我国部分地区PRRS分子流行病学及病毒遗传变异研究.pdf

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分类号：S858.28单位代码：10193密级：公开学号：20130206硕士学位论文我国部分地区PRRS分子流行病学及病毒遗传变异研究TheMolecularEpidemiologyandGeneticDiversityofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusinthePartialRegionsofChina作者姓名：常晓博学位类别：农学硕士专业名称：临床兽医学研究方向：现代兽医临床诊疗技术指导教师：张辉高级实验师安同庆副研究员所在学院：动物科学技术学院2016年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是一种广泛流行且严重影响养猪业健康发展的猪的繁殖与呼吸障碍性传染病。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus,PRRSV）是单股、正链RNA病毒。在自然界和免疫压力下，PRRSV不断变异，不断出现新的病毒株，给PRRS的防治带来了巨大的挑战和严峻的考验。为了解2013~2014年我国PRRS分子流行病学及病毒遗传变异情况，本研究对我国部分地区（以东北地区为主）401份样品进行了RT-PCR检测，并对51份阳性样品的GP5和部分NSP2基因进行了遗传进化及序列比对分析。结果表明：所检测的样品中PRRSV阳性率为20.2%，GP5和NSP2遗传进化分析表明51个病毒株均为北美洲型毒株，且以HP-PRRSV为主，经典株与变异株共存。其中JL580毒株的GP5和NSP2不同于国内的经典和高致病性毒株，与美国NADC30毒株属于同一个新的亚群。GP5氨基酸序列分析表明，大多数毒株在氨基酸高变区、中和抗原表位和诱导表位发生了一定的变异。NSP2部分氨基酸序列分析表明，与CH-1a相比大多数PRRS病毒株的NSP2在基因高变区缺失30个氨基酸，1株缺失34个氨基酸，1株缺失20个氨基酸。GP5和NSP2遗传进化及氨基酸序列分析结果表明我国PRRSV表现为更为复杂的遗传多样性。鉴于JL580株的特殊性，本研究对该病毒进行了全基因组序列的测定与分析。结果表明：JL580株是一个自然重组毒株，由美国NADC30毒株与国内高致病性毒株重组而成，且不同于中国现流行的其它毒株，属于一个新的亚群。同源性分析表明，JL580与中国经典毒株CH-1a的核苷酸同源性是84.9%，与HP-PRRSV代表株JXA1、HuN4、TJ的核苷酸同源性分别是84.8%、84.9%、85%。对基因组的进一步分析表明，JL580病毒株GP5蛋白与CH-1a、VR-2332、HuN4相比，信号肽和跨膜区的氨基酸发生了显著变异，且NSP2存在3处共131个氨基酸的缺失，与HP-PRRSV的30个氨基酸的缺失有明显的不同。仔猪致病性分析表明JL580毒株对仔猪具有较高的致病性。我们的研究表明NADC30类毒株已经在我国部分省份出现，这给当前的预防和治疗措施带来了一定的难度。因此我们有必要更新监测数据和疫苗策略，以防止疾病的继续蔓延。本研究将为PRRS流行病学调查研究提供必要的实验数据，为制定切实有效的预防和治疗措施提供科学依据。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；分子流行病学；JL580；基因重组I AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)iswidelypopularandisaneconomicallydevastatingviraldiseasethreateningthehealthydevelopmentofswineindustryworldwide,whichischaracterizedbyreproductivefailureinsowsandrespiratorydiseaseinpigsofallages.PRRSVisasingle-strandpositive-senseRNAvirus.PRRSVisundergoingvariationandhasemergednewvirusstrainsunderthepressurefromnatureandimmunity,posingachallengetothepreventionandcontrolofPRRS.Toinvestigatetheepidemiologyandgeneticvariationofpathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRSV)inChinafrom2013to2014,401tissuesamplescollectedfrompartialregionsofChina(mainlyinthenortheastofChina)weretestedbyRT-PCR.TheGP5andpartialNSP2genesof51positivesampleswereamplified,sequenced,phylogeneticandalignmentanalyzed,respectively.TheresultsshowedthatthePRRSVpositiveratewas20.2%,ThephylogeneticanalysisofGP5andNSP2demonstratedthatallstrainsbelongedtoNorthAmericangenotype,whichgaveprioritytoHP-PRRSV,withcoexistenceofclassicstrainsandmutantstrains.TheGP5andNSP2ofJL580aresimilartoNADC30,belongingtoanewsubtypeandclearlydifferingfromotherprevalentstrainsinChina.AminoacidanalysisofGP5revealedthatmoststrainshadmutations,especiallyinthehyper-variableregions,theprimaryneutralizingepitopeanddecoyepitope.AminoacidalignmentoftheNSP2highlyvariableregionofallPRRSVstrainscomparedwiththoseotherstrainsshowedthatmostvirusstrainshada30-aadeletion,onestrainhada34-aadeletionandanotherstrainhada20-aadeletion.ThephylogeneticandaminoacidanalysisofGP5andNSP2demonstratedthatPRRSVismorecomplexanddiverseinChina.InconsiderationofthespecificityofJL580strain,thefull-lengthgenomicsequenceofJL580strainswasamplifiedandanalyzed.TheresultsshowedthatJL580strainwasarecombinationstrainandclearlydifferentfromotherprevalentstrainsinChina,WhichwasanewgenotypeformedbyageneticexchangebetweenaNADC30-likePRRSVstraininNorthAmericaandtheHP-PRRSVstrainsinChina.JL580strainshared84.9%nucleotidesimilarityofcompletesequencecomparedwithCH-1astrainand84.8%,84.9%,85%comparedwithJXA1,HuN4andTJstrains.AminoacidmutationsofGP5inthesignalpeptideandtransmembranedomainhadhugevariationcomparedtoCH-1a,VR-2332andHuN4.Inaddition,thefull-lengthgenomicsequenceofthevirusrevealedthreedistinctdeletions（131-aa）inNSP2whichwassignificantlydifferenctfromthe30-aaofHP-PRRSV.ThepathogenicityofJL580ishighcomparatively.OurstudydescribedandcharacterizedtheII importationofaNADC-30-likePRRSVstrainfromNorthAmericathathasemergedinseveralprovincesinChina,whichresultedinthedifficultytopreventandcontrolwithcurrentmeasures.Therefore,wesuggestthatsurveillancedataandvaccinestrategiesbeupdatedtopreventthediseasefromspreadingfurther.ThisstudyaimstoprovidenecessaryexperimentaldatafortheepidemiologicalinvestigationofPRRS,whichwilllayafoundationformakingeffectivepreventionandtreatmentmeasures.Keywords:PRRS;molecularepidemiology;JL580;geneticrecombinationIII 目录前言.........................................................................................................................................1第一篇文献综述.......................................................................................................................2第一章猪繁殖与呼吸综合征概述...........................................................................................21.1病原及病毒特性..............................................................................................................21.2基因组结构特征..............................................................................................................31.3主要的结构蛋白和非结构蛋白......................................................................................31.4生态学特征......................................................................................................................51.5PRRSV致病机理..............................................................................................................51.6临床症状及病理组织变化..............................................................................................61.7PRRSV遗传变异..............................................................................................................61.8PRRSV疫苗研发的科学制约..........................................................................................71.9预防和治疗......................................................................................................................8第二篇研究内容.......................................................................................................................9第一章我国部分地区PRRS流行病学..................................................................................91.1材料和方法......................................................................................................................91.2结果................................................................................................................................141.3讨论................................................................................................................................221.4小结................................................................................................................................23第二章特异性毒株JL580的分离鉴定、遗传变异及致病性分析....................................242.1材料和方法....................................................................................................................242.2结果................................................................................................................................282.3讨论................................................................................................................................362.4小结................................................................................................................................37结论...................................................................................................................................39参考文献...................................................................................................................................40IV 附录...................................................................................................................................46作者简介...................................................................................................................................47致谢...................................................................................................................................48V 前言猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus,PRRSV）引起的猪的一种急性、高度接触性传染病。