生物药物白细胞介素.doc

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1、白细胞介素-2（别名：T细胞生长因子,TCGF；IL2）刘璇璇制药1403一、简单介绍白细胞介素-2是趋化因子家族的一种细胞因子。它是由多细胞来源（主要由活化T细胞产生），又具有多向性作用的细胞因子（主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化）；对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。可用于临床研究和肿瘤治疗。类型：糖蛋白；来源：主要由T细胞产生；作用方式：以自分泌和旁分泌方式发挥效应

2、；名词领域：免疫学它的一般性质为：1．IL-2的产生细胞IL-2主要由T细胞（特别是CD4+T细胞）有受抗原或丝裂原刺激后合成；B细胞、NK细胞及单核－巨噬细胞亦能产生IL-2。2．IL-2分子IL-2分子量为15KD，是含有113个氨基酸残基的糖蛋白，在人类由第4号染色体上的一个基因编码。IL-2具有一定的种属特异性，人类细胞只对灵长类来源的IL-2起反应，而几乎所有种属动物的细胞均对人的IL-2敏感。3．IL-2受体（IL-2R）IL-2的靶细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞及单核－巨噬细胞等。这些细胞表面均可表达IL-2R。IL-2R包含3条多肽链：1条为α链，

3、分子量55KD；1条为β链，分子量75KD；另1条为γ链，分子量64KD。α链的胞内区较短，不能向细胞内传递信号，而β链和γ链的胞内区较长，具有传递信号的能力。3种肽链单独与IL-2结合亲和力较低，只有同时表达才能产生高度亲和力。二、生产工艺材料和方法1.制备粗制IL2无菌采血，肝素抗凝，用RPMI1640按1∶1将血液稀释，然后重层于菲可液面上，以1500r/min离心30min，取白细胞层，用RPMI1640洗2次，按1~3×10细胞/ml浓度加入10%胎牛血清RPMI1640，注入一装有磁棒的大瓶中，置37℃搅拌培养4天，取出，分装于50ml离心管中，1500

4、r/min离心20min，弃上清液，将细胞悬浮于1%胎牛血清RPMI1640培养液中，使细胞浓度为106细胞/ml。同时加入纯质PHA1~2μg/ml以及多种B淋巴母细胞株，使其浓度为106细胞/ml，37℃搅拌培养18~24h后，取出以1500r/min离心30min，取上清，用045μg滤膜过滤除菌，滤液即为粗制IL2。制备精品IL-21、硫酸铵沉淀与真空浓缩透析：在4℃下将硫酸铵粉末按50%饱和量加入上述粗制IL2中，搅拌2h，12000g离心30min，取上清液，再加入80%饱和硫酸铵，4℃过夜，次日以12000g离心30min，弃上清液，将沉淀溶于01%P

5、EG6000的1∶2PBS溶液（pH值73）中，置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量。2、SephadexG100凝胶过滤：用2×180cm的过滤柱及PBS（同上），以80ml/h流速过滤。将各管洗脱液用紫外分光光度计280nm检测其OD值。同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其OD值，绘出IL2及标准蛋白OD值的曲线。将各管洗脱液过滤除菌后，作白细胞生物活性试验，按试验结果绘出曲线，找出具有最高IL2活性的几管洗脱液，混合后，作下一步精制。3、BlueSepharose层析：将上述混合后的洗脱液加入BlueSepharose柱中，流速约15ml

6、/h，按每管10ml收集流出液，当样品全部流出柱中以后，用上述PBS洗涤样品柱，再用梯度NaCl溶液（从0075mol/L至06mol/LNaCl的PBS溶液）洗脱，按2ml/管收集洗脱液。NaCl溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制。洗脱完毕后，作各管OD值及NaCl浓度的测定。各管洗脱液过滤除菌后，作出生物活性测定。将峰值前后的数管洗脱液混合，即为精制的IL2。置-20℃冰箱保存。检定1、活性测定用10%胎牛血清RPMI1640将上述IL2稀释为50%、25%、125%、625%，而后再将每个百分浓度以及100%浓度的IL2倍比稀释，自1∶2至1∶128，将每个

7、稀释度分别加入多孔板的孔中，每孔01ml。然后取CT6细胞株（小鼠的IL2依赖性T细胞株），调整浓度为106细胞/ml，每孔加入01ml，同时用培养基代替IL2作对照。将多孔板培养24h后，取出按每孔1μci的浓度加H3标记胸腺嘧啶核苷继续培养4h。取出后用MESHⅡ细胞收集器过滤洗涤细胞，用β计数器测定各孔细胞的cpm。必要时按此结果绘出曲线，确定活性单位。2、蛋白含量测定采用分光光度计，分别测得OD280及OD260，然后按下式计算：蛋白含量（mg/ml）=（144×OD280-075×OD260）×稀释倍数。3、毒性试验及细菌检查参考胸腺肽制备部分。三、技