完全培养液为含20％胎牛血清的基础培养液，补加L．谷氨酰胺lmmol／mL。HAT选择培养液为含I％HAT(50×HAT)储存液的完全培养液。HT选择培养液为含2％HT(50×HT)储存液的完全培养液。LB液体培养液及固体培养基：每升含酵母提取物59，胰蛋白胨109，NaCI109用10mol／LNaOH调pH至7．5，15磅高压灭菌20min，4"C保存备用(J．萨姆布鲁克，2002)。在每100mLLB液体培养基中加入1．59琼脂即为固体LB培养基，15磅高压灭菌20min，4"C保存备用。双抗：青霉素100万单位(U)，链霉素100万岭，溶于100mL灭菌无离子水中，过滤除菌后分装，．30"C冻存备用。lO 材料与方法燃基曹量詈量暑皇詈鼍黑皇I—I————————————————————————————II—IIIII———————————————————一——,III葛皇詈皇50％聚K,--醇(PEG)溶液：取PEG3350lg，加入lmL基础培养液，混匀，高压灭菌。2．1．4．3聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)所用主要试剂2xSDS凝胶加样缓冲液：100mmol／LTHs．HCIpH6．8、200mmol／L4％SDS、O．2％溴酚蓝、20％甘油。DTT缓；串液：称取3。ogⅨ订加入20mLNaAC(pH5．2)溶液，过滤除菌分装，贮存于-20"C保存备用。IPTG溶液：IPTG加入去离子水，配制成20mg／mL的溶液，0．221am滤膜过滤除菌，一20。C保存备用。丙烯酰胺、N’M皿甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、Tfis·HC!缓冲液、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)。Tris．苷氨酸缓冲液：900mL纯化水中溶解15．19Tris·Base静9。49甘氯酸，再加入59SDS(邀泳级)，纯水定容至1000mL，配成5×贮存液。考马燎亮兰R250染色液；以体积酉分比45％N醇，10％冰乙酸，45％纯水，含考马斯亮兰R2500．25％。脱色液：45％甲醇，10％冰乙酸，45％纯水，按体积百分比混合。2．1．4．4蛋白质免疫印迹(Westem-blot)所用主要试剂封闭液：脱脂奶粉(完达山产品)59溶于100mL0．01mol／LPBS液。0．01mol／LPBS液：NaCI8．09，KH2P040．29，Na21--I-P04·12H202．99，KCl0．29溶于1000mL蒸馏水pH7．4。PBST洗脱液：NaCl89，KCIO．29，Na2HP04-12H202．99，KH2P040．29，加水定容1000mL。加入5009l蛙温20，室温保存。，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠lgG(购于北京中杉公司)显色液：4．氯．1．奈酚(4，CN，购自上海华瞬生物工程有限公司)(6mg4-C-N溶于2mL甲醇、10mLPBS缓冲液、509l30％H202中)，混合后立即使用。2．1．4．5ELISA试剂包被稀释液(0．05mol／l碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pH9．6)：Na2C031．59，NaHC032．99，加蒸馏水至1000mL，调pH至9．6。0．01mol／LPBS液。PBST洗脱液封闭液：0。5％明胶于三蒸水中加热溶解后晾凉。TMB显色液：A液：TMB700mg，，DMSO40mL，充分溶解，加蒸馏水960mL，柠檬酸·H2010．339，3mL2mg／mL的Na2S203·5H204"C贮存3个月。B液：过氧化脲1．09，Na2HP04·12H2035．8g，柠檬酸·H2010．39，Tween一20O．1mL，加1000mL蒸馏水，现配现用。终．It液(2mol／LH2S04溶液)：蒸馏水600mL，浓硫酸100mL(缓慢滴加并不断搅拌)， 农北农业大学农学硕七学位论文皇曼鼍掌寰寰篁鲁!鼍皇篁暑葛鼍躺薯皇詈暑詈鼍曼鼍鼍躺麓葛量曼曼曼量詈舞黧蔓皇!!詈!詈詈鼍鼎蔓皇!!曼!!!鼍燃苎皇寡!!!曼寰囊鼎篡篁皇鲁兽量昌皇紫I,——I!鸯羹蒸馏承至900mL。2．1。4．6变性条件下NI-NAT纯化所需试剂配制StocksolutionA(10x)：磷酸二氢钠13．89，NaCl146．459，去离子水定容至500mL。室滠保存。StocksolutionB(10x)：磷酸氢二钠14．29，NaCI146．45，去离子水定容至500mL，寰温保存。盐酸瓢裂鳃液：80mL去离子水中燕入StocksolutionA(10x)0。58mL，StocksoCutionB(10x)9．42mL，盐酸胍57．39，完全溶解后，调pH至7．8，定容至100mL，0．45um过滤除菌，室温保存。DenaturingBindingBuffer：80raL去离子承孛热入StocksolutionA(10x)0。58mL，StocksolutionB(10x)9．42mL，尿素48．19，50—60"C；打I热融化后，冷却至窒温后，调pH至7．8，定容至100mL，0。45urn过滤除菌，室瀑保存。DenaturingWashBufferp}{6。O：80mL去离予水中加入StocksolutionA(10x)7．38mL，StocksolutionB(10x)2．62mL，尿素48．19。50—60。