[1-4]PRRS于20世纪80年代首次报道于美国，随后迅速在欧洲和美洲地区蔓延，我国于[5][6]1995年首次分离到PRRSV，命名为CH-1a株。目前该病在全球范围内流行。PRRSV有两种基因型，分别为欧洲型（EU-type）和北美洲型（NA-type），我国主要流行毒株[7]为北美洲型毒株。在自然界和免疫压力下，PRRSV不断变异，不断出现新的病毒株，给PRRS的防治带来了巨大的危机和挑战。PRRSV的毒力由多基因控制，并且存在于病毒结构蛋白和非结构蛋白中。PRRSV基因组中ORF5是高变区之一，其编码的结构蛋白是PRRSV主要[8]的宿主保护性抗原蛋白，PRRSV的变异可以导致PRRS疫苗株交叉保护率低下，而且[9]GP5蛋白具有受体识别作用和诱导细胞凋亡的功能。编码PRRSV的非结构蛋白基因中，位于ORF1a的NSP2基因最易发生变异，主要表现为氨基酸的突变、缺失和插入。2006[10]年，我国南方暴发的HP-PRRSV基因组中NSP2存在30个不连续氨基酸的缺失；Darwich等通过分析PRRSV基因I型毒株的基因和免疫多样性发现他们所研究的基因I[11]型PRRSV中NSP2存在74个氨基酸的缺失。近年来，我国部分省份出现了NADC30[12-14]类毒株，其NSP2存在131个不连续氨基酸的缺失。另外，欧洲型和北美洲型NSP2高变区氨基酸缺失的报道表明NSP2对于病毒的复制不具有决定性作用但在宿主免疫方[15]面可能具有至关重要的作用。因此，针对GP5和NSP2的研究有助于了解整个基因组的遗传衍化特征。本研究对我国部分地区401份疑似PRRS的猪的组织样品进行了RT-PCR鉴定，对51份阳性样品的GP5和部分NSP2基因进行了遗传进化及序列比对分析，并对新毒株JL580进行了全基因组序列的扩增、测定、序列比对及致病性分析。本研究旨在及时监测并掌握我国现阶段PRRSV的流行现状，从而为我国PRRSV遗传进化及疫病防制提供一个新的参考依据。1 第一篇文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征概述猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是一种广泛流行且严重影响养猪业和食品行业健康发展并造成巨大经济损失的猪的繁殖与呼吸障碍性传染病，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus,PRRSV）。该病以厌食、发热，母猪生殖障碍，怀孕母猪后期发生流产，产下死胎和木乃伊胎儿，幼龄仔猪发生呼吸系统性疾病和大量死亡为主要特征。该病最早作为“猪神秘病”报道于20世纪80年代的美国中西部。1990年，英国、法国、德国、荷兰、比利时、西班牙等西欧国家也[4]出现了此病。1991年荷兰学者确定了PRRS病因，并通过流行病学方法发现和分离出[2]了Lelystad病毒，命名为Lelystadvirus（简称LV株）；1992年美国也分离到了命名[1]为ATCCVR-2332的PRRSV毒株。相对于欧洲和北美洲国家，我国台湾地区1991年出现PRRS，我国内地于1995年出现此病，并于1996年由郭宝清等首次分离得到了以[5]CH-1a命名的PRRSV。2006年我国南方地区暴发了以持续性高热、高死亡率为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRSV），其突发性、高致病性、高发病率和高死亡[16]率给中国养猪行业带来了空前的损失。PRRSV有两种基因型，分别为基因Ⅰ型和基因[17,18]Ⅱ型，我国主要流行株为基因Ⅱ型，即北美洲型。PRRSV是单股、正链RNA病毒，在自然界和免疫压力下极易发生变异和基因重组。因此，PRRS不仅是现代化商业生产[10]中重要的影响因素，同时也是我国规模化养猪场的主要传染病之一。未来的疫苗研制可以专注于实现免疫保护效率的提升和提高整个PRRSV遗传多样性更为广泛的保护手段方面。1.1病原及病毒特性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是单股、正链RNA病毒。PRRSV与马动脉炎病毒(equinearteritisvirus,EAV)、小鼠乳酸脱氢酶活性病毒(lactate-dehydrogenaseelevatingVirus,LDV)、猴出血热病毒(simianhemorrhagicfevervirus,SHFV)以及新发现的不稳定[19]的负鼠病毒（wobblypossumdiseasevirus,WPDV）同属于动脉炎病毒属（Arterivirus）、[17,20]动脉炎病毒科（Arteriviridae）、套式病毒目。不同于其他病毒，PRRSV是一种包膜[21]病毒。结构分析表明，PRRSV是由一个螺旋状的核衣壳组成，并包裹成一个空心球。[22]病毒粒子呈现一种卵圆形，直径大约为55-65nm，核衣壳是对称的二十面体，直径为[23]30-35nm。通过电镜观察可看到其表面有约5nm大小的突起，并且被一层脂质膜包裹。病毒在低温环境下具有较好的稳定性，在-70℃冰箱可保存18个月，4℃可保存1个月；2 高温干燥情况下稳定性下降，37℃条件下仅可保存48h，56℃时病毒完全失去感染力。另外，病毒对pH具有较强的依赖性，当pH值在6.5-7.5之间时相对较稳定，一旦pH值高于7或者低于5时，病毒感染性将会损失90%以上，并且感染力会很快消失。自然分[24]离的PRRSV没有血凝特性，但是Dea等研究表明经过非离子去污剂和脂溶剂处理后，PRRSV可以凝集小鼠的红细胞。1.2基因组结构特征PRRSV基因组为单股、正链、不分节段的RNA，全长大约为15kb，是目前发现的五种动脉炎病毒家族成员中基因组最大的一个。病毒基因组具有5′端帽子结构和3′端[25]poly(A)尾巴，它们是参与病毒复制所必需的元件。PRRSV基因组是多顺反子的，通过两种不同的转录机制表达一系列组件和结构蛋白。PRRSV基因组可以编码10个开放性阅读框，分别是ORF1a，ORF1b，ORF2a，ORF2b，ORFs3-7，以及包括ORF5a在内[26-28]的ORF5。ORF1a和ORF1b位于基因组5′端非编码前导序列之后，大约是PRRSV全基因组的80%，ORF1a中又包括NSP1α，NSP1β，NSP2，NSP3，NSP4，NSP5，NSP6，NSP7，NSP8；ORF1b包括部分的NSP8和4个非结构蛋白，分别是依赖于RNA的RNA聚合酶（NSP9），含金属结合区和核苷酸三磷酸结合区的螺旋酶基元（NSP10），以及功能未知的NSP11和NSP12。1.3主要的结构蛋白和非结构蛋白有研究表明PRRSV至少含有7个结构蛋白，ORF5编码的GP5蛋白（或E蛋白），ORF6编码的基质蛋白（M蛋白），ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白），GP5、M蛋白和N蛋白是PRRSV的主要结构蛋白；另外，次要结构蛋白GP2、GP3和GP4则由ORF2、ORF3和ORF4编码。Wu等研究发现在ORF2内还存在一个新的可读框，即ORF2b，其主要编码73个氨基酸的非糖基化蛋白，而且还发现ORF2b所编码的蛋白是病毒粒子的[29]主要结构蛋白。这些结构蛋白和非结构蛋白共同组成了以非常保守的核衣壳蛋白包裹的全基因组RNA形成的正二十面体的核衣壳为中心，外层围绕着M蛋白为骨架的脂质双层膜，囊膜上有由ORF2b编码的蛋白、GP2、GP3、GP4以及GP5构成的囊膜突起的[30-32]病毒颗粒（图1.1）。图1.1PRRSV主要结构蛋白（引自Meulenberg,2000）Fig.1.1ThestructuralproteinofPRRSV(fromMeulenberg,2000)3 1.3.1E蛋白E蛋白又称为GP5蛋白，是由ORF5编码的，是PRRSV的囊膜蛋白，也是PRRSV变异最为显著的一个结构蛋白，分子质量大约为25kDa。Ⅰ型（欧洲型）PRRSV的GP5[33,34]蛋白有201个氨基酸，Ⅱ型（美洲型）PRRSV的GP5蛋白是200个氨基酸，欧洲型和美洲型GP5核苷酸同源性仅为51%~55%。GP5蛋白在N端含有一个大约32个氨基酸的信号肽区域和两个抗原区，一个存在于胞外区（氨基酸27~41），另一抗原区在蛋白的C端（氨基酸180~197）。而且，GP5蛋白C端的50个氨基酸对于维持蛋白的抗原性具有至关重要的作用，如果GP5蛋白C端失去这50个重要的氨基酸，那么GP5就会失[35]去与血清的反应性。GP5蛋白的60~125处的氨基酸由一个高变区组成，并且包含三[36]个跨膜区。GP5蛋白的超突变是病毒之间缺乏免疫交叉反应的重要原因，此外，GP5[37]蛋白可诱导产生中和抗体，且在体内外均可诱导细胞凋亡。1.3.2N蛋白N蛋白与病毒RNA相互作用共同形成病毒的核衣壳，N蛋白是由ORF7编码形成的，是一个碱性的亲水性蛋白，有123~128个氨基酸，分子质量约为14~15kDa。N蛋白可以[21]表达最小的亚基因mRNA（mRNA7），并且在PRRSV感染的细胞内，N蛋白的表达[34]水平最高。N蛋白是最有免疫源性的蛋白，且PRRSV感染猪之后针对N蛋白的抗体是最早产生的，并且可以在猪体内持续很长一段时间，但是其抗体不是中和抗体且不具[38]备保护性。1.3.3M蛋白M蛋白是第三类膜蛋白，又称基质蛋白，是由ORF6编码，有173（欧洲分离株）[39,40]或174（美洲分离株）个氨基酸，分子量为18~19kDa。M蛋白有一个非常突出的特征，即其蛋白N端有3个特别明显的疏水区，位于M蛋白的跨膜区，即第17~88位的氨基酸残基处。而且疏水性分析表明，M蛋白可能存在一段很短的氨基酸（第10~18位氨基酸），并且暴露于病毒粒子的表面。此外，M蛋白是一种非糖基化蛋白，且是最为保守的一个结构蛋白。有研究发现，M蛋白和GP5蛋白通过二硫键形成的异质二聚体对[41,42]于动脉炎病毒的感染性是非常重要的。M蛋白具有很强的免疫原性，有研究表明M[43]蛋白上具有中和表位，且由于M蛋白与其他膜蛋白具有密切的关联性，M蛋白很可能在病毒的装配及出芽过程具有相当重要的作用。1.3.4NSP2NSP2位于ORF1a的中上游，是一个多功能蛋白，且是PRRSV变异最为显著的非4 结构蛋白，以高变区氨基酸的突变、缺失和插入为主要变异特点。NSP2在PRRSVⅠ型[44]和Ⅱ型间具有较大的基因差异性，其中氨基酸同源性仅为40%左右。NSP2蛋白在高变区之后近N端含有一个木瓜酶样蛋白域（PL2），研究表明PL2具有去泛素化活性和[45,46]ISG15依懒性宿主免疫活性。此外，NSP2具有种属特异性，这可能与PRRSV对细胞和组织的嗜性有关，也有可能与病毒株的致病性相关。鉴于NSP2变异的特殊性，在流行病学调查过程中可通过分析比对NSP2基因序列来进行PRRSV的遗传衍化监测。1.4生态学特征猪繁殖与呼吸综合征病毒只会感染猪，也就是说猪是PRRSV的唯一易感动物，并且PRRSV可感染各年龄阶段和各种不同品种的猪，但主要感染仔猪、保育猪和母猪。PRRS一年四季均可发生，冬春季节较为严重。病猪和带毒猪是主要的传染源，本病传播和扩散非常迅速，其主要的传播途径是接触传播、空气传播和精液传播。猪感染PRRSV后可明显排毒，唾液、尿液、粪便、乳腺分泌物和精液中均可排出病毒。仔猪和怀孕中后期的母猪对PRRSV最为易感。1987年，美国首先出现本病。随后，加拿大、德国、荷兰、韩国、日本、菲律宾以及我国台湾地区相继发生此病。我国于1995年底首次发生本病，并于1996年成功分离[5]到第一个PRRSV毒株，并命名为CH-1a株。目前，该病已成为世界性动物疫病，而且在由于PRRSV的持续感染性及易突变性，我国PRRS一直处于新病不断发生，旧病难以根除的状态。1.5PRRSV致病机理1.5.1靶细胞PRRSV具有明显的细胞嗜性。在猪体内，所有PRRSV毒株均对肺泡巨噬细胞（PAM）[47]具有显著的亲嗜性，即PAM是PRRSV的主要靶细胞。另外，猪的淋巴结、心脏、扁桃体、肝、脾、肾和胸腺等组织中的巨噬细胞也对PRRSV敏感，但是在病料检测过程中，猪肺脏中的病毒含量是最高的。在体外，Marc-145、MA-104和CL-2621均可用于[20,48]PRRSV野毒和疫苗毒的增殖，且均可产生致细胞病理变化作用（CPE）。相对于MA104和CL-2621，体外试验中Marc-145细胞的应用范围更广。1.5.2细胞受体PRRSV能够在易感细胞系上增殖说明易感细胞系表面的相关受体是其进行复制的关键因素，而且不管是对PAM还是Marc-145细胞，PRRSV都是通过网格蛋白依赖性的[49]内吞作用进入细胞的。研究发现，PAM上存在3个PRRSV细胞受体，分别是猪唾液[50]酸黏附素（Sn）、硫酸乙酰肝素（HS）和CD163分子。Sn是介导病毒内化的受体；[41]HS发挥着将病毒吸附到细胞表面的作用；CD163分子则是病毒感染细胞所必需的，5 [51]它不仅可以介导病毒的吸附和内化，还可以促进病毒的装配及释放。Marc-145细胞上已经证实的细胞受体只有2个，即HS和猴波形蛋白（vimentin）。波形蛋白存在于Marc-145细胞的表面，是一种骨架蛋白，它作为PRRSV的一种特异性受体或者受体复合体的一[52]部分，可以与细胞内的其他骨架纤维一起介导病毒对Marc-145的感染。1.5.3PRRSV感染细胞的模式PRRSV感染巨噬细胞的第一步是与细胞表面的硫酸乙酰肝素结合，将病毒吸附到细胞的表面，增加细胞表面的病毒粒子浓度，从而促进唾液酸黏附素与病毒粒子的结合，并在唾液酸黏附素的作用下启动细胞受体介导病毒的内吞和感染，最后在细胞内部因子的作用下发生膜融合，使得病毒基因组得到释放，从而启动病毒的复制。1.6临床症状及病理组织变化感染PRRSV的猪发病初期体温升高，精神不济，食欲减退。随着发病时间的延长，可见耳朵发绀，四肢出现红斑；部分母猪流产，产死胎、木乃伊胎或畸形胎，仔猪则表现呼吸症状。剖检可见肺脏充血、淤血，淋巴结肿胀、脾肿大，胸腺萎缩；病理变化则以间质性肺炎为主要特征，并伴有淋巴细胞浸润。1.7PRRSV遗传变异国内外学者对PRRSV遗传变异进行了大量的研究，结果表明近年来PRRSV具有更为复杂的遗传多样性。PRRSV不仅存在序列缺失、插入或突变等多样性，而且还出现了[53]一些自然重组PRRSV。随着疫苗的广泛应用，在免疫压力下，PRRSV的变异速率也[54]有所增加。PRRSV具有较高的抗原变异性，从第一株PRRSV出现以来，PRRSV的不断变异和[55,56]自然重组使得具有基因异质性的PRRSV流行于世界各地。通过病毒基因组的序列分析比对，PRRSV可以分为欧洲型（基因型Ⅰ）和北美洲型（基因型Ⅱ）两种不同的基[57]因型，两种基因型的核苷酸同源性在50%-60%左右。氨基酸序列分析比对表明，两种基因型在开放性阅读框1a（ORF1a)和结构蛋白区域存在巨大的差异。遗传进化分析表明，[58]两种基因型属于一个共同的祖先，在一些新分离株，尤其是ORF1a区域可以观察到自然性缺失和插入。由于PRRSV基因组的特殊及特异性，同型和不同型的毒株间均存在广泛的变异和重组，而且基因重组也是病毒基因组发生变异的一个重要因素。