《大理地区白族人群及鼠的微孢子虫和隐孢子虫分子流行病学调查研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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学校代码：丨０６７９研究生学号：Ｙ２０１５１０４０１７声明？本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，论文中不包含其他，除了文中特别加以标注和致谢的地方外个人或集体已经发表或撰写过的研宂成果，也不包含为获得大理大学或其他教育机构的学位或证明而使用过的材料。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己。在文中以明确方式标明，并表示了谢意本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。研究生签名；＾ｔｉｔ日期：ｆ＊＊ｋ＊论文使用和授权说明本人完全了解大理大学有关保留、使用学位论文的规定，ｓ卩：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文复印件和论文电子版；允许论文被查阅或借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文；授权学校将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。（保密的论女在解密后应遵循此规定）研宄生签名：ｉｉ导师签名：日期：＿ｉｌＬ， 大理大学2018届硕士研究生学位论文目录中文摘要....................................................................................................................................1Abstract.....................................................................................................................................4前言............................................................................................................................................7第一章微孢子虫及隐孢子虫研究进展..................................................................................8第二章大理地区白族人群及鼠的毕氏微孢子虫分子流行病学调查和基因型研究.......181材料与方法.....................................................................................................................182结果.................................................................................................................................243讨论.................................................................................................................................314结论.................................................................................................................................32第三章大理地区白族人群及鼠的隐孢子虫分子流行病学调查和种属鉴定...................331材料与方法.....................................................................................................................332结果.................................................................................................................................353讨论.................................................................................................................................374结论.................................................................................................................................39全文总结.................................................................................................................................40硕士在读期间发表的论文.....................................................................................................52综述.........................................................................................................................................53致谢.........................................................................................................................................63 大理大学2018届硕士研究生学位论文大理地区白族人群及鼠的微孢子虫和隐孢子虫分子流行病学调查研究研究生：王琪琪导师：李海龙副教授中文摘要目的利用巢式PCR反应的敏感性、特异性和准确性等特点，选取大理地区白族人群和鼠为调查对象，对毕氏微孢子虫和隐孢子虫的感染情况进行调查；研究白族人群和鼠感染的毕氏微孢子虫是否存在人兽共患基因型，以及白族人群和鼠感染的隐孢子虫种类，为今后微孢子病和隐孢子虫病的进一步研究提供参考。方法从2016年4月至2017年7月，在大理市周边及村庄共采集599份白族人群粪便样本和287份鼠粪便样本，用OMG试剂盒提取粪便样本DNA。基于微孢子虫内转录间隔区（ITS）序列和隐孢子虫的核糖体小亚基（SSUrRNA）基因中的多态区，应用巢式PCR方法扩增粪便样本DNA，把成功扩增到条带的样本测序，确定阳性率。在NCBI序列库进行同源序列搜索，并应用ClusterX1.83、SPSS19.0和MEGA6等分子生物学软件进行序列比对、分析和建树，确定虫种、基因型及流行规律。结果1.在大理地区采集到的599份白族人群粪便样本中，经巢式PCR扩增、测序后检测出12份阳性样本，毕氏微孢子虫的感染率为2.00%（12/599，95%CI0.88～3.13）。其中男性感染率为2.91%（8/275，95%CI0.92～4.90），女性感染率为1.24%（4/324，95%CI0.03～2.44），男女两组感染率差异无统计学意义（P=0.15）。18岁以下的人群组无毕氏微孢子虫感染，18～40岁人群中有2人感染，感染率为1.36%（2/147，95%CI0.00～3.23）；在41～65岁的304人中有7人感染毕氏微孢子虫，感染率为2.30%（7/304，95%CI0.62～3.99）；在65岁以上人群中有1 大理大学2018届硕士研究生学位论文3人感染毕氏微孢子虫，感染率为3.49%（3/86，95%CI0.00～7.37）；年龄组之间感染率差异无统计学意义（P=0.44）。农村居民毕氏微孢子虫感染率（2.97%，11/370，95%CI1.24～4.70）显著高于城镇人群感染率（0.44%，1/229，95%CI0.00～1.29），差异具有统计学意义（P＜0.05）。12份阳性样本中鉴定出4种已知基因型：EbpC（n=5）、SC02（n=1）、Henan-Ⅳ（n=2）和D（n=1）；3种新基因型，分别命名为Yunnan1，Yunnan2和Yunnan3。2.在采集到的287份鼠粪便样本中共检测出12份毕氏微孢子虫阳性样本，感染率为4.18%（12/287，95%CI1.87～6.50）。其中褐家鼠感染率为4.44%（12/270），黄胸鼠感染率为0（0/17）。幼年组感染率为12.50%（2/16，95%CI0.00～28.70），少年组感染率为1.37%（1/73，95%CI0.00～4.04），成年组感染率为4.55%（9/198，95%CI1.64～7.45），差异无统计学意义（P＞0.05）。雌性感染率为4.57%（8/175，95%CI1.48～7.67），雄性感染率3.57%（4/112，95%CI0.13～7.00），差异无统计学意义。鼠粪便样本中除了发现与人群粪便中相同的基因型D和EbpC外，还有一种新基因型，命名为YNM1。3.白族人群隐孢子虫的研究中仅检测出1份阳性样本，感染率为0.17%（1/599），为鼠隐孢子虫（Cryptosporidiummuris）。4.鼠粪便样本中检测出13份隐孢子虫阳性样本，全为鼠隐孢子虫，感染率为4.53%（13/287，95%CI2.12～6.94）。幼年组感染率（31.25%，5/16，95%CI8.54～53.96）显著高于少年组（6.85%，5/73，95%CI1.06～12.64）和成年组（1.52%，3/198，95%CI0.00～3.22），年龄段是鼠感染隐孢子虫的重要风险因素，差异有统计学意义（P＜0.001）。雌性感染率为6.29%（11/175，95%CI2.69～9.88），雄性感染率为1.79%（2/112，95%CI0.00～4.24），差异无统计学意义（P＞0.05）。有一幼年鼠既感染毕氏微孢子虫，也感染隐孢子虫。结论本研究首次解析了大理地区白族人群及鼠毕氏微孢子虫的人兽共患基因型和隐孢子虫的种类。白族人群毕氏微孢子虫感染率为2.00%，隐孢子虫感染率为0.17%；鼠毕氏微孢子虫感染率为4.18%，隐孢子虫感染率为4.53%。成功鉴定出毕氏微孢子虫基因型：EbpC、SC02、Henan-Ⅳ、D、Yunnan1、Yunnan2、Yunnan3和YNM1；发现鼠粪便样本中有与人群粪便样本相同的基因型：D和EbpC；其2 大理大学2018届硕士研究生学位论文中Yunnan1、Yunnan2、Yunnan3和YNM1是本次研究鉴定出的新型。人和鼠感染的隐孢子虫都为鼠隐孢子虫（C.muris）。关键词：毕氏微孢子虫；隐孢子虫；白族人群；鼠；巢式PCR3 大理大学2018届硕士研究生学位论文MolecularepidemiologyofEnterocytozoonbieneusiandCryptosporidiumintheBaiethnicpeopleandwildrodentsfromDaliareaPostgraduate:WangQiqiSupervisor:AssociateProf.LiHailongAbstractObjectiveThesensitivity,specificityandaccuracyofnestedPCRreactionwereusedtoinvestigatetheinfectionofEnterocytozoonbieneusiandCryptosporidium.TostudywhethertherearezoonoticgenotypesofEnterocytozoonbieneusiinBaiethnicpeopleandwildrodents,andtheinfectedspeciesofCryptosporidium,whichcanprovidereferencetofurtherresearchofMicrosporidiosisandCryptosporidiosis.MethodsFromApril2016toJuly2017,atotalof599fecalsamplesfromtheBaiethnicpeopleand287fecalsamplesfromwildrodentswerecollectedinthesurroundingareasandvillagesofDaliCity.DNAsampleswereextractedfromfecalsamplesbyOMGKit.Theinternaltranscribedspacer(ITS)ofribosomalDNAofEnterocytozoonbieneusiandthepolymorphicregionofthesmallsubunitofribosomalRNA(SSUrRNA)geneofCryptosporidiumwereamplifiedbynestedPCR,respectively.Thesuccessfullyamplifiedsamplesweresequencedtodeterminethepositiverate.HomologoussequencesearchintheNCBIdatabase,thegenotypesandepidemiologicaldistributionofEnterocytozoonbieneusiandCryptosporidiumwerecomparedandanalyzedbyClusterX1.83,SPSS19.0andMEGA6.Results1.Among599stoolsamplescollectedfromBaiethnicgroupinDaliarea,and12samplesweretestedasE.bieneusipositivebynestedPCRaftersequencing.Theoverall4 