苹果叶片可溶性碳水化合物与褐斑病抗性的关系研究

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分类号：Ｓ６６１．１学校代码：１０７１２ＵＤＣ：６３４研究生学号：２０１４０５０３０６密级：公开？Ａ灶农林ｆ牧大学２０１７届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文苹果叶片可溶性碳水化合物与褐斑病抗性的关系研究学科专业果树学研究方向果树生理生态研究生同晓蕾指导教师李明军副教授完成时间２０１７．０５中国陕西杨陵 Classificationcode:S661.1Universitycode:10712UDC:634Postgraduatenumber:2014050306Confidentialitylevel:PublicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2017THESTUDYOFTHERELATIONSHIPBETWEENSOLUBLECARBOHYDRATEANDMARSSONINACORONARIARESISTANCEINAPPLELEAVESMajor:PomologyResearchfield:FruitTreePhysiologicalandEcologyNameofPostgraduate:TongXiaoleiAdviser:Prof.LiMingjunDateofsubmission:May2017YanglingShaanxiChina 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的硕士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已迻发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一工。与我同作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年夕月彡，曰导师指导研宄生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的硕士研究生麄所呈交的碩士学位（毕业）论文＿離＿是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名’＂：时间：加丨年月彡日７５７ 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明技本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕北）论文的全部或部分内容授权汇编录版入《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》进行出，本并人享受保证相关权益。，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用位本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单任。，任否则何，收愿存意和按保《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责论文管本论文各种版本的其他单位和个人（包括研究生本人）未经本作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著法作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究律责任。（保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫研描复制手段保存、汇编论文）究生签名：贼ｔ时间：年ｔ月多／日导师签名时间：从年Ｊ月彡｜曰 苹果叶片可溶性碳水化合物与褐斑病抗性的关系研究摘要苹果褐斑病（Marssoninamali）是我国苹果树生长季节最主要的病害之一，导致早期落叶，严重影响苹果的产量和品质。糖作为植物中重要的能量物质和结构组成，也是植物体内重要的信号分子和渗透调节物质，调控着植物体内成千上万的基因表达，参与了植物对病原菌入侵的响应。为探明苹果叶片中蔗糖和山梨醇与褐斑病抗性的关系，本文分析了褐斑病接种条件下苹果叶片可溶性糖含量及糖代谢关键基因SUSY等表达的变化，研究了山梨醇/蔗糖改变的转基因苹果及不同碳源饲喂对苹果褐斑病抗性的影响，并探索了苹果不同种质资源间叶片糖含量与褐斑病抗性的关系，主要结果如下：1.感病品种‘太平洋玫瑰’（M.domesticaBorkh.cv.PacificRose/PR）和抗病种‘山定子’（MalusbaccataBorkh./S）叶片糖含量和糖代谢对褐斑病入侵的响应结果表明：感病品种‘太平洋玫瑰’叶片接种褐斑病后，蔗糖与葡萄糖含量均表现为先下降后上升，且蔗糖含量和葡萄糖含量接种后期均高于未接种，但在‘山定子’中无明显变化。对糖转运和代谢基因的表达分析发现，两个品种在接种褐斑病菌后SWEET基因表达均下降，其中，MdSWEET1.1/1.2、MdSWEET2.4、MdSWEET3.9和MdSWEET3.10的表达变化最为明显，均表现为接种72h后表达显著降低。