抗鹅细小病毒vp1蛋白单克隆抗体制备及其识别抗原表位初步鉴定

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1、东北农业大学硕士学位论文抗鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其识别抗原表位的初步鉴定姓名：李俚申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王君伟20080620摘要摘要鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)属于细小病毒科(parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)，是鹅纲小病毒瘸(Gooseparvovirus)酶病原体。鹅细小病毒病又称小鹅瘟(GoslingplagueGP)，其主要侵害30日龄以内的各种雏鹅和雏番鸭，是一种急性、高度接触性、败血性传染病。该瘸具有传染性强、瘸

2、死率高的特点，以目前仍是危害养鹅业发展的最主的要传染病之一。由予本病长期困扰着养鹅监，因此建立一种准确、简便的诊鞭方法懿对该瘸作出早期的诊断已成为迫切的需要。细小病毒具有基因组短小，衣壳结构简单的特点，所以它{

3、’】的无关抗原成分更易于筛除，并利于将其制造成亚单位疫苗和重组诊断抗原。鹅细小病毒VPI蛋白(GPuVPl)是鹅细小病毒的主要结构蛋白，它在病毒感染细胞的过程中起着重要的作用，通过单克隆抗体技术对GPV．VPl的抗原表位进行研究，不仅有助于了解其抗原结构与功麓的关系，琵显对该瘸的诊断以及设计安全有效的基因工程

4、袭位疫苗等具有重要的意义。本研究首先构建了带有表达载体pET30a(+)的重组GPV-VPl，在大肠杆菌原核表达系统中避行了表达，裁用GPV感染鹅的盘清对表达产豹进行Westernblot分橱，证实表达的融合蛋囱具有较好的反应活性。然后以纯化后的GPV-VPl融合蛋白为免疫抗原，免疫BALB，c小鼠，并以其作为为筛选抗原，建悫检测抗GPV-VPl蛋白单克隆抗体的ELISA方法。按常规方法进行敲合，间接ELISA方法进行筛选，采焉有限稀释法，经过三次竞隆，最终共获得了5株针对VPl蛋白的杂交瘤细胞系(命名为3A8、3G

5、4、481l、5G6、5C11)，平均染色体数为9l圭7对，分泌的单巍隆抗体亚型分别为19A、IgGl、IgG2b、IgGl、lgGl型，轻链均为1c链。用5株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别与纯化后的重组融合蛋白GPV-VPl进行Westernblot试验，在GPV-VPl蛋良处均出现明显的特异性条带，说明这5株单抗识别的抗原表位为线性抗原表位。为了进一步分析这5株单抗的抗原表位，用本实验室制备的GPV-VPl截短表达的19个重组鬣自，分舅

6、l进行Westemblot的鉴定，结栗显示有3株单抗麓够特异性识别VP(81

7、．136)，1株单抗能够特异性识别VP(124．161)，另一株既能识别VP(81．136)又能识别VP(124。161)。利用覆盖VP(81．161)氮基酸序列进一步截短表达的重组蛋白对这5株肇抗再次进行鉴定，根据结果初步确定了5株单抗抗原表位的主要功能区域。本研究制备了针对GPV结构蛋白的单抗，并初步对其相应抗原表位区域进行了鉴定，对进一步了解GPV的分子抗原特性，建立基于抗原表位水平的特异性诊断方法以及设计新型的GPV亚单位疫苗等其有重要意义。关键词：鹅细小病毒；VPl蛋白；单克隆抗体；抗原表位Abstract

8、詈詈詈鼍攀皇鲁詈IIII,————一IIII—I——————I—————I—————————————i曼ii皇曼!!鼍懋皇曼皇曼鼍麓皇曼曼!皇燃篁曼!!詈鼍鼍鲁詈詈詈鼍嬲皇曼皇詈詈黑麓皇詈置詈鼍懋皇曼!!篁燃MonoclonalAntibodiesPreparationandBcellEpitopeDeterminationofMajorStructuralAntigenofGpVAbstractGooseparvovirus(GPV)belongstoParvovirinaeDependovims．GPVinfec

9、tionalsoknown鲢gooseplaque，causesdomesticgoslingsandMuscovyducklingsinfectedundertheageof20days。GPVinfectionisakindofacutehigh-contagiousseptico—infectiondisease．Ithasthefeatureofhi曲mortalityandhighcontagiousness，SOitcanstillbeoneofthemostjeopardizedcontagiousdi

10、sease．OwningtothehindrancetodevelopmentofgooseculturlalindustrybecauseofthediseaSe，thereneedsaccurate，convenientdiagnosticmethodforearlydiagnosisavoidingtheinterferenceofmat