Martin-Valls等对不同区[53]域不同基因型PRRSV的ORF5研究发现，不同基因型的ORF5间存在基因重组。Zhao等对JL580毒株基因组的分析过程中发现JL580全基因组存在3处基因重组，重组区域[14]发生在ORF1a、ORF2a、ORF3和ORF4处。由于病毒株通过不断变异和基因重组，形成新的或更强毒力的变异株，使得PRRSV的防治面临着巨大的挑战。6 1.8PRRSV疫苗研发的科学制约在封闭的畜群中自然筛选初次感染PRRSV的猪的试验已经得到验证，建立猪的免疫系统可以完全消除PRRS病毒感染。这个关键性发现使PRRSV从不能成功控制永久性、持续性感染的病毒列表上得以清除。尽管PRRSV不在持续性疾病的范畴，然而疫苗控制疾病仍然面临着巨大的挑战。目前面临的主要挑战包括对猪免疫及PRRSV免疫应答的不当理解，宿主感染的年龄差异及PRRSV自身的基因多样性。1.8.1PRRSV的基础免疫学及免疫反应目前对猪免疫学及猪对传染病的免疫力的概念主要基于小鼠和人体系统的类比。科学研究已经证明猪在一定基因水平上的免疫力与人及小鼠是相似的。它们具有相似的细胞因子、TLRS、干扰素及先天免疫系统的其他效应，以及以相似的方式产生免疫球蛋白及多样性T细胞受体，而且似乎具有更为相似的淋巴细胞发展途径。然而，猪完全免疫应答的详细分子及细胞路径似乎以不同方式发生变化，而且这些方式可能对猪包括[59,60]PRRSV在内的病原体的成功应答具有关键作用。1.8.2记忆应答的缺失疫苗研发的一个常用方法是在一个生物模型中测试最初的假设，通过可能与体内抵抗强毒病原体有关的记忆应答来筛选抗原配方。一个强大记忆应答的经典指标是记忆抗[61]体反应。然而在PRRSV感染情况下，如果抗体水平发生改变免疫动物通常会面临再次[62]感染的风险。接种过疫苗的动物再次感染遗传学上不相关的病毒会引起动物间抗体水平的不明显改变。据悉，先前PRRSV疫苗的研究是在病毒血症结束后而淋巴结、扁桃体感染仍然存在的不同时间进行的。因此，可能存在在记忆细胞没有激活的情况下，再次[63]感染时的免疫应答由效应细胞完成。这些研究表明猪抗PRRSV免疫不符合先天和获得性免疫的标准模型，然而这些模型却在抗PRRSV新型疫苗的发展中发挥着有限的作用。针对再次感染的免疫生物学的研究是必要的且具有深远的意义，病毒感染后机体受到刺激产生抗原并递呈给记忆细胞，但是这种情况在再次感染中不会发生。病毒血症的[62]缺乏验证了这一结论。再次感染PRRSV后病毒的少量增殖可能是抗体介导的病毒中和反应。然而这一机制并不能解释血清中的中和抗体活性是如何防止因鼻腔给药而造成的[64]肺泡巨噬细胞感染，尽管存在于肺部的中和活性水平很低。这些研究表明记忆免疫的标志即记忆应答在对PRRSV的记忆反应中是不存在的，所以在解释疫苗药效试验上是不成立的。因此，免疫效果预测标准的缺失是研发复杂疫苗的一个重要制约因素。1.8.3宿主抗感染的年龄依赖性猪对PRRSV感染的先天抵抗力会随着年龄而发生变化。和断奶仔猪相比，育肥猪及[65]成年猪血液中病毒血症的持续时间和病毒载量大幅减少。病毒血症水平的降低可能是7 [66]由于体内巨噬细胞对病毒感染的先天抵抗力，而与IL-10水平无关。免疫反应是由对抗PRRSV蛋白的抗体反应决定的，不受年龄影响，这表明肺和淋巴组织的病毒感染一定会引起强大的免疫反应。然而，明显减少的抗原载量表现在成年母猪较低或不可检测的病毒血症上，这表明记忆免疫应答可提供对抗再次感染的疫苗保护，而且随着猪群的大量免疫可能发生较大变动，从而造成一个低水平的动物免疫比率。1.8.4病毒的遗传多样性目标抗原的变异会降低结构依赖性抗体的效力并影响受体依赖性T细胞识别和控制病毒的机制。多数情况下抗原变异是由免疫压力造成的，表现为个体周而复始的感染，[67]变异的抗原可以逃避免疫控制，只有新型抗体才能控制，例如马贫血病毒。其他情况，如流感，遗传变异的发生是群体逃避突变体在时间和空间上出现遗传漂变和基因转移的过程。由于PRRSV具有广泛的基因和抗原多变性。从1996年至今，北美和中国的Ⅱ型毒株会定期出现毒力显著增强的现象。科学家们曾做过许多尝试从遗传学角度剖析PRRSV从[68,69]而确定毒力和免疫保护的关键决定因素，但都失败了。保护性免疫目标的假设性研究的失败是由于判定分子和细胞防护PRRSV机制的失败。第二种方法是寻找能够抵抗既[70]往感染或疫苗接种的诱导免疫的逃逸突变体。突变体能够逃避GP4中和抗体反应，但病毒逃避抗PRRSV免疫还没有得到证实。因此，无法将基因突变或特定的基因变异与免疫逃避联系起来，更让人沮丧的是基因突变有助于疫苗衍生物的保护功效。然而，相关基因的改变是否影响先前存在的免疫力的易感性和抵抗性还没有得到确认，因此很难系统地定位问题。1.9预防和治疗目前，该病尚无有效的治疗措施，疫苗免疫虽然在一定程度上可以缓解PRRSV的流行和扩散，但是PRRSV在国内并没有真正根除。因此，当务之急是对制约PRRSV疫苗研发的因素展开系统的分析，从而研制出新型的基因工程疫苗。但是要想从根本上预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征除了疫苗免疫及紧急接种外，还必须辅以其他有效的治疗措施。除此之外，对PRRS流行病学的调查和监测也是及时了解疫情并制定切实有效的预防和治疗措施的关键。8 第二篇研究内容第一章我国部分地区PRRS流行病学研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus,PRRSV）是单股正链RNA病毒。PRRSV在自然界和免疫压力下极易发生变异和基因重组，PRRSV的毒力由多基因控制，并且存在于病毒结构蛋白和非结构蛋白中。GP5是3种主要结构蛋白中唯一的糖蛋白，也是PRRSV最主要的保护性抗原蛋白，GP5蛋白具有受体识别作用和诱导细胞凋亡的功能；NSP2是ORF1a编码的非结构蛋白，是病毒基因组最易发生变异的区域之一，主要表现为氨基酸的缺失、插入以及突变。在PRRSV整个基因组中NSP2和GP5是最易发生变异的非结构蛋白和结构蛋白。因此，针对NSP2和GP5基因变异的研究可以在一定程度上反应PRRSV整个基因组的变异情况。本研究对我国部分地区2013~2014年疑似PRRS的组织样品进RT-PCR鉴定，并对阳性样品的GP5和部分NSP2基因进行PCR扩增、测序及遗传进化分析，从而及时监测并掌握我国现阶段PRRSV的流行现状。1.1材料和方法1.1.1材料1.1.1.1主要试剂及实验器材QIAampViralRNAMiniKit购自QIAGEN公司；EasyPureViralDNARNAKit、EasyScriptOne-StepRT-PCRSuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；ReverseTranscriptaseM-MLV、RecombinantRNaseInhibitor、TaKaRaEXTaqHotStartVersion、dNTP（10mM）、RandomPrimer(hexadeoxyribonucleotidemixture;pd(N)6)、pMD18-TVectorKit、PremixTaq(TaKaRaTaq™Version2.0)、E.coliDH5a感受态、6×LoadingBuffer（DNA电泳用）、DL5000DNAMarker、DL2000DNAMarker均购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；胶回收试剂盒购于OMEGA公司。台式低温高速离心机（Thermo）；制冰机（上海田枫实业有限公司）；-80℃冰箱、-20℃冰柜及4℃冰柜（海尔）；涡旋混合振荡器（上海四创实业有限公司）；DHP-9082型37℃恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；生物安全柜（Thermo）；倒置荧光显微镜（Nikon）；恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；梯度PCR仪（eppendorf）；电泳仪（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（DNR）。1.1.1.2病料样品来源于我国部分地区规模化猪场送检的猪的肺、淋巴结、肾和脾脏等组织；送样地9 区主要来自黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古自治区、北京市、天津市、山东省和安徽省。1.1.2方法1.1.2.1PRRS流行病学统计对2013~2014年疑似PRRS的猪的组织样品进行整理，并将RT-PCR鉴定为阳性的样品按照不同月份阳性率和不同阶段猪的发病率进行统计。1.1.2.2引物设计根据GenBank中已登录的国内外经典PRRSV毒株NSP2和GP5序列的保守区，以HuN4（GenBankno.EF635006）为模板，设计并合成了扩增完整GP5基因和部分NSP2基因的特异性引物（表1-1）。表1-1NSP2和GP5扩增引物Tab.1-1PrimersforNSP2andGP5名称引物序列位置长度（bp）NSP2-FCGGCTGAGCAGGTCGATTTA2570～3312762NSP2-RGCCAAGTCAGCATGTCAACCCGP5-FGGGCAACCGTTTTAGCCTGTC13641～14331711GP5-RAAACGCCAAAAGCACCTTCTG1.1.2.3病料处理取猪的肺脏、脾脏和淋巴结等组织剪碎、研磨、加入含有青链霉素的PBS缓冲液制成匀浆，以8000rpm离心5min，取上清液并用0.22μm的滤器过滤除菌，-80℃保存备用。1.1.2.4RNA提取按照EasyPureViralDNARNAKit说明书提取病毒RNA，具体步骤如下：（1）加入20μLProteinaseK于一个无菌的1.5mL的离心管中；（2）在离心管中加入200μL样品。（注意：如果样品量不足200μL，用PBS或0.9%NaCl补足）；（3）加入200μLBB5溶液（实验前加入5.6μgCarrierRNA），涡旋15s；（4）放入56℃水浴锅，孵育15min；（5）加入250μL无水乙醇（可能会出现絮状沉淀），涡旋15s之后，室温静置5min；（6）将溶液和沉淀一起加入配套的离心柱中，6800g离心1min，弃掉废液；（7）加入500μLWB5，6800g离心1min，弃掉废液；10 （8）重复步骤（7）；（9）室温条件下12000g离心1min，去除离心柱内残留的乙醇，在室温静置2min，彻底晾晒干离心柱；（10）将离心柱放进一个新的无Rnase的1.5mL离心管中，并向离心柱内加50μLRnase-freeWater（切勿扎破滤膜），室温静置1min；（11）12000g离心1min，洗脱RNA；（12）将RNA置于-80℃保存备用。1.1.2.5RT-PCR鉴定按照EasyScriptOne-StepRT-PCRSuperMix操作说明对所提取的RNA样品进行PRRSV的RT-PCR鉴定。反应体系（20μL）如下：RNA样品4μL上游引物1μL下游引物1μL2×one-stepsupermix12.5μLddH2O补足至20μL（1）体系配制完成后充分混匀并瞬离，按照如下PCR反应程序进行扩增：45℃30min；95℃5min；94℃1min55℃1min35个循环72℃1min72℃10min；4℃终止。（2）PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。1.1.2.6PRRSV阳性样品GP5和NSP2基因的扩增与测序1.1.2.6.1PRRSV阳性样品RNA提取按照QIAampViralRNAMiniKit操作手册提取PRRSV阳性样品的总RNA。提取步骤如下：（1）吸取140μL样品（血液、病毒液等）；（2）加入560μLBufferAVL，涡旋15s混匀；（3）室温静置10min，瞬离，使离心管盖上的液体流下来；（4）加入560μL无水乙醇，涡旋15s混匀，瞬离；11 （5）吸取630μL混合液加入配套柱子中，8000rpm离心1min；（6）重复步骤（5）；（7）吸取500μLAW1加入柱子内，8000rpm离心1min，弃废液；（8）吸取500μLAW2加入柱子内，12000rpm离心3min，弃废液；（9）空离柱子，12000rpm离心1min；（10）将柱子放于一无RNA酶的离心管中，加入60μLTE洗脱液，静置2min，8000rpm离心1min。注：每次都使用新的离心管。1.1.2.6.2反转录及PCR将提取所得的RNA反转录成cDNA，体系（20μL）如下：5×M-MLVBuffer4μLdNTP（10mM）2μLRNA酶抑制剂（RRI）0.5μL随机引物1μLM-MLV反转录酶2μLRNA10.5μL（1）体系混匀并瞬离后室温静置10min；（2）移至42℃水浴锅中水浴1h；（3）在冰水中冷却2min后，-20℃保存备用，或直接进行全长GP5和部分NSP2基因的扩增。PCR反应体系（25μL）如下：10×Buffer2.5μLdNTP（各2.5mM）2.5μL上游引物1μL下游引物1μLEXHotStart酶0.5μL模板1μLddH2O补足至25μL（4）体系配制完成后，充分混匀并瞬离，按照如下PCR反应程序进行扩增：95℃5min；94℃1min55℃1min35个循环72℃1min12 72℃10min；4℃终止。（2）PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。1.1.2.6.3PCR产物胶回收利用OMEGA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收步骤如下：（1）加入与回收胶等量的等体积的BindingBuffer（XP2），即0.3g对应0.3mL；（2）放入55℃水浴锅7min，期间不断摇晃，使胶充分融化；（3）将液体（融化后的胶）加入柱子内，10000g离心1min；（4）弃废液，加入300μLXP2，10000g离心1min；（5）弃废液，加入700μLWashBuffer，10000g离心1min；（6）重复步骤（5）；（7）空离柱子，13000g离心2min；（8）将柱子放入1.5mLEP管中，加入15-30μLElutionBuffer，室温静置2min，13000g离心1min。1.1.2.6.4胶回收产物与pMD18-T载体连接将胶回收产物与pMD18-T载体连接，反应体系（10μL）为：胶回收产物4μLpMD18-T载体1μLSoulutionⅠ5μL充分混匀，瞬离后置于连接仪中，16℃过夜连接。1.1.2.6.5连接产物转化（1）将E.coliDH5a感受态冰浴解冻；（2）将10μL连接产物加入100μL感受态中，混匀；（3）保持冰浴30min；（4）在42℃水浴锅中热激90s；（5）返回冰浴1~2min；（6）加入890μL的无抗LB；（7）在37℃摇床中，220rpm摇1h；（8）6000rpm离心1min，弃去800μL上清液，余200μL与离心管底的菌沉淀混匀；（9）涂板，将上述菌液涂于氨苄LB平板上；（10）将LB板置于37℃温箱中培养至长出针尖样大小的菌落。13 挑取5个大小均匀的单个菌落，置于盛有7mL氨苄LB的培养基中，于37℃摇床中培养过夜，PCR鉴定之后阳性菌液送测序。1.1.2.7遗传进化分析应用生物学分析软件DNAStar中的Megalign软件对测序样品中的51个PRRSV毒株及参考毒株进行序列比对及同源性分析，应用MEGA5.2软件对扩增的GP5和NSP2核苷酸序列进行遗传进化分析。1.2结果1.2.1PRRS流行病学统计情况通过对2013年和2014年不同月份样品进行统计分析发现，5、6、7、8月份PRRS发病率相对较低，1、11、12月份是PRRS的高发期（图1.1，表1-2、1-3）；另外，仔猪和保育猪的发病率相对较高（图1.2）。图1.12013-2014年不同月份样品阳性率图1.2不同阶段猪的发病率Fig.1.1Positiverateofdifferentmonthsof2013-2014Fig.1.2Morbidityofdifferentagesofpig表1-22013年不同月份样品统计Tab.1-2Thesamplestatisticsofdifferentmonthsof2013月份123456789101112样品数181113151310201719201024阳性样品数1322100112628阳性率（%）72.218.215.46.70055.910.5302033.314 表1-32014年不同月份样品统计Tab.1-3Thesamplestatisticsofdifferentmonthesof2014月份123456789101112样品数15131419242092319231517阳性样品数2234540224912阳性率（%）13.315.421.421.120.82008.710.526.16070.51.2.2PRRSV的RT-PCR鉴定本研究对我国部分地区401份样品进行了病料处理，并提取RNA，进行样品的RT-PCR检测。