C力I热融化后，冷却至宝温后，调pH至6．0，定容至100mL，0。45um过滤除菌，室潺保存。DenaturingWashBufferpH5．3：取10mLDenaturingWashBufferpH6．0用HCI调至pH5．3备用。DenaturingElutionBuffer：80mL去离子水中加入StocksolutionA(10x)10mL尿素48．19，50—60℃加热融化后，冷却至室温后，调pH至4．0，定容至100mL，0．45urn过滤除菌，室温保存。2。1，5主要仪器纯水仪：MilliporeMitli．QII型；低温台式高速离心机：BeckmanAvanti30；电热恒温培养籀；DNP-9162型，上海精宏实验设备有限公落；超净王作台：FromaScientific1829．SN．17069。15；落地式低温高速离心机：HITACHI；C02恒温培养箱：REVCO倒置显微镜：Nikon产蹴；电泳装置：BioRadMAl20型MINIVERITICALGELSYSTEM；电热恒温水槽；DK．80鍪，上海鞲宏实验设备有限公词；恒温水浴摇床：HZS．D型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；恒温气浴摇床：HWY-100B型上海智城分析仪器制造有限公司；紫外分熙光度计：UV-120．20型，岛津公司；M酐疆RAE260型，Deltalange公司；赢流电泳仪：DYY-Ifl型，Deitalange公司；电泳仪：SavantPS4000型SavantInstruments；pH计：METERTOLEDOMP220；超声清洗仪：SB．2200型，上海Bronson公司；凝胶成相仪(美国，Millipore)；叁动酶标梭测仪：LabsystemsUniskan；洗板机：MODELl575，赡鸯BioRAD：台式离心机：上海第三分析仪器厂。12 材料与方法。2．2实验方法2。2．1重组GPV-VPl蛋白的诱导表达及纯化2．2．1．1pET-30a(+)一GPV-VP1的构建1)GPV-VPl基因片段的回收纯化将实验室储存的pGEX一6p—l—GPV-VPl的质粒进行目的片段的酶切a选择酶切位点Ba．mHl和XhoI。双酶切反应体系：重组蕨粒pGEX-6p-l-GPV-VPl2．5：此BamH10．5她XhoIO。5皿10xKBuffer1皿ddI-1205．5此取pGEX-6p．1一GPV-VPl的酶切后产物2皿在l。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后戳l。2％琼脂糖回收纯化目的片段，方法参照上海华舜回收试剂盒说明。2)GPV-VPl基因片段与pET-30a(+)原核表达载体的连接：粘性末端的GPV-VPl基因的纯化产物pET-30a(+)的酶切纯化产物10×BufferT4DNA连接酶总反应体积为lO畦，，轻轻混匀后，予16"(2连接过夜。7．5此1儿I皿0．5嵋3)GPV-VPl与原核表达载体pET-30a(+)连接产物向Rosetta菌株中的转化从一70。C取出感受态细胞Rosetta，放予冰上，使其缓慢融化；将连接产物全部加入到感受态细胞中，并轻轻混合；放冰上30min；42*(2热休旄90s，放置冰上冷却2-4min；加入10011LLB，37℃震荡培养1h；涂布含有卡那霉素(Kan)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。4)重组质粒pET30a(+)．GPV-VPI的筛选于平扳上挑取4．6个单个菌落，分别接种到含Kan的LB液体培养基中，扩增过夜盾，碱裂解法提取质粒(萨姆布鲁克等，1999)。5)重组质粒的酶切鉴定13 东北农业大学农学硕七举位论文攀酶切反应体系；双酶切反应体系：重组质粒pET30a(+)一GPV-VPlXhoI10xHBufferddH20踅组质粒pET30a(+)一GPV-VPIBamHIXhoI10xHBufferddH20阳性质粒命名为pET-30a(+)-GPV-VPl2．5此0．59L1池61xL2．5雌O．59L0，5ffL1rtL5．5p．L2。2。1．2重组GPV-VPl蛋白的诱导表达1)重组GPV-VPl蛋白的诱导表达将含有阳性质粒pET-30a(+)．GPV-VPl的Rosetta菌活化，12h后，以1：100的比例将500pL菌液接嵇至5mLLB液体培养基中进行扩大培养1-2h，至OD600值达0。4．0。6时，加IPTG至终浓度1．0mmolFL继续诱导培养4h。取诱导前和诱导后菌体样品，120009离心lmin，弃上清，将菌体用PBS洗涤一次，重复操作一次，然詹热入2xSDS凝胶橱样缓冲液(含DIW)，充分混匀，煮沸10min，120009离心5min，取上清上样，以蛋白质标准分子量为参考，在12％SDS—PAGE上进行电泳分析。选取含有囤的带表达的菌液为阳性菌种。2)表达产物的SDS．PAGE分析(1)SDS—PAGE样品的制螯取诱导前和诱导后蔚体样品，120009离心1rain，弃上清，重复操作一次，然后加入2xSDS凝胶加样缓冲液(含DTT)，充分混匀，煮沸10min，120009离心5min，取上清上样，以蛋自震标准分子鬟为参考，在12％SDS．PAGE上进行100V恒医电泳，电瀛在1-20mA范匿内，电泳1．5h，至溴酚蓝泳移出凝胶底部，关闭电源，终止电泳。≤2)聚丙烯酸胶凝胶染色、脱色和于燥卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(45％甲醇，45％纯水，10％冰乙酸，0．