接种后随时间的延长，MdSDH1和MdSPS表达量上调。这些结果表明，褐斑病接种对不同抗性材料叶片糖含量影响不同，且对感病品种糖酸含量影响较大，同时也表明糖代谢基因可能参与了叶片对褐斑病原菌的响应调控。2.为探明蔗糖和山梨醇在苹果褐斑病抗性中的作用，本论文分析了叶片蔗糖和山梨醇合成分别抑制的转基因苹果对褐斑病的抗性，并研究不同碳源饲喂苹果叶片对褐斑病抗性的影响。结果表明，与野生型相比，山梨醇合成抑制转基因株系山梨醇含量降低、蔗糖含量增加，抗病性下降，抗病基因表达下调，同时蔗糖合成抑制的转基因苹果叶片中山梨醇含量增加、蔗糖含量下降，抗病性增加，但抗病相关基因表达也下调，且幅度较大。这说明蔗糖和山梨醇含量对褐斑病的调控可能通过抗病基因以外的机制进行。糖饲喂试验进一步表明，饲喂蔗糖后‘嘎啦’苹果叶片褐斑病发病加重，而饲喂山梨醇叶片褐斑病发病较轻。同时，饲喂蔗糖和山梨醇后抗病基因的表达均低于ck叶片，这些结果表明，苹果叶片中山梨醇参与了对褐斑病的抗性，但其作用机制与相关的抗病相关基因表达关系不大。3．为进一步确定糖及糖醇含量与苹果对褐斑病抗性的关系，在课题组前期抗病性评价的基础上，本论文对33种野生种质资源和15种品种种质资源叶片进行了可溶性糖酸含量测定及其与抗病相关性分析。结果表明，无论在野生种质资源还是栽培品种中 叶片山梨醇、蔗糖、葡萄糖及苹果酸的含量均与抗病性不存在明显的相关性，但山梨醇的相关性明显高于蔗糖。4.以上的基因表达分析发现，SUSY基因的表达受褐斑病接种的诱导，为系统分析SUSY在糖代谢和抗病中的作用，本论文系统分析了苹果基因组中SUSY家族基因结构及其表达特性。结果表明，苹果中的11个MdSUS基因分为三个类型，分别为SUSI，SUSII和SUSIII，具有10-14个内含子。表达分析发现，这些MdSUSY在苹果不同组织及果实发育过程中表达模式不同，其中MdSUS2.1在果实中高度表达。在褐斑病接种过程中，MdSUSY1-4表达均受褐斑病的高度诱导。这些结果表明，不同的MdSUS基因可能在源-库之间的糖代谢和糖利用水平上扮演着不同的角色。关键词：苹果；褐斑病；糖代谢；SUSY基因 THESTUDYOFTHERELATIONSHIPBETWEENSOLUBLECARBOHYDRATEANDMARSSONINACORONARIARESISTANCEINAPPLELEAVESABSTRACTApplebrownspotdisease(Marssoninamali)isoneofthemostimportantdiseasesofappletrees'growingseasoninChina,whichleadtofruittreeleavesearlyfall,seriouslyaffecttheyieldandqualityofapple.Sugarasimportantenergyandstructuralsubstanceisalsoimportantinsignaltransductionandosmoticregulation.Alsoregulatestheexpressionofthousandsofgenesandparticipatesinplantresponsetopathogen.Inordertoelucidatetherelationshipbetweensucrose/sorbitolandleafspotresistanceinapple,westudiedthechangesofsolublesugarcontentandtheexpressionofkeygenesincarbohydratemetabolismafterinoculatedwithMarssoninacoronaria.Also,weuseddecreasedofsorbitol/sucrosetransgenicapplesanddifferentcarbonfeedingleavestoverifytheeffectofMarssoninamaliresistance.Themainresultswereasfollows:1.Thecontentofsugarandsugarmetabolisminleavesofsusceptiblecultivar'Pacificrose'anddiseaseresistancecultivar'Shandingzi'showedthatafterinoculated,thesucroseandglucosecontentsinleavesof'PacificRose'wereincreasedfirstandthendecreased,andhigherthanthoseoftheun-inoculated,buttherewasnoobviouschangesin'Shandingzi'.TheexpressionofSWEETgenesweredecreasedinbothcultivars,andtheexpressionofMdSWEET1.1/1.2,MdSWEET2.4,MdSWEET3.9andMdSWEET3.10in72hweresignificantlylowerthanthatof24h.TheexpressionofMdSDH1andMdSPSshowedup-regulatedwiththeinoculatedtimegoing,andtheexpressionofMdSPSincreasedsignificantly.TheseresultsindicatedthattheinoculationofMarssoninacoronariahaddifferenteffectsonthesugarcontentofdifferentresistanceleaves,andhadmoreinfluenceonsusceptiblecultivar.keygenesofsugarmetabolismmayalsobeinvolvedintheregulationofresistancetoMarssoninacoronaria.2.ForfurtherstudythefunctionofsucroseandsorbitolinresistanceofMarssoninacoronaria,Decreasingofsorbitolandsucrosetransgenicappleanddifferentcarbonfeedingleaves’resistancewereanalyzed.Theresultsshowedthatcomparedwiththewildtype,thecontentofsorbitolweredecreased,andthesucrosewereincreasedof sorbitol-synthesis-inhibitedtransgeniclines,andtheexpressionoftheresistancegenewasdown-regulated.Meanwhile,thecontentofsorbitolintheleavesofthesucrose-synthesis-inhibitedtransgenicapplewasincreasedandthecontentofsucrosewasdecreased,theresistancegenewassignificantlydown-regulated.ThisindicatedthattheresistancestoMarssoninacoronariaindifferenttransgeniclinesweredifferent,andtheregulationmightbethroughthemechanismotherthandiseaseresistancegenes.Carbonfeedingleavesfurthershowedthattheincidenceofapplebrownspotdiseasewasincreasedafterfeedingwithsucrose,whilewaslighterafterfeedingwithsorbitol.Meanwhile,theexpressionofdisease-resistancegenewaslowerthanthatofckleavesafterfeedingwithsucroseandsorbitol.Theseresultsshownthatincreasedofsucrosereducedtheleafresistance,ontheotherhand,sorbitolmaybeinvolvedintheresistancetoapplebrownspotdisease,butthemechanismisindependenttotheexpressionofdiseaseresistancegene.3.Inordertodeterminetherelationshipbetweencontentofsugars&alditolsandtheresistanceofdifferentgermplasmresourcestoMarssoninacoronaria,basedontheevaluationofdiseaseresistanceoftheteamresearch.Thecontentofsolublesugarandacidof33wildand15cultivargermplasmsweredetermined，alongwithitscorrelationtodiseaseresistance.Theresultsshowedthattherewasnosignificantcorrelationbetweenthecontentofsorbitol,sucrose,glucoseandmalicacidinthewildorcultivargermplasm,butthecorrelationofsorbitolwashigherthanthatofsucrose.4.TheexpressionofSUSYgenewasinducedbytheinoculationofMarssoninacoronaria,inordertoanalyzeSUSYonsugarmetabolismanddiseaseresistanceinapple.ThestructureandexpressionofSUSYgenefamilyinapplegenomewasanalyzed.Resultsshowedthat