《多中心AKI临床流行病学调查、Klotho蛋白对AKI早期诊断价值评估及保护作用的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：Ｒ６９２密级：公开单位代码：１０７６０学号：１０７６０１１３０６８７新疆科大学ＸｉｎＪｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ博士学位论文ＴＨＥＳＩＳＯＦＤＯＣＴＯＲＤＥＧＲＥＥ临床医学博士专业学位（学位教育）论文题目：多中心ＡＫＩ临床流行病学调查、Ｋｌｏｔｈｏ蛋白对ＡＫＩ早期诊断价值评估及保护作用的研究研究生王顺指导教师刘健教授专业学位领域内科学（肾脏病学）研究方向急性肾损伤研究起止时间２０１４年１月－２０１７年１２月所在学院新疆医科大学第一临床医学院２０１８年３月 论文独创性说明本人中明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特別加以标注和致谢的地方外一，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名減、；ｎ签字丨丨期：导师签名：签字日期：关于论文使用授权的说明本人完企／解学校关于保留、使用学位论文的各项规定，—“”（选：：项杼同意／不同意）以下？：＿＿１．学校有权保留本论文的览印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手．段保存、汇编学位论文；“２．学校有权将本人的学位论文提交至淸华大学中国学术期刊（光”盘版）电子杂志社用于出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》或其他＊同类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名：五＋签字曰期：导师签名，：签字日期：加“！—Ｉ１ 多中心AKI临床流行病学调查、Klotho蛋白对AKI早期诊断价值评估及保护作用的研究研究生王顺指导教师刘健教授专业学位领域内科学（肾病）研究方向急性肾损伤课题来源：自治区自然科学基金（2015211C069）；中华医学会专项基金（17010030672）2018年3月 Multi-centerAKIclinicalepidemiologicalinvestigation,klothoproteinasabiomarkerforthedetectionofAKIandklotho'sprotectiveeffectinAKIＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofMedicineByWangShunInternalMedicineDissertationSupervisor:(Prof.LiuJian)March,20 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名AKIAcutekidneyinjury急性肾损伤Community-acquiredacuteCA-AKI社区获得性急性肾损伤kidneyinjuryHospital-acquiredacuteHA-AKI医院获得性急性肾损伤kidneyinjuryBUNBloodureanitrogen尿素氮ScrSerumcreatinine血肌酐EstimatedglomerulareGFR估算肾小球滤过率filtrationrateCKDChronickidneydisease慢性肾脏病ATNAcutetubularnecrosisf急性肾小管坏死MultipleorgandysfunctionMODS多器官功能障碍综合征syndromeDisseminatedintravascularDIC弥散性血管内凝血coagulationARDSAcuterespiratorydistresssyndrome急性呼吸窘迫综合征Neutrophilge]atinase中性粒细胞明胶酶NGALassociatedlipocalin相关脂质运载蛋白I/RIschemia/Reperfusion缺血再灌注 英文缩写英文全名中文译名ERSEndoplasmicreticulumstress内质网应激UPRUnfoldedproteinresponse未折叠蛋白反应JNKc-junamino-terminalkinasec-jun氨基末端激酶CHOPCEBPhomologousprotein转录因子C/EBP同源蛋白双链RNA依赖PERKPKRlikeERkinase的蛋白激酶样ER激酶ATF6Activatingtransctipdonfactor6激活作用转录因子6IRE1Inositolrequitingenzymel跨膜蛋白激酶1(核酸内切酶) 目录摘要...................................................................................................................................1ABSTRACT.........................................................................................................................4前言...................................................................................................................................8第一部分新疆地区多中心AKI临床流行病学调查研究...........................................141研究内容与方法...................................................................................................141.1研究设计...................................................................................................141.2研究对象...................................................................................................141.3研究方法...................................................................................................151.4质量控制...................................................................................................211.5统计方法...................................................................................................212结果.......................................................................................................................223讨论.......................................................................................................................364小结.......................................................................................................................40第二部分血清KLOTHO蛋白监测对AKI早期诊断及预后评估作用的初步研究.................................................................................................................421研究内容与方法...................................................................................................421.1研究对象...................................................................................................421.2相关定义及诊断标准...............................................................................431.3研究方法...................................................................................................431.4统计方法...................................................................................................472结果.......................................................................................................................473讨论.......................................................................................................................504小结.......................................................................................................................53 第三部分KLOTHO蛋白对缺血再灌注AKI中内质网应激的作用........................551研究内容与方法...................................................................................................551.1研究对象...................................................................................................551.2实验方法...................................................................................................551.3统计方法...................................................................................................672结果.......................................................................................................................683讨论.......................................................................................................................834小结.......................................................................................................................89结论.................................................................................................................................91致谢.................................................................................................................................92参考文献.............................................................................................................................93综述...................................................................................................................................102攻读博士学位期间获得的学术成果...............................................................................111个人简历...........................................................................................................................112导师评阅表.......................................................................................................................113 摘要多中心AKI临床流行病学调查、Klotho蛋白对AKI早期诊断价值评估及保护作用的研究研究生：王顺导师：刘健教授/主任医师摘要目的：1.了解新疆地区多中心住院患者急性肾损伤（AKI）发生的病因、疾病特征、临床诊治情况和预后的危险因素，比较社区获得性急性肾损伤（CA-AKI）与医院获得性急性肾损伤（HA-AKI）患者的长期预后，探讨AKI患者3年全因死亡的预后因素。2.评估血清Klotho蛋白监测对成人AKI早期诊断及预测AKI患者预后的价值。3.探讨在缺血再灌注（I/R）AKI中，Klotho对内质网应激的影响作用。方法：1.多中心回顾性调查新疆地区四家综合性医院2013年1月和7月收治的住院患者资料，依据纳入、排除标准，筛选出AKI患者。收集AKI患者的临床资料。将新疆医科大学第一附属医院筛选出的AKI患者根据AKI发生时间不同分为CA-AKI组和HA-AKI组，并对上述患者进行为期3年的临床随访，比较两组患者的长期预后，分析AKI患者3年全因死亡的预后因素。2.病例来自2016年7月1日至2016年8月31日入住新疆医科大学第一附属医院重症监护病房（ICU）的成人患者，依据患者入住ICU期间是否发生AKI将患者分为AKI组和非AKI组。收集患者一般临床资料、实验室检查及预后情况。ELISA法检测血清Klotho蛋白、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）水平。用受试者特征工作曲线（ROC）评价血清Klotho、NGAL和血肌酐诊断AKI的价值。比较不同预后的AKI患者Klotho水平，分析其与AKI预后的关系。3.建立急性肾缺血再灌注损伤大鼠模型，随机分为正常组+NS（NORM+NS），假手术组+NS（Sham+NS），手术组+NS（IR+NS），假手术组+Klotho（Sham+Kl），手术组+Klotho（IR+Kl）。造模成功后30分钟、60分钟、3小时、5小时、12小时、24小时6个时间点，将Klotho蛋白（0.01mg/kg）或NS（同等剂量）腹腔注入。收集损伤后1h、5h、12h、24h几个时间点的大鼠血清和肾脏组织，检测肾功能，利用ELISA法检测血清Klotho水平，HE染色和TUNEL染色评估不同时间点肾脏病理损伤程度和肾小管上皮细胞凋亡程度，用western-blot及RT-PCR检测各时间点动物标本中CHOP、JNK、Caspase12的表达量及其相应的mRNA表达量。1 新疆医科大学博士学位论文结果：1.32157例成人住院患者中，AKI患者722例，排除资料不完整者，最终719例AKI患者纳入本研究，AKI总检出率为2.25%（722/32157）。AKI患者中男性居多，占65.79%；平均年龄58.15±16.82岁，60-79岁发生AKI的比例最高，共320例（44.51%）。在所有科室中，最常发生AKI的科室为ICU，其次为心内科，肾内科位居第三。AKI主要病因类型为肾前性338例（51.76%），其次为肾实质性188例（28.79%）和肾后性127例（19.45%）。肾前性主要致病因素为心搏出量减少和血容量不足。急性肾小管坏死为肾实质性AKI首要因素，其次为肾间质性因素。AKI诊断情况分析中，总漏诊率为72.4%（407/557）。短期预后分析中，总死亡率为12.8%（92/719）。出院时存活的323例AKI患者中，肾功能恢复患者占43.7%（141例）；肾功能未完全恢复，但未持续透析的患者占40.2%（130例）；出院时仍在维持透析的患者占16.4%（53例）。多因素Cox回归模型提示，合并DIC及休克是AKI住院期间死亡的独立危险因素，另外妇产科AKI患者死亡危险性高于其他科室。单中心352例AKI患者中，CA-AKI组和HA-AKI组的1年全因死亡率为41.8%（89/213）和56.8%（79/139），两组有统计学差异（P＜0.05），CA-AKI组和HA-AKI组的3年全因死亡率为60.1%（128/213）和64%（89/139），两组无统计学差异。对352例AKI患者预后进行分析，多因素Cox回归模型提示，与AKI患者3年预后相关的危险因素包括MODS评分，总胆固醇，血浆白蛋白，中性粒细胞与淋巴细胞比值，血小板，平均动脉压。2.150例ICU患者纳入本研究，AKI组52例，非AKI组98例。AKI组患者基线血清Klotho水平明显低于非AKI组（P＜0.001），血清Klotho水平诊断AKI发生的曲线下面积为0.945（95%CI为0.892～0.997），最佳临界值为1.76μg/L（灵敏度92%，特异性94%），明显高于血肌酐；灵敏度高于NGAL（NGAL诊断AKI的灵敏度为87%，特异性96%）。血清Klotho联合血清肌酐诊断AKI发生的曲线下面积为0.958，95%CI为0.915～1.000，灵敏度96%；特异性92%。确诊AKI时的血清Klotho水平在肾功能恢复组与未恢复组两组间的差异有统计学意义（P=0.047），两组间血清NGAL及Scr水平的差异无统计学意义。确诊AKI时的Klotho水平与AKI发生后的峰值Scr、峰值eGFR、出院时Scr、出院时eGFR均无相关性。3.（1）I/R+NS组与Norm+NS组和Sham+NS组相比，血清Klotho蛋白、组织中Klotho蛋白及KlothomRNA自损伤后开始降低，至损伤后24小时下降最为明显，各组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。血清Klotho蛋白水平、组织Klotho蛋白水平和Scr均呈负相关（r=-0.488，P=0.016；r=-0.570，P=0.021）。（2）缺血再灌注术后24小时，IR+NS组HE染色显示肾小管上皮细胞水肿、变性、坏死、脱落，肾小管管型形成。与Sham+NS组相比，I/R+NS组术后1小时肾小管损伤评分开始升高，至24h最为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。TUNEL法检测肾脏组织肾小管上皮细胞凋亡水平，和Norm+NS组、Sham+NS组相比，I/R+NS组大鼠在缺血再灌注损伤后24小2 摘要时肾小管上皮细胞凋亡细胞数量显著增加，I/R+NS组IOD值较其它两组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）与Norm+NS组、Sham+NS组相比，I/R+NS组凋亡蛋白caspase-12、JNK、CHOP和caspase-12mRNA、JNKmRNA、CHOPmRNA相对表达水平在缺血再灌注损伤后表达开始升高，24小时表达最多，差异有统计学意义（P＜0.05）。Pearson相关性分析显示：组织中Caspase-12蛋白、CHOP蛋白与Scr无明显相关关系（r=0.373，P=0.155；r=0.478，P=0.061），JNK蛋白与Scr呈正相关关系（r=0.582，P=0.035）。（4）外源性补充Klotho蛋白后，与I/R+NS组相比，I/R+Klotho组Scr明显降低，肾小管损伤评分显著下降，HE染色见肾小管上皮细胞空泡变性、坏死减轻，凋亡蛋白caspase12、JNK、CHOP相对表达量及caspase12mRNA、JNKmRNA、CHOPmRNA相对表达量明显回落，差异均有统计学意（P＜0.05）。结论：1.中老年男性是住院患者AKI发生的高危人群；新疆地区住院患者AKI主要病因类型为肾前性，主要致病因素为心搏出量减少和血容量不足；AKI的漏诊情况严重；AKI预后差，合并DIC及休克及妇产科住院是AKI住院期间死亡的独立危险因素。CA-AKI组与HA-AKI组患者3年的长期预后无明显差异。AKI3年预后相关的独立危险因素包括MODS评分，总胆固醇，血浆白蛋白，中性粒细胞与淋巴细胞比值，血小板，平均动脉压。2.血清Klotho有望作为成人AKI的早期诊断指标；Klotho与AKI预后的相关关系不确定。3.I/RAKI后全身及局部Klotho表达下调，Klotho蛋白的表达下降可能与肾组织细胞凋亡有关。I/RAKI后内质网应激参与了肾损伤过程，促进肾小管上皮细胞凋亡。Klotho蛋白可能可以通过抑制内质网应激发挥抗凋亡作用。关键词：急性肾损伤，临床流行病学，Klotho蛋白，诊断，保护作用，内质网应激3 新疆医科大学博士学位论文Multi-centerAKIclinicalepidemiologicalinvestigation，klothoproteinasabiomarkerforthedetectionofAKIandklotho'sprotectiveeffectinAKIPostgraduate:WangshunSupervisor:Prof.LiujianAbstractObjective:1.Weaimedtoevaluatetheetiology,epidemiologicalcharacteristics,clinicaldiagnosis,outcomesandtheriskfactorsofclinicalprognosisofthehospitalizedpatientswithAKIinXinjiang.Tocomparethelong-termoutcomesofhospital-andcommunity-acquiredacutekidneyinjuryinXinjiangandinvestigateprognosticfactorsof3-yearsall-causemortalityforAKIpatients.2.ToevaluatetheclinicalsignificanceofserumKlothoproteinlevelsintheearlydiagnosisandprognosisofAKIamongadultpatientsintheintensivecareunits(ICU).3.ToinvestigatetheeffectofKlothoonendoplasmicreticulumstressduringischemia/reperfusion(I/R)AKI.Methods:1.Amulti-centerretrospectivesurveyofadultpatientsin4hospitalsfromXinjianginJanuary2013andJuly.PatientswithAKIwerescreenedoutbasedoninclusionandexclusioncriteria.ClinicalvariablesofpatientswithAKIwerecollected.Then,352patientsadmittedtotheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversityweredividedintohospital-acquiredacutekidneyinjury(HA-AKI)groupandcommunity-acquiredAKI(CA-AKI)groupintermsoftimeofonsetofAKI.Allpatientswerefollowedupfor3years.Clinicaldataandtheresultsoflaboratoryexaminationwerecollected.Comparisonoflong-termoutcomesbetweenpatientswithHA-AKIgroupandthosewithCA-AKIwasperformedusingtheLogranktest,andprognosticfactorsof3-yearsall-causemortalityinAKIpatientswereanalyzedusingtheCoxregression.2.Thestudywasprospectiveandobservational.BloodsamplesandclinicaldataofAKIpatientsadmittedtotheICUoftheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversitybetweenJuly1andAugust312016werecollected.ELISAwasusedforthedetectionof4 AbstractKlothoandNGAL.Receiveroperatingcharacteristiccurve(ROC)andtheareaunderthecurve(AUC)wereusedtocomparethepredictiveperformanceamongKlotho,NGALandserumcreatinine,evaluatingthesensitivityandspecificityofKlothoonthediagnosisofAKI.ThecorrelationbetweenKlothoandprognosisofAKIwasinvestigatedbycomparingserumKlotholevelsandearlyAKIpredictors.3.Aratmodelofacuterenalischemia/reperfusioninjurywasestablishedandrandomlydividedintonormal+NSgroup,Shamoperation+NSgroup,Surgical+NSgroup,shamoperationgroup+KlothoGroup(Sham+Kl),Surgical+Klothogroup(IR+Kl).Klothoprotein(0.01mg/kg)orNS(samedose)wasintraperitoneallyinjected30minutes,60minutes,3hours,5hours,12hoursand24hoursafterthesuccessfulmodeling.Theserumandkidneytissuesofratsat1,5,12,24hafterinjurywerecollectedtodetecttherenalfunction.SerumKlotholevelsweredetectedbyELISA.ThepathologicalchangesofrenaltubulesandtherenaltubularepithelialcellsatdifferenttimepointswereevaluatedbyHEstainingandTUNELstaining.ThelevelsofapoptosisproteinCHOP,JNKandCaspase12inanimalspecimensweredetectedbyWestern-blotandRT-PCRateachtimepoint.Results:1.Among32,157adulthospitalizedpatients,719patientssufferingfromAKIfor722episodeswereenrolledinthisstudy.ThedetectionrateofAKIwas2.25%(722of32157)byKDIGOcriteria.ThemajorityofAKIpatientsweremale,accountingfor65.79%.Themeanagewas58.15±16.82years.AKIwasthehighestin60-79years(320cases,44.51%).Inalldepartments,themostcommonlyoccurringAKIwasICU,followedbycardiology,andnephrologywasthethird.ThemaincausesofAKIwere338cases(51.76%)ofprerenaletiologies,followedby188cases(28.79%)withrenalparenchymaand127cases(19.45%)withrenalparenchyma.ThemajorriskfactorsofprerenalAKIwerecardiacoutputandhypovolemia.AcutetubularnecrosisistheprimaryfactorofrenalAKI,followedbyrenalinterstitialfactors.Thenon-recognitionrateofAKIwas72.4%(407/557).Intheshort-termprognosticanalysis,theoverallmortalityratewas12.8%(92/719).Ofthe323patientswithAKIwhosurviveddischarge,43.7%(141)hadrenalfunctionrecovery;40.2%(130)didnotfullyrecovertheirrenalfunctionbutdidnotcontinuedialysis;16.4%(53)werestillondialysisatdischarge.MultivariateCoxregressionmodelsuggestedthatDIC,shockanddepartmentofobstetricswereindependentriskfactorsfordeathduringhospitalizationofAKI.Inaddition,theriskofdeathforAKIfromdepartmentofobstetricsandgynecologypatientswashigherthanthat5 