RT-PCR鉴定结果表明：所检测样品中PRRSV阳性率为20.2%（表1-4）。表1-42013-2014年PRRS样品统计Tab.1-4ThesamplestatisticsofPRRSof2013-2014省份样品数量阳性样品测序数量阳性率（%）黑龙江297543118.2吉林4812725辽宁124433.3北京103330河南72228.6江苏92222.2浙江82225内蒙古51020天津21050山东1000江西1000安徽1000总计401815120.21.2.3GP5和NSP2基因片段的扩增与序列测定利用设计的2对特异性引物分别扩增PRRSV阳性样品的GP5基因和部分NSP2基因，PCR扩增产物与pMD18-T载体连接、转化，筛选阳性菌液并测序。测序结果显示，所有毒株的GP5基因扩增产物均为711bp，大部分毒株的部分NSP2基因扩增产物为762bp（图1.3），其中HLJ13株NSP2基因PCR扩增产物有两条目的条带，分别为762bp和852bp。15 图1.3部分样品GP5和NSP2基因PCR电泳图片Fig.1.3PCRproductsofGP5andNSP2M：DL2000Marker；1-5：部分毒株GP5；7-11：部分NSP2基因；6、12：阴性对照M:DL2000Marker;1-5:GP5ofpartialstrains;7-11:NSP2ofpartialstrains;6、12:Negativecontrol1.2.4GP5遗传进化分析1.2.4.1GP5遗传进化树及同源性分析GP5遗传进化树结果显示，所有毒株均属于北美洲型，其中大部分毒株属于高致病性PRRSV（HP-PRRSV），与HuN4和JXA1同属于一个亚群；HLJ13和LN283属于经典PRRSV，与国内经典株CH-1a同属于一个亚群；更重要的是JL580和HLJ58与美国NADC30株处于同一新的分支，是PRRSV的一个新的亚群（图1.4）。应用PhyML3.0软件对JL580和HLJ58株的ORF5进行遗传进化分析发现，JL580和HLJ58与属于L8亚群的国内HP-PRRSV亲缘关系相差甚远，其属于L1亚群，起源于加拿大，然后于2008年出现于美国，后来传播到了中国（图1.5）。与国内外已发表的10个PRRSV毒株进行同源性分析发现，GP5基因核苷酸同源性为84.4%～100%，推导的氨基酸同源性为83.1～100%。与经典株CH-1a、VR-2332株相比，部分毒株的GP5核苷酸同源性为86.2%～100%（图1.6），氨基酸同源性为85.1%～100%；与HP-PRRSV中的代表株HuN4和JXA1株相比，核苷酸同源性为91.5%～99.8%，氨基酸同源性为90%～99.5%（图1.7）。与疫苗株MLVRespPRRS/Repro和PrimePac相比，核苷酸同源性为85.9%～92.7%，氨基酸同源性为84.1%～94.5%。16 GX1001-GP5HLJ563-GP5JXA1-R-GP5HLJ558-GP5HLJ20-GP5HLJ77-GP5HLJ579-GP5HLJ74-GP5HLJ5-GP5HLJ298-GP5ZJyw5-GP5ZJyw1-GP5HLJ124-GP5HLJ16-GP5HLJ18-GP5HLJ486-GP5HLJ270-GP5JXA1-GP5TJM-F92-GP5BJcp-GP5BJ11-GP5HLJ461-GP5HLJ511-GP5HuN4-F112-GP5HLJ1-GP5HLJ610-GP5JL620-GP5JL559-GP5JL315-GP5HLJ626-GP5HUN4-GP5GD-GP5LN1-GP5HEB1-GP5TJ-GP5LN-GP5JL544-GP5JL543-GP5HLJ6-GP5SX2009-GP5HLJ09-GP5AH0701-GP510-10-JL-GP5HLJ556-GP5LN609-GP5HLJ590-GP5HLJ8-GP5HLJ14-GP5HB-1(sh)2002-GP5BJ1-GP5HLJ13-GP5JS-GP5CH-1r-GP5CH-1a-GP5LN283-GP5Ingelvac_ATP-GP5P129-GP5Prime_Pac-GP5HLJ2-GP5HN1-GP5HUB1-GP5VR-2332-GP5BJ-4-GP5MLV_RespPRRS-Repro-GP5S1-GP5JL580-GP5HENAN-XINX-GP5NADC30-GP5HLJ58-GP5LV-GP50.05图1.4GP5遗传进化树Fig.1.4PhylogenetictreeofGP5gene17 L1图1.5新发PRRSV基因分型Fig.1.5GenotypingofPRRSVstrainthathasnewlyemerged图1.6部分毒株GP5核苷酸同源性分析Fig.1.6HomologyofnucleotidesequenceofGP5geneofsomestrains18 图1.7部分毒株GP5氨基酸同源性分析Fig.1.7HomologyofdeducedaminoacidssequenceofGP5ofsomestrains1.2.4.2GP5蛋白氨基酸序列分析GP5测序结果显示，所有毒株的GP5基因全长均为603bp，编码200个氨基酸，不存在氨基酸的缺失和插入。应用Megalign软件对部分毒株GP5基因进行序列比对分析，与CH-1a、VR-2332和HuN4相比，部分毒株GP5蛋白在氨基酸高变区、中和表位和诱导表位存在多处氨基酸的变异（图1.8），主要变异位点为C24→Y24，F25→L25，V27→A27，L28→I28，N34→G34/S34/D34，H38→N38，L47→I47。1.2.5NSP2遗传进化分析1.2.5.1NSP2遗传进化树及同源性分析NSP2遗传进化树结果显示，与国内外已发表的29个参考株相比，绝大多数毒株的NSP2属于HP-PRRSV亚群，与HUN4和JXA1同属于一个亚群；HLJ13-NSP2-762和LN283-NSP2属于HuN4亚群，而HLJ13-NSP2-852和JS1-NSP2与国内经典株CH-1a同属于一个亚群；JL580-NSP2遗传进化分析结果同GP5基因遗传进化分析结果一致，因此，JL580是一个新出现的病毒株（图1.9）。与国内外已发表的10株PRRSV进行同源性分析发现，NSP2基因的核苷酸同源性为67.1%～99.8%，氨基酸同源性为54.4%～99.3%。与CH-1a相比，核苷酸同源性为85.8～90.7%，推导的氨基酸同源性分别为79.9%～87.4%；与经典株VR-2332相比，核苷酸同源性为75.9%～79.6%，氨基酸同源19 性为67.8%～71.1%；与HP-PRRSV株HuN4和JXA1相比，具有90.4%～99.8%高度同源性。图1.8部分毒株GP5氨基酸序列比对分析Fig.1.8Analysisandcomparisonofaminoacidofsomestrains20 HLJ461-NSP2HLJ13-762JL543-NSP2HLJ511-NSP2HLJc2-NSP2HuN4-F112-NSP2HLJc1-NSP2JL315-NSP2LN283-NSP2HLJ1-NSP2HLJ626-NSP2HuN4-NSP2LN-NSP2LN609-NSP2JXA1-NSP2JL559-NSP2HLJ610-NSP2HLJ270-NSP2HLJ558-NSP2HLJ5-NSP2HLJ77-NSP2JL59-NSP2HLJ16-NSP2HLJA18-NSP2HLJ74-NSP2HLJ563-NSP2JXA1-R-NSP2GX1001-NSP2HLJ486-NSP2HLJ124-NSP2HLJ09-NSP2AH0701-NSP2HLJ590-NSP2HLJ556-NSP2HEB1-NSP2GD-NSP2TJ-NSP2HUB1-NSP2SX2009-NSP2HLJb1-NSP2TJM-F92-NSP2LNsyP-NSP2HeN94-NSP210-10JL-NSP2JL620-NSP2JL544-NSP2HeN53-NSP2HLJb3-NSP2HLJ298-NSP2HLJ6-NSP2LN1-NSP2HLJ20F-NSP2HLJ18-NSP2HLJ13-852HB-1sh-2002-NSP2JS1-NSP2CH-1a-NSP2CH-1r-NSP2Ingelvac_ATP-NSP2P129-NSP2Prime_Pac-NSP2VR-2332-NSP2HN1-NSP2S1-NSP2MLV_RespPRRS-Repro-NSP2BJ-4-NSP2HENAN-XINX-NSP2NADC30-NSP2JL580-NSP2LV-NSP20.1图1.9NSP2遗传进化树Fig.1.9PhylogenetictreeofNSP221 1.2.5.2NSP2蛋白氨基酸序列分析部分毒株NSP2氨基酸序列比对分析显示：与CH-1a、VR-2332和HuN4相比，HLJ13NSP2-852不存在氨基酸的缺失和插入现象；HLJ1，HLJ13-NSP2-762，HLJ124，HLJ270，HLJ298，HLJ461，HLJ486，HLJ511，HLJ556，HLJ558，HLJ563，HLJ590，HLJ610，JL315，JL543，JL559，JL620，LN1，LN283，LN609与HuN4和JXA1一样在481位缺失一个氨基酸，在532～560处缺失29个氨基酸，除此之外HLJ558在487～490处还缺失4个氨基酸；而JL580毒株的NSP2不同于HuN4的缺失情况，其在482位和502～520位存在2处缺失，共缺失20个氨基酸（图1.10）。480490500510520530540550560570-------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+☆CH-1aNVPNGWEDFAVGGPLDFPTPSEPMTPLSEPVLMPASQHIPRPVTPLSGPAPVPAPRRTVSRPMTPLSEPIFVSAPRHKFQQVEEANPAATTLTYQDEP☆VR-2332DVPNSWEDLAVSSPFDLPTPPEPATPSSELVIVSSPQCIFRPATPLSEPAPIPAPRGTVSRPVTPLSEPIPVPAPRRKFQQVKRLSSAAAIPPYQDEP☆BJ-4DVPNSWEDLAVSSPFDLPTPPELATPSSELVIVSSPQCIFRPATPLSEPAPIPAPRGTVSRPVTPLSEPIPVPAPRRKFQQVKRLSSAAAIPPYQNEP☆HB-1(sh)2002NVPNGSEDLTVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLTPALQRVPKLMTPLDGSAPVPAPRRTVSRPMTPLSEPIFLSAPRHKFQQVEEANPATTTLTHQNEP◆HLJ13-NSP2-852NIPNGSEALTVGGPFNFPTPSEPTTPMSELVLTSTSRRDPELTTSLNGSAPIPAQRRTVSRPIAPLGESIFVSAPRHKFQQGEEANPATTTLTHQDEP◆HLJ1-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ13-NSP2-762NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ124-NSP2SVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLVPASRRVPKLMALLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ270-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPKPSEPMTPMSEPVLVPASRHVPKLMTPWSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ298-NSP2NVPNGSEG-TVGGPLNFPIPSELMTPMSEPVLVSASQFVPKLMTPLIGSAPAPAPRRTV-----------------------------TTTLMHQDEP◆HLJ461-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ486-NSP2NAPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLVPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ511-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ556-NSP2NVPNGSRE-PVGGPLDFPTPSEPMTPMSEPVPVPALRCVPKLMTPLSGSTPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTYQDEP◆HLJ558-NSP2NVPNGSEE-TVGVP----TPSEPMTPMSEPVLVPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ563-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLVPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆HLJ590-NSP2NVPNGSRE-TVGGPLDFSTPSEPMTPMSEPVPVPALRCVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTYQDEP◆HLJ610-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLVPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆JL315-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆JL543-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆JL559-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLVPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTA-----------------------------TTTLTHQDEP◆JL620-NSP2NVPNGTEE-TVGGPLNFPTPSDPMTPVSEPVLAPVSQFVPRLMTPLAGSTPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆LN1-NSP2NVPNGSGE-TVGGPLNFPTPSELVTPMSEPVLVPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆LN283-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆LN609-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRAPKLMTPLGGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP☆HUN4NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLMPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP☆JXA1-NSP2NVPNGSEE-TVGGPLNFPTPSEPMTPMSEPVLVPASRRVPKLMTPLSGSAPVPAPRRTV-----------------------------TTTLTHQDEP◆JL580-NSP2DFPDSWEDAA-GGPFHSPVLLEPVARSNE-------------------PVPVPAPRRTVFRLKPSSMTSTPVPAPRCRLQQVEGMNLAVRTLACQDEL☆NADC30-NSP2NFPDSWEDLA-GGPFRSPVLPESVARSNE-------------------PVPVPAPRRTVSRLKPSPIVSTPVPAPRCGLQQVEGMNLAVGTLACQDEL☆MLVRespPRRSReproDVPNSWEDLAVSSPFDLPTPPEPATPSSELVIVSSPQCIFRPATPLSEPAPIPAPRGTVSRPVTPLSEPIPVPAPRRKFQQVKRLSSAAAIPPYQNKP☆PrimePacNLPDSWEDLAVGCPSDLPTSPEPVTPLSEPASVSAPRRSFRPVKPLSEPVPVPAPRKTVSRPATPLSEPIPVPAPRRKFQQVEKVNPAAATLGCQDEF图1.10部分毒株NSP2氨基酸序列比对分析Fig1.10AnalysisandcomparisonofaminoacidmutationsofNSP21.3讨论[34]GP5是重要的糖基化蛋白，也是变异最为显著的结构蛋白。