11MdSUSgenesinappleweredividedintothreetypes:SUSI,SUSIIandSUSIII,with10-14introns.TheexpressionpatternsofMdSUSYwerediverseindifferenttissuesandfruitdevelopmentofapple,andMdSUS2.1washighlyexpressedinfruit.TheexpressionofMdSUSY1-4wasinducedobviouslybyMarssoninacoronaria.TheseresultssuggestthatdifferentMdSUSgenesmayplayadifferentroleinsugarmetabolismandsugarutilizationbetweensourceandsink.KEYWORDS:Apple;Marssoninacoronaria;Carbohydratemetabolism;Sucrosesynthase 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1引言..............................................................................................................................11.2苹果褐斑病的研究......................................................................................................11.3植物免疫系统与抗病性反应......................................................................................21.4糖代谢与植物免疫......................................................................................................31.5植物SUS基因家族研究进展.....................................................................................51.6本研究的目的和意义..................................................................................................6第二章苹果叶片可溶性碳水化合物对褐斑病的响应..........................................................72.1材料与方法...................................................................................................................72.1.1试验材料.............................................................................................................72.1.2试验方法.............................................................................................................72.1.3数据统计分析.....................................................................................................92.2结果与分析..................................................................................................................92.2.1太平洋玫瑰和山定子叶片糖代谢对褐斑病的响应.........................................92.2.2转基因‘绿袖’苹果株系褐斑病抗性鉴定........................................................132.2.3不同糖饲喂‘嘎啦’叶片糖代谢对褐斑病响应分析........................................162.2.4种质资源糖含量测定及其与褐斑病抗性相关性分析...................................212.3讨论............................................................................................................................