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1、第33卷第5期北京化工大学学报Vol.33,No.52006年JOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGY2006重组人胰岛素及C肽的分离纯化＊冷雪陈劲春董鹏(北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029)摘要:对基因工程构建的含重组人胰岛素和C肽基因的毕赤酵母工程菌进行诱导表达,工程菌用甲醇诱导72h后,离心去除菌体,上清液经中空纤维膜超滤后SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱层析,0～400mmol/LNaCl梯度洗脱,得到纯度大于92%的重组人胰岛素原。经Lys-C酶和羧肽酶B酶切后,SephadexG-25柱分离
2、,得到了重组人胰岛素和C肽。关键词:重组人胰岛素;C肽;毕赤酵母;分离纯化中图分类号:Q786胰岛素是治疗糖尿病的特效药物,含51个氨基重组人胰岛素在A链的N端和B链的C端,通过两酸,由A和B两条链构成。C肽是胰岛素A链和B个Lys连接C肽,B链的N端连接有6个His构成[8]链之间的连接肽,为31个氨基酸序列的单链化合的短肽来提高表达量。经10L发酵罐实验,目的物。含有C肽的胰岛素称为胰岛素原,酶解后,胰蛋白产量可达280mg/L。纯化后的重组人胰岛素岛素原裂解成为胰岛素和C肽。在研究胰岛素的原经Lys-C酶和羧肽酶B酶切后,得到重组人胰岛结构和生物功能的关系中,过去人们一直认为C肽素
3、和C肽。无生物活性,仅在胰岛素二硫键正确配对时起作用,1材料和方法在20世纪80年代至90年代,科学家对不同长度的C肽进行了研究,发现C肽在胰岛素A、B链正确配1.1菌种对时,可能只起柔性连接肽作用。在很多重组胰岛重组毕赤酵母基因工程菌由本实验室构建并保[1-3]素的研究中人们都重新设计C肽。但近年很多存。研究肯定C肽具有多种生物学作用,用C肽对胰岛1.2培养基[4]素依赖性病人进行替代治疗已有临床报道;在治种子培养基(YPG):1g酵母提取物,2g大豆蛋疗和预防糖尿病并发症方面,C肽也具有很重要的白胨,4g甘油溶于100mL去离子水中;基础盐培养[5]作用。基以及微量元素配方参照文献[
4、9]。毕赤酵母表达系统在重组胰岛素的生产中已显1.3试剂示出了它的优越性,目前在国外已经展开了广泛的中空纤维膜超滤装置购自天津膜天膜公司;SP-研究和应用,但在国内还刚刚起步。它具有表达稳SepharoseFastFlow和SephadexG-25购自Pharma-定、易于高密度培养、表达产物分泌到胞外和易于分cia公司;Lys-C酶和羧肽酶B购自Sigma公司;其他离等特点,广泛应用于外源蛋白的生产。在用毕赤试剂均为国产分析纯。酵母生产人胰岛素的过程中,常用的方法是在毕赤1.4基因工程菌的诱导表达[6]酵母中表达猪胰岛素前体,或在毕赤酵母中表达将毕赤酵母基因工程菌接种于YPG培养基中,
5、[7]胰岛素原或胰岛素前体时,缩短C肽,去除Thr在30℃和200r/min地振荡条件下培养过夜,以B30,来有效地提高分泌表达量。本实验室设计的10%的接种量转接到基础盐培养基中,30℃、200r/min振荡培养。其间取样检测甘油浓度,待甘油耗收稿日期:2005-11-07尽,饥饿1h开始诱导,诱导期每12h补加甲醇进行第一作者:女,1979年生,硕士生诱导,诱导72h时停止发酵。离心去除菌体,上清＊通讯联系人液以凝胶浓度为16.5%的SDS-PAGE进行电泳分E-mail:jingchunchen@hotmail.com析。第5期冷雪等:重组人胰岛素及C肽的分离纯化·31·1.5目的
6、蛋白的分离纯化PAGE电泳分析,可知在200mmol/L处的吸收峰为发酵上清液用15k(膜截留分子量在15k以上)目的蛋白。HPLC分析,纯度可达92%以上(图3)。中空纤维膜超滤除去分子量15k以上的杂蛋白,再过6k中空纤维膜超滤截流分子量6k以下的蛋白,脱盐浓缩。浓缩液上样于SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱,用紫外检测器于280nm处在线检测。20mmol/L(pH4.0)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗至吸光度A280基线为零,用含有0～400mmol/LNaCl的20mmol/L(pH4.0)柠檬酸缓冲液梯度洗脱,流速为4mL/min,收集吸收峰进行SDS-PAGE电
7、泳。HPLC分析纯度,色谱条件:流动相A(20%乙腈,0.1%三氟乙酸),流动相B(100%乙腈,0.1%三氟乙酸),检测波长为214nm,15min线性梯度洗脱,流动相B至80%。1.6酶切反应及重组人胰岛素和C肽的纯化图1发酵上清液的SDS-PAGE分析纯化的目的蛋白(重组人胰岛素原)按质量比Fig.1SDS-PAGEanalysisofthebrothduringtheinductiontime50∶1与Lys-C酶混合,25