新疆医科大学博士学位论文ofotherdepartments.Inthesingle-center352patientswithAKI,the1-yearall-causemortalitywassignificantlydifferentbetweenpatientswithCA-AKI(41.8%,89/213)andHA-AKI(56.8%,79/139)(P＜0.05),butthe3-yearall-causemortalityshowednosignificantdifferencesbetweenthetwogroups(60.1%(128/213)oftheCA-AKIgroupand64%(89/139)oftheHA-AKIgroup).ThemultivariateCoxregressionmodelwithdatafrom352AKIpatientsindicatedthattheriskfactorsrelatedto3-yearoutcomesintheAKIpatientsincludedincreasedMODSscores,increasedtotalcholesterol,reducedplasmaalbumin,decreasedratioofneutrophilegranulocyteandleukomonocyte,reducedplateletcounts,andlowmeanarterialpressure.2.ThepatientsweredividedintoAKIgroupof52casesandnon-AKIgroupof98cases.ThebaselineserumKlotholevelinAKIgroupwassignificantlylowerthanthatinnon-AKIgroup(P＜0.001).TheAUCofKlothopredictingforAKIwas0.945(95%CI:0.892-0.997)forAKIandthebestcutoffvaluewas1.76μg/L(sensitivity92%,specificity94%).ThepredictiveabilityofKlothowassignificantlyhigherthanserumcreatinine(Scr),andthesensitivityishigherthanNGAL(sensitivity87%,specificity96%).SerumKlothocombinedwithScrpredictedbetter(AUC=0.958,95%CI:0.915-1.000,sensitivity96%,sensitivity92%).ThelevelofKlothoinpatientswithAKIwassignificantlydifferentbetweentherenalfunctionrecoverygroupandnon-recoverygroup(P=0.047),whiletherewasnosignificantdifferencebetweenthetwogroupsinthelevelofNGALandScr(P＞0.05).TherewasnosignificantcorrelationbetweentheKlotholevelatdiagnosisofAKIandpeakScr,peakeGFR,ScratdischargeandeGFRatdischarge(r=0.026,P=0.853;r=-0.127,P=0.368;r=0.243).3.(1)ComparedwithNorm+NSgroupandSham+NSgroup,theKlothoproteinandKlothomRNAofKlothoproteindecreasedintheI/R+NSgroupfromthebeginningoftheinjurytothe24hourafterinjury,Therewassignificantdifferencebetweeneachgroup(P＜0.05).SerumKlothoproteinlevel,tissueKlothoproteinlevelandScrwerenegativelycorrelated(r=-0.488,P=0.016;r=-0.570,P=0.021).(2)24hoursafterischemia-reperfusion,HEstainingofIR+NSgroupshowedthatrenaltubularepithelialcellswereedema,degeneration,necrosis,sheddingandtubuleformation.ComparedwiththeSham+NSgroup,thescoreofrenaltubularinjurybegantoincrease1hourafteroperationinI/R+NSgroupandreachedthepeakat24h,withsignificantdifference(P＜0.05).ComparedwithNorm+NSgroupandSham+NSgroup,theapoptosisofrenaltubularepithelialcellswasdetectedbyTUNELinrenaltubularepithelialcells24hoursafterischemia-reperfusioninjuryinI/R+NSgroupThenumberofIODinI/R+NSgroupwassignificantlyhigherthanthatinothertwogroups(P＜0.05).6 AbstractConclusion:1.Middle-agedandelderlymenareat-riskAKIpatients.ThemostcommonreasonforAKIinhospitalizedpatientsinXinjiangwasprerenalinjury.Themainriskfactorswerelowcardiacoutputandlowbloodvolume.TheomissiondiagnosisofAKIwasserious.TheprognosisofAKIwaspoor,DIC,shock,hospitalizationinobstetricswereindependentriskfactorsfordeathinpatientswithAKI.Therewasnodifferencein3-yearall-causemortalitybetweenHA-AKIgroupandCA-AKIgroup.MODSscores,totalcholesterol,plasmaalbumin,rationofneutrophilegranulocyteandleukomonocyte,bloodplateletandmeanarterialpressureisrelatedtoprognosisofAKIpatients.2.SerumKlothomaybeapotentialbiomarkerforearlydiagnosisofAKI,buttheassociationbetweenserumklothoandtheprognosisofAKIrequiresfurtherstudy.3.TheKlothoexpressionisdown-regulatedafterI/RAKI,andthedecreaseofKlothoproteinmayberelatedtotheapoptosisofrenaltissue.endoplasmicreticulumstressinvolvedintheprocessoI/RAKIandpromoterenaltubularepithelialcellapoptosis.Klothoproteinmayplayananti-apoptoticrolebyinhibitingendoplasmicreticulumstress.Keywords:Acuterenalinjury;Clinicalepidemiology;Klothoprotein;Diagnosis;Protection;Endoplasmicreticulumstress7 新疆医科大学博士学位论文前言急性肾损伤（acutekidneyinjury，AKI）是由各种原因造成的短时间，肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate，GFR）快速下降引起的以肾功能减退为主要临床表现的临床综合征，表现为肌酐和尿素氮潴留，水，电解质和酸碱平衡紊乱，严重的患[1]者可以合并多系统损害。国外最新报道meta分析显示，住院成人患者AKI发病率为[2][3]21.6%，死亡率为23.9%。北京大学第一附属医院的杨莉教授等人做了一项研究：2013年共纳入44家医院共计2223230例住院患者，其中一月和七月患者为374286例。通过电子筛选出及病历证实，符合KDIGO标准AKI的检出率为0.99%（3687例/374286例），通过扩大标准AKI检出率是2.03%（7604例/374286例）。已捕获AKI7604例分析，漏诊74.2%（5608），延误诊断4.6%（343），及时诊断21.2%（1604），院内死亡12.4%（927），放弃治疗16.1%（1203）。在我国ICU患者中急性肾损伤发病率相关的报道存[4]在差异，有报道ICU患者当中有9.52%的患者发生急性肾损伤，有57%-63%的患者[5][6]死亡。相关研究表明AKI的发生发展影响危重病人的总体预后，岳金凤等回顾性分析了544例ICU患者的临床资料，其中AKI1期81例（14.8%），AKI2期45例（8.2%）、AKI3期65例（11.9%），AKI（1+2+3期）组患者死亡率明显高于肾功能正常组患者（48.2%vs11%，OR7.48，95%CI4.831～11.587，P＜0.0001），且ICU死亡率随AKI分期加重而呈线性增长的趋势，即AKI1期37%，AKI2期51.1%，AKI3期60%。研究结果提示AKI分期与患者临床预后密切相关。[7]国外观察性队列研究结果显示，在1997年至2012年间接受了重症监护并幸存的成年患者中，没有AKI的患者30天再次入院的绝对风险为12.3%，具有风险，损伤，衰竭风险的患者30天再次入院的绝对风险分别为19.0%，21.2%和21.1%。调整包括年龄，种族（白人与非白人），性别，Deyo-Charlson指数，患者类型（医疗与手术）和败血症等变量后，具有风险，损伤，衰竭风险的患者出院后30天再入院的几率分别为1.44（95%CI，1.25-1.66），1.98（95%CI，1.66-2.36）和1.55（95%CI，1.26-1.91）；相对于没有急性肾损伤的患者，出院后30天死亡率的可能性分别为1.39（95%CI，1.28-1.51），1.46（95%CI，1.30-1.64）和1.42（95%CI，1.26-1.61）。提示在接受重症护理并住院治愈的患者中，急性肾损伤是再入院和出院后死亡的有力预测指标，并且在多变量调整后仍然如此。AKI的各种致病因素可以通过个体和医院内多层次的、综合的干预措施来预防。就我国而言，不同地域AKI的主要病因及其发病方式有所区别，由于新疆地区环境、人民生活方式、医疗预防模式及各种慢性肾脏疾病的主要病因与我国东部地区以及西方各发达国家有显著差异，肾脏病的预防和治疗策略也必有不同的侧重点。至今8 前言为止，新疆地区针对AKI还未进行大规模流行病学调查研究，因此关于急性肾损伤的疾病认知水平，本地区可谓有限。本研究通过回顾性调查新疆地区4家综合性医院成人住院患者临床资料，根据KDIGO指南筛选确认AKI患者，分析上述患者的临床资料特点，了解新疆地区住院患者AKI发生的病因、流行病学特征、临床诊治情况和预后的危险因素。并通过对新疆医科大学第一附属医院2013年1月、7月收治的急性肾损伤患者进行为期三年的临床随访，了解AKI的长期预后情况。在AKI的病理生理机制中，其发生和发展呈现动态演变的过程。在大多数情况下，各种损伤因素会影响肾脏正常结构，当损伤严重或持续存在时，肾脏组织结构的损伤导致肾小球滤过率（GFR）水平下降，即发生急性肾损伤。大量相关研究表明，AKI的早期阶段是可逆的。在临床上如果能在GFR开始轻微下降或仍处于正常阶段就能及时识别或诊断AKI，并能给予相应的治疗干预，肾功能可以得到很大程度的改善和恢复。然而，迄今为止，AKI的临床诊断仍然缺乏临床敏感性和特异性高的生物学标志物，对AKI的临床预后造成一定程度的影响。通过临床常用的一些血肌酐（Scr）、尿量等诊断指标估测肾脏损伤程度可有相对局限性：1.当GFR正常或范围高值时，Scr并不敏感。因为Scr与GFR并非指数关系，在Scr升高之前就有相当一部分肾单元已经失去功能。另外，Scr无法反映肾功能储备的受损。当面临应激时，例如急性蛋白负荷或高动力情况下，RFR就与GFR代偿性增加有关。肌酐清除率在高GFR时可能作为肾功能监测更可靠的手段。2.Scr滞后于GFR变化。Scr水平反映的是产生（取决于肌肉含量）和肾脏清除（通过肾小球滤过）之间的平衡，正常半衰期为4h。GFR急性下降后，直到达到新的平衡，肌酐才会升高。而重新达到平衡的这段时间取决于GFR下降程度及半衰期延长情况，这将可能延误AKI的诊断。3.其他混杂因素可能会进一步延误甚至掩盖基于Scr标准的AKI诊断，这在严重疾病时更为如此。液体超负荷将稀释Scr，从而延误甚至漏诊AKI。脓毒症和肌肉萎缩可以引起Scr产生减少，造成假阴性。在严重疾病状态下，这两种情况更明显。4.KDIGO肌酐标准需要基线水平的肌酐。AKI的诊断是基于Scr变化与基线的比较。确定基线水平的Scr可能需要临床医生来判断。但已经有人提出替代缺失基线值2情况的办法。利用eGFR方程进行反向计算并假定正常eGFR为75ml/min/m时，这将可能忽略未确诊的慢性肾脏病（chronickidneydisease，CKD），继而可能导致假阳性。使用入院时Scr水平而不考虑社区获得性AKI的存在，这将会降低发病率。5.肌酐是肾脏功能的标志物，但不是肾脏损伤的标志物。基于目前组织损伤的生物标志物研究表明，肾脏损伤可以在没有Scr变化的情况下就已经发生，这可能反映了有足够的RFR代偿能力或非常早期的诊断。这种亚临床AKI与不良预后相关。6.尿量作为诊断标准缺乏特异性，而且可能不够严谨。少尿在ICU中很常见，它的出现往往伴随GFR的下降。KDIGO定义的尿量标准并没有得到较好的验证。7.KDIGO定义对AKI的病因、9 新疆医科大学博士学位论文病理生理学没有提供任何解释。AKI为不同病因（缺血、炎症、肾毒性）及不同临床情况（心脏手术、脓毒症等）的异质综合征。因此，诊断AKI并不会转化为治疗策略，而是触发下一步处理。肾损伤的生物标志物可以提示病理生理过程并指导干预措施。8.没有金标准来验证KDIGO定义或其他AKI标志物。理想的定义应该具备高敏感性及高特异性；然而，在没有金标准的情况下，这些都很难确定。甚至关于AKI的金标准是否可以反映GFR、肾小管功能的变化或组织损伤（生物标志物、组织病理学）都还没有达成共识。虽然没有金标准，KDIGO定义已通过AKI诊断、严重程度与死亡率之间的关联得到验证。这种关联是否反映潜在的并发症和/或与急症有关的因素，或者真正的病因，只能通过（仍然缺乏）AKI有效的肾脏特异性干预措施来证明。9.采用不同AKI标准可能预后不同。通常我们对肾功能不全3期的患者启动肾脏替代治疗。然而，AKI患者启动RRT的指标尚未明确建立，而且差异很大。另外，KDIGO定义包括10个不同的标准，分为三个阶段。最近的队列研究分析显示，对AKI采用不同标准可能和预后的关联也不同。10.KDIGO定义对肾功能恢复的评估帮助不大。最新研究根据KDIGO将肾脏恢复定义为AKI消失。然而，住院期间肌肉含量逐渐减少也将高估肾脏功能的恢复。因此，寻找能够早期诊断AKI，具有高敏感性和高特异性的生物标志物已成为近年该邻域目前研究的热点。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展，通过进一步研究缺血性病理生理学的发生发展机制，从分子水平揭示急性肾损伤后的一些明显异常蛋白质。研究发现，这些蛋白质在体内的代谢特征与AKI病理生理学和组织形态学存在密切的关系。这些异常蛋白被用作早期生物标志物来预测AKI的发生和发展。最近，大量相关研究集中在发现和鉴定AKI的这些生物标志物的早期发现价值。通过这些研究发现具有潜在临床应用前景的早期检测标志物主要包括：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（cystatinC）、肾损伤分子-l（kidneyinjurymolecule-1，KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophilge]atinaseassociatedlipocalin，NGAL）、白介素-18（IL-18）等。CystatinC是一种非糖基化的碱性小蛋白分子，可以由人类所有有核细胞以相对稳定的速度合成并释放入血。血CystatinC基本上完全被肾小球滤过，并由近端小管重吸收。虽然在以往的相关研究中宣称它不受性别、肌肉含量、年龄、体重的影响，但最近的相关研究中表明在较高身高、体重和年龄，以及肌肉[8]含量的人群当中的胱抑素C浓度更高。在发生AKI后，与NGAL相比，胱抑素C升高较晚，在许多研究中也显示，NGAL在4h尿液中以及2h血清中显著升高，而胱抑素则[9]8～24h后升高。胱抑素C由于缺乏标准化检测，从而限制其在相关研究中的普遍应用。NGAL是一种结合嗜中性粒细胞凝胶的25-kDa蛋白质，是lipocalin家族的新成员。NGAL通常在肾小管，肺，结肠，肝脏和其他组织中较低。对19项单中心研究和2，10 前言500名患者的荟萃分析评估了NGAL诊断和预测AKI的准确性。发现尿和血清NGAL[10]是早期AKI的有效预测因子。在2011年的一项单中心研究中，2322例患者的荟萃分[11]析显示NGAL可以监测亚临床AKI的发生，即使血清肌酐不符合AKI标准。NGAL目前是AKI早期诊断，诊断，预后评估和指导意义最有前途的生物标志物。KIM-1是一种由334个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。其在正常肾组织近曲小管中低表达，在缺血及肾毒性损伤后的近曲小管上皮细胞中表现为高表达状态。尿KIM-1作为一种非侵入性、对肾脏损伤较高敏感度及特异度的生物学监测指标，在预测AKI患者是否需要肾替代治疗以及早期预测死亡率等方面KIM-1与[12]Scr和BUN相比并没有显著优势。IL-18是一种促炎症细胞因子，IL-18水平受患者肝炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、多发性硬化等非肾脏疾病病理生理状态的影响。尿液中IL-18水平的升高针对预测缺血性AKI时急性肾小管坏死（Acutetubularnecrosisf，ATN）具有较高的特异性。直到今日，尚未能明确到底哪种生物学标志物或标志物组合是最具有预测价值。1997年，matsuura等人在自发性高血压的研究中，与衰老有关的基因被偶然发现并命名为Klotho。由于Klotho基因主要在肾脏组织中表达，因此Klotho基因在肾病发展中的作用和意义近年来引起了人们极大的兴趣。Klotho基因与AKI之间的关系不可避免地受到了更多的关注。在AKI大鼠模型中，Klotho蛋白显示AKI早期检测的理想潜力，表明Klotho基因有望成为AKI早期预测和新治疗靶点的新靶标。AKI的许多新的早期检测标志物是AKI的病理生理学和标志物本身的物理和化学特性的共同特征，代谢途径与生物学功能之间的紧密联系，从而解释了AKI与相应指标在病理生理水平上的密切关系。这些关系为这些生物标志物的临床应用提供了客观依据。在许多这些生物学标志物中，由于Klotho蛋白水平的变化可能与肾功能呈负相关，表明Klotho蛋白具有潜在的肾保护作用。本次研究中我们采用前瞻性、单中心研究方法，通过检测ICU中AKI患者血清Klotho蛋白的变化，评价其早期诊断AKI的价值，并分析其与AKI预后的关系。内质网是真核细胞中重要细胞器，其基本生理功能包括Ca2+调节、生物大分子的合成加工等。病理生理状态时，增加了需求蛋白质折叠或破坏正常折叠过程导致错误折叠的蛋白质积累内质网和内质网的扩张，并导致内质网应激（endopl-asmic[13]reticulumstress，ERS）和激活未折叠的蛋白质应答（unfoldedproteinresponse，UPR）。适当的ERS可增强内质网的应激能力，并促进内质网功能的恢复。当ERS持续存在或程度过强时将诱导ERS相关性细胞凋亡，并造成细胞损伤。UPR过程中，能够感知内质网腔内未折叠蛋白异常聚集的感受器主要是3个跨膜蛋白，即双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶（PKRlikeERkinase，PERK），激活作用转录因子6（activatingtransctipdonfactor6，ATF6）和跨膜蛋白激酶1（inositolrequitingenzymel，IRE1，又11 新疆医科大学博士学位论文称核酸内切酶）。正常情况下，这3种蛋白的内质网腔内侧都与糖调节蛋白GRP78（glucose-regulatedproteins78又称immuno-globulinbindingprotein，GRP78／BIP）结合而处于失活状态，当内质网大量未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内聚集时，GRP78即与这3种跨膜蛋白解离而通过与大量聚集的未折叠或错误折叠蛋白质结合协助蛋白质的正确折叠，GRP78的解离可活化PERK，IREl，ATF6而触发UPR，这种反应主要包括内质网蛋白质合成的广泛抑制、ERS相关蛋白质的表达水平上调以及细胞凋亡。蛋白质合成的广泛抑制UPR最先出现的反应是蛋白质合成广泛下调，该反应主要由PERK途径调控的真核细胞翻译起始因子2α（eukaryoticinitiationfactor2alpha，elF2α）磷酸化介导。ERS时PERK被激活，进而磷酸化elF2α，使翻译启动受阻，通过减少蛋白质合成量，减轻内质网受到蛋白负荷，缓解ERS反应。ERS相关的蛋白质表达水平上调是ERS过程中的重要环节，ERS的相关刺激因素可诱导GRPs、蛋白二硫键异构酶、肽基脯氨酰异构酶、ERS相关凋亡酶等多种基因的上调，此过程与ATF6，IREl信号通路密切相关。ATF6在ERS时转位至高尔基体，被剪切活化后进入胞核与ERS靶基因启动予中的顺式作用序列结合而引起靶基因转录。IREl活化后激活核酸内切酶，后者特异地剪切转录因子XBPq（菌体内为Hacl）mRNA的抑制序列，高效翻译XBP-1蛋白，转位至胞核后与UPR靶基因启动子中的顺式作用序列结合后，上调靶基因转录表达。ERS相关蛋白质的表达上调促进ER腔内大量聚集的未折叠及错误折叠蛋白质的正确折叠、调节Ca2+稳态、增强Ca2+依赖性蛋白质修饰反应等，与终止ERS、恢复细胞功能密切相关，具有显著的细胞保护作用。过度ERS反应造成持续Ca2+紊乱，诱导凋亡酶合成的增加，并通过激活凋亡酶级联反应而引发内质网相关的细胞凋亡。ERS经独立的信号转导途径导致细胞凋亡，主要包括转录因子C/EBP同源蛋白（CEBPhomologousprotein，CHOP）表达、和c-jun氨基末端激酶（CJunNH2terminalkinases，JNK）的活化及caspase12激活。CHOP又称为DNA损伤基因（growtharrestandDNAdamageinduciblegene153，GADDl53），主要存在于细胞浆内，在ERS反应时活化转位至细胞核，通过下调Bel-2表达水平而[14]促进细胞凋亡。活化的IREl、ATF6及PERK均可诱导CHOP基因的转录、表达上调。[15]研究表明，注射ERS诱导剂TM后，在数小时内野生型小鼠肾皮质CHOPmRNA水平升高并升高持续2-3天，肾功能不良的症状也相应的出现，相关的组织学检测可见肾小管上皮细胞明显肿胀坏死，揭示CHOP在ERS相关细胞凋亡中具有关键的作用。Caspase12存在于ER膜上，在ERS反应时被特异激活。非ERS相关刺激因素（如TNF、抗Fas等）诱导野生型细胞的凋亡中无caspase12激活，提示caspase12在非ERS相关的细胞凋亡过程中的作用并不重要。但相关的动物实验结果示caspase12在内质网应激相关的细胞凋亡中过程中发挥关键性作用，野生型小鼠注射TM后，肾小管上皮细胞[16]的凋亡特别严重，肾功能也表现出明显受损。IREl还可激活哺乳类细胞重要应激12 前言信号分子C-Jun，通过由IREl-TRAF2-ASKl（apoptosissignal-regulatingkinase-1）复合物介导的JNK途径诱导细胞凋亡。缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）时，缺氧、ATP耗竭、酸中毒、钙超载以及大量自由基生成等损伤因素均可作为诱导ERS的刺激因素，ERS在I/R损伤的发生发展过程中具有重要的意义。Klotho对肾脏的保护作用已经证实了，其相关的保护机制仍在研究当中，Klotho是否对内质网应激相关的细胞凋亡产生影响尚不明确。基于此，本研究旨在探讨在I/R引发的AKI中，Klotho对内质网应激介导细胞凋亡的重要信号途径的影响及作用机制。综上所述，本课题拟从以下三个方面进行研究：1.通过多中心回顾性调查新疆地区四家综合性医院AKI患者的临床资料及短期和长期预后情况，了解新疆地区多中心住院患者AKI发生的病因、疾病特征、临床诊治情况和预后的危险因素，为本地区该疾病的早期诊断、合理治疗及预防提供依据。比较社区获得性急性肾损伤（Community-acquiredacutekidneyinjury，CA-AKI）与医院获得性急性肾损伤（Hospital-acquiredacutekidneyinjury，HA-AKI）患者的长期预后，探讨AKI患者3年全因死亡的预后因素。2.通过对新疆医科大学第一附属医院重症监护病房（ICU）的成人AKI患者的前瞻性研究，评估血清Klotho蛋白监测对成人AKI早期诊断及预测AKI患者预后的价值。探讨Klotho蛋白与AKI在临床中的关系。3.通过建立急性肾缺血再灌注损伤大鼠模型，并给予外源性补充Klotho蛋白，对比分析探讨Klotho蛋白对AKI的保护作用，研究在缺血再灌注AKI中，Klotho对内质网应激反应的影响作用。如果这些研究结果能够转入临床，则Klotho蛋白可能成为阻止和治疗急性肾损伤的有效治疗措施，改善患者预后的同时减轻国家和个人的经济负担，节省国家医疗资源。13 新疆医科大学博士学位论文第一部分新疆地区多中心AKI临床流行病学调查研究在住院患者和社区人群中，AKI是常见的临床综合征，病因复杂、预后差。研究[17]显示，15%-25%的AKI患者3个月后进入CKD3期，1年后有5%患者发展成尿毒症，需要长期透析治疗，给社会带来沉重的经济负担。2012年改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）发布了急性肾损伤临床实践指南，但是新疆地区生活环境、生活方式、医疗模式等与西方国家及我国东部地区存在差异，KDIGO急性肾损伤临床实践指南是否适应于新疆AKI患者还有待于临床验证。至今为止，新疆地区还未有针对AKI进行较大规模流行病学调查。本研究通过回顾性调查新疆地区4家综合性医院成人住院患者临床资料，根据KDIGO指南筛选确认AKI患者，分析上述患者的临床资料特点，了解新疆地区住院患者AKI发生的病因、流行病学特征、临床诊治情况和预后的危险因素。HA-AKI主要是针对CA-AKI而言，是指在入院时患者的肌酐处于正常水平，在[18,药物，感染，手术，医源性检查以及低灌注等医源性因素作用下导致的急性肾损伤19]。因此，在临床工作中，了解HA-AKI和CA-AKI的临床特点以及影响预后的主要因素，这有利于更好的管理和治疗，具有重要的临床指导意义。为此，本研究拟通过对新疆医科大学第一附属医院2013年1月、7月收治的急性肾损伤患者的临床资料作回顾性研究，并进行为期3年的临床随访，以探讨本中心CA-AKI与HA-AKI之间的长期预后差异及其影响因素。1研究内容与方法1.1研究设计本研究分为两个阶段进行：第一阶段，多中心、横断面、回顾性调查，调查2013年1月、7月成人住院患者临床资料，筛选出AKI，记录和分析临床资料。第二阶段，本中心随访研究，对本中心筛选出的AKI患者进行3年随访，计算全因死亡率，分析死亡原因。