磷酸钙转染法.doc

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1、磷酸钙转染法材料：质粒DNA指数生长的真核细胞2MCaCl22×HBS（pH7.05）配方:2×HBS(pH7.05)：900ml超纯水中加入NaCl16.3g,KCl0.74g,Na2HPO40.214g，Glucose2.4g和HEPES10g，调pH至7.05，定容至1升，过滤（0.2μm滤膜）后储存于4℃备用。方法：1.细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60mm组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40~70％）。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8~24h,当

2、细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2h换液（用4ml新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。2.制备磷酸钙－DNA沉淀：以60mm组织培养皿用500μl反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA（总量4~10μg为佳），再加入31μl2MCaCl2，使三者总体积达到250μl，混匀。将等体积2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置2min后，立即将这500μl的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色

3、，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％CO2的37℃温箱孵育。8h后吸去培养基与DNA沉淀，加入5ml37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，16-40h观察其转染效率。