大理大学2018届硕士研究生学位论文prevalenceofE.bieneusiinfectionwas2.00%(12/599,95%CI0.88～3.13).Theprevalencewas2.91%(8/275,95%CI0.92～4.90)inmaleandtheprevalencewas1.24%(4/324,95%CI0.03～2.44)infemale.Therewasnosignificantdifferenceininfectionratebetweenmaleandfemalegroups(P＞0.05).Asforagegroup,noE.bieneusipositivesamplewasdetectedinunder18yearsoldgroup.TwosampleswastestedasE.bieneusipositivein18～40yearsoldgroup,andtheinfectionratewas1.36%(2/147,95%CI0.00～3.23).SevensampleswastestedasE.bieneusipositivein41～65yearsoldgroup,withaninfectionrateof2.30%(7/304,95%CI0.62～3.99).Amongthegroupofover65yearsold,theinfectionratewas3.49%(3/86,95%CI0.00～7.37).Therewasnosignificantdifferenceininfectionrateamongdifferentages(P=0.44).TheinfectionrateofE.bieneusiinruralresidents(2.97%,11/370，95%CI1.19～4.52)wassignificantlyhigherthanthatintheurbanpopulation(0.44%,1/229，95%CI0.00～1.38)andthedifferencewasstatisticallysignificant(P＜0.05).Outof12positivesamples,4knowngenotypeswereidentified:EbpC(n=5),SC02(n=1),Henan-Ⅳ(n=2)andD(n=1).ThreenewgenotypesnamedasYunnan1,Yunnan2andYunnan3wereidentified.2.TwelvesamplesweretestedasE.bieneusipositivefrom287fecalsamplesofwildrodents,withaninfectionrateof4.18%(12/287,95%CI1.87～6.50).TheinfectionrateofRattusnorvegicuswas4.44%(12/270),theinfectionrateofRattusflavipectuswas0(0/17).Theinfectionratewas12.50%(2/16,95%CI0.00～28.70)injuvenilegroup,1.37%(1/73,95%CI0.00～4.04)injuniorgroupand4.55%(9/198,95%CI1.64～7.45)inadultgroup.Thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P＞0.05).Femaleinfectionratewas4.57%(8/175,95%CI1.48～7.67)andmaleinfectionratewas3.57%(4/112,95%CI0.13～7.00).Thedifferencewasnotstatisticallysignificant.BesidesthesamegenotypesDandEbpCfoundinthefecalsamplesofpeople,thereisanewgenotypenamedasYNM1.3.InthestudyoftheinfectionwithCryptosporidiuminBaiethnicpeople,onlyonepositivesamplewasdetected,theinfectionratewas0.17%(1/599),itrepresentedCryptosporidiummuris.4.ThirteensamplesweretestedasCryptosporidiumpositiveinthefecesofwild5 大理大学2018届硕士研究生学位论文rodents.Theinfectionratewas4.53%(13/287,95%CI2.12～6.94).Theinfectionrateinjuvenilegroup(31.25%,5/16,95%CI8.54～53.96)wassignificantlyhigherthanthatinthejuniorgroup(6.85%,5/73,95%CI1.06～12.64)andtheadultgroup(1.52%,3/198,95%CI0.00～3.22),respectively.AgeisanimportantriskfactorforCryptosporidiuminfectioninwildrodents,andthedifferenceisstatisticallysignificant(P＜0.001).Theinfectionrateoffemalewas6.29%(11/175,95%CI2.69～9.88)andthatofthemaleratswas1.79%(2/112,95%CI0.00～4.24).Thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P＞0.05).Inthewildrodents,onlyonejuvenilewildrodentwasco-infectedwithE.bieneusiandCryptosporidium.ConclusionThisstudywasthefirsttimetoanalyzethegenotypesandspeciesofE.bieneusiandCryptosporidiumintheBaiethnicpeopleandrodentsinDaliarea.TheinfectionratesofE.bieneusiandCryptosporidiumwere2.00%and0.17%intheBaiethnicpeople,4.18%and4.53%inwildrodents,respectively.TheE.bieneusigenotypesweresuccessfullyidentified:EbpC,SC02,Henan-Ⅳ,D,Yunnan1,Yunnan2,Yunnan3andYNM1;Thesamegenotypeswerealsofoundinwildrodentsasthoseinhuman:DandEbpC.TheYunnan1,Yunnan2,Yunnan3andYNM1wereidentifiedasnewgenotypesinthisstudy.CryptosporidiumwhichwasfoundinthisstudyinhumanandwildrodentswasidentifiedasC.muris.Keywords:Enterocytozoonbieneusi;Cryptosporidium;Baiethnicpeople;wildrodents;NestedPCR6 大理大学2018届硕士研究生学位论文前言毕氏微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）和隐孢子虫（Cryptosporidium）是一类能感染人、家畜及各种野生动物的寄生虫。免疫功能正常的人群或动物感染时表现为腹或者无症状；而老年人、儿童、器官移植者和艾滋病患者等免疫功能低下者感染，会造成长期性腹泻，严重者甚至危及生命。随着生活水平的逐渐提高，微孢子虫病和隐孢子虫病越来越受到重视。这两种病原可以通过多种途径进行传播，包括人与人接触传播、人与动物接触传播、食源性传播和水源性传播。目前已在水源中发现了感染人类和动物的微孢子虫种，这引起了人们的广泛关注。我国关于动物感染这两种病原的研究报道相对较多，而人感染的报道相对较少。鼠常寄居于人类生活区，是传播人兽共患病的重要宿主，不仅对农业作物造成威胁，还是鼠疫、恙虫病、流行性出血热等疾病的传播者。野鼠的活动范围很广，比如厨房、下水道和垃圾堆等，鼠粪便可能会污染水源，会使其他一些动物感染微孢子虫或隐孢子虫，从而广泛感染人类。大理地区气候温和，为野鼠提供了良好的生存环境。随着分子生物学检测技术的不断发展，PCR（聚合酶链反应）一直是检测和研究微孢子虫及隐孢子虫的主导。它广泛应用于检测种类、基因型和人类与动物感染的跨种传播程度，为感染源和所鉴定分离物提供了公共卫生意义的信息。目前对毕氏微孢子虫的基因型研究，多基于小亚基核糖体RNA（SSUrRNA）基因中的内部可转录间隔区（ITS，internaltranscribedspacer），已鉴定出200多种基因型。关于隐孢子虫种属划分是有争议的，隐孢子虫具有较大的遗传多样性和宿主特异性，基于其卵囊形态、分子遗传学等方面，有33种被认为是有效的；除此之外，还有多个基因型。这两种病原目前尚无有效治疗及预防方法，对其进行分子流行病学的调查可以帮助我们了解微孢子虫病和隐孢子虫病的传播和预防。本次研究从大理地区采集白族人群和野鼠新鲜粪便，用分子生物学技术对这两种病原进行感染率的调查，鉴定其基因型和种类；并分析是否为人兽共患基因型，为微孢子虫病和隐孢子虫病的防控提供科学依据。7 大理大学2018届硕士研究生学位论文第一章微孢子虫及隐孢子虫研究进展1.微孢子虫微孢子虫（Microsporidia）是一种专性细胞内寄生性的真核生物，分布于世界各地，宿主种类繁多包括无脊椎动物和脊椎动物[1]。有些微孢子虫甚至能同时感染脊椎动物和无脊椎动物，而一些单个虫种的微孢子虫只能感染一些特定的宿主[2]。微孢子虫在昆虫中分布广泛，几乎整个昆虫纲均有发现；但是仅约1％的微孢子虫种类在鸟类和哺乳动物中发现。微孢子虫病（Microsporidiosis）是由微孢子虫引起的一种呈世界性分布的人兽共患寄生虫病。1857年首次在蚕中分离到家蚕微孢子虫，被鉴定为引起家蚕微粒子病的病原[3]；1959年报道了第一例人类微孢子虫病[1]；1985年在艾滋病患者中发现毕氏微孢子虫[3]。艾滋病患者和免疫低下的儿童感染微孢子虫，经常会导致持续性腹泻，伴有发热、食欲不振和体重减轻等症状[3,4]；接受免疫抑制剂治疗的器官移植患者感染微孢子虫后，同样会出现发热、乏力、恶心和腹泻[5]。微孢子虫引起的急性腹泻，是导致免疫缺陷患者（艾滋病患者与器官移植患者）的重要致死因素。随着外出旅游的人越来越多，常有旅行者感染微孢子虫，感染后会发生约2-3周的自限性腹泻[6,7]。1.1病原生物学特征1.1.1分类从微孢子虫的发现到现在，人们对微孢子虫的进化起源研究已经长达160年。1857年Nägeli首次发现微孢子虫后，在当时研究条件所限的情况下将其定义为类似于酵母的真菌，这一结果与一百多年后的今天惊人地相似，并命名了第一个微孢子虫－Nosemabombycis（家蚕微孢子虫）[8,9]。而后1882年，Balbiani创建了微孢子虫目；1976年Sprague建立了微孢子虫门，后被分为原生动物中[9]。随着研究设备的更新换代，学者们通过借助电子显微镜发现微孢子虫不具备典型的真核生物结构，而具有源真核生物体的某些特性，例如缺少高尔基体、线粒体、鞭毛、过氧化物酶体结构等，而且其核糖体的沉降系数为类似于原核生物的70S，而非真核生物的80S。基于此，微孢子虫被划定为源真核生物[9]。而近年来，通过分子生物学等技术进行系统进化分析和基因组的基因测序研究发现，其与真菌8 大理大学2018届硕士研究生学位论文门中的结合菌亚门有特定的亲缘关系，所以现在主流的学说认为微孢子虫是一种真菌（图1）[10,11]。现在微孢子虫已被归类为真菌，之前被认为是藻类、原虫，现在仍有调查者将微孢子虫视为原虫来研究。2003年美国国立信息中心（NCBI）将微孢子虫确定为真菌界，孢子门，微孢子目。关于其进化起源归类的研究主要划分为四个时期，分别是：最初的真菌学说；而后是原生生物学说；到后来的源真核生物学说；现在又回到最初的真菌学说。如今针对微孢子虫的进化分类尚有争议，未来的研究将其归类为一种新的物种也是有可能的。图1.微孢子虫进化地位研究的变迁[10]Figure1.ChangesintheevolutionarystatusofMicrosporidium随着近几年分子生物学技术的发展，除了传统的生物学分类方法，现如今在进化和种系发育分析上，用来鉴定和分类的基因有SSUrRNA基因的内转录间隔区（ITS）序列、16SrDNA片段等，现在最常用的就是ITS序列[12]。至今为止已报道的微孢子虫有200多个属超过1400种，其中有9个属的17个种微孢子虫感染人类[13,14]，而最常见感染人类的有4种（见表1）。在4种主要的人类致病原微孢子虫中，90％以上是由毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）感染[15]。1.1.2形态对人和动物有感染力的微孢子虫为孢子阶段，成熟的孢子为椭圆形，约1.0-3.0μm×1.5-4.0μm[9]。孢子对外界环境的抗性相对较强，孢壁由糖蛋白组成的高密度外壁、几丁质组成的电子透明层的内壁和中间内质膜包绕孢子质。成熟的微9 大理大学2018届硕士研究生学位论文孢子虫孢子含有独特的后空泡与前部区域（包括锚状盘、极体及极管三部分），是微孢子虫显著的结构特征[9]。微孢子虫被宿主摄入到体内后，其孢子会形成复杂的感染装置，通过这个感染装置形成极丝，而后微孢子虫通过极丝形成的管状结构进入到宿主细胞内，以完成其无性生殖和有性生殖阶段，最后以最初的孢子形式返回到环境中。表1.