青藏高原部分地区牦牛BVDV分子流行病学调查及基因组分析.pdf

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硕士学位论文题目青藏高原部分地区牦牛BVDV分子流行病学调查及基因组分析作者陈新诺完成日期2018年3月15日学科门类农学专业预防兽医学研究方向动物病原分子生物学指导教师张斌教授学院生命科学与技术学院授予学位日期年月日 MolecularepidemiologicalinvestigationandgenomicanalysisofyakBVDVinpartsoftheQinghai-TibetanPlateauByChenXinnuoATHESISSubmittedtoSouthwestMinzuUniversityinFulfillmentoftheRequirementsForMasterDegreeSupervisor:ProfessorZHANGBinCollegeofLifeScienceandTechnologySouthwestMinzuUniversityChengdu,610041,P.R.China 本论文由以下课题资助：“十三五”国家重点研发计划-牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究（2016YFD0500907）；四川省科技计划项目青年基金-应用病毒宏基因组学技术鉴定青藏高原地区牦牛犊腹泻病原（2014JQ0044） 原创性声明本人郑重声明：本学位论文成果是本人在西南民族大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归西南民族大学所有。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南民族大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本人同意学校根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等有关规定保留本人学位论文并向国家有关部门或资料库送交论文纸件或电子版本，允许论文被查阅和借阅；本人同意西南民族大学可以将论文的全部或者部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其它复制手段和汇编学位论文，同时授权中国学术期刊电子杂志社等单位将本论文收录到《中国优秀硕士学位论文全文数据库》、《中国博士学位论文全文数据库》等数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。导师签名：作者签名：日期：年月日日期：年月日 摘要牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）为单股正链RNA病毒，属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）。BVDV可存在于多种动物机体内并能够导致呼吸系统和消化系统疾病，在牛群及其周边环境中也普遍存在。BVDV进入机体后可造成持续性感染和免疫抑制，持续感染动物的血清抗体为阴性，却终身带毒并排毒，因此对养牛业及其他动物养殖业均造成了巨大的危害。在青藏高原地区，牦牛感染BVDV后导致腹泻，繁殖力降低，生长迟缓和继发感染其他疾病。近年来的流行病学调查显示，该病在西藏和青海地区均广泛流行。牦牛感染BVDV的情况十分普遍，但是关于牦牛BVDV分子方面的研究相对较少，因此，掌握青藏高原地区牦牛BVDV的病原流行情况和分子特征，对预防和控制该病具有重要的意义。本研究通过RT-PCR方法对青藏高原部分地区牦牛腹泻和临床健康的粪便样本进行BVDV的分子流行病学调查，并且从粪便样本中分离鉴定出两株CP型BVDV毒株；应用RT-PCR方法获得分离株的全基因序列，分析其遗传进化关系，取得的结果如下：1.2015-2016年青藏高原部分地区牦牛BVDV的分子流行病学调查及遗传进化分析2015-2016年从青藏高原部分地区（西藏、云南、青海、四川）采集牦牛腹泻和临床健康的粪便样本共计390份，利用RT-PCR方法对所采集的样品开展分子流行病学调查。结果表明BVDV在青藏高原地区普遍存在，总检出率为19.23%（95%CI=15.4%-23.5%）。腹泻样本的总检出率为25.52%（95%CI=19.5%-32.39%），临床健康的牦牛粪便样本的总检出率为13.13%（95%CI=8.8%-18.6%）（p=0.002），与近年来的流行病学调查结果相近。从四个地区平均的随机选取35份样本（14份来自临床健康牦牛和21份来自腹泻牦牛）分别基于5'-UTR，Npro基因和E2基因进行克隆测序，测序结果与GenBank中的参考序列进行比对，并基于5'-UTR，Npro基因和E2基因构建进化树，确定青藏高原部分地区2015~2016年牦牛BVDV流行的基因型和亚型。35份测序株的5'-UTR基因之间的核苷酸同源性为71.6%～100%，与其他BVDVI 毒株的核苷酸同源性为69.1%～90.9%。Npro基因之间的核苷酸和氨基酸序列分别为72.8%～100%和74.7%～99.3%，与其他BVDV毒株的Npro基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别介于74.9%～87.5%和82.3%～89.0%之间，E2基因之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为68.2%～99.9%和66.8%～99.5%，与其他BVDV毒株E2基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别介于68.2%～97.8%和67.4%～96.0%之间。基于5'-UTR构建的遗传进化树表明，31个测序株与BVDV-1d亚型的韩国毒株10JJ-SKR的遗传关系较近，但独自聚为一支，属于BVDV-1d亚型。Z3和Z6分离株与美国BVDV-1a亚型的GS5毒株遗传关系较近，而CB7和FB3分离株与德国BVDV-1b亚型的Osloss毒株遗传关系较近。即35个BVDV阳性样品属于BVDV-1a（n=2），BVDV-1b（n=2）和BVDV-1d（n=31），且基于Npro和E2基因构建的遗传进化树与5'-UTR的结果相同。结果表明，BVDV-1d为2015~2016年青藏高原部分地区牦牛BVDV主要的流行亚型。2.两株致细胞病变的BVDV毒株的分离鉴定将已经测序的35份牦牛粪便样本处理后接种于牛肾细胞（MDBK）中盲传3代后进行RT-PCR检测，BVDV检测均呈阳性，传至7代后，四川样本Z6（BVDV-1a）和青海样本DJ2（BVDV-1d）两个样本在70h左右出现细胞病变，病变初期细胞出现圆缩的现象，逐渐出现拉网状并开始脱落，正常MDBK细胞作为阴性对照没有发生病变，通过噬斑实验纯化病毒3次，RT-PCR检测为BVDV阳性。初步确定分离到了两株致细胞病变(Cytopathic，CP）型BVDV，分别命名为SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015。按Reed-Muench法对两株分离株的效价进行计算，结果显示，该两株分离株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015第9代细胞毒的TCID-8.11和10-5.81。通50/100µL分别为10过间接免疫荧光实验检测，显微镜下观察可见，两株分离株均出现了与阳性参考毒株OregonC24V相似的明亮的特异性绿色荧光，而阴性对照则未出现绿色荧光，说明成功分离到两株BVDVCP型毒株。3.SMU-Z6/1a/SC/2016与SMU-DJ2/1d/QH/2015的全基因扩增与遗传进化分析为了进一步了解牦牛源BVDV的基因组信息，根据GenBank已公布的BVDV全基因序列，利用Primer6.0软件设计10对引物，通过PCR方法扩增SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015的全基因序列，利用DNAstar等软II 件拼接序列。SMU-Z6/1a/SC/2016的全基因组长度为12,178bp，G+C含量为47.0%，ORF为11,703bp编码3884个氨基酸，5'-UTR和3'-UTR分别长300bp和175bp。SMU-DJ2/1d/QH/2015的长度为12,255bp，G+C含量为45.6%，编码3897个氨基酸，5'-UTR和3'-UTR分别长374bp和190bp。SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015与其他BVDV毒株的ORF的核苷酸及氨基酸同源性分别为68.4%〜89.8%/67.1%〜84.4%和71.8%〜97.3%/70.7%〜90.5%。在比较BVDV-1a毒株的序列中，SMU-Z6/1a/SC/2016的E2糖蛋白编码区变异情况比较大，与其他BVDV-1a毒株的E2基因核苷酸及氨基酸同源性分别为78.6%〜88.8%/72.9%〜78.3%。结果表明，SMU-Z6/1a/SC/2016的抗原性可能与其他BVDV-1a毒株具有明显差异，可能是新型病毒。而SMU-DJ2/1d/QH/2015与其他BVDV-1d毒株的E2基因核苷酸及氨基酸同源性分别为97.2%〜97.8%/95.7%〜96%，无明显差异。此外，CP型的病毒能够通过内部加工将NS2-3蛋白裂解为NS2和NS3蛋白，NS3蛋白是CP型BVDV在蛋白水平的分子标记。SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域与其他BVDV-1a毒株相比显示出明显的变化。我们确定了SMU-Z6/1a/SC/2016毒株NS3基因中存在49个有意突变和62个无意突变，导致47个氨基酸变化和1个氨基酸缺失。SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域的变异可能会影响毒力和毒株的致病性。而SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株的变化则相对较小。为了确定两个毒株之间的遗传进化关系，我们将SMU-Z6/1a/SC/2016与SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与25株BVDV毒株的E2基因及全基因建立系统发育进化树，分析显示SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与BVDV-1d型10JJ-SKR的同源性较高，亲缘关系较近，但SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株单独位于一支上，属于BVDV-1d型。SMU-Z6/1a/SC/2016分离株与BVDV-1a型OregonC24V和NADL的同源关系较近，位于同一分支上，而BVDVOregonC24V和NADL毒株均为毒力较强的CP型BVDV疫苗毒株。关键词：牦牛；BVDV；青藏高原；分子流行病学调查；基因组分析III AbstractBovineviraldiarrheavirus(BVDV)isapositive-strandedRNAvirusbelongingtothegenusPestivirusoftheFlaviviridaefamily，affectsmanyanimals,whichcausedrespiratoryanddigestivediseases.Itisalsocommoninherdsanditssurroundingenvironment.BVDVcancausepersistentinfectionandimmunosuppression.Theserumantibodiesofpersistentinfectedanimalsarenegative,buttheyarepoisonousanddetoxifyforlife,therebyresultinginmajoreconomiclossesinthecattleandotheranimalindustries.IntheQinghai-TibetPlateau,yakinfectedBVDVcancausesdiarrhea,reducedfertility,growthretardationandsecondaryinfectionwithotherdiseases.However,theprevalenceofBVDVinyakintheTibetanPlateauisnotfullyunderstood.Therefore,itisofgreatsignificancetomastertheepidemicsituationofBVDVandthegenomiccharacteristicsofyakBVDVtopreventandcontrolthedisease.Inthisstudy,amolecularepidemiologicalinvestigationofBVDVwasperformedindiarrhealdiarrheaandclinicallyhealthyfecalsamplesfromsomeregionsoftheTibetanPlateaubyRT-PCR.BVDVstrainswereisolatedfromfecalsamplesandthewholegenewereobtainedbyRT-PCR,theresultsobtainedareasfollows:1.MolecularepidemiologicalsurveyandphylogeneticanalysisofYakBVDVinpartsoftheQinghai-TibetanPlateauToinvestigatetheprevalenceanddominantsubtypeofBVDVinyaks,atotalof390fecalsampleswerecollectedfromyakswithdiarrheaandclinicallyhealthyintheQinghai-TibetanPlateau(Tibet,Yunnan,Qinghai,andSichuan)from2015to2016.RT-PCRwasusedtotargetthe5'untranslatedregion(UTR),whichdeterminedaprevalenceof25.52%(95%confidenceinterval(CI)=19.5%-32.39%)in192animalswithdiarrhea,and13.13%(95%CI=8.8%-18.6%)in198clinicallyhealthyYaks.ThissuggestedthatBVDVinfectionwasapotentialfactorofdiarrheainyaksintheQinghai-TibetPlateau.ToidentifythesubtypeofBVDVoftheQinghai-TibetPlateaufrom2015-2016,werandomlyselected35positivesamples(14fromclinicallyhealthyyaksand21IV