25％的考马斯亮篮R250)染色lh，用脱色液(45％甲醇，45％纯水，lo％冰乙酸)进行过夜脱色后，观察结果。2．2．1．3菌体的破碎和包涵体的提取扩大培养体系至500mL，诱导4h后，44C，80009，10min离心集菡，弃上清。阕菌体～～．14 材料与方法裂解缓冲液I(50mmol／LTris，lmmol／LEDTA，pH8．O)按I／10培养体系的比例即50mL低温快速重悬菌体沉淀，加入溶菌酶(10mg／mL)509L充分混匀冰浴30m．in，超声裂解34次，30s次，中间间隔摇匀。4℃，8000r／min，离心10min，弃上清，将沉淀用50．100mL缓冲液II(50mmolFgTris，O．5mmol／LEDTA，NaCI100mmol／L，TritonX．1001％，Urea2mmolFL，pH8．o)悬起，4"C，8000r／min，离心10rain洗涤一至三次后备用。2．2．1．4筛选抗原GPV-VPl重组蛋白的纯化1)制备菌体裂解物(变性条件下)：50mL菌液5000r／min离心5min，收获沉淀；用盐酸胍裂解缓冲液8mL重悬沉淀；缓慢搅动菌体5．10min室温迸行：超声裂解，高强度5s欣，共3次；3000r／min离心，15min，回收上清。2)变性条件下重组蛋白的纯化(利用变性缓冲液，柱子和菌体裂解物)：加8mL裂解物至已制好的柱中：室温条件下轻轻地搅动(或震荡)使之结合15．30rain，使柱中的树脂始终处于悬浮状态，重力法使树脂沉淀，小心吸去上清；用4mLDenaturingBindingBuffer重悬树脂。晃动2min，重力法沉淀树脂，小心吸取上清，4℃保存上清液，用做SDS．PAGE分析，重复1次以上；·3)用4mLDenaturingWashBufferpH6．0重悬树脂，晃动2min，重力法沉淀树脂，小心吸取上清，4℃保存，用做SDS．PAGE分析。重复1次以上；用4mLDenaturingWashBufferpH5．3重悬树脂，晃动2min，重力法沉淀树脂，小心吸取上清，4℃保存，用做SDS。PAGE分析，重复2次以上；垂直固定好柱子，打开底部的小盖，用5mLDenaturingElutionBuffer洗脱蛋白。取lmL洗液，OD280检测洗液，之后将所有洗液于4"C透析，透析过夜以除去尿素。取透析后的洗液109L，加89LSDS上样缓冲液，2I．tLDTT。充分混匀，在15％SDS．PAGE上进行电泳分析纯化结果：其余一20℃保存。～2．2．2单克隆抗体的制备2．2．2．1实验动物的免疫用纯化的重组蛋白GPV-VPI作为免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，经腹腔接种于4-6周龄BALB／e小鼠(301．tg／只)，随后每隔两周，将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫。三次后，直接用免疫原于腹腔加强免疫，3d后取小鼠脾细胞供细胞融合。2．2．2．2间接ELISA检测方法的建立4．6周龄BALB／C小鼠，与免疫小鼠，在相同条件下饲养，作为对照小鼠。融合前分别将免疫小鼠和对照小鼠摘除眼球放血，分离血清，．20"C保存备用。取纯化的重组pET030a(+)．GPV-VPl蛋白用包被稀释液做l：50、l：100、1：200、l：400、l：800、1：1600稀释，加入微量反应板，每孔100“L，并振动平板使抗原分布均匀。将包被的微量反应板用保鲜膜封好，4"C过夜，弃去板中液体，用PBST溶液洗涤三次。每；tL；tl封闭液3009L，37℃封闭1，5h后，同样洗涤3次。15 东乾农池大学农学硕士学位论文嬲性、阳性血清用封}il液分别傲1：200、1：400、l：800、1：1600稀释后，加入各反应孔巾，每徉品每次平行做2孔，每孔100}．tL，同时设空白对照，37℃作用60min，洗涤3次。用封闭液将羊抗鼠酶标抗体稀释至工作浓度(1：10000倍稀释)，每孔100p．L，37"C作用lh，洗涤3次。新配制的TMB底物显色液每孔加100pL，37℃避光显色10．15min，2mol／乙H2S04每孔50儿终止反应。自动酶标蓼{|l定仪予波长450nm处测定光吸收(o玟5溉)值。每个样品徽两个平行孔，取平均值。以阳性血清孔的OD450nm值1．0以上，P／N>2．0时的抗原、衄清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度。2。2。2．3饲养细胞的制备在融合前1天，选择健康BALB／e小鼠拉颈处死，75％酒精浸泡消毒5min，移入超净工馋台逡后，圈定于勰剃板上，髑镊子提起小鼠骏都皮肤，震灭菌剪刀剪一小墨(注意不可损伤腹膜)，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用酒精擦拭消毒，用一次性无菌注射器吸取含20％胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，固定注射器，用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠黢部1-2min，再吸出腹腔围的培养液(肉含巨噬绒胞)，加入到准备好麓HAT培养液孛，将细胞悬液混匀后加入到96孔细胞培养板中，每孑L1001．tL，置于37。C、5％C02培养箱中培养。18—24h后观察细胞生长状态，纲胞呈多形性，贴壁紧密，折光性较好时可用。2．2．2．4骨髓瘤细胞的准备融合前两周从液氮中取出臀髓瘤细胞进行复苏，于融台前48．