常见的四种感染人类的微孢子虫Table1.Fourcommonspeciesofmicrosporidiuminfectinghumans种类动物宿主参考文献SpeciesAnimalshostReferences毕氏肠微孢子虫哺乳动物，鸟类，鸡[13-16]EnterocytozoonbieneusiMammals,birds,Chickens兔脑炎微孢子虫哺乳动物[17-20]EncephalitozooncuniculiMammals海伦脑炎微孢子虫鸟[9,21,22]EncephalitozoonhellemBirds肠脑炎微孢子虫哺乳动物[23-25]EncephalitozoonintestinalisMammals1.2传播途径1.2.1昆虫传播感染昆虫的微孢子虫种在人体中已发现，可能的原因是通过昆虫叮咬、皮肤损伤或者是食用被昆虫污染的食物和水而感染。有研究发现，艾滋病患者被蜜蜂或黄蜂刺伤是感染微孢子虫病的风险因素之一[9,26]。1.2.2水源传播水源是感染微孢子虫的重要因素，水为孢子提供了存活的环境。污染的水用来饮用、灌溉和娱乐，导致微孢子虫的传播。人类致病性微孢子虫，如毕氏微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）、海伦脑炎微孢子虫（Encephalitozoonhellem）、兔脑炎微孢子虫（Encephalitozooncuniculi）、按蚊微孢子虫（Anncaliia/Nosema/Brachiolaalgerae）、角膜条纹微孢子虫（Vittaformacorneae）和肠脑炎微孢子虫（Encephalitozoonintestinalis），已在农作物灌溉水、游憩水域、饮用水和10 大理大学2018届硕士研究生学位论文废水处理厂流出的废水中检测到[27-32]。随着人类尿液和粪便排出的孢子会污染水源，许多动物可能通过食用被孢子污染的水从而感染微孢子虫。1.2.3食源性传播因饮食而发生微孢子感染的报道相对较少，食用未煮熟的海产品可能会引起感染，或者在处理感染寄生虫的鱼类肉类时会污染手及餐具等，这些生物的感染来源尚不明确；在人类食用的家禽和鸡蛋中已发现了微孢子虫的感染[16]。一项流行病学研究指出，艾滋病患者食用未煮熟的牛肉是感染微孢子虫的相关风险因素。而在一次酒店会议中人们食用了微孢子虫污染的食物，而引起微孢子虫病的爆发[33]。1.2.4人源传播胎盘（垂直）传播尚未见于人类，但在非人灵长类动物和其他各种哺乳动物中有报道[9,22]。有研究者对4组男同性恋的调查中发现有7人感染了微孢子虫，这些感染者虽不能证实微孢子虫的性传播，但在多个人的体液和排泄物中发现微孢子虫是符合性传播方式的。在少数情况下，微孢子虫是能通过直接接触或创伤传播的。1.2.5动物源传播在秘鲁，一名儿童与家养的豚鼠同时检测出微孢子虫基因型Peru16；而调查同一社区其他家庭的豚鼠也发现豚鼠感染基因型Peru16，而这些家庭的人员未感染微孢子虫，表明该儿童可能是从家中的豚鼠中感染微孢子虫的[34]。家庭宠物的增加，人和动物的频繁接触，动物与人之间的传播途径应该引起重视。1.3宿主范围及基因型分布在许多脊椎动物中都有毕氏微孢子虫的发现，宿主包括人类、马、猪、牛、猫、羊、狗、狐狸、浣熊、水獭、猴类、海狸、兔子、猎鹰、啮齿类动物和鸟类等。据不完全统计，迄今为止基于对SSUrRNA基因的ITS序列分析，鉴定了202种毕氏微孢子虫基因型，其中54种仅感染人，34种感染人和动物，114种只感染特定动物。1.3.1人仅在人中检测到的基因型包括B、CAF2、CAF3、CAF4、CHN2、CZ1、CZ2、Peru17、HAN1、Henan-Ⅱ、IH、KIN1、KIN2、KIN3、MAY1、NIA1、Nig1、Nig2、11 大理大学2018届硕士研究生学位论文Nig3、Nig4、Nig5、Peru3、Peru13、Peru15、Q、R、S、S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH6、SH7、SH8、SH9、SH10、SH11、SH12、T、TypeⅢ、TypeⅤ、U、UG2145、V及W共计54个，其中Henan-Ⅱ,SH1～SH8是在我国发现的[12,34-46]。人兽共患基因型有A、BEB4、CAF1、CHN3、CHN4、CZ3、C、D、EbpA、EbpC、EbpD、Henan-Ⅰ、Henan-Ⅲ、Henan-Ⅳ、Henan-Ⅴ、I、J、O、PigEBITS7、Peru6、Peru11、Peru7、Peru16、Peru10、PtEbⅡ、PigEBITS5、SC02、TypeⅣ、WL11、WL15、S6、Peru8、WL12及WL7共34个[34,40,41,44,47-51]。1.3.2猪如今猪肉已经成为我们餐桌上不可或缺的动物性食物之一，据统计我国是生产和消耗猪肉最多的国家，猪肉是否感染寄生虫直接影响着我们日常生活。在各个国家的猪中检测到的毕氏微孢子虫基因型有H、G、PigEbITS1、PigEbITS2、PigEbITS3、PigEbITS4、PigEbITS6、PigEbITS8、EbpB、CHN7、CHN8、CHN9、CHN10、E1、F1、CS-1、CS-2、CS-3、CS-4、CS-5、CS-6、CS-7和CS-8，其中基因型CHN7～CHN10、CS-1～CS-8是在我国发现的[12]。对人有感染力的基因型有EbpD、Henan-Ⅰ、Henan-Ⅲ、Henan-Ⅳ、BEB4、EbpA、PigEBITS5、D、O、PigEBITS7、CAF1和EbpC[12,38,52]。1.3.3牛牛感染毕氏微孢子虫的报道主要集中在大型牧场，所鉴定的基因型主要是牛特有基因型，包括BEB3、BEB3-like、PtEbⅪ、M、N、4948FL-22004、CEbA、CEbD、CEbF、BEB6、BEB7、BEB8、BEB9、BEB10以及人兽共患基因型BEB4、EbpA、I、J、CHN3、CHN4、D、Peru6和EbpC，基因型BEB4、I、CHN3、CHN4和J是在我国发现的[12,53]。1.3.4猫目前在德国、瑞士、哥伦比亚、葡萄牙、日本都有猫感染微孢子虫的报道，基因型有L、EbfelA、PtEbⅣ、PtEbⅧ、D-like以及对人有感染力的TypeⅣ、WL11和Peru10[53]。1.3.5狗现在越来越多的家庭养宠物狗，在瑞士、哥伦比亚、西班牙、葡萄牙、日本12 大理大学2018届硕士研究生学位论文和国内的狗的粪便中都有发现毕氏微孢子虫。基因型有PtEbIX、CHN5和CHN6，人兽共患基因型有D、TypeⅣ、WL11和Peru6[12]。1.3.6羊和兔有关羊和兔感染微孢子虫的报道国外相对少一些，国内有对黑龙江、内蒙古和河南等地区羊微孢子虫的调查，基因型有BEB6、Peru6、D、CM4、EbpC、EbpA和J[47]。1.3.7啮齿类动物鼠是实验室经常用来做实验的一种动物，本次论文的一部分也是以鼠为调查对象。鼠感染的毕氏微孢子虫基因型有H、WL4、WL6、WL10、WL14、WL20、WL21、WL22、WL23、WL25、PtEbⅤ、PigEbITS5、EbpA、CZ3、Peru8、S6、D、EbpC和Peru11[54]，以及本次研究中发现的新型YNM1。1.3.8非人灵长类动物非人灵长类动物具有很多与人类相似的生物学特征，是研究人类健康和疾病问题最理想的动物模型。基因型有BEB6、KB-1、KB-2、KB-3、KB-4、KB-5、KB-6、Macaque1、Macaque2、Macaque3、Macaque4、CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、CM6、CM7和PtEbⅫ。目前已经在灵长类动物身上发现对人有感染力的基因型，有A、Peru11、Peru7、EbpC、TypeⅣ、PigEBITS7、WL15、D、Peru8、I和Henan-Ⅴ[49-51,53]。1.3.9鸟类许多国家的各种鸟类中都有毕氏微孢子虫的感染[14,21]。在鸽子、鸡、鹰等鸟类中发现的基因型有Col01a、Col02a、Peru6-var和M，以及人兽基因型PtEbⅡ、EbpA、Peru8、Peru6和A[14,21,48]。1.3.10其他野生类动物目前在狐狸、浣熊、水獭、猎鹰等动物中鉴定出的基因型有P、WL1～WL19、WL26、WL24、Wildboar1、Wildboar2、Wildboar3、Wildboar4、Wildboar5、Wildboar6、G、PtEbⅤ、WL24和WL26，以及对人也有感染力的基因型Henan-Ⅰ、WL7、EbpA、WL12、D、TypeⅣ、WL11、WL15、Peru11和EbpC[54]。13 大理大学2018届硕士研究生学位论文2.隐孢子虫隐孢子虫是一种全球分布性的寄生性原虫，可感染多种脊椎动物，包括人类。人类感染隐孢子虫会导致腹泻，免疫功能正常的人通常呈隐性感染；对于免疫功能低下的患者如艾滋病感染者会出现长期腹泻或者是水样腹泻，造成患者严重脱水、电解质紊乱和营养不良，最终导致死亡[55,56]。隐孢子虫病引起的肠道疾病，通常会比由病毒和细菌引起的肠道疾病持续时间更长（超过10天）[55,57]。在全球范围内5岁以下儿童死亡的原因，约30～50%是由隐孢子虫病引起的[58,59]。人类感染隐孢子虫还有其他常见的症状，包括腹痛、恶心、呕吐和低热，偶尔会出现肌肉痛、无力、不适、头痛和厌食等非特异性症状[55]。2.1病原生物学特性2.1.1分类学当前隐孢子虫在分类上属原生动物界，顶复门，孢子虫纲，球虫亚纲，真球虫目，隐孢子虫科，隐孢子虫属[60]。近些年的基因组和生化数据表明，隐孢子虫不同于其他顶复门类，因为它缺失顶端体和线粒体基因[55,61]。隐孢子虫还表现出区分于其他球虫的几个特性：第一，隐孢子虫在宿主细胞内的位置，其中内源性发育阶段局限于宿主细胞的顶表面（胞内，但胞质外）；第二，多膜结构的营养器官促进从宿主细胞中摄取营养物；第三，存在两种形态功能型的卵囊：厚壁卵囊和薄壁卵囊，前者可以释放到环境中去，后者负责在感染宿主中启动自体感染周期；第四，卵囊体积小（微小隐孢子虫5.0×4.5μm），缺乏形态结构如孢子囊，卵孔和异染颗粒[62]；第五，对所有的抗球虫药都不敏感[63]；第六，抗隐孢子虫单克隆抗体与簇虫存在交叉反应[64]。分子生物学研究表明，相对于球虫，隐孢子虫与原始顶复门寄生虫簇虫（gregarines）关系更为密切[65]。未来对簇虫寄生虫基因组的研究，将有望更清楚的了解隐孢子虫种属的分类位置。了解隐孢子虫与簇虫的关系，也将为隐孢子虫的发病机制、流行病学、治疗和控制开辟新的途径。用于鉴定隐孢子虫种类的最常见的靶向基因是SSUrRNA。除了SSUrRNA外，分子流行病学调查还发现了其他有价值的基因，包括70-kDa热休克蛋白（HSP70）、隐孢子虫卵囊壁蛋白（COWP）和内转录区1（ITS-1）等。为了更详细地了解可能的传播途径需要种内基因分型，而60kDa糖蛋白（GP60）基因的分型通常用于进行种内基因分型[66]。关于隐孢子虫种属划分是有争议的，但目前14 大理大学2018届硕士研究生学位论文有33种被认为是有效的[67]，包括11种属和20多个未知种类的基因型。随着生物学信息的不断扩展和补充，多个基因型有很大的可能性最终会重新命名成一个单独的虫种。感染人类的隐孢子虫约有20种，其中最常见的就是微小隐孢子虫（C.parvum）和人隐孢子虫（C.hominis）[55]。通过使用GP60基因的分型鉴定，显示人微孢子虫（C.hominis）对宿主具有高度的专一性；而一些微小隐孢子虫（C.parvum）的亚型是以人源方式传播的，而其他的则是人畜共患传播的[68]。2.1.2生活史具有感染性的孢子化卵囊是从宿主粪便中排出的，卵囊壁坚硬，除了体积小、浮力强外，对化学和机械破坏具有极强的抵抗力，并在恶劣的环境条件下也能存活[69]。宿主感染隐孢子虫后会经常排出大量卵囊，未感染者一旦摄入卵囊，就会在肠道内释放子孢子，肠道感染主要集中在空肠和回肠。子孢子侵入细胞后，细胞内发育到滋养体阶段，而后形成的滋养体进行裂殖生殖，裂殖生殖产生两种类型的裂殖体（Ⅰ型和Ⅱ型）。从Ⅰ型裂殖体释放的裂殖子进入其他肠上皮细胞，发育为Ⅱ型裂殖体，或完成另一周期的Ⅰ型裂殖体。Ⅱ型裂直体释放的裂殖子发育为小配子体或者大配子体，小配子进入大配子体胞质中，受精形成合子，发育为卵囊（图2）。2.2传播途径隐孢子的传播涉及直接（人与人之间以及动物与人之间）和间接（通过卵囊污染的水，食物和污染物）传播，通过粪-口途径的传播可能是最常见的传播形式。在欧盟（EU）和欧洲经济区（EEA）国家，隐孢子虫病是一种强制监测的传染病。2.2.1人源传播人类隐孢子虫病的传播途径是复杂的，然而值得注意的是受感染的儿童可能会把寄生虫传染给父母。粪便中大量的感染性卵囊和低感染剂量意味着隐孢子虫具有高度的传染性，需要采取具体措施防止人与人之间的传播。例如有国家规定，隐孢子虫感染者在腹泻停止48小时之前，病人不准到食品处理中心和照顾高危病人[57]；第一次大便正常后病人2周内应避免使用泳池，因为在停止腹泻后卵囊会继续脱落。二次传播途径值得进一步研究，需要考虑年龄和传染性潜力等影响因素，我们应将个人卫生作为一项重要的干预措施。15 大理大学2018届硕士研究生学位论文图2.隐孢子虫生活史[70]Figure2.LifecycleofCryptosporidium2.2.2食物传播由于农业耕种、食品加工人员或家庭内部的卫生不良，食源性传播是隐孢子虫感染的一个重要原因。食源传播最初可能是由于个人的卫生不良传播到家庭成员和社区，从而导致小规模的隐孢子虫病的爆发，这种情况非常普遍特别是在发展中国家。根据已发表的报告和隐孢子虫病例的文献回顾：在东地中海地区，由食源性传播导致感染的病例数量每年可高达六百万例；在非洲区域可能高达二千七百万例[71]。例如1993年，美国食客因食用受隐孢子污染的鲜榨果汁而爆发的隐孢子虫病，是因为食物或饮料的污染而导致更大规模感染的传播[71,72]。有研究结果显示牡蛎可作为隐孢子虫卵囊（寄生于消化器官）的有效传播媒介，除非食用煮熟的牡蛎菜肴，否则食用生牡蛎仍然是影响公众健康的因素[73]。许多国家的人们习惯食用生的双壳类动物，而在国外的调查刊物中有报道称，食用的牡蛎曾受到过隐孢子虫卵囊的污染。16 大理大学2018届硕士研究生学位论文2.2.3水源传播水源被认为是隐孢子虫传播的一种主要方式，隐孢子虫是世界报告的水源传播性寄生虫病暴发的主要病原体[74]。来自城市或农村景观的径流水、家庭污水的排放和工业未经处理的水，这些会对海洋环境造成寄生虫污染影响到各种双壳类动物。之前有研究表明，微小隐孢子可以在体外和生物膜中繁殖[70,75-77]。双壳类动物一般以悬浮浮游植物为食，这很有可能造成广泛感染和传播。游泳是世界上最受欢迎的娱乐活动之一，在过去的十几年里，有超过1万多人被确认为从游憩水域获得隐孢子虫病[78]。在公共泳池中，常见的粪便污染、卵囊对氯的抗药性、低传染剂量和较高的游泳者密度共同促进了隐孢子虫的传播。2.2.4动物源传播接触动物会增加感染隐孢子虫的风险，特别是幼崽(例如在宠物场)。