高效液相色谱法测定兽药硫酸粘菌素及其制剂的含量

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2009年第3《湖北畜牧兽医》月刊邮发代号38-352HUBEIJOURNALOFANIMALANDVETERINARYSCIENCES硫酸粘菌素（ColistinSulfate是由粘杆菌发酵产生的由多种氨基酸和脂肪酸组成的碱性多肽类抗生素，对革兰氏染色阴性菌有很强的抗菌作用，并且具有高效、低毒、低残留等特点，在畜病防治中主要用于由大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌引起的肠道疾病。其含量测定《中国兽药质量标准》2003年版规定为生物效价测定方法，但其方法具有操作步骤复杂,检测周期长,影响因素多等缺点。随着兽药的发展，检验制度的完善，为了满足生产单位与监督检验机构逐渐增加的检验量，本文利用高效液相色谱法（HPLC检测原理,建立了快速、准确的HPLC测定兽药硫酸粘菌含量的检测方法。1材料与方法 1.1主要仪器与试剂Waters2690高效液相色谱仪，2487紫外检测器，硫酸粘菌素标准品（购自中国兽医药品监察所乙月青为色谱纯，其余试剂均为分析纯，硫酸粘菌素原料、可溶性粉和10%硫酸粘菌素预混剂均为湖北兴鼎生物制药公司提供（均已用生物效价法测定其含量。1.2实验方法1.2.1色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，检测波长215nm流速1.0mL/min,柱温30⑤C,进样量20仙L[1]流动相0.1mol/L无水硫酸钠：乙月青=4：1,用磷酸调酸碱度至pH2.4。1.2.2测定方法分别取标准品和样品适量，精密称定，置相应的容量瓶中用流动相稀释至刻度，摇匀，分别制成含粘菌素0.5mg/mL的待测工作液，预混剂按规格精密称取适量加流动相适量超声助溶5min，冷却，定容至刻度，同法测定，记录色谱图1〜4。2结果分析2.1方法适用性试验收稿日期：2009-02-05作者简介:朱曦（1974-,女，安徽定远人，助理工程师，主要从事兽药、畜产品、饲料检验及微生物发酵工程工作，（电tS027-********（电子信箱zhuxi@0819sina.com。 高效液相色谱法测定兽药硫酸粘菌素及其制剂的含量朱曦,田慧云，徐军（湖北省兽药监察所，武汉430070摘要:应用高效液相色谱法（HPLC进行检测，在色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温306C,流动相:无水硫酸钠（0.1mol/L:乙月青=80:20以磷酸调pH至2.481,检测波长215nm进样量20^L的条彳^下，硫酸粘菌素峰与杂质峰分离良好变异系数（RSD小于1.5%。结果表明，HPLC法能快速、准确的测定兽药硫酸粘菌素的含量，并能够满足兽药硫酸粘菌素其他剂型的含量测定。关键词：硫酸粘菌素；高效液相色谱;含量测定中图分类号：S859.79;O657.7+2文献标识码：A文章编号:1007-273X（200903-0007-02图4预混剂图谱图1标准品图谱图2原料药图谱图3可溶性粉图谱时间/min时间/min 时间/min时间/minAUAUAUAU82009年第3期15Ac^dcmkk，ur）】ulElcctioniiHUBEIJOURNALOFANIMALANDVETERINARYSCIENCES 取原料、可溶性粉及预混剂3种样品进行方法适用性实验，每个样品选一个浓度水平，各制备5份，每份进两针，取其平均值。见图谱1~4表明5种主要物质的在不同时间出峰,样品峰保留时间与标准品峰保留时间一致，色谱峰峰形较好。说明所测物质相同。各峰能完全分离成E1、E2、E3、E1-1、E1-7MOA等5个峰，相邻之间的分离度分别为2450、8008、4134、1850，表明各峰之间分离良好。积分基线在同一水平，表明其积分稳定，并且与杂质峰完全分离。各峰系统适应性良好数据见表1。从表2和表3中根据峰面积所得含量测定结果与按《中国兽药典》2005年版一部生物效价法测定值一致，且最大变异系数（RSD为0.71%,表明其方法影响因素少，测定结果准确。2.1线性范围和精密度准确度在该试验条件下硫酸粘菌素标准溶液的浓度在0.1,0.3,0.5,0.7,1.0,1.5,2.0,2.5mg/mL#取10pL进样,t己录色谱图，以浓度（C,mg/mL为横坐标，峰面积（A为纵坐标进行线性回归，在0.3,0.5,0.7,1.0,1.5mg/mL范围内与峰面积呈线性相关性，线性回归方程为y=3258710.5x（r=0.9990以0.500mg/mL硫酸粘菌素标准溶液连续进样10次,峰面积 响应值的变异系数为0.4%。