36h扩大培养，镜下观察，缩胞生长状态良好时可用于融合。融合滔天，将处于生长旺盛期的细胞收集至离心管审，1000r／min离心10min，弃去上清，用基础培养液洗涤一次后，将细胞重新悬浮、计数，用于融合。2．2．2．5脾淋巴细胞的准备取免疫的BALB／e小鼠，鼹撼除球放血，分离巍清作为筛选阳性杂交瘤缨臆株时的嬲性对照血清。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中消毒5min，秃链取出脾脏，放入盛有基础培养液的平皿中清冼，尽量剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛有适量基础培养液的平皿内，蔫针头在脾脏～端刺数魏，另一端溺镊孑夹起匿定，然后雳一次性无菌注射器吸取基稿培养液，从脾脏同定端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复多次，尽量将细胞洗出。将平皿中脾细胞悬液转移到离心管中，1000r／rain离心，弃上清，补液至2mL，重悬细魏，计数。2．2．2。6细胞融合将免疫鼠薄细胞与詈髓瘤缨艟按缨胞数量8：1混合，加入离心管内，1000r／min离心，弃上清；用手指轻弹管底，使两种细胞充分混匀；将离心管置于37"C水浴的烧杯中，吸取37。C预热的50％PEG3350溶液0．6mL，在60s内缓慢滴入，边滴边转动离心管，然后静止90s，立瑟瑟在5min内按亩慢至快的羰序，加入37"C预热的不含电清的RPMI．1640绪养液使PEG稀16 材科弓方法鲁詈!詈冀簟皇詈詈詈攀葛皇詈量曹燃鲁曼曼皇墨糟皇曼詈烹iiiiii,iii嬲皇詈!皇黑舞暑皇篁释而失去促融作用。1000r／min离心，弃上清，加入培养液，再洗一次，以除去PEG，减少其对细胞的毒性律用(朱立平，2000)。将沉淀细胞轻悬于含20％胎牛血清37"C预温的HAT选择培养液中，混合均匀，加入到有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔lOOl止，将培养板移至37"C、5％C02饱和湿度温箱中培养。2．2．2．7融合细胞的培养和筛选融合羼的细胞每3．5d曼换培养液一次，采用半换液方式。所用的培养液按培养对阀的不同而有所不同，在融合后lOd内用HAT培养液；第10．15d用HT培养液，第15d后用普通的完全培养液。．待杂交瘤细胞汇合度为1／5．1玛时，子换液314d后即可在纛蓥条件下取细胞培养上清液100uL，不作稀释，用已建立的间接ELISA筛选方法对上清进行检测，同时用SP2／0细胞培养上清液俸阴性对照，并设阳性、阴性巍清对照，选出P／N大于2筋潮性孔及时进行耍克隆。采用液相有限稀释法进行细胞克隆(周宗安，1991)：将间接ELISA检测为阳性孔中的杂交瘸细胞集落糟微量移液器悬起混匀，取出少量准确计数后，根据计数缩果吸取一定量至无菌小瓶中进行系列稀释，稀释至lmL含10个细胞，将稀释好的细胞悬液以每孔lOOgL加入到含有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养，适时换液并将克隆化后剩余细胞进行扩大培养冻存。驻克隆后lO天左右，选取适中的单克隆孔上清进行检测，从中选取1个阳性孔再进行亚克隆，方法同上，直至筛选结果100％阳性为止。2．2．2．8杂交瘤细胞的冻存和复苏冻存：将阳性缨胞依次转至24孔板和培养瓶中扩大培养，收集培养上清液保存务用。收集培养瓶中处于对数生长期、状态良好的细胞，1000r／m离心，弃上清，用细胞冻存液(含10％DMSO、90％d、牛血清)将细脆稀释成106个矗nL，加入蜀细胞冻存警中。4℃放置30min，-20℃放置60min，再移至．70℃冰箱中过夜，次日放入液氮保存。复苏：自液氮罐中取出冻存管，迅速放入盛有374C水烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无蘸开定冻存管，缓慢加入不舍巍清的PRMI．1640培养液，1000r／min离心10min，以完全培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置5％C02、37℃饱和湿度培养箱中培养。．2。2。3杂交瘤细胞的鉴定2．2．3．1杂交瘤细胞染色体数鉴定将各株杂交瘤细胞和SP2／0细胞分别传代，36．48h后加入秋水仙素至终浓度0。3}tg／mL，5h后收集细胞离心，37℃水浴，0．075mol／L的KCI5mL混匀，37℃水浴15min后，加入lmL新配瓣定液<甲醇与冰醋酸以3：1混合)混匀慧离心，以轻微圈定细胞，然后加入5mL露定液混匀，室温放置20min离心弃上清，张加入5mL固定液混匀室温放置20min离心弃上清。保留少许固定液与细魏混匀籍漓1．2滴懋液至载玻片上，Giemsa染色液染色。在显微镜下观17 系能农业大学农学硕七学位论文察染色体的形态，分别计数10个形态完整、单在，染色体分敖良好、无重叠、无散失憋缨臆进行观察、染色体记数分析(薛庆善，2001)，求出平均染色体数嗣，并拍照保存。2．2．3．2杂交瘤细胞冻存前后分泌抗体稳定性的鉴定将冻存后各株杂交瘤细胞复苏于培养瓶中传代培养，取培养三天左右上清，与冻存前细胞培养上清分别以每孔100uL加至融经包被好的ELISA反应板中，‘进行间接ELISA检测，比较检溪l值。2．2．4单克隆抗体的鉴定2．2．4．1单克隆抗体与重组GPV-VPl蛋白Westernblot的特异性检测将经亲和层析纯化后的重组GPV-VPl蛋白点样进行SDS．