世界各地的牛都有检测出感染微小隐孢子虫，在断奶前的牛犊最容易感染发病率最高，而且产生的卵囊数量最多。断奶的小牛常感染牛隐孢子虫（C.bovis）和芮氏隐孢子虫（C.ryanae）[79]，粪便中也会排出大量的卵囊；而安氏隐孢子（C.andersoni）常见于年长的牛。牛排出的粪便可能会随降雨后的径流将隐孢子虫卵囊带入地表水，因此牛被认为是水传播隐孢子虫的重要来源之一。周红芳等对上海市不同人群的500份粪便检测，发现养狗家庭的隐孢子虫感染率（13.33％）显著高于腹泻病人隐孢子虫感染率（5.30％）[80]。对于家禽类的报道，在巴西已检测到鸡感染隐孢子虫，阳性率为12.6%（24/190）[81]。目前对隐孢子虫病的治疗方案有限，虽然药物硝唑尼特(NTZ,Nitazoxanide)已获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，但是这种药物在儿童和免疫功能正常的人群中只显示出中等的临床疗效，而在艾滋病患者中则没有疗效[82]。治疗性干预由于缺乏包括疫苗在内的预防措施，使情况更加恶化。发展中国家的人群感染隐孢子虫的同时，经常也会感染其他几种肠道性寄生虫，这成为今后预防和治疗的一道难题。17 大理大学2018届硕士研究生学位论文第二章大理地区白族人群及鼠的毕氏微孢子虫分子流行病学调查和基因型研究毕氏微孢子虫是一种肠道细胞寄生虫，是导致人类疾病常见的微孢子虫，特别是艾滋病患者。毕氏微孢子虫广泛分布于各种动物，在鸟类中也有报道。在艾滋病人发现微孢子虫之前，人类很少关注微孢子虫病。现在越来越多地出现在其他群体中，如儿童、免疫抑制的个体（例如器官移植受者）、戴隐形眼镜的人、旅行者和老年人。此外，在动物和水源中发现了感染人类的微孢子虫，这引起了公众对人畜共患病和水传播微孢子虫的关注。微孢子虫病发生在世界各地，因为检测方法的差异性，流行率数据差异很大。为了解大理地区人群和动物微孢子虫感染情况，选取白族居民和居民区附近鼠作为调查对象，利用巢式PCR技术扩增SSUrRNA基因的ITS序列，利用生物学软件进行比对分析，阐明大理居民和鼠是否存在人兽共患微孢子虫基因型，为今后微孢子虫病的预防和研究提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1样本采集地概况大理地区处于我国西南地区云南省西部（图3），海拔2090米，地跨东经98°52′～101°03′，北纬24°41′～26°42′之间。四季温差不大，气候温和，热带季风气候。分雨季和旱季，雨季为5月至10月，降水量占全年的85～95％之间，其余月份为旱季。1.1.2样本来源本次研究样本的采集时间为2016年4月至2017年7月，白族人群样本采集的地点为大理市区及周边白族聚居村，每两个采集点的距离大于5千米，人群粪便样本的采集是于前一天发放粪盒，第二天去收集，样本量共计599份；鼠粪便样本是在鼠笼内捕获老鼠获得：在大理市大理大学下关校区及其附近居民住所隐蔽处放置鼠笼，在鼠笼内部放置诱饵，待鼠进去后鼠笼触发器自动激活，于第二天查看，共收集新鲜粪便样本287份，分别为褐家鼠（270份）和黄胸鼠（17份）。18 大理大学2018届硕士研究生学位论文阳性样本DNA是由兰州兽医研究所，朱兴全课题组提供。图3.中国西南地区云南省大理地区调查地点图Figure3.TheinvestigationsiteofDaliBaiAutonomousPrefecture,YunnanProvince,SouthwestChina1.1.3主要实验试剂名称来源OMEGAStoolDNA甘肃众庆生物科技有限公司代理10×PCRBuffer（Mg2+free）TaKaRa大连宝生物工程有限公司MgCl2（25ml）TaKaRa大连宝生物工程有限公司dNTPsMixture（2.5mM）TaKaRa大连宝生物工程有限公司DL500/DL2000DNAMarkerTaKaRa大连宝生物工程有限公司Ex-TaqDNA聚合酶（5U/μl）TaKaRa大连宝生物工程有限公司6×LoadingBuffer北京天根生化有限公司19 大理大学2018届硕士研究生学位论文引物上海生工生物工程技术服务有限公司琼脂糖甘肃鹏程生物科技发展有限公司BSA（牛血清白蛋白）北京百灵克生物公司无水乙醇天津市富宇精细化工有限公司1.1.4耗材1.5ml离心管，2ml离心管，50ml离心管，量筒，烧杯，锥形瓶，PE手套，PCR管，乳胶手套，洗手液，枪头，实验记录本1.1.5实验仪器名称来源移液枪（规格2.5μl、10μl、100μl、德国Eppendorf公司200μl、1000μl）高压蒸汽灭菌锅HVE-50Hirayama日本公司高速离心机美国SIGMA公司，型号1-14超净工作台苏净安泰工作台DNA凝胶电泳成像系统美国UVP凝胶成像系统PCR扩增仪器美国Bio-RadS1000梯度PCR仪显微镜日本OLYMPUS显微镜，型号CX22LED微波炉格兰仕旋涡振荡仪麒麟医用仪器厂60目筛网浙江省上虞市金鼎标准筛具厂电子天平常熟市双杰测试仪器厂1.1.6溶液配制50×TAEBuffer（pH8.5）配制带上手套准确称量Tris242g，Na2EDTA2H2O37.2g，置于1L烧杯中，向烧杯中加入800ml的去离子水，充分混匀，加入57.1ml的乙酸，搅拌混匀，调pH8.5后，溶液定容至1L后，室温保存。使用时，用去离子水将溶液稀释至50倍，配成1×TAEBuffer。1.2方法从大理市区及周边白族村庄收集人群粪便样本599份，每份50g，记录民族、20 大理大学2018届硕士研究生学位论文性别和年龄。将采集到的老鼠粪便样品做好编号及信息记录，和人的粪便一起放在4度冰箱，分开放置防止污染。1.2.1粪便DNA的提取做实验前要做好口罩和手套的防护工作，按照E.Z.N.A.StoolDNAKit（OMEGA，USA）试剂盒说明书提取DNA。老鼠粪便样本量相对小，不需要过滤，取50～100mg于2ml离心管中，直接从第3步开始。先把水浴锅温度调至70℃。（1）取新鲜粪便加入自来水，充分搅拌混匀，将混合粪液用60目铜筛过滤到50ml离心管中。（2）将离心管放入离心机中，5000rpm离心3～5min，弃上清。（3）取粪便样本于2ml离心管中，置于冰上，加入SP1Buffer300ul，玻璃珠200mg，蛋白酶K20ul，振荡15min。（4）放入70℃水浴锅5min，振荡5min，水浴3min，振荡5min，水浴3min，振荡5min，冰浴3min。（5）加SP2Buffer200ul，振荡30s混匀，冰浴5min，12000rpm离心5min，将上清移至1.5ml离心管中。（6）加入HTR200ul，振荡10s，放入离心机静置2min后12000rpm，离心2min，吸取管内500ul的上清液至新的2ml的离心管中，加入BLBuffer和无水乙醇各500ul，振荡30s混匀。（7）将离心管内的750ul溶液移至DNA吸附柱（吸附柱下放置收集管）中，延管壁缓慢注入，12000rpm离心2min，弃掉滤液，再加（6）步中的混合液750ul，13000rpm离心1min，弃滤液；将ElutionBuffer放入65℃水浴锅加热。离心后的收集管中液体倒掉，将吸附柱放入一个新的收集管中，加HBBuffer500ul，12000rpm离心1min。（8）离心后收集管中液体倒掉，在DNA吸附柱中加入DNAWashBuffer（用前请按说明书加入无水乙醇）750ul，12000rpm离心1min。倒掉液体后，放回收集管中，再次加入750ul的DNAWashBuffer，12000rpm离心1min。（9）倒掉上一步中的废液，放回收集管进行空离，12000rpm离心1min，然后扔掉收集管，把DNA吸附柱放在干净纸上，静置5min至无酒精味。（此步很21 大理大学2018届硕士研究生学位论文重要，使无水乙醇蒸发，冬天应大于5min）（10）取出新的1.5ml离心管，将DNA吸附柱放入，加入提前预热的ElutionBuffer70ul，在离心机中静置3min后，12000rpm离心1min，将离心管中的液体再次加于吸附柱中，12000rpm离心2min。离心管中的液体为DNA提取液，分装于两个无菌离心管中，一管于4℃保存短期内实验用；一管于﹣20℃冻存备用。注意事项：（1）新鲜样本保存方法，提取过程中操作问题，粪便筛洗过滤时容易造成污染。（2）粪便DNA的提取及浓缩，震荡不成功和水浴时间过短容易造成提取失败。1.2.2巢式PCR引物（见表2）表2.毕氏微孢子虫引物序列[83]Table2.PrimerssequenceofEnterocytozoonbieneusi引物名称引物序列退火温度片段大小（℃）第一轮上游引物5′-GGTCATAGGGATGAAGAG-3′55410bp第一轮下游引物5′-TTCGAGTTCTTTCGCGCTC-3′第二轮上游引物5′-GCTCTGAATATCTATGGCT-3′55392bp第二轮下游引物5′-ATCGCCGACGGATCCAAGTG-3′公司合成回来的引物呈粉末状附着在管壁上，使用之前先用离心机12000rpm离心2min。然后按说明书加入TE缓冲液或者双蒸水（ddH2O），振荡混匀使其充分溶解，然后再用低速离心机离心30s。若近期使用则放入4℃，否则放﹣20℃保存。1.2.3PCR反应体系总反应体系25μl，见表3表3.毕氏微孢子虫巢式PCR反应体系Table3.NestedPCRreactionsystemofEnterocytozoonbieneusi所需试剂第一轮PCR扩增体系第二轮PCR扩增体系ddH2O（高压灭菌水）15.75μl16.75μl22 大理大学2018届硕士研究生学位论文dNTPsMixture（2.5mM）2μl2μl10×PCRBuffer(不含Mg2+)2.5μl2.5μlMgCl2（25ml）1.5μl1.5μlBSA（10mg/ml）1μl不加合成的上游引物（F）0.25μl0.25μl合成的下游引物（R）0.25μl0.25μlEx-Taq聚合酶（5U/μl）0.25μl0.25μl样本DNA2μl2μl（第一轮PCR产物）注：BSA在PCR反应中有助于稳定和提高酶的活性，降低DNA中的抑制剂。1.2.4PCR反应程序第一轮：94℃预变性5min，然后35个循环（94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min），最后72℃延伸10min。第二轮：94℃预变性5min，然后35个循环（94℃，45s；55℃，45s；72℃，40s），最后72℃延伸10min。1.2.5第二轮PCR产物检测1.2.5.1琼脂糖凝胶的配制及放置在电子天平上称取琼脂糖粉2.0g，倒入干净的锥形瓶中，加入100ml之前配制好的1×TAE，轻轻摇晃混匀后放入微波炉中，加热约3-5分钟，直至琼脂糖全部溶解无沉淀。拿出后混匀用搅拌棒搅拌使温度降至60度左右，加入溴化乙锭（EB，EthidiumBromide）10μl，倒入放置梳子的板槽中，胶液缓慢舒展后看是否有气泡，室温下平整放置时间约为30分钟。直到液体完全凝固成胶状，垂直轻轻地拔下梳子，取出凝胶及板槽放入电泳槽中。电泳槽中的电泳液为1×TAE溶液，倒入量应超过凝胶最上端（注意事项：操作这一步骤时应带口罩手套，溴化乙锭具有一定的毒性）。1.2.5.2产物加入将5μl的第二轮PCR产物和1μl的6×LoadingBuffer混匀，加入凝胶点样孔内，留出3～4孔加入阴阳性对照和DL500DNAMarker做分子量大小的参照。全部样本加完后接通电源，一般电压调至110～130V之间，时间约20～30分钟，当条带跑至距凝胶前沿的2～3cm处时，关掉电源。从电泳槽中取出凝胶，放在23 大理大学2018届硕士研究生学位论文电泳凝胶成像系统仪中，观察结果并对图像进行存储。1.2.6第二轮PCR产物测序根据电泳成像结果，将与目的条带大小相近的第二轮PCR产物，送去南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，每个测序产物要求进行双向测通及拼接。1.2.7测序结果分析测序回来的结果在NCBI上进行搜索，与GenBank数据库进行同源性比对，根据同源性是否100％确定其基因型或新基因型。应用统计学软件SPSS19.0对可能影响感染率的风险因素计算其感染率、95%置信区间（95%confidenceinterval,95%CI）、比值比（oddsratio,OR）和P值，P值若小于0.05则被认为差异具有统计学意义。应用生物学软件ClustalX1.83进行序列比对，看有哪些碱基突变。使用生物学软件MEGA6进行进化分析及构建进化树，并选取其中的Kimuratwo-parameter模型来计算遗传距离，所选参数为显示1000次以上重复（pseudoreplicates）显示大于50%的引导值（bootstrap），参考序列是根据已发表的文献从GenBank数据库中获得。2结果2.1人群粪便样本中毕氏微孢子虫感染情况及基因型检测2.1.1人群粪便样本中毕氏微孢子虫电泳检测结果基于巢式PCR方法检测，在白族人群599份粪便样品中成功扩增出12份阳性样本，条带大小约为390bp（如图4所示）。图4.人群粪便样本中毕氏微孢子虫PCR扩增结果Figure4.ThePCRamplificationofE.bieneusiinfaecalsamplesofpeople24 大理大学2018届硕士研究生学位论文1和14：DL500DNAMarker；2-4和7-9：阳性样品；5、6、10和11：阴性样本；12：阴性对照；13：阳性对照。1and14:DL500DNAMarker;2-4and7-9:positivesamples;5,6,10and11:negativesamples;12:negativecontrol;13:positivecontrol.2.1.2不同组别间毕氏微孢子虫感染情况本次研究的599份白族人群粪便样本，总感染率为2.00％；其中男性感染率为2.91%，女性感染率为1.24%，男女两组感染率差异无统计学意义（P=0.15）。18岁以下的人群组无感染，18～40岁人群中有2人感染（1.36%，95%CI0.00～3.23）；在41～65岁的304人中，有7人为毕氏微孢子虫阳性（2.30%，95%CI0.62～3.99）；在65岁以上人群中，有3人为毕氏微孢子虫阳性（3.49%，95%CI0.00～7.37），差异无统计学意义（表4，图5）。农村居民毕氏微孢子虫感染率（11/370，2.97%，95%CI1.24～4.70）显著高于城镇人群感染率（1/229，0.44%，95%CI0.00～1.29），差异有统计学意义（P＜0.05）。表4.