fromanimalswithdiarrhea)forPCRamplificationandthesequencingresultswerecomparedwiththereferencesequencesinGenBankandconstructedbasedon5'-UTR,NproandE2genes.The5'-UTRshared71.6%-100%ntidentitieswitheachother,69.1%-90.9%withotherBVDVs.TheNproshared71.6%-100%ntidentitieswitheachother,69.1%-90.9%withotherBVDVstrains.ThenucleotideandaminoacidsequencesofNprogenewere72.8%-100%and74.7%-99.3%,respectively.ThenucleotideandaminoacidhomologyofNprogenesequencewithotherBVDVstrainswere74.9%-87.5and82.3%-89.0%,respectively.ThenucleotideandaminoacidsequencesofE2genewere68.2%-99.9%and66.8%-99.5%,respectively.ThenucleotideandaminoacidhomologyofE2genesequencewithotherBVDVstrainswere68.2%-97.8%and67.4%-96.0%respectively.Thephylogenetictreewasconstructedbasedon5'-UTRshowedthatsampleswerebranchedintoanindependentphylogeneticclusterandweremorecloselyrelatedtoBVDV-1dstrain10JJ-SKR(Fig.2a),indicatingthatthe31samplesbelongedtoBVDV-1d.SamplesofboththeZ3andZ6isolatesweregroupedwithintheBVDV-1astrainGS5cluster,butwerelocatedinauniquelineage,whereassamplesofbothCB7andFB3isolateswerecloselyrelatedtoBVDV-1bstainOsloss.Thus,thesefindingsdemonstratedthatthe35BVDV-positivesamplesbelongedtoBVDV-1a(n=2),BVDV-1b(n=2),andBVDV-1d(n=31).WeshowedthatphylogeneticanalysisofNpronucleotideacidsequencesandotherBVDVsproducedsimilarfindingstotheanalysisofthe5’-UTRanalysis.TheresultsshowthatBVDV-1disthepredominantsubtypeofBVDVamongcalvesinpartsoftheTibetanPlateaufrom2015to2016.2.IsolationandidentificationoftwostrainsofcytopathogenicBVDVstrainsToisolatethevirus,thirty-fiveofBVDV-positivefeceswereprocessedandusedtoinoculatetheMDBKcells.After3generationsofblindtransmission,allsampleswerepositivebyRT-PCR.After7passages,bothspecimensofZ6fromSichuanregion(BVDV-1a)andDJ2fromQinghaiprovince(BVDV-1d)wereobservedthetypicalCPEsinabout70hr.Itshowedthattheinfectedcellshadaroundedappearancewithanincreasedrefractionintheearlystageofthelesion.ViruseswereV purifiedthreetimesbyplaqueassayandRT-PCRtestpositiveforBVDV.Theisolatedviruseswereinitiallyidentifiedastwocytopathic(cp)BVDVstrainsSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015.ThetitersofthetwoisolateswerecalculatedbytheReed-Muenchmethod.TheresultsshowedthattheTCID50/100μLofthe9passagesstrainsofthetwoisolatesSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015were10-8.11/100µLand10-5.81/100µL,respectively.Toconfirmtheisolatedvirus,theindirectimmunofluorescenceassay(IFA)wasperformedbyBVDVpolyclonalantibody(VMRD,USA).ThespecificimmunofluorescentsignalsweredetectedinthecytoplasmofinfectedcellsusingBVDVpositiveserumantibody,whereasnoimmunofluorescentsignalwasdetectedinthemockMDBKcells.TheisolatedvirusesweredesignatedasSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015,whichbelongedtocytopathic(cp)BVDVstrains.3.GenomeamplificationandphylogeneticanalysisofyakBVDVisolatesSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015Tofurtherunderstandthegenomicinformationofthepurifiedviruses,wedesigned14differentpairsofprimerstoamplifytheSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015.ThecompletegenomeofSMU-Z6/1a/SC/2016was12,178bpinlength,witha47.0%G+Ccontent.Basedonthesequenceanalysis,thevirushadalargeORFof11,703bp,whichencodeda3,884aalongpolyproteinprecursor,andwasflankedbya300bplong5’-UTRanda175bplong3’-UTR.Inaddition,theSMU-DJ2/1d/QH/2015was12,255bpinlength,witha45.6%G+Ccontent,whichcontainedoneORFencodinga3,897aa,andwasflankedbya374bplong5’-UTRanda190bplong3’-UTR.ThegenomeorganizationwassimilartootherBVDV,containing4structuralproteinsand7non-structuralproteins.ComparedtothatofotherBVDVstrains,thepairwisent/aaidentitiesofSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015genomesrangedfrom68.4%-89.8%/67.1%-84.4%and71.8%-97.3%/70.7%-90.5%forORF,respectively.IntheBVDVgenome,theE2glycoproteincodingregionisconsideredasoneoftheleastconservedregionsandplaysakeyroleininducinganimmuneresponseVI againstviralinfections.ComparedtothecodingsequenceofBVDV-1astrains,theE2glycoproteincodingregionofSMU-Z6/1a/SC/2016exhibitedthehighestdegreeofdivergenceandshared78.6-88.8%nt/72.9-78.3%aaidentities.InSMU-DJ2/1d/QH/2015,theE2had92.7-97.8%nt/95.7-96%aaidentitiestootherBVDV-1dstrains.TheseresultssuggestedthattheantigenicityofSMU-Z6/1a/SC/2016mighthavetheobviousdifferencetootherBVDV-1astrains,indicatingthatthevirusmaybeanovelvirus.Furthermore,theNS3regionofSMU-Z6/1a/SC/2016exhibitedobviousvarietycomparedtootherBVDV-1a.Weidentified109nucleotideacidmutationsintheNS3geneofSMU-Z6/1a/SC/2016strain,consistingof49synonymousmutationsand62non-synonymousmutations,leadingto47aachangesandoneaadeletion.Todeterminethegeneticrelationshipofthetwoisolates,phylogeneticanalysiswasperformedbyanalyzingthecompletegenomicandE2sequencesoftwostrains.TheresultsindicatedthatSMU-Z6/1a/SC/2016wasclusteredwithintheBVDV-1astrainGS5cluster,andSWU-DJ2wasgroupedwithintheBVDV-1dstrainBJ1201clusterbutwerelocatedinauniquelineage.ThehomologousrelationshipbetweentheSMU-Z6/1a/SC/2016isolateandtheBVDV-1aOregonC24VandNADLwasonthesamebranch,whiletheBVDVOregonC24VandNADLstrainswerebothhighlyvirulentCPtypeBVDVstandardvirusstrains.Keywords:yak；BVDV；Qinghai-TibetPlateau；molecularepidemiologicalsurvey；genomicsVII 目录摘要.........................................................................................................IAbstract...................................................................................................IV第1章牛病毒性腹泻病毒的研究进展..................................................11.1牛病毒性腹泻病毒的概述................................................................................................11.1.1病原学.....................................................................................................................11.1.2BVDV编码的主要蛋白及其功能..........................................................................21.2BVDV的国内外流行现状................................................................................................41.3BVDV的遗传与变异情况................................................................................................51.4小结.....................................................................................................................................7第2章牦牛BVDV的分子流行病学调查和遗传进化分析................92.1材料与方法........................................................................................................................92.1.1临床样本.................................................................................................................92.1.2试验仪器...............................................................................................................102.1.3主要试剂及其配制...............................................................................................112.1.4引物的设计与合成...............................................................................................122.1.5RNA的提取与cDNA的合成..............................................................................122.1.6PCR扩增与测序...................................................................................................132.1.7进化关系分析.......................................................................................................142.2结果..................................................................................................................................152.2.12015~2016年青藏高原地区地区牦牛BVDV分子流行学调查........................152.2.2根据BVDV5'-UTR基因的分子特征研究.........................................................172.2.3根据BVDVNpro基因的分子特征研究............................................................192.2.4根据BVDVE2基因的分子特征研究................................................................202.3讨论..................................................................................................................................242.4小结..................................................................................................................................26第3章牛病毒性腹泻病毒的基因组研究............................................273.1材料..................................................................................................................................28 