回收率:取各样品5个水平与可溶性淀粉相混匀，每个水平做5次重复以检测该方法的回收率，结果见表4,其原料浓度在0.5mg/mL时,原料回收率在98.0%以上，表明本试验过程中样品稳定性好，损失小，准确度高。3结论本试验建立了高效液相色谱法测定兽药硫酸粘菌素的含量，以上结果表明样品溶液与标准品溶液出峰时间一致，积分稳定，与杂质峰完全分离，系统稳定性好，HPLC法能够准确测定兽药硫酸粘菌素及其制剂的含量。HPLC法相对于生物效价法具有快速、准确、简便，能够批量检验等优点。此法适用于兽药硫酸木菌素的各类剂型，缩短了此药在实际生产的检验时间，为兽药生产品质控制提供了有力保障。参考文献：[1]BRITISHPHARMACOPOEIACOMMISSION.BRITISHPHAR-MACOPOEIA2008VOLUME1[M].London:theStationeryOfficeonBehalfoftheMedicinesandHealthcareProductsRegulatoryAgency(MHRA,2007.611-612.3.792906e+003 名称E2E3E1-1E1E1-7MOAUSP分离度2.450304e+0008.008058e+0004.133778e+0001.850270e+000对称因子1.144555e+0009.885051e-0011.201249e+0001.056013e+0001.025445e+000USP理论塔板数3.792906e+003 5.320977e+0034.446904e+0035.189700e+0034.870077e+003表2生物效价法测定结果名称标准品原料预混剂可溶性粉规格/Umg-1213441900010%(30000U/mg19000称样量/mg25.6752.74 52.810.33500.337752.6952.72定容体积/mL50.15100.21100.34100.50101.31100.11100.17标示量/%92.7992.1593.04 92.5392.1992.98表3HPLC法测定结果样品标小量/%92.4592.6792.1692.0792.49RSD/%0.1样品标小量/%92.9692.1692.7692.3792.2RSD/% 0.25样品标小量/%92.1193.3492.5693.7992.48RSD/%0.71硫酸粘菌素原料硫酸粘菌素可溶性粉硫酸粘菌素预混剂表4HPLC法的回收率浓度/mgmL-10.30.50.71.01.5回收率 /%98.899.898.196.996.4浓度/mgmL-10.30.50.71.01.5回收率/%96.598.898.396.2 95.0浓度/mgmL-10.30.50.71.01.0回收率/%98.098.998.696.395.1硫酸粘菌素原料硫酸粘菌素可溶性粉硫酸粘菌素预混剂【试验研究】母猪产后的卫生处理在母猪生产情况调查中发现，农村母猪饲养户对产后 母猪不注意卫生处理，极易引起母猪产后子宫炎、乳房炎、无乳综合征、产后热、破伤风、产后不食等诸多常见产科疾病，以致影响其繁殖机能，甚至被淘汰。注意母猪产后卫生处理，可以大大减少产后诸多病症的发生。方法如下：(1检查胎衣是否完全排出，胎衣数或脐带数是否与产仔数一致。对胎衣不下的母猪，可肌注乙烯雌酚10mg待子宫颈扩张以后，每隔30min肌注催产素30万IU,连注2~3次。确定胎衣完全排出后，向产道深部投放青霉素80万~160万IU。(2根据母猪具体情况采取具体消炎措施：①初产母猪、7d为一个万IU,每天注射2次。同时可向产道深部灌注温的0.1%的高钮酸钾溶液，直至恢复正常为止。对曾有产后患病史的经产母猪，也可按上述方法处理。②对正常顺产的经产母猪，每次按每千克体重肌注青霉素2万IU,每天注射2次，连续注射2d。消炎后的母猪，若1周后产道仍有脓液排出，可首先向其子宫内灌注微温的0.1%的高钮酸钾溶液200~300mL，同时肌注乙烯雌酚5mg使子宫颈扩张；隔30min左右肌注催产素30万IU,间隔30min注射1次，连续注射2~3次。同时肌注青、链霉素混合液，配合地塞米松全身治疗。也可向产道深部投放10%的葡萄糖生理盐水与青霉素80万~160万IU混合液100mL，每天投放1次，连续给药3d,效果极佳。③对母猪产 后消炎化瘀去滞后，若母猪胎衣仍不下，也可采取中草药拌料喂服。取新鲜益母草0.25kg、水1000mL,煎为300~400mL，候温后加入红糖0.2kg分早、晚拌料喂服母猪，连服3d,效果较好。（来源:猪病专业网!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"!!!!!!!!!!!!!!!!!