242.3.1叶片糖含量与褐斑病抗性...............................................................................242.3.2糖代谢关键基因及抗病相关基因对褐斑病响应...........................................252.3.3种质资源褐斑病抗性评价...............................................................................26第三章苹果SUSY基因家族分析........................................................................................283.1材料与方法................................................................................................................283.1.1试验材料...........................................................................................................283.1.2苹果SUS基因家族的搜索与注释..................................................................283.1.3苹果SUS基因蛋白序列比对及进化分析......................................................283.1.4苹果SUS基因外显子-内含子结构分析........................................................293.1.5苹果SUS基因酶活性的测定..........................................................................293.2结果与分析................................................................................................................293.2.1苹果SUS基因的鉴定与同源性分析..............................................................293.2.2苹果SUS基因结构和蛋白序列分析..............................................................323.2.3苹果不同组织中MdSUS基因的表达和酶活分析........................................35 3.2.4果实发育阶段MdSUS基因的表达及酶活分析............................................363.2.5山梨醇抑制和蔗糖抑制转基因苹果株系茎尖中MdSUS基因表达分析....373.3讨论............................................................................................................................38第四章结论............................................................................................................................39参考文献..................................................................................................................................40缩略词..................................................................................................................................46致谢..................................................................................................................................47作者简介..................................................................................................................................48 第一章文献综述1.1引言苹果是世界四大水果之一。