3.1.1病料采集背景.......................................................................................................283.1.2细胞与毒株...........................................................................................................283.1.3主要试剂及其配制...............................................................................................293.1.4试验仪器...............................................................................................................303.2方法................................................................................................................................303.2.1引物的设计与合成...............................................................................................303.2.2样本的处理...........................................................................................................313.2.3病毒的分离培养...................................................................................................313.2.4病毒的噬斑纯化...................................................................................................323.2.5间接免疫荧光检测...............................................................................................323.2.6病毒毒价测定.......................................................................................................333.2.7病毒RNA的提取与cDNA的合成....................................................................333.2.8RT-PCR扩增.........................................................................................................343.2.9RT-PCR产物克隆与测序.....................................................................................343.2.10序列的拼接和分析.............................................................................................363.3结果..................................................................................................................................363.3.1病毒的分离...........................................................................................................363.3.2病毒的噬斑纯化...................................................................................................373.3.3间接免疫荧光检测...............................................................................................383.3.4病毒TCID50的测定.............................................................................................393.3.5各片段的PCR扩增与纯化.................................................................................393.3.6序列拼接...............................................................................................................403.3.7分离株基因型鉴定及系统发育树分析...............................................................413.3.8NS2-3蛋白的序列分析........................................................................................433.4讨论..................................................................................................................................433.5小结..................................................................................................................................45结论.......................................................................................................46参考文献..................................................................................................47附录一硕士期间已发表的文章..........................................................53致谢.......................................................................................................54 第一章牛病毒性腹泻病毒的研究进展牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirus，BVDV）是导致牛腹泻的重要致病病毒之一，BVDV感染不仅能造成严重的临床症状，且可导致患畜的免疫力降低从而感染其他病原，致使患病动物的发病率和死亡率大大增加，给养牛业造成重大的损失。随着近年来分子生物学相关理论及技术不断发展，对于BVDV的研究逐渐深入，人们对该病毒的分子生物学方面有了一些新的了解，本文主要从牛病毒性腹泻病毒的病毒粒子结构组成及功能、国内外的流行情况和BVDV基因的遗传与变异情况这三个方面阐述近几年BVDV的分子生物学进展。1.1牛病毒性腹泻病毒的概述1.1.1病原学BVDV是一条有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子直径长约40~60nm,由一个含有约3900个密码子的开放阅读框(openreadingframe，ORF)和两端5'及3'非编码区（5'-UTR及3'-UTR）组成。BVDV基因组全长约12.5kb，不同分离株的具体长度会因基因组片段的插入、缺失、重组或序列重复而发生改变（Dengetal.,2015）。5'-UTR由360~386个核苷酸组成的瘟病毒最保守的基因，其可形成稳定的二级结构，因此BVDV通常根据该基因来进行分子分型，通过比对BVDV5'-UTR基因可知，在该基因的208~223nt和294~323nt处通常有较大的变异，因此，可通过该变异区来设计特异性引物进一步进行BVDV的基因型及基因亚型的鉴定与分类。BVDV的ORF编码一个约3900个氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白经翻译、加工生成12种成熟的蛋白质（Zemke.,2010），包括4种结构蛋白（衣壳蛋白(C)和囊膜蛋白（Erns、E1和E2））和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)（Ridpath.,2005）（图1）。基因组上的位置从N端到C端为NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-COOH,其对应的基因分别为5'-P20-P14-P48-gP25-gP53-P54/P80-P10-P30-P133（P58/P75）-3'。ORF1 直接影响病毒的抗原性、是否致细胞病变及病毒复制能力的强弱等。末端3'-UTR由223~230个氨基酸组成，基因开端于ORF的终止密码子TGA，3'-UTR内富含AT序列，但缺乏Poly(A)“尾”结构。通过研究表明BVDV3'-UTR虽然具有较高的保守性，但不具有明显的保守二级结构，它与病毒复制酶对RNA模板的识别作用有关。该基因涉及RNA翻译的正确终止及病毒RNA稳定性和复制的完成，参与病毒的复制与调控。图1BVDV基因组及其编码蛋白图Figure.1ThegenomeofBVDVanditscodenproteins1.1.2BVDV编码的主要蛋白及其功能BVDV基因组编码的结构蛋白有P14(C)、gP48(Erns)、gP25(E1)和gP53(E2)，是核衣壳和囊膜蛋白的重要组成部分，该部分含有重要的保护性抗原蛋白，具有很好的抗原性，具有诱导产生中和性抗体的抗原决定簇，且对病毒粒子的组装、病毒与受体之间的相互作用密切相关。P14是非糖基化蛋白，具有免疫原性，带有很高电荷，疏水性强。位于阅读框的第505~810位核苷酸处，P14蛋白的N端切点可能在第164~165位氨基酸残基之间，由P20水解产生，其C末端切点可能在248~250位氨基酸之间，P14是BVDV的核衣壳组成成分之一（王银,2013），与病毒基因组RNA构成病毒核心。gP48由约227个氨基酸残基组成，位于ORF中811~1491处，分子质量为14ku，有9个糖基化位点，其产生的抗体能中和BVDV和猪瘟病毒（CSFV），gP48在BVDV编码的蛋白中属于保守性较好的蛋白之一（王银,2013），为BVDV的保护性抗原，诱导机体产生保护反应。氨基酸序列结构分析表明，gP48蛋白内有一个高度保守的结构域（梁霄勇等,2016），因此,它可作为基因工程诊断及亚单位疫苗研究的候选，这也是近几年来BVDV分子生物学和BVDV疫苗研究的热点。同时，gP48为包膜糖蛋白，具有很好的抗原性，在病毒黏附细胞中起重要作用。2 gP53为囊膜糖蛋白，由约370个氨基酸残基组成，分子质量为51~55ku，gP53是决定BVDV抗原的主要部位，具有中和活性。BVDV-1和BVDV-2基因组的E2基因的N端氨基酸差异率在40%左右。gP53蛋白有两个抗原决定区，一个是种内保守抗原区，一个是决定不同毒株的抗原特异性区，E2基因变异率高，也是BVDV基因分型的依据之一。Liang（Liangetal.,2003）等发现，gP53蛋白可能影响BVDV感染细胞的类型，也影响宿主的趋向性，gP53蛋白中存在的高变区域引起BVDV逃避宿主免疫的重要因素之一。该蛋白的免疫原性较强，且是介导宿主细胞识别和吸附的主要部位，gP53蛋白基因的保守性相对较低，其抗原的变异导致BVDV可很好的适应环境的变化，这种特性也导致了BVDV疫苗的免疫失效，且也是畜群感染BVDV后出现持续性感染的重要原因。因此，该蛋白也一直是国内外学者研究瘟病毒的重点。Npro是ORF编码的第一个非结构蛋白，且是黄病毒中仅瘟病毒独有的一种非结构蛋白，该蛋白基因具有较高的保守性，也常用于瘟病毒的定型和BVDV的分型。Npro蛋白是自体蛋白酶，有研究报道Npro是干扰素（Interferon,IFN）的颉颃物（Giletal.,2006），其蛋白N端对其抑制干扰素的合成发挥至关重要的作用，因此Npro在BVDV与病毒持续感染及病毒的生存有关。Tao等（Taoetal.,2015）研究表明，蛋白质Npro可能在调节BVDV-2毒株干扰的宿主细胞中的抗病毒反应中起多重作用。P125（NS2-3）蛋白是BVDV编码的重要的非结构蛋白之一，NS2-3核苷酸序列的变异也与病毒的毒力有关。该蛋白的N端由宿主细胞的信号肽酶切割聚蛋白形成，而C末端可能在2300位氨基酸左右（Dengetal.,2015）。P125蛋白在NCP型毒株感染的细胞中是呈现一种成熟的蛋白形式，但在CP型毒株感染的细胞中除了存在稳定的P125蛋白外，还有由其断裂而产生的P54和P80蛋白，因此，P125被认为是CP型BVDV在蛋白水平的分子标记（Kalaiyarasuetal.,2015）。在P54基因序列中宿主细胞RNA的插入、突变、重组或缺失等情况可导致P8蛋白的产生，致使NCP型毒株转化为CP型毒株。因此，P125基因也是进行流行病学研究的重点。3 1.2BVDV的国内外流行现状BVD于1946年在美国纽约州首先报道，随后在美国的其他州和世界各地也相继报道并得到分离毒株。1971年，美国兽医协会将该病统一命为“牛病毒性腹泻-黏膜病”，世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病，中国在进出境检疫中将其列为二类动物疫病。BVDV在世界范围内广泛流行，欧美等养牛业发达的国家均有检出，牛群中抗体阳性率高达50%~89%（Ridpathetal.,2006）。BVDV主要宿主为牛，牛感染BVDV后会出现一系列临床症状，直接影响牛的生长发育与繁殖繁衍，而牛感染BVDV后，部分牛群会出现免疫力下降等情况，这就给其他病原感染牛群造成了便利条件。因此，BVDV是造成全球乳/肉牛养殖业经济损失的主要病原体之一。同时BVDV可能本身就存在于活疫苗等生物制品中，这给检验检疫早成了很大的困难，这可能是造成BVD流行的重要原因之一（毛晓娜等,2013）。BVDV也常存在于胎牛血清中，这就大大影响了细胞分离等试验的准确性。持续性感染的个体也是主要的传染源之一，病畜的呼吸道、眼分泌物、乳汁、精液及粪便等均含有病毒，其中带毒血便的含毒量很高（李庆超等,2010）。由于BVDV的宿主极其广泛，包括多种野生动物均可感染BVDV，并可携毒、排毒，这就加大了散养动物感染BVDV的概率，这也可能是一些极端气候地区的动物也存在BVDV感染的主要原因之一(如青藏高原地区牦牛感染BVDV)。由于中国养殖业的快速发展且跨省跨国交易频繁，自中国分离鉴定出BVDV以来，该病几乎遍及全国各个地区。Deng等（Dengetal.,2015）对中国8个省份的4种牛品种（奶牛、肉牛、水牛和牦牛）进行流行病学调查，RT-PCR检测BVDV阳性率为22.64%。何美琳等（何美琳等,2014）对川西北阿坝州8个县的牦牛3种病毒性腹泻病的血清型调查发现BVDV血清抗体阳性率平均为44.3%。王晓亮等（王晓亮等,2016）对宁夏部分地区牛病毒性腹泻的血清学检测发现BVDV抗体阳性率高达64.92%，并有一定程度的抗原阳性。王淑娟等（王淑娟等,2014）对新疆等11个省（市）的奶牛场血清学调查显示BVDV的抗体总阳性率的达69.1%。李智勇等（李智勇等,2014）对内蒙个地区17个大中小奶牛场的2391份血清样品进行了BVDV抗体检测，平均阳性率为88.9%，144 个奶牛场的抗原阳性率为3.6%。姚伟（姚伟,2015）对辽宁地区牛病毒性腹泻的血清学检测BVDV抗体平均阳性率为74.0%。陈新诺（陈新诺等,2016）对青藏高原地区（青海、西藏、四川和云南）222份牦牛粪便样品进行了流行病学调查，BVDV总阳性检出率为20%。以上研究表明，中国牛群感染BVDV的情况十分严重。