GP5遗传进化结果显示，所有病毒株均属于北美洲型毒株，大部分毒株属于HP-PRRSV，HLJ13株和LN283株属于经典PRRSV，JL580和HLJ58属于一个新的亚群。部分毒株GP5氨基酸序列分析表明，与经典株CH-1a、VR-2332和高致病性毒株HuN4相比，本实验所研究的GP5在邻近信号肽序列外区近端的氨基酸高变区（aa24～aa39）、中和抗原表位（aa37～aa45）24252425和诱导表位（aa27～aa30）存在氨基酸的变异。HuN4亚群的18个GP5基因CF→YF，HLJ13株L28→I28，HLJ486株L28→P28；与CH-1a相比，HLJ556、HLJ590、JL543、JL620、LN609的GP5氨基酸V29→A29；部分毒株氨基酸N34→D34/S34/G34；JL580毒株的L6→S6，V27→A27，H38→N38，L47→I47。HLJ13和LN283株与CH-1a一样22 aa39为F39，其余均为I39。aa34是糖基化位点，它的变异可能导致部分毒株失去一个糖基化位点且aa34的突变可能会影响病毒颗粒的产生和病毒的感染性从而引起病毒效[71]价下降。NSP2是具有高度免疫原性的非结构蛋白，NSP2的变异主要表现为氨基酸的缺失与插入。Shen等于2000年首次报道与VR-2332相比，PRRSV北美洲型SP株在813～814[72]处插入了36个氨基酸。2006年中国暴发的以高热、高发病率、高死亡率为特征的高[16]致病性PRRSV（HP-PRRSV），NSP2分别在481位和532～560处缺失30个氨基酸。[73]2014年Choi等研究韩国PRRSV分离株NSP2存在392和393个核苷酸的缺失。有报[74]道表明NSP2的缺失可能在宿主免疫方面具有至关重要的作用。部分毒株NSP2的遗传进化分析显示：与CH-1a、VR-23323和HuN4相比，HLJ13-NSP2-852不存在氨基酸的缺失和插入现象，属于CH-1a经典亚群，HLJ13-NSP2-762则属于HP-PRRSV亚群。与LN283-GP5属于经典PRRSV不同，LN283-NSP2属于HP-PRRSV亚群。氨基酸序列比对结果表明：大部分毒株与HP-PRRSV代表株HuN4和JXA1高度同源，且均存在30个不连续氨基酸的缺失，此外HLJ558在487～490处还缺失4个氨基酸；而JL580毒株的NSP2不同于HuN4的缺失情况，其在482位和502～520位存在2处缺失，共缺失20个氨基酸。由于HLJ13-NSP2-762和HLJ-13-852分别处于不同的亚群，HLJ13株可能为经典和高致病性混合感染株。LN283株GP5和NSP2基因遗传进化树的不同结果表明，LN283株可能涉及PRRSV基因组重组。JL580株GP5和NSP2的遗传进化及氨基酸序列分析则表明JL580属于一个新的毒株。1.4小结猪繁殖与呼吸综合征是影响我国乃至世界养猪业健康、持续发展的重要传染病之一。2013~2014年我国部分地区PRRS流行病学研究表明：冬春季节是PRRS的高发期，且仔猪和保育猪的发病率相对较高。51个阳性样品的GP5和部分NSP2基因的遗传进化及序列比对分析结果则表明我国PRRSV具有更为复杂的遗传多样性，而且PRRSV已经出现了新的遗传分支。23 第二章JL580毒株的分离鉴定、遗传变异及致病性分析PRRSV在自然界和免疫压力下随着时间的变迁和不同毒株的快速出现，极易发生变异和基因重组，出现新的病毒株，从而给养猪业带来巨大的威胁。2013年，吉林省某猪场发生疑似PRRS，临床表现为高热，耳朵发绀，24小时全身发绀，最后死亡，病程较短，发病率较高。本研究对采自该发病猪场的病料样品进行了PRRSV的分离与鉴定，并对新分离毒株JL580进行了遗传进化及致病性分析，从而了解JL580株的遗传变异情况。JL580毒株的出现表明中国出现了新的PRRSV亚型，因此，PRRS的流行监测及数据的更新有助于及时提供新的数据以便及时掌握PRRSV的流行现状，从而为PRRSV的防制和新疫苗的研制提供有效的科学依据。2.1材料和方法2.1.1材料2.1.1.1病料样品及细胞JL580病料样品来源于吉林省某猪场疑似PRRSV感染猪的肺脏、脾脏和淋巴结等组织；Marc-145细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病诊断及技术服务中心提供。2.1.1.2主要试剂及器材QIAampViralRNAMiniKit购自QIAGEN公司；ReverseTranscriptaseM-MLV、RecombinantRNaseInhibitor、RandomPrimer(hexadeoxyribonucleotidemixture;pd(N)6)、TaKaRaEXTaqHotStartVersion、dNTP（10mM）、rTaqDNA聚合酶、3'-FullRACECoreTMSetVer.2、ClontechSMARTerRACEcDNAAmplificationKit、、pMD18-TVectorKit、PremixTaq(TaKaRaTaq™Version2.0)、E.coliDH5a感受态均购自于宝生物工程（TaKaRa）有限公司；胶回收试剂盒购自于OMEGA公司；胎牛血清（FBS）、DMEM购于GIBCO22公司；6孔板、25cm培养瓶、75cm培养瓶购于Corning公司；FITC标记的山羊抗鼠IgG，HRP标记的山羊抗鼠IgG，HRP标记的山羊抗兔IgG购于中杉金桥公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购于索莱宝有限公司；SuperECLplus超敏发光液购于Applygen公司；SDS-PAGE电泳缓冲液，鼠源PRRSVN蛋白抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病诊断及技术服务中心提供。Mini-PROTEAN®Tetra电泳槽（BIO-RAD）；Trans-Blot®半干转印系统转印槽（BIO-RAD）。2.1.2方法24 2.1.2.1试验猪14头60日龄的健康仔猪饲养于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，经检测PRRSV、PCV、PRV、CSFV抗原和抗体均为阴性。2.1.2.2病毒分离将猪的肺脏、脾脏和淋巴结等组织剪碎，加入无菌PBS研磨，制成匀浆，以8000rpmin2离心5min，取上清液用0.22μm的滤器过滤，滤液置-80℃冰箱保存或接种于25cm的长满单层且生长状态良好的Marc-145细胞的培养瓶中。接种病毒前，将培养瓶中的培养液换成2%FBS的DMEM，接毒后将细胞置于37℃，5%的CO2培养箱中继续培养4~5d，每天在显微镜下观察细胞状态，查看病变病变。待出现明显的细胞病变之后，将细胞反复冻融3次后，-80℃保存备用。同时，将收获的病毒液继续往下传代，获得JL580-F2代病毒液。2.1.2.3分离株外源病毒的检测按照EasyPureViralDNARNAKit说明书提取经Marc-145细胞培养的病毒样品的RNA和DNA（参考1.1.2.4RNA提取步骤）。然后按照RT-PCR和PCR反应体系及反应程序，利用PRV、MHP、PCV、CSFV等特异性引物进行扩增，最后PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。2.1.2.4JL580毒株的鉴定2.1.2.4.1间接免疫荧光试验将生长状态良好的Marc-145细胞正常传代并铺于6孔板中，待细胞长成单层且状态良好时，接种分离到的JL580株病毒液，每孔100μL，做3个重复孔，并设立阴性对照，置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育2h。然后弃去病毒液，用灭菌的PBS洗3遍，并加入2mL2%FBS的DMEM继续培养。60h后，弃去培养液，PBS洗2遍；用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，每次5min；孵育鼠源N蛋白一抗，37℃孵育1~2h，PBS洗3遍，每次5min；加入FITC标记的抗鼠二抗，37℃孵育1h；PBS洗3遍后放于倒置荧光显微镜下观察。2.1.2.4.2WesternBlot鉴定（1）蛋白样品处理将6孔板中的培养液弃去，用预冷的PBS洗2遍，弃去废液再加入1mLPBS，用细胞刮刀将细胞轻柔地刮下来，然后移入1.5mL的离心管中，3000rpm，4℃，离心5min，弃去上清；每管加入100μLRIPA裂解液（含蛋白酶抑制），冰上裂解1h，13000rpm，4℃，10min；取75μL上清液加入25μL4×蛋白上样缓冲液，沸水煮5~10min，-80℃25 保存备用。（2）SDS-PAGE根据实验要求配制12%的分离胶和浓缩胶，胶配好之后装入电泳槽中，加入新配制好的SDS-PAGE电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子，每孔加入40μg的蛋白样品，并在相应孔道加入蛋白Marker。然后设置电泳程序：浓缩胶80V，25min；分离胶110V，60~70min。（3）转膜剪裁大小合适的PVDF膜，放入甲醇中充分浸泡2min，然后放入转膜液中浸润；滤纸在转膜液中完全浸湿后，放入转膜仪中，然后依次放上PVDF膜、胶、滤纸（注意赶走气泡）；15V转膜30min。（4）封闭配制5%的脱脂乳（5g脱脂乳，100mLPBS），转膜完成后将膜放入脱脂乳中封闭2h；封闭完后用PBST洗膜，洗3-4次，每次10min。（5）孵育一抗分别加入稀释好的鼠源抗N蛋白单克隆抗体和鼠源抗β-actin抗体，4℃孵育过夜，用PBST洗膜，洗3-4次，每次10min。（6）孵育二抗PBS稀释HRP标记的山羊抗鼠IgG，室温孵育，在摇床上缓慢摇动2-3h。孵育完二抗后，用PBST洗膜，洗3-4次，每次10min。（7）曝光配制ECL发光液，A液与B液等体积混匀，避光。剪好塑封袋，将PVDF膜（不要太湿）放于塑封袋上，加上ECL发光液后，放于暗盒中孵育2min，然后将多余的发光液用吸水纸吸去；然后再暗室进行压片，根据情况目的条带发光强度，压片时间可为几秒至几分钟；压完片后，先放入显影液中浸泡数秒，然后拿出来冲洗之后，放入定影液中浸泡数秒，最后充分冲洗、晾干。2.1.2.5JL580全基因组分析2.1.2.5.1引物及参考序列根据GenBank中已登录的国内外经典毒株序列的保守区及GP5测序结果，并参考美国NADC30株（GenBankno.JN654459）设计并合成9对特异性引物（表1）。2.1.2.5.2RNA提取与PCR扩增、克隆及测序按照QIAampViralRNAMiniKit操作手册提取病毒总RNA，反转录成cDNA后用于目的片段的扩增，然后利用胶回收试剂盒回收PCR产物并分别与pMD18-T载体16℃过夜连接（总RNA提取、反转录、胶回收以及连接反应均参照1.1.2.6PRRSV阳性样品GP5和NSP2基因的扩增与测序中的步骤），转化并挑取单克隆菌落，每个片段选取5个26 单克隆菌落，重复进行3次测序。2.1.2.5.3全基因组序列的分析应用DNAStar软件中的Seqman程序对9个片段进行拼接，应用Megalign进行序列比对及同源性分析；应用MEGA5.2软件对该毒株的全基因组序列进行遗传进化分析；应用simplot软件对全基因组进行重组分析。表2-1JL580全基因组序列扩增所需引物Tab.2-1Primersforfull-lengthofJL580名称引物序列位置长度（bp）JL580-A-FATGACGTATAGGTGTTGGCTCT1～16331633JL580-A-RGAGGGTTTGAATAGCGTTAGJL580-B-FTTCCCGAAAGAGTGAGGT1563～31231561JL580-B-RCAAGGGTAGGGCGGTGGTJL580-C-FATGCTAACCTGGCGCAAC3017～45791563JL580-C-RGGCCATCGAACAAGCAACJL580-D-FGACCCCGACTGCAGGATT4385～58391455JL580-D-RTCCTTCCAGTTCGGGTTTJL580-E-FCCATGTTGTTTACCCCGTCTC5184～71671984JL580-E-RCACTGGGCTTTCACGTTCTCTJL580-F-FTGCCAACCCAGAGAACGTGAAAG7138～90971960JL580-F-RCCAGACATGCACAACTGTCCJL580-G-FGGCTGCAATACTCATGGAC9063～115772515JL580-G-RAAACGCTTCATTGTAATCCTCJL580-H-FGGTGAGGACTGGGAGGATT11545～135061962JL580-H-RGGAGCTGCTGTTGCTGTTGJL580-I-FTTGCCTTTTTTGTGGTGTATC13435～150191585JL580-I-RAATTTCGGCCGCATGGTTCTC2.1.2.6动物试验2.1.2.6.1病毒滴度的测定按照Reed-Muench两氏法对分离到的病毒株进行TCID50的测定。将上述分离鉴定-1得到的JL580-F2代毒株的病毒液用含2%FBS的DMEM培养液做10倍稀释，即从10-8一直倍比稀释至10。将稀释好的病毒液接种到铺有生长状态良好的Marc-145细胞的96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种100µl。另设两纵排正常细胞对照。27 2.1.2.6.2JL580-F0代荧光定量PCR提取JL580原代（JL580-F0）组织（淋巴结、肺脏）匀浆中的RNA，反转录为cDNA后，按照韦天超所建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方[75]法对JL580病毒株原代组织匀浆所提取的RNA进行荧光定量PCR，测定组织样品中病毒的拷贝数。2.1.2.6.3致病性试验将14头经PRRSV、PCV、PRV、MHP、CSFV抗原和抗体检测均为阴性的60日龄4仔猪随机分为3组，并单独饲养在不同的生物安全房内。A组（5头仔猪）每头接种3×104TCID50的JL580-F2，其中包括肌肉注射1mL，滴鼻2mL；B组（5头仔猪）每头接种3×10copies（qPCR）的JL580组织匀浆，肌肉注射1mL，滴鼻2mL；C组（4头仔猪）每头接种3mLDMEM，肌肉注射1mL，滴鼻2mL。接种病毒后每天观察动物的临床症状（精神状态、体温、食欲、呼吸状态及体表颜色变化等），并于0、3、7、10、14dpi采集血样进行病毒的分离检测。另外，对实验过程中死亡的猪及实验结束后的猪进行剖检观察，观察并记录各组织脏器的大体病理变化；同时采集肺脏，用10%的福尔马林固定后制成病理切片，从而观察病理组织学变化。2.2结果2.2.1JL580病毒分离结果将处理好的病毒液接种于生长良好的Marc-145细胞，然后放于温箱中继续培养，60h后观察细胞病变。与正常细胞相比，接毒的Marc-145细胞60h可见明显的细胞病变，细胞成堆聚缩，并随着时间的延长，细胞渐渐脱落（图2.1）。图2.1病毒在Marc-145细胞上的分离A：接种病毒的Marc-145细胞；B：正常的Marc-145细胞Fig.2.1TheisolationofvirusinMarc-145A:Marc-145cellsinfectedPRRSV;B:NormalMarc-145cells28 2.2.2外源病毒检测分别提取JL580-F0组织样品和JL580-F2细胞传代毒的RNA和DNA，然后利用PRRSV、PRV、MHP、PCV、CSFV的特异性引物分别进行外源病毒的RT-PCR和PCR鉴定。