瞬时基因表达技术

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1、稳定的基因表达技术是生物生产系统的金标准。然而，其中的转染过程却耗费了大量时间。因此，瞬时基因表达方法为基因－蛋白质研究提供了一种快速、方便的方法。相对于稳定的基因表达方法，短暂基因（蛋白质）表达方法在得到基因后，只需10天就可以获得试验结果，而前者通常需要6个月。缺点则是，瞬时转染得到的蛋白质产物保存时间较短，只能持续数天或2周。这是因为瞬时转染中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不与基因组染色体相整合，当细胞复制后，诱导的性状消失。药物蛋白质为了开发一种药物，在药物研发期间，生物技术公司可能会像小分子药物开发者一样，准备成百上千种目标蛋白质，相当于建立了一个

2、模型库。因为必须对每一个发现阶段的蛋白质进行快速生产和测试，所以，药物开发者通常采用瞬时基因/蛋白质表达技术。Genentech公司资深科学家TinaEtcheverry博士说：“在一个特定的开发项目中，瞬时表达系统是研究大量蛋白质的最好方式。”在研究人员确定一个临床候选药物之后，仍然需要蛋白质表达技术。研究人员可能希望去构建不同的动物模型，或者去生产蛋白质试剂，用于分析蛋白质产物。确定目标之后，为了提高有效性，研究人员将进一步采用亲和成熟方法进行研究，这意味着需要更多的蛋白质。Genentech公司的实验表明，瞬时表达系统应用范围很广，从培养皿到100升的生物反应器，从灵

3、长类到其他物种的研究。时下，大规模的瞬时表达很少，不是因为缺乏技术，而是因为生成基因和试剂的成本太高。对于稳定的基因转染也存在同样的问题。例如，用于基因治疗的腺病毒和转染的哺乳动物细胞需要分别进行培养和检测。研究人员需要制作、扩增并纯化病毒载体，而且要保证这些病毒不被污染。通过利用简单的载体，像磷酸钙和阳离子类脂，瞬时表达技术不但降低了成本，而且还加快了相关腺病毒的生产。扩大途径作为一名世界一流的细胞培养专家，瑞士联邦技术研究所的FlorianWurm博士对瞬时基因表达具有浓厚的兴趣，尤其是对哺乳动物细胞。Wurm参与了Genentech公司“一种改良的组织纤维蛋白溶酶原激

4、活剂TNKase-TPA”的项目开发工作。最后，获得了成功，TNKase-TPA通过了审批，它是基因中数百种密码子置换的结果，蛋白质中的每一个氨基酸变化都要分开表达，因此工程量浩大。在这个项目中，Wurm团队需要比稳定转染更多的TPA种类。因此，他们变成了瞬时基因/蛋白质表达“专家”，不仅仅产生大量实验用蛋白质，而且也生产临床前产品。Wurm博士一直想扩大规模，“瞬时表达蛋白质和提取DNA几乎一样快。那为什么不能大规模生产呢？”Wurm团队用磷酸钙作为基因的递送载体，同时进行2~3升的瞬时基因表达。另外，他们在洛桑实验室采用生物反应器进行了100升的瞬时转染实验。Genen

5、tech公司继续去完善几种基于阳离子脂质体的基因递送方法，目前，也能处理数百升短暂转染细胞培养。虽然与稳定转染相比，短暂转染的产量还很低，但是该方法有一天一定可以用于大规模生产。关键是发现高效蛋白质，比天然材料效率更高的蛋白质。例如，每毫克TNKase-TPA的效率是同等剂量TPA的3倍，而且安全性能相似。Wurm博士相信，通过诱变作用进行改良，应该能发现比TPA效率高100倍的蛋白质。只需要添加1%的原溶液，天然蛋白质的生物活性就可以提高100倍。可以在小型生物反应器中进行蛋白表达，不需要大型设备，还可以省略下游纯化过程。但是，他也指出，研究计划可能会因为某些原因而搁浅。

6、Wurm认为，生物技术的经济学关键是效能。到目前为止，单克隆抗体只能在培养基中生产，产量低而成本高。许多单克隆抗体生产厂家只能生产几百公斤的产物，而且很多剂量因不能特异性靶向肿瘤细胞而白白浪费了。“如果我们能改善单克隆抗体的效价，患者每天只需要几毫克药物，剂量减少1,000倍，这样只需要生产少量药物就可以满足市场需求。”NRCC的YvesDurocher也这样认为。突破100升生产能力的最大问题是产生足够的质粒DNA。对基因治疗而言，在优质生产规范（GMP）条件下，有技术，有材料，生产所需要的DNA很容易。对瞬时基因表达的机理还没有彻底弄清楚。目前知道的是，如果基因能进入细

7、胞，就能被核糖体所利用。“基因如何进入细胞”这一问题无关紧要。磷酸钙介导的转染（磷酸钙与DNA混合）会极大降低载体的成本。此外，阳离子脂质体可以穿过细胞膜并允许基因进入细胞。教各位老师，有知道瞬时表达的概念？具体内容？谢谢是指真核细胞的瞬时表达吧！外源基因进入宿主细胞表达蛋白但未整合到其染色体中稳定传代。一般转染48-72小时分析产物即为瞬时表达。稳定表达要经抗性筛选