BVDV存在于世界上许多养牛业发达的国家，Nilnont等（Nilnontetal.,2016）对泰国共北部的牛畜群进行了血清学检测，畜群中抗体阳性率为62.5%。Yilmaz（Yilmaz.,2016）检测了土耳其卡尔斯地区奶牛血液和牛奶血清中BVDV的抗体流行率。通过间接酶联免疫吸附测定测试血液和乳汁样品发现172例血清（89.58%）存在BVDV抗体阳性，161例乳汁样本（83.85%）为阳性。其他地区如美国牛群BVDV阳性率高达55.3%（Sauskeretal.,2002），Mahmoud等（Mahmoudetal.,2013）流行病学调查显示，沙特阿拉伯地区BVDV抗体阳性率为26%。南美洲乌拉圭地区的BVDV流行率达69%（Guarino.,2008）。近年来国内外的流行病学调查表明地理位置、生存环境及饲养状况的不同，牛群感染BVDV的情况也不同，因此，对于BVDV的防控与根除的方法不能一概而论，应根据具体的饲养地点、环境状况等生存因素，因地制宜的制定防控措施。1.3BVDV的遗传与变异情况BVDV为单股RNA病毒，具有很高的突变率。如前文所述5'-UTR是瘟病毒属最保守的基因，也是BVDV基因分型的依据之一。根据5'-UTR基因差异可将BVDV分为两个基因型BVDV-1型和BVDV-2型，BVDV-1型可进一步分为BVDV-1a~BVDV-1t，Deng等（Dengetal.,2015）分离到了新的亚型BVDV-1u型，但还未被认证，该亚型与现有的牦牛源毒株M31182遗传关系较近。BVDV-2型可进一步分为BVDV-2a~BVDV-2d（Dengetal.,2015；Giammariolietal.,2015）。Schirrmeier等（Schirrmeieretal.,2004）报道了从牛血清中分离到了一株非典型的瘟病毒，从病毒的基因序列分析，该病毒与已知的BVDV-1和BVDV-2有较大的差异，该病毒被命名为“Ho-like”也被称为BVDV-3基因型，但还未被国际病毒分类委员会确认，近几年内也有分离出该病毒的报道，该基因型先可分为两个基因亚型（Brazilian源和Thai源）。基于5'-UTR的基因差异构建进化树对研究5 BVDV的流行病学和疫苗研究及对病毒的追溯具有重要的意义。因此，国内外对BVDV分子生物学方面研究多涉及5'-UTR，如RussellGC等通过对来自英国各地的2693个样本进行了检测，获得了2300个5'-UTR的序列，通过序列分析显示，5'-UTR具有很大的多样性，许多样本带有相同的5'-UTR序列的病毒，且这些样本通常来自单个位置，但也存在不同位置处的样本获得相同序列的实例。Tajima等（Tajimaetal.,2001）对BVDV的5'-UTR基因进行了系统进化分析。通过序列分析显示5'-UTR核苷酸同源性在60.1%~100%之间，近几年来每年都有新亚型被检测出来，且新亚型与之前的亚型虽均为一个型但遗传进化关系相对较远，且同一个地域的亚型有很多具有相同的序列，这也为BVDV的传播与地域、环境等外界因素有关提供了重要的依据。在BVDV基因组中，E2基因含有最多的变性位点，这在BVDV进化中扮演着重要的角色。E2作为瘟病毒的最主要的抗原蛋白，含有较多的种间共同抗原表位及重要特异抗原表位，主要分布在E2蛋白的N端（汤中和,2013）。E2蛋白主要承载着BVDV的主要抗原决定位点，许多基于E2的中和抗体可有效地抑制病毒感染。E2蛋白保守性较低，不同基因型及基因亚型间的E2往往差异较大，同一基因亚型的E2序列同源性很高，不同基因型的BVDV的E2序列存在差异，不同BVDV的E2基因和核酸同源性在60.3%~98.9%之间（Pecoraaetal.,2015）。有关系统遗传进化分析而言，5'-UTR由于其过于保守的遗传性，和相对较短的长度，从而构建的进化树步长较低，Npro则在病毒的感染和增殖中发挥着作用，从而导致变异性位点较少，这可能会影响由于同源重组而导致的病毒之间的区分。而E2基因含有较多的变性位点，因此，也可用E2基因作为BVDV分型的依据之一（Ostachuk.,2016）。目前国际市场上的商业化疫苗主要是基于BVDV-1a，BVDV-1b及BVDV-2a等亚型，这与国内流行的亚型不完全相同，也会导致免疫效力的缺失，由于E2能诱导机体产生中和抗体，所以目前研制的新型疫苗也多针对E2蛋白。因此，对E2基因的相关知识还需进一步研究。将近几年来扩增出的BVDV基因序列进行系统进化分析显示毒株序列之间不同的地域，BVDV的基因型分布有很大的差异，相同地区之间病毒序列更加接近。如于美国分离的USMARC-55924毒株、USMARC-53874、USMARC-55447毒株均为BVDV-1b亚型。美国地区主要流行的是BVDV-1a、BVDV-1b和6 BVDV-2a（Ridpathetal.,2011），欧洲许多国家主要流行1a、1b、1d、1e和1f（Giammariolietal.,2015；Toplaketal.,2004），日本和韩国主要流行BVDV-1b（Abeetal.,2016；Oemetal.,2010），澳大利亚则主要流行BVDV-1c（Lanyonetal.,2014）。Liu等（Liuetal.,2009）建议将一类牛源的非典型瘟病毒定为BVDV基因3型(BVDV-3)。世界范围内BVDV主要的流行亚型是1a和1b，这两个基因亚型5'-UTR差异率在10%左右，E2蛋白N端氨基酸差异率30%左右，虽然均为BVDV-1型，但两个亚型之间存在很多的差异。而中国地域辽阔，物种繁多，疾病的流行情况及病毒的遗传进化情况十分复杂。研究表明，已从中国牛群中分离到了BVDV1型和BVDV2型病毒。我国主要流行的亚型为BVDV-1b和1m型，而中国青藏高原的主要流行的亚型是BVDV-1b、1q和1m型（Gongetal.,2014）。新疆地区分离到的病毒主要为BVDV-1q和BVDV-1f亚型（陈锐等,2016）。BVDV病毒基因组及其复制特征造成BVDV可变性高，毒株间序列差异较大。研究表明，BVDV-1a和BVDV-1b交叉保护会随着疫苗毒株的不同而结果不同（王炜,2014）。近年来，世界各国分离鉴定出的毒株序列差异较大，各国流行的亚型也不同且出现很多新的BVDV毒株，根据基因组序列显示部分新分离出的毒株与之前的毒株同源性有较大差异，如青藏高原地区分离的牦牛源BVDV的全基因序列与其他已分离出BVDV毒株核苷酸的同源性为68.9%~74.4%，同源性很低，这可能是因为该毒株具有新的遗传衍化来源或高原环境诱变的结果。中国分离并测序的BVDV全基因序列与其他毒株序列差异较大，如ZM-95独立划分为BVDV-1m亚型。这也可说明BVDV的亚型分布可能与地域或生存环境有关。BVDV虽然感染率较高，但其致死率较低，存在持续性感染的特性，所以饲养主对其重视度不是很高，同时BVDV毒株间差异较大，可变性较高，因此之前国内没有商品化的疫苗。而近期国内商品化的BVDV疫苗是由BVDV-1a毒株研制（王炜,2014）。1.4小结自发现BVDV以来，人们对BVDV的研究不断深入，在分子生物学方面对主要的蛋白结构和功能有了比较系统的研究，特别是基因组结构及功能、基因分7 型及流行病学研究方面都有较多报道。近年来，学者们对E0和E2等基因蛋白的研究也为基因工程疫苗的开发与应用提供了重要基础，国外对BVDV的防制已经有所成效，国内近几年也有商品化的BVDV疫苗产生。但由于世界经济贸易频繁，导致BVDV在世界范围内广泛存在，且存在毒株变异较大,毒力增强的现象。因此，为了能彻底防制BVDV，需加强对BVDV与宿主之间的的相互作用的研究，以及BVDV进入细胞后，病毒的结构的结构蛋白和非结构蛋白的相互作用等对BVD的预防和控制有着十分重要的意义。8 第2章牦牛BVDV的分子流行病学调查和遗传进化分析牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）属单股正链RNA病毒，与猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）和边界病病毒（Borderdiseasevirus,BDV）同属黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)（Lanyonetal.,2014；韩玉霞等,2015）。在BVDV基因组中，5'-UTR和Npro基因均是瘟病毒最保守的基因，而E2基因是瘟病毒的重要保护性抗原编码的基因，在瘟病毒结构蛋白基因中变异较大，代表着毒株的遗传特性，因此5'-UTR、Npro和E2均常用于瘟病毒及BVDV的遗传多样性分析。通常根据5'-UTR可将BVDV分为两个不同的遗传物种，即BVDV-1型和BVDV-2型（Yesilbagetal.,2017；Dengetal.,2015）。BVDV-1型可进一步分为1a-1u亚型，BVDV-2型可进一步分为2a-2d亚型（Dengetal.,2015；Giammariolietal.,2015;Zemke.,2010;张倩等,2017）。由于牦牛生存环境恶劣，且牧民预防意识不高，近年来的青藏高原部分地区的BVDV流行病学调查显示，BVDV阳性率较高，且流行范围较广（陈新诺等,2016;何美琳等,2014），新型亚型的鉴定明显增加，BVDV基因组的遗传多样性发生了显着变化（Dengetal.,2015；Kutaetal.,2013）。由于BVDV在我国牦牛产区广泛存在，而且BVDV的多型性导致该病的防控具有一定的难度，也造成牦牛养殖业巨大的经济损失。但BVDV在牦牛上流行情况尚不完全清楚。因此，掌握BVDV的病原流行情况，对预防和控制该病具有重要的意义。在本研究中，我们调查了2015~2016年青藏高原地区牦牛粪便BVDV的感染情况并分析了2015~2016年青藏高原地区牦牛BVDV主要的流行亚型。2.1材料与方法2.1.1临床样本检测的样本为2015年~2016年期间采集青藏高原地区30~60日龄牦牛的192份腹泻粪便样本和198份健康粪便样本，分别是西藏藏族自治区（纬度位置为N27°38′31.34″，经度位置为E89°02′27.94″，平均海拔为4284米）的55份腹泻9 粪便样本和45份健康粪便样本，青海省玉树市地区（纬度位置为N33°20′33.85″，经度位置为E97°12′51.89″，平均海拔为4223米）的33份腹泻粪便样本和21份健康粪便样本，四川省阿坝州地区（纬度位置为N31°32′31.03″，经度位置为E101°40′07.82″，平均海拔为3605米）的59份腹泻粪便样本和87份健康粪便样本，云南香格里拉市地区（纬度位置为N27°34′48.01″，经度位置为E99°48′04.19″，平均海拔为3379米）的45份腹泻粪便样本和45份健康粪便样本，如图2。被采集粪便样本的牦牛牛群规模通常较小，牛群为自由放养，并且不接种针对BVDV的疫苗。收集的粪便样本放置于50mL离心管中低温运输，然后所有样本放置在-80℃低温冰箱保存。图2青藏高原四个地区的样本采集地点Figure.2GeographicdistributionofBVDVsamplescirculatinginfourregionsoftheQinghai-TibetPlateau括号中的数字代表在该地区一共采集的样本数，黑色三角代表样本采集地区地点。10 2.1.2试验仪器恒温培养箱和恒温振荡培养箱购自Thermoforma公司；高速离心机5804购自Eppendorf公司；凝胶成像系统VersaDoc2000、普通PCR仪、核酸蛋白电泳仪powerpacuniversalTM购自Bio-Rad公司；OLYMPSIX71型荧光显微镜购自TOKYO公司；恒温水浴锅购自上海科升仪器有限公司；超纯水仪Milli-Q购自法国Millipore公司；高压蒸汽灭菌锅购自诸城安泰机械有限公司；金属浴购自上海之信仪器有限公司；移液器购自德国Eppendorf公司。2.1.3主要试剂及其配制（1）购买的试剂QuickTaqHSDyeMix购自TOYOBO东洋纺生物科技有限公司；pMD19-T载体、DH5α感受态细胞、DNAMarkerⅡ、上样缓冲液（loadingbuffer）、PrimeScriptTMRT试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Tirzol试剂盒（RNAisoPlus）购于Takara公司；GelExtractionKit胶回收试剂盒、PlasmidMinikit质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。（2）配制的试剂①磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）：以配制1LPBS缓冲液为例，称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.42g，氯化钠（NaCl）8g，氯化钾（KCL）0.2g，溶于800~900mL去离子水中，待固体完全溶解后调节pH至7.4，加入去离子水用容量瓶定容至1L之后，121°C高压蒸汽灭菌15min，冷却后4°C冰箱保存。②氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）：使用灭菌后的双蒸水配制成浓度为100mg/mL的溶液，用孔径为0.22µm的滤器过滤后分装，放在-20°C冰箱保存。③LB液体培养基：以配制100mLLB液体培养基为例，称取氯化钠（NaCl）1g，胰蛋白胨1g，酵母0.5g，溶于100mL去离子水中，待固体完全溶解后调节pH至7.0~7.2，121°C高压蒸汽灭菌15min。冷却后放入4°C冰箱保存。④LB固体培养基：以配制100mLLB液体培养基为例，称取氯化钠（NaCl）1g，胰蛋白胨1g，酵母0.5g琼脂粉1.5g，溶于100mL去离子水中，待固体完全溶解后调节pH至7.0-7.2，121°C高压蒸汽灭菌15min。稍微冷却些后立即11 加入氨苄青霉素（Amp）4°C混匀，在超净工作台中倒置平板。⑤50×TAE缓冲液：以配制1L50×TAE缓冲液为例，称取Tris-base242.0g,量取醋酸57.1mL，Na2EDTA.2H2O37.2g于烧杯中，向烧杯中加入600mL去离子水，充分搅拌溶解。加入57.1mL的醋酸，充分搅拌。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。⑥1.5%琼脂糖凝胶：按比例在1×TAE缓冲液中加入1.5%的琼脂糖粉末，加热至完全溶解后，加入约1µL的DNA染色剂GoldenView，摇晃均匀后倒入插有梳子的板子中。2.1.4引物的设计与合成参照文献（Dengetal.,2015；Gongetal.,2014）中引物序列，合成BVDV的特异性引物BVDV-P1~BVDV-P6用于扩增5'-UTR、Npro基因来进行分子流行病学调查及分子分型。根据GenBank上已发表的BVDVE2基因序列，应用PrimerPremier6.0软件设计特异性引物BVDV-P7和BVDV-P8对E2基因进行扩增和序列分析。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2.1.5RNA的提取与cDNA的合成取约1g采集的牦牛粪便样本与已灭菌的PBS（pH7.4）5mL制成1:5悬液，充分涡旋5min。放入-80°C冰箱中反复冻融3次之后，在4℃条件下以3000rpm离心20min，取上清液在以12000rpm，4°C离心30min，取上清。将上清液按照RNAisoPlus试剂盒说明书的步骤提取粪便样本的总RNA，具体步骤如下：(1)取400μL处理后的粪便样本上清液加入200μL氯仿，颠倒混匀后在涡旋仪上剧烈震荡，直至液体呈乳白状（无分层现象），将液体室温静置5min，12000rpm，4°C离心15min。(2)将上层水相（不少于400μL）移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒后，室温静置至少10min，12000rpm，4°C离心15min。(3)弃去上清液，加入1mL75%冰乙醇，洗涤RNA沉淀管壁，弹起沉淀后涡旋2min，12000rpm，4°C离心10min。(4)弃去上清液，用100μL的枪头将EP管中残留的液体吸净，将EP管放在无12 菌操作台内风干，用15~20μLDEPC水将RNA溶解。提取的RNA于-80°C冰箱保存。(5)cDNA的合成分两个步骤，第一个步骤为了防止提取RNA中基因组DNA的污染影响定量结果，在反应体系中加入DNAase将污染的DNA除去，详细反应体系见表1。42°C，2min。将处理好的RNA用以反转录反应。表1去除提取RNA中基因组DNA的反应体系Table1thereactionsystemforextractingthegenomicDNAfromtheRNA组分反应体系(µL)5×gDNAEraserBuffer2gDNAEraser1TotalRNA1RNAaseFreedH2Oupto10去除污染的基因组DNA后的RNA按照SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase（Invitrogen,USA）说明书的方法（如表2）反转录成cDNA，反转录反应条件：37°C，15min；85°C，15s；16°C，10min，取出cDNA置于-20°C冰箱保存。