PAGE电泳，取出凝胶，用去离子永反复冲洗，敖入转印缓冲液审，将滤纸耜硝酸纾维素滤膜也敞入转印缓冲液中浸湿，然后由下至上按照滤纸、硝酸纤维素滤膜、聚丙烯酰胺凝胶、滤纸的顺序放置在转印仪上，装好盛连接电源，50mA悭流转印40min，转印结束届，取下硝酸纤维素滤膜，去离子水反复冲洗，然后放入丽春红染色液中染色，轻轻摇动，观察蛋白带邂现后，立鞋器用去离子水洗膜；放在5％封闭液中于4℃冰箱过夜封闭，然后放置于阳性细胞培养上清中，并用SP2／0细胞上清作为臻性对照，37℃摇床作髑1．5h后，用PBST洗涤，爱放入含毒辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠lgG(1：2000)的封闭液中，37。C摇床作用1．5h后用PBST冲洗，然后用4一氯一1奈酚显色液显色，10．15min后观察，出现反应条带后，用去离子水冲洗硝酸纤维素滤膜以终止反应。2．2．4．2抗体亚类的测定采磺SBAClonotypingTMSystem／HRP(Cat。N05300．05)抗体泛类试剂盒测定。具体操作过程为：用碳酸盐缓冲液稀释包被抗原至0．5I-tg／mL，加入到ELISA反应板中，每孔100肛L，密封，于4℃饱署玎湿度过夜包被。弃去ELISA反应板中液体，PBS洗涤，加入0．5％聚乙烯醇封闭液，每琵300}tL，37℃封闭2小时。弃去ELISA反应板中液体，PBST洗涤，加入各株杂交瘤细胞培养液上清，每孔100儿，37℃作用30min，PBST洗涤，用封闭液稀释HRP标记的羊抗鼠抗渡类二抗对应加至ELISA反应板，37℃作用30min，弃去液体PBST洗涤，OPD遂色液显色30min矗，用扫接仪扫描保存。2．2．4．3免疫印迹检测法(WestembloO对单克隆抗体B细胞抗原表位的初步鉴定将本实验室制作的所有GPV-VPl截短表达髓重组缀自点样进行SDS．PAGE，电泳结束看转印至硝酸纤维膜(步骤同2．2．4．1)，转印后将转印膜加入到5％的脱脂乳中，40C封闭过夜后，分别加入到不嗣杂交瘪细胞株的上清的一抗中在37。C下作用l。5h，然螽再和二抗(HRP标记羊抗小鼠IgG)在370C下作用l。2h，4．氯。l奈酚显色液显色聪，用于离子水冲洗终止反应。观察westernblot的结果，并记录出不同单抗所对应的作用表位。18 3结果31gl的片段GPV—VPl的回收产物及pET30a(+)GPVVPl的单双酶切产物；’。罩IDLI5000Marker；2pGEX．6D．1．GPV-VPl终酶切后的胶阿收产物．3Xhol单酶切黪定结果，4BamHI剌姗oI般酶切鉴定结果，5DL2000Marker1DL15000Marker；2RetrievalproductionofpGEX6p1GPv_VPI：3TheproductofpMDl8／I-E1digestedbyXhol；4TheproductofpMD18T-EldigestedbyXho[andBamH]；5DL2000Markcr削3-1囊组质粒pGEX-6P—I-GP％VPl的敬酶切同收产物及pET-30a(+)一GI’V-VPI的单坝酶切产物Fig3-ITheresultsofRetrievalproductionofpGRX-6p-I-GP％VPlwithrestrictionen叫medigestandtileidentiflcatmnafpFI一30af十1一GPV-VPlwithrestricUonen叫medigest32重组GPV—VPl蛋白的表达和纯化321诱导表达菌的sDsPAGE分析焉导后构表达广物经裂斛后进行SDSPAGE分析，白幽32可见泳j苴2在00ku左右处宵明牲丧丛带，而未经诱导的对照则没何。 I经爵导后表进的pET-30a空载体对照、2诱导前的GPV-VP]萤白质分子{t标准IInducedexpressingrecombinantpET-30a；2ExpressedGPv_VPGPV-VPIinduced；4molecularmassstandards3诱导后的GPV-VPI，4阁3-2重组GPV-VPI的表达Fig3-2SDS-PAGEanalysisofexpressedrecombinantGPV-VPl322亲和层析的纯化图3-3箭头所示即为通过亲和层析纯化得到目的蛋白GPV-VPI．由幽可见所纯化的蛋白质与表达后的曲体裂解物的目的条带位置相符，纯化过程术出现蛋白质的降解现象。121160ku662ku一～一。45Oku”一、3s0kI】⋯＼250ku184ku144ku_．一1蛋一质分子世标准2纯化后的GPVVPlImolecularweightmarkers(kDa)；2TherecombinantGPV-VPIpurified幽3-3醇组GPV-VPI的纯化Fig3Thepur[ficafionofrecombinantGPVVPI323GPV-VPl蛋白westerrlblot的特异性鉴定将纯化肪的GPV-VPI盘一j，扰GPV鹅的多抗血清进行westernblot的特异肚鉴定．结果 站*如‘刳3-4显示，纯化厉构VPl蛋门与多抗tin清柏良好的抗原性。1纯化后的GPV-VPI，2诱导表达后的pET-30af+1的空载体对照IpurifiedpmteinGPV-VPl2ExpressedpEI-30(+)图3-4纯化后怕GPV-VPl蛋门与多抗鹅血清的搽定结果Fig3-4WesternblotanalysisofpurifiedproteinGPV-VPIperformedwitllgooseserumagainstGPV-VPl33细胞融合与筛选结果31ELlsA筛选方法建立的结果川纯化的重组GPV-VPI蛋白筛选抗原包被ELISA甲板，采川矩阵法确定蚩白的最徙包被浓度及⋯比血清的最佳稀释倍数，结粜见袭3-1。