与阳性对照相比，JL580-F0和JL580-F2的PRRSV检测结果均为阳性，而PRV、MHP、PCV、CSFV的检测结果均为阴性（图2.2）。图2.2外源病毒的RT-PCR鉴定鉴定M：DL2000Marker；1、5、9、13、17：JL580-F1；2、6、10、14、18：JL580-F2；3：PRRSV阳性对照；7：PRV阳性对照；11：MHP阳性对照；15：PCV阳性对照；19：CSFV阳性对照；4、8、12、16、20：阴性对照Fig.2.2TheRT-PCRidentificationofexogenousvirusM:DL2000Marker;1,5,9,13,17:JL580-F1;2,6,10,14,18:JL580-F2;3:PRRSVpositivecontrol;7:PRVpositivecontrol;11:MHPpositivecontrol;15:PCVpositivecontrol;19:CSFVpositivecontrol;4,8,12,16,20:Negetivecontrol2.2.3病毒鉴定结果2.2.3.1间接免疫荧光鉴定将生长状态良好的Marc-145细胞正常传代并铺于6孔板中，待细胞长成单层且状态良好时，接种分离到的JL580株病毒液，每日观察细胞，查看病变。60h后对接毒的Marc-145细胞进行PRRSVN蛋白的间接免疫荧光鉴定试验。荧光鉴定结果显示感染病毒的细胞孵育相应的单克隆抗体之后，能够被PRRSV特异性N蛋白单克隆抗体所识别。在倒置荧光显微镜下可以观察到被感染细胞呈特异性绿色荧光，而阴性对照细胞无特异性荧光现象（图2.3）。29 图2.3JL580病毒株间接免疫荧光鉴定结果C：JL580分离株；D：阴性对照Fig.2.3IFAidentificationofJL580virusisolatedinMarc-145cellsC:IsolatedstrainofJL580;D:Negetivecontrol2.2.3.2WesternBlot鉴定将病毒接种于生长状态良好的Marc-145细胞，48h处理细胞，收获蛋白进行WesternBlot鉴定。鉴定结果表明：与阳性对照（HuN4-F112和CH-1a）相比，JL580病毒株在15kd处有N蛋白目的条带（图2.4），WesternBlot结果从蛋白水平证明我们分离到了PRRSV。图2.4JL580株N蛋白WesternBlot鉴定结果1：HuN4-F112；2：CH-1a；3：JL580；4：阴性对照Fig.2.4IdentifictionoftheNproteinofJL580bywesternblot1:HuN4-F112;2:CH-1a;3:JL580;4:Negativecontrol2.2.4JL580全基因组序列的扩增将JL580病毒株所提取的RNA反转录成cDNA后，利用9对特异性引物对其进行扩增，得到9条与预期大小相符的片段（图2.5）。将PCR扩增产物进行胶回收和测序，并将测序所获得的9个首尾重叠的目的基因片段进行拼接，测定的JL580基因组全长为15019bp。30 图2.5PRRSV全基因组PCR扩增产物M：DNA分子质量标准；1-9：JL580PCR扩增产物；10：阴性对照Fig.2.5PCRproductsofPRRSVgenomeM:DL5000DNAMarker;1-9:PCRproductsofJL580genome,respectively;10:Negativecontrol2.2.5JL580全基因组序列分析2.2.5.1JL580遗传进化分析运用MEGA6软件对JL580全基因组进行遗传进化分析，结果显示：JL580株即不同于CH-1a株和VR-2332株等经典亚群，也不同于HuN4株等高致病性亚群，它与美国NADC30同属于一个新的亚群，形成了一个新的独立分支（图2.6）。JXA1TPHUN4TJGX1001HLJ-09HEB1HUB1HB-1(sh)_2002CH-1aP129Prime_PacVR-2332HN1MLV_RespPRRS-ReproBJ-4S1JL-580NADC300.02图2.6PRRSV全基因组核苷酸序列系统进化树分析Fig.2.6Phylogenetictreeconstructedonthebasisofthefull-lengthgenomeofPRRSV2.2.5.2JL580同源性分析31 JL580分离株与18株国内外参考株（表2-2）相比，核苷酸同源性在83.2%～92.9%。与美国NADC30株相比核苷酸同源性为92.9%；与经典株CH-1a、VR-2332株的核苷酸同源性为84.9%和84.3%；与HP-PRRSV中的代表株HuN4、JXA1、TJ株的核苷酸同源性分别为84.9%、84.8%、85%；与HB-1（sh）2002株和BJ-4株相比，核苷酸同源性分别为84.6%和83.8%；与疫苗株HuN4-F112株、MLV-RespPRRS-Repro株相比，JL580的核苷酸同源性分别为84.9%、84.4%（图2.7）。表2-2参考毒株信息Tab.2-2Informationofreferencestrains参考毒株登录号分离国家分离年代参考毒株登录号分离国家分离年代CH-1aAY032626中国1996TPEU864233中国2008BJ-4AF331831中国1997HLJ-09HQ843178中国2009HB-1(sh)2002AY150312中国2002GX1001JQ955657中国2011HN1AY457635中国2003S1DQ459471中国NAHuN4EF635006中国2006VR-2332PRU87392美国1992JXA1EF112445中国2006P129AF494042美国2000TJEU860248中国2006NADC30JN654459美国2008HEB1EF112447中国2006PrimePacDQ779791美国/HUB1EF075945中国2006MLVRespPRRS/ReproAF159149美国/NA：non-available图2.7JL580全基因组核苷酸序列同源性分析Fig.2.7Homologyofnucleotidesequenceoffull-lengthgenomeofJL5802.2.5.3JL580株ORF5遗传特征JL580株与NADC30相比，GP5核苷酸同源性为95.2%，推导的氨基酸同源性为92.5%；32 与CH-1a株相比，GP5核苷酸同源性为86.7%，氨基酸同源性为86.1%；与经典株VR-2332相比，JL580-GP5的核苷酸同源性为84.7%，氨基酸同源性为83.1%；与HP-PRRSV中的HuN4毒株相比，核苷酸同源性为85.6%，氨基酸同源性为84.6%；与JXA1相比，核苷酸同源性为83.7%，氨基酸同源性为84.1%（图2.8、图2.9）。此外，JL580病毒株GP5蛋白与CH-1a、VR-2332、HuN4相比，信号肽和跨膜区的氨基酸发生了显著变异，主要变异位点分别是R13→Q13，L15→P15，V27→A27，H38→N38，L47→I47，V124→A124，R151→K151（图2.10）。图2.8JL580病毒株GP5核苷酸同源性分析Fig.2.8HomologyofnucleotidesequenceofGP5geneofJL580图2.9JL580株GP5氨基酸同源Fig.2.9HomologyofdeducedaminoacidssequenceofGP5ofJL58033 图2.10JL580株GP5氨基酸序列比对分析Fig.2.10AnalysisoftheSequencealignmentsofGP5ofJL5802.2.5.4JL580株NSP2遗传特征JL580株与经典株CH-1a株相比，NSP2基因核苷酸同源性为72.2%，氨基酸同源性为68.6%，与HuN4株相比核苷酸同源性为71.5%，氨基酸同源性为69.1%。JL580分离株存在3处不连续碱基的缺失，分别位于基因组2304～2636、2779～2781和2852～2908处；这3处缺失导致NSP2编码的蛋白在322～432位缺失111个氨基酸、481位缺失1个氨基酸、504～522位缺失19个氨基酸（图2.11）。JL580与HuN4-NSP2、JXA1-NSP2缺失情况不同，而与美国NADC30的NSP2的缺失情况完全一致。这也是JL580区别于国内高致病性亚群的一个新的特点。图2.11NSP2氨基酸序列比对Fig.2.11SequencealignmentsofNSP22.2.5.5JL580基因重组分析34 由于JL580全基因组与NADC30的核苷酸同源性位92.9%，而且在对JL580的扩增测序过程中，我们发现JL580部分片段与国内某些高致病性毒株同源性较高，因此，初步判断JL580存在基因重组。应用Simplot软件分析所知，JL580确实存在基因重组。A图中的3处灰色区域正是NADC30与09HEN1重组区域（图2.12）。另外JL580重组部分和非重组部分遗传进化分析也表明非重组部分与NADC30处于同一分支中（B），而重组部分则与高致病性毒株09HEN1处于同一分支中（C）。图2.12JL580基因重组分析Fig.2.12RecombinationanalysisofJL580strain2.2.6JL580致病性分析2.2.6.1毒价测定按照Reed-Muench两氏法对JL580-F2代进行病毒滴度的测定，经纯化后的病毒滴4度为3×10个TCID50/ml。按照韦天超所建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法对JL580病毒株原代组织匀浆所提取的RNA进行荧光定量PCR，4测得的拷贝数为3×10copies。2.2.6.2临床症状、剖检及病理变化感染JL580-F2和JL580-F0的A组和B组仔猪均表现出明显的临床症状，主要表现为咳嗽、食欲不振、精神沉郁、耳朵和四肢皮肤发绀，而且A组和B组仔猪在感染后第3天表现发热。A组的仔猪在第7天开始死亡，第10天全部死亡；B组的仔猪在第1035 天开始死亡，在14天时全部死亡（图2.13）。感染病毒的猪剖检可见肺脏有实变，肺出血、水肿，淋巴结肿大，病理组织学变化表现为间质性肺炎，并有淋巴细胞浸润（图2.14）。图2.13JL580试验猪的体温（A）和存活率（B）Fig.2.13RectaltemperaturesandmortalityratesofpigletsinoculatedwithJL580图2.14感染猪的临床症状及病理组织学变化A：感染组临床症状；B：对照组临床症状；C：感染组大体病变；D：对照组大体病变；E：感染组显微病变；F：对照显微病变Fig.2.14ClinicalsymptomsandpathologicalhistologychangesinswineA:ClinicalsymptomsofJL580-infected;B:Clinicalsymptomsofcontrol;C:GrosslunglesionsofJL580-infected;D:Grosslunglesionsofcontrol;E:MicroscopiclesionsofJL580-infected;F:Microscopiclesionsofcontrol36 2.3讨论猪繁殖与呼吸综合征自1995年在我国发现以来已有20年，虽然已研制多种疫苗防治，但PRRS并未根除。PRRSV为单股正链RNA病毒，在自然界以及免疫压力下不断[76]变异。2006年北美和亚洲出现的高致病性PRRSV表明病毒的潜在变异导致PRRSV[77]出现了新的变异株。本研究通过对JL580分离株进行分子流行病学及遗传进化分析发现，JL580病毒株属于北美洲型PRRSV，并且与国内PRRSV经典株CH-1a和HP-PRRSV株HuN4处于遗传进化树的不同分支中，核苷酸同源性较低，亲缘关系相对较远；而与美国NADC30株的全基因组序列具有较高的同源性。从JL580与国内之前报道的经典PRRSV和HP-PRRSV的遗传距离上来看，JL580属于国内出现的一个新亚型毒株。本研究结果表明我国PRRSV出现了新的遗传分支，揭示了我国PRRSV存在着更为复杂的遗传多样性。研究发现JL580株GP5蛋白与CH-1a、VR-2332、HuN4相比，糖基化位点并未发生变异，但是中和表位、非中和表位及毒力位点发生了显著的变异，主要表现在R13→Q13，L15→P15，V27→A27，H38→N38，L47→I47，V124→A124，R151→K151。GP5是PRRSV[78]的主要结构蛋白，也是最易发生变异的蛋白，R13和R151是毒力相关位点，非中和表位A（aa27～aa30）和中和表位B（aa37～aa45）是影响免疫的关键位点。因此，JL580病毒株的毒力和免疫原性是否与GP5蛋白氨基酸的变异有关，还需要进一步的研究。NSP2是PRRSV非结构蛋白中最易发生变异的蛋白，欧洲型和北美洲型NSP2高变区氨基酸缺失的报道表明NSP2对于病毒的复制不具有决定性作用但在宿主免疫方面可能具[15]有非常重要的作用。JL580株NSP2编码的蛋白存在3处不连续氨基酸的缺失，与经典株CH-1a和VR-2332相比NSP2共缺失了131个氨基酸；与2006年暴发的HP-PRRSV基因组中NSP2存在30个不连续氨基酸的缺失相比，JL580株NSP2基因编码的蛋白共缺失101个氨基酸，且与HuN4、JXA1株NSP2的缺失情况完全不一致。另外，JL580病毒株NSP2的缺失情况与2006年Han等和2014年Choi等所研究的PRRSV分离株[73,78]NSP2缺失131个氨基酸情况相似。因此，JL580病毒株NSP2的3处不连续的缺失可作为一个分子标记来区分JL580样PRRSV和其他Ⅱ型PRRSV。JL580毒株是一个基因重组株，是美国NADC30株和国内某些PRRSV的重组毒株，这一发现意味着随着国际贸易的发展，国际间畜禽贸易也越来越频繁，JL580重组毒株很有可能是进口动物与国内猪群HP-PRRSV相互结合的产物。因此，我们有必要加强国内猪繁殖与呼吸综合征的监测，从而保证国内养猪业及公共卫生事业的健康持续发展。2.4小结JL580病毒株是目前国内出现的一种新的变异株，其GP5和NSP2基因的变异相对于以往国内发现的变异株具有显著的差异性。最具有代表性的是NSP2存在131个不连37 续氨基酸的缺失，且JL580是一个基因重组株。38 结论1、我国部分地区PRRS流行病学及遗传进化分析表明，我国PRRSV具有更为复杂的遗传多样性，而且PRRSV已经出现了新的遗传变异分支。2、分离并鉴定了JL580毒株，重组分析表明JL580是基因重组株，是美洲NADC30样PRRSV与我国高致病性PRRSV重组的产物，而且JL580病毒株具有较高的致病性。39 参考文献[1]CollinsJE,BenfieldDA,ChristiansonWT,etal.Isolationofswineinfertilityandrespiratorysyndromevirus(isolateATCCVR-2332)inNorthAmericaandexperimentalreproductionofthediseaseingnotobioticpigs[J].JVetDiagnInvest,1992,4(2):117-126.[2]WensvoortG,TerpstraC,PolJM,etal.MysteryswinediseaseinTheNetherlands:theisolationofLelystadvirus[J].VetQuart,1991,13(3):121-130.[3]BaronT,AlbinaE,LeforbanY,etal.Reportonthefirstoutbreaksoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)inFrance.Diagnosisandviralisolation[J].AnnRechVet,1992,23(2):161-166.[4]AlbinaE.Epidemiologyofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS):anoverview[J].VetMicrobiol,1997,55(1-4):309-316.[5]郭宝清,陈章水,刘文兴,etal.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病,1996,87(2):1-4.