通过核酸蛋白检测仪检测DNA的质量，结果中A260/A280比值在1.8~2.0之间，浓度可达到100ng/µL左右即可。剩余部分的RNA放入-80°C冰箱中保存备用。表2反转录反应体系Table2Reversetranscriptionreactionsystem组分反应体系(µL)5×PrimeScriptBuffer4PrimeScriptRTEnzymeMix1RTPrimerMix1RNAthatErasedthegDNA(3.2-2)10RNAaseFreedH2Oupto202.1.6PCR扩增与测序以反转录后的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。反应体系如下：QuickTaqHSDyeMix5µL，上下游引物均为10pmol/L各0.5µL，cDNA模板1µL，加ddH2O3µL；PCR反应条件为94°C预变性2min，94°C变性30s，52°C退火30s，68℃13 延伸1min，共35个循环，72°C延伸8min，4°C保存，取扩增产物经琼脂糖凝胶核酸电泳和凝胶成像扫描仪进行检测与分析。扩增片段胶回收，连接pMD19-T载体后，转化到E.coliDH5α感受态细胞中，筛选重组质粒，送由上海生工生物有限公司测序。2.1.7进化关系分析应用DNAStar、CLUSTALW软件将测序样本的序列与GenBank中已公布的进行多序列比较（表3），使用MEGA6.06软件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值为1000)构建系统进化树。表3BVDV参考株信息Table3ReferencestraininformationofBVDVGenBankID毒株名称年份地点AJ1337392000USANADLAJ585412VEDEVAC2003HungaryM96687Osloss1993GermanyAB078950KS86-1ncp2003JapanAF526381ZM-951995ChinaFJ527854XJ-042004ChinaDQ088995Singer_Arg2006ArgentinaJQ799141M311822010ChinaKU1593652016USAUSII-S15KJ541471GS52013ChinaKP941584USMARC-538752014USAKP941586USMARC-554772014USAAF091605OregonC24V1998EnglandKX857724ACM/BR/20162016BrazilKF501393BVDVJL-12014ChinaKJ620017IBSP4ncp2014Brazil14 KR029825EgyIsmailia/20142014EgyptKF772785CC13B2013ChinaKP941581USMARC-519982014USAKC96396712F0042013SouthKoreaEF101530KE92007GermanyKJ689448GX42014ChinaKU756226HJ-12010ChinaKP313732Carlito2014SwitzerlandJN400273SD08032014ChinaKU200260BE/061536/20142014BelgiumKT355592HP-KY-RK132015USAKF896608Bega-like2012AustraliaLT797813viral_cRNA2017ItalyKR866116SD-152015ChinaKF835697AU5262014USAKT943518BJ12012015chinaKT943518BJ13082015chinaKT943518BJ13052015chinaKC853440SuwaNcp1993SwitzerlandKC75738310JJ-SKR2010SouthKoreaKC695810camel-62010China2.2结果2.2.12015~2016年青藏高原地区牦牛BVDV分子流行学调查根据引物BVDV-P1、BVDV-P2进行RT-PCR检测，结果显示192份出现腹泻症状牦牛的粪便样品中，有49份扩增出了特异性条带，198份临床健康牦牛的粪便样品中，有26份扩增出了特异性条带，部分样品的PCR扩增结果如图3。15 M．DNAMarkerⅡ;P为阳性对照;N为阴性对照;1~7为样本M.DNAMarkerⅡ;P.Positivecontrol;N.Negativecontrol;1~8.samples图3BVDVRT-PCR扩增部分结果Figure.3AmplifiedresultsofBVDVbyRT-PCR结果显示BVDV在青藏高原地区普遍存在，青藏高原地区腹泻牦牛粪便中BVDV总检出率为25.52%（49/192，95%CI=（19.5～32.3%），临床健康牦牛粪便中BVDV总检出率为13.13%（26/198，95%CI=8.8%～18.6%）（p=0.002）。其中西藏地区腹泻牦牛粪便BVDV检出率为21.81%（12/55，95%CI=11.8%～35%），临床健康牦牛粪便BVDV检出率为24.44%（11/45，95%CI=3.8%～30.7%）（p=0.813）。云南地区腹泻牦牛粪便BVDV检出率为35.56%（16/45，95%CI=21.9%～51.2%），临床健康牦牛粪便BVDV检出率为13.33%（6/45，95%CI=5.1%～26.8%）（p=0.026）。青海地区腹泻牦牛粪便BVDV检出率为36.36%（12/33，95%CI=20.4%～54.9%），青海地区临床健康牦牛粪便BVDV检出率为42.86%,（9/21，95%CI=21.8%～66%）（p=0.782）。四川地区腹泻牦牛粪便BVDV检出率为15.25%（9/59，95%CI=7.2%～27%），临床健康牦牛粪便BVDV检出率为0（0/87，95%CI=0%～4.2%）（p＜0.001），结果见表4。青藏高原地区腹泻牦牛样品中BVDV的总检出率高于临床健康牦牛粪便样本（p=0.002），这表明BVDV感染是构成青藏高原地区牦牛腹泻的潜在因素。而西藏（p=0.813）和青海（p=0.782）地区的腹泻牦牛和临床健康牦牛样本之间的流行率没有显着差异，表明BVDV亚临床感染在牦牛中广泛流行。16 表4青藏高原四个地区健康和腹泻粪便样本中牦牛BVDV的流行病学调查Table4TheprevalenceofBVDVinhealthyanddiarrhealyakfecesfromthefourdifferentregionsintheQinghai-TibetanPlateau.粪便地区样本西藏云南青海四川共计检出率腹泻21.81%35.56%36.36%15.25%25.52%（95%CI）样本(11.8-35%)(21.9-51.2%)(20.4-54.9%)(7.2-27%)(19.5-32.3%)健康24.44%13.33%42.86%013.13%样本(3.8-30.7%)(5.1-26.8%）(21.8-66%)(0-4.2%)(8.8-18.6%)P值0.8130.0260.782<0.0010.002OR0.8643.530.832.26-（95%CI）(0.33-2.24)(1.25-10.948)(0.26-2.58)(1.34-3.87)2.2.2根据BVDV5'-UTR基因的分子特征研究为了解2016年青藏高原地区牦牛BVDV主要的流行亚型及遗传进化情况，我们从四个地区（西藏，云南，青海和四川）每个地区选择2.2.1中RT-PCR呈阳性的样本8~9份（共计35份，17份来自临床健康牦牛和18份来自腹泻牦牛，35份阳性样品详细的临床背景如表5所示），用5'-UTR基因的特异性引物BVDV-P1、BVDV-P2进行RT-PCR扩增和测序。在位于230bp处可见特异性扩增条带，部分样品的PCR扩增结果如图4所示。将产物进行回收克隆测序后结果显示35个样本均为BVDV-1型。将测序所得序列与GenBank中公布的25株BVDV进行同源性比较。结果显示，根据5'-UTR基因测序所得35株测序株之间的核苷酸同源性为71.6％~100％，与美国BVDV-1型NADL毒株5'-UTR基因的核苷酸同源性为69.1％~90.9％，与中国BVDV-2型XJ-04毒株的5'-UTR基因的核苷酸同源性为69.4％~77.6％。为了确定35个样本与其他BVDV毒株的关系，用MEGA6.06软件以bootstrap值为1000构建系统发育树（图5）。结果表明，35份样本均聚为BVDV-1型毒株的分支上，其中31份样本与韩国毒株BVDV-1d亚型的10JJ-SKR毒株亲缘关系较近，说明31个样品属于BVDV-1d亚型；Z3和Z6分离株与中国毒株BVDV-1a亚型的GS5毒株位于同一大支上，但是单独聚为一支中，属于BVDV-1a亚型；而CB7和FB3分离株与匈牙利毒株BVDV-1b亚型的VEDEVAC毒株亲缘关系较近。因此，17 这些结果表明35个BVDV阳性样品属于BVDV-1a亚型（n=2），BVDV-1b亚型（n=2）和BVDV-1d亚型（n=31）。表535份青藏高原四个地区临床健康牦牛和腹泻粪便的样本采集信息Table5Theinformationof35clinicallyhealthyanddiarrheayakfaecestheQinghai-TibetanPlateau.样本名称采集宿主采集年份采集地点宿主健康状况IB6Yak2015西藏腹泻JB4Yak2015西藏腹泻JB6Yak2015西藏腹泻JB8Yak2015西藏腹泻BB1Yak2015青海腹泻BB10Yak2015青海腹泻CB6Yak2015青海腹泻CB7Yak2015青海腹泻FB3Yak2015青海腹泻M-1-1Yak2016四川腹泻M-1-7Yak2016四川腹泻M-2-1Yak2016四川腹泻M-2-8Yak2016四川腹泻M-2-17Yak2016四川腹泻Z3Yak2016四川腹泻Z6Yak2016四川腹泻Z8Yak2016四川腹泻EB1Yak2015云南腹泻EB5Yak2015云南腹泻EB6Yak2015云南腹泻BB8Yak2015云南腹泻BJ1Yak2015西藏临床健康BJ2Yak2015西藏临床健康18 BJ8Yak2015西藏临床健康KJ1Yak2015西藏临床健康KJ2Yak2015西藏临床健康AJ10Yak2015青海临床健康CJ8Yak2015青海临床健康DJ2Yak2015青海临床健康IJ2Yak2015青海临床健康AJ1Yak2015云南临床健康AJ2Yak2015云南临床健康AJ7Yak2015云南临床健康CJ4Yak2015云南临床健康CJ6Yak2015云南临床健康2.2.3根据BVDVNpro基因的分子特征研究为了确定5'-UTR基因分型结果，我们用Npro特异性引物对2.2.2中的35份样本进行巢式PCR扩增与测序，在位于440bp处可见特异性扩增条带，部分样品的PCR扩增结果如图1所示。结果显示，从35份样本中扩增出22份样品（2个为BVDV-1a亚型，2个为BVDV-1b亚型和18个为BVDV-1d亚型）的Npro基因部分。22个测序株的Npro基因之间的核苷酸同源性为72.8%~100%，氨基酸同源性为74.7%~99.3%，与GenBank上发表的其他BVDV毒株的Npro基因序列的核苷酸同源性为74.9%~87.5%，氨基酸同源性为82.3%～89.0%。基于Npro基因构建系统发育树（图6），结果显示18个测序株与与韩国毒株BVDV-1d亚型的10JJ-SKR毒株亲缘关系较近，说明18个样品属于BVDV-1d。Z3和Z6分离株与中国毒株BVDV-1a亚型的GS5毒株位于同一大支上，但是单独聚为一支中，而CB7和FB3分离株与匈牙利毒株BVDV-1b亚型的VEDEVAC毒株密切相关。显示Npro基因核苷酸序列和其他BVDV毒株的系统发育分析产生与5'-UTR分析的分析类似的结果。因此，上述结果表明青藏高原牦牛粪便中BVDV-1d是主要的亚型。19 2.2.4根据BVDVE2基因的分子特征研究在本研究中，我们将用E2基因的特异性引物进行RT-PCR扩增和测序，在位于1223bp处可见特异性扩增条带，从35份样本中扩增出了17株测序株的序列，部分样品的PCR扩增结果如图4所示。根据E2基因测序结果显示17株测序株之间的核苷酸同源性为68.2%~99.9%，氨基酸同源性为66.8%～99.5%，与GenBank上发表的其他BVDV毒株的E2基因序列的核苷酸同源性为68.2%~97.8%，氨基酸同源性为67.4%~96.0%。我们显示E2基因核苷酸序列与GenBank上发表的其他BVDV毒株的系统发育分析产生与5'-UTR和Npro分析的分析类似的结果（图7）。通过对比根据5'-UTR、Npro和E2基因测序所得的序列，并结合采集样本的地域及宿主健康状况等信息，分析腹泻牦牛样本和临床健康样本之间的基因序列和遗传进化情况并未有明显差异。上述结果表明青藏高原牦牛粪便中BVDV-1d是主要的亚型。同时，根据后文对SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015全基因组测序及分析显示，在比较BVDV-1a毒株的序列中，SMU-Z6/1a/SC/2016的E2基因编码区变异情况比较大，与其他BVDV-1a毒株的E2基因核苷酸同源性为78.6%〜88.8%，氨基酸同源性为72.9%〜78.3%。结果表明，SMU-Z6/1a/SC/2016的抗原性可能与其他BVDV-1a毒株株具有明显差异，可能是新型病毒。而SMU-DJ2/1d/QH/2015的E2基因与其他BVDV-1d毒株的E2基因核苷酸同源性为97.2%〜97.8%，氨基酸同源性为95.7%〜96%，无明显差异。M为DNAMarkerⅡ；P1-P3为阳性对照；N1-N3为阴性对照；1~4为根据5'-UTR扩增出的RT-PCR产物（230bp）；5~8为根据Npro扩增出的RT-PCR产物(440bp)；9~12为根据E2扩增出的RT-PCR产物(1223bp)；M．DNAMarkerⅡ；P1-P3．Positivecontrol；N1-N3．Negativecontrol；1-4RT-PCRproduct(230bp)amplifiedaccordingto5'-UTR;5-8RT-PCRproduct(440bp)amplifiedaccordingtoNpro;9-12isRT-PCRproduct(1223bp)amplifiedaccordingtoE2图4BVDVRT-PCR部分扩增结果Figure.4PartialamplifiedresultsofBVDVbyRT-PCR20 图5基于5'-UTR的测序株的系统发育分析。（测序株被标记框）Figure.5Phylogeneticanalysisofthesequencingstrainsbasedon5'-UTR.(Thesequencingstrainismarkedasaframe)21 图6基于Npro的测序株的系统发育分析。（测序株被标记为框）Figure.6PhylogeneticanalysisofthesequencingstrainsbasedonNpro.(Thesequencingstrainismarkedasaframe)22 图7基于E2序列的测序株的系统发育分析。（测序株被标记为框）Figure.7PhylogeneticanalysisofthesequencingstrainsbasedonE2sequence(c).(Thesequencingstrainismarkedasaframe)23 2.3讨论牦牛多生存于海拔3000m~5000m及以上的青藏高原地区，是典型的高原物种之一，具有“高原之舟”之称。牦牛广泛分布于中国青藏高原地区（西藏、青海、四川、云南等地区）及其相邻的高原地区。我国牦牛资源较为丰富、牦牛数量较多，据统计我国约有1300多万头牦牛，占世界牦牛总数的90%以上（拜彬强等,2014）。在青藏高原地区，牦牛作为最重要的高原生存物种之一，具有产肉、产奶、皮革和绒毛生产等多方面的经济价值（李齐发等,2006）。自1983年代初以来，在牦牛中检测到BVDV，至今BVD尚未被清除。BVDV是导致牦牛腹泻的重要病原，牦牛感染BVDV后可导致牛奶产量下降，牛奶品质差，繁殖力降低，生长迟缓和继发感染其他疾病。据调查该病在我国大部分地区广泛存在，牛群中有相当一部分是BVDV的携带者（范晴等,2015）。因此青藏高原的BVD控制具有重要意义。牦牛生态系统是非常复杂的，因为它与牛，绵羊，山羊甚至野生动物共享牧场和水源，这导致了BVDV种间传播的巨大潜力和领先的病毒遗传变异性（Gongetal.,2014）。此外，BVDV的高度抗原性和遗传多样性造成了诊断和预防难度（GÖMEZ-ROMEROetal.,2017）。因此，了解牦牛BVDV多样性对于改善临床诊断和疫苗接种计划具有重要意义。