我国苹果栽培面积和产量均居世界第一，但目前苹果产业却面临主栽品种单一，老果园占总栽培面积比重较大、有待更新等诸多问题（李燕等2012）。品种的单一化和树体的衰弱引发了大规模的病虫害，进而影响果实的品质和产量，而病害尤其是一些真菌类病害成为限制苹果生产的重要因素，如腐烂病、褐斑病、炭疽叶枯病等严重影响苹果果树健康生长，导致苹果品产量和品质下降（王三红2007）。病原菌侵染寄主植物后首要目标是获取营养物质，成功入侵的病原菌使得寄主营养流出机制不断输出养分，植物启动免疫反应阻止病原菌获取养分，病原菌不断进化抑制寄主免疫。然而，病原菌是如何改变寄主植物免疫反应，特别是使寄主输出糖分用于自身生长机制并不清楚（Chenetal.2010）。因此，研究病原菌如何改变寄主植物免疫反应过程、分析病原菌可能的糖分利用形式，培育抗病新品种对苹果生产来说是极其重要的。1.2苹果褐斑病的研究苹果褐斑病（Marssoninamali）引起苹果树早期落叶，主要由冠盘二孢（Marssoninacoronaria）侵染引起，多发生在高温高湿区域如黄河流域、秦岭北麓和云、贵、川等苹果产区（赵华2012；谢为龙1988）。苹果褐斑病还被称为绿缘褐斑病，这是因为其发病后病斑中心为褐色边缘为绿色，这也是区别于其他落叶病最显著的特征（Lietal.2014）。该病对果树树势、果品品质及产量影响较大，叶片是最主要的发病部位。褐斑病病斑主要表现为三种类型：分别是同心轮纹状、针芒状和混合类型（中国农科院果树研究所1959）。苹果褐斑病于每年7、8月份大量流行，这段时间降雨多导致湿度增加，同时气温升高，病情发生及传播也就加重，但不同品种间抗病性差异较大。苹果褐斑病最早于1974年由日本人Harada（1974）发现并报道，随后在加拿大（Permeiee1974）、印度尼西亚（Shivasetal.1996）、印度（Sharma2000）、意大利（Tamietti&Matta2003）、巴西（Kretzschmaretal.2005）、韩国（Leeetal.2006）等国均有报道。我国记载最早发生苹果褐斑病是在1913年（Miyake1913）湖北果园，目前在我国各省苹果产区均有分布（孔宝华等2010；寿园园2009）。1986年，苹果褐斑病成为限制我国苹果产量提高的主要因素（黄亦存等1986）。目前，我国乃至世界各苹果产区都有较为严重的褐斑病发生，流行年7、8月份重病果园发病率达80%-100%，引起树势衰弱，严重影响当年及来年苹果树势、产量和品质（惠隽雄2003；姜好胜等2005；潘换来和潘小刚2000）。近年来，苹果褐斑病的发生更加普遍，发病严重，树势衰弱，果实品质下降，尤其是栽培品种的单一化，更加剧了该病害的发生。而目前对苹果褐斑病的研究主要集中在对该病的化学防治、侵染过程等方面的研究，对抗病机理及其免疫机制的研究报道比较1 少。在侵染过程方面，谢为龙等（谢为龙1988）最先研究了褐斑病孢子入侵苹果叶片的方式，认为褐斑病菌丝主要以牙管的形式侵入叶片表皮细胞，统计分生孢子在蒸馏水、1%葡萄糖、10%苹果叶片浸提液和1%琼脂中的萌发率，发现营养条件影响着分生孢子的萌发，尤以琼脂中效果显著。在褐斑病病原菌对培养基类型的选择上，认为不同培养基上生长的菌落大小、产生孢子等均有较大差异，在PPDA培养基上生长要好于普通PDA培养基（Leeetal.2011）。说明营养物质对褐斑病病原菌生长有明显作用。赵晶等（2012）通过观察不同抗性苹果叶片在褐斑病侵染过程中细胞学水平变化，结果表明，苹果叶片抗性不同，褐斑病病菌分生孢子的附着胞形成率、芽管分枝率及侵入后在叶片组织内的发育也表现出有明显差异。范涛等（2015）测定了褐斑病病菌侵染山定子和富士叶片过程中DNAladder和类caspases活性，认为褐斑病菌侵染过程中山定子叶片类caspase活性下降，DNAladder却没有产生。在苹果叶片抗褐斑病的生理和生化机制水平，谢为龙和冷怀琼（1990a）通过对苹果叶片对褐斑病的抗性与叶片角质层厚度和含氮量的相关性分析发现，叶片角质层和全氮量与褐斑病抗性呈正相关，而游离酚、磷、钾等含量与其无明显关系。过氧化物酶（POD）同工酶在发病期间表现为常态曲线（谢为龙和冷怀琼1990b）。党志国等（2011）进一步研究POD、PAL活性及木质素含量与褐斑病抗性的相关性，结果表明二者为正相关。在分子机制方面，通过对比苹果品种‘秦冠’、‘富士’及其杂交后代对苹果褐斑病的抗性及其遗传特性，认为褐斑病的抗病基因是一种含有主效抗病基因的数量性状（张坤等2007）。为研究杂交后代对早期落叶病抗性的遗传特性，赵磊等利用‘秦冠’和‘富士’品种为亲本，研究发现不同组合在不同年份褐斑病的遗传倾向表现不同（赵磊等2008）。寿园园等对‘红玉’和‘金冠’的杂交后代进行褐斑病抗性鉴定后认为，苹果褐斑病的遗传具有主基因效应，并对抗病性接种鉴定方法进行了探索，认为离体叶片接种进行抗性鉴定方法可用于苹果种植资源大规模抗褐斑病评价（寿园园等2009）。Zhou等通过抑制性差减杂交的方法从被冠盘二孢侵染后的秦冠叶片中分离得到了175个表达序列标签等（Zhou2012）。李苗苗等利用蛋白质双向凝胶电泳技术在蛋白质水平上研究人工接种苹果褐斑病菌诱导的差异蛋白，共筛选出与碳水化合物代谢、物质转运及抗病相关的蛋白59种（Lietal.2014）。