测序引物设计指南

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1、测序引物设计指南测序引物设计指南♦PCR引物设计方法：1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72

2、℃。GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核甘酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核甘酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。4.引物3'端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第6/5测序引物设

3、计指南3位易发生简并，会影响扩增的特异性及效率。1.引物3'端不能选择A,最好选择T。引物3,端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3,端最好选择To2.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3,端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）o降低引物及模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚噤吟或聚嗑嗟的

4、存在。尤其3,端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。3.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物及模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer及Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。6/5测序引物设计指南引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要

5、过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。1.引物5'端和中间4G值应该相对较高，而3，端4G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，4G值越大，则双链越稳定。应当选用5'端和中间4G值相对较高，而3'端4G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3'端的4G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的4G值可以用01igo6软件进行分析）2.引物的5，端可以修饰，而3'端不可修饰。

6、引物的5,端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5,端修饰包括:加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3Z端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构可能。3.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影6/5测序引物设计指南响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预

7、测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（^G。）小于58.61kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。1.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果及其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定，引物设计的选

8、择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做RealTime时，用于SYBRGreenl法时的一对引物及一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。♦总结：1）避免重复碱基，尤其是G.2）Tm=58-60度。6/5测序引物设计指南3）GC=30-80%.4）3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.5）正向引