1.2研究对象应用医院网络系统，调查新疆医科大学第一附属医院、新疆昌吉州中医院、新疆和田地区人民医院、新疆伊犁州友谊医院2013年1月、7月成人住院患者临床资料，根据纳入、排除标准，筛选出AKI患者。1.2.1筛选步骤（1）利用医院网络系统，排除住院期间只有一次肾功能检查结果或无肾功能检14 第一部分·研究内容与方法查结果的成人患者。（2）在剩余的住院患者中，筛选出相邻两次血肌酐结果差值大于26.5μmol/L（0.3mg/d1）或较低值变化超过1.5倍的患者。（3）逐份调阅步骤2所筛选患者的病历，依据KDIGO2012年3月发布的AKI诊断标准和本次研究的纳入、排除标准，进一步确诊是否为AKI。1.2.2纳入标准（1）符合KDIGO2012年3月发布的AKI诊断标准：I.48小时内血肌酐升高超过26.5μmol/L（0.3mg/d1）；II.血肌酐升高超过基线1.5倍--确认或推测7天内发生；III.-1-1尿量＜0.5ml·kg·h，且持续6小时以上；（2）年龄≥18岁、性别不限；（3）有完整的入、出院记录，住院时间＞24小时。1.2.3.排除标准（1）慢性肾脏病5期；（2）已行肾脏切除手术；（3）已行肾脏移植手术；（4）开始肾脏替代治疗。1.3研究方法本研究采用多中心联合横断面回顾性调查。调查单位包括南、北疆4家综合性医院，其中昌吉州中医院是三级乙等医院，其余三家均为三级甲等医院。详细的筛选标准及调查内容以文字形式发放到各研究单位。对本中心组所有患者均予以随访，随访时间为3年，采取电话随访和门诊预约随访形式，以每3个月间隔随访1次，随访的主要内容为获取患者的准确死亡时间。本研究经过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会伦理审核（伦理审批号：20160714-08）。1.3.1记录住院AKI患者一般资料及实验室检查包括患者一般信息：姓名、性别、出生日期、就诊医院、科室（包括住院期间转科科室）、住院号、联系方式、入院日期、出院日期、入院诊断、出院诊断等；既往病史：高血压、动脉硬化、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、冠心病、肿瘤、脓毒血症、呼吸衰竭、心力衰竭、慢性肾脏病、肝硬化、外科疾病、外科手术、PCI手术等；辅助检查结果：血常规（白细胞、粒细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板等）；血生化（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素、尿素氮、血肌酐、血清白蛋白、血糖、血钾、血钙、血磷、二氧化碳结合力、血清胱抑素C）；凝血功能；C反应蛋白（CRP）；降钙素原（PCT）；脑利钠肽前体（BNP）；用CKD-EPI公式计算肾小球率过滤（eGFR）；尿液检查（包括小管功能检测）；肾脏B超（形态、15 新疆医科大学博士学位论文大小）、心电图、心脏彩超、X线胸片；血气分析（包括乳酸浓度）等。1.3.2记录AKI发生前的危险因素包括：1.肾脏低灌注因素：①血容量不足（包括呕吐、腹泻、消化道大出血、利尿、烧伤、肝肾综合征、肾病综合征、挤压伤、胰腺炎、营养不良等）；②心搏出量下降/心肾综合征（包括心肌梗死、心律不齐、缺血性心脏病、心肌病、瓣膜病、高心病、肺心病等）；③周围血管扩张（抗高血压药、麻醉药等药物、脓毒症、过敏等）；④肾脏血管收缩、扩张失衡（RAS阻断剂、去甲肾上腺素等）；⑤肾动脉机械性阻塞：（夹层形成、血肿压迫、血管创伤等）。2.肾毒性药物或毒物：氨基糖甙类抗生素、万古霉素、抗真菌类、抗病毒类、β-内酰胺类、利尿剂或脱水药、解热镇痛药、免疫抑制剂、化疗药、中药（包括斑蝥、蟾酥、雄黄、生草乌、生白附子、关木通、广防己、青木香、天仙藤、寻骨风、马兜铃、朱砂莲等其它可致肾毒性中药）、对比剂、结晶尿/管型尿、化学毒物、生物毒物等。3.合并其他严重疾病：多器官功能衰竭、弥散性血管内凝血、脓毒血症、恶性肿瘤晚期、急性呼吸窘迫综合征、休克、气管插管呼吸机治疗。4.外科手术、PCI术等。1.3.3明确AKI分期跟据KDIGO2012年3月发布AKI临床实践指南的分期标准，依据AKI发生期间血肌酐最高值，判断AKI的分期。表1-1AKI分期标准Table1-1AKIstagingcriteria分期血肌酐尿量-1-11基础值的1.5-1.9倍，或增高≥0.3mg/d1（≥26.5μmol/L）＜0.5ml·kg·h，持续6-12h-1-12基础值的2.0-2.9倍＜0.5ml·kg·h，持续≥12h-1-13基础值的3.0倍，或血肌酐增加至≥4.0mg/d1（353.6μmol/L），＜0.3ml·kg·h，持续≥24h或开始肾脏替代治疗或无尿≥12h1.3.4分析AKI病因根据肾脏损伤部位，病因分类分为肾前性、肾性及肾后性。肾前性AKI指各种原因引起的肾脏绝对或相对灌注不足导致的AKI。具有以下任意一条可判定为肾实质性AKI：1.典型的急性肾小管坏死临床表现（少尿期-多尿期等）；2.典型的肾小管功能损害临床表现（肾性糖尿、肾小管酸中毒、肾小管源性蛋白尿等）；3.急性/急进性肾炎综合征；4.系统性红斑狼疮临床活动；5.系统性血管炎临床活动；6.血栓性微血管病（包括恶性高血压、溶血性尿毒症综合征、血栓性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征等）；7.肾梗死或肾皮质坏死；8.造影剂肾病。肾后性AKI指各种原因引起的尿路16 第一部分·研究内容与方法梗阻导致的AKI。1.3.5记录AKI治疗方案包括补液治疗、利尿剂应用、糖皮质激素使用、其他药物及肾脏替代治疗等。1.3.6判断AKI的预后按照患者出院时状态，预后分为：1）肾功能恢复：患者出院时脱离透析，肾功[20]能恢复，血肌酐（Scr）下降到AKI发生前基线水平或更低；对于发生在CKD基础上的AKI，则患者Scr需降至发生AKI之前水平；2）肾功能未恢复（未透析）：患者脱离透析治疗，但Scr未完全恢复正常；3）持续透析：出院时仍需维持透析治疗。（4）死亡。1.3.7相关定义及诊断标准1.3.7.1漏诊和延迟诊断的定义漏诊定义：Scr的变化被误诊为慢性肾功能不全；或Scr变化达到AKI诊断标准，但是临床未予重视，以致住院期间未予相应的诊断和干预。延迟诊断定义：Scr变化已达到AKI诊断标准，临床未能在病情变化当天作出正确诊断，但在住院后期给予相应诊断或干预，或出院诊断中作出AKI诊断。1.3.7.2急性肾损伤的伴随症状定义（1）器官功能障碍综合征（Multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS）是指在严重感染、创伤或大手术等急性疾病过程中，同时或相继并发一个以上系统或（和）器官的急性功能障碍或衰竭，多器官功能障碍综合征发病的特点是继发性、顺序性、和进行性。（2）脓毒血症是感染导致的生理性、病理性和生物化学性异常综合征，是宿主对感染的全身炎症反应，导致危及生命的器官功能障碍。（3）弥散性血管内凝血（DisseminatedIntravascularCoagulation，DIC）系不同病因导致局部损害而出现以血管内凝血为特征的一种继发性综合征，它既可由微血管系统受损而引起，亦可导致微血管系统损伤，当其严重时可致脏器功能衰竭。（4）急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）是由肺内原因和/或肺外原因引起的，以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征，因高病死率而倍受关注。急性呼吸窘迫综合征的病因繁多，不同病因所致急性呼吸窘迫综合征发病机制也各有不同。临床表现多呈急性起病、呼吸窘迫、以及难以用常规氧疗纠正的低氧血症等。17 新疆医科大学博士学位论文表1-2MODS诊断标准Table1-2MODSdiagnosticcriteria系统或器官诊断标准循环系统收缩压低于90mmHg，持续1h以上，或需药物支持使循环稳定呼吸系统急性起病，PaO2/FiO2≤200mmHg，胸片双肺浸润，PAWP≤18mmHg或无左房压力升高的证据肾脏肌酐＞177μmol/L伴有少尿或多尿，或需血液净化治疗肝脏胆红素＞34μmol/L，转氨酶升高＞2倍正常值，或有肝昏迷胃肠上消化道出血＞400ml/24h，消化道穿孔或坏死，胃肠蠕动消失不能耐受食物＞5天血液血小板＜50×109/L或降低25%，或出现DIC代谢不能为机体提供能量，糖耐量降低，需用胰岛素；骨骼肌萎缩、无力中枢神经系统格拉斯哥昏迷评分＜7分1.3.7.3急性肾损伤的病因诊断标准或定义（1）急性肾小管坏死（ATN）由于各种病因引起肾缺血或肾毒性损害导致肾功能急骤、进行性减退而出现的临床综合征。经补液扩容后尿量仍不增多；血尿素氮、肌酐迅速升高，肾小球滤过率在短时间内（数小时至数日）下降50%以上，同时双肾体积无缩小；多无严重贫血，血红蛋白大于80g/L，并除外失血或溶血性；排除肾前性或肾后性和其他肾脏病所致AKI。（2）肾性糖尿指血糖正常，尿糖排出增加，重吸收减少。测血糖的同时检测尿糖，如血糖在正常范围内而尿糖多次阳性，可诊断肾性糖尿。（3）肾小管酸中毒是一组由于肾脏泌氢或重吸收碳酸氢盐的能力下降而引起的阴离子间隙正常的代谢性酸中毒。（4）急性肾炎综合征以血尿、蛋白尿、水肿和高血压和一过性急性肾损伤为主要临床表现的综合征。（5）系统性红斑狼疮（SLE）临床活动评分SLEDAI评分：0-4分基本无活动，5-9分轻度活动，10-14分中度活动，＞=15分重度活动。18 第一部分·研究内容与方法表1-3SLE临床活动评分表（SLEDAI）Table1-3SLEclinicalactivityscore（SLEDAI）积分临床表现8癫痫发作：最近开始发作的，除外代谢、感染、药物所致8精神症状：严重紊乱干扰正常活动。除外尿毒症、药物影响8器质性脑病：智力的改变伴定向力、记忆力或其它智力功能的损害并出现反复不定的临床症状，至少同时有以下两项：感觉紊乱、不连贯的松散语言、失眠或白天瞌睡、精神运动性活动↑或↓。除外代谢、感染、药物所致8视觉障碍：SLE视网膜病变，除外高血压、感染、药物所致8颅神经病变：累及颅神经的新出现的感觉、运动神经病变8狼疮性头痛：严重持续性头痛，麻醉性止痛药无效8脑血管意外：新出现的脑血管意外。应除外动脉硬化8脉管炎：溃疡、坏疽、有触痛的手指小结节、甲周碎片状梗塞、出血或经活检、血管造影证实4关节炎：2个以上关节痛和炎性体征〈压痛、肿胀、渗出〉4肌炎：近端肌痛或无力伴CPK↑，或肌电图改变或活检证实4管型尿：HB、颗粒管型或RBC管型4血尿：＞5RBC/HP，除外结石、感染和其它原因4蛋白尿：＞0.5g/24h，新出现或近期↑4脓尿：＞5WBC/HP，除外感染2脱发：新出现或复发的异常斑片状或弥散性脱发2新出现皮疹：新出现或复发的炎症性皮疹2粘膜溃疡：新出现或复发的口腔或鼻粘膜溃疡2胸膜炎：胸膜炎性胸痛伴胸膜摩擦音、渗出或胸膜肥厚1发热：体温大于或等于38℃，排除感染原因1血小板减少：小于100x109/L（6）系统性血管炎临床活动评分采用伯明翰系统性血管炎活动性评分（BVAS），分值越高，临床疾病越活动。19 新疆医科大学博士学位论文表1-4系统性血管炎临床活动评分表（BVAS）Table1-4SystemicVasculitisClinicalActivityRating（BVAS）受累脏器和指标权重分数系统性表现3（最高总分）皮肤表现6（最高总分）粘膜/眼6（最高总分）耳鼻喉6（最高总分）胸部6（最高总分）心血管6（最高总分）腹部9（最高总分）肾脏12（最高总分）神经系统9（最高总分）（7）溶血尿毒症综合征是一种以微血管溶血性贫血、血小板减少和急性肾功能衰竭为特征的急性病症。急性期标志性的症状包括紫癜性皮疹、易激惹、嗜睡，之后出现少尿；再然后会出现脾大、轻度黄疸、肝大、肺水肿以及肾衰竭，部分病人会出现惊厥。（8）抗磷脂综合征符合至少1项临床标准和1项实验室标准：临床标准：①血管栓塞：任何组织或器官的动、静脉和小血管发生血栓≥1次。②异常妊娠：≥1次发生于妊娠10周或10周以上无法解释的形态学正常的胎儿死亡，或≥1次发生于妊娠34周之前因严重的先兆子痫、子痫或者明确的胎盘功能不全所致的形态学正常的新生儿早产，或≥3次发生于妊娠10周之前的无法解释的自发性流产，必须排除母体解剖或激素异常以及双亲染色体异常。实验室标准：①狼疮抗凝物至少2次阳性，间隔至少12周。②中/高滴度IgG/IgM型ACL至少检测2次，间隔至少12周。③型IgG/IgM抗β2GP1抗体至少检测2次，间隔至少12周。（9）造影剂肾病造影剂肾病即对比剂肾病，是指经过放射学造影后发生的急性肾功能损害，中国专家共识中造影剂肾病的诊断标准为：在无其他明确原因的情况下，在使用造影剂后2-7天，血清肌酐升高超过25%或绝对升高0.5mg/dl（44µmol/L）以上。20 第一部分·研究内容与方法1.3.7.4估算基线Scr[21]没有可靠基线Scr记录的患者，根据KDIGO指南推荐，假定患者的肾小球滤过-12-1率（eGFR）为75ml·min·（1.73m），应用MDRD公式反推基线Scr：-12-1-1.154-0.203eGFR=75ml·min·（1.73m）=186×（Scr/88.4）×（年龄）×（若为女性0.742）。1.3.7.5HA-AKI的判定标准：住院期间由于医源性治疗或检查等引起的急性肾损伤；CA-AKI的判定标准：医院外发生的急性肾损伤。1.3.8研究终点第一阶段研究以患者出院时间作为观察终点，主要观察终点事件为患者住院期间是否死亡，出院时肾功能状态。第二阶段研究以发病后3年为观察终点，主要观察终点事件为患者是否存活。1.4质量控制质控原则：新疆医科大学第一附属医院负责项目质量控制方法确定，统一研究的各项工作流程；负责对4个研究中心调查员进行培训；对各临床中心进行技术指导和定期监控。（1）病例报告表（CRF）填写：由研究者填写，填写务必完整，无漏填错填，字迹清楚到位。每个入选病例必须完成病例报告表。完成的病例报告表由临床监查员审查后，进行数据录入与管理。（2）数据的录入与修改：数据由各中心统一录入管理。每一份CRF的数据需核对、无误，同时检查没有逻辑错误。（3）数据锁定：在数据审核并确认建立的数据库正确后，由主要研究者、统计分析人员对数据进行锁定。锁定后的数据文件不再做改动。1.5统计方法计量资料符合正态分布者用χ±s表示，组间比较采用t检验，不符合正态分布者用中位数和四分位数间距表示；计数资料采用用频数和率表示，组间比较采用卡方检验；等级资料两组比较采用秩和检验。将单因素分析有统计学意义的自变量纳入多因素二分类logistics回归分析，对漏诊原因进行分析。应用单因素和多因素Cox回归分析影响AKI患者死亡的危险因素。并用Cox回归分析绘制AKI患者住院期间的生存曲线。采用logRank检验比较HA-AKI组和CA-AKI组两组累积死亡率，应用多因素Cox回归方法分析影响急性肾损伤患者3年预后的危险因素，自变量包括年龄，性别，住院天数、基础内科疾病，血常规、血生化以及危重状态等，选取的自变量为两组单因素比较存在差异的变量，采用逐步回归法纳入分析。所有数据采用SPSS22.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。21 新疆医科大学博士学位论文2结果2.1AKI临床流行病学调查2.1.1AKI患者人口学及一般临床资料特征共调查了32157例住院患者，按照纳入和排除标准，筛选出AKI患者722例，排除资料不完整者3例，最终719例患者纳入本研究。AKI总检出率2.25%。AKI患者中男性居多，共473例，占65.79%；平均年龄58.15±16.82岁，其中60-79岁发生AKI的比例最高，共320例，占住院AKI患者总数的44.51%，其次为40-59岁年龄段，共247例，占住院AKI患者总数的34.35%。根据AKI发生的时机，社区获得性AKI所占比例较大，占61.61%。见表1-5，表1-6，图1-1。在既往合并症中，高血压、糖尿病、心血管疾病分别占前3位，合并高血压患者251例，占40.55%，合并糖尿病患者120，占19.39%，合并心血管疾病49例，占7.92%，合并恶性肿瘤性疾病43例，占6.95%，合并慢性肾脏病34例，占5.49%。见表1-5。表1-5住院AKI患者临床资料特征Table1-5clinicaldatacharacteristicsofhospitalizedpatientswithAKI项目数据年龄（岁）58.15±16.82男[例（%）]473（65.79）CA-AKI[例（%）]443（61.61）住院天数9（9，31）住院费用（万）2.15（1.29，7.17）既往病史n=619高血压[例（%）]251（40.55）糖尿病[例（%）]120（19.39）心血管疾病[例（%）]49（7.92）恶性肿瘤[例（%）]43（6.95）慢性肾脏病[例（%）]34（5.49）基线Scr（μmol/L）85.44±81.0822 第一部分·结果表1-6住院AKI患者的年龄构成Table1-6AgecompositionofhospitalizedpatientswithAKI年龄例数比例（%）18-3910915.1640-5924734.3560-7932044.51≥80435.99合计719100图1-1住院AKI患者性别分布情况Figure1-1GenderdistributionofhospitalizedpatientswithAKI在科室分布情况中，有效数据642例，住院患者发生AKI的科室以内科系统科室为主，在所有科室中，最常发生AKI的科室为ICU，占17.60%，其次为心内科，占11.37%，肾内科位居第三，占7.79%。之后依次为神经外科占6.39%，心外科占5.76%，泌尿外科占4.98%，普外科占4.52%，感染科占4.21%，妇产科占3.89%，血液科占3.43%。提示上述10个科室为住院患者发生AKI的高危科室。见表1-7，图1-2。23 新疆医科大学博士学位论文表1-7住院AKI患者的科室分布情况Table1-7DepartmentdistributionofhospitalizedpatientswithAKI住院科室例数比例（%）ICU11317.60内科24738.47心内科7311.37肾内科507.79感染科274.21血液科223.43呼吸科182.80肿瘤内科162.49消化科152.34内分泌科121.87神经内科71.09风湿免疫科50.78皮肤科10.16中医科10.16外科17627.41神经外科416.39心外科375.76泌尿外科324.98普外科294.52骨科172.65胸外科91.40肿瘤外科71.09烧伤科20.31介入科20.31妇产科253.89其他科室8112.63合计64210024 第一部分·结果ICU心内科肾内科感染科血液科呼吸科3.89%12.63%肿瘤内科消化科17.60%内分泌科神经内科0.31%风湿免疫科皮肤科0.31%中医科神经外科1.09%心外科泌尿外科1.40%普外科骨科2.65%胸外科肿瘤外科烧伤科介入科11.37%妇产科其他科室4.52%4.98%7.79%5.76%6.39%4.21%0.16%3.43%0.16%2.34%2.49%2.80%0.78%1.09%1.87%图1-2住院AKI患者的科室分布情况Figure1-2DepartmentdistributionofhospitalizedpatientswithAKI在719例AKI患者中，AKI分期有效数据525例，其中AKI1期患者比例最高，341例，占64.95%，其次为AKI2期106例，占20.19%，AKI3期78例，占14.86%。见表1-8。表1-8住院AKI患者的分期Table1-8StageofhospitalizedpatientswithAKIAKI分期例数比例（%）1期34164.952期10620.193期7814.86总计5251002.1.2AKI病因和致病因素分析AKI病因分类中，有效数据653例，肾前性因素占主导，共338例，占51.76%，其次为肾实质性188例（28.79%）和肾后性127例（19.45）。结果见表1-9。25 新疆医科大学博士学位论文表1-9住院AKI患者病因分类情况Table1-9etiologicalclassificationofhospitalizedpatientswithAKI病因分类例数比例（%）肾前性33851.76肾实质性18828.79肾后性12719.45总计653100进一步对AKI的致病因素进行分析，肾前性AKI致病因素中心搏出量下降为首要因素，其次分别为血容量不足，心脏手术、机械通气、利尿剂使用等。具体情况如下：血容量不足228例，占41.45%，心搏出量下降267例（47.64%），周围血管扩张48例（8.73%），肾脏血管收缩5例（0.91%），利尿剂使用147例（26.73%），合并严重伴随疾病导致肾脏灌注不足，其中MODS77例（20.87%），DIC9例（2.44%），休克74例（14.63%），脓毒血症12例（3.25%），机械通气121例（32.79%），ARDS26例（7.05%），恶性肿瘤50例（13.55%），手术心脏手术91例（40.81%），骨科手术19例（8.52%），胸外科手术9例（4.04%），开腹手术38例（17.04%），神经外科手术27例（12.11%），妇产科手术25例（11.21%），泌尿系统手术17例（7.62%）。肾实质性AKI致病因素中，急性肾小管坏死为首要因素，其次依次为肾间质性因素，肾小球和肾脏微血管因素，肾血管因素。具体情况如下：急性肾小管坏死344例，占47.85%，肾间质性因素302例，占42%，肾小球和肾脏微血管因素53例，占7.37%，肾血管因素20例，占2.78%。结果见表1-10，图1-3，图1-4。表1-10住院AKI患者致病因素分析Table1-10PathogenicfactorsinhospitalizedpatientswithAKI因素例数比例（%）肾前性因素肾低灌注因素n=550血容量不足22841.45心搏出量下降26747.64周围血管扩张488.73肾脏血管收缩50.91利尿剂14726.7326 第一部分·结果因素例数比例（%）严重疾病状态n=369MODS7720.87DIC92.44休克5414.63脓毒血症123.25机械通气12132.79ARDS267.05恶性肿瘤5013.55手术n=223心脏手术9140.81骨科手术198.52胸外科手术94.04开腹手术3817.04神经外科手术2712.11妇产科手术2511.21泌尿系统手术177.62肾实质性因素n=719急性肾小管坏死34447.85肾间质性因素30242.00抗生素12217.00利尿剂14720.4化疗药111.5对比剂192.6毒物31.08肾小球和肾脏微血管因素537.37肾血管因素202.7827 新疆医科大学博士学位论文肾脏血DIC脓毒血症胸外科手术急性呼吸窘迫综合征管收缩0.74%0.98%1.22%2.13%泌尿系统0.27%手术骨科手术2.30%2.57%周围血管扩张心搏出量下降2.63%PCI手术14.36%3.11%妇产科手术3.38%神经外科手术血容量不足3.65%12.50%恶性肿瘤4.09%休克4.41%心脏手术12.30%开腹手术5.14%MODS6.29%机械通气9.89%利尿剂8.06%图1-3肾前性AKI致病因素分析Figure1-3AnalysisofriskfactorsforprerenalAKI图1-4肾实质性AKI致病因素分析Figure1-4AnalysisofriskfactorsforrenalparenchymaAKI2.1.3AKI诊断情况分析AKI诊断情况分析中，有效数据557例，总的漏诊率达73.1%（407/557），及时诊断22.4%（125例），延迟诊断4.5%（25例）。结果见表1-11。2.1.4AKI患者短期预后情况分析2.1.4.1AKI患者短期预后情况719例AKI患者中，死亡人数92人，总死亡率为12.8%。出院时存活的AKI患者预28 第一部分·结果后分析中，收集到有效数据共计323例，出院时肾功能恢复患者占43.7%（141例），肾功能未完全恢复，但未持续透析的患者占40.2%（130例），出院时仍在维持透析的患者占16.4%（53例）。见图1-5。表1-11住院AKI患者诊断情况分析Table1-11RecognitionofAKIbyphysiciansduringhospitalstay诊断情况例数比例（%）及时诊断12522.4延迟诊断254.5漏诊40773.1总计557100图1-5AKI患者短期预后情况Figure1-5Short-termprognosisofAKIpatients2.1.4.2AKI患者住院期间死亡的相关因素分析单因素Cox回归模型分析针对AKI患者住院期间死亡的主要危险因素进行单因素分析，进行分析的因素有：中心、CA-AKI、性别、年龄、住院科室（ICU、内科、外科、妇产科、其他科室）、既往病史（高血压、糖尿病、冠心病、恶性肿瘤、CKD史）、肾脏低灌注因素（血容量不足、心搏出量下降、周围血管扩张、肾脏血管收缩）、肾毒性药物、疾病严重状态（MODS、DIC、脓毒血症、休克、ARDS、机械通气）、外科手术、PCI手术、肾前性、肾后性、肾实质性、AKI分期（1期、2期、3期）。结果显示，CA-AKI、MODS、DIC、肾后性、肾实质性5个危险因素对急性肾损伤患者短期预后中差异有统计学意义（P＜0.05）。住院科室中的内科、妇产科及致病因素中29 新疆医科大学博士学位论文的休克状态变量P＜0.1，可能为影响预后的危险因素。见表1-12。表1-12AKI患者住院期间死亡相关因素的单因素cox回归分析Table1-12Univariatecoxregressionanalysisforfactorsassociatedwithall-causein-hospitalmortalityinAKI变量分类BSEWaldPOR95.0%CI中心外中心0.20.3570.3150.5751.2220.607-2.462院内外院外-2.5990.52224.7820.0000.0740.027-0.207性别女0.1140.2930.1520.6961.1210.632-1.989年龄-0.0040.0080.1850.6670.9960.98-1.013住院科室ICU1.000内科1.1380.6023.5730.0593.1200.959-10.151外科0.8290.5712.110.1462.2920.749-7.017妇产科1.0300.5583.4050.0652.80.938-8.359其他科室1.3870.8762.5060.1134.0010.719-22.279高血压是-0.1280.2950.1870.6650.8800.493-1.570糖尿病是0.4210.3231.6940.1931.5230.808-2.871冠心病是0.5360.4361.5070.221.7090.726-4.019恶性肿瘤是-1.3361.0111.7450.1860.2630.036-1.908CKD史是-0.2460.7230.1160.7330.7820.190-3.222血容量不足是0.4090.2832.0860.1491.5050.864-2.620心搏出量下降是-0.3550.2881.5230.2170.7010.399-1.232周围血管扩张是0.2180.4410.2460.621.2440.524-2.951肾脏血管收缩是-0.0061.0770.0000.9960.9940.121-8.199肾毒性药物是-0.1450.3150.2120.6450.8650.466-1.604MODS是0.7540.3145.770.0162.1251.149-3.932DIC是1.3790.459.3840.0023.9711.643-9.595脓毒血症是-0.7610.7381.0640.3020.4670.110-1.984休克是0.6220.3393.3680.0661.8620.959-3.61630 第一部分·结果变量分类BSEWaldPOR95.0%CIARDS是0.2070.3840.087-1.699机械通气是0.0571.7870.982-3.250外科手术是0.0440.7630.0030.9541.0450.234-4.660PCI手术是-3.1663.9920.6290.4280.0420.000-105.347肾前性是0.3190.360.7860.3751.3760.679-2.789肾后性是-3.5161.4495.8850.0150.0300.002-0.509肾实质性是0.6180.2924.4750.0341.8541.046-3.286AKI分期1期1.0002期0.3030.3560.7250.3951.3540.674-2.7233期-0.6210.5351.3460.2460.5380.188-1.534多因素Cox回归模型分析采用Cox比例风险模型分析，将内科、妇产科、DIC也带入模型中分析，最后进入主效应方程的因素为住院科室中的妇产科、DIC、休克（P＜0.05）。见表1-13，见图1-6。表1-13AKI患者住院期间死亡相关因素的多因素cox回归分析Table1-13Multivariatecoxregressionanalysisforfactorsassociatedwithall-causein-hospitalmortalityinAKI变量分类BSEWaldPOR95%CI住院科室ICU1.000内科0.5410.5341.0290.3101.7180.604-4.889外科0.6560.5101.6540.1981.9270.709-5.236妇产科3.3241.1827.9100.00527.7732.739-281.602其他科室0.0320.7210.0020.9641.0330.251-4.243MODS是0.0560.5190.0120.9141.0580.382-2.928DIC是1.5080.5936.4600.0114.5161.412-14.443休克是1.2990.4269.2860.0023.6661.590-8.455肾实质性是0.6220.5551.2550.2631.8620.628-5.52831 新疆医科大学博士学位论文图1-6AKI患者住院期间生存曲线（Cox回归）Figure1-6SurvivalcurveofhospitalizedAKIpatients(Coxregression)2.1.5缺失数据病例集代表性分析所有患者的年龄和性别数据完整，将年龄及性别作为衡量指标，分析住院科室、既往病史、肾脏低灌注、严重疾病状态、手术及AKI分期有效数据集的代表性意义。