细胞免疫组化.pdf

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1、精品文档细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1.细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色定。2.PBS清洗标本3次各1min。3.冰丙酮固定15min(或4%多聚甲醛固定30min)。4.空气干燥5min。5.PBS清洗标本3次各2min。6.0.5%TritonX-100(DPBS配)孵育1次20min。7.PBS清洗标本3次各2min。8.3%H2O2（试剂A）孵育15min。9.DPBS清洗标本3次各2min。10.封闭血清孵育（试剂B）20min。11.一抗孵育（滴度1：200，湿盒）4℃过夜或37℃60min。阴性对照最好用一抗来源血清，

2、否则用PBS液12.PBS清洗标本3次各5min。13.二抗工作液孵育（湿盒试剂C）37℃30min。14.PBS清洗标本3次各5min。15.试剂D（湿盒）37℃30min。16、PBS清洗标本3次各5min。17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。1欢迎下载。精品文档18、蒸馏水洗2次1min。19、苏木素复染0.5~1min。20、自来水洗返蓝。21.梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。22.二甲苯透明2次3min。23、中性树胶封片。注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬

3、片须注意以下：a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、TritonX-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较

4、少。2欢迎下载。精品文档细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24孔，或6孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻

5、片上，由于液体的表面张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，到固定时细胞生长到80％左右比较合适。偶是在盖玻片上做的，首先细胞要爬的匀一些，象dongwp战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片3欢迎下载。精品文档背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。细胞爬片的保存和抗原修复问题总结1.细胞爬片可以用含叠氮钠PB

6、S液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!!0.04--0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!2.louischenwrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?!丢失3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20度保存4.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。4欢迎下载。精品文档5.丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。不要

7、固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会6.丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备用。7.(1)细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟(2)4%多聚甲醛固定，室温，20分钟(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好8.我

8、的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好9.细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固