大理地区白族人群毕氏微孢子虫流行的相关因素Table4.FactorsassociatedwiththeprevalenceofEnterocytozoonbieneusiintheBaiethnicgroupfromtheDaliarea影响因素类别检测数阳性阳性率%（95%CI）OR值（95%CI）P值居住地城镇22910.44（0.00～1.29）Reference0.03农村370112.97（1.24-～4.70）6.99（0.90～54.48）﹤18620－－0.44年龄18-4014721.36（0.00～3.23）Reference41-6530472.30（0.62～3.99）1.71（0.35～8.33）＞658633.49（0.00～7.37）2.62（0.43～16.00）性别女32441.24（0.03～2.44）Reference0.15男27582.91（0.92～4.90）2.40（0.71～8.05）599122.00（0.88～3.13）25 大理大学2018届硕士研究生学位论文不同因素下白族人群毕氏微孢子虫感染率分布3.49■城镇地区3.5■农村地区2.972.913■男性感染2.30■女性2.5率■＜18岁（%2■18～40岁）1.361.51.24■40～65岁■＞65岁10.440.500居住环境性别年龄影响因素图5.不同因素下白族人群毕氏微孢子虫感染率分布Figure5.DistributionofEnterocytozoonbieneusiinfectionrateinBaiethnicgroupunderdifferentfactors2.1.3毕氏微孢子虫基因型鉴定在12个阳性样品中，鉴定出7条不同的DNA序列，并上传于GenBankTM（GenBank号为KY465440-KY465443和MG050711-MG050713）。根据其DNA序列进行系统发育比对如下：其中4种为已知基因型分别为EbpC（n=5）、SC02（n=1）、Henan-Ⅳ（n=2）和D（n=1）；3种为新基因型命名为Yunnan1,Yunnan2和Yunnan3。在这7条序列中共观察到14个多态位点（表5）。此外系统发育分析表明，本研究的所有基因型都属于人兽共患病组（Group1）（图5）。基因型SC02在1b亚组，D、Yunnan2和Yunnan3基因型在1a亚组，其余3个基因型（EbpC、Henan-Ⅳ和Yunnan1）被划分为1d亚组。已知基因型用△表示，新基因型用▲表示（图6）。26 大理大学2018届硕士研究生学位论文表5.大理地区白族毕氏微孢子虫基因型间核苷酸序列的变异Table5.VariationsinITSnucleotidesequencesamonggenotypesofEnterocytozoonbieneusiintheBaiethnicgroupfromtheDaliarea序列号368237476107129157177181195205241EbpCTCACGGGGTTGGCCHenan-ⅣTCACGAGGTTGGCCSC02TCACTGAATCGATCDTCACGGGGCCTGTCYunnan1TCACGGGGTTGGCTYunnan2GCGGGGGGCCTGTCYunnan3TAACGGGGCCTGTC27 大理大学2018届硕士研究生学位论文图6.毕氏微孢子虫种系发育系统进化树Figure6.PhylogenetictreeofE.bieneusi28 大理大学2018届硕士研究生学位论文2.2鼠粪便样本中毕氏微孢子虫感染情况及基因型检测2.2.1鼠粪便样本中毕氏微孢子虫电泳检测结果基于巢式PCR方法检测，在287份鼠粪便样品中成功扩增出12份阳性样本，条带大小约为390bp（如图7所示）。图7.鼠粪便样本中微孢子虫PCR扩增结果Figure7.ThePCRamplificationofE.bieneusiinfaecalsamplesofwildrodents1和16：DL500DNAMarker；2-9：阳性样品；10-13为阴性样本，14：阳性对照，15：阴性对照1and16:DL500DNAMarker,2-9:positivesamples,10-13:negativesamples,14:positivecontrol,15:negativecontrol.2.2.2不同组间毕氏微孢子虫感染情况鼠的287份样品中有黄胸鼠（n=17）和褐家鼠（n=270）两种，褐家鼠感染率为4.44％，黄胸鼠感染率为0，总感染率为4.18％。鼠的年龄判断依据体长（mm）、体重（g）、尾长（mm）、后足长（mm）和耳高（mm）等因素[84]，将这些鼠分为幼年组、少年组和成年组。鼠阳性样本中，有8只为雌性（4.57%，95%CI1.48～7.67），4只为雄性（3.57%，95%CI0.13～7.00）；幼年组有2只为毕氏微孢子虫感染者（12.50%，95%CI0.00～28.70），少年组有1只感染者（1.37%，95%CI0.00～4.04），而在成年组有9只感染毕氏微孢子虫（4.55%，95%CI1.64～7.45）（见表6，图8）。2.2.3毕氏微孢子虫基因型鉴定在12个阳性样品中鉴定出3种基因型，并上传于GenBankTM（GenBank号为MG999509-MG999511）。根据其DNA序列进行种系发育比对如下：其中2种为已知基因型分别为EbpC（n=3）和D（n=2）；1种为新基因型命名为YNM129 大理大学2018届硕士研究生学位论文（n=7）。在这3种基因型中共观察到5个多态位点（表7）。用生物学软件MEGA6将此次研究获得的核苷酸序列和从GenBank下载的参考序列，构建进化树。种系发育分析表明，本研究的所有基因型都属于人畜共患病组（Group1）。其中，基因型D和YNM1划分在1a亚组，基因型EbpC被划分在1d亚组。用○表示的为已知基因型，用●表示的为新基因型（图6）。不同因素下鼠毕氏微孢子感染率分布■雄性12.5■雌性感14■幼年组染12率■少年组10（%■成年组84.574.55）63.5741.3720性别年龄影响因素图8.不同因素下鼠毕氏微孢子虫感染率分布Figure8.DistributionofEnterocytozoonbieneusiinfectionrateinwildrodentsunderdifferentfactors表6.大理地区鼠样本毕氏微孢子虫流行的相关因素Table6.FactorsassociatedwiththeprevalenceofEnterocytozoonbieneusiinwildrodentsfromtheDaliarea影响因素类别检测数阳性阳性率（95%CI）OR值（95%CI）P值性别雌17584.57（1.48～7.67）1.29（0.38～4.40）0.68雄11243.57（0.13～7.00）Reference年龄幼年16212.50（0.00～28.70）10.29（0.87～121.30）0.12少年7311.37（0.00～4.04）Reference成年19894.55（1.64～7.45）3.43（0.43～27.55）总计287124.18（1.87～6.50）30 大理大学2018届硕士研究生学位论文表7.大理地区鼠毕氏微孢子虫基因型间核苷酸序列的变异Table7.VariationsinITSnucleotidesequencesamonggenotypesofEnterocytozoonbieneusiinwildrodentsfromtheDaliareaPositionNo150170174198201EbpCTTGCGDCCTTGYNM1CCTTA3讨论毕氏微孢子虫不仅在艾滋病患者中发现，而且在住院儿童、癌症患者和正常人群当中也有报道。在我国哈尔滨市癌症患者中发现毕氏微孢子虫感染，阳性率为1.3％[85]。腹泻是常见的临床症状，东北地区腹泻儿童的感染率（22.5%）明显高于上海住院儿童（4.2%）[12,86]，上海腹泻门诊病人的感染率为13.49%[87]。此外，广西和河南省HIV+（艾滋病阳性）患者的感染率分别为11.6%和5.7%[45,88]，而在广西省健康人群未发现感染。本次研究中毕氏微孢子虫患病率为2.00%，不同地区的卫生条件可能会导致结果的差异。本研究中农村地区的感染率显著高于城镇地区，12个毕氏微孢子虫感染者只有一人是来自城镇地区，其他人全部来自农村地区。这一现象可能与城乡环境卫生、生活条件和习惯不同有关。采样时发现一些农村家庭没有安装抽水马桶和自来水管道，居民们从水井中获得饮用水，这些水井很有可能被含有寄生虫的污水污染。此外饮用生水的习惯也是易感因素之一，有研究者对广西285例HIV阳性患者进行调查时发现，饮用生水者微孢子虫感染率明显高于其他患者[88]。另外由于住在农村地区的人们经常在农田里工作，而且在住所附近饲养家禽家畜，如猪、牛、鸭和鸡等。目前已有研究发现鸡体内有微孢子虫感染[16]。虽然白族人群中毕氏微孢子虫的感染途径尚不清楚，但与动物接触可能是感染的潜在危险因素之一。本次研究中鼠的毕氏微孢子虫的感染率为4.18%，在性别和年龄上差异无统计学意义。鼠的种类有很多，目前在国内无褐家鼠和黄胸鼠感染毕氏微孢子虫的31 大理大学2018届硕士研究生学位论文报道。国外有对野生仓鼠科（Cricetidae）的报道，感染率为23.9%[89]。在我国毕氏微孢子虫基因型EbpC不仅存在于人类中，也普遍存在于许多地区的家畜和野生动物中。本研究中人感染毕氏微孢子虫主要基因型为EbpC（5/12，41.67%），与东北地区儿童的调查结果（11/19，57.89%）及其河南HIV阳性和HIV阴性患者的调查结果相似[45,90]。在山羊、牛、猪、灵长类动物等动物中，均检测到EbpC基因型[51,91-93]。基因型D在癌症患者、住院儿童和艾滋病阳性患者以及废水和动物中都有发现[31,85,86,88,91,92]。而在本次研究的鼠样本中，同样也出现了基因型EbpC（3/12，25%）和基因型D（2/12，17%）。此外在国外的研究中，也有鼠感染基因型D的报道。白族人群新发现的基因型样本量均为1个，黄胸鼠无毕氏微孢子虫感染，今后需加大样本量予以研究。褐家鼠和黄胸鼠是我国广大地区的主要害鼠，它们会盗取食物污染各种粮食和水源，更有成年鼠会咬伤家禽或者家畜。除此之外，它们还会传播其他疾病，比如鼠疫、血吸虫病、弓形虫病和出血热等。鼠粪便污染猪、牛等动物饲料后，可使猪和牛等动物感染微孢子虫。再加上大理是旅游城市，这将成为当地居民和外来旅游者感染微孢子虫的潜在因素。大理的气候环境使得鼠的数量多于北方地方，我们更应该加强防范。我国对鼠的毕氏微孢子虫的研究较少，今后应加强这方面的调查，为国内的流行病学和防治提供参考。4结论本次研究首次解析了大理地区白族人群和鼠毕氏微孢子虫的感染情况及基因型。白族人群毕氏微孢子虫感染率为2.00%，鼠毕氏微孢子虫感染率为4.18%。成功鉴定出毕氏微孢子虫基因型：EbpC，SC02，Henan-Ⅳ，D，Yunnan1，Yunnan2，Yunnan3和YNM1；在鼠粪便样本中发现与人群粪便样本相同的基因型：D和EbpC；其中Yunnan1，Yunnan2，Yunnan3和YNM1是本次研究鉴定出的新型。32 大理大学2018届硕士研究生学位论文第三章大理地区白族人群及鼠的隐孢子虫分子流行病学调查和种属鉴定隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种寄生于宿主消化道上皮细胞引起人类腹泻的专性细胞内寄生原虫，几乎能够感染所有的脊椎动物。隐孢子虫分布广泛，传播这种寄生虫的方法有很多，包括人对人、动物对动物、动物对人、水源、食物传播甚至是空气传播等[55,78,94]。1907年寄生虫学家Tyzzer首次在小鼠的胃消化腺上皮细胞内发现隐孢子虫，1976年首次报道隐孢子虫病[69]。感染隐孢子虫的高危人群有儿童、营养不良者、老年人和免疫功能低下的患者（艾滋病和恶性肿瘤以及器官移植）等[95,96]，隐孢子虫可导致艾滋病患者长期性腹泻，是艾滋病患者潜在的致死因素之一。此外隐孢子虫现在被认为是发展中国家，特别是非洲和东南亚儿童腹泻发病率和死亡率的主要原因之一。有学者调查了非洲和亚洲一些地方的2万多名儿童（5岁以下）腹泻的原因，发现隐孢子虫是引起严重腹泻的第二常见病原体，并与幼儿（12-23个月）的死亡有关[75]。隐孢子虫已成为世界范围内腹泻病的一个重要原因，而且对畜牧业的发展造成严重影响，在农村地区与动物的接触似乎是一个重要的传播途径。为了解大理地区隐孢子虫的感染情况，本研究选取部分白族居民和居民区附近鼠作为研究对象，为今后对隐孢子虫病的进一步研究及防控提供参考。1材料与方法1.1材料样本采集来源于大理市区及周边白族聚居村，每两个采集点大于5千米，人群粪便样本的采集是于前一天发放粪盒，第二天去收集，样本量共计599份；鼠粪便样本是在大理市大理大学下关校区及其附近居民住所隐蔽处放置鼠笼捕获而得，共收集新鲜粪便样本287份，分别为褐家鼠（270份）和黄胸鼠（17份）。阳性样本DNA是由兰州兽医研究所朱兴全课题组提供。1.2方法1.2.1见第三章1.2.133 大理大学2018届硕士研究生学位论文1.2.2巢式PCR引物隐孢子虫扩增片段约为830bp表8.隐孢子虫SSUrRNA基因引物序列[79]Table8.PrimerssequenceinSSUrRNAgeneofCryptosporidium引物名称引物序列退火温度片段大小（℃）（bp）第一轮上游引物5′-CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3′551325第一轮下游引物5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′第二轮上游引物5′-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-588303′第二轮下游引物5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′1.2.3PCR反应体系总反应体系25μl表9.隐孢子虫巢式PCR反应体系Table9.NestedPCRreactionsystemofCryptosporidium体系所需试剂第一轮PCR扩增体系第二轮PCR扩增体系ddH2O（高压灭菌水）14.75μl15.75μldNTPsMixture（2.5mM）2μl2μl10×PCRBuffer(不含Mg2+)2.5μl2.5μlMgCl2（25ml）2μl2μlBSA（10mg/ml）1μl不加引物（F）0.25μl0.25μl引物（R）0.25μl0.25μlEx-Taq聚合酶（5U/μl）0.25μl0.25μl样本DNA2μl2μl（第一轮PCR产物）1.2.4PCR反应程序第一轮：94℃预变性5min，然后35个循环（94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min），最后72℃延伸10min。