表31确定ElISA最住反应条什T曲3-lThebestconditionofEL】SA注：(+)表示m性向浩．()表示阴性血沾 东北农业人学椒学砸土学位论文根据阳性血清孔的OD450nm值10左右．f羽性血消OD450nm值<02，P／N>2，分析表3-I得出OD450nm值为I445时，P／N最大，此时VPl蛋向及刚性向消的稀释度为最佳r怍条仆，即抗原最佳包被浓度为1：400，最佳抗体稀释成为1：800。32细胞融合率细胞融合后3-5天履微镜观察，记数板中山现细胞克隆的数最，除以细胞培养孔总掳，计算得细胞融台率为67％。33阳性杂交瘤细胞的筛选结果经过了细胞融台利3≯、亚兜隆，j}获得5林能稳定分泌抗GPV—VPI单克隆抗体的杂交痈细胞株，分圳命名为3A8、3G4、4811、5G6、5C11。34单克隆抗体鉴定结果341单克隆抗体与免疫原的westernbIot分析用5株杂变瘤绑胞的；R养上7自诎Westemblot，如幽35可见，这5株细胞的坫养上滴1J纯化后的GPV-VPI在转印脱约80kDa处均竹-Ⅱ见反应，而R髓痛细胞sP2m细胞们培养上清作为的月降时娥不与纯化后的GPVVPI拄生可见反应。照明这5株单抗且肯很好的反应原盹。一蛳⋯∞剖35GPV-V[，ItE目l盘白对5株单抗的westernblot的持删Fig35WeslernblotanalysisofrecombinantGPV-VPIperfonnedwithantiGP％VPlMcAbs342单克隆抗体亚类鉴定结果经单克隆抗体业黄鉴定试剂盒检洲，所获5株杂交瘤细胞分泌晌抗体，3A8为[gA挝4811为IgG2b矾·3G4、5G6、5CII均为IgGI型。所打的单抗都址K链抗体。 l西1l窑G2aIgG2bIgG3I”l州K雾图36抗体Ⅱ粪鉴定结果Fig3-6TheresultofidentifyingsubtypsofMcAbs35杂交瘤细胞鉴定结果351杂交瘤细胞染色体数鉴定SP2／0细胞和杂交瘤细胞经社水仙素处理．离心沉淀，同定液同定．Gicmsa染色，100倍光镜观察，随机选取细胞形态完整，染色体分散均匀的细胞进行染也体计数，计算取其平均数。sP2m细胞的平均染色体数为55．65．而杂交瘤细胞的平均染色体数是85+103，杂交瘤细胞数明显多于SP2／0目髓瘤细胞数，}M片见图3-7至3-11。酬3．7细胞株3A8染色体计数Fig3—7Thenumbcrof3A8hybr]domacell’schromosomes圈3-8细胞株3G4染色体计数Fig3—8Thenumberof3G4hybridomaceil’schromosomes H3-9细胞4Bl|染色体计数r追3—9Thenumberof4811hybridomacell’schromosomes剀3-11细胞株5C11染色体计数F％3—11lhenumberof5C]1hybridomacell’schromosomes％≮、图3-10细胞株506染色件计数Fig3-10Thenumberof5G6hybridomacell’schromosomes352杂交瘤冻存前后分泌抗体稳定性的鉴定结果经削接ELISA检洲(表3-2)，砑、存前后并株杂交螬细咆培养上消晌效价变化并1：人，说明返5株j}交瘤细胞都且呐稳定分泌特异性单克逢抗体的能力。 表3-2杂交瘤分泌抗体稳定性鉴定结果Tab3-2Theresultofstabili可ofhybridomathatsecretedantibody36WesternbIot对单抗识别的抗原表位的初步分析分划以3A8、3G4、4811、5G6、5CII细胞株的培养上清作为一抗，对实验室已截短表达的19个相互重叠且覆盖整个GPV-VPI的氨基酸序列的融合蛋白VP(1-53)，VP(35．100)，VP(8I-136)，VP(124-161)，VP(146．198)，VP(199256)．VP(237284)，VP(267—329)．VP(310．366)，VP(347-409)．VP(391—“3)，VP(423．491)，VP(468．519)，VP(496．548)．VP(531-595)，VP(574-635)，VP(616-669)，VP(678-732)，VP(647-694)做Westernblot分析。结果发现单克隆抗体4811、5G6、5C11都特异性识别VP(81-I36)融合蛋白：3G4特异性识别VP(124—161)融合蛋白；而3A8分别识别VP(81．136)和VP(124．161)融台蛋白。12341234I2341234123rPq__■嘲pL主誓．。。r。-_毗”。■謦“，#7剿黔’，。茹二一．。一t。．3A83G448115G65C11lVP(35—100)，2VP(gl一136)：3VP(】24—16I)，4VP(146一198图3-12单抗为一抗的Westernblot分析Fig3—12IdentificationbyWesternblotwithMcAbs37WesternbIot对单抗识别的表位的进一步分析分别以3A8、3G4、481I、5G6、5C11细胞株的培养上清作为一抗．对VP(81-136)和VP(124．161)融合蚩白进步截短的表达产物做Westernblot分析。结果发现单克隆抗体4B]I、5G6、5C11都特异性识别VP(92．123)融合蛋白；3G4特异性识别VP(111．