结果显示住院科室、既往病史、肾脏低灌注、严重疾病状态、手术及AKI分期在有效数据病例集和缺失数据病例集两组间差异均无统计学意义（P＞0.05），可以认为有效数据病例集具有代表性。见表1-14。表1-14缺失数据病例集代表性分析Table1-14Representativeofmissingdatacase-setanalysis因素指标有效数据集缺失数据集统计量P住院科室年龄（岁）57.92±16.5559.00±14.93-0.5430.587男[例（%）]428（59.5）45（6.3）2.0670.151既往病史年龄（岁）57.59±16.4960.80±15.49-1.8180.07男[例（%）]414（57.6）59（8.2）2.3760.123肾脏低灌注因素年龄（岁）58.05±15.9158.02±17.880.0220.983男[例（%）]370（51.5）103（14.3）2.2980.130严重疾病状态年龄（岁）57.95±16.1458.13±16.65-0.1430.886男[例（%）]237（33.0）236（32.8）0.8180.366手术年龄（岁）58.79±16.3257.70±16.410.8250.410男[例（%）]146（20.3）327（45.5）0.0140.905AKI分期年龄（岁）57.38±16.6559.81±15.53-1.7610.079男[例（%）]346（48.1）127（17.7）0.0120.91232 第一部分·结果2.2HA-AKI和CA-AKI的长期预后分析2.2.1HA-AKI和CA-AKI的临床特点比较本中心544例AKI患者中，顺利随访的患者有有352例，其中HA-AKI为139例，CA-AKI为213例。CA-AKI组患者的平均年龄显著高于HA-AKI组（P＜0.05）；确诊时两组患者的基础Scr水平无显著差异，而Scr峰值差异有显著性（P＜0.05）。两组患者MODS、休克和脓毒血症比例差异无显著性，机械通气比率和手术比例差异有显著性（P＜0.05）。在基础疾病方面，两组患者在糖尿病比例、心血管疾病比例、慢性肝病比例、慢性肺病比例、恶性肿瘤比例和慢性肾脏病比例差异无统计学意义，高血压病比例差异有显著性（P＜0.05）。139例HA-AKI中25.9%（36例）为内科患者，33.1%（46例）为外科患者，213例CA-AKI中39.4%（84例）内科患者，15%（32例）为外科患者，两组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。HA-AKI中25.2%（35例）为重症监护室患者，15.8%（22例）患者来自其他科室，CA-AKI中24.4%（52例）为重症监护室患者，21.1%（45例）患者来自其他科室，差异有统计学意义（P＜0.05）。CA-AKI肾前性、肾性和肾后性比例分别为43.2%（92例）、49.3%（105）和7.5%（16例）；HA-AKI分别为82%（114例）、16.6%（23例）和1.4%（2例），差异均有统计学意义（P＜0.05）。CA-AKI中AKI1期和3期的比例分别为54%（115例）和20.6%（44例），HA-AKI中AKI1期和3期的比例65.5%（91例）和10.8%（15例），差异均有统计学意义（P＜0.05）；而两组患者在AKIIII期比例差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1-15。表1-15CA-AKI组与HA-AKI组患者临床特点比较Table15ComparisonofclinicalcharacteristicsbetweenHA-AKIandCA-AKIpatientsCA-AKI组HA-AKI组项目检验值P值（n=213）（n=139）年龄（岁，x±s）63.56±16.8956.06±15.82-4.1700.000男[例（%）]146（68.5）99（71.2）0.2850.636入院科室内科[例（%）]84（39.4）36（25.9）8.1430.017外科[例（%）]32（15）46（33.1）ICU[例（%）]52（24.4）35（25.2）其他[例（%）]45（21.1）22（15.8）33 新疆医科大学博士学位论文CA-AKI组HA-AKI组项目检验值P值（n=213）（n=139）住院天数（d）28.11±26.9120.18±15.771.6490.102既往病史高血压[例（%）]88（41.3）39（28.1）6.4100.011糖尿病[例（%）]48（22.5）21（15.1）2.9440.086冠状动脉疾病[例（%）]19（8.9）11（7.9）0.1090.741慢性肝病[例（%）]16（7.5）18（12.9）2.8500.091慢性肺病[例（%）]11（5.2）4（2.9）1.0780.299恶性肿瘤[例（%）]15（7.0）5（3.6）1.8630.172慢性肾脏病[例（%）]14（6.6）5（3.6）1.4580.227病因分类肾前性[例（%）]92（43.2）114（82）42.2130.000肾性[例（%）]105（49.3）23（16.6）肾后性[例（%）]16（7.5）2（1.4）疾病严重状态MODS[例（%）]14（6.6）11（7.9）0.2290.632脓毒血症[例（%）]6（2.8）1（0.7）1.8990.168休克[例（%）]20（9.4）14（10.1）0.0450.832机械通气[例（%）]17（8.0）30（21.6）13.4500.000手术[例（%）]45（21.1）74（53.2）38.7550.000基线Scr（μmol/L）84.561±18.5888.52±13.231.9240.056Scr峰值（μmol/L）208.07±149.09163.10±127.30-2.9250.004AKI分期1期[例（%）]115（54）91（65.5）4.88240.0272期[例（%）]54（25.4）33（23.7）3期[例（%）]44（20.6）15（10.8）2.2.2HA-AKI和CA-AKI两组患者的预后比较CA-AKI组中患者的在30天，3个月，1年，2年和3年的不同时间点的累积死亡率34 第一部分·结果分别为19.2%、31.5%、41.8%、54%和60.1%；而HA-AKI组中患者的不同时间点的累积死亡率分别为29.5%、43.2%、56.8%、62.6%和64%。两组患者在30天，3个月，1年的累积死亡率方面差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1-7。进一步行logRank检验显示，两组1年全因死亡率分布有统计学意义（P＜0.05）差异，3年全因死亡率分布的差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1-8。图1-7两组患者累积死亡比较Figure7Comparisonofcumulativemortalitybetweenthetwogroups22*与CA-AKI组相比，χ=4.943，P=0.026；#与CA-AKI组相比，χ=5.001，P=0.025；2Δ与CA-AKI组相比，χ=7，637，P=0.006；图1-8两组累积生存率的比较Figure8Comparisonofcumulativesurvivalratesbetweenthetwogroups2.2.3AKI患者3年预后的多因素Cox回归模型分析多因素回归分析显示，与AKI患者3年预后相关的危险因素包括MODS评分，总胆固醇，血浆白蛋白，中性粒细胞与淋巴细胞比值，血小板量，平均动脉压，见表1-16。35 新疆医科大学博士学位论文表1-16AKI患者3年预后的多因素Cox分析Table1-16MultivariateCoxregressionanalysisfor3-yearoutcomesinpatientswithAKI因素WaldP值RR95%CIMODS评分3.8980.0492.5211.007-6.265总胆固醇7.5850.0064.7351.567-14.318血浆白蛋白18.4260.00010.5233.592-30.805中性粒细胞与淋巴细4.5780.0323.9201.095-7.751胞比值血小板量6.0780.0145.0261.393-18.142平均动脉压18.5940.00011.5733.803-15.2173讨论急性肾损伤（AKI）在世界范围内的死亡率和发病率都很高。国际肾脏病协会（ISN）因此提出「0by25」的全球目标：即到2025年前，没有一位患者死于未治疗的急性肾衰竭。新疆是西北地区少数名族聚集区，地域广阔，南、北疆地区自然环境、社会及经济因素均有差别，不同地区AKI的发生、疾病特征、诊断及治疗可能存在差异，KDIGO关于急性肾损伤临床实践指南是否适应于新疆AKI患者尚不明确。本次研究联合新疆地区多家综合性医院，调查范围覆盖南疆（和田地区人民医院）、北疆（伊犁州友谊医院）、首府及周边城市（新疆医科大学第一附属医院、昌吉州中医医院），具有新疆地区代表性。针对AKI进行较大规模临床流行病学调查，分析AKI的疾病特征，以了解新疆地区AKI的重大负担。[3,22,23]既往国内关于AKI的回顾性流行病学调查中，依据不同的AKI诊断标准，AKI检出率在0.32%-3.2%，本研究依据KDIGO中AKI诊断标准，成人患者中AKI总检出率为2.25%，与上述研究中AKD诊断标准的AKI检出率相近。本次研究结果显示，AKI患者中男性居多，共473例，占65.79%；平均年龄58.15±16.82岁，其中60-79岁发生AKI的比例最高，共320例，占住院AKI患者总数的44.51%，其次为40-59岁年龄段，共247例，占住院AKI患者总数的34.35%。提示中老年男性住院人群是AKI发生的高危人群。美国一项调查急性肾功能衰竭（ARF）的发[24]病率和死亡率的研究显示，ARF与年龄较大，男性和黑人种族密切相关。这个年龄段以上的住院病人基础疾病多，生理性肾功能减退、肾脏储备功能降低，代偿能[24]力下降等因素与AKI高发密切相关。研究结果显示，根据AKI发生的时机，CA-AKI所占比例较大，占61.61%。既往36 新疆医科大学博士学位论文[25,26]国外文献显示，所有AKI患者中CA-AKI占70%-82%，国内研究显示社区获得性[27,28]AKI占所有AKI患者的56%-70%。与本次研究结果相似。本研究发现，高血压、糖尿病、心血管疾病及慢性肾脏病及恶性肿瘤为AKI患者主要合并的基础疾病。上述慢性基础疾病可继发慢性肾脏病，如糖尿病肾病及高血压肾损害等，此类患者在应激条件下更易发生慢性肾脏病基础上的急性肾损伤。AKI可以发生在任何科室。本次研究结果显示，住院患者发生AKI的科室以内科系统科室为主，与国内外研究结果相似。在所有科室中，最常发生AKI的科室为ICU，其次为心内科，肾内科位居第三。之后依次为神经外科，心外科，泌尿外科，普外科，感染科，妇产科，血液科。提示上述10个科室为住院患者发生AKI的高危科室。ICU收治的患者一般病情复杂危重，容易累及其他脏器，引起功能异常；前述更多AKI患者合并有慢性疾病，而内科治疗是慢性疾病的主要干预措施；外科患者在住院期间更易进行外科手术或相关有创操作，手术操作过程中易造成肾脏组织的急性缺血再灌注损伤，从而引起AKI。因此上述科室住院患者易发生AKI。在本研究中，AKI的病因以肾前性为主，其次依次为肾实质性和肾后性。国外多[29]中心调查报道显示，AKI的病因分类中肾前性占21%，急性肾小管坏死占44%，肾[30]后性占10%。国内单中心调查显示肾前性AKI占51.7%，肾性AKI占45%，肾后性AKI占3.3%。本次调查结果肾前性病因所占比例与国内研究结果相似，但肾后性病因与国内外相比所占比例较高，可能与新疆地区泌尿系结石高发有关。致病因素的研究中，肾前性AKI致病因素以心搏出量下降（包括心肌梗死、心律不齐、肺心病、高心病等）为首要因素，其次分别为血容量不足（包括体液丢失、大出血、肝肾综合征等），心脏手术、机械通气、利尿剂使用等。提示并发心肺疾病及外科手术等是新疆地区肾前性AKI发生的主要病因。肾实质性AKI致病因素中，急性肾小管坏死为首要因素，其次依次为肾间质性因素，肾小球和肾脏微血管因素，肾血管因素。急性肾小管坏死指肾小管上皮细胞损伤，常由缺血所致，也可由肾毒性药物引起。本次研究显示在所有AKI患者中有13.98%的患者与使用抗生素有关，8.60%的患者与使用抗病毒药物有关，其他3.49%和6.45%的患者分别与使用化疗药物和对比剂有关。国[31]际报道药物性AKI比例为20%-25%，与本次研究结果接近。因此，针对高危人群应该严格掌握肾毒性药物的适应症，强调个体化用药，合理用药。[32]陈平等单中心调查显示漏诊率为49.61%，高血压病史、RRT史和少尿史是AKI[33]患者漏诊的独立影响因素。毛敏等回顾性调查了非肾科成年患者AKI的漏诊率为[34]49.61%，外科漏诊率达62.96%，内科漏诊率为50%。程小燕等在单中心AKI流行病学调查研究中发现AKI漏诊率为52.7%，延迟诊断率为3.3%。本研究亦发现新疆地区AKI漏诊较高，总体漏诊率达72.4%，漏诊率较上述研究结果高。本课题组李财昌[35]等针对AKI漏诊原因做了相应的分析，对本中心110名临床医师进行了问卷调查，37 新疆医科大学博士学位论文结果发现了解AKI最新诊断标准的医师有45名，占40.9%，其中以ICU医师所占比例最高，其次是普外科医生，消化科居第三，心内科、泌尿外科、神经外科并列第四。能在临床诊疗过程中持续关注Scr水平变化的医生有102名，占92.7%。对AKI漏诊原因进行多因素logistics回归分析后发现：脓毒血症、解热镇痛药物史、脑血管病、多器官功能衰竭是急性肾损伤患者漏诊的独立危险因素。综合考虑AKI漏诊的原因除外临床医师对AKI疾病了解程度不够以外，还与发生AKI时患者伴发其他疾病的严重程度有关，临床医师可能更多考虑肾脏以外其他脏器的损害而忽略了AKI的诊断。[3]AKI的短期预后差。杨莉等回顾性调查结果显示AKI院内全因死亡率为12.4%，本次调查显示新疆地区AKI患者院内全因死亡率为12.8%，结果非常近似。出院时存活的AKI患者预后分析中，出院时肾功能恢复患者只占43.7%，肾功能未完全恢复，但未持续透析的患者占40.2%，出院时仍在维持透析的患者占16.4%。单因素Cox回归模型分析AKI患者住院期间死亡的主要危险因素，进行分析的因素有：中心、CA-AKI、性别、年龄、住院科室（ICU、内科、外科、妇产科、其他科室）、既往病史（高血压、糖尿病、冠心病、恶性肿瘤、CKD史）、肾脏低灌注因素（血容量不足、心搏出量下降、周围血管扩张、肾脏血管收缩）、肾毒性药物、疾病严重状态（MODS、DIC、脓毒血症、休克、急性呼吸窘迫综合征、机械通气）、外科手术、PCI手术、肾前性、肾后性、肾实质性、AKI分期（1期、2期、3期）。结果显示，CA-AKI、MODS、DIC、肾后性、肾实质性5个危险因素对急性肾损伤患者短期预后中差异有统计学意义（P＜0.05）。住院科室中的内科、妇产科及致病因素中的休克状态变量P＜0.1，可能为影响预后的危险因素。多因素Cox回归模型分析采用Cox比例风险模型分析，将内科、妇产科、DIC也带入模型中分析，最后进入主效应方程的因素为住院科室中的妇产科、DIC、休克。本研究结果显示，合并休克、DIC是AKI患者死亡的独立危险因素，提示在AKI治疗过程中应尽可能改善肾组织血流灌注，预防严重疾病状态。国外研究报[36,37]道妊娠相关性AKI死亡率为28.3%-30.9%，本次研究亦发现妇产科AKI患者死亡风险较大，是AKI死亡的独立危险因素。妊娠期机体发生一系列生理性变化，对正常孕产妇来说，由于肾血流量增加，肾小球滤过率增加，孕期血肌酐平均浓度从70μmol/L降低至44μmol/L，孕妇血肌酐水平大于71μmol/L时即高度提示肾功能损害[38]。因此在临床上可能会忽略早期肾功能异常的孕妇。妊娠相关性AKI病因复杂，妊娠期高血压、重症感染、严重产科出血、药物损害等均易导致血肌酐的急剧升高。以上因素综合起来使妊娠相关性AKI的病情更加严重。本研究为回顾性调查研究，研究结果存在一定的局限性：对AKI的诊断主要依据血肌酐，忽略了尿量作为诊断依据的资料，可能导致研究结果偏倚；部分数据的缺失影响资料的完整性。本研究结果的代表性亟待前瞻性的多中心临床研究验证。本研究第二阶段将调查对象分为CA-AKI和HA-AKI。以往对HA-AKI的研究较38 新疆医科大学博士学位论文多，HA-AKI的发生率呈逐年上升趋势，影响着患者的生命以及预后，这可能与近年[39,40]来大量器官移植、有创检查等开展，以及大量抗生素和其他新的药物应用相关。有研究报道，HA-AKI的发病率约为1.9%，其中有7.5%的患者要接受血液净化治疗，[41,42]死亡率约为2.6%，是非HA-AKI患者者的10倍左右。另有研究表明，HA-AKI的[43,44]死亡率为62.7%，肾功能治愈率为20.5%左右。关于HA-AKI的死亡率和患病率的临床报道差异可能与入选标准，诊断标准、患者分布、医院级别以及重症监护患者[45,46]的比例的不同有关。实际上社区发生急性肾损伤患者显著多于住院患者，但对CA-AKI的研究较少。有研究报道，50204例病患进行8年左右的随访观察，发现79.4%[47]的急性肾损伤患者为CA-AKI。[48]杨莉等在2013年从全国22家教学医院和22家县市级医院中纳入了2，223，230例住院的成人患者（年龄≥18岁），根据2012年KDIGO标准定AKI。CA-AKI定义为患者在入院时即存在AKI。主要观察指标是院内全因死亡率和出院时的肾功能恢复率。确定了4136例CA-AKI患者，CA-AKI患者的检出率是1.11%，占总的AKI患者的比例是54.4%。CA-AKI患者的平均年龄是61.2±17.9岁，以男性为主（65.5%）。CA-AKI病因方面，2020名（48.8%）患者与肾功能灌注降低有关，1111名（26.9%）患者与肾实质疾病有关，499名（12.1%）患者与尿道梗阻有关。在可能导致肾损伤的致病因素中，肾脏低灌注（74.7%）和肾毒性药物（59.9%）最常见。CA-AKI患者的院内全因死亡率是7.3%（295/4068）。在3582名存活出院的患者中，1453名（40.6%）患者肾功能完全恢复，1358名（37.9%）患者肾功能部分恢复，771名（21.5%）患者肾功能未恢复。本研究发现CA-AKI的发病年龄为63岁左右，显著大于HA-AKI的平均发病年龄，可能是老年人的肾脏生理储备功能随着年龄增加而逐渐下降，并且老年患者常伴有糖尿病和高血压等慢性疾病，因此老年患者对于肾毒性和血流动力学变化造成的急性肾损伤较为敏感。CA-AKI多数为内科患者，而HA-AKI多数为外科患者，HA-AKI主要来自外科系统可能与近年开展的冠脉搭桥术，肝移植术等大量复杂手术，以及[49,50]有创检查和治疗相关。外科手术是造成AKI尤其是HA-AKI的另一重要原因。有[51]研究表明肝移植术后约有60%的患者发生AKI以上。本研究发现HA-AKI中一半以上患者为手术并发症，并且肾前性、肾性和肾后性的比例显著高于CA-AKI，表明术前避免液体摄入不足、术中减少液体丢失或者失血，加强围术期的处理，以及术后防治感染、避免肾毒性药物的应用有助于降低HA-AKI的发生。从患者的预后来看，HA-AKI患者的1年全因死亡率显著高于CA-AKI患者，差异有统计学意义（P＜0.05），两组之间的3年全因死亡率差异无统计学意义。并且HA-AKI的30天和3个月的累积死亡率也显著增高。这可能与HA-AKI患者的病情复杂以及严重相关。从患者的危重状态分析发现，HA-AKI患者较CA-AKI患者更容易发39 新疆医科大学博士学位论文生机械通气比率。部分专业人士认为CA-AKI患者的肾脏和患者生存率优于HA-AKI，[52]基于此DerMesropian等展开一项比较CA-AKI和HA-AKI的长期结局的研究。针对纽约州退伍军人事务部医院2004年至2005年住院的患者进行回顾性队列分析，将患者分为CA-AKI（n=560）组，HA-AKI（n=158）组和无AKI（NA）（n=2，320）组。使用风险，肾损伤，肾功能衰竭，肾功能丧失和终末期肾病（RIFLE）标准来定义AKI。主要研究终点为血清肌酐加倍，终末期肾病（ESRD），死亡以及三者的综合，次要研究终点为新发慢性肾脏病（CKD），肾功能恢复以及再次入院率。在出院后3年内确定累计的结果发生率。结果显示CA-AKI发生率是HA-AKI的3.5倍。与HA-AKI患者相比，CA-AKI患者的估计肾小球滤过率（71.3比61.1mL/min/1.73m（2），P＜0.001）和CKD患病率更低（42.3%比51.9%，P=0.03）。比HA-AKI更多的CA-AKI患者符合RIFLE标准（43.8比29.1%，P＜0.001）。到3年时，所检测的个体主要和次要结局没有差异（所有P＞0.05）。由此得出CA-AKI比HA-AKI更常见并且具有类似的长期后果的结论。上述结论与本次研究结果一致。对预后的多因素回归分析，与AKI患者3年预后相关的危险因素包括MODS评分，总胆固醇，血浆白蛋白，中性粒细胞与淋巴细胞比值，血小板，平均动脉压。这与[52]既往的研究报道结果相似。上述研究结果提示，避免患者出现呼吸衰竭或心功能衰竭等多脏器衰竭，重视患者的重要脏器的支持治疗，以及增加肾灌注压和加强营养支持，有可能为急性肾损伤的肾功能恢复争取时间并创造良好的条件，同时有利于提高患者的生存率。综述所述，CA-AKI与HA-AKI患者的各自临床特点有所不同，并且3年的长期预后无明显差异。MODS评分，总胆固醇，血浆白蛋白，中性粒细胞与淋巴细胞比值，血小板，平均动脉压等是AKI3年预后相关的独立危险因素。但是本研究为单中心研究，纳入的样本量较少，获得的结论仍需进一步国内相关研究的证实。未来多科室、多中心的合作研究有助于进一步提高急性肾损伤的临床诊治水平。4小结通过对新疆地区AKI患者的调查、随访研究，得出以下结论：4.1本研究依据KDIGO中AKI诊断标准，成人患者中AKI总检出率2.25%，与国内其他研究中的AKI检出率相近。4.2AKI以内科相关科室居多，其次为外科和ICU，与国内外研究结果相似。4.3新疆地区AKI的病因以肾前性为主，其次依次为肾实质性和肾后性。本次调查结果肾前性病因所占比例与国内研究结果相似，但肾后性病因与国内外相比所占比例较高。40 新疆医科大学博士学位论文4.4新疆地区AKI漏诊较高，总体漏诊率达72.4%。4.5新疆地区AKI患者院内全因死亡率为12.8%，合并休克、DIC是AKI患者死亡的独立危险因素。妇产科AKI患者死亡风险较大，是AKI死亡的独立危险因素。4.6单中心CA-AKI组与HA-AKI组患者3年的长期预后无明显差异。与AKI3年预后相关的独立危险因素包括MODS，总胆固醇，血浆白蛋白，中性粒细胞与淋巴细胞比值，血小板，平均动脉压等。41 新疆医科大学博士学位论文第二部分血清Klotho蛋白监测对AKI早期诊断及预后评估作用的初步研究本文第一部分研究结果显示，AKI诊断情况中总的漏诊率达73.1%，延迟诊断[48]4.5%，而及时诊断只有22.4%。杨莉等在研究中发现延迟识别AKI是AKI患者住院死亡的独立危险因素。因此，早期正确诊断AKI对改善AKI预后显得尤为重要和关键。急性肾损伤（AKI）常发生于重症监护病房（ICU）。大量临床资料显示，ICU患[53,54][55-57]者AKI的发生率为36%-67%，死亡率高达40%-70%。研究表明，AKI早期阶段是可逆的，如能达到早期诊断并及时治疗，则肾功能大多可以得到恢复。血肌酐（Scr）是目前临床最常用的AKI诊断指标，但其存在相对局限性，如当GFR正常或范围高值时，Scr并不敏感；Scr滞后于GFR变化；其他混杂因素可能会进一步延误甚至掩盖基于Scr标准的AKI诊断等。近年研究发现血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运[58]载蛋白（NGAL）对AKI的早期诊断价值优于Scr。NGAL因在AKI早期监测中的出色表现，被认为是目前最有潜在临床应用价值，是最有希望AKI早期识别、诊断、评估预后及指导意义的AKI早期干预生物标志物。分泌型Klotho主要表达于肾小管上皮细胞中，有研究表明，AKI动物模型中Klotho水平均有降低，且多发生在肾损伤早期，[59,60]提示Klotho可能成为早期诊断AKI新的生物学标志物。相关的大规模临床研究目前尚不多，国内单中心研究发现血清Klotho蛋白可能对心脏瓣膜术后极早期AKI的诊[61]断更有价值。我们采用前瞻性、单中心研究方法，通过检测ICU中AKI患者血清Klotho蛋白的变化，评价其早期诊断AKI的价值，并分析其与AKI预后的关系。1研究内容与方法1.1研究对象选择2016年7月1日至2016年8月31日期间在新疆医科大学第一附属医院ICU住院的成人患者为研究对象，包括重症监护室1病区（ICU1）、重症监护室2病区（ICU2）、呼吸重症监护室（RICU）、心脏重症监护室（CCU）、急诊重症监护室（EICU）、感染重症监护室。研究期间患者如多次入住ICU，只在第一次入住ICU时入选。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）有完整的入、出院记录，住院时间＞24h。排除标准：42 第二部分·研究内容与方法（1）入住ICU前或入住ICU时已有肾功能异常者；（2）有慢性肾脏病、透析治疗或肾移植病史者；[62]（3）Scr波动于53μmol/L以下者。依据患者在入住ICU期间是否发生AKI将患者分为AKI组和非AKI组。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理审批号：20160714⁃08）。所有入选者均签署知情同意书。1.2相关定义及诊断标准1.2.1AKI诊断标准同第一部分AKI诊断标准。1.2.2肾功能恢复定义患者在观察终点时脱离透析，肾功能恢复，Scr下降至AKI发生前基线水平或更[20][21]低。没有可靠基线Scr值记录者，根据KDIGO指南推荐，假定患者的肾小球滤过2率（eGFR）为75ml·min-1·（1.73m）-1，应用MDRD公式反推其基线Scr值：2eGFR=75ml·min-1·（1.73m）-1=186×（Scr/88.4）-1.154×（年龄）-0.203（女性×0.742）。1.2.3心力衰竭是指由于心脏的收缩功能和（或）舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心功能分级标准：Ⅰ级，患者患有心脏病但活动量不受限制，平时一般活动不引起疲乏、心悸、呼吸困难或心绞痛。Ⅱ级，心脏病患者的体力活动受到轻度的限制，休息时无自觉症状，但平时一般活动下可出现疲乏、心悸、呼吸困难或心绞痛。Ⅲ级，心脏病患者体力活动明显限制，小于平时一般活动即引起上述的症状。Ⅳ级，心脏病患者不能从事任何体力活动。休息状态下也出现心衰的症状，体力活动后加重。1.2.4肝硬化是指一种由不同病因长期作用于肝脏引起的慢性、进行性、弥漫性肝病的终末阶段。本文诊断肝硬化主要依据来自于患者入院诊断或出院诊断。1.3研究方法1.3.1资料收集收集患者的一般资料、实验室检查结果及预后情况等。一般资料包括性别、年龄、入院诊断、既往病史、伴随疾病等。实验室检查包括血常规、血生化、血气分析等。预后包括患者出院时肾功能是否完全恢复、患者是否存活等。1.3.2标本收集及检测患者入住ICU当日用抗凝管采集外周静脉血4ml，随后常规每天早8：00时采取4ml外周静脉血直至患者出院。其中2ml在留取标本后10～20min内离心（离心20min，43 新疆医科大学博士学位论文3,000×g），收集上清于-80℃冰箱保存，用于Klotho、NGAL的检测，另外2mL用于肾功能检测。在ICU住院期间每天至少进行1次肾功能检测，转出ICU后只检测出院当日的肾功能；所有患者均检测入住ICU当日的血清Klotho、NGAL浓度，确诊AKI的患者再次检测确诊当日的血清Klotho和NGAL浓度。血肌酐采用苦味酸法检测，参考值范围：53～115μmol/L。血Klotho、NGAL采用ELISA方法检测，试剂盒购自武汉华美公司，按照试剂盒说明书步骤操作，具体操作如下：1.3.2.1血清Klotho检测（1）仪器设备、型号及来源TM酶标仪xMarkBio-Rad微量移液器单道移液器、多道移液器大龙医疗设备有限公司电热恒温培养箱DNP-9272上海精宏试验设备有限公司微量振荡器MM-2金坛市医疗仪器厂（2）试剂盒组成试剂盒购自武汉华美公司，货号为CSB-E13235h，生产批号A13011652，规格为96T。具体组成如下：酶标板12×8标准品2瓶（冻干品）生物素标记抗体1×120μL/瓶（100×）辣根过氧化物酶标记亲和素1×120μL/瓶（100×）生物素标记抗体稀释液1×15mL/瓶辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液1×15mL/瓶样本稀释液1×50mL/瓶浓洗涤液1×20mL/瓶（25×）底物溶液1×10mL/瓶终止液1×10mL/瓶板贴4说明书1份44 第二部分·研究内容与方法（3）试剂配制1）标准品原液10ng/ml。Klotho检测试剂标曲梯度具体配制方法见表2-1。表2-1Klotho检测试剂标曲梯度配制方法Table2-1StandardreagentpreparationmethodofKlotho编号浓度（ng/ml）制备方法S7101000μL标准品S65250μLS7+250μL样本稀释液S52.5250μLS6+250μL样本稀释液S41.25250μLS5+250μL样本稀释液S30.625250μLS4+250μL样本稀释液S20.312250μLS3+250μL样本稀释液S10.156250μLS2+250μL样本稀释液空白0250μL样本稀释液2）洗液工作液：浓洗涤液按1：25倍用去离子水进行稀释。3）生物素标记抗体工作液：生物素标记抗体工作液按1：100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。使用前10分钟内配妥。4）辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：辣根过氧化物酶标记亲和素按1：100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。