徐建华等通过对人工接种褐斑病后的‘秦冠’叶片转录组测序，揭示了‘秦冠’品种褐斑病抗性的分子机制（Xuetal.2015）。虽然在基因及蛋白质领域已取得了一些进展，但在糖代谢对抗褐斑病育种的机制研究少有学者涉及。1.3植物免疫系统与抗病性反应由于植物生长在一个地方不能逃离各种生物和非生物胁迫，为了应对这种威胁，植物自身通过长期的进化，形成免疫机制（Hametal.2007）。植物有效的免疫系统主要分为先天性免疫和系统获得性免疫。先天性免疫是植物在长期进化过程中与入侵的微生物2 不断斗争而建立起来的一种特性，它可以对病原入侵产生快速的防卫反应，随后诱导超敏反应，使病菌的入侵点及周围组织细胞程序化死亡，从而阻断病原菌从侵染点周围组织中获取养分而进一步扩散。目前研究认为，植物先天免疫系统包括病原相关分子模式激发的免疫反应和效应蛋白激发的免疫反应两种反应（Spoel&Dong2012）。植物首先产生过敏反应，之后经过信号传导激发整株植株对后续多种病原菌侵染表现出广谱抗性称为系统获得性免疫。在植物与病原菌互作进程中，只要病原菌意图侵入寄主植物，就会诱导寄主植物启动自身免疫防御系统来阻止病原菌的入侵。病原菌侵染寄主植物时先与寄主植物的某些器官或组织的表面接触，随后产生牙管或在牙管尖端产生附着胞，从而侵入寄主细胞内。病原菌侵入之初，最先产生变化的是细胞壁、角质层和蜡质层等一些植物的表面结构。除了这类物理作用的屏障外，植物表面结构还会分泌一些抗菌物质抵御病原菌的入侵（Hoefle&Hückelhoven2008）。在病原菌侵入寄主细胞前，细胞壁等表面结构发挥主要的防卫功能，而当病原菌为成功入侵释放各种酶类、毒素等物质破坏植物机械屏障之后，寄主植物为抑制病原菌从自身细胞内获取营养物质而产生过敏反应（HR）。成株抗性品种Xingzi（9104）在接种条锈病菌（Pucciniastriiformis）18~36h后表现明显的过敏性坏死以限制条锈菌的生长，从而达到抵抗病原菌入侵的目的（Zhangetal.2012a）。晚疫病菌、稻瘟病菌及玉米小斑病菌等兼性寄生真菌在与寄主植物互作过程中叶伴随着过敏反应，从而阻断病原菌的营养来源，同时积累酚类化合物产生植保素（Beardmoreetal.1983）。此外，真菌细胞壁可以被几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶水解，Lawrence等（2000）利用纯化的几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶水解链格孢菌的细胞壁发现，水解物可诱导激发寄主植物的过敏反应。在条锈病菌侵染小麦试验中，β-1，3-葡聚糖酶的活性在抗病品种高于感病品种中，这表明β-1，3-葡聚糖酶在小麦抗条锈病发病过程中起着重要的作用（Liuetal.2009）。Zhang（2012b）从湖北海棠中克隆获得β-1，3-葡聚糖酶基因，该基因在水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和1-氨基环丙烷羧酸（ACC）的诱导下表达上调。1.4糖代谢与植物免疫病原菌主要可分为两种：活体营养型和腐生营养型（Jones&Dangl2006；Glazebrook2005），活体营养型病原体在活体植物细胞内生存，但不诱导植物的抗病机制，这就导致其在整个植物组织迅速扩散，同时通过运输植物的营养物质来满足自己增殖的需要（Mendgen&Hahn2002）。相反的，腐生营养型病原体通过分泌毒素或者降解一些酶类物质杀死和降解植物细胞，植物通过长期的进化形成独特的免疫机制阻止病原菌的入侵。植物受病菌侵染后自身生理生化发生改变。糖作为基本的结构物质在植物防御反应中提供能量，有时还可以与植物免疫系统的激素信号网络相互作用参与植物免疫。在感病初期，糖通过增强活性氧爆发来增加细胞壁木质化，同时刺激产生类黄酮或者诱导某3 些PR蛋白表达。一些糖类作为引发剂诱导高等植物对病原体的抗性（Morkunas2014）。真菌病原体攻击植物后，其可溶性碳水化合物以及单成分糖的比例通过植物调节机制和病原体干扰修饰发生改变，在感染部位糖含量的以下改变有几个原因：糖含量通过能量和组成细胞结构的消耗而减少；被病原体吸收；而在自养组织中，由于光合作用的抑制而发生。由于感染位点转变成库，大量的糖分涌入，糖的流入补偿了糖损失，因此，在不同的植物-病原体相互作用中，观察到感染组织中的糖水平减少或增加（Bergeretal.2007）。研究表明，植物受病原菌侵染后，其体内糖代谢发生显著变化（李佐同等2009），且在侵染过程中植物基因被诱导或被抑制、推迟表达（章元寿.1996）。还有一些研究表明，植物组织受病原菌侵染后糖含量显著增加，如在柑橘黄龙病菌侵染的甜橙果实中，相对于未接种果实，其淀粉、蔗糖和果糖的含量均表现为增多（Fanetal.2010）。同样，在可可扫帚病（Witches’broomdisease）侵染后的可可中，蔗糖、葡萄糖和果糖等一些可溶性糖的含量也有明显变化（Scarparietal.2005）。1957年，Horsfall（1959）首次把植物病害分为高糖和低糖病害，因此，在植物抗病防御机制中糖含量的高低具有重要的作用。Tadege（1998）等认为蔗糖可以通过产生细胞程序性死亡来限制病原菌的侵染。Gomez-Ariza等（2007）研究表明，水稻对稻痕病菌的抗性可通过提前用蔗糖处理来实现。