第二轮：94℃预变性5min，然后35个循环（94℃，45s；58℃，45s；72℃，34 大理大学2018届硕士研究生学位论文1min），最后72℃延伸10min。1.2.5第二轮产物检测1.2.5.1琼脂糖凝胶的配制及放置在电子天平上称取1g琼脂糖粉倒入干净锥形瓶中，加入100ml的1×TAE溶液，混匀放入微波炉中加热约3-5分钟，拿出后混匀或用搅拌棒搅拌使温度降至60度左右，加入溴化乙锭（EB，EthidiumBromide）10μl，倒入放置梳子的板槽中，胶液缓慢舒展后，看是否有气泡，室温下平整放置（时间约为30分钟左右），直到液体完全凝固成胶状，垂直轻轻拔下梳子，取出凝胶及板槽，放入电泳槽中。电泳槽中的电泳液为1×TAE溶液，倒入量应超过凝胶最上端。1.2.5.2产物加入将5μl的第二轮PCR产物和1μl的6×LoadingBuffer混匀，加入凝胶点样孔内，留出3～4孔加入阴阳性对照和DL2000DNAMarker做分子量大小参照。全部样本加完后接通电源，一般电压调至110～130V之间，时间约30分钟，当条带跑至距凝胶前沿的2～3cm处时，关掉电源。从电泳槽中取出凝胶，放在电泳凝胶成像系统仪中，观察结果并对图像进行存储。1.2.6第二轮PCR产物测序根据电泳成像结果，将与目的条带大小相近的第二轮PCR产物，送去南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，每个测序产物进行双向测通及拼接。1.2.7测序结果分析测序回来的结果在NCBI上进行搜索，与GenBank数据库进行同源性比对。应用生物学软件ClustalX1.83进行序列比对，看有哪些碱基突变。应用统计学软件SPSS19.0对可能影响感染率的风险因素计算其感染率、95%置信区间（95%ConfidenceInterval，95%CI）、比值比（oddsratio，OR）和P值，P值若小于0.05则被认为差异具有统计学意义。2结果2.1人粪便样本中隐孢子虫感染情况此次研究中仅检测出1份阳性样本，条带大小约为830bp（如图9）。感染率为0.17％（1/599），为鼠隐孢子虫（C.muris）。感染者为男性，农村居民，年龄35 大理大学2018届硕士研究生学位论文为57岁。2.2鼠粪便样本中隐孢子虫感染情况2.2.1鼠粪便样本中隐孢子虫电泳检测结果经过巢式PCR方法检测，在鼠的287份样品中鉴定出13份阳性样品，条带大小约为830bp（如图9）。图9.人和鼠粪便样本中隐孢子虫SSUrRNA基因PCR扩增结果Figure9.ThePCRamplificationofCryptosporidiumSSUrRNAgeneinfaecalsamplesofhumanandwildrodents1和16：DNA分子质量标记；2-8：鼠样本DNA阳性，9：人粪便样本DNA阳性，10-13：阴性样本，14：阳性对照，15：阴性对照1and16:DL2000DNAMarker;2-8:DNApositivesamplesinwildrodents,9:DNApositiveinhuman,10-13:Negativesample,14:Positivecontrol,15:Negativecontrol2.2.2不同组间隐孢子虫感染情况本次研究的鼠粪便样本中共有13份阳性样本，感染率为4.53％，褐家鼠的感染率为4.81%，黄胸鼠的隐孢子虫感染率为0。阳性样本中有11只为雌性（6.29%，95%CI2.69～9.88），2只为雄性（1.79%，95%CI0.00～4.24）；幼年组感染隐孢子虫的鼠有5只（31.25%，95%CI8.54～53.96），少年组有5只（6.85%，95%CI1.06～12.64），在成年组中有3只感染隐孢子虫（1.52%，95%CI0.00～3.22）（见表10，图10）。2.2.3隐孢子虫种属鉴定本次研究的鼠的粪便样本中成功扩增到13个阳性样品，将扩增出的序列与NCBI数据库中的序列进行比对，全为鼠隐孢子虫（C.muris）。DNA序列一致，并上传于GenBankTM（序列号为MG999512）。36 大理大学2018届硕士研究生学位论文不同因素下鼠的隐孢子虫感染率分布■雄性31.2535■雌性30感■幼年组染25■少年组率20（%■成年组15）6.296.85101.791.5250性别年龄影响因素图10.不同因素下鼠的隐孢子虫感染率分布Figure10.DistributionofCryptosporidiuminfectionrateinwildrodentsunderdifferentfactors表10.大理地区鼠样本隐孢子虫流行的相关因素Table10.FactorsassociatedwiththeprevalenceofCryptosporidiuminwildrodentsfromtheDaliarea影响因素类别检测数阳性阳性率（95%CI）OR值（95%CI）性别雌175116.29a（2.69～9.88）3.69（0.80～16.97）雄11221.79b（0.00～4.24）Reference年龄幼年16531.25c（8.54～53.96）29.55（6.24～139.90）少年7356.85d（1.06～12.64）4.78（1.11～20.53）成年19831.52e（0.00～3.22）Reference总计287134.53（2.12～6.94）注：a与b比较：P＞0.05，c与d比较：P＜0.05，c与e比较：P＜0.001，d与e比较：P＞0.053讨论目前国内还没有人感染鼠隐孢子虫（C.muris）的报道，国外报道也相对较37 大理大学2018届硕士研究生学位论文少。仅有法国的一名男性艾滋病患者身上发现了鼠隐孢子虫感染[97]，肯尼亚的艾滋病患者和泰国的一名6岁艾滋病儿童以及秘鲁的一名女性身上同样发现了鼠隐孢子虫感染[98-100]。大理地区气候温和，当地鼠繁殖数量比其他地方相对较多，它们在食物丰富和居民密集的地方繁衍生息，增加了向人群传播的机会，比如它们的粪便污染了水源。本研究中唯一的感染者为农村居民，可能是因为农村一些地区的卫生条件相对于城镇地区较差，发生直接和间接传播的机会增加，而且与家畜家禽和野生动物的接触率较高。在采样过程中参与者告知他们现在定期做肠道寄生虫虫检测，感染率低的原因也与现在的卫生条件的改善和防范意识增强有关。国内人群感染隐孢子虫的首次报道是在1987年，现在人们越来越多的关注隐孢子虫病，人类隐孢子虫病的流行病学资料至少覆盖了17个省市。根据形态学鉴定，检出率在1.0%至60.0%之间[101-104]。王霖等对昆明地区的30例艾滋病患者调查发现隐孢子虫感染率为60%（18/30）[101]，黄民主等调查的长沙市吸毒人员阳性率为19.05%（172/903）[102]，有对山东部分地区的调查发现隐孢子虫感染率为1.0%（36/3631）[104]，之前有关大理地区吸毒人群的隐孢子虫感染调查发现感染率为16.8%[105]。应用分子生物学方法对人群中隐孢子虫的研究，在上海市、江苏省、河南省和湖南省已有报道[86,87,106-109]。上海和江苏的门诊腹泻病人的隐孢子虫感染率为13.49%和9.91%[87,108]，上海市住院儿童的隐孢子感染率为1.62%[106]。Yu等对湖南地区的218名肝衰竭病人调查发现，感染率为6.0%（13/218），而感染者有8人有腹泻症状；慢性乙肝病人的感染率为0.8%（1/22），腹泻儿童感染率为1.4%（2/140）[107]。隐孢子虫可感染各个年龄段的人，但有数据表明幼儿最容易感染。此外从流行病学的角度来看，不同种的隐孢子虫感染不同地区的人。据研究显示中国东部地区的感染主要是由人隐孢子虫（C.hominis）引起的[106,108,109]，但现在上海（34/34）和江苏（21/23）发现了安氏隐孢子虫（C.andersoni）的感染[87,108]；在湖南，微小隐孢子虫（C.parvum）是优势种[107]。在国外，例如中东地区微小隐孢子虫（C.parvum）是感染人类的优势种；而在发展中国家，人隐孢子虫（C.hominis）被认为是人类隐孢子虫病的主要病原；在欧洲国家，微小隐孢子虫（C.parvum）和人隐孢子虫（C.hominis）的分布比例几乎相等[110,111]。38 大理大学2018届硕士研究生学位论文鼠是研究隐孢子虫多样性的有效模型，这些无处不在的鼠有着广泛的栖息地，是繁殖力极强的宿主。相对于其他动物而言，鼠感染隐孢子虫的报道相对较少。根据已报道的数据统计，鼠的感染率在0.7%～73.0%[112-114]。本次研究的野生鼠中，隐孢子虫感染率低于福建野生鼠的感染率（18.2%）；褐家鼠的感染率（4.8%）略低于河南褐家鼠感染率（6.3%）[115]。在三组年龄段中，幼年组（31.25%）鼠的感染率显著高于成年组（1.52%），差异有统计学意义（P＜0.001）。可能是由于随着年龄的增加，鼠的免疫功能逐渐增强，而它的感染率和感染强度将会下降。而在性别上雌性感染率为6.29%，雄性感染率为1.79%，差异无统计学意义。本研究发现有一幼年鼠既感染隐孢子虫，也感染毕氏微孢子虫。黄胸鼠未发现感染，可能是与采集的黄胸鼠样本少的原因有关。有实验表明鼠隐孢子虫（C.muris）很容易感染多种非啮齿动物，包括狗、兔子、羊羔和猫[116]。鼠隐孢子虫除了在鼠身上发现，还在骆驼、海豹等动物身上发现感染[117-119]。而鼠除了感染鼠隐孢子虫，还会感染微小隐孢子虫。用分子生物学方法鉴定宿主感染的寄生虫种类，对确定该病原的流行病学及其传播途径具有重要意义。目前还没有有效的药物治疗和疫苗，除分子生物学检测技术外，全基因组测序和代谢组学扩大了我们对这种生物化学需求的认识。为了有效治疗这一重要病原体，资金的投入是必不可少的。尽管这些肠道病原体广泛存在，但在发展中国家它们的流行病学仍然不清楚。在中国，这些病原体的分子流行病学资料仍然有限。关于人是如何感染鼠隐孢子虫（C.muris）的，这一传播途径还尚未明确。今后需要进行大规模的研究以了解人群中隐孢子虫的感染率和感染类型；以及其他动物感染的类型分布和季节变化，特别是畜牧业。这对于早期预防和控制隐孢子虫感染具有重要的意义。4结论本次研究首次解析了大理地区白族人群和鼠感染隐孢子虫的种类和感染率；白族人群隐孢子虫感染率为0.17%，鼠的隐孢子虫感染率为4.53%，全部为鼠隐孢子虫（C.muris）感染。39 大理大学2018届硕士研究生学位论文全文总结本研究是国内初次解析了大理地区白族人群和鼠毕氏微孢子虫感染率及基因型，初次调查了大理地区白族人群和鼠的隐孢子虫感染率及感染虫种。1白族人群毕氏微孢子虫感染率为2.00%，对白族人群影响因素统计分析发现不同的居住条件之间，差异具有统计学意义（P＜0.05）；其基因型Yunnan1、Yunnan2和Yunnan3是本次研究鉴定出的新基因型。2鼠毕氏微孢子虫感染率为4.18%，YNM1是本次研究鉴定出的新基因型。3在白族人群样本和鼠样本中，发现相同基因型EbpC和D型。4白族人群隐孢子虫感染率为0.17％，鼠的隐孢子虫感染率为4.53％，感染的虫种全部为鼠隐孢子虫（C.muris）。5有一幼年鼠同时感染毕氏微孢子虫和隐孢子虫。40 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大理大学2018届硕士研究生学位论文硕士在读期间发表的论文[1]王琪琪,李海龙等.微孢子虫基因组学及分子流行病学研究进展[J].动物医学进展,2018,39(03):92-96[2]Qi-QiWang,Yao-DongWu,Xiao-XuanZhang,etal.PrevalenceandgenotypesofEnterocytozoonbieneusiintheBaiethnicgroupinYunnanProvince,SouthwestChina（已投稿）[3]Qi-QiWang,Yao-DongWu,Hai-LongLi,etal.PrevalenceandgenotypesofEnterocytozoonbieneusiandCryptosporidiuminwildrodentsinYunnanProvince,SouthwestChina（拟投稿）[4]WuYD,XuMJ,WangQQ,etal.Recombinasepolymeraseamplification(RPA)combinedwithlateralflow(LF)stripfordetectionofToxoplasmagondiiintheenvironment.VeterinaryParasitology,2017,243:199-203.(SCI,IF=2.356)52 大理大学2018届硕士研究生学位论文综述微孢子虫基因组学及分子流行病学研究进展摘要：随着多种微孢子虫全基因组的测序完成，微孢子虫的基因组学研究，尤其是比较基因组学和功能基因组学方面成为微孢子虫的研究热点，这能够为进一步阐明其致病机理提供依据。同时，近年来对微孢子虫的分子流行病学研究发现，微孢子虫在我国蚕、水产动物和哺乳动物当中大量流行，也在我国人群当中流行，对其在各个宿主的分子流行病学进行概述，能够为研究其流行规律及趋势提供参考。人类研究微孢子虫已有100多年的历史，在这基础上，预计未来对微孢子虫的基因组学研究和分子流行病学研究还将进一步完善，并在其侵染机制、分子诊断等方面取得新的突破。关键词：微孢子虫；基因组；基因型；分子流行病学微孢子虫（Microsporidia）是一种专性细胞内寄生性真核生物。在1857年微孢子虫首次被鉴定为引起家蚕微粒子病的病原，给当时欧洲的养蚕业造成重大损失，1959第一例人类微孢子虫病发现于一个脑炎患儿，1985年报道比氏肠微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）感染艾滋病患者[1]。比氏肠微孢子虫导致多数患者的临床症状为慢性腹泻，同时也感染多种野生动物和家畜[2]。除了比氏肠微孢子虫，其他一些微孢子虫同样可以感染多种脊椎动物，也有的同时能感染脊椎动物和无脊椎动物[3]。微孢子虫广泛分布于全球各地的各种环境当中，其卵囊对外界环境具有很强的抵抗力，使得微孢子虫能够通过深海热泉、洲际尘埃等多种途径进行传播[4,5]。微孢子虫的孢子在感染时形成复杂的感染装置，通过其产生的极丝所形成的管状结构进入到宿主细胞内，在细胞内度过整个复制循环阶段后最终分化成最初的孢子返回到环境当中。