使用前10分钟内配妥。5）样本稀释：尿和血浆样本用样本稀释液做1：2稀释。（4）操作步骤1）将各种试剂移至室温（18-25℃）平衡至少30分钟，按前述方法配置试剂，备用。2）加样：分别设标准品孔、待测样本空。每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，附上板贴，37℃温育2小时。3）弃去液体，甩干，不用洗涤。4）每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。5）弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干。6）每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。7）弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干。8）依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15-30分钟。45 新疆医科大学博士学位论文9）依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。10）在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度值（OD值）。1.3.2.2血清NGAL检测（1）仪器设备同血清Klotho检测。（2）试剂盒组成同血清Klotho检测。（3）试剂配制1）标准品原液1000pg/ml。NGAL检测试剂标曲梯度具体配制方法见表2-2。表2-2NGAL检测试剂标曲梯度配制方法Table2-2StandardreagentpreparationmethodofNGAL编号浓度（pg/ml）制备方法S710001000μL标准品S6500250μLS7+250μL样本稀释液S5250250μLS6+250μL样本稀释液S4125250μLS5+250μL样本稀释液S362.5250μLS4+250μL样本稀释液S231.2250μLS3+250μL样本稀释液S115.6250μLS2+250μL样本稀释液空白0250μL样本稀释液2）洗液工作液：浓洗涤液按1：25倍用去离子水进行稀释。3）生物素标记抗体工作液：生物素标记抗体工作液按1：100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。使用前10分钟内配妥。4）辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：辣根过氧化物酶标记亲和素按1：100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。使用前10分钟内配妥。5）样本稀释：尿和血浆样本分别用样本稀释液做1：100与1：300稀释。1.3.2.4操作步骤同血清Klotho检测。1.3.3观察终点主要观察终点事件为在ICU住院期间发生AKI，以患者出院时间作为AKI预后观察终点；次要终点事件为患者出院时是否存活及肾功能是否完全恢复。46 新疆医科大学博士学位论文1.4统计方法χ±s采用SPSS22.0软件进行数据的统计学处理。符合正态分布计量资料采用表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布计量资料采用M（1/4，3/4）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率计算法。采用受试者工作特征曲线（ROC）方法评估血清Klotho、NGAL预测（早期诊断）AKI发生的敏感性和特异性；用Pearson相关分析确诊AKI时的Klotho水平与AKI发生后的峰值Scr、峰值eGFR、出院时Scr、出院时eGFR的相关关系。P＜0.05视为差异有统计学意义。2结果2.1AKI组与非AKI组患者基线资料比较2016年7月1日至2016年8月31日期间入住新疆医科大学第一附属医院ICU患者共1595例，依据入选标准及排除标准最终纳入本研究的患者150例，AKI组52例；非AKI组98例。AKI组既往有高血压病、心血管疾病、心力衰竭及接受外科手术比例、入住ICU时Scr、NGAL水平均高于非AKI组（均P＜0.05），AKI组基线eGFR、Klotho水平低于非AKI组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表2-3。表2-3AKI组与非AKI组患者基线资料比较Table2-3ComparisonofclinicalbaselinedatabetweenAKIandnon-AKIpatients项目非AKI组（n=98）AKI组（n=52）P值性别[男，例（%）]68（69.3）35（67.3）0.822年龄（岁）54.9±17.258.1±17.00.417既往病史[例（%）]高血压26（26.5）27（51.9）0.009糖尿病24（24.5）9（17.3）0.374心血管疾病12（12.5）17（32.6）0.014肿瘤20（20.8）8（15.3）0.364并发疾病[例（%）]MODS02（3.8）0.166心力衰竭04（7.7）0.048肝硬化4（4.2）00.141外科手术55（56.3）12（23.1）0.00047 新疆医科大学博士学位论文项目非AKI组（n=98）AKI组（n=52）P值eGFR114.7±34.183.2±31.60.000Scr（μmol/L）66±17.7285.68±18.460.000Klotho（ng/ml）2.22±0.321.12±0.270.000NGAL（ng/ml）46.43±12.24113.26±12.770.0002.2Scr及生物学标志物预测AKI的价值受试者工作特征曲线结果显示，入住ICU时Scr预测AKI发生的曲线下面积为0.792（95%CI为0.703～0.881），取值84.52μmol/L时，诊断AKI的灵敏度0.65，特异度0.80。入住ICU时血清Klotho单独预测AKI的曲线下面积为0.945（95%CI为0.892～0.997），取值1.76ng/mL时，诊断AKI的灵敏度0.92，特异度0.94。入住ICU时血清NGAL预测AKI的曲线下面积为0.965（95%CI为0.935～0.995），取值80.71ng/mL时，诊断AKI的灵敏度0.87，特异度0.96。见图1。Klotho联合Scr预测AKI的曲线下面积可提高至0.958（95%CI为0.915～1.000）。见表2-4，见图2-1，图2-2。表2-4不同生物学标志物诊断AKI的AUC值Table2-4ROC-AUCofdifferentbiomarkersfordiagnosisAKI项目最佳临界值灵敏度特异度AUC95%CIP值Scr84.520.650.800.7920.703~0.8810.000Klotho1.760.920.940.9450.892~0.9970.000NGAL80.710.870.960.9650.935~0.9950.000Scr+Klotho0.960.920.9580.915~1.0000.000图2-1Scr、Klotho及NGAL诊断AKI的ROC曲线Figure2-1ROCofdifferentbiomarkersfordiagnosisAKI48 新疆医科大学博士学位论文图2-2Scr和Klotho联合诊断AKI的ROC曲线Figure2-2ROCofScrcombinedwithKlothofordiagnosisAKI2.3血清Klotho水平预测AKI短期预后的价值AKI组患者院内死亡8例，非AKI组院内死亡0例，AKI组患者死亡率显著高于非AKI组（15.3%比0，P=0.014）。所有AKI患者至观察终点时，有19例（36.5%）患者肾功能恢复，其中包括1例死亡患者；33例（63.5%）肾功能未恢复患者，其中包括7例死亡患者。确诊AKI时的血清Klotho、NGAL、Scr水平在死亡组与存活组组间差异无统计学意义（P﹥0.05）。确诊AKI时的血清Klotho水平在肾功能恢复组与未恢复组的组间差异有统计学意义（P=0.047）；确诊AKI时的血清NGAL及Scr水平在肾功能恢复组与未恢复组间的差异无统计学意义（P﹥0.05）。见表2-5，表2-6。Pearson相关分析确诊AKI时的血清Klotho水平与AKI发生后的峰值Scr、峰值eGFR、出院时Scr、出院时eGFR的相关性，结果显示均无相关关系（均P﹥0.05）。见表2-7。表2-5存活组与死亡组患者确诊AKI时不同生物学标志物水平的比较Table2-5ComparisonofserumdifferentbiomarkerslevelsinthediagnosisofAKIbetweensurvivalandnon-survivalpatients存活组（n=44）死亡组（n=8）P值血Klotho1.47（1.31，1.59）1.42（1.31，1.56）0.630血NGAL96.73（93.45，118.07）99.79（88.34，110.81）0.723血Scr98（85.52，105.50）89（74.02，103）0.26249 新疆医科大学博士学位论文表2-6肾功能恢复组与未恢复组确诊AKI时不同生物学标志物水平的比较Table2-6ComparisonofserumdifferentbiomarkerslevelsinthediagnosisofAKIbetweenrenalfunctionrecoveryandnon-recoverypatients肾功能恢复组（n=19）肾功能未恢复组（n=33）P值血Klotho1.49（1.35，1.61）1.41（1.26，1.53）0.047血NGAL93.21（87.01，107.32）99.29（90.93，110.81）0.300Scr88.20（66.07，99.41）89（79，103.43）0.314表2-7确诊AKI时血清Klotho水平与Scr和eGFR的相关性分析Table2-7RelationshipofKlothoinserumwithScrandeGFR项目相关系数P值峰值Scr0.0260.853峰值eGFR-0.1270.368出院时Scr0.2430.082出院时eGFR-0.1870.184注：峰值eGFR是指AKI发生后峰值Scr时计算所得的eGFR值。3讨论AKI是临床常见的危急重症，但临床上常常诊断延迟，治疗手段欠缺，预后较差。Scr和尿量是目前临床最常用于诊断AKI的指标，而Scr水平常受性别、年龄、体重、进食、肌肉量、肌代谢及药物等因素的影响，尿量的评估须排除容量不足、利尿剂使用等影响因素。尿量是一个重要的临床指标，但跟Scr一样并非肾脏特异性，事实上，尿路可能持续至肾功能几乎停止，同样，少尿可出现在长时间禁食、低血容量、术后、应激、疼痛或外伤之后。用于AKI的KDIGO标准是基于少尿最少6小时，部分专家质疑这个规定的阈值的有效性，并且在肥胖患者中基于体重的尿量标准可能特别易于误判，欧洲肾脏最佳实践指南（2012）中建议以理想体重而不是真正的重量计算尿量，避免AKI过度诊断。近年有研究发现一些新型生物学标志物对AKI的早期诊断价值优于Scr和尿量。理想的情况下，AKI的候选生物标志物应该具有很多重要的特征，例如可以用无创，简单，快速和廉价的技术进行测量，并且对AKI具有高灵敏度和特异性。它还应该允许早期发现AKI，提供疾病严重程度和可逆性的信息，并[63]预测对治疗和临床结局的反应。在AKI的各种潜在生物标志物中，包括肾损伤分子-1（KIM-1），N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG），肝脏脂肪酸结合蛋白（L-FAB）50 新疆医科大学博士学位论文和白介素-8（IL-8），NGAL是迄今为止AKI研究最广泛和最有前景的生物标志物之一。快速和可靠的自动化免疫分析的可用性允许快速的实验室评估和及时的测试结果传达给临床医生，使AKI的早期诊断和结果的可靠预测。血清或血浆中NGAL的测量也被认为比尿中测量更方便，因为AKI患者的尿量可能大大减少。尿液测量的可靠性也受到若干分析前问题的挑战，例如与静脉血相比尿液收集程序的标准化程度差以及[64]泌尿系感染患者可能受到白细胞污染，这可能最终降低该生物标志物的诊断效率。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）是一种管状多肽，分子量25KD，结合在明胶酶上，最早在中性粒细胞中发现，通常在几种人体组织中表达，包括肾，肺，前列腺，子宫，胃和结肠。在动物模型中缺血性肾损伤后的头几个小时内，NGAL的表达即可增加，NGAL蛋白在肾近端小管细胞中高度表达，并且AKI之后不久在血[65]液和尿中即可被检测到。已经进行的AKI临床研究中，NGAL在各种临床环境中均[65-70]有明确价值，如体外循环和心脏手术，脓毒血症，对比剂肾病，危重患者及肾[69]移植后AKI等。此外，研究还表明，尿NGAL可区分肾前性AKI和CKD。2011年的一项纳入了10家单中心研究的荟萃分析结果显示，在Scr未达AKI诊断标准时，血[71]NGAL即可预测亚临床AKI的发生，对早期识别、早期诊断AKI有重要意义。但NGAL在透析过程中可以被清除，因此AKI患者一旦进入透析，使用NGAL作为AKI诊断的生物学标记物，其结果可能出现偏差。目前为止，肾脏病学领域对于哪种生物学标记物或哪种生物学标记物组合在AKI早期诊断中最具价值仍未有定论。Klotho基因最早作为一种抗衰老基因被发现，它主要在肾脏，特别是肾小管上皮细胞中，脑脉络膜上表达，在细胞表面上，膜锚定蛋白酶切割Klotho的胞外结构域，并释放到血液中，尿液和脑脊液中。Klotho的可溶性形式作为内分泌物质起作用，发[72-75][76]挥多种作用，包括抗凋亡，调节多种离子通道，和氧化应激。Klotho在AKI中的研究是有限的。动物实验研究结果显示，血Klotho水平降低为大鼠AKI模型的共同表现，并表现[77]出潜在的肾脏保护作用，提示Klotho有望成为AKI早期诊断和预后评估的新指标。[78]Hu等动物实验表明，双侧肾动脉闭塞后，所有动物（大鼠和小鼠）Scr较基线值升高至少2-3倍，Scr在第1天达到峰值，在第2天开始下降，在第7天与Sham组大鼠相比仍较高；在AKI第1天和第2天Klotho蛋白和mRNA在大鼠的肾脏中减少，AKI大鼠血浆和尿液中Klotho蛋白含量均降低。到第七天，Klotho在肾脏，血浆，和尿液的水平回落到与Sham组大鼠相当的水平。表明I/RAKI诱导急性和短暂的全身和局部Klotho缺陷。研究结果还显示，血浆和肾脏Klotho在AKI早期阶段（I/R后1，3，5和24小时），5小时血浆Klotho略有升高，24小时达到统计学显着性。肾再灌注5小时后可见肾脏形态轻度改变，近曲小管轻度退变，间质轻度出血。24小时后，近曲小管有明显的坏死和刷状缘膜丢失，具有较高的肾脏病理评分。血浆和肾脏中Klotho水平在再灌注后51 新疆医科大学博士学位论文1小时中度增加，但是立即和3小时后持续下降。因此，血液和肾Klotho水平的变化先于Scr的变化或肾脏组织学。血浆和肾脏NGAL水平在再灌注后5小时开始升高。因此，至少对于由I/R诱导的AKI来说Klotho可能是最早用于肾损伤的生物标志物之一。Klotho蛋白对急性肾损伤的肾脏保护作用可能体现在以下方面：1.Klotho调节肾组织氧化应激：氧化应激发生时，包括细胞膜在内的细胞器在氧自由基、活性氧等物质作用下，发生损伤，此过程是急性肾损伤发生发展的一个重要机制。抗氧化应激可以增加Klotho基因及蛋白的表达水平，同时，Klotho也可以防止各种原因引起的[79]氧化应激损伤，两者之间有密切关系。Klotho基因可以减轻氧化应激损伤。氧化应激是环孢素A（CsA）肾损伤的重要机制，研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）在治疗慢性CsA肾病实验模型中，可以同时保持Klotho基因的表达，显着改善肾功能[79]并减轻了肾小管间质纤维化。Klotho抗氧化应激的机制可能与叉头转录因子（forkheadtranscriptionfactors-1，FOXOs）有关。FOXOs调节体内锰⁃超氧化物岐化酶的表达水平，明显加强抗氧化能力；同时减少活性氧等氧化应激反应物的产生，[80]减轻机体的氧化应激损伤。2.Klotho抑制肾组织炎症性反应：Klotho表达的减少也可与机体的炎症性反应相关，Klotho可抑制机体炎症性反应，并且机体一些炎症介质的表达也可以调节Klotho的表达水平，全身或局部肾脏炎症降低肾Klotho表达，炎性[81]细胞因子导致Klotho转录的表观遗传性失活。相关体外实验结果也显示，Klotho能抑制包括系膜细胞的肾脏固有细胞、白细胞介素6、白细胞介素8等多种炎症介质[82,83]的表达水平。具体机制可能为Klotho抑制机体炎性反应过程中的主要转录因子核因子⁃κB（NF⁃κB）介导的炎性反应有关。炎症下调肾脏Klotho表达可能由特定细胞因子如肿瘤坏死因子-α或TWEAK通过炎症转录因子核因子κB（NFκB）的激活和RelA诱导发生。Klotho本身具有抗氧化和抗炎特性，经典NFκB成分RelA是其目标之一。3.Klotho可抑制肾细胞凋亡：临床研究证实了Klotho蛋白的补充可以抑制单侧输[84,85]尿管结扎的模型（UUO）导致的肾脏细胞的凋亡，减轻肾脏损伤。体外实验结[86-88]果显示，Klotho对各种原因导致的肾细胞凋亡有抑制作用。目前有关Klotho蛋白与AKI的关系研究主要集中于动物实验，临床对两者关系的研究相对较少，多数以特定病因导致的AKI为前提进行相关研究（如心脏术后发生的AKI），对不同病因类型的AKI，Klotho是否具有早期诊断和评估预后的作用，目前尚不完全明确。本研究中，我们评估了Scr、Kloth、NGAL三种生物学标志物预测所有病因类型的AKI的价值，并分析了其与AKI预后的关系。本研究结果显示，AKI组死亡患者的比例显著高于非AKI组。进入ICU时，AKI组基线血清Klotho水平显著低于非AKI组，Scr、血清NGAL水平显著高于非AKI组。血清Klotho水平早期诊断AKI的曲线下面积为0.945，最佳临界值为1.76ng/ml，诊断灵敏度0.92，特异度0.94，灵敏度高于NGAL，特异度两者接近；而其特异度及灵敏度均高于Scr，提示Klotho对早期52 新疆医科大学博士学位论文诊断AKI发生的价值优于Scr，诊断AKI的灵敏度高于NGAL。Klotho联合Scr早期诊断AKI的曲线下面积为0.958，灵敏度0.96，特异度0.92，与Scr单独诊断AKI相比，灵敏度更高，利于早期发现肾功能异常。血Klotho水平检测在评估AKI患者预后中的研究并不多，有学者发现在缺血性损害发生后，给予补充Klotho蛋白可有效地减轻AKI，提示Klotho蛋白与AKI预后可能[78][89]存在关联；Seo等研究发现，AKI患者肾组织中Klotho蛋白低表达与患者短期不良预后相关。作者回顾性收集了2001年1月至2012年12月AKI患者的肾脏活检标本及临床资料。采用免疫组织化学染色法检测Klotho的表达，分析临床特征与病理组织学之间的相关性。在诊断为急性肾小管坏死或急性肾小管间质性肾炎的34名患者中，包括21名没有慢性组织学病变的患者。平均年龄为37.3±18.5岁，平均峰值血肌酐水平为8.2±5.5mg/dL。总共有10名患者（47.6%）接受了临时肾脏替代治疗，有17名患者（81%）在1个月后Scr水平下降至正常水平，提示肾脏功能恢复正常。将肾脏Klotho阳性区域所占的百分比作为Klotho表达的强度评分。肾脏Klotho评分显示与初始或峰值Scr水平显着负相关。当根据Klotho评分（低，中，高）将患者分成三组时，低组患者的峰值Scr水平显着更高，肾脏替代治疗需求更高。但是Klotho评分并不是肾脏恢复的重要预测指标。该研究结果表明，无论病因如何，根据AKI的严重程度，人类肾脏Klotho表达显着下降，并且低表达与短期结果不佳有关。但血清Klotho蛋白水平与AKI预后的关系鲜有报道。本研究初步探讨血清Klotho水平与AKI患者预后的关系，发现肾功能恢复组确诊AKI时的血清Klotho水平较未恢复组高，组间差异有统计学意义（P=0.047），确诊AKI时的血清Klotho、NGAL、Scr水平在死亡组与存活组两组间比较差异无统计学意义。进一步对确诊AKI时的Klotho水平与AKI的严重程度（包括AKI发生后峰值Scr、峰值eGFR、出院时Scr、出院时eGFR）进行相关性分析，结果显示无相关关系。综上所述，AKI发生时的血清Klotho水平与肾功能短期恢复可能存在相关性。但本研究样本量较小，尚须多中心、大样本、前瞻性研究对该结论加以验证。综上，AKI患者肾损伤早期血清Klotho水平即可降低，血清Klotho水平检测有望成为AKI早期诊断灵敏性和特异性较高的生物学指标之一。但本研究为单中心研究，纳入的样本量较小，血清Klotho监测的时间点较少，因此，监测血清Klotho水平对早期诊断AKI的价值，尤其是血清Klotho与AKI预后之间的关系尚须进一步研究证实。4小结4.1血清Klotho与AKI临床关系密切。血清Klotho早期诊断AKI特异度高，灵敏度高，有望作为成人AKI良好的早期诊断预测指标。53 新疆医科大学博士学位论文4.2AKI发生时的血清Klotho水平与肾功能短期恢复可能存在相关性，需进一步研究证实。54 新疆医科大学博士学位论文第三部分Klotho蛋白对缺血再灌注AKI中内质网应激的作用AKI病情凶险，病死率高，其发病机制尚未阐明，缺乏有效治疗措施。在各种肾脏疾病，包括糖尿病肾病，肾纤维化，炎症或渗透压造成的肾损伤，缺血再灌注，肾蛋白基因突变，蛋白尿等疾病中均可以出现内质网应激（ERS）反应。在一些情况下，化学伴侣如4-苯基丁酸和牛磺脱氧胆酸可缓解症状，表明ERS诱导的肾细胞凋亡是某些肾脏疾病的主要原因之一。因为ERS是一些肾脏疾病的主要原因，所以ERS反应和内质网中积累的未折叠蛋白，可能有希望成为急性和慢性肾病的新的治疗靶[90]点。研究表明，缺血再灌注（I/R）可启动强烈的ERS性凋亡途径，而肾小管上皮[91]细胞凋亡是肾脏缺血再灌注损伤重要的发生机制之一。本文第二部分研究结果显示血清Klotho与AKI临床关系密切。血清Klotho早期诊断AKI特异度高，灵敏度高，有望作为成人AKI良好的早期诊断预测指标，Klotho蛋白水平变化与肾功能状态呈负相关关系预示着Klotho蛋白潜在的肾脏保护作用。已有研究表明Klotho对肾脏具有保护作用，其保护机制仍在研究中，Klotho是否对内质网应激介导的细胞凋亡产生影响尚不明确。基于此，本研究旨在探讨在I/R引发的AKI中，Klotho对内质网应激介导细胞凋亡的重要信号途径的影响及作用机制。1研究内容与方法1.1研究对象实验动物3-4月龄健康近交系Wistar雄性大鼠120只，体质量180-260g（SPF级）由实验动物中心提供。动物分笼饲养，恒温环境下标准化实验日粮饲养，饮水不限。随机分为正常组+NS（NORM+NS，n=24），假手术组+NS（Sham+NS，n=24），假手术组+Klotho（Sham+Kl，n=24），手术组+NS（IR+NS，n=24），手术组+Klotho（IR+Kl，n=24）。NS为生理盐水。1.2实验方法1.2.1动物模型制作造模过程：常规消毒手术器械、准备无菌手术台。2%戊巴比妥钠（40mg／kg）腹腔注射麻醉成功后，备皮并消毒手术野。假手术组：做腹部正中切口，从耻骨联合上方1cm至剑突下方。将腹腔肠管翻至腹腔外，用湿纱布包裹保护。暴露双侧肾脏，切除右肾，不夹闭左侧肾蒂。手术组：同法切除右肾，钝性分离左肾动脉，保护好55 新疆医科大学博士学位论文输尿管，靠近肾门处用无创动脉夹夹闭肾动脉。观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色。将肠管还纳至腹腔，用3把血管钳钳夹腹壁，夹闭腹腔，以防止体温下降和水分散失。45min后去除血管钳，打开腹腔，将腹腔肠管翻至腹腔外，暴露肾脏。松开动脉夹，恢复灌流，肉眼可见肾动脉充盈，肾脏由暗红色变为鲜红色，表明再灌注成功。用1号细丝线连续缝合腹壁切口。术后大鼠放于24-29℃环境，密切观察大鼠的生命体征，同时补充水与饲料。正常组：仅戊巴比妥钠麻醉大鼠和腹腔内注射NS或Klotho蛋白，不开腹。造模成功后30分钟、60分钟、3小时、5小时、12小时5个时间点，将Klotho蛋白（0.01mg/kg）或NS（同等剂量）腹腔注入。模型成功判定：松开动脉夹观察肾脏从紫黑色转红色说明经过肾脏缺血一再灌注病理生理过程；如果松开动脉夹后5min，肾脏未转变为正常的红色，则认为再灌注未成功；术中如损伤大血管或者周围组织时认为造模不成功。1.2.2标本收集五组分别在术后1小时、5小时、12小时及24小时，4个时间点处死大鼠。从腹正中线皮肤切开腹腔，使腹主动脉清楚暴露，用注射器吸出静脉血液，编号后静置2h，3000×g，离心10分钟，常规分离血清并置于-80℃冰箱保存。于上述4个时间点处死大鼠后，迅速剥离大鼠的左右肾脏，记录双肾肉眼外观，然后每侧肾各取1块组织置于10%的中性甲醛中4℃固定过夜，标本待测。1.2.3检测指标1.2.3.1肾功能检测Scr和BUN采用美国Backman全自动生化检测仪检测。1.2.3.2肾脏病理检查已固定肾组织经脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤制成蜡块后制作切片，染色前切片常规脱蜡入水，最后行HE染色和PASM染色。1.2.3.2.1实验原理（1）细胞核染色的原理：苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。（2）细胞浆染色的原理：伊红是一种化学合成的酸性染料，在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞浆的染色与染液的pH在胞浆蛋白质等电点（4.7-5.0）以下时，胞浆蛋白质以碱式电离，则细胞浆带正电荷，就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子，与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合，使细胞浆着色，呈现红色。（3）分化作用：染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这56 第三部分·研究内容与方法个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，在进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。（4）返蓝作用：分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水出去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。1.2.3.2.2材料大鼠肾脏组织1.2.3.2.3主要试剂的货号及来源苏木素伊红（HE）染色试剂盒C0105碧云天无水乙醇福宇精细化工1%盐酸酒精ZLI--9065生工生物工程（上海）PBS缓冲液（PH7.2-7.4）二甲苯福宇精细化工中性树脂福宇精细化工1.2.3.2.4仪器电热恒温鼓风干燥箱，型号DHG-92402，生产商上海精宏。1.2.3.2.5操作步骤（1）实验前65℃烤片5min；（2）检查各染缸内的染料及试剂，开启通风橱内的风机；（3）把待处理的石蜡切片依次放入铜染色架上；（4）二甲苯（Ⅰ）中脱蜡10min；（5）二甲苯（Ⅱ）中脱蜡10min；（6）100%乙醇（Ⅰ）中5min洗去二甲苯；（7）100%乙醇（Ⅱ）中5min洗去二甲苯；（8）90%乙醇中水化5min；（9）80%乙醇中水化5min；（10）70%乙醇中水化5min；（11）蒸馏水中水化待用；57 新疆医科大学博士学位论文（12）苏木素染色10min；（13）流水冲洗2min；（14）1%盐酸酒精分化2s；（15）流水冲洗切片15min；（16）蒸馏水过洗1-2s；（17）伊红染色10min；（18）根据颜色深浅用80%的乙醇分化；（19）85%乙醇脱水5min；（20）95%乙醇脱水5min；（21）无水乙醇脱水10min；（22）无水乙醇脱水10min；（23）二甲苯（Ⅰ）透明10min；（24）二甲苯（Ⅱ）再次透明10min；（25）在石蜡切片的中央滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片封固。（26）镜检。1.2.3.3细胞凋亡TUNEL法评价肾脏组织细胞中凋亡细胞在单位面积的个数。1.2.3.3.1TUNEL法的实验原理TUNEL法可检测细胞凋亡过程中的核DNA断裂情况，其基本原理是采用生物素（Biotin）来标记dUTP，其在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）作用下，可连接凋亡细胞中断裂DNA的3′－OH末端，并能与连接辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）进行特异性结合，在辣根过氧化酶的底物二氨基联苯胺（DAB）存在时，出现较强颜色反应（呈棕色），正常活细胞几乎没有DNA的断裂，不会形成3'-OH，故很少能被染色。故该方法能特异性的定位细胞的凋亡情况，在普通光学显微镜下即可观察并计数凋亡的细胞数。1.2.3.3.2TUNEL实验方法（1）石蜡切片处理：按常规法进行脱蜡，水合，依次于二甲苯浸泡5min→二甲苯浸泡5min→无水乙醇5min→95%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min，切片于PBS中浸洗5min×3次。（2）促渗：将切片侵入1%的TritonX-100通透液，室温静置5min，然后用PBS漂洗3次，每次5min。（3）封闭：将切片侵于3%H2O2封闭液中，室温静置8min，然后用PBS漂洗3次，每次5min；（4）通透：每张切片上滴加100μlProteinaseK工作液，于37℃反应30min，然后58 第三部分·研究内容与方法用PBS漂洗3次，每次5min。