根据近年来的BVDV流行病学调查显示，青藏高原部分地区（西藏、云南、青海、四川）均有不同程度的BVDV感染。在2010年至2012年期间，中国西藏和青海地区牦牛样品中RT-PCR检测到的BVDV的流行率为24.0％〜28.9％（GÖmez-romeroetal.,2017；张倩等,2017）。陈新诺等通过PCR检测从2013年青藏高原地区的20份腹泻牦牛粪便样品中病毒流行情况，BVDV阳性率为15%，检测2015年青藏地区腹泻牦牛222份粪便样品，BVDV阳性率为20%（陈新诺等,2016）。本研究结果显示，青藏高原四个地区牦牛粪中BVDV总体感染率为19.23％（95％CI=15.4％~23.5％），与报道结果大致相同（Dengetal.,2015；Gongetal.,2014;Gaoetal.,2013）。四川地区阳性率有所降低。分析可能是因为样本采集地区差异以及我们研究所用的样本为腹泻牦牛的粪便，而之前文献报道的样本多为牦牛血清。从流行的结果来看，腹泻牦牛样本比临床健康牦牛样本的BVDV存在的可能性更高，这表明BVDV感染与青藏高原牦牛腹泻的存在有关。据国内外研究报道，BVDV-1a，1b和2a在美国为主要的流行亚型（Ridpath24 etal.,2011），欧洲许多国家主要流行BVDV-1a，1b，1d，1e和1f（Giammariolietal.,2015；Toplaketal.,2004）。日本和韩国主要流行BVDV-1b（Abeetal.,2016；Oemetal.,2010），澳大利亚则主要流行BVDV-1c（Lanyonetal.,2014）。中国的主要亚型是BVDV-1b和1（王炜,2014）。BVDV-1b，1q和1m是青藏高原西藏和青海地区牦牛的主要BVDV亚型（Gongetal.,2014）。本研究中BVDV-1d，BVDV-1a和1b为2015年~2016年青藏高原部分地区牦牛BVDV存在的亚型，其中BVDV-1d亚型的检出率为88.6%（31/35），BVDV-1d为青藏高原地区流行的牦牛BVDV的优势基因型。在中欧国家和东亚国家，BVDV-1d占主导地位（Dengetal.,2015;Giammariolietal.,2015;范晴等,2015）。近期的研究报道BVDV-1d存在于中国西北地区的牛群中，而BVDV-1d亚型也在中国逐渐流行（Dengetal.,2015）。在BVDV基因组中，E2糖蛋白是BVDV病毒粒子的主要结构成分，并在病毒附着于宿主细胞和诱导针对病毒感染的免疫应答中起关键作用。E2糖蛋白编码区通常被认为是最不保守的区域之一，因此，该蛋白也被认为是BVDV分型的依据之一。有研究通过扩增E2基因全长，将国内BVDV分离株分为9个亚型：BVDV-1a，-1b，-1c，-1d，-1o，-1m，-1p，-1q和BVDV-2a，显示出国内BVDV的极大多样性。其抗原的变异导致BVDV可很好的适应环境的变化，这种特性也导致了BVDV疫苗的免疫失效，且也是畜群感染BVDV后出现持续性感染的重要原因（Pecoraaetal.,2015;Ostachuk.,2016）。同时，作为BVDV的一个重要特征，亚型往往是群体特有的，不同的地方和地可能流行不同的亚型（Kalaiyarasuetal.,2015）。因此，在防控时必须认识到BVDV分离株的变异性。本研究中，我们根据E2基因设计特异性引物对检测呈阳性的样本进行E2基因扩增、测序并构建系统发育进化树，并结合5'-UTR和Npro所构建的系统发育树，结果显示，35份腹泻牦牛样本中有31份样本与韩国毒株BVDV-1d亚型的10JJ-SKR毒株同源性较高，均为BVDV-1d亚型，但是分离株单独聚为一个分支，该31份样本采集自西藏地区、青海地区和云南地区。2份采集自四川地区的样本Z3和Z6与中国毒株BVDV-1a亚型的GS5毒株位于同一大支上，但是单独聚为一支中，而GS5毒株与标准毒株OregonC24V同源，属于BVDV-1a亚型；2份采集自青海地区的样本CB7和FB3与匈牙利毒株BVDV-1b亚型的25 VEDEVAC毒株亲缘关系较近，属BVDV-1b亚型。结果也进一步说明在不同的地区BVDV主要的流行亚型也是不同的。由于我国幅员辽阔，在不同的养殖地区，尤其是青藏高原地区牦牛的生存环境和养殖的规模等差异较大，因此应该根据不同地区的饲养特点，同时借鉴国际先进防控技术及经验，采取不同的防控措施来进行BVD/MD防控。（1）充分了解和认识BVD的危害。据国内外的流行病学调查显示，BVD往往呈现高感染率，但是死亡率相对较低。这就造成了该病不被养殖户重视，防控意识淡薄。尤其在青藏高原地区，牧民文化相对较低，对该病知之甚少。因此，在预防控制BVD前，应该学习该病的相关知识和危害，动物疫病防控部分应该对该病造成的危害给予重视，加大宣传力度，做好防控工作。（2）加强流行病学调查与检测。流行病学调查是认识该病，对该病进行有效防控的重要途径。青藏高原地区地广人稀，牦牛等畜生通常为放养，并且由于BVDV的多型性，给该病的防控带来了一定的难度。因此，应该学习国际上先进的技术，建立简便快捷的检测方法和诊断试剂，进行系统的流行病学调查，了解青藏高原地区BVDV毒株的流行情况，掌握BVDV毒株的流行背景，研制适宜我国使用的BVDV疫苗。在针对青藏高原地区牦牛的BVDV防控更应在实际操作中，因地制宜，围绕疾病的控制和根除制定针对性强的防控政策，从而达到疫病的控制或根除。2.4小结本研究基于5'-UTR基因利用RT-PCR方法对青藏高原四个地区（西藏、青海、四川、云南）共计198份牦牛腹泻粪便样本和192份牦牛健康粪便样本进行了牦牛BVDV的分子流行病学调查，结果显示青藏高原地区BVDV感染广泛，青藏高原地区腹泻牦牛粪便中BVDV阳性检出率为25.52%（95%CI=19.5～32.3%），临床健康牦牛粪便中BVDV阳性检出率为13.13%（95%CI=8.8～18.6%）。与近年来的流行病学调查结果相近。另外，根据5'-UTR、Npro和E2基因的特异性引物对样本进行扩增、测序和建立系统发育树，结果表明，BVDV-1d为2015年~2016年青藏高原部分地区流行的牦牛BVDV的优势基因型。26 第3章牛病毒性腹泻病毒的基因组研究牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）引起的一种极为复杂、呈多临床类型表现的传染性疾病。以发热、白细胞下降、腹泻、消化道黏膜糜烂、溃疡、母畜流产、产死胎或畸形胎为主要特征（刘亚刚等,2003）。其一年四季均可发生，各种年龄均可发病，以3岁以上的母牦牛发病居多。BVDV属黄病毒科、瘟病毒属，是一种重要的动物疫病病原，在全球范围内广泛分布（韩玉霞等,2015），BVDV的寄主范围广泛，包括牛，羊，山羊，猪，牦牛，鹿和骆驼（Bacchofenetal.,2013;Taoetal.,2013）。主要感染牛，可引起患畜发热，腹泻，产奶量降低和生产障碍等临床症状。BVDV进入机体后可造成持续性感染与免疫抑制，持续感染牛的血清抗体为阴性，但却终身带毒与排毒（Helaletal.,2012），因此对养牛业及其他动物养殖业造成了重大经济损失。BVDV是单股正链RNA病毒，病毒基因组RNA序列几乎可以代表该病毒全部的生物学特性，BVDV的总基因组长约12.5kb，含有一个侧接5'和3'非翻译区（UTRs）的单个开放阅读框（ORF）（Zahooretal.,2010）。该ORF编码约3900个氨基酸的前体多蛋白，其随后通过病毒或细胞蛋白酶加工成11或12个单独的蛋白，包括Npro，C，Erns，E1，E2，p7，NS2/3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B从N末端到C末端（Ridpath.,2005；Tautzretal.,1997）。BVDV最重要的特征之一是病毒分离株的遗传和抗原多样性的性质（Couvreuretal.,2002）。通常根据5'-UTR或Npro基因分成两种不同的遗传物种，即BVDV-1和BVDV-2（Dengetal.,2015）。BVDV-1可进一步分为亚型1a-1u和BVDV-2亚型2a-2d（Dengetal.,2015；Giammariolietal.,2015），而基于细胞病变效应（Cytopathiceffect,CPE），可将BVDV分为两组生物型，致细胞病变型(cytopathicbiotype，cp)和非致细胞病变型(noncytopathicbiotype，ncp)。近年来，四川、西藏等地区的流行病学调查显示，BVDV流行范围广泛（Ridpath.,2005；Qiuetal.,2012），且BVDV亚型的鉴定明显增多（Dengetal.,2015；Giammariolietal.,2015；Kutaetal.,2013；Kadiretal.,2008），BVDV基因组的遗传多样性发生了显着变化（Reedetal.,1938）。BVDV被发现后，便在世界范围内流行，在养牛业发达的地区较为严重。自传入我国后，各地牦牛产区陆27 续报道本病。近年来的血清流行病学表明（Dengetal.,2015；Giammariolietal.,2015；Kutaetal.,2013；Fuetal.,2014），该病在牦牛中广泛流行，因牦牛生存环境特殊，且青藏高原当地牧民预防意识不高，BVDV的感染情况十分严重，严重危害牦牛生产，给当地牧民造成了巨大的经济损失。尽管近年来关于BVDV感染动物的报道日益增加，但是关于牦牛BVDV毒株分子方面的研究还是相对较少，而全面了解牦牛株BVDV毒株的基因组成，分子进化，基因调控及致病机理等对牦牛疫病的防控方面有着非常重要的意义。本研究中，我们利用MDBK细胞从之前测序的35份牦牛BVDV阳性的粪便样本中分别分离了两株致细胞病变的牦牛BVDV-1a和BVDV-1d毒株，使用RT-PCR方法、噬斑试验和间接免疫荧光试验等方法对毒株进行鉴定。将两株分离株分别命名为SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015，进而对该两株分离株的全基因序列进行扩增和测序，通过对E2基因和全基因组序列的基因结构分析以及构建系统发生树来确定该分离株的基因型，进一步了解青藏高原地区的牦牛BVDV的分子生物学特征及流行特点，为后续对牦牛BVDV专用疫苗的研究奠定基础。3.1材料3.1.1病料采集背景2015-2016年，本实验室从青藏高原部分地区（西藏、青海、云南、四川）采集牦牛腹泻粪便样本和临床健康牦牛的粪便样本。被采集粪便样本的牦牛牛群规模通常较小，牛群为自由放养，并且不接种针对BVDV的疫苗。腹泻牦牛的精神沉郁，采食量下降，部分牛发生了拉带黏膜的血便及灰便的情况。收集的粪便样本放置于50mL离心管中低温运输，然后所有样本放置在-80℃低温冰箱保存。3.1.2细胞与毒株本研究所用的细胞MDBK（Madin-Darbybovinekidney，MDBK）购自博士德生物有限公司；牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）（CVCCAV68）标准毒株OregonC24V购自中国药品生物制品检定所。28 3.1.3主要试剂及其配制（1）购买的试剂DMEM培养基和0.25%Trypsin-EDTA（1×）胰酶购自Gibco公司；胎牛血清购自BI公司；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗羊IgG购自美国Abbkine公司；Fluoroshield固定剂withDAPI购自Abcam公司；BVDV阳性血清购自美国VMRD公司。QuickTaqHSDyeMix购自TOYOBO东洋纺生物科技有限公司；pMD19-T载体、DH5α感受态细胞、DNAMarkerⅡ、上样缓冲液（loadingbuffer）、PrimeScriptTMRT试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Tirzol试剂盒（RNAisoPlus）购于TakaRa公司；GelExtractionKit胶回收试剂盒、PlasmidMinikit质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。（2）配制的试剂①Hank's：以配制1LHank's缓冲液为例，称取氯化钠8g，氯化钾0.4g，磷酸氢二钾0.06g，碳酸氢钠0.35g，磷酸氢二钠0.06g，溶于800mL去离子水中，完全溶解后调节pH至7.2~7.4，加入去离子水用容量瓶定容至1L，121°C高压蒸汽灭菌15min。②甲基纤维素半固体培养基：A液：按照比例1%甲基纤维素（W/V）加入去离子水中充分搅拌混匀，121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却后置4°C冰箱，期间不断的轻轻晃动瓶身，2~3d即可完全溶解成为透明的液体。B液：按照比例混匀以下试剂即可，2×MEM（用不含酚红的MEM配制并高压或过滤灭菌）80mL，犊牛血清1~4mL，7.5%碳酸氢钠（高压或过滤灭菌）6mL，青、链霉素（1000U/mL）2mL。使用前，将A液和B液等量混合，立即覆盖于感染的细胞表面，注意避光培养。③氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：使用灭菌后的双蒸水配制成浓度为100mg/mL的溶液，用孔径为0.22µm的滤器过滤后分装，放在-20°C冰箱保存。④LB液体培养基：以配制100mLLB液体培养基为例，称取氯化钠(NaCl)1g，胰蛋白胨1g，酵母0.5g，溶于100mL去离子水中，待固体完全溶解后调节pH至7.0~7.2，121°C高压蒸汽灭菌15min。冷却后放入4°C冰箱保存。29 ⑤LB固体培养基：以配制100mLLB液体培养基为例，称取氯化钠(NaCl)1g，胰蛋白胨1g，酵母0.5g琼脂粉1.5g，溶于100mL去离子水中，待固体完全溶解后调节pH至7.0-7.2，121°C高压蒸汽灭菌15min。稍微冷却些后立即加入氨苄青霉素(Amp)4°C混匀，在超净工作台中倒置平板。⑥50×TAE缓冲液：以配制1L50×TAE缓冲液为例，称取Tris-base242.0g,量取醋酸57.1mL，Na2EDTA.2H2O37.2g于烧杯中，向烧杯中加入600mL去离子水，充分搅拌溶解。加入57.1mL的醋酸，充分搅拌。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。⑦1.5%琼脂糖凝胶：按比例在1×TAE缓冲液中加入1.5%的琼脂糖粉末，加热至完全溶解后，加入约1µL的DNA染色剂Goldenview，摇晃均匀后倒入插有梳子的板子中。3.1.4试验仪器恒温培养箱和恒温振荡培养箱购自Thermoforma公司；高速离心机5804购自Eppendorf公司；凝胶成像系统VersaDoc2000、普通PCR仪、核酸蛋白电泳仪powerpacuniversalTM购自Bio-Rad公司；OLYMPSIX71型荧光显微镜购自TOKYO公司；恒温水浴锅购自上海科升仪器有限公司；超纯水仪Milli-Q购自法国Millipore公司；高压蒸汽灭菌锅购自诸城安泰机械有限公司；金属浴购自上海之信仪器有限公司；移液器购自德国Eppendorf公司。3.2方法3.2.1引物的设计与合成参照GenBank中公布的25对BVDV全基因序列，见表4，在保守区设计10对特异性引物，用于SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015两株分离株的全基因组序列测定，相邻扩增片段之间至少重叠25bp，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物标注为P1~P10，合成后的引物在开该前室温12000rpm离心30s~60s以防止干膜状的OligoDNA散失，慢慢打开管盖后，加入适量的缓冲液或灭菌水（加入量参见DNA合成报告对应项或管上标签提示），盖上管盖后充分震荡混匀，混匀后瞬时离心使用，将暂时不用或长30 期贮存放入-20℃冷藏保存。3.2.2样本的处理将2.2.1中已经进行测序的35份BVDV阳性样本取约1g采集的牦牛粪便样本与已灭菌的PBS（pH7.4）5mL制成1:5悬液，充分涡旋5min。放入-80°C冰箱中反复冻融3次之后，在4℃条件下以3000rpm离心20min，取上清液在以12000rpm，4°C离心30min，取上清。将上清液于超净工作台内加入10%的青霉素和链霉素充分混匀后，用0.22μm滤器过滤，放入-80°C冰箱中保存。3.2.3病毒的分离培养研究表明该病毒能够在MDBK细胞上增殖，因此本研究选用MDBK细胞来对该病毒进行分离培养（Mowatetal.,1962）。细胞的培养：将MDBK细胞从液氮中取出后立即放入37°C水浴锅内解冻，完全溶解后，1000rpm室温离心10min，将冻存液去除。用现配制的含10%胎牛血清的DMEM生长液将保种管底部的细胞沉淀吹均匀，将重悬液吸出加入到2细胞瓶内，放置于37°C，5%CO35cm2细胞培养箱内培养过夜。