烟草瞬时转化.doc

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1、本氏烟草（N.benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。4、用2mlInductionmedium（withoutAS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。5、重复步骤4。6、所得沉淀用

2、1mlInductionmedium重悬。7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂：Inductionmedium：MES-KOHPH5.710nMMgCl210mMAS200uM推荐提前配制母液1MMES-KOHPH5.7过滤灭菌，4℃保存，用时稀释1

3、00倍。1MMgCl2过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。0.2MAS溶于DMSO有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。