近年来，随着分子生物学的发展，人们对微孢子虫的基因组研究和分子流行病学研究逐渐增多，以下从基因组学和各宿主的分子流行病学两方面对微孢子虫近年来的研究进展情况进行综述。53 大理大学2018届硕士研究生学位论文1微孢子虫基因组学研究1.1微孢子虫比较基因组学从1990年人类基因组计划的提出到现在，各种各样的模式生物和重要生物的全基因组测序相继完成。关于微孢子虫，目前已完成了兔脑炎微孢子虫（Encephalitozooncuniculi）的全基因组精细图谱，由我国西南大学等单位共同研究的家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）全基因组图谱也已基本完成，比氏肠微孢子虫、蝗虫微孢子虫（Paranosemalocustae）和蜜蜂微孢子虫（Nosemaceranae）等的全基因组草图拼接工作也已接近尾声[6]。兔脑炎微孢子虫的全基因组大小仅为2.9Mb，这在真核生物的全基因组当中最小，共编码1997个基因，对蝗虫微孢子虫和兔脑炎微孢子虫的全基因组进行比较，发现虽然这两种微孢子虫进化地位相差较远，但两者的基因之间有保守的共线性排列。对比氏肠微孢子虫的全基因组进行研究，发现其基因组同样具有高度精简的特征，同时与兔脑炎微孢子虫的全基因组进行比较，发现两者之间的基因存在大量的同源关系。对蜜蜂微孢子虫的全基因组进行研究，并且与兔脑炎微孢子虫进行比较，得到了与比氏肠微孢子虫类似的结果。由西南大学进行的家蚕微孢子虫全基因组研究发现，其基因组中AT含量高达70%，转座元件高达36%，这一特征与蜜蜂微孢子虫相似[6]。1.2微孢子虫功能基因组学微孢子虫的基因组高度精简，其自身缺乏三羧酸循环、脂肪酸氧化等重要代谢途径，这就使得微孢子虫必须依赖宿主细胞内所提供的营养物质进行增值。微孢子虫的分泌蛋白能够帮助其逃避宿主免疫反应和摄取宿主营养物质。目前，微孢子虫的功能基因组学研究主要集中在家蚕微孢子虫的孢壁蛋白。2013年李田等基于家蚕微孢子虫的全基因组数据，应用生物信息学技术分析获得97种分泌蛋白，为微孢子虫分泌蛋白的研究提供了研究方法和基础数据[7]。我国学者基于家蚕微孢子虫的基因组数据，分离鉴定了多种基因和蛋白，鉴定出一批微孢子虫纺锤剩体的相关基因，分析了多种分泌蛋白和胞壁蛋白的功能等等，这些工作填补了微孢子虫功能基因组学多项空白[8]。2微孢子虫分子流行病学经过最近20多年的发展，微孢子虫的鉴定和基因型分型研究进展明显。针对感染人和多种哺乳动物的比氏肠微孢子虫，目前广泛认为标准的检测方法是通过应用普通PCR方法扩增其核醣体基因的转录间隔区（ITS），而后对产物进行54 大理大学2018届硕士研究生学位论文序列分析进行基因型鉴定[2]。家蚕微孢子虫主要是通过应用实时荧光定量PCR等方法检测小亚单位核糖体RNA（SSUrRNA）基因[9]。蜜蜂微孢子虫等其他微孢子虫的检测和分型多是依据16SrDNA片段[1]。微孢子虫可以感染多种动物，有些基因型所感染的宿主范围很广，而通常情况下单个种的微孢子虫只能感染一些特定的宿主[3]。目前已经报道的微孢子虫有150个属，大约1400多个种，这些数字每年都可能有所增加[8]。微孢子虫威胁着人类健康的同时也给养殖业造成巨大损失，其分子流行病学研究为防控该病提供了重要参考依据。2.1蚕微孢子虫是蚕最致命的寄生虫之一，它的存在阻碍了全球养蚕业的健康发展，造成巨大的经济损失。马露芸等对四川省2006年到2010年近五年的家蚕微粒子病调查时发现，感染率受气候和蚕具的影响，秋季感染率大于春季；野外昆虫感染微孢子虫后，会将微孢子虫传染给家蚕[10]。黄旭华等对广西蚕区调查也发现，野外昆虫与家蚕存在微孢子虫交叉感染现象[11]。蚕微粒子病的流行，除了受季节、野外昆虫的影响，还会受气候、病原的密度、养蚕环境、人为因素等的影响。家蚕微粒子病是由家蚕微粒子虫属引起的，除了这个属，家蚕还能被其它4个属的微孢子虫感染，它们分别是：具褶孢虫属(Pleistophoratypicales)，泰罗汉孢虫属(Thelohaniagiardi)，变形孢虫属(Vairimorphanecatrix)和内虫网属(Endoreticulatusfidelis)。2.2水产动物关于水产物种微孢子虫病的流行病学研究报道相对较少，可能使我国微孢子虫对水产行业的危害被低估。虾感染微孢子虫后生长缓慢，并可见其肌肉部分呈不透明的白色，因此病虾被称为“棉花虾”，中华绒螯蟹感染后表现为“水瘪子病”，梭子蟹表现为“牙膏病”，石斑鱼标粗过程中常表现为“瘦身病”。肠道上皮细胞微胞子虫（E.hepatopenaei），又叫“虾肝肠胞虫”，是危害对虾养殖业的一种重要病原，雷燕等建了一种基于其SSUrRNA基因的PCR检测方法，并对来自广东、广西、江苏、山东、海南等地的755份凡纳滨对虾临床样本进行了检测，结果发现有21份为阳性[12]。王元对江苏启东海水中脊尾白虾和三疣梭子蟹的“肌肉白化病”的病原进行了研究，发现脊尾白虾所感染的微孢子虫与Potasporamorhaphis亲缘关系最近，但是它们的形态差异明显，将这种微孢子虫暂归类为55 大理大学2018届硕士研究生学位论文未分类的Microsporidiumsp.；同时发现感染三疣梭子蟹的微孢子虫与Ameson属的形态结构相同，并且SSUrRNA基因系统发育亲缘关系相近，故将其归为Amesonsp.[13]。DingZ等首次对我国江苏省中华绒螯蟹的“水瘪子病”进行了报道，引起国内外同行的广泛关注，他们发现该病的病原具有微孢子虫的典型特征，并通过分子生物学分析表明其与Hepatosporaeriocheir具有99%相似，系统发育建树分析也与Hepatosporaeriocheir同属一个分支[14]。2.3哺乳动物毕氏肠微孢子虫几乎感染所有的哺乳动物，对全国各地几种主要的哺乳动物的感染情况和基因型进行总结（表1），发现不同动物之间或者同种动物不同地区之间感染率不同，大多数动物感染的基因型多样，而且一些基因型可以同时感染多种动物，还发现了大量新的基因型。家畜微孢子虫病的传播可能导致潜在的人畜共患微孢子虫病流行。表1我国哺乳动物微孢子虫感染率及基因型Table1TheinfectionrateandgenotypeofE.bieneusifrommammalinChina宿主总数阳性数阳性率基因型地区参考文献HostTotalPositivePositiveGenotypeRegionReferencecasescasesrate梅花鹿521325％BEB6(8),HLJD-ItoHLJD-V(各1个)黑龙江15SikadeerHeilongjiang341544.1％BEB6(12),HLJD-V(3)吉林Jilin山羊34311332.9％BEB6(22),E(3),F(2),D(2),J(1),KIN-河南16Goat1(2),COS-I(1),CD6(4),CHG13(1),HenanCHG1(13),CHG2(6),CHG3(10),CHG5(3),CHG6toCHG11(各1个),CHG13(1),CHG18(1),CHG20toCHG23(各1个),CHG25(1)1343022.4％BEB6(14),E(4),F(1),D(1),COS-I(1),云南16CD6(1),CHG1(1),CHG3(2),YunnanCHG5(1),CHG16(1),CHG17(1),CHG19(1)8067.5％BEB6(1),CHG5(1),CHG3(1)安徽16Anhui8562.5％CHG1(12),CHG3(1),CD6(1),重庆16CHG12(1)Chongqing462247.8％BEB6(4),E(1),F(1),CD6(3),GHG1(3),陕西16GHG3(3),CHG5(2),CHG14(1),ShaanxiCHG16(1),CHG24(1)56 大理大学2018届硕士研究生学位论文551221.8％EbpC,BEB6,D,黑龙江17COG-I,EbpA,Peru6Heilongjiang绵羊31016151.9％BEB6(53),COS-I(12),CM4(1),河南16SheepCHG3(5),CHS10(1),CHS3(2),CHS4toHenanCHS6(各1个),CHS12(1)6469.4％BEB6(3)辽宁16Liaoning401025％BEB6(4),COS-I(2),CHS7toCHS9(各1黑龙江16个),CHS11(1)Heilongjiang1383122.5％BEB6(12),Peru6(5),D(4),O(3),COS-I黑龙江17toCOS-VII(各1)Heilongjiang37526069.3％BEB6(237),CM7(23)内蒙古18InnerMongolia牛5148516.5％BEB6(4),D(2),CC4(1),I(19),EbpC(2),新疆19CattleJ(57)Sinkiang87921424.3％I(61),D(2),O(1),BEB4(15),BEB6(17),河南宁夏20BEB8(1),CD6(1),CHG3(1),CHG2(1),HenanandCM8(18),COS-I(5),EbpA(2),EbpC(6),NingxiaJ(77),H(1),CHC1toCHC5(各1)3717319.7％I(40),J(30),CHN1(1),CSX1(1),陕西21CSX2(1)Shaanxi猪89748554.1％PigITS5(158),河南22SwineEbpC(6),F(15),HenanIV(8),EbpD(7),Pig(6)1569460.3％CHN7,CS-1,CS-4,CS-6,EbpA,EbpB,吉林23EbpC,EbpD,EBITS3,G,Henan-I,CS-9Jilin958589.5％H(18),HLJ-I(2),HLJ-II(1),HLJ-III(1),黑龙江24HLJ-IV(1),CS-1(1),O(11),LW1(1),HeilongjiangEbpA(30),D(19)灵长类动138615811.4％CM1(43),IV(31),D(30),HenanV(10),广东、广西25物Peru8(9),CM4(8),I(1),CM2(4),GuangdongNonhumanCM7(1),CM3(1),EbpC(5),andGuangxiprimatesPigEBITS7(5),BEB6(5),Peru11(3),CM5(1),CM6(1)兔子42640.94％D(4)辽宁、吉林26RabbitLiaoningandJilin狐狸9177.69％Peru8(1),IV(2),D(2),NCF2(2)吉林2FoxJilin7057.14％Peru8(1),IV(1),NCF2(1),黑龙江CHN-DC1(2)Heilongjiang1412517.7％Peru8(2),IV(2),D(2),NCF1(3),河北NCF2(10),NCF3(1),NCF4(1),NCF5(2),HebeiNCF6(1),NCF7(1)2.4人微孢子虫目前已经成为危害人类身体健康重要的寄生虫之一，90％以上的微孢子虫病都是由E.bieneusi引起，它不仅在艾滋病人中发现，也在器官移植、儿57 大理大学2018届硕士研究生学位论文童和正常人群中报道过。徐利纳等收集河南郑州市某儿童医院1996份儿童新鲜粪便，对样品进行了调查发现微孢子感染率为1.5％，7岁～10岁这个年龄段的感染率最高为2.8％[27]。ZhangX等调查的吉林省长春市某医院的40名儿童腹泻样品，发现9名儿童感染微孢子虫，感染率为22.5%[28]。WangL等调查的573名上海某医院儿童病人，发现34名微孢子感染者，阳性率为13.49％[29]。YangJ等报道的哈尔滨市和大庆市的255名12岁以下的儿童，样本来源于社区医院（n=40），幼儿园（n=37）和小学（n=178），感染率为7.5％（19/255），有3个已知的基因型（CS-4，EbpC,Henan-IV）和5个新基因型（NEC1～NEC5）；社区医院儿童的感染率22.5％（9/40）远大于小学儿童的感染率5.61％（10/178）；哈尔滨6-12岁的儿童感染率高于大庆儿童的感染率[30]。WangL等调查的河南省683名HIV阳性患者和683名HIV阴性患者中，有7个已知基因型（EbpC,D,Ⅳ,Peru8,Peru11,PigEBITS7,EbpD）和5个新基因型（Henan-Ⅰ～Henan-Ⅴ），但两者感染率并无太大差异（表2）[31]。表2我国人微孢子虫感染率及基因型Table2TheinfectionrateandgenotypeofE.bieneusifromhumaninChina样品来源阳性阳性率基因型地区参考文献SamplePositivepositivegenotypeRegionReferencesourcecasesrate腹泻儿童922.5％I(3),J(3),CHN1(5),吉林28DiarrheachildrenCHN2(2),CHN3(4),JilinCHN4(3)住院儿童244.2％Peru11(6),EbpC(1),D(1),上海29HospitalizedEbpA(2),SH1(1),SH2(3),ShanghaichildrenSH3toSH12(各1)儿童197.5％CS4(2),EbpC(11),Henan-黑龙江30ChildrenIV(3),NEC1toNEC5(各1)HeilongjiangHIV阳性患者395.7％EbpC(18),D(7),IV(6),河南31HIVpositivePigEBITS7(1),EbpD(1),HenanpatientsPeru8(1),Henan-ItoHenan-V(各1)HIV阴性患者294.2％EbpC(21),D(5),IV(1),HIVnegativePeru11(1),unknown(1)patients目前已发现有200多种比氏肠微孢子虫的基因型可以感染人类和动物，通过系统的进化分析，这些基因型已经分为8个组（Group1-8），其中1组（Group1）是人兽共患基因型组，有30多种为人畜共患基因型，主要有EbpC、BEB4、D、58 大理大学2018届硕士研究生学位论文I、J、BEB6、Henan-Ⅳ、Peru6、EbpA、O、Peru8、Peru11、BEB4等[29,31,32]；其他组只能感染特定的宿主，具有宿主特异性。预计将来还会有更多的人畜共患基因型被发现。3展望随着分子生物学的发展，微孢子虫的基因组学和分子流行病学研究逐渐深入，多种微孢子虫的全基因组测序和拼接工作相继完成，为研究其致病机制、诊断和防治方法等方面提供了基因组数据支持，但目前仍有多种危害严重的微孢子虫基因组研究工作尚未完成。同时，目前国内已有的微孢子虫的分子流行病学研究工作只是冰山一角，尤其是对人和水产动物，尚需投入大量人力和物力才能掌握微孢子虫在各个地区和各种动物之间的分子流行病学规律，为微孢子虫病的防控奠定基础。