待细胞铺满细胞瓶的80%~90%时弃掉原细胞生长液，用37°C预热的Hank's液洗涤3遍，加入0.25%EDTA的胰酶1mL铺平细胞生长面，放入37°C细胞培养箱内作用3~5min左右，在显微镜下观察细胞圆缩时弃掉胰酶，加入新配制含10%胎牛血清的DMEM生长液轻轻地将细胞从细胞瓶壁吹落下来，再用移液枪将细胞团块吹散进行细胞传代。病毒的培养：用新鲜配制的含有10%胎牛血清的DMEM生长液复苏MDBK细胞，37°C5%CO2条件下培养，待细胞铺满细胞瓶80%~90%时进行传2~3代使细胞的活力达到最佳。在准备进行细胞繁毒实验之前，加入已加温至37°C的0.25%EDTA胰酶溶液处理成细胞悬液，传入6孔细胞培养板，37°C5%CO2条件下培养细胞量达到2.5×106个/孔。将铺满MDBK细胞的6孔细胞培养板内的细胞培养液弃掉，用已预热至37°C的Hank's洗3遍，将3.2.1中处理好的粪便样本的上清液用DMEM（无血清）稀释10倍后，每孔加入1mL并摇动使其均匀分布于细胞表面，置于37°C5%CO2条件下吸附1h左右，弃去稀释液后用31 Hank's洗3遍，加入预热的含有2%胎牛血清的DMEM维持液，留两个孔作对照。放入37°C5%CO2条件下培养，每天观察细胞是否出现细胞病变（CPE），96h后收集细胞培养液并在-80°C条件下反复冻融3次，12000rpm，4°C离心20min，取上清经0.22μm滤器过滤，按20%量接入新的6孔细胞培养板中按照此方法盲传培养。当75%~95%的细胞产生CPE时，收集细胞培养液放入-80°C冰箱中保存。盲传的每一代收集的病毒液均需要提取其病毒的核酸，利用RT-PCR方法检测结果判断病毒的存在。3.2.4病毒的噬斑纯化将长满致密单层MDBK细胞的6孔细胞培养板内的细胞培养液弃掉，用已经预热至37°C的Hank's缓冲液清洗洗3遍，将2.4.2中收集的病毒液进行10倍系列稀释后分别接种于各孔，每孔加入100µL~200µL，轻轻摇动使接种物均匀分布于细胞表。置于37°C5%CO2恒温箱内，吸附1小时后，加入事先预热好的1%的甲基纤维素培养基，缓慢加入轻轻摇晃后使其均匀的覆盖在细胞的表面，待甲基纤维素凝固后，将6孔板放入37°C5%CO2的恒温箱内避光培养，48h~72h内，细胞出现CPE后，用5%福尔马林和1%的结晶紫的固定染色液，每孔加入0.5~2mL进行固定和染色感染细胞，20min后用自来水轻轻冲洗后出现噬斑后观察、计数。挑取选取清晰可见的噬斑加入到事先培养好的铺满80%~90%细胞的细胞瓶内扩繁病毒，待细胞瓶内80%左右的细胞出现CPE时收取细胞培养液，按照上述6孔细胞培养板的方法继续通过噬斑的技术纯化该病毒3次即可获得纯度较高的病毒液。3.2.5间接免疫荧光检测待细胞培养板上的细胞长成单层后，弃去维持液并用PBS（pH为7.4）洗涤3次，每次3min。每孔加入80%冰丙酮1mL，在4℃条件下固定10min左右，弃掉丙酮后用PBS洗涤3次。每孔加入1:300稀释的一抗（BVDV多克隆抗体）1mL，37℃孵育45min。一抗孵育结束后用PBS洗涤3次，再加1:1000稀释的FITC标记的兔抗羊IgG二抗，每孔1mL，37℃孵育45min。二抗孵育结束后再用PBS洗涤5次以上，滴加含有DAPI的封片液，室温孵育10min使用吸水纸32 吸取残留液体后直接在荧光显微镜下观察细胞核周边有无绿色荧光出现，判定标准如下：（-）无绿色荧光；（+）绿色荧光较弱，但清楚可见；（++）绿色荧光明亮；（+++~++++）绿色荧光闪亮。待检样本特异性绿色荧光强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。3.2.6病毒毒价测定将3.2.4中细胞培养物用细胞营养液做连续10倍梯度稀释，从10-3稀释到10-13，依次吸取病毒液100μL接种到长满单层MDBK细胞的96孔细胞培养板上，每一个稀释度接种8个培养孔，37℃5%CO2培养箱培养，逐天观察并记录病变情况，同时设立未接毒的正常细胞作对照，根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50，计算方法：距离比例＝（高于50%的百分数-50%）/（高于50%的百分数－低于50%的百分数）；TCID50的对数＝高于50%的最高稀释对数+距离比例×（稀释系数的对数）。3.2.7病毒RNA的提取与cDNA的合成取约400μL病毒培养物在-80°C冰箱中反复冻融3次之后，按照RNAisoPlus试剂盒说明书的步骤提取病毒培养物的总RNA，具体步骤如下：(1)取400μL病毒培养物加入200μL氯仿，颠倒混匀后在涡旋仪上剧烈震荡，直至液体呈乳白状（无分层现象），将液体室温静置5min，12000rpm，4°C离心15min。(2)将上层水相（不少于400μL）移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒后，室温静置至少10min，12000rpm，4°C离心15min。(3)弃去上清液，加入1mL75%冰乙醇，洗涤RNA沉淀管壁，弹起沉淀后涡旋2min，12000rpm，4°C离心10min。(4)弃去上清液，用100μL的枪头将EP管中残留的液体吸净，将EP管放在无菌操作台内风干，用15~20μLDEPC水将RNA溶解。提取好的RNA按照SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase（Invitrogen,USA）说明书的方法（如表2）反转录成cDNA，反转录反应条件：37°C，15min；85°C，15s；16si，10min，取出cDNA置于-20Ai冰箱保存。通过核酸蛋白检测仪检测DNA的33 质量，结果中A260/A280比值在1.8~2.0之间，浓度可达到100ng/到0左右即可。剩余部分的RNA放入-80°C冰箱中保存备用。3.2.8RT-PCR扩增参照QuickTaqHSDyeMix的说明方法，以3.2.7中的cDNA为模板，用3.2.1中的10对引物分段扩增SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株的全基因序列。PCR反应体系及反应条件如下表6。表6PCR扩增全基因序列的反应体系Table6ThereactionsystemofPCRtoamplifygeneticsequence组分反应体系(µL)QuickTaqHSDyeMix（2×）25Forwardprimer1.5Reverseprimer1.5cDNA2ddH2Oupto50反应条件如下（扩增不同片段的引物的退火温度不同，因此需根据具体设计的引物来设置PCR具体的反应条件）：94°C预变性2min；94°C变性30s，52°C退火30s，68°C延伸1min，设置40个循环；72°C延伸10min，4°C保存。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的片段，鉴定结果与预期引物设计的片段大小一致的PCR产物放置-20°C冰箱保存，准备胶回收纯化。3.2.9RT-PCR产物克隆与测序将RT-PCR扩增产物加到事先配制好的1.5%琼脂糖凝胶中，每块凝胶中的首个孔道需点加DNAMarkerⅡ、阴性和阳性作为对照。在电泳液中80~90V跑约30min，带目的条带清晰后，迅速将含有目的片段的凝胶切下，放置在干净的1.5mlEP管内。按照GelExtractionKit胶回收试剂盒的说明书对PCR扩增产物进行回收，具体步骤如下：①首先将称重空白的1.5mlEP管，然后将装有目的片段凝胶的1.5mlEP管称重，从而计算出凝胶的重量，之后加入等体积的BindingBuffer（XP2）。②将EP管置于50°C~60°C的水浴锅中水浴7min左右直至凝胶完全融化，其间每隔2~3min摇晃EP管混匀。34 ③待凝胶完全融化成透明澄清的黄色液体后，将液体吸入到HiBindDNAMini柱中，再把HiBindDNAMini柱装入干净的2mL收集管中，10000×g室温离心1min，之后弃去收集管中的液体。④向HiBindDNAMini柱内加入300μLBindingBuffer（XP2），10000×g室温离心1min，之后弃去收集管中的液体。⑤向HiBindDNAMini柱内加入700μLSPWWashBuffer（SPWWashBuffer使用前已经加入100%无水乙醇混匀），10000×g室温离心1min，之后弃去收集管中的液体。⑥重复第⑤步，弃去液体后将HiBindDNAMini柱重新放回收集管中，10000×g室温离心1min，之后弃去收集管中的液体。⑦室温下，以离心机最大的速度离心2min以除去柱内残余的液体。⑧将HiBindDNAMini柱放入干净的1.5mlEP管内，直接将15μL~30μL的ElutionBuffer或去离子水加入到HiBindDNAMini柱底部的膜上，静置2min后，室温下，以离心机最大的速度离心2min。⑨取4μL胶回收产物加入1μL左右的上样缓冲液（loadingbuffer）用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定回收结果与PCR产物片段大小是否一致，确认回收是否成功。之后将胶回收产物放置于-20°C保存。按照TaKaRa公司的pMD19-T载体试剂盒的使用说明，在冰上操作，将胶回收产物连接到pMD19-T载体内，16内，金属浴链接过夜。具体反应体系如表7。表7连接反应体系Table7reactionsystemofconnection组分反应体系(µL)pMD19-TVector0.5SolutionⅠ5胶回收产物4.5将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体步骤如下：①取出于-80°C保存的DH5α感受态细胞，在冰上融化15min左右，在无菌操作台内将10μL连接产物加到50μLDH5α感受态细胞中，吹打混匀后继续冰浴30min，冰浴过程中不要摇动。35 ②冰浴结束后，立即放入42°C水浴锅内，热激70s~90s，热激过程中不要摇动，热激结束后后放到冰上冷却5min。③冷却结束后，在无菌操作台内加入37°C预热的LB液体培养基1mL，吹打混匀后放入37°C恒温振荡培养箱内摇菌2h左右。④摇菌后，将菌液室温5000rpm离心5min，在无菌操作台内弃去800μL上清液，用剩余的200μL液体重悬沉淀，在含有Amp的终浓度为100μg/mL的LB固体平板上涂菌棒涂匀，置37°C恒温培养箱内培养12-16h。用10μL的枪头在无菌操作台内在培养好的平板内挑取表面光滑、形态颜色单一的单菌落10个，溶于10μL无菌水中混匀后吸出2μL作为模板，按照之前扩增相对应的目的片段的PCR引物及反应条件筛选出克隆转化成功的阳性单个菌落。根据琼脂糖凝胶电泳鉴定菌落PCR产物的结果，选取条带清晰、单一的单个菌落，加入到预热至37°C的1mL含Amp的LB液体培养基内，放入37°C恒温振荡培养箱内扩大培养10~12h左右。取500μL重组菌液送至生工生物工程有限公司测序，测序引物为M13通用引物，另外500μL重组菌液加入等体积的40%甘油-20°C保种。3.2.10序列的拼接和分析按照SmartRacecDNAamplificationkit试剂盒的使用说明扩增5'末端和3'末端基因序列。将测序成功获得的10个基因序列，参照GenBank中公布的BVDV分离株的全基因序列，参考株的具体信息如表3，利用BioXM、DNAMAN等软件对牦牛SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015的全基因测序结果进行拼接，并对全基因组的结构特征包括G＋C%含量及通过ORFFingdertool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找开放阅读框ORF的位置。用DNAStar等软件等对全基因组序列进行遗传进化分析，使用MEGA6.06软件以MaximumLikelihood法(Bootstrap值为1000)构建系统进化树，以了解两株分离株之间以及两株分离株与GenBank已公布的BVDV毒株之间的遗传进化关系。3.3结果3.3.1病毒的分离36 将RT-PCR呈阳性的35份粪便样本处理后接种于事先培养好的MDBK细胞中，盲传3代后，将毒株提取RNA，反转录成cDNA后，以RT-PCR方法检测BVDV，35份粪便样本仍呈阳性。盲传7代后，BVDV-1a亚型分离株SMU-Z6/1a/SC/2016和BVDV-1d亚型分离株SMU-DJ2/1d/QH/2015两个样本在70h左右出现与BVDV参考株OregonC24V阳性对照相同的典型的细胞病变。病变初期细胞开始出现圆缩的现象，之后圆缩的细胞逐渐出现拉网状，随着时间的增加，病变感染的局部区域的面积逐渐扩大，细胞逐步出现崩解直至全部脱落死亡，而正常的MDBK细胞阴性对照没有发生病变（图7），RT-PCR方法检测两株分离株BVDV仍呈阳性，初步确定分离到了两株CP型BVDV。3.3.2病毒的噬斑纯化病毒分离株通过MDBK细胞的连续扩繁培养后，可在接种细胞70h后产生CPE。噬斑纯化病毒的试验过程中，吸出甲基纤维素后，用结晶紫的固定染色后，肉眼可见近似圆形的透明噬斑，在显微镜下观察，看到不规则圆形透明的噬斑，噬斑的大小不一，且噬斑周围的边界清晰可见。未接毒的MDBK细胞则无CPE，结果如图6所示。通过挑取单个未经染色的噬斑进行扩大培养，获得的病毒液继续通过噬斑纯化试验的方法纯化该病毒株。噬斑纯化3次后即可获得纯度较高的病毒液，并用该纯化的病毒液接种到事先培养好的MDBK单层细胞上，约在24h时出现明显的CPE。ABA:分离毒株的噬斑;B:对照组A:Theplaqueofthestrain;B:Thenormalcells图6BVDV的部分噬斑纯化结果Figure6TheresultoftheBVDVplaquepurification37 3.3.3间接免疫荧光检测通过间接免疫荧光实验检测，荧光显微镜下观察可见，两株分离株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015以及阳性对照OregonC24V毒株的细胞膜内均出现了明亮的特异性绿色荧光，而MDBK阴性对照则未出现绿色荧光，如图7。说明成功分离到两株BVDVCP型毒株，分别命名为SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015。G图7SMU-Z6/1a/SC/2016（A）、SMU-DJ2/1d/QH/2015（B）和OregonC24V（G）在MDBK细胞中引起典型的致细胞病变作用，正常MDBK细胞用作阴性对照（C）。通过IFA检测SMU-Z6/1a/SC/2016（D）、SMU-DJ2/1d/QH/2015（E）和OregonC24V（H）感染的MDBK细胞中BVDV抗原，正常MDBK细胞做对照（F）。Figure.7BVDVantigeninMDBKcellinfectedwithSMU-Z6/1a/SC/2016(A)、SMU-DJ2/1d/QH/2015(B)andOregonC24V(G)byIFADetectionofnormalMDBKcellsbyIFA(C).SMU-Z6/1a/SC/2016(A)、SMU-DJ2/1d/QH/2015(B)andOregonC24V(G)causetypicalCPEinMDBKcellsandnormalMDBKcellswereusedasnegativecontrol(F).38 3.3.4病毒毒价测定按Reed-Muech氏法计算牦牛BVDV分离株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015感染MDBK细胞的TCID50，试验记录出现病毒增殖的细胞孔数。以SMU-Z6/1a/SC/2016为例，能够使半数细胞出现CPE的病毒稀释度（TCID-8与10-9之间，即在10-8稀释度下，出现CPE的百分比为53.3%，50）介于10在10-9稀释度下，出现CPE的百分比为23.5%。其准备的稀释倍数：距离比=高于50%的%（53.3）－50高于50%的%（53.3）－低于50%的%（23.5）TCID50=高于50%的病毒稀释度的负对数（8）+距离比（0.11）=8.11即SMU-Z6/1a/SC/2016分离株的TCID-8.11/100µL50=10同理，可计算SMU-DJ2/1d/QH/2015的TCID-5.81/100µL50=10按Reed-Muench法对两株分离株的效价进行计算，结果显示，该两株分离株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015第9代细胞毒的TCID50/100µL分别为10-8.11和10-5.81。3.3.5各片段的PCR扩增与纯化培养至第9代时收集BVDVSMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015病毒株感染的MDBK细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，以10对PCR引物扩增基因组全部10个片段。