（5）TUNEL反应：切片周围用吸水纸吸干，每个样本滴加50ulTdTEnzyme反应液，避光湿润37℃反应1h。反应后切片用PBS漂洗3次，每次5min。（6）标记：切片周围用吸水纸吸干，滴加100ul连接Streptavidin-HRP，避光湿润37℃反应30min；（7）DAB显色：切片周围用吸水纸吸干，每个样本加50ul新鲜配制的DAB溶液，室温显色反应4min。显色后的切片用PBS漂洗3次，每次5min。（8）复染：将切片放入苏木素染液，染色5min，先用蒸馏水冲洗干净，放入1%盐酸甲醇溶液中后，用蒸馏水冲洗干净。分别用70%酒精、85%酒精、95%酒精和无水乙醇浸泡5min。二甲苯浸泡2次，每次8min，待晾干后滴加中性树胶，加盖玻片。（9）计算总积分光密度（Integratedopticaldensity，IOD）：于400倍光镜下观察正常细胞为蓝紫色，凋亡细胞为棕色并可出现染色质浓缩、细胞皱缩与周围分离、出现凋亡小体等。应用图像分析系统对切片进行定量分析，每张切片选取5个阳性较高的高倍视野（×400），测出IOD值，取其平均值，计算总的IOD值。首先，免疫组化的样品应该是用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。切片上阳性反应物量是由图片上黄色染色的深浅与面积一起表现的。所以最终要测量的就是图片上黄色部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数值。在拍摄照片时，需要注意的地方是：a.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。在拍摄照片时，要保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。这样才能测量出正确的密度值。b.曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白色背景的亮度，应该在230附近。过低过高都不好。c.注意相机白平衡：如果使用的是专业CCD相机，会有校正白平衡的功能，此时应对空视野进行白平衡校正。如果是普通的数码相机，要关闭自动白平衡功能。或者选择阳光模式。避免拍摄的照片因为色偏而偏蓝或偏黄。d.很多显微镜都是同时有荧光附件的，在拍摄荧光照片时要加上滤光片，注意有时候这些滤光片会忘了移开，结果拍摄的照片就会严重偏色。1.2.3.4肾小管损伤评分肾组织HE染色显微镜下观察肾小管损伤表现：肾小管上皮细胞刷状缘丢失；肾小管扩张；管型形成；细胞变性坏死。59 新疆医科大学博士学位论文表3-1肾小管损伤评分表3-1Tubularinjuryscore损伤肾小管百分比评分无损伤0＜25%125%-50%250%-70%3﹥75%41.2.3.5Klotho蛋白表达ELISA法测定血液中Klotho蛋白水平；免疫组化检测Klotho蛋白在大鼠肾脏的表达与分布。ELISA检测血清Klotho蛋白：实验试剂及方法同第二部分。免疫组化法检测Klotho蛋白（1）实验原理：免疫组化，是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。（2）材料：切好的免疫组化片子。（3）主要仪器：电热恒温鼓风干燥箱，型号DHG-92402，生产商上海精宏。（4）主要试剂名称及来源：无水乙醇福宇精细化工二甲苯福宇精细化工中性树脂福宇精细化工PBS缓冲液生工生物工程（上海）柠檬酸钠盐缓冲液中杉金桥免疫组化试剂盒中杉金桥浓缩型DAB试剂盒中杉金桥（5）实验步骤1）脱蜡和水化：脱蜡前，应将组织切片在65℃恒温箱中烘烤90分钟。2）组织芯片置于二甲苯中浸泡20分钟，更换二甲苯后再浸泡20分钟；3）无水乙醇中浸泡5分钟，更换无水乙醇后再浸泡5分钟，；4）95%乙醇中浸泡5分钟；60 第三部分·研究内容与方法5）90%乙醇中浸泡5分钟；6）80%乙醇中浸泡5分钟；7）70%乙醇中浸泡5分钟；8）蒸馏水中浸泡5分钟；9）蒸馏水中再浸泡5分钟；10）抗原修复：高压热修复，将柠檬酸缓冲溶液倒入不锈钢高压锅，煮沸。将玻片置于不锈钢染色提篮上，放入高压锅内，盖上盖子，从电磁炉上拿下，盖子锁定，使玻片在缓冲液中浸泡15分钟，然后打开盖子室温放凉；11）3%H2O2溶液孵育10分钟；12）PBS洗3次各3分钟；13）滴加试剂A（封闭用正常山羊血清工作液），室温孵15分钟，倾去，不洗；14）滴加适当比例稀释的一抗（klotho抗体）50μl，4℃过夜孵育；15）4℃后需在37℃复温30分钟；16）PBS洗3次各3分钟；17）滴加试剂B（生物素化二抗工作液），室温孵育30分钟；18）PBS洗3次各5分钟；19）滴加试剂C（辣根酶标记链霉卵白素工作液），室温孵育15分钟；20）PBS洗3次各3分钟；21）DAB显色1分钟，在显微镜下掌握染色程度；22）将切片放入自来水中，终止显色；23）苏木精复染3min，盐酸酒精分化24）蒸馏水洗3分钟；25）脱水：蒸馏水浸泡5分钟；蒸馏水再浸泡5分钟；70%乙醇中浸泡5分钟；80%乙醇中浸泡5分钟；90%乙醇中浸泡5分钟；95%乙醇中浸泡5分钟；无水乙醇中浸泡5分钟，更换无水乙醇后再浸泡5分钟，；26）透明：二甲苯中浸泡20分钟，更换二甲苯后再浸泡20分钟；27）封片：中性树胶封片；28）镜检，拍片。1.2.3.6Klotho基因表达荧光定量PCR检测肾脏组织细胞中KlothomRNA水平。61 新疆医科大学博士学位论文（1）实验原理：异硫氰酸胍/苯酚混合试剂的液相提取法：Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（粉红色）主要为DNA和蛋白质。SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，所以在指数扩增阶段的荧光信号的-△△Ct增加与PCR产物的增加是存在线性关系。利用2计算公式，计算出实验组相对于对照组的基因的相对表达水平。（2）实验材料：大鼠肾脏组织。（3）试剂名称、货号及来源：TransZolUpET111-01全式金琼脂粉9002-18-0生工6×Loadingbuffer异丙醇天津市富宇精细化工有限公司TransScriptOne-StepgDNARemovalAT311全式金andcDNASynthesisSuperMixQuantiNovaSYBRGreenPCRKit208054QIAGEN（500）50×TAESD8108生工生物工程（上海）（4）主要仪器及型号、来源：高速冷冻离心机上海力申科学仪器有限公司Nefuqe15R核酸蛋白定量仪北京凯奥K5500电泳仪电源北京市六一仪器厂DYY-6C型电泳槽北京市六一仪器厂DYCZ-21凝胶成像系统上海天能Tanon2500（5）操作步骤1）RNA提取①取适量的大鼠肾脏组织，用液氮研磨成粉末状，快速转移到1.5mlEP管中（避62 第三部分·研究内容与方法免组织样品化冻），加入1mLTrizol；平衡至室温，混匀，室温放置15min以上；②加入200ml的氯仿，颠倒混匀后室温放置2-5min。4℃，12000rpm离心15分钟；③吸取上清于另一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置1h。4℃，12000rpm离心15分钟，倒掉上清液。加入75%的乙醇，使沉淀漂浮起来洗涤。4℃，12000rpm离心15分钟，倒掉上清液；④重复步骤5一次；⑤空管离心，吸尽液体，晾干；⑥用无RNADNA酶的水溶解沉淀，1.0%琼脂糖凝胶：称取0.36g琼脂糖溶解于50mL1×TAE缓冲液中，加热煮沸3min，至溶液澄清透明，溶液最终体积为36mL。室温放置5min后加入1μL核酸染料，混匀倒入胶槽，凝固待用；⑦浓度测定与1.0%琼脂糖凝胶电泳，150v，14min，电泳完毕后使用凝胶成像仪观察结果；⑧检测合格的RNA用于下游反转录实验。2）反转录实验步骤①按照下列反应体系配制；TotalRNA50ng-5μgOrRandomPrimer（0.1μg/μl）1μl2×TSReactionMix10μl@TransScriptRT/RIEnzymeMix1μlgDNARemover1μlRNase-freeWaterUpto20μl②轻轻混匀；③25℃10min，42℃30min，85℃5s取出，结束反转录实验；④将反转录得到的cDNA置于-20℃保存，用于后续实验。3）荧光定量体系：试剂体积（μl）2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix10QNROXReferenceDye（AppliedBiosystemscycleronly）0.1P10.5P20.5模板（cDNA）2ulddH2OUpto2063 新疆医科大学博士学位论文4）荧光定量程序：阶段（ABI）温度时间循环预变性95℃2min1变性95℃5s1退火与延伸60℃30s401.2.3.7内质网应激标志蛋白基因表达荧光定量PCR法检测肾脏组织细胞中CHOP、JNK、capase-12mRNA水平。具体试剂及操作步骤同Klotho基因表达。1.2.3.8内质网应激标志蛋白表达Westernblot法检测肾脏组织细胞中CHOP、JNK、capase-12蛋白水平。（1）实验原理：它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。（2）实验材料：大鼠肾脏组织。（3）主要试剂货号及来源：EasyIIProteinQuantitativeKit（BCA）DQ111-01全式金RIPA裂解液AR0105-100博士德组织蛋白抽提试剂CW0004A康维蛋白酶抑制剂AR1178博士德广谱磷酸酶抑制剂AR1183博士德PierceGoatAnti-MouseIgG，（H+L），31430ThermoScientificPeroxidaseConjugatedPierceGoatAnti-RabbitIgG，（H+L），31460ThermoScientificPeroxidaseConjugated蛋白预染Marker26634ThermoScientificβ-巯基乙醇0482-100mLAmrescoTris0497-500gAmrescoSDS0227-100gAmresco丙烯酰胺0341-500gAmresco64 第三部分·研究内容与方法N，N’-亚甲双丙烯酰胺0172-100gAmrescoPVDFTransferMembrane（0.45μm）IPVH00010MilliporeGlycineG0167-500gSangonBiotechglycerineG0854-100mLSangonBiotechTween20T0777-500mLSangonBiotechSuperSignalWestPricoChemiluminescent34080ThermoScientificSubstrateAnti-Klothoab154163AbcamAnti-eNOSab76198Abcam（4）主要仪器型号及来源漩涡混合器GL-88B海门市其林贝尔仪器制造有限公司台式离心机Neofuge上海力申科学仪器制造厂TM酶标仪xMarkBio-Rad，China移液器DragonlabEppendorf，Germany化学发光成像仪系统Chemiscope3,000上海勤翔科学仪器有限公司蛋白转膜仪Mini-PROTEANTetraBio-Rad，USAsystem电泳仪DYCZ-24DNBeijingLiuyi，China电子天平CP324SSartorius，Germany脱色摇床TS-3D江苏其林贝尔（5）WesternBlot总蛋白提取1）细胞样本经PBS洗涤后，加入300μLRIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），充分混匀。4℃放置60min后匀，12000rpm，4℃，离心15min，收集上清。2）组织样本加入液氮研磨后，取100mg加入500μLRIPA裂解液，振荡器充分混匀，4℃放置60min后，12000rpm，4℃，离心15min，收集上清。65 新疆医科大学博士学位论文（6）WesternBlot样品的质检1）蛋白定量：BCA定量法①标准品的稀释：用与样品相同缓冲体系的稀释液按下表对BSA标准品进行稀释。管号稀释剂体积（μL）BSA体积（来源）BSA的终浓度（μg/mL）A020（母液）2000B416（母液）1600C812（母液）1200D128（B管）800E164（C管）400F182（E管）200G191（F管）100H200（G管）0②配制BCA工作液：依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50：1配制适量BCA工作液，并充分混匀。注：配制BCA工作液前需将试剂A摇晃混匀。③分别取20µL表格中新鲜配制的BSA标准液和待测样品（稀释10倍），加入到96孔板中。④每孔中加入200µLBCA工作液，并充分混匀。⑤封板，37℃孵育30min后冷却至室温或室温放置2min。⑥酶标仪562nm处检测其吸光度，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。2）考马斯亮蓝染色①将已电泳后的聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色90min。②有明显条带后再用洗脱液洗3次，10min/次，然后漂洗过夜，第二天观察胶上是否有所需的目的条带。（7）Westernblot实验步骤1）蛋白样本处理①一部分采用完全变性的方法（加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGEloadingbuffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000rpm离心5min，取上清备用。②一部分采用非完全变性的方法（未加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGEloadingbuffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000rpm离心5min，取上清备用。2）分离胶浓缩胶配方如下：66 第三部分·研究内容与方法不同浓度的分离胶与5%浓缩胶，配方如下：8%分离胶5%浓缩胶试剂体积试剂体积去离子水（mL）5.52去离子水（mL）4.030%丙烯酰胺（mL）3.2430%丙烯酰胺（mL）1.01.5mol/lTris.cl（PH8.8）（mL）3.01.0mol/lTris.cl（PH6.8）（mL）1.010%SDS（mL）0.1210%SDS（μL）80.010%AP（mL）0.1210%AP（μL）60.0TEMED（μL）7.2TEMED（μL）8.0总体积（mL）12.0总体积（mL）6.03）制胶：加入分离胶溶液至2/3处，加水饱和正丁醇封胶，室温放置40min后加浓缩胶至顶，插入梳子，静置10min。4）加样：预染蛋白marker8μl，样品每孔上样组织蛋白30μg。5）电泳：80V恒压使溴酚蓝至分离胶处，恒压100V，90min，溴酚蓝到达较底部时，停止电泳。6）转膜：SDS-PAGE电泳结束后，将PVDF膜在甲醇中浸泡10s，蒸馏水中漂洗1min，然后将聚丙烯酰胺凝胶、滤纸以及处理过的PVDF膜在TransferBuffer中浸泡10min，制备转膜“三明治”，夹子的黑色面在下，然后是海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-夹子的透明面，将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。转膜时采用恒压转膜，使用0.45μmPVDF膜，电压100V，时间为：90min。7）漂洗：转膜后将PVDF膜水洗3次，10min/次。8）封闭：使用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭转印膜1h，然后TBST洗3次，10min/次。9）一抗孵育：用TBST稀释一抗，适当的比例，4℃孵育过夜。10）漂洗：1×TBST漂洗3次，10min/次。11）二抗孵育：加入适当稀释的二抗，室温孵育1h。12）漂洗：1×TBST漂洗3次，10min/次。13）显色：将显色液A液和B液混合，加2ml至膜上，用ChemiScopemini化学发光仪检测、拍照。1.3统计方法χ±s采用SPSS22.0软件进行数据的统计学处理。符合正态分布计量资料采用表示。两组间差异显著性检验采用两独立样本t检验，多组均数间显著性差异用AVONA（Bonferonni）分析，以P＜0.05代表有统计学差异。67 新疆医科大学博士学位论文2结果2.1I/RAKI中Klotho的动态改变及其与肾损伤关系2.1.1Klotho的动态改变ELISA检测结果显示，Norm+NS组和Sham+NS组血清Klotho在各时间点无明显变化，I/R+NS组血清Klotho自损伤后1小时开始至损伤后24小时持续下降，与Norm+NS组和Sham+NS组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3-2，图3-1。Westernblot结果显示，Norm+NS组组织中Klotho无明显改变，Sham+NS组组织中Klotho蛋白有低水平的波动，I/R+NS组组织中Klotho自损伤后1小时开始呈下降趋势，至损伤后24小时下降最为明显，与Norm+NS组和Sham+NS组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3-3，图3-2。RTPCR结果显示，I/R+NS组大鼠组织KlothomRNA自损伤后1小时开始持续降低，至24小时降低最为明显，与其它各组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3-4，图3-3。血清、组织中Klotho蛋白及KlothomRNA在各时间点变化趋势一致。上述结果显示在I/R损伤后大鼠体内Klotho水平受到影响，呈动态改变，损伤后1小时至24小时持续下降。表3-2各组大鼠血清Klotho蛋白在不同时间点的变化（x±s，n=24）Table3-2ChangesofserumKlothoproteinconcentrationatdifferenttimepointsineachgroup（x±s，n=24）时间点Norm+NSSham+NSI/R+NS1h343.458±32.312325.815±37.183290.315±32.735△5h321.139±30.938335.446±13.763182.859±28.788△▲12h337.952±25.444344.780±27.913147.560±10.120△▲24h341.776±28.932342.195±29.750133.203±16.680注：△与I/R+NS1h相比，P＜0.05；▲与I/R+NS5h相比，P＜0.05。图3-1各组大鼠血清Klotho蛋白在不同时间点的变化Figure3-1ChangesofserumKlothoproteinconcentrationatdifferenttimepointsineachgroup68 第三部分·结果表3-3各组大鼠组织Klotho蛋白在不同时间点的变化（x±s，n=24）Table3-3ChangesoftissueKlothoproteinlevelsatdifferenttimepointsineachgroup（x±s，n=24）时间点Norm+NSSham+NSI/R+NS1h0.527±0.1250.533±0.0900.499±0.077△5h0.693±0.1240.668±0.0950.507±0.09612h0.660±0.0790.635±0.0630.471±0.125△▲▽▼24h0.703±0.0680.749±0.0380.275±0.061注：△与Sham+NS1h相比，P＜0.05；注：▲与I/R+NS1h相比，P＜0.05；▽与I/R+NS5h相比，P＜0.05；▼与I/R+NS12h相比，P＜0.05。图3-2各组大鼠组织Klotho蛋白在不同时间点的变化Figure3-2ChangesoftissueKlothoproteinlevelsatdifferenttimepointsineachgroup表3-4各组大鼠组织KlothomRNA在不同时间点的变化（x±s，n=24）Table3-4ChangesoftissueKlothomRNAlevelsatdifferenttimepointsineachgroup（x±s，n=24）时间点Norm+NSSham+NSI/R+NS1h1.002±0.0731.002±0.0681.005±0.115▽5h1.023±0.0791.032±0.1020.679±0.050▽▼12h1.020±0.0331.002±0.1160.484±0.047△▲▽▼☆24h0.937±0.0240.891±0.0330.286±0.087注：△与Norm+NS12h相比，P＜0.05；▲与Sham+NS5h相比，P＜0.05；▽与I/R+NS1h相比，P＜0.05；▼与I/R+NS5h相比，P＜0.05；☆与I/R+NS12h相比，P＜0.05。69 新疆医科大学博士学位论文图3-3各组大鼠组织KlothomRNA在不同时间点的变化Figure3-3ChangesoftissueKlothomRNAlevelsatdifferenttimepointsineachgroup2.1.2大鼠肾脏损伤情况分析2.1.2.1肾脏组织学改变缺血再灌注术后24小时，NORM+NS组镜下肾小管未见明显异常，肾皮质区个别肾小管轻度扩张，个别管腔内见红染无结构蛋白管型样结构；肾小球未见明确异常。Sham+NS组镜下见皮质区个别肾小管扩张，部分肾小管上皮水肿，空泡变性；肾小球未见明确异常。IR+NS组镜下见皮质区及皮髓交接区部分肾小管刷状缘消失，较多肾小管上皮细胞水肿，空泡变性，部分肾小管上皮核固缩，胞浆红染，凝固性坏死，脱落，管型形成；间质未见明确炎症反应；肾小球未见明确异常。见图3-4。图3-4大鼠I/R后24小时肾脏组织病理学改变×400，HE染色（A.NORM+NS组；B.Sham+NS组；C.IR+NS组）Figure3-4PathologicalchangesinkidneyafterI/R24hours×400，HEstaining（A.NORM+NS；B.Sham+NS；C.IR+NS）70 第三部分·结果2.1.2.2肾功能及肾小管损伤情况Norm+NS组大鼠Scr、BUN及肾小管损伤评分在1h、5h、12h、24h无明显变化，差异无统计学意义（P﹥0.05）。Sham+NS组Scr和BUN在各时间点无明显变化（P﹥0.05）；肾小管损伤评分在术后12h开始增高，与1h和5h相比，肾小管损伤评分在12h和24小时差异有统计学意义（P＜0.05）。与1h和5h相比，I/R+NS组Scr和BUN在12h、24小时差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham+NS组相比，I/R+NS组术后1hScr、肾小管损伤评分开始升高，至24h最为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3-5，表3-6，表3-7，表3-8。表3-5Norm+NS组大鼠肾功能及肾小管损伤评分在不同时间点的比较（x±s，n=24）Table3-5ComparisonofrenalfunctionandtubularinjuryscoresinNorm+NSgroupatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组ScrBUN肾小管损伤评分1h77.348±4.5825.607±1.03905h77.017±1.9715.358±0.554012h78.233±3.8885.967±0.480024h79.433±2.6495.627±0.8330注：各组间无差异表3-6Sham+NS组大鼠肾功能及肾小管损伤评分在不同时间点的比较（x±s，n=24）Table3-6ComparisonofrenalfunctionandtubularinjuryscoresinSham+NSgroupatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组ScrBUN肾小管损伤评分1h79.083±5.2195.575±0.68505h76.033±1.0955.828±0.9410△▲12h78.233±2.9785.555±0.5351△▲24h77.533±1.9555.977±0.6431.333±0.577注：△与1h组相比，P＜0.05；▲与5h组相比，P＜0.0571 新疆医科大学博士学位论文表3-7I/R+NS组大鼠肾功能及肾小管损伤评分在不同时间点的比较（x±s，n=24）Table3-7ComparisonofrenalfunctionandtubularinjuryscoresinI/R+NSgroupatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组ScrBUN肾小管损伤评分1h85.642±4.0048.453±0.8691.667±0.5775h88.517±1.8969.390±0.7441.333±1.155△▲△▲12h93.267±2.18110.972±1.2061.667±0.577△△▲▽△▲▽24h97.650±11.61712.970±1.0693.000±0.000注：△与1h相比，P＜0.05；▲与5h组相比，P＜0.05；▽与12h相比，P＜0.05表3-8Sham+NS组和I/R+NS组大鼠Scr及肾小管损伤评分在不同时间点的比较（x±s，n=24）Table3-8ComparisonofScrandtubuleinjuryscoresbetweenSham+NSandI/R+NSgroupsatdifferenttimepoints（x±s，n=24）Scr肾小管损伤评分时间点P值P值Sham+NS组I/R+NS组Sham+NS组I/R+NS组1h79.083±5.21985.642±4.0040.01001.667±0.5770.0075h76.033±1.09588.517±1.8960.00001.333±1.1550.01612h78.233±2.97893.267±2.1810.00011.667±0.5770.11624h77.533±1.95597.650±11.6170.0001.333±0.5773.000±0.0000.0072.1.2.3肾小管上皮细胞凋亡情况采用TUNEL法检测肾脏组织肾小管上皮细胞凋亡水平，凋亡细胞核呈棕黄色或棕褐色，结果显示：和Norm+NS组、Sham+NS组相比，I/R+NS组大鼠在缺血再灌注损伤后24小时肾小管上皮细胞凋亡细胞数量显著增加，I/R+NS组IOD值较其它两组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3-5，表3-9。图3-5大鼠I/R后24小时肾小管上皮细胞凋亡情况×400TUNEL+DAB染色（A.NORM+NS组；B.Sham+NS组；C.IR+NS组）Figure3-5TubularepithelialcellapoptosischangesafterI/R24hours×400，UNEL+DABstaining（A.NORM+NS；B.Sham+NS；C.IR+NS）72 第三部分·结果表3-9三组大鼠肾小管上皮细胞IOD值比较（x±s，n=18）Table3-9ComparisonofIODofrenaltubularepithelialcellsinthreegroups（x±s，n=18）分组IODNorm+NS1668.07±205.05△Sham+NS4186.20±679.96△▲I/R+NS22963.59±10334.90注：△与Norm+NS组相比，P＜0.05；▲与Sham+NS组相比，P＜0.05；IOD数值越高说明组织的凋亡程度越高。2.1.3血清及组织中Klotho蛋白与Scr相关性分析Pearson直线相关性分析结果显示：I/R+NS组大鼠血清Klotho蛋白水平和Scr显著负相关（r=-0.488，P=0.016）。肾组织Klotho蛋白的表达水平和Scr亦呈显著负相关（r=-0.570，P=0.021）。血清Klotho蛋白和肾组织Klotho蛋白水平越低，Scr水平越高。见图3-6。图3-6I/R+NS组大鼠血清及组织中Klotho蛋白与Scr相关性（图A显示血清Klotho蛋白与Scr相关关系，相关系数r=-0.488，P=0.016；图B显示组织中Klotho蛋白与Scr相关关系，相关系数r=-0.570，P=0.021。）Figure3-6LinearrelationshipbetweenScrandKlotho2.2ERS在I/RAKI中的作用2.2.1大鼠肾组织Caspase12、JNK、CHOP蛋白表达变化Westenblot结果显示：与Norm+NS组相比，I/R+NS组凋亡蛋白caspase12在缺血再灌注损伤后5小时表达开始升高，24小时表达最多，JNK在损伤后1小时表达开始增多，24小时表达最多，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHOP在损伤后1小时表达开始增多，24小时表达最多，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham+NS组相比，I/R+NS73 新疆医科大学博士学位论文组caspase12在损伤后24小时差异有统计学意义（P＜0.05），JNK在1小时、5小时及24小时差异均有统计学意义，CHOP在1小时、5小时差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3-10，3-11，3-12，图3-7，图3-8，图3-9。