[6]RowlandRR,LunneyJ,DekkersJ.Controlofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)throughgeneticimprovementsindiseaseresistanceandtolerance[J].FrontGenet,2012,14(3):260-265.[7]朱佳毅,任晓峰.猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的研究进展[J].中国预防兽医学报,2014,36(1):77-80.[8]PirzadehB,DeaS.MonoclonalantibodiestotheORF5productofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusdefinelinearneutralizingdeterminants[J].JGenVirol,1997,78(8):1867-1873.[9]WeilandE,Wieczorek-KrohmerM,KohlD,etal.MonoclonalantibodiestotheGP5ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusaremoreeffectiveinvirusneutralizationthanmonoclonalantibodiestotheGP4[J].VetMicrobiol,1999,66(3):171-186.[10]ZhouYJ,HaoXF,TianZJ,etal.HighlyvirulentporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusemergedinChina[J].TransboundEmergDis,2008,55(3-4):152-164.[11]DarwichL,GimenoM,SibilaM,etal.GeneticandimmunobiologicaldiversitiesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromegenotypeIstrains[J].VetMicrobiol,2011,150(1-2):49-62.[12]ZhouL,WangZ,DingY,etal.NADC30-likeStrainofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,China[J].EmergInfectDis,2015,21(12):2256-7.[13]ZhouF,ZhaoJ,ChenL,etal.CompleteGenomeSequenceofaNovelPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusThatEmergedinChina[J].GenomeAnnounc,2015,3(4):15-16.[14]ZhaoK,YeC,ChangXB,etal.ImportationandRecombinationAreResponsiblefortheLatest40 EmergenceofHighlyPathogenicPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusinChina[J].JVirol,2015,89(20):10712-10716.[15]Rascon-CasteloE,Burgara-EstrellaA,MateuE,etal.Immunologicalfeaturesofthenon-structuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Viruses,2015,7(3):873-886.[16]TongGZ,ZhouYJ,HaoXF,etal.Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome,China[J].EmergInfectDis,2007,13(9):1434-1436.[17]CavanaghD.Nidovirales:AnewordercomprisingCoronaviridaeandArteriviridae[J].ArchVirol,1997,142(3):629-633.[18]MeulenbergJJ,HulstMM,DeMeijerEJ,etal.Lelystadvirus,thecausativeagentofporcineepidemicabortionandrespiratorysyndrome(PEARS),isrelatedtoLDVandEAV[J].Virology,1993,192(1):62-72.[19]DunowskaM,BiggsPJ,ZhengT,etal.IdentificationofanovelnidovirusassociatedwithaneurologicaldiseaseoftheAustralianbrushtailpossum(Trichosurusvulpecula)[J].VetMicrobiol,2012,156(3-4):418-424.[20]BenfieldDA,NelsonE,CollinsJE,etal.Characterizationofswineinfertilityandrespiratorysyndrome(SIRS)virus(isolateATCCVR-2332)[J].JVetDiagnInvest,1992,4(2):127-133.[21]DoklandT.ThestructuralbiologyofPRRSV[J].VirusRes,2010,154(1-2):86-97.[22]SpilmanMS,WelbonC,NelsonE,etal.Cryo-electrontomographyofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:organizationofthenucleocapsid[J].JGenVirol,2009,90(3):527-535.[23]MusicN,GagnonCA.Theroleofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusstructuralandnon-structuralproteinsinviruspathogenesis[J].AnimHealthResRev,2010,11(2):135-163.[24]DeaS,GagnonCA,MardassiH,etal.Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virus:comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates[J].ArchVirol,2000,145(4):659-688.[25]LeeC,HodginsD,CalvertJG,etal.Mutationswithinthenuclearlocalizationsignaloftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnucleocapsidproteinattenuatevirusreplication[J].Virology,2006,346(1):238-250.[26]FirthAE,Zevenhoven-DobbeJC,WillsNM,etal.DiscoveryofasmallarterivirusgenethatoverlapstheGP5codingsequenceandisimportantforvirusproduction[J].JGenVirol,2011,92(5):1097-1106.[27]JohnsonCR,GriggsTF,GnanandarajahJ,etal.NovelstructuralproteininporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyanalternativeORF5presentinallarteriviruses[J].JGenVirol,2011,92(5):1107-1116.[28]HanM,YooD.EngineeringthePRRSvirusgenome:updatesandperspectives[J].VetMicrobiol,2014,174(3-4):279-295.[29]WuWH,FangY,FarwellR,etal.A10-kDastructuralproteinofporcinereproductiveandrespiratory41 syndromevirusencodedbyORF2b[J].Virology,2001,287(1):183-191.[30]MeulenbergJJ,Petersen-DenBestenA,DeKluyverEP,etal.CharacterizationofproteinsencodedbyORFs2to7ofLelystadvirus[J].Virology,1995,206(1):155-163.[31]MeulenbergJJ,PetersenDenBestenA,DeKluyverE,etal.MolecularcharacterizationofLelystadvirus[J].VetMicrobiol,1997,55(1-4):197-202.[32]MeulenbergJJ.PRRSV,thevirus[J].VetRes,2000,31(1):11-21.[33]KapurV,ElamMR,PawlovichTM,etal.GeneticvariationinporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatesinthemidwesternUnitedStates[J].JGenVirol,1996,77(6):1271-1276.[34]MurtaughMP,ElamMR,KakachLT.ComparisonofthestructuralproteincodingsequencesoftheVR-2332andLelystadvirusstrainsofthePRRSvirus[J].ArchVirol,1995,140(8):1451-1460.[35]DeaS,WilsonL,TherrienD,etal.CompetitiveELISAfordetectionofantibodiestoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirususingrecombinantE.coli-expressednucleocapsidproteinasantigen[J].JVirolMethods,2000,87(1-2):109-122.[36]MengXJ.Heterogeneityofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:implicationsforcurrentvaccineefficacyandfuturevaccinedevelopment[J].VetMicrobiol,2000,74(4):309-329.[37]SuarezP,Diaz-GuerraM,PrietoC,etal.Openreadingframe5ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusasacauseofvirus-inducedapoptosis[J].JVirol,1996,70(5):2876-2882.[38]MurtaughMP,XiaoZ,ZuckermannF.Immunologicalresponsesofswinetoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection[J].ViralImmunol,2002,15(4):533-547.[39]DrewTW,MeulenbergJJ,SandsJJ,etal.Production,characterizationandreactivityofmonoclonalantibodiestoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JGenVirol,1995,76(6):1361-1369.[40]MardassiH,MounirS,DeaS.MolecularanalysisoftheORFs3to7ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,Quebecreferencestrain[J].ArchVirol,1995,140(8):1405-1418.[41]DelputtePL,VanderheijdenN,NauwynckHJ,etal.Involvementofthematrixproteininattachmentofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirustoaheparinlikereceptoronporcinealveolarmacrophages[J].JVirol,2002,76(9):4312-4120.[42]SnijderEJ,DobbeJC,SpaanWJM.Heterodimerizationofthetwomajorenvelopeproteinsisessentialforarterivirusinfectivity[J].JVirol,2003,77(1):97-104.[43]YangL,FreyML,YoonKJ,etal.CategorizationofNorthAmericanporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses:epitopicprofilesoftheN,M,GP5andGP3proteinsandsusceptibilitytoneutralization[J].ArchVirol,2000,145(8):1599-1619.[44]NelsenCJ,MurtaughMP,FaabergKS.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscomparison:divergentevolutionontwocontinents[J].JVirol,1999,73(1):270-280.[45]Frias-StaheliN,GiannakopoulosNV,KikkertM,etal.Ovariantumordomain-containingviralproteasesevadeubiquitin-andISG15-dependentinnateimmuneresponses[J].CellHostMicrobe,2007,42 2(6):404-416.[46]VanKasterenPB,BeugelingC,NinaberDK,etal.Arterivirusandnairovirusovariantumordomain-containingDeubiquitinasestargetactivatedRIG-Itocontrolinnateimmunesignaling[J].JVirol,2012,86(2):773-785.[47]DuanX,NauwynckHJ,PensaertMB.Virusquantificationandidentificationofcellulartargetsinthelungsandlymphoidtissuesofpigsatdifferenttimeintervalsafterinoculationwithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)[J].VetMicrobiol,1997,56(1-2):9-19.[48]KimHS,KwangJ,YoonIJ,etal.Enhancedreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusinahomogeneoussubpopulationofMA-104cellline[J].ArchVirol,1993,133(3-4):477-483.