P1~P10引物的序列及各段扩增片段的长度如表8。表8SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株全基因组扩增的引物Table8ThesequenceofthePCRprimersusedtoamplifythegenomeoftheSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015strains引物名称引物序列(5’→3’)扩增长度(bp)BVDV-1F-GAATTAGAAAAAGCTCCTGTATACA1252R-GTACAGATTTTYTCTGGCCABVDV-2F-AAGGGATACAACGGGCAATG1038R-TACTTGCCCTGCCTCTTCBVDV-3F-TGTATAAGACCTAATTGGT502R-CATCACATGGGCAAATCGCA39 BVDV-4F-ACAGAAATCAGCGGACAC1330R-CCTTATAYCTRAAGTARTCTGTBVDV-5F-TAGAGCGGGCAGACCTTA1468R-GCCRTGGGWAATCTTACTBVDV-6F-AGATTTCCCACGGCATTA1104R-CGTRGGCACSAASACCAGBVDV-7F-CCTATAGAGGAATTCATAG1856R-GAATAGGCTGGCAACGAABVDV-8F-CGGTTCGTTGCCAGCCTAT1455R-AGGCTGTCTTCCCGATTABVDV-9F-TCAACGAAGAATCTGGGACT1338R-GTGTTKCACGGATGGSTTBVDV-10F-CACAATAGCCAACCCATCC1724R-GAAGACCTCTAACAGCCCC3.3.6序列拼接利用DNAStar软件将序列进行拼接，获得SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株的全基因组序列SMU-Z6/1a/SC/2016的完整基因组长度为12,178bp，G+C含量为47.0％。ORF为11703bp，编码3884个氨基酸，两端分别为300bp长的5'-UTR和175bp长的3'-UTR。SMU-DJ2/1d/QH/2015长度为12,255bp，G+C含量为45.6％，ORF为11780bp，编码3897个氨基酸，两端分别为374bp长的5'-UTR和190bp长的3'-UTR。两组全基因组组成结构与其他BVDV相似，含有4种结构蛋白和7种非结构蛋白。基因组中各基因编码大小及位置见表9。表9SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株各基因片段大小及位置Table9LengthandlocationofeachgeneinthegenomeofstrainSMU-Z6/1a/SC/2016andSMU-DJ2/1d/QH/2015基因位置SMU-DJ2/1d/QH/2015SMU-Z6/1a/SC/20165’UTR1-3741-300NPRO375-878301-804C879-1187805-1113E01187-18701114-1797E11871-24471798-2374E22448-35682375-349540 P73569-37793496-3706NS23780-51293707-5056NS35130-71785057-7105NS4A7179-73707106-7297NS4B7371-84117298-8338NS5A8412-98998339-9826NS5B9900-120569827-120023’UTR12056-1225512003-121783.3.7SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015基因型鉴定及系统发育树分析将两株分离株与GenBnak中公布的其他BVDV毒株的全基因序列进行Blast比对，SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015两株分离株之间的核苷酸同源性为80.2%。其中SMU-Z6/1a/SC/2016基因组的核苷酸同源性及氨基酸同源性分别为68.4％〜89.8％/67.1％〜84.4％。SMU-DJ2/1d/QH/2015基因组的核苷酸同源性及氨基酸同源性分别为71.8％〜97.3％/70.7％〜90.5％。其中，SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015两株分离株的5’-UTR与GenBank中BVDVYak株的5’-UTR的核苷酸同源性分别为70.1%和74.7%。将分离株与25株BVDV毒株的E2基因及全基因建立系统发育进化树。进化树分析显示分析显示SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与BVDV-1d型韩国毒株10JJ-SKR的同源性较高，亲缘关系较近，与国内分离的其他毒株同源关系较远，但SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株单独位于一支上，属于BVDV-1d型，如图8。SMU-Z6/1a/SC/2016分离株与BVDV-1a型OregonC24V和NADL的同源关系较近，位于同一分支上，而BVDVOregonC24V和NADL毒株均为毒力较强的CP型BVDV标准毒株。41 ab图8基于E2序列（a）和全基因（b）的系统发育分析。（测序株被标记为黑点）Figure.8PhylogeneticanalysisofthesequencingstrainsbasedonE2sequence(a)andcompletegenome(b).(Thesequencingstrainismarkedasablackspot)42 3.3.8NS2-3蛋白的序列分析CP型的病毒能够通过内部加工将NS2-3蛋白裂解为NS2和NS3蛋白，NS3蛋白是CP型BVDV在蛋白水平的分子标记。SMU-Z6/1a/SC/2016与SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株之间的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为77.0%和88.1%。SMU-Z6/1a/SC/2016与其他BVDV毒株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为67.9%~88.2%/81.1%~88.7%。SMU-DJ2/1d/QH/2015与其他BVDV毒株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为74.0%~98.3%/88.1%~99.6%。而SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域与其他BVDV-1a毒株的NS3区域相比显示出明显的变化。我们确定了SMU-Z6/1a/SC/2016菌株NS3基因中存在49个有意突变和62个无意突变，导致47个氨基酸变化和1个氨基酸缺失。SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域的变异可能会影响毒力和毒株的致病性。而SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株的变化则相对较小。3.4讨论本研究从四川腹泻牦牛粪便样本中分离两株病毒，经病毒分离培养、RT-PCR与间接免疫荧光方法鉴定，确定两株病毒均为CP型BVDV，命名为SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015并对该两株分离株进行了全基因组测序和分析。研究结果显示，SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015全基因组长度均为12000bp左右，基因组组成与GenBank中公布的BVDV毒株组成一致。Blast比对及构建系统发育树显示，SMU-Z6/1a/SC/2016与BVDV-1a亚型的亲缘关系较近，属于BVDV-1a亚型，与BVDV-1a标准毒株OregonC24V和NADL的同源性较高，遗传进化关系较近，位于同一分支上，而BVDVOregonC24V和NADL毒株均为毒力较强的CP型BVDV标准毒株，也是国际上常用的BVD制苗用毒株。SMU-DJ2/1d/QH/2015与BVDV-1d亚型的亲缘关系较近，属于BVDV-1d亚型，这也是首次于青藏高原地区分离并获得BVDV-1d亚型的毒株。在之前的报道中，中国BVDV主要流行的亚型是BVDV-1b和1m。青海和西藏地区牦牛的主要流行亚型为BVDV-1b，1q和1m（Gongetal.,2014；Dengetal.,2015）。而43 BVDV-1d主要流行与中欧国家和东亚国家（Kutaetal.,2013；Toplaketal.,2004）。在之前的研究中，有报道（Dongetal.,2016）分离出三种BVDV-1d病毒，近期的研究报道BVDV-1d存在于中国西北地区的牛群中，而BVDV-1d亚型也在中国逐渐流行（Gongetal.,2014；Dengetal.,2015）。通过全基因组分析可知两株牦牛BVDV分离株与之前分离的BVDVYak株之间同源性很低，这也说明了青藏高原部分地区BVDV的流行范围广且存在BVDV不同亚型的感染，因此，牦牛BVDV的防控必须要考虑BVDV的基因型的差异。通过分析全基因序列，在比较BVDV-1a毒株的序列中，SMU-Z6/1a/SC/2016的E2糖蛋白编码区变异情况比较大，与其他BVDV-1a毒株的E2基因核苷酸及氨基酸同源性分别为78.6%〜88.8%/72.9%〜78.3%。结果表明，SMU-Z6/1a/SC/2016的抗原性可能与其他BVDV-1a毒株具有明显差异，可能是新型病毒。而SMU-DJ2/1d/QH/2015与其他BVDV-1d毒株的E2基因核苷酸及氨基酸同源性分别为97.2%〜97.8%/95.7%〜96%，无明显差异。此外，CP型的病毒能够通过内部加工将NS2-3蛋白裂解为NS2和NS3蛋白，NS3蛋白是CP型BVDV在蛋白水平的分子标记，NS3核苷酸序列的变异与病毒的毒力有关。SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域与其他BVDV-1a毒株相比显示出明显的变化。我们确定了SMU-Z6/1a/SC/2016毒株NS3基因中存在49个有意突变和62个无意突变，导致47个氨基酸变化和1个氨基酸缺失。SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域的变异可能会影响毒力和毒株的致病性。而SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株的变化则相对较小。因此，我们也将在下一步的研究中着重研究两株病毒的致病性及致病力等相关问题。本实验还根据Reed-Muench法测定了两株分离猪的TCID50/100µL，结果分别为10-8.11和10-5.81，可见，两株病毒的毒力相差很大，经分析原因可能有以下几点：（一）样本采集地区差异。川藏地区由于地理、文化和经济等多种因素导致牦牛的养殖多属于小型养殖或散养，而BVDV的传播具有地域差异（王炜,2014），因此可能导致两株分离株存在明显的毒力差异。（二）样本差异。SMU-Z6/1a/SC/2016样本采集于四川地区腹泻十分严重的牦牛，该牦牛临床症状明显，有排血便的现象。（三）环境因素。牦牛的生存环境恶劣，且多与野生生物共同分享水食物等，因此牦牛生态系统的复杂性为BVDV的种间传播提供了44 巨大的潜力，也造成了病毒毒力的差异。综上所述，我们通过接种MDBK细胞分离并纯化了两株cp型牦牛BVDV-1a和1d毒株，并获得了其详细的全基因组信息。这也是青藏高原地区首次分离并报道了两株cp型牦牛BVDV毒株和其完整的全基因组序列。本研究所获得的数据为后续研制BVDV疫苗提供基础。3.5小结首次在我国牦牛群中分离到了BVDV-1a和BVDV-1d亚型毒株，分别命名为SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015并获得两株分离株的全基因组序列，为制备BVDV疫苗提供基础。45 结论1.利用RT-PCR方法对2015-2016年青藏高原部分地区（西藏、云南、青海、四川）采集的共计390份牦牛腹泻和临床健康的粪便样本开展分子流行病学调查。结果表明BVDV在青藏高原地区感染普遍存在总检出率为19.23%，腹泻样本的总检出率为25.52%，临床健康的牦牛粪便样本的总检出率为13.13%，与近年来的流行病学调查结果相近。从四个地区随机抽取35份阳性样本进行5’-UTR、Npro和E2基因扩增及建立系统发育进化树显示，BVDV-1d为2015年~2016年青藏高原部分地区牦牛BVDV主要的流行亚型。2.首次在我国牦牛粪便中分离到了BVDV-1a和BVDV-1d亚型毒株，分别命名为SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015。3应用RT-PCR扩增技术成功获得了两株分离株的全基因组序列，基因组GenBank登录号分别为MF166858和MF693403。经全基因组序列分析可知SMU-Z6/1a/SC/2016E2糖蛋白编码区变异情况比较大且NS3区域与其他BVDV-1a毒株相比显示出明显的变化，可能会影响毒力和毒株的致病性。而SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株的变化则相对较小，与BVDV-1d亚型毒株10JJ-SKR的亲缘关系较近，但单独位于一支。46 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作者在攻读硕士学位期间发表的论文1.陈新诺,肖敏,阮文强,覃思楠,岳华,汤承,张斌.川藏地区牦牛BVDV分子流行病学调查及分离鉴定.畜牧兽医学报,2018,49(3):606-613.2.陈新诺,张朝辉,徐林,唐川,余劲,李劲,廖昆,汤承,张斌.青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病学调查.动物医学进展,2016,37(9):39-42.3.陈新诺,张斌.牛病毒性腹泻病毒的分子生物学研究进展.中国畜牧兽医,2017,44(11):3137-3142。4.ZeZeng§,XinnuoChen§,HuaYue,HuanHe,YupengRen,ChengTang,BinZhang*.TheeffectofrfaDandrfaFofHaemophilusparasuisonlipooligosaccharideinducedinflammationbyNF-κB/MAPKssignalinginporcinealveolarmacrophages.TheJournalofVeterinaryMedicalScience,2018,80(5):842-845.53 致谢本论文是在导师张斌教授的悉心指导下完成的。论文的选题、试验方案的设计、结果的分析和论文的撰写等诸多方面无不凝结着导师的心血。导师为人正直、知识渊博、治学态度严谨和孜孜不倦的追求精神都在潜移默化的影响着我、激励着我，导师是我终生学习的榜样。导师不仅在学习方面支持鼓励我，并在生活方面给予我关爱和帮助。在此，衷心感谢导师对我三年的指导与关爱，向导师致以最崇高的敬意。感谢汤承教授、岳华教授、罗薇教授、刘亚刚教授、张焕容教授、杨发龙教授、任玉鹏老师和王远微老师对我学习、实验的帮助和关心，感谢西南民族大学预防兽医教研室的全体老师在学习期间给予的帮助与关怀。感谢在试验过程中给予我很大帮助的师兄师姐，阮文强、覃思楠、王丹、周叶、周可磊、阚蕊慈和周群等师弟师妹们，是你们的帮助和爱护，使我渡过了难忘的三年研究生生活，是你们的支持，激励着我不断进取，顺利地完成学业。愿你们实验顺利，前程似锦！感谢我亲爱的室友夏宾雁、张昕和蔡雯祎，是你们在我实验繁忙的时候帮我带饭，帮我取快递，以及在实验上的帮助，很荣幸能够和你们一起生活3年！同时也要感谢2015级预防兽医硕士的小伙伴们马艳君、葛志琪、张兴民、管礼麟、任攀、王牧川、葛润洲、薛照越，感谢你们平时对我的帮助，也祝你们事业有成！再者，感谢所有参与论文评审和答辩的各位老师。虽然本人竭尽全力完成此论文，但是由于本人知识及阅历的局限，论文中仍有不足和疏漏的地方，敬请各位老师批评指正。最后，感谢我的父母，感谢你们生了一个这么大的我，你们在精神上的坚定支持和物质上的无私奉献让我能够全身心的投入到学习生活中，你们之间的相知相守相濡以沫为我营造了无比温馨的家庭氛围，让我永远知道无论我在外面受到多少挫折，家永远是我的港湾。在今后的岁月中，我也会更加努力的学习和工作，54 不辜负你们对我的期望！感谢母校西南民族大学这片沃土，让我渐渐成熟。衷心祝愿母校西南民族大学的明天更加美好！55