表3-10不同时间点大鼠肾组织中caspase-12蛋白表达变化（x±s，n=24）Table3-10Renalcaspase-12proteinexpressionatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组Norm+NS组Sham+NS组I/R+NS组1h0.492±0.2260.458±0.1350.607±0.095▲5h0.469±0.0930.563±0.1230.678±0.140△12h0.588±0.0520.674±0.0541.164±0.352△▲△24h0.575±0.1440.620±0.0781.016±0.222注：△与Sham+NS1h相比，P＜0.05；▲与Norm+NS1h相比，P＜0.05。图3-7不同时间点大鼠肾组织中caspase-12蛋白表达变化Figure3-7Renalcaspase-12proteinexpressionatdifferenttimepoints表3-11不同时间点大鼠肾组织中JNK蛋白表达变化（x±s，n=24）Table3-11RenalJNKproteinexpressionatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组Norm+NS组Sham+NS组I/R+NS组☆▲1h0.266±0.0130.278±0.0300.397±0.068☆△5h0.270±0.0710.342±0.0200.478±0.061△☆▽▼12h0.334±0.0690.445±0.1170.766±0.107△▲☆▽▼24h0.355±0.0700.476±0.0920.842±0.121注：☆与Norm+NS1h相比，P＜0.05；△与Sham+NS1h相比，P＜0.05；▲与Sham+NS5h相比，P＜0.05；▽与I/R+NS1h相比，P＜0.05；▼与I/R+NS5h相比，P＜0.05。74 第三部分·结果图3-8不同时间点大鼠肾组织中JNK蛋白表达变化Figure3-8RenalJNKproteinexpressionatdifferenttimepoints表3-12不同时间点大鼠肾组织中CHOP蛋白表达变化（x±s，n=24）Table3-12RenalCHOPproteinexpressionatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组Norm+NS组Sham+NS组I/R+NS组☆△1h0.240±0.0500.275±0.0360.395±0.046☆☆△5h0.221±0.0470.318±0.0670.431±0.035△▲☆▽▼△▲12h0.332±0.0550.446±0.0240.741±0.226▲△▲☆▽▼△▲24h0.348±0.0900.489±0.0450.835±0.173注：☆与Norm+NS5h相比，P＜0.05；△与Sham+NS1h相比，P＜0.05；；▲与Sham+NS5h相比相比，P＜0.05；▽与I/R+NS1h相比，P＜0.05；▼与I/R+NS5h相比，P＜0.05。图3-9不同时间点大鼠肾组织中CHOP蛋白表达变化Figure3-9RenalCHOPproteinexpressionatdifferenttimepoints2.2.2大鼠肾组织Caspase12、JNK、CHOPmRNA表达变化RTPCR结果显示：与Norm+NS组相比，I/R+NS组caspase-12mRNA在缺血再灌注损伤后5小时表达开始升高，24小时表达最多，JNKmRNA在损伤后5小时表达开75 新疆医科大学博士学位论文始增多，24小时表达最多，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHOPmRNA在损伤后5小时表达开始增多，24小时表达最多，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham+NS组相比，I/R+NS组caspase12mRNA在损伤后5小时、12小时、24h小时差异有统计学意义（P＜0.05），JNK在5小时及24小时差异均有统计学意义，CHOP在5小时、12小时、24h小时差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3-13，3-14，3-15，图3-10，图3-11，图3-12。表3-13不同时间点大鼠肾组织中caspase12mRNA表达变化（x±s，n=24）Table3-13Renalcaspase12mRNAexpressionatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组Norm+NS组Sham+NS组I/R+NS组1h1.001±0.0451.002±0.0691.000±0.031▲△5h0.873±0.0600.840±0.0740.992±0.167△12h0.896±0.0620.883±0.0551.100±0.194▲△24h0.819±0.0120.845±0.0561.175±0.156注：△与Sham+NS1h相比，P＜0.05；▲与Norm+NS1h相比，P＜0.05。图3-10不同时间点大鼠肾组织中caspase12mRNA表达变化Figure3-10Renalcaspase12mRNAexpressionatdifferenttimepoints表3-14不同时间点大鼠肾组织中JNKmRNA表达变化（x±s，n=24）Table3-14RenalJNKmRNAexpressionatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组Norm+NS组Sham+NS组I/R+NS组1h1.001±0.0491.002±0.0781.007±0.131△△△5h1.138±0.0401.216±0.1611.415±0.086△▲△△12h1.253±0.0551.308±0.0691.362±0.096△▲▽▲▽△▽24h0.909±0.0701.022±0.1311.314±0.118注：☆与Norm+NS1h相比，P＜0.05；△与Sham+NS1h相比，P＜0.05；▲与Sham+NS5h相比，P＜0.05；▽与I/R+NS1h相比，P＜0.05；▼与I/R+NS5h相比，P＜0.05。76 第三部分·结果图3-11不同时间点大鼠肾组织中JNKmRNA表达变化Figure3-11RenalJNKmRNAexpressionatdifferenttimepoints表3-15不同时间点大鼠肾组织中CHOPmRNA表达变化（x±s，n=24）Table3-15RenalCHOPmRNAexpressionatdifferenttimepoints（x±s，n=24）分组Norm+NS组Sham+NS组I/R+NS组1h1.001±0.0441.001±0.0561.001±0.0465h1.004±0.0481.111±0.1741.246±0.221△12h1.019±0.0451.146±0.0801.369±0.209△▲▽△24h0.933±0.0291.102±0.1081.459±0.250注：☆与Norm+NS5h相比，P＜0.05；△与Sham+NS1h相比，P＜0.05；；▲与Sham+NS5h相比相比，P＜0.05；▽与I/R+NS1h相比，P＜0.05；▼与I/R+NS5h相比，P＜0.05。图3-13不同时间点大鼠肾组织中CHOPmRNA表达变化Figure3-13RenalCHOPmRNAexpressionatdifferenttimepoints77 新疆医科大学博士学位论文2.2.3I/R+NS组大鼠组织中Caspase12、JNK、CHOP蛋白表达与Scr的相关性分析Pearson直线相关性分析结果显示：I/R+NS组大鼠组织中Caspase-12蛋白、CHOP蛋白与Scr无明显相关关系（r=0.373，P=0.155；r=0.478，P=0.061）。JNK蛋白与Scr呈正相关关系（r=0.582，P=0.035），组织中JNK蛋白表达水平越高，Scr水平越高。见图3-14。图A显示组织中Caspase-12蛋白与Scr相关关系，相关系数r=0.373，P=0.155；图B显示组织中JNK蛋白与Scr相关关系，相关系数r=0.582，P=0.035；图C显示组织中CHOP蛋白与Scr相关关系，相关系数r=0.478，P=0.061。图3-14I/R+NS组大鼠组织中内质网应激相关蛋白与Scr相关性分析Figure3-14LinearrelationshipbetweenScrandERSrelatedproteins2.3Klotho蛋白对I/RAKI大鼠体内ERS的作用2.3.1Klotho蛋白对I/RAKI大鼠Scr及肾小管损伤评分的影响I/R24h后I/R+NS组大鼠Scr较Norm+NS组和Sham+NS组明显升高（P＜0.05），外源性补充Klotho蛋白后I/R+Klotho组Scr明显降低，与I/R+NS组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。I/R+NS组大鼠肾小管损伤评分较Norm+NS组和Sham+NS组明显升高（P＜0.05），外源性补充Klotho蛋白后I/R+Klotho组肾小管损伤评分显著下降，与Sham+NS组和I/R+NS组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。外源性补充Klotho蛋白后AKI大鼠肾功能恶化和肾小管损伤程度得到显著改善。见表3-16，图3-15。2.3.2Klotho蛋白对I/RAKI大鼠肾脏病理改变的影响各组大鼠24小时处死后，肾脏组织病理学改变如下：Norm+NS组镜下肾小管未见明显异常，肾皮质区个别肾小管轻度扩张，个别管腔内见红染无结构蛋白管型样结构；肾小球未见明确异常。Sham+NS组镜下见皮质区个别肾小管扩张，部分肾小78 第三部分·结果管上皮水肿，空泡变性；肾小球未见明确异常。I/R+NS组镜下见皮质区及皮髓交接区部分肾小管刷状缘消失，较多肾小管上皮细胞水肿，空泡变性，部分肾小管上皮核固缩，胞浆红染，凝固性坏死，脱落，管型形成；间质未见明确炎症反应；肾小球未见明确异常。Sham+Klotho组镜下部分肾小管上皮空泡变性；肾小球未见明确异常。I/R+Klotho组镜下部分肾小管上皮空泡变性，并见少部分肾小管上皮坏死、脱落及管型形成；肾小球未见明确异常。见图3-16。表3-16I/R后24小时Klotho蛋白对大鼠Scr及肾小管损伤评分的影响（x±s，n=30）Table3-16EffectofKlothoproteinonScrandtubularinjuryscoreafterI/R24hours（n=30）分组KlothoScr肾小管损伤评分Norm+NS341.776±28.93279.433±2.6490Sham+NS342.195±29.75077.533±1.9551.333±0.577△▲△▲I/R+NS133.203±16.68097.650±11.6173.000±0.000Sham+Klotho490.885±28.20674.683±1.3690.333±0.516▽▽▲I/R+Klotho166.029±24.55387.783±1.5160.500±0.548注：△与Norm+NS组相比，P＜0.05；▲与Sham+NS组相比，P＜0.05；▽与I/R+NS组相比，P＜0.05图3-15I/R后24小时Klotho蛋白对大鼠Scr及肾小管损伤评分的影响Figure3-15EffectofKlothoproteinonScrandtubularinjuryscoreafterI/R24hours79 新疆医科大学博士学位论文图3-16Klotho蛋白对I/RAKI大鼠肾脏病理改变的影响×400HE染色（A.NORM+NS组；B.Sham+NS组；C.IR+NS组；D.Sham+Klotho组；E.I/R+Klotho组）Figure3-16EffectofKlothoproteinonrenalpathologicalafterI/RAKI×400HEstaining（A.NORM+NS，B.Sham+NS；C.I/R+NS；D.Sham+Klotho；E.I/R+Klotho）2.3.3Klotho蛋白对I/RAKI大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响各组大鼠24小时处死后，TUNEL法检测肾脏组织肾小管上皮细胞凋亡水平，结果显示：和Norm+NS组、Sham+NS组相比，I/R+NS组大鼠在缺血再灌注损伤后24小时肾小管上皮细胞凋亡细胞数量显著增加，外源性补充Klotho蛋白后I/R+Kl组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况较I/R+NS组明显减轻。见图3-17。I/R+Kl组IOD值较I/R+NS组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3-17。80 第三部分·结果图3-17Klotho蛋白对I/RAKI大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响×400TUNEL+DAB染色（A.NORM+NS组；B.Sham+NS组；C.IR+NS组；D.Sham+Klotho组；E.I/R+Klotho组）Figure3-17Effectofklothoproteinonapoptosisofrenaltubularepithelialcells×400，UNEL+DABstaining（A.NORM+NS；B.Sham+NS；C.IR+NS;D.Sham+Klotho组；E.I/R+Klotho组）表3-17五组大鼠肾小管上皮细胞IOD值比较（x±s，n=30）Table3-9ComparisonofIODofrenaltubularepithelialcellsinfivegroups（x±s，n=30）分组IODNorm+NS1668.07±205.05△Sham+NS4186.20±679.96△▲I/R+NS22963.59±10334.90△Sham+Klotho3766.40±509.57△▲▼I/R+Klotho13012.38±6107.70注：△与Norm+NS组相比，P＜0.05；▲与Sham+NS组相比，P＜0.05；▼与I/R+NS组相比，P＜0.05;IOD数值越高说明组织的凋亡程度越高。2.3.4Klotho蛋白对I/RAKI大鼠体内ERS的作用I/R24小时I/R+NS组大鼠体内凋亡蛋白caspase12、JNK、CHOP水平较Norm+NS组和Sham+NS组明显升高，caspase12mRNA、JNKmRNA、CHOPmRNA相对表达量较Norm+NS组和Sham+NS组亦显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。外源性补充Klotho蛋白后I/R+Klotho组caspase12、JNK、CHOP水平和caspase12mRNA、81 新疆医科大学博士学位论文JNKmRNA、CHOPmRNA相对表达量较I/R+NS组明显回落，差异均有统计学意义（P＜0.05）。外源性补充Klotho蛋白后AKI大鼠体内内质网应激相关三种凋亡蛋白相对表达量和对应的蛋白mRNA相对表达量均有降低，提示大鼠体内内质网应激作用在补充Klotho蛋白后受到一定程度的抑制。见表见表3-18，表3-19，图3-18，图3-10，图3-20。表3-18Klotho蛋白对ERS相关蛋白表达的影响（x±s，n=30）Table3-18EffectofKlothoproteinonERSrelatedproteinsexpression（x±s，n=30）分组Klothocaspase-12JNKCHOPNorm+NS341.776±28.9320.575±0.1440.355±0.0700.348±0.090Sham+NS342.195±29.7500.620±0.0780.476±0.0920.489±0.045I/R+NS133.203±16.6801.016±0.2220.842±0.1210.835±0.173Sham+Klotho490.885±28.2060.567±0.0660.359±0.0480.406±0.052I/R+Klotho166.029±24.5530.856±0.0320.674±0.1270.689±0.124图3-18Klotho蛋白对ERS相关蛋白表达的影响Figure3-18EffectofKlothoproteinonERSrelatedproteinsexpression图3-19Westernblot检测大鼠肾组织ERS相关蛋白的表达Figure3-19EffectofKlothoproteinonERSrelatedproteinsexpression（Westernblot）82 新疆医科大学博士学位论文表3-19Klotho蛋白对ERS相关蛋白mRNA表达的影响（x±s，n=30）Table3-19EffectofKlothoproteinonexpressionofERSrelatedproteinsmRNA（x±s，n=30）分组Klothocaspase-12JNKCHOPNorm+NS1.002±0.0641.000±0.0141.002±0.0771.000±0.031Sham+NS0.930±0.0341.125±0.0741.196±0.1531.213±0.119I/R+NS0.309±0.0941.885±0.2511.892±0.1692.009±0.345Sham+Klotho2.009±0.4330.924±0.0740.955±0.1511.081±0.114I/R+Klotho0.676±0.1221.183±0.0801.370±0.1101.261±0.081图3-20Klotho蛋白对ERS相关蛋白mRNA表达的影响Figure3-20EffectofKlothoproteinonexpressionofERSrelatedproteinsmRNA3讨论3.1Klotho与AKI的关系Klotho在1997年被发现，当时它的基因座被无意中断，同时产生了高血压鼠模型。由此产生的表型类似于过早的多器官变性，其特点是寿命缩短，性腺机能减退，生长迟缓，皮肤萎缩，血管钙化，骨量减少，肺气肿，认知障碍，听力丧失和高磷血症。相反，转基因Klotho过表达小鼠（Tg-K1）的血浆Klotho水平是野生型（WT）小鼠的约两倍，平均寿命延长20-30%。这些发现确保了Klotho作为老化抑制基因，并催生了二十年的老化研究。人类Klotho基因主要表达于肾脏、脑脉络膜组织，尤以肾皮质小管上皮细胞表达最强烈。人、大鼠、小鼠的基因具有同源性，其中人和大鼠之间有83%的同源性，人和小鼠之间有80%的同源性，大鼠和小鼠间有93%的同源性。Klotho基因在不同物种所在的染色体不相同，人的Klotho基因位于13号染色83 新疆医科大学博士学位论文体ql2区域，编码区有5个外显子与4个内含子，其长度大于5kb。Klotho基因编码的蛋白是跨膜Klotho蛋白，主要为编码α-Klotho蛋白，其次编码β-Klotho蛋白、γ-Klotho蛋[92]白。Klotho在人体中有膜型和游离型两种存在形式。人类的膜型klotho蛋白由1012个氨基酸组成，cDNA长度为3036bp，分泌型Klotho蛋白由549个氨基酸组成，cDNA长度为1647bp，其中分泌型Klotho蛋白的表达量明显高于膜结合型。膜型Klotho蛋白是含有与B-葡萄糖醛酸苷酶同源性的单向跨膜蛋白，膜型Klotho在近端肾小管上皮细胞表达，可调节代谢稳态，为激素样受体，调节磷排泄，介导成纤维细胞生长因子-23（FGF23）的生物学活性，合成活性维生素。游离型Klotho蛋白缺乏跨膜结构，它以游离的形式发挥生物学效应，游离型Klotho作为体液因子，起到多种生物学效应，如[93]抑制氧化应激，调控离子转运，调节细胞因子的表达，抑制炎性反应，抗细胞凋亡。[78]HuMC等发现AKI大鼠其血、尿Klotho水平在肾损伤后明显下降，且随着肾损伤好转而恢复正常。在该项研究中，AKI后3小时即可检测到血、尿标本中Klotho下降。AKI后30分钟，弹丸注射重组的分泌型Klotho蛋白可保护肾功能，改善肾脏的组织学变化，有效缓解缺血性AKI程度。在探讨Klotho表达减少肾缺血再灌注损伤的机[94]制研究中，SugiuraH等将雄性小鼠经受双侧肾缺血30分钟并再灌注24小时，或进行假手术。在肾脏缺血再灌注之前，I/R组和假手术组静脉注射含有小鼠Klotho基因（ad-k1）的腺病毒。另外，通过DNA微阵列和实时PCR分析经ad-kl转移Klotho基因诱导过表达Klotho的mIMCD3细胞。通过实时PCR或Western印迹评估通过DNA微阵列选择的Klotho和几种基因的肾表达，并且进行TUNEL染色以评估细胞凋亡。研究结果显示先给予小鼠ad-k1导致肾和肝中KlothomRNA的强烈诱导。Ad-kl转移提高了血浆肌酐值并减轻了由缺血再灌注诱导的组织学损伤和细胞凋亡，肾脏损伤得到缓解，血肌酐降低。由于Klotho表达的改变，几种基因的表达在mIMCD3细胞中被改变，并且热休克蛋白70（HSP70）的表达特别是在ad-k1小鼠肾脏和HK2细胞中被上调。由此得出结论Klotho参与缺血再灌注的病理生理学，Klotho缺陷参与缺血再灌注引起的急性肾损伤的病理生理过程，Klotho通过HSP70的表达减轻实验性缺血性急性肾损伤的细胞凋亡。缺血再灌注急性肾损伤后Klotho表达下调可能与肾组织细胞凋亡相关，Klotho蛋白可能可以通过促凋亡因子Bax/抗凋亡因子Bcl-2途径发挥抗凋亡作用[95][96]。在证实Klotho具有增加体内和体外抗氧化应激的活性的研究中，Yamamoto等发现在缺血性肾损害后30min补充Klotho蛋白可减轻急性肾损伤，提示Klotho蛋白可以抑制胰岛素样信号传导，并且增加对氧化应激的抵抗力，从而减轻肾脏的损伤。在第二部分研究结果中，我们评估了Scr、Kloth、NGAL三种生物学标志物预测所有病因类型的AKI的价值，结果显示血清Klotho对早期诊断AKI发生的价值优于Scr，诊断AKI的灵敏度高于NGAL，Klotho联合Scr早期诊断AKI的灵敏度更高，利于早期发现肾功能异常。提示血清Klotho与AKI临床关系密切。84 新疆医科大学博士学位论文第三部分研究结果显示，I/R损伤后大鼠发生AKI，肾功能、肾脏组织病理学及肾小管上皮细胞凋亡水平均发生了显著变化。与Sham+NS组相比，I/R+NS组术后1hScr、肾小管损伤评分开始升高，至24h最为显著。术后24小时，IR+NS组镜下见皮质区及皮髓交接区部分肾小管刷状缘消失，较多肾小管上皮细胞水肿，空泡变性，部分肾小管上皮核固缩，胞浆红染，凝固性坏死，脱落，管型形成，证明肾小管损伤发生。用TUNEL法检测肾脏组织肾小管上皮细胞凋亡水平，与Norm+NS组、Sham+NS组相比，I/R+NS组大鼠在I/R损伤后24小时肾小管上皮细胞凋亡细胞数量显著增加，I/R+NS组IOD值较其它两组明显升高。与此同时，在I/RAKI后大鼠体内Klotho水平受到影响，呈动态改变，损伤后1小时至24小时持续下降。ELISA检测结果显示，Norm+NS组和Sham+NS组血清Klotho在各时间点无明显变化，I/R+NS组血清Klotho自损伤后1小时开始至损伤后24小时持续下降，与Norm+NS组和Sham+NS组相比明显降低。Westernblot结果显示，Norm+NS组组织中Klotho无明显改变，Sham+NS组组织中Klotho蛋白有低水平的波动，I/R+NS组组织中Klotho自损伤后1小时开始呈下降趋势，至损伤后24小时下降最为明显，与Norm+NS组和Sham+NS组相比明显降低。RTPCR结果显示，I/R+NS组大鼠组织KlothomRNA自损伤后1小时开始持续降低，至24小时降低最为明显。血清、组织中Klotho蛋白及KlothomRNA在各时间点变化趋势一致。上述结果显示在缺血再灌注损伤后大鼠体内Klotho水平受到影响，呈动态改变，损伤后1小时至24小时持续下降。Pearson相关性分析结果亦显示血清Klotho蛋白水平和肾组织Klotho蛋白的表达水平与Scr均呈负相关，血清Klotho蛋白和肾组织Klotho蛋白水平越低，Scr水平越高。本次研究结果提示，对于AKI，Klotho蛋白不仅可作为生物学标记物，也是保护性因素。与既往国外相关研究结果一致。3.2ERS在I/RAKI中的作用缺血性AKI中ERS可以由许多不同的刺激信号触发，包括突变蛋白聚集，缺氧，能量和代谢功能障碍等。内质网中蛋白质折叠能力的下降导致大量的错误折叠的蛋白质聚集，从而启动ERS。ERS导致细胞凋亡三个典型的信号通路，PERK-eIF2-ATF4通路，IRE1-XBP1途径和ATF6途径。肾小管细胞应对ERS的能力是维持正常肾功能所必需的。因此了解ERS的病理过程和作用机制有助于提高我们对缺血性AKI的认识能力。分泌蛋白和膜蛋白在内质网被合成、修饰，正确折叠后，才能离开内质网被运送到高尔基体和其他细胞器内，正确的折叠过程才能使蛋白质具有正确的结构，实现正常的生理功能。UPR对于正常生理情况非常重要，在具有高蛋白质合成速率的细胞中起作用（例如胰腺β细胞和浆细胞）。UPR的激活保持内质网功能，便利从压力中恢复，并可能防止额外的压力（自适应UPR）。但是，如果蛋白质在内质网中被85 新疆医科大学博士学位论文错误折叠，这些错误折叠的蛋白质可以聚集，积累，导致细胞损伤，这个过程被称[97][98]为内质网应激。持续的或延长的内质网应激可能是细胞毒性的，导致凋亡。细胞凋亡的介质包括C/EBP同源蛋白（CHOP；也称为DDIT3），这是通过PERK和ATF4诱导的。或者，IRE1α可通过激活caspase4或caspase3诱导细胞凋亡caspase12，凋亡信号调节激酶1（ASK1；也称为MAPKKK5）和JUNN-末端激酶（JNK）和/或ER定位mRNA的衰变。ERS时内质网腔内的未折叠蛋白会增多，为了清除过多的未折叠蛋白，可以采取以下三种方式：一是终止早期蛋白的合成；二是激活折叠酶以此来酶解更多的未折叠蛋白；三是激活内质网分子伴侣，诱导内质网相关性降解。未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）具备以上三种功能，它可以减轻甚至消除由ERS引起的细胞损伤，使细胞功能恢复正常，UPR对维持机体内环境的稳定和生[99]理平衡具有不可或缺的作用。UPR通过三种途径促使内质网恢复正常生理功能，这是一个促生存反应：一是PERK-elF2a介导的生存信号途径：二是ATF6转录诱导的生存信号途径；三是IREl介导的生存信号途径。UPR受GRP78和ERS感受蛋白（PERK、ATF6、IREl）调控。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）也被称为免疫球蛋白结合蛋白（BiP），是细胞中的一种分子分子伴侣，可促进蛋白质折叠与ATP的水解。在内质网腔内，GRP78结合到不完全折叠的蛋白质，防止错误折叠的蛋白质与周围的分子相互作用。在非ERS的细胞中，GRP78与PERK、IRE1、ATF6结合，使它们保持在非激活状态。当内质网中错误折叠的蛋白质积累到一定程度时，GRP78与上述三种跨膜蛋白解离，不与GRP78结合的跨膜蛋白用来激[100]活UPR，促使内质网恢复正常生理功能，帮助蛋白质折叠。因此，GRP78在激活[101]UPR的过程中发挥关键作用。Lee等人认为它可以做为ERS的标志蛋白。ERS过度反应，内质网分子伴侣激活的信号（ERK、ATF6和IREl）通路不再促进细胞生存，而是促进细胞凋亡，它们通过激活下游的凋亡信号分子来引起细胞凋亡，如：CHOP、JNK、caspase12等。在ERS中，被激活的PERK招募和磷酸化底物eIF2α，eIF2a能够降低内质网蛋白[102]负荷。但eIF2α活性下降激活了ATF4mRNA的翻译，激活转录CHOP（C/EBP同源[103]蛋白），它可以下调bcl-2并导致细胞凋亡。CHOP是ERS的特异转录因子，是一个[104]由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子。另一方面，ATF4和CHOP可以也激活GADD34（生长停滞和DNA损伤诱导蛋白-34），通过蛋白质磷酸酶1（PP1）复合物[105]促进eIF2a去磷酸化，从而在PERK通路中形成负反馈。本次研究中，CHOP的表达水平显著升高，这说明I/R损伤诱导大鼠肾脏发生了ERS。需肌醇酶1（IRE-1）-c-jun氨基端激酶（JNK）通路是ERS的一条重要的通路，JNK属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。当与GRP78结合时，IRE1保持无效动态平衡。一旦发生ERS，GRP78与IRE1解离并激活内切核糖核酸酶，形成X框结合86 新疆医科大学博士学位论文蛋白质-1（sXBP-1）mRNA，生成XBP-1蛋白。XBP-1蛋白作为一个有效的转录激活[106]剂，增加GRP78的表达。IRE1-XBP1途径作为适应性反应通过降解或折叠错误折叠的蛋白质来降低ERS。另外，胞质溶胶IRE1结构域结合肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2），然后激活c-JunN-末端激酶（JNK）介导的凋亡途径通过凋亡信号调节激酶-1（ASK1）磷酸化，最终导致ERS的细胞凋亡。Caspasel2是定位于内质网的外膜上的一种特殊分子，它参与的凋亡信号通路只能是ERS介导的，因为它在线粒体途径和死亡受体途径介导的细胞凋亡中不被激活。当ERS时Caspasel2被激活，激活的Caspasel2激活并切割Caspase9，继而激活Caspase3等Caspases，导致细胞凋亡。研究发现Caspasel2缺陷的鼠能抑制ERS引起的凋亡。本次试验中，I/R组中Caspasel2的表达水平显著上升，这进一步说明了，肾脏中发生的ERS介导了肾脏组织细胞凋亡。我们研究结果显示，凋亡蛋白caspase12在I/R损伤后5小时表达开始升高，24小时表达最多，JNK在损伤后1小时表达开始增多，24小时表达最多，CHOP在损伤后1小时表达开始增多，24小时表达最多。Caspase12mRNA在I/R后1小时即出现明显升高，CHOPmRNA在4小时升至最高峰。CHOP、JNK、capase12三基因mRNA表达水平在模型组中较假手术组显著上升，mRNA水平变化与对应的蛋白表达趋势是一致的，上述三种基因与ERS引起细胞凋亡相关，说明I/R可引起ERS，从而引起细胞凋亡。