145)融合蛋白：而3A8分别识别vP(92123)和VP(III-145)融合蛋白。 一"1。”黛渤。一埘、．、{．．．．、VP(73—100)，2VP(92-123)：3VP(1ll-145)，4vP(136．161)图3-I3单抗为一抗的进一步Westernblot分析Fig3-I3ThefurtheridentificationbyWestemblotwithMAbs 讨论詈詈詈量暑鼍嬲懋兰曼曼皇兽詈皇尊燃麓鲁詈量量曼曼鼍黑j11IIIIIIIII4讨论4．．1制备单克隆抗体的免疫原的选择蛋自质抗原结构与免疫原性关系的研究推动了分子免疫学与疫苗学的发展，人们已认识到蛋白质抗原可以不依赖完整爨自发挥功能，而通过抗原表谴体现其特异性。就～个吴体的蛋自质抗原而言，存在B细胞袭位、11l表位、CTL表位等与免疫识别相关的结构，也存在非中和表使、毒性或抑制性表位、病理性及自身交叉反应性表位等对于保护性关系不大或有不剩的结构。由于许多天然抗原引发的免疫反应不能满足预防感染及免疫治疗的需要，为了提高蛋白质抗原的保护性，有必要在表位水平上做出选择和改造，以得到更理想的疫苗抗原。1994年Langeveld选择了两段含有重复序列的包含CPV的VP2氨基端21个氨基酸的肽段作为疫苗免疫犬，在目标犬体内产生了完全的保护，这是历史t首次利用合成肽作为亚单位疫苗在目标动物中取得成功。它不但证明了利用部分农壳蛋白制备的亚单位疫苗有着良好的发展翁景，圜时也说明了VP2氮基端良好的免疫原性。其后豹研究孛均发现其它细小病毒的VP2氨基端同样具有良好的免疫原性，说明细小病毒家族是有许多共性的。所以其他细小病毒的研究成果可以为GPV的研究提供指导。GPV是细小病毒家族中在兽医领域里很重要的病毒之一，健在许多方西镌研究还远远落后子多种病原性较强的动物缨小病毒及入类豹细小病毒。病毒的农壳结构决定着病毒的组织嗜性，宿主范围和致瘸性。因此关于GPV农壳结构即VP蛋白的研究将对殍发防制鹅细小病毒瘸的亚单位疫苗和燕组诊断试剂提供依据，同时它也能帮助我们了解GPV的致病桃理，免疫逃避及迸化方向等。而利用GPV-VPl作为免疫原制作单克隆抗体将会更好的解释体液免疫的本质，’并为抗原功能位点的定位提供依据。与其他传统的抗体生产比较，杂交瘤技术主要优点之一是，只要设计出可区分露的抗体与其他抗体的筛选方法，免疫用的抗原就不用纯化。虽然制备单壳隆抗体的免疫抗原从纯度上说虽不要求很高，但不纯的抗原将给筛选针对目的抗原的单抗带来很多繁琐工作，也会增加无关杂交瘤的产生。两蕊纯度豹抗原将使得所震单抗的枫会增加，同时霹以减轻筛选的工作量，并从而减少工作量和避免浪费。一般来说，在制备单克隆抗体的过程中，通常分离纯化天然蛋白质作为免疫原兔疫小鼠，然后将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用免疫原佟为筛选藏朦簿选出产生番的蛋白抗体的细瑰株。两大部分天然蛋自的表达量低，不易纯化且成本高，因pET30a(+)是一种是一个专为外源基因在E．coli中表达的高效原核表达系统。表达系统可用IPTG诱导产生融合蛋白，可在N端、C端加入His标签，便于应用金属鳌合屡额：(MetalChelateAffinityChromogrph的方法获得缝化蛋是，融合处禽有不影囔蛋白梅象的Gly，Ser残基，不会影响目的蛋白的结构。所以本研究中用作免疫原的融合蛋白选择了pET30计)作为表达载体。又因为含有标签蛋白分子量小，可以减少针对标签蛋白的杂交瘤细胞产生，并在大肠杆菌表达系统中对謦的基因进行有效、大量地表达，篇柱层褥技术对其缝化，以去除菌体杂蛋白，从而作为免疫原来免疫小鼠。从免疫的结果来看，说明纯化后的GPV-VPl蛋自具有良好的反应。27 东北农、业大学农学硕士学位论文暑詈詈嬲IIIII11I皇I曼皇詈醚邕4。2ELlSA筛选方法的建立杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤细胞从众多的融合孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，但作为杂交瘤细胞筛选的抗体检测方法必须具有快速、准确、简便，便于一次处理大量样品等特点，因为往往有几百个样品需要在短短几个小时内就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍，所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省久力。本实验选择溜接ELISA方法，闯接ELISA方法筛选杂交瘤细胞具有良好的灵敏性，最佳工作条件～经建立，样品可大批量检测，准确性、平行性较好。ELISA实验中选择不同封闭荆对实验结果影响很大，寻找合适的封}ij波对筛选工作十分重要，常用的封闭液主要是PBS稀释的0。5％PVA或PEG、l％-5％BSA以及5％的脱脂奶粉。l％．5％BSA封闭效果很好，但是价格昂贵。5％的脱脂奶粉作为封闭液较便宜，毽在本实验中该封闭液却蠢现封闭效采不稳定导致检测值上下浮动较大的问题，绘筛选工作带来困难，因此我们试着寻找另外一种封闭效果好又经济实惠的封闭液。后尝试0．5％明胶封闭效果良好。由此可见在不同ELISA检测过程中，选择封闭液并不是一成不变的，而且相互之闻封闭效果的差异也较大。此外，ELISA显色系统中的各因素对ELISA的结果也有着很大的影响。在建立间接酶联免疫吸附试验初期还遇到了显色过快、P／N值低且不稳定的闽题。因为ELISA即使是在相同的pH条件下，仅仅是由于缓冲体系不同，对酶促反应的速率影响也会不同。