[49]NauwynckHJ,DuanX,FavoreelHW,etal.Entryofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusintoporcinealveolarmacrophagesviareceptor-mediatedendocytosis[J].JGenVirol,1999,80(2):297-305.[50]VanderheijdenN,DelputtePL,FavoreelHW,etal.Involvementofsialoadhesininentryofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusintoporcinealveolarmacrophages[J].JVirol,2003,77(15):8207-8215.[51]CalvertJG,SladeDE,ShieldsSL,etal.CD163expressionconferssusceptibilitytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses[J].JVirol,2007,81(14):7371-7379.[52]KimJK,FahadAM,ShanmukhappaK,etal.Definingthecellulartarget(s)ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusblockingmonoclonalantibody7G10[J].JVirol,2006,80(2):689-696.[53]Martin-VallsGE,KvisgaardLK,TelloM,etal.AnalysisofORF5andFull-LengthGenomeSequencesofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusIsolatesofGenotypes1and2RetrievedWorldwideProvidesEvidencethatRecombinationIsaCommonPhenomenonandMayProduceMosaicIsolates[J].JVirol,2014,88(6):3170-3181.[54]FrossardJP,HughesGJ,WestcottDG,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:geneticdiversityofrecentBritishisolates[J].VetMicrobiol,2013,162(2-4):507-518.[55]GoldbergTL,LoweJF,MilburnSM,etal.Quasispeciesvariationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusduringnaturalinfection[J].Virology,2003,317(2):197-207.[56]FangY,SchneiderP,ZhangWP,etal.DiversityandevolutionofanewlyemergedNorthAmericanType1porcinearterivirus:analysisofisolatescollectedbetween1999and2004[J].Archvirol,2007,152(5):1009-1017.[57]AllendeR,LewisTL,LuZ,etal.NorthAmericanandEuropeanporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesdifferinnon-structuralproteincodingregions[J].JGenVirol,1999,80(2):307-315.[58]YoonSH,KimH,KimJ,etal.Completegenomesequencesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses:perspectivesontheirtemporalandspatialdynamics[J].MolBiolRep,2013,40(12):43 6843-6853.[59]MurtaughMP,JohnsonCR,XiaoZ,etal.Speciesspecializationincytokinebiology:isinterleukin-4centraltotheT(H)1-T(H)2paradigminswine?[J].DevCompImmunol,2009,33(3):344-352.[60]SangY,RowlandRR,HesseRA,etal.DifferentialexpressionandactivityoftheporcinetypeIinterferonfamily[J].PhysiolGenomics,2010,42(2):248-258.[61]VidorE.Evaluationofthepersistenceofvaccine-inducedprotectionwithhumanvaccines[J].JCompPathol,2010,142(1):96-101.[62]FossDL,ZillioxMJ,MeierW,etal.Adjuvantdangersignalsincreasetheimmuneresponsetoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].ViralImmunol,2002,15(4):557-566.[63]LagerKM,MengelingWL,BrockmeierSL.Durationofhomologousporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusimmunityinpregnantswine[J].VetMicrobiol,1997,58(2-4):127-133.[64]VanheeM,VanBreedamW,CostersS,etal.Characterizationofantigenicregionsintheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbytheuseofpeptide-specificserumantibodies[J].Vaccine,2011,29(29-30):4794-4804.[65]KlingeKL,VaughnEM,RoofMB,etal.Age-dependentresistancetoPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusreplicationinswine[J].VirolJ,2009,27(6):177-187.[66]ThanawongnuwechR,ThackerEL,HalburPG.Influenceofpigageonvirustiterandbactericidalactivityofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)-infectedpulmonaryintravascularmacrophages(PIMs)[J].VetMicrobiol,1998,63(2-4):177-187.[67]HoweL,LerouxC,IsselCJ,etal.Equineinfectiousanemiavirusenvelopeevolutioninvivoduringpersistentinfectionprogressivelyincreasesresistancetoinvitroserumantibodyneutralizationasadominantphenotype[J].JVirol,2002,76(21):10588-10597.[68]EllingsonJS,WangY,LaytonS,etal.Vaccineefficacyofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruschimeras[J].Vaccine,2010,28(14):2679-2686.[69]AnTQ,TianZJ,ZhouYJ,etal.Comparativegenomicanalysisoffivepairsofvirulentparental/attenuatedvaccinestrainsofPRRSV[J].VetMicrobiol,2011,149(1-2):104-112.[70]CostersS,VanheeM,VanBreedamW,etal.GP4-specificneutralizingantibodiesmightbeadrivingforceinPRRSVevolution[J].VirusRes,2010,154(1-2):104-113.[71]AnsariIH,KwonB,OsorioFA,etal.InfluenceofN-linkedglycosylationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGP5onvirusinfectivity,antigenicity,andabilitytoinduceneutralizingantibodies[J].JVirol,2006,80(8):3994-4004.[72]ShenS,KwangJ,LiuW,etal.DeterminationofthecompletenucleotidesequenceofavaccinestrainofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandidentificationoftheNsp2genewithauniqueinsertion[J].ArchVirol,2000,145(5):871-883.[73]ChoiHW,NamE,LeeYJ,etal.GenomicanalysisandpathogeniccharacteristicsofType2porcine44 reproductiveandrespiratorysyndromevirusnsp2deletionstrainsisolatedinKorea[J].VetMicrobiol,2014,170(3-4):232-245.[74]FaabergKS,KehrliME,Jr.,LagerKM,etal.Invivogrowthofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusengineerednsp2deletionmutants[J].VirusRes,2010,154(1-2):77-85.[75]韦天超,田志军,安同庆,etal.猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J].中国预防兽医学报,2008,30(12):944-948.[76]LiuD,ZhouR,ZhangJ,etal.Recombinationanalysesbetweentwostrainsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinvivo[J].VirusRes,2011,155(2):473-486.[77]HanJ,WangY,FaabergKS.CompletegenomeanalysisofRFLP184isolatesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].VirusRes,2006,122(1-2):175-182.[78]AllendeR,KutishGF,LaegreidW,etal.Mutationsinthegenomeofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusresponsiblefortheattenuationphenotype[J].ArchVirol,2000,145(6):1149-1161.45 附录英文缩略表英文缩写英文全称中文名称PRRSporcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征PRRSVporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus猪繁殖与呼吸综合征病毒ORFopenreadingframe开放阅读框GPGlycoprotein糖蛋白NSPnon-structuralprotein非结构蛋白Mmembraneenvelopeprotein基质蛋白Nnucleocapsidprotein核衣壳蛋白DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RNAribonucleicacid核糖核酸PRVpseudorabiesvirus伪狂犬病毒MHPmycoplasmahyopneumoniae猪肺炎支原体PCVpocinecircovirus猪圆环病毒CSFVclassicalswinefevervirus猪瘟病毒FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素Marc-145Africangreenmonkeykidneycell非洲绿猴肾细胞CPEcytopathiceffect致细胞病理变化作用TCID5050%tissuecultureinfectiousdose50%组织细胞感染量PAMporcinealveolarmacrophages猪肺泡巨噬细胞PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳aaaminoacid氨基酸bpbasepair碱基对hhour小时minminute分钟ssecond秒rpmrotationperminute每分钟转速46 作者简介姓名常晓博性别女民族汉籍贯河南登封政治面貌党员入学时间2013年9月申请学位类别农学硕士论文答辩日期2016年5月授予学位年月2016年6月就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2009/9--2013/7：河南科技大学，动物医学专业，本科2013/9--2016/6：吉林农业大学，临床兽医学，硕士2014/6--2016/5：哈尔滨兽医研究所蔡雪辉研究员团队安同庆副研究员名下客座研究生攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名署名发表情况题目刊物名称（级别）次序单位(刊出时间/录用)发表学术论文PRRSV新亚型毒株吉林中国兽药杂志JL580的基因组变1农业2015-5-20重点异特征研究大学2013-2014年我国东北地区猪繁殖与吉林中国兽药杂志呼吸综合征病毒1农业2015-8-20重点GP5和NSP2基因大学遗传变异分析署名署名获奖名称成果级别发表情况次序单位项目及专利47 致谢时间飞逝，转眼间即将面临毕业。值此论文完成之际，我由衷地感谢导师张辉副教授和哈尔滨兽医研究所安同庆副研究员在三年硕士研究生期间对我的关怀、照顾、包容和支持。两位老师都是我生命中的灯塔，在我茫然不知所措时，为我点亮前进的方向。两位老师细心、耐心的指导，严谨、务实的工作态度，以及渊博的知识让我在实验生活中受益匪浅。在此，向我敬爱的张辉老师和安同庆老师致以真诚的祝福和崇高的敬意。由衷地感谢崔焕忠老师和哈尔滨兽医研究所的姜成刚老师、王淑杰老师在实验中给予的宝贵建议和帮助。感谢叶超师兄、赵款在实验技术及实验操作中给予的帮助和建议，你们无私的奉献让我在实验技术的学习与操作中收获多多。感谢郭金超师弟、王同云师妹、高嘉聪师妹，你们的努力向上及朝气蓬勃让整个实验室都充满着满满的正能量。感谢诊断中心所有的老师和同学，感谢临床兽医学所有的同学，因为有你们，生活才充满着不一样的气息。感谢我亲爱的父母及亲人，因为你们的无私奉献和默默支持，让我的生活充满温馨，充满感动。因为有你们，我的生活才更加美好，我对未来才更加充满希望和期待。48