进一步分析显示组织中Caspase12蛋白、CHOP蛋白与Scr无明显相关关系，JNK蛋白与Scr呈正相关关系，组织中JNK蛋白表达水平越高，Scr水平越高。上述研究结果提示在I/R引起的AKI中，ERS参与了肾损伤和细胞凋亡的过程，在此过程中JNK通路可能发挥更为主要的作用。3.3Klotho蛋白对I/RAKI大鼠体内ERS的作用本次研究结果提示klotho对I/RAKI具有保护作用。我们在体内实验中给予大鼠外源性可溶性Klotho蛋白，发现补充Klotho蛋白可以明显降低I/R24h的BUN和Scr的水平，HE染色和肾小管坏死评分也表明肾小管上皮细胞的变性、坏死、管型形成均减轻，提示Klotho蛋白在肾I/R中起着保护作用。另外补充Klotho蛋白显著降低l/R后肾组织TUNEL阳性凋亡细胞数，这些结果提示Klotho蛋白可以通过减少肾组织缺血再[107]灌注后细胞凋亡，减轻肾脏损伤。Banerjee等在Klotho水平下降是否与ERS增加有因果关系的研究中，使用内质网应激诱导剂，毒胡萝卜素和/或衣霉素处理人肾上皮HK-2，肺泡上皮A549，HEK293和SH-SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。通过免疫印迹和实时PCR研究过表达或siRNA介导的Klotho敲低对UPR信号传导的影响。结果发现在HK-2细胞中升高的Klotho水平可以降低ERS标记物磷酸-IRE1，XBP-1s，BiP，CHOP，pJNK和磷酸化-p38的表达，所有这些在响应衣霉素和/或毒胡萝卜素的情况下均升高。使用A549细胞对于毒胡萝卜素响应的XBP-1s，BiP和CHOP观察到类似的结果。87 新疆医科大学博士学位论文相反，使用siRNA敲低Klotho在HEK293细胞中导致进一步毒胡萝卜素诱导的pIRE-1，XBP-1s和BiP的增加。Klotho在A549细胞中的过度表达阻断了毒胡萝卜素诱导的胱天蛋白酶和PARP切割并改善了细胞活力。研究结果提示Klotho在调节ERS中发挥重要作用，并且Klotho的丧失与ERS诱导的细胞凋亡有因果关系，Klotho具有抑制ERS的作用。本次研究结果表明，I/R24小时I/R+NS组大鼠体内凋亡蛋白caspase12水平较Norm+NS组和Sham+NS组明显升高，caspase12mRNA相对表达量较Norm+NS组和Sham+NS组亦显著升高，差异均有统计学意义。外源性补充Klotho蛋白后I/R+Klotho组caspase12水平和caspase12mRNA相对表达量较I/R+NS组明显回落，差异均有统计学意义。提示在外源性补充Klotho蛋白后caspase12的表达受到抑制。Caspase家族是内质网介导的细胞凋亡的关键因素。Klotho基因作用于缺氧心肌细胞后，Caspase12的基因表达显着降低。虽然Caspase12的表达水平略高于正常对照组，但低于Klotho[108]基因治疗前的低氧模型组，凋亡心肌细胞的数量也明显减少。在探讨Klotho蛋白对UUO引起的ERS相关凋亡和肾纤维化的影响研究中，将24只大鼠分为假手术组，UUO组和Klotho治疗组。将可溶性Klotho蛋白质注射入腹腔。在UUO手术后14天收集血清和肾脏样品，用苏木精-伊红和Masson三色染色法检查肾损伤和肾间质纤维化。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记测定来评估凋亡细胞的水平。测量包括葡萄糖调节蛋白78，CHOP和caspase12在内的3种内质网应激相关蛋白的表达。结果显示UUO组发生肾功能障碍，肾损伤指数增加和肾纤维化加重。在UUO大鼠中Klotho的表达显着降低，并且所有三种内质网应激相关蛋白的表达显着上调，伴随着凋亡细胞数量的增加。可溶性Klotho给药改善了肾功能，改善了病理变化，减少[84]了ERS相关蛋白的表达，并减少了凋亡细胞的数量。由此可见，Klotho基因可降低细胞内caspase12基因的表达，这可能是Klotho基因通过抑制ERS发挥抗细胞凋亡的机制之一。[109]CHOP是ERS发生时诱导表达上调的促凋亡蛋白。将Klotho基因注入动物模型腹腔后，模型组GRP78表达明显下降，随后，CHOP和caspase3的表达也下降，表明Klotho基因可以降低GRP78的表达以降低促凋亡因子CHOP和caspase3的表达，从而[110]达到降低凋亡的目的。上述研究说明，Klotho可以通过降低ERS时CHOP蛋白的表达，减少心肌细胞的凋亡，从而发挥保护脏器的作用。本次研究结果亦显示，I/R24小时I/R+NS组大鼠体内凋亡蛋白CHOP水平较Norm+NS组和Sham+NS组明显升高，CHOPmRNA相对表达量较Norm+NS组和Sham+NS组亦显著升高，差异均有统计学意义。外源性补充Klotho蛋白后I/R+Klotho组CHOP水平和CHOPmRNA相对表达量较I/R+NS组明显回落，差异均有统计学意义。此外，JNK活化是另一种诱导内质网凋亡的途径。当ERS时，大量的活性氧（ROS）88 新疆医科大学博士学位论文会迅速产生。ROS不仅可以直接引起细胞损伤，还可以通过调控JNK下游信号通路影[111]响细胞的生长和凋亡。因此，JNK在抑制细胞凋亡方面起着重要作用。实验发现，当Klotho基因浓度为0.1μg/ml或1μg/ml时，JNK磷酸化水平明显受到抑制，但浓度为0.01μg/ml和10μg/ml时未受到明显抑制。提示Klotho含量太多或太少，不能发挥其对JNK的磷酸化抑制作用。因此，Klotho基因在浓度合适时可以抑制JNK通路的磷酸化，减少心肌细胞凋亡的发生，降低CHOP介导的凋亡率。心肌细胞凋亡是心脏病中常见的病理改变，其导致收缩功能障碍或猝死。在异丙肾上腺素处理的心肌细胞中测试klotho对细胞凋亡的影响，在BALB/c小鼠中，通过皮下注射异丙肾上腺素（5mg/kg，9天）诱导心脏损伤。给予Klotho（0.01mg/kg，隔日4天，腹膜内）以确定异丙肾上腺素诱导的细胞凋亡的变化。注射异丙肾上腺素后第2天，第5天和第9天收获小鼠心脏。异丙肾上腺素以时间依赖性方式诱导心肌细胞凋亡和内质网应激。然而，klotho部分逆转异丙肾上腺素诱导的心脏细胞凋亡和ERS。在培养的心肌细胞中观察到这些相同的效果。此外，结果还显示p38抑制剂SB203580和c-JunNH2-末端激酶（JNK）抑制剂SP600125减少心肌细胞凋亡和ERS，然而，klotho抑制异丙肾上腺素诱导的p38和JNK活化。这些结果表明klotho的心脏保护与ERS和ERS诱导的细胞凋亡的减弱有[112]。关，至少部分通过抑制p38和JNK途径的激活这些结果表明，Klotho基因可部分通过抑制内质网中JNK的磷酸化水平来降低细胞凋亡，并且还能直接保护心肌免于ROS的损伤和心肌纤维化。本次研究结果显示，外源性补充Klotho蛋白后I/R+Klotho组JNK水平和JNKmRNA相对表达量较I/R+NS组明显回落，差异均有统计学意义。如上所述，肾脏组织细胞处于长期或严重的ERS时，可以通过caspase、CHOP、JNK等通路引起不同程度的细胞凋亡，而Klotho基因可以通过调控上述通路，抑制内质网的应激，避免细胞凋亡的数量继续增加和严重程度的持续加重，发挥保护肾脏组织细胞的作用。它不仅可以改善大鼠肾脏的结构变化，重要的是，Klotho能够通过抑制内质网应激诱导的凋亡信号来抑制体内细胞凋亡。或者认为，Klotho蛋白发挥肾脏保护作用，部分是通过抑制ERS诱导的细胞凋亡实现的。综上所述，I/RAKI后全身及局部Klotho表达下调，Klotho表达下调和肾脏损害密切相关，急性肾缺血再灌注损伤时，肾组织Klotho蛋白的表达下降可能与肾组织细胞凋亡有关，Klotho蛋白可能可以通过抑制ERS发挥抗凋亡作用。本研究为理解Klotho蛋白在AKI中的作用机制提供了理论依据，当然关于Klotho蛋白抑制缺血再灌注后AKI中ERS的机制还有待于进一步深入研究。4小结4.1I/RAKI后全身及局部Klotho表达下调，Klotho表达下调和肾脏损害密切相关，急89 新疆医科大学博士学位论文性肾缺血再灌注损伤时，肾组织Klotho蛋白的表达下降可能与肾组织细胞凋亡有关。4.2I/RAKI后内质网应激参与了肾损伤过程，促进肾小管上皮细胞凋亡。4.3Klotho蛋白可能可以通过抑制ERS发挥抗凋亡作用。90 结论结论通过本次研究，得出以下结论：1．中老年男性是住院患者AKI发生的高危人群；新疆地区住院患者AKI主要病因类型为肾前性，主要致病因素为心搏出量减少和血容量不足；AKI的漏诊情况严重；AKI预后差，合并DIC及休克及妇产科住院是AKI住院期间死亡的独立危险因素。CA-AKI组与HA-AKI组患者3年的长期预后无明显差异。AKI3年预后相关的独立危险因素包括MODS评分，总胆固醇，血浆白蛋白，中性粒细胞与淋巴细胞比值，血小板，平均动脉压。本研究为回顾性调查研究，研究结果存在一定的局限性：对AKI的诊断主要依据血肌酐，忽略了尿量作为诊断依据的资料，可能导致研究结果偏倚；部分数据的缺失影响资料的完整性。本研究结果的代表性亟待前瞻性的多中心临床研究验证。2．血清Klotho有望作为成人AKI的早期诊断指标；Klotho与AKI预后的相关关系不确定。但本研究为单中心研究，纳入的样本量较小，血清Klotho监测的时间点较少，因此，监测血清Klotho水平对早期诊断AKI的价值，尤其是血清Klotho与AKI预后之间的关系尚须进一步研究证实。3．I/RAKI后全身及局部Klotho表达下调，Klotho蛋白的表达下降可能与肾组织细胞凋亡有关。I/RAKI后内质网应激参与了肾损伤过程，促进肾小管上皮细胞凋亡。Klotho蛋白可能可以通过抑制ERS发挥抗凋亡作用。Klotho抑制ERS作用的具体机制需进一步深入研究。91 新疆医科大学博士学位论文致谢光阳荏苒，时光飞逝，五年的博士研究生学习生涯即将结束，期间的学习生活经历将使我受益终生。一路走来，时至今日，除了深切的体会到求学的艰辛与不易，还深刻感受到来自各方的关怀和帮助。首先感谢我的导师刘健教授，感谢他将我纳入门墙，正是因为他的接纳才使我完成了一个科学的门外汉向一个科学的探索者的蜕变。感谢他在我课题实施最困难的时候给予的帮助，使我能够顺利完成基础研究部分。其次感谢桑晓红教授，正是她的指引才使我在课题初期选题时少了许多迷茫，使我能够快速的锁定研究方向，节省了大量的时间。再次衷心感谢我的良师益友李素华副教授，从课题设计、课题实施至论文撰写整个过程倾注了她大量心血。在她的督促和倾心帮助下课题顺利完成，没有她就没有这篇论文的诞生。另外感谢我的同事和伙伴们，感谢他们在课题研究过程中给予的配合和支持。最后感谢我的家人，尤其是我的小女儿，谢谢他们的支持和理解，让我在求学道路上没有后顾之忧，他们是我生命中永远的依靠和支持，是我生命中不可缺少的快乐和幸福源泉。感谢评阅论文和出席博士论文答辩委员会的诸位专家、教授在百忙中给予的悉心指导！再次对曾给予我帮助和关心我的老师、同学和朋友们表示衷心的感谢!92 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新疆医科大学博士学位论文综述急性肾损伤病理生理研究进展王顺综述刘健审校急性肾损伤（AKI）是与高发病率，高死亡率和高医疗保健成本相关的全球公共卫生问题。除透析外，目前没有任何治疗干预措施能可靠地提高生存率，减轻损伤程度或促进恢复。此外，虽然AKI与死亡之间的直接因果关系一直存在争议，但AKI[1]与高发病率，高成本和高死亡率相关联，每年约有170万人死因与AKI相关。在存活的患者中，AKI的长期预后可能包括慢性肾脏病（CKD）和终末期肾病（ESRD），[2,3]或现有CKD加速发展为ESRD。上述情况促使国际肾脏病学学会在2015年实施[1]0by25倡议，即到2025年AKI的死亡率减少为零。然而，AKI的多因素病因学和该患者群的复杂临床过程使寻找能够发挥治疗作用的药物变得更为困难。在这篇文章中，我们就该领域的动物模型中发现的新型病理生理机制最新进展做一综述，这可能对AKI今后的治疗干预提供基础。1微血管内皮损伤肾微血管在AKI的病理生理学中起关键作用。在AKI的损伤性病变中，一个非常重要却往往被忽略的环节即为肾小管周围微血管（peri-tubularcapillary，PTC）内皮[4]的损伤。AKI时，急性缺血/再灌注、各种毒素以及炎症性损伤均会导致肾小管间质的微血管内皮功能以及结构受损。微血管内皮损伤和多糖蛋白复合物（glycocalyx）的变化导致内皮细胞活化，其新表达的细胞表面标记促进白细胞和血小板的聚集和[5,6]粘附，减少血流量，导致额外的内皮细胞损伤和炎症反应。伴随着损伤，血管通透性增加，间质水肿增加，血流量进一步下降。此外，受损小管的氧化应激和具有血管收缩作用的前列腺素产生，进一步减少血流量，导致局部“无复流”现象，其中[5,6]闭塞的微血管系统加剧了初始损伤。微血管损伤的主要长期后果是肾小管管周毛细血管密度降低，这部分是对血管内皮生长因子（VEGF）降低和转化生长因子β[7]（TGF-β）信号增加的反应，导致持续缺氧和肾纤维化的发展。2内质网应激内质网是真核细胞中重要细胞器，其基本生理功能包括Ca2+调节、生物大分子的合成加工等。内质网对葡萄糖、营养物质缺乏非常敏感，蛋白质糖基化抑制、蛋白质转运异常、二硫键形成障碍、Ca2+耗竭等刺激均可导致内质网功能失调，即导102 综述致内质网应激（endopl-asmicreticulumstress，ERS）。ERS时内质网腔内的蛋白无法正确折叠而大量滞留在内质网腔内，导致未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）。UPR是通过激活PERK，IRE1和ATF6途径来恢复细胞和组织稳态的适应性机制。（1）通过磷酸化eIF2α来抑制整体蛋白质翻译；（2）通过上调内质网伴侣蛋白增加内质网蛋白质折叠能力；（3）增加内质网相关降解，从而提供对急性应激的短期保护。[8-11]在体内和体外实验中急性缺血和肾毒性后，肾上皮细胞中ERS能被诱导。过[12][13]表达内质网分子伴侣BiP/GRP78和ORP150或者增强适应性UPR的化学分子伴侣[14]如PBA或TUDCA的使用，都可以改善蛋白质折叠能力，促进运输未折叠或错误折[12-14]叠的蛋白质，从而起到保护细胞和组织免受损伤的作用。如果应激过于严重或延长，则通过诱导CHOP（CEBP-同源蛋白；CEBP，CCAAT/增强子结合蛋白）介导的细胞凋亡而激活适应不良反应。在CHOP基因敲除的小鼠体内缺血再灌注介导的[15]肾脏结构和功能损伤、细胞凋亡和炎症反应都减轻。长时间和严重的ERS与肾纤[16]维化的发生有关。因此，以UPR为目标可能提供预防或治疗AKI的方法。然而，对于慢性进展期，是否可能存在对于肾小管萎缩，纤维化和炎症的治疗选择，还需要进一步研究。3线粒体功能障碍内质网和线粒体在多个接触部位之间具有结构连续性，称为线粒体-内质网-相关[17]膜（MAM）。MAM含有内质网结合蛋白和线粒体蛋白，对维持两个细胞器之间的结构联系非常重要。这种互连与钙释放在功能上将ERS与细胞应激反应激活的线粒体途径联系起来。在AKI的发病机制中，近端小管尤其易受线粒体功能障碍的影响，因为它们依赖于有氧代谢，其线粒体比远端小管细胞（可使用糖酵解）的氧化状态[18][19,20]更加强烈。线粒体功能障碍的研究已经成为确定AKI疗法的一个新领域。肽SS-31，也称为Bendavia，目前正在针对线粒体功能障碍的临床研究中进行评估，已经发现在损伤之前使用肽SS-31在缺血性肾损伤的大鼠模型中具有保护性的作用。通过与线粒体膜上的心磷脂结合并抑制导致线粒体损伤的细胞色素C过氧化物酶活性[21]，SS-31/心磷脂复合物在再灌注早期保护线粒体结构，加速ATP的恢复。同时小管[22]细胞死亡和功能障碍减少，血管充血，氧化应激和炎症也减少。此外，在损伤开[23]始前四周的长期治疗减轻了管周毛细血管减少，间质炎症和纤维化。线粒体生物发生是一种体内平衡机制，是指线粒体前体的生长和分化。在基础条件下可代替受损的线粒体，它被迅速诱导响应细胞损伤，并且已经报道改善线粒体生物发生促进受损肾脏的恢复。因此，刺激线粒体生物发生的药物可以作为AKI的可行疗法。线粒体生物发生的主要调节因子是PGC-1α，它激活转录因子Nrf1，Nrf2，103 新疆医科大学博士学位论文ERRα和PPARα，后者又调节线粒体DNA，抗氧化剂和生物发生基因的转录。PGC-1α的活性包括AMPK的激活剂，如二甲双胍和AICAR，以及SIRT1的激活剂，其中包括[24-28]异黄酮，白藜芦醇和小分子SIRT1720。所有这些增加线粒体数量和功能。PGC-1α[29]的活化减少了氧化损伤和细胞死亡，加速了肾线粒体和肾小管稳态的恢复。在没有细胞死亡的败血症诱导的AKI中，PGC-1α的诱导可以通过改善线粒体呼吸作用和恢复线粒体电子传递基因的表达来促进肾脏恢复。福莫特罗是一种β2-肾上腺素能激动剂，通过Camp/PKA/CREB轴恢复线粒体蛋白（包括PGC-1α）的表达和功能，恢复[30]肾功能并保护肾小管免受损伤和死亡。因为线粒体融合和分裂控制线粒体形态和形状，是线粒体功能的关键决定因素，所以调节线粒体动力学是预防或治疗AKI的另一种治疗选择。线粒体裂变导致Bax/Bak敏感性增加，凋亡调节因子表达增加和细胞死亡。SIRT3是一种线粒体抗衰老酶，已被证明可通过阻止Drp1依赖性裂变，线粒体膜电位丧失和线粒体自噬来改善线粒[31]体动力学。因此，线粒体动力学的调节可能为AKI提供新的治疗机会。4自噬目前认为细胞的坏死（necrosis），凋亡（apoptosis）和自噬（Autophagy）是细胞死亡过程中常见的三种表现。自噬是近年来发现的另一种细胞表现，是机体进化过程中的一种保守的代谢机制，其中蛋白质，细胞器和细胞质组分被递送至溶酶体用于降解和再循环。UPR的激活，特别是PERK-ATF4途径，转录调控十多个自噬基[32][33]因。在AKI中诱导肾脏自噬反应可以起到肾脏保护作用。它通过将细胞质蛋白质和细胞器封装在自噬体中开始其与溶酶体融合以降解。激活后，它也可以通过去除含有UPR传感器的内质网膜和/或从内质网中清除异常蛋白质来减少细胞应激。用氯喹抑制自噬会恶化顺铂诱导的AKI。自噬体的溶酶体降解被阻断，导致肾功能更快[33]的恶化，更严重的组织损伤和细胞死亡。最近报道了通过KIM-1（肾损伤分子-1）介导的吞噬作用由近端小管吸收的腔内凋亡碎片随后通过自噬与呈递给MHC（主要[34,35]组织相容性复合体）的抗原进行处理以下调炎症反应。然而，自噬在从急性肾脏损伤转变为慢性肾损伤中的作用值得进一步研究。在这种情况下，自噬可能不太有效，因此不能介导新合成纤维化胶原的细胞内降解。5炎症蛋白质折叠和线粒体功能的变化影响固有免疫反应，导致炎症。在UPR期间，IRE-1的激活刺激JNK（JUNN-末端激酶）途径，其调节细胞死亡和存活以及下游促[36]炎性细胞因子以促进AKI的炎症环境。嗜中性粒细胞和单核细胞在损伤的前24小[37]时内介导急性期，而在小鼠模型中的研究支持T和B淋巴细胞在肾损伤进展中的作104 综述[38]用。当在缺血再灌注损伤之前超声激活脾CD4+T细胞上的α7烟碱乙酰胆碱受体介[39]导的胆碱能抗炎途径时，存在肾保护作用。肾组织学和功能被保留，并且肾脏炎症和随后的纤维化减少。6适应不良修复通常情况下，肾小管上皮细胞在急性损伤后具有强大的增殖再生能力。伴随着损伤，适应性反应被激活以恢复正常的细胞和组织稳态，即适应性修复。然而，当损伤严重或持续时，导致细胞和组织功能障碍，适应性修复转变为适应不良性修复。在急性肾损伤进展为慢性肾脏病的过程中，炎症和纤维化适应不良是其核心环节。巨噬细胞是炎症和纤维化的关键调节因子。尽管并未证实因果关系，但对215名[40]CKD患者的活检标本的前瞻性研究显示，间质巨噬细胞的数量直接与肾小球瘢痕形成，间质纤维化，小管萎缩，毛细血管密度降低和肾脏生存率降低相关。最近研[41]究通过全基因组微阵列在再灌注后的不同时间对肾缺血再灌注模型中的巨噬细胞亚群进行分析，以便将表型和功能分配成与损伤，修复和纤维化阶段相关的巨噬细[42]胞群。基于Ly6C在CD11b+细胞中的差异表达，鉴定了三个群体，每个群体具有独[42,43]特的基因标签。如其他报道的结果，CD11b+/Ly6C高群体在急性损伤阶段出现，与单核细胞/巨噬细胞免疫反应相关，并且CD11b+/Ly6C高群体的耗竭具有肾脏保护[42]作用。CD11b+/Ly6C中间体群在修复阶段存在，具有伤口愈合的基因标记，并且[44]在耗竭时延长肾损伤的过程。CD11b+/Ly6C低群体具有促纤维化表型并在进行期中占主导地位。所有人群携带不同的炎症标志，调节损伤，修复或纤维化。由于巨噬细胞表型和功能在疾病过程中发生变化，这些发现强调了理解巨噬细胞功能在人类AKI病理生理学中的重要性。[45]受损的肾小管上皮细胞也介导炎症和纤维化。表达KIM-1的上皮细胞分泌[46]MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）以增加巨噬细胞趋化性，并且由于p53介导的G2/M阻滞引起的细胞周期阻滞，导致促纤维化细胞因子TGFβ-1和CTGF（结缔组织生长因[47]子）的产生。当再生上皮细胞无法分化时，这些也与PDGF-B（血小板衍生的生长[18,48]因子B）联合产生，导致AKI后萎缩的肾小管发生持续的促纤维化信号。p53的[49]升高与复制和应激诱导的衰老有关。衰老相关的分泌表型（SASP）与适应不良修[47]复有关。急性损伤后慢性期白细胞浸润增加和趋化因子和细胞因子表达增加，因[47,50,51]此在AKI后细胞衰老可能促进促炎环境，从而促进纤维形成。生长抑制细胞和未分化的肾小管上皮细胞通过破坏间质间隙中的细胞相互作用来扩大纤维化/炎症级联反应，从而促使纤维化和炎性信号转导因子发挥作用。由于内皮细胞在AKI反应中受损，内皮-周细胞相互作用进一步改变。这些变化导致周细胞的激活和增殖，周细胞是导致纤维化的平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞的主要来105 新疆医科大学博士学位论文源。炎症和组织内稳态的基本要素是模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR），PRR是一类可识别一种或多种病原体相关分子模式（PAMP）的识别分子，其由跨膜toll样受体（TLR）和细胞内NOD（核苷酸结合寡聚化结构域）样受体（NLR）[52,53]组成。PRR在肾实质和固有免疫细胞以及肾损伤后聚集的白细胞上表达。NLR家族的成员可以寡聚形成细胞质的多聚体蛋白-炎性体复合物，其调节炎性细胞因子白细胞介素（IL）-1β，IL-18和IL-33的成熟和分泌。PRR通过结合危险相关分子模式（DAMPs）以促进无菌炎症。在AKI的环境中，DAMP包括坏死细胞碎片的组分，如组蛋白，热休克蛋白和HMGB1，以及片段化细胞外基质的组分，DAMPs，TLRs，NLR和炎性体被认为通过调节细胞碎片的清除和组织修复程序来促进肾细胞再生[52][54]。具体而言，某些DAMP激活肾祖细胞上的TLR2并加速肾小管修复。肾脏树突状细胞的TLR4激活导致IL-22的释放，IL-22又激活其在肾小管上皮细胞上的受体以[55]加速上皮再形成。然而，当炎性通路不适应时，肾组织受损并发生纤维化。在这里TLRs的激活诱导SMAD2磷酸化所需的NLRP3炎症小体，这对于TGF-β受体信号转[56]导是关键的，而这又导致肌成纤维细胞的增殖和形成。因此，目前对PRRs可以作为调节慢性肾脏病中的炎症和纤维化的药物靶点成为研究热点。细胞应激反应和适应不良修复机制之间的生物学联系是复杂的，并且与治疗目标密切相关，其中对人体的影响有多种途径。理想的AKI治疗应该包括减轻组织损伤、促进肾组织修复和改善器官预后，以实现真正意义的“治愈”AKI。深入探讨AKI损伤与修复的相关机制、寻找更多的治疗靶点是该领域的研究焦点。此外，目前的研究大多局限于动物实验，相关的机制尚需在人类疾病中证实。参考文献[1]MehtaRL,CerdaJ,BurdmannEA,etal.InternationalSocietyofNephrology's0by25initiativeforacutekidneyinjury(zeropreventabledeathsby2025):ahumanrightscasefornephrology[J].Lancet,2015,385(9987):2616-2643.[2]ChawlaLS,EggersPW,StarRA,etal.Acutekidneyinjuryandchronickidneydiseaseasinterconnectedsyndromes[J].NEnglJMed,2014,371:58-66.[3]IshaniA,XueJL,PEggers,etal.AcutekidneyinjuryincreasesriskofESRDamongelderly[J].JAmSocNephrol,2009,20(1):223-228.[4]PatschanD,PatschanS,MüllerGA.InflammationandmicrovasculopathyinrenalischemiareperfusionInjury[J].JTransplantation,2012,2012:1-7.[5]FerenbachDA,BonventreJV.MechanismsofmaladaptiverepairafterAKIleading106 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攻读博士学位期间获得的学术成果攻读博士学位期间获得的学术成果1论著[1]王顺,杨磊,刘健等.血清Klotho蛋白监测对急性肾损伤早期诊断及预后评估的价值.中华肾脏病杂志,2018,34(2):101-105.[2]ShunWang,SuhuaLi,GuoyaoSang,etal.Long-termoutcomesofhospital-andcommunity-acquiredacutekidneyinjury[J].IntJClinExpMed2017:10(6):9482-9487.[3]王顺,张丽,戴晨等.连续性血液净化治疗重症急性胰腺炎合并急性肾损伤的疗效及对血清炎症因子的影响.标记免疫分析与临床,2016,23(7):727-730.[4]王顺,张菁菁,刘健等.连续肾脏替代疗法治疗急性肾损伤的回顾性研究.山西医药杂志,2016,,45(16):1913-1915.[5]谯铭铭,王顺,李财昌等.社区获得性与医院获得性急性肾损伤的临床特点和预后分析.中华肾脏病杂志,2016,32卷(1):16-23.[6]李财昌,王顺,谯铭铭等.单中心急性肾损伤患者漏诊原因的回顾性研究.中国中西医结合肾病杂志,2016,17(2):127-130.2项目[1]Klotho蛋白对缺血-再灌注急性肾损伤中内质网应激介导的细胞凋亡的作用及机制研究，中华医学会专项资助项目（17010030672），2018.01-2019.12，5万元。（主持）[2]Klotho蛋白对缺血再灌注损伤所致的急性肾损伤肾脏保护机制及其预后判断价值的相关研究，库尔勒市科技计划项目（2016-19），2016.01-2017.12，20万元。（参与）[3]多中心住院患者AKI的流行病学调查及Klotho蛋白对AKI预后评估的初步研究，自治区自然科学基金（2015211C069），2015.01-2017.12，7万元。（主持）111 新疆医科大学博士学位论文个人简历王顺，女，中共党员，硕士研究生，在读博士，副主任医师。本人于2009年7月硕士毕业后在新疆医科大学第一附属医院肾病科工作至今。在这期间本人热爱祖国，拥护中国共产党的领导，认真学习毛泽东思想、邓小平理论、“三个代表”及“一带一路”的重要思想，认真贯彻党的路线、方针和政策，忠诚卫生事业，有较强的事业心和责任心。经过系统的学习，掌握了相应的专业知识，为医疗工作打下了坚实的基础，并能将所学知识融入实际临床工作之中以便更好的服务患者。作为“自治区地方公派出国留学成组配套项目”成员，2015年8月1日至2015年10月31日在美国麻省总医院介入肾脏病学部进修学习介入肾脏病新技术，为期三个月，圆满完成了既定的研修目标，学习并掌握了介入肾脏病学新技术的临床操作与应用。自任职以来，本人每年都承担本专业本科生及研究生的教学工作，5年半共计承担教学时数760学时。除临床和教学工作外，本人积极关注科研发展动态，努力提高自身科研能力，任职期间主持自治区自然科学基金项目一项，主持中华医学会专项基金项目一项，参与国家级、省级和院级课题七项，发表论文共计13篇，其中SCI收录一篇，核心期刊10篇。2013年因参与科研项目“墨玉县农村维吾尔人群慢性肾脏病与慢性牙周炎流行病学及相关动物实验基础研究调查”获得“新疆医学科技奖”二等奖。112 导师评阅表新疆医科大学硕士研究生学位论文导师评阅表Ｚ＇研究１丨：姓名Ｊ：ｍ学号０７６０１１３０６８７第？附ｈ叹院导师姓名刘健教授－（》ｇ业ａ科学ｎ脏病学研究方向急竹：行损伤坫础巧临床１心ＡＫ［临．．、ＫＡＫ１ｉ此克彳ｒ病￥调：ｆｔｌｏｔｌｉ〇Ｉｌｉｆ則丨对卩令断价依＾，多屮论义题Ｍ汗佔及保护作用的研究｜＿：７ｉ／：术评ｉ？＇．？：本课题计丨丨削办丨來和相海駐础做］初少研？Ｌ？的儿对ＡＫ丨丨丨临认流？ｊ病／扮１，丨奸：做了ＩＷ心较人样本的调许，」１￥新邮地ｋ多ｉ心ｎ：Ｋ忠？大ｘ－特扯、临味诊治怙况和ｉｌｒＩ索，为本地的危噏Ｉｉ该仗病的ｖ即泠断ｓ介观治疗及ｉ、｜ＡＫ］的诊断七及时」木丫ｊ，发，恥１肠〔依裾。在此过裎中现临冰屮对１此在＿＿＜课题：ｆｔｈｏ丨ｌ训究１〗厂沿邰分计对Ｋｏ足带ｄ：ＡＫ的诊断屮ＹｒＹ：价〖１Ｌ做ｒ初叫＇ｊ１１：ｉ丨ＫｌｏｔｌｏＭＫｌ江临认ＩＯｎｆｒ卜．研究，发现ｉ进ｎ１关？、人ＡＫ：邰分讪过让，丨的早期诊断指标，紧接农第ｕｆｍ缺血ｗ潲汴损仿人鼠模制＇Ｋ．ｏｔｈｏＡＫＩ，ｈｏ卜给予外源性补充ｌ蛋丨丨，研究缺血山灌ｆＰ．中Ｋｌｏｔ对内成扑碎设反Ｋｖ：的－：垃純Ｋ１用，对比分析探讨／Ｋ丨ｏｔｈｏ逭１〔］对ＡＫＩ的保沪作川？研究纪汜提小Ｋｌｏｔｈｏ蛋＇Ｐ可能可以通过抑制内质Ｈ应激Ｋ押：抗糾Ｉ：作川。－次淸楚似讲究课题设计严丨也姐路沾晰，论幻Ｍｉｌ怡３，结构合理，Ｍ，呎点突出，ｉｒｑ规范，资料数ｉｗｒｄ：，〖／ｈＹ及达ｉＶＰ趑衄顺ｒ符介博士研究卞的论文标准，：同总该牛．提交学位论文，并迸彳」论义答辩！指疔教师签Ｖ、丨ｌＩ叫年：＜ｊｊ｜：］Ｍ０１１３
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