参考文献：[1]刘吉平,李进,吕思行,等.微孢子虫基因组学研究新进展[J].广东蚕业,2011,45(2):43-47.[2]ZhangXX,CongW,LouZL,etal.Prevalence,riskfactorsandmultilocusgenotypingofEnterocytozoonbieneusiinfarmedfoxes(Vulpeslagopus),NorthernChina[J].ParasitVectors,2016,9(1):72.[3]SzumowskiSC,TroemelER.Microsporidia-hostinteractions[J].CurrOpinMicrobiol,2015,26:10-16.[4]SapirA,DillmanAR,ConnonSA,etal.Microsporidia-nematodeassociationsinmethaneseepsrevealbasalfungalparasitisminthedeepsea[J].FrontMicrobiol,2014,5:43.[5]FavetJ,LapanjeA,GiongoA,etal.Microbialhitchhikersonintercontinentaldust:catchingaliftinChad[J].ISMEJ,2013,7(4):850-867.[6]向恒.家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）基因组学研究[D].重庆：西南大学,2010.[7]李田,刘显林,韩冰,等.家蚕微孢子虫全基因组分泌蛋白的预测分析[J].蚕业科学,2013,39(2):295-301.59 大理大学2018届硕士研究生学位论文[8]PanG,XuJ,LiT,etal.Comparativegenomicsofparasiticsilkwormmicrosporidiarevealanassociationbetweengenomeexpansionandhostadaptation[J].BMCgenomics,2013,14(1):186.[9]曹琛福,林彦星,吕建强,等.家蚕微孢子虫诊断方法研究进展[J].安徽农业科学,2016,44(2):1-3.[10]马露芸,吴钢,张学清,等.四川家蚕微粒子病流行规律调查[J].四川蚕业,2012,40(2):40-43.[11]黄旭华,潘志新,朱方容,等.昆虫微孢子虫对家蚕的感染力及其增殖情况研究[J].南方农业学报,2011,42(6):664-667.[12]雷燕,肖洋,张会军,等.凡纳滨对虾肠道上皮细胞微胞子虫PCR检测方法的建立与应用[J].广东海洋大学学报,2016,36(4):50-54.[13]王元.脊尾白虾与三疣梭子蟹微孢子虫病的病原和病理[D].上海：上海海洋大学,2013.[14]DingZ,MengQ,LiuH,etal.Firstcaseofhepatopancreaticnecrosisdiseaseinpond-rearedChinesemittencrab,Eriocheirsinensis,associatedwithmicrosporidian[J].JFishDis,2016,39(9):1043-1051.[15]ZhaoW,ZhangW,WangR,etal.Enterocytozoonbieneusiinsikadeer(Cervusnippon)andreddeer(Cervuselaphus):deerspecificityandzoonoticpotentialofITSgenotypes[J].ParasitolRes,2014,113(11):4243-4250.[16]ShiK,LiM,WangX,etal.MolecularsurveyofEnterocytozoonbieneusiinsheepandgoatsinChina[J].ParasitVectors,2016,9(1):23.[17]ZhaoW,ZhangW,YangD,etal.PrevalenceofEnterocytozoonbieneusiandgeneticdiversityofITSgenotypesinsheepandgoatsinChina[J].InfectGenetEvol,2015,32:265-270.[18]YeJ,XiaoL,WangY,etal.DominanceofGiardiaduodenalisassemblageAandEnterocytozoonbieneusigenotypeBEB6insheepinInnerMongolia,China[J].VetParasitol,2015,210(3-4):235-239.[19]QiM,JingB,JianF,etal.DominanceofEnterocytozoonbieneusigenotypeJindairycalvesinXinjiang,NorthwestChina[J].ParasitolInt,2017,66(1):960-963.60 大理大学2018届硕士研究生学位论文[20]LiJ,LuoN,WangC,etal.Occurrence,molecularcharacterizationandpredominantgenotypesofEnterocytozoonbieneusiindairycattleinHenanandNingxia,China[J].ParasitVectors,2016,9:142.[21]WangXT,WangRJ,RenGJ,etal.MultilocusgenotypingofGiardiaduodenalisandEnterocytozoonbieneusiindairyandnativebeef(Qinchuan)calvesinShaanxiprovince,northwesternChina[J].ParasitolRes,2016,115(3):1355-1361.[22]王海燕.河南省家畜的三种肠道原虫分子流行病学调查[D].北京：中国农业大学,2015.[23]LiW,LiY,LiW,etal.GenotypesofEnterocytozoonbieneusiinlivestockinChina:highprevalenceandzoonoticpotential[J].PLoSOne,2014,9(5):e97623.[24]ZhaoW,ZhangW,YangF,etal.HighprevalenceofEnterocytozoonbieneusiinasymptomaticpigsandassessmentofzoonoticriskatthegenotypelevel[J].ApplEnvironMicrobiol,2014,80(12):3699-3707.[25]KarimMR,WangR,DongH,etal.GeneticpolymorphismandzoonoticpotentialofEnterocytozoonbieneusifromnonhumanprimatesinChina[J].ApplEnvironMicrobiol,2014,80(6):1893-1898.[26]ZhangXX,JiangJ,CaiYN,etal.MolecularCharacterizationofEnterocytozoonbieneusiinDomesticRabbits(Oryctolaguscuniculus)inNortheasternChina[J].KoreanJParasitol,2016,54(1):81-85.[27]徐利纳.河南省郑州地区微孢子虫病流行病学调查及分子特征初步研究[D].河南郑州：河南农业大学,2011.[28]ZhangX,WangZ,SuY,etal.IdentificationandgenotypingofEnterocytozoonbieneusiinChina[J].JClinMicrobiol,2011,49(5):2006-2008.[29]WangL,XiaoL,DuanL,etal.ConcurrentInfectionsofGiardiaduodenalis,Enterocytozoonbieneusi,andClostridiumdifficileinChildrenduringaCryptosporidiosisOutbreakinaPediatricHospitalinChina[J].PLoSNeglTropDis,2013,7(9):e2437.[30]YangJ,SongM,WanQ,etal.EnterocytozoonbieneusigenotypesinchildreninNortheastChinaandassessmentofriskofzoonotictransmission[J].JClinMicrobiol,2014,52(12):4363-4367.61 大理大学2018届硕士研究生学位论文[31]WangL,ZhangH,ZhaoX,etal.ZoonoticCryptosporidiumspeciesandEnterocytozoonbieneusigenotypesinHIV-positivepatientsonantiretroviraltherapy[J].JClinMicrobiol,2013,51(2):557-563.[32]MatosO,LoboML,XiaoL.EpidemiologyofEnterocytozoonbieneusiInfectioninHumans[J].JParasitolRes,2012,2012(4):981424.ProgressonGenomicsandMolecularEpidemiologyofMicrosporidiaAbstract:WiththecompletionofthegenomesofMicrosporidia,thecomparativegenomicsandfunctionalgenomicshavebecomethemajorresearchtasksofMicrosporidiaandthatwillprovidesignificantdataforilluminatingthepathogenesisofMicrosporidia.Meanwhile,investigatingoftheprevalenceinMicrosporidiausingthemolecularepidemiologymethodrevealedthatMicrosporidiawidespreadinsilkworm,mammalandaquacultureanimals,whichcouldprovideareferenceforstudyingtheepidemiccharacteristics.Basedonthemorethan100yearsofMicrosporidiaresearches,thefutureworkwillrefinethegenomicsandmolecularepidemiologystudyandachievenewbreakthroughsinthepathogenicmechanismandmoleculardiagnosticsofMicrosporidia.Keywords:Microsporidia;genome;genotype;molecularepidemiology62 大理大学2018届硕士研究生学位论文致谢回首这即将过去的研究生生涯，心中涌现的不是想象的欢欣，却是难以言喻的失落。随着论文的终结，意味着我生命中美好的学生时代暂时告一段落，尽管百般不舍，这一天终在熙熙攘攘的喧嚣中来临。三年寒窗，所收获的不仅仅是书本上的知识，更重要的是遇到了许多良师益友，无论学习上还是生活上都给我了无私的帮助和热心的照顾，让我在诸多方面都有所成长。首先要感谢我的导师李海龙副教授。三年来，感谢李老师对我的学习和研究等方面的严格要求，感谢您对我实验操作、撰写论文等方面给予的悉心指导和无私帮助。每当有实验上的疑惑或者生活上的困难时，您都给了我最大的帮助。您严谨的作风、求实的态度深深的影响了我，是我以后人生道路上的榜样。其次，我要感谢恩师朱兴全教授，您学识渊博，专业上孜孜以求，工作上兢兢业业；以身立教，为人师表；传道授业，呕心沥血；思想深邃，视野雄阔。在我初到兰州，一切都很陌生之时，是您的关怀让我很快融入到了兰州这个大家庭。每当我实验不顺利时，是您帮我分析原因，宽慰我不要气馁。在实验方面，我知道是我自己不够努力，辜负了您的期望和栽培。能成为您的弟子，我三生有幸！此外，我还要感谢师母在生活上，对我的关心和照顾。在此，我向你们表示最深切的谢意与祝福。特别感谢大理大学基础医学院杨毅梅教授、张莉教授、吕艳老师和李倩老师在实验方面及论文写作方面的指导及帮助。感谢张雷老师、钱体军老师、秦凤老师在学习和生活中给予的帮助与指导。感谢我师兄师姐王鑫磊、张珊珊和夏彬彬在实验上的指导，衷心感谢田显樟老师、师弟罗潇、李渊和师妹孙春雪在我的实验样品上给予的帮助。感谢在兰州的王金磊师兄、张晓轩师兄和我的同级邹扬、刘晴同学对我实验上的指导，没有你们，我实验无法顺利完成。感谢岳东梅师姐，袁晓丹、白梦捷和聂兰碧师妹，你们对我生活上、精神上无私的帮助和宽慰。感谢师兄师姐陈小庆、姚秋霞、朱伟宁、韩亮、张芙恺、郑文斌、孙淼淼，你们是我学习的榜样；感谢我的同学杨文彬、田艾灵、陈凯、宋海洋，我的师弟师妹梁勤立、谢世臣、牛美容对我实验提供热情的帮助。再回首这些日子，让我很开心也很难忘。63 大理大学2018届硕士研究生学位论文最后深深的感谢我的家人，我永远的支持者。感谢父母的养育之恩，每当我遇到困难的时候父母总是给我鼓励，回顾20多年来，我走过的每一段路每一个脚印都浸满着你们无私的关爱和教诲。感谢我的对象吴耀东对我生活和实验上的指导；感谢我的弟弟妹妹，是你们在父母身边，才能让我安心的在外求学和追求自己的理想。本研究是在中国农业科学院兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室完成的，得到了中国农业科学院科技创新工程项目（编号：CAAS-ASTIP-2016-LVRI-03）、中国农业科学院农科英才计划项目、中国农业科学院基本科研业务费专项项目（编号：Y2016JC05，1610312017004）和国家自然科学基金项目（81560331，31760726）的资助，特此致谢！64
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