Chen（2010）通过对拟南芥、水稻糖转运蛋白表达分析，认为病原菌侵染寄主植物后从寄主获取营养物质用于自身生长，诱导植物启动免疫反应阻止病原菌入侵。但病原菌是如何改变寄主植物免疫反应，特别是使寄主输出糖分用于自身生长机制并不清楚。已经有较多关于糖信号分子调节植物免疫反应的报道，并且主要参与触发病原分子模式和效应子介导的免疫反应。目前研究发现，蔗糖、海藻糖、松二糖、阿洛酮糖、半乳糖醇以及多聚半乳糖醛酸（OG）等均参与植物的防御反应，这些糖信号分子通过诱导防御相关基因的表达、刺激花青素等黄酮类物质的积累以及激活促分裂活化蛋白激酶（MAPK）的活性等提高植物对病原菌的抗性，但其中的信号机制还不是很清楚（Denouxetal.2008;Kanoetal.2011;Singhetal.2011）。除此之外，糖还可以与植物激素共同作用参与植物对病原菌的防御反应（Leno&Sheen2003），如ABA能诱导CWIs的表达（Hayesetal.2010）。己糖激酶（HXK1）是研究葡萄糖最好的传感器，然而这种蛋白质同时还作为酶发挥作用，通过糖酵解途径将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸（Smeekensetal.2010）。Kim等（2006）研究表明，己糖激酶介导的细胞程序性死亡（PCD）在超敏反应（HR）中诱导许多抗病相关基因（PR）表达。基于HXK突变体和转基因拟南芥中基因表达的分析，表明己糖激酶信号通过整合营养和激素信号以调节基因表达和植物生长，生理和发育过程（Bolourietal.2010）。除HXK外，G蛋白偶联受体作为另外一种葡萄糖传感器（Grigstonetal.2008），由于它在质膜中的位置使得它在细胞外葡萄糖信号转导中发挥重要作用（Baena-Gonzalez2010）。Perfus-Barbeoch等人（2004）报道，水稻G-蛋白亚基中的突变表现出对诱导子和病原体例如稻瘟病真菌的改变的反应，这表明RGS1参与防御反应，即通过刺激ROS合成。除葡萄糖外，蔗糖也作为信号分4 子（Windetal.2010），因为它影响增强花青素生物合成基因表达的某些基因的表达。其参与某些bZIP转录因子的翻译调节。海藻糖是在植物的生长和发育过程中以及植物防御反应中发挥信号传导功能的另一种二糖，此外，海藻糖-6-磷酸（T6P）也是植物细胞中的有力信号分子（Pauletal.2008;Delatteetal.2011）。海藻糖是众所周知的非还原糖，已经显示通过苯丙氨酸氨裂解酶和过氧化物酶基因的活化可诱导小麦白粉病（Blumeriagraminisf.sp.tritici）的抗性（Muchembledetal.2006）。此外糖转运蛋白SWEETs的表达受细菌共生体和真菌病原体诱导，表明SWEET转运蛋白的糖流出功能可能与病原体和共生体的营养增益有关。研究发现，引起水稻细菌性枯萎病的黄单胞菌与SWEET协同从寄主细胞中获取贮存的养分。这类细菌利用其III型分泌系统分泌转录激活因子（TAL）来直接诱导特异性SWEET基因的表达（Liuetal.2011）。如水稻细菌性枯萎病通过分泌TAL效应物PthXO1直接作用于OsSWEET11（Yangetal.2006），同样的，非洲病毒株系BAI3分泌TAL效应物TALC诱导OsSWEET14的表达（Yuetal.2011）。在拟南芥根中，SWEET2的表达在腐霉菌感染期间是未感染根系的十几倍，由于AtSWEET2可以调节根系中糖分泌，减少碳源流向根际，所以通过调节SWEET2的表达可以增加拟南芥对腐霉菌的抗性（Chenetal.2015）。Asai通过分析番茄子叶感染灰霉病菌后SWEET家族基因的表达，结果表明只有SlSWEET15的表达上调，SlSWEET15可以为灰霉病菌菌丝的生长提供糖类营养物质（Asaietal.2016）。葡萄灰霉菌侵染后可引起VvSWEET4表达上调。1.5植物SUS基因家族研究进展在大多数植物中，蔗糖作为初级光合产物在源器官中合成后被运输到库器官中。在库器官中，蔗糖主要通过蔗糖转化酶（Inv）和蔗糖合成酶（SUS）转化为己糖，之后参与各类代谢途径中（Ruanetal.2010）。SUS可以催化蔗糖发生可逆反应，但其主要参与蔗糖的分解反应，蔗糖和UDP在SUS的作用下转化为果糖和UDP-葡萄糖，并且在调节生物合成，信号传导和储存功能的蔗糖分配中起着关键的作用（Kleczkowskietal.2010）。研究发现SUS具有四个亚基，分子量约83-100KD，其在植物组织中通常存在两种或更多种同功酶形式。其中，豌豆（Duncanetal.2006）中含有3个SUS基因，拟南芥、百脉根、水稻和桃树中（Baudetal.2004;Horstetal.2007;Hiroseetal.2008;Zhangetal.2015）都包含6个SUS基因，而玉米（Chenetal.2012）、白杨（（Anetal.2014）中含有7个SUS基因，二倍体的棉花基因组（GossypiumarboreumL.）包含8个SUS基因，目前研究发现的含有SUS基因最多的是四倍体棉花基因组（G.HirsutumL.）和可可（TheobromacacaoL.）（Zouetal.2013;Lietal.2015）都包含15