后根据酶促反应动力学的原理，通过将TMB显色系统的成份、含量、pH值和缓冲体系等参量进行对比、选择和优化，降低菲特异性显色，P／N值变离，最终使ELISA反应更适合单抗的筛选。。4。3单克隆抗体所针对的B细胞抗原表位的分析对GPV-VPl蛋白抗原表位的分析和精确定位，是研究关于GPV的诊断及基因工程疫苗等的重要手段。在本实验室的另一个独立研究(2007，于天飞>中，已表达了互相重叠10aa-25aa氨基酸的19个GST融合蛋白，这些蛋白覆盖了整个GPV结构蛋白的氨基酸序列。用本实验所获得的5株单抗分别与这19个蛋白进行wegemblot，然后将能与这5株单抗反应的蛋白片段进一步截短表达，并进行抗原表位分析，进嚣确定GPV-VPI蛋自上具有抗原表位功能的区域。依据结果，单抗4BIl、5G6、5C1l均能与VP(81．136)进行反应，而不与其它片段的蛋白反应，说明这三株单抗所识别的抗原表位区域位于81．136aa内；单抗3A8既能与VP(81．136)反应又能与VP(124—161)反应，说明它识别的抗原表位区域应该位于81．161aa内；而单抗3G4只与VP(124．161)发生反应，不与其它片段豹蛋白反应，表明它识别的抗原表位区域应该位子124—161aa内。进而又用覆盖GPV-VPl81—161aa基因片段醵4个相互重叠的小萋因片段表达的融合蛋自对这5株单克隆抗体进行进一步的westernblot检测，结果显示481l、5G6、5Cll这3株单抗都能特异性识别VP(92。123)，所以可以推论出它们识别的抗原袭位区域存在于92一123aa中；结聚显示单抗3A8既能识别VP(92．123)又能识别VP(11l。145)，所以其识别的抗原表位区域应存在于92．145aa中，且抗原表位的必需氨基酸区域可能存在于两个片段相互重叠 讨论的lll一123aa的区域；单抗3G4特异性识别VP(111．145)，所以其识别的抗原表位应该在111"145aa区域中。根据结果，本研究所获得的5株单抗所识别的抗原表位已限定在了13—35个氨基酸之内，当然对于以上抗原表位的进一步精确定位仍需要进行大量的实验来验证。4．4抗GPV—VPl单克隆抗体的应用价值本研究表明抗GPV-VPl重组蛋白的单抗针对的抗原表位主要集中在VPl蛋白的92．145aa区域中，在VPl的氨基端，是结构蛋白的非重叠区域。虽然GPV-VPl蛋白在病毒侵袭细胞并产生感染性方面是一个重要的结构区域，但通过对GPV衣壳蛋白三维结构模拟比较分析发现，暴露于病毒粒子表面的氨基酸序列均出现在VP3蛋白多肽链内，表明GPV主要抗原决定簇成分集中在VP3内，并能诱导机体产生具有中和作用的抗体，所以说VP3是GPV主要免疫保护性抗原，而天然的GPV粒子并不能与抗VPl的抗体，也就是抗非重叠区的抗体产生中和性反应。因此制备的这5株单抗也就不能够与天然GPV发生特异性反应。于天飞(2007，于天飞)已证实GPV感染的鹅血清能与小鹅瘟病毒结构蛋白非重叠区域发生特异性反应，说明在病毒感染的过程中有抗VPl蛋白的抗体产生。因此利用重组蛋白GPV-VPl作为抗原，以制备出的单抗作为竞争抗体，可建立用来检Nd,鹅瘟血清抗体的竞争ELISA，并为小鹅瘟的诊断提供一种辅助检测手段。 东北农业大学农学硕士学位论文5结论1．制备了5株抗重缓GPV-VPl的杂交瘸细胞系，分别命名为3A8、3G4、4811、5G6、5C11，分泌的单克隆抗体亚型分别为IgA、lgGl、IgG2b、IgGl、[gGl型，轻链均为1c链。5株杂交瘤细胞在体外长期培养和长期冻存时都能稳定地分泌抗重组GPV-VPI单克隆抗体。2．利用包含整段VPl蛋白的重叠短肽对抗GPV-VPI的单克隆抗体进行westernblot的鉴定，初步证实了单克隆抗体481l、5G6、5C11的识别表位存在于GPV-VPl的92—123aa内；3A8识嬲麓表位存在于111．136aa逡；3G4识别的表馒限定在lll。145aa内。30 致谢致谢值此论文完成之际，首先向尊敬导师王君伟教授表示崇高的敬意和衷心的感谢。导师渊博的学术知识、严谨的治学态度、科学的思维方法以及和蔼朴实、宽厚待人、高风亮节的品德境界，更令学生终身难忘。感谢导师多年来给予我生活与学习的无私帮助，给了我宝贵的学习机会，使我在科研与为人上渐渐成熟起来。衷心的感谢东北农业大学预防兽医学教研室的李一经教授、师东方教授、马波老师、葛俊伟老师、李海滨老师、任晓峰老师、师守信老师等在课题完成过程中的关心和帮助。感谢已走向工作岗位的于天飞博士在课题完成中所给予的指导和鼓励，感谢同一课题组的硕士研究生仇铮、鞠环宇、郭鹭在试验中提供的无私帮助。感谢一同攻读学位的硕士研究生高明春、金红岩、肖妙、呼鑫鑫、张雅为、张扬、刘峰源、孙仰峰等在生活和学习上给予的无私帮助和鼓励，和你们相伴的三年将使我终生难忘。感谢同一教研室的博士研究生李勐、于志丹、霍慧、李爽、赵妍；硕士研究生张智慧、王兆鹏、杨雪晶、刘思莹、葛兰云、王巍、李丹、卫娜、乌伊汗、刘晓玫、尚绪增、魏伟、李岩、张润祥等在试验中给予的帮助和鼓励。感谢已经毕业走向工作岗位的李洪涛博士、郭东华博士、吴明福博士、邢明伟博士、孙进华博士、靳淼博士、齐岩硕士、藏玉婷硕士、周丽硕士、贾珊珊硕士，汤海宽硕士，付海兵硕士等，感谢他们在试验开展之初所给予的指导和鼓励。最后，向我的父母致以衷心的感谢，没有你们对我学业上的支持和生活上的关心，就没有我的今天。感谢我的朋友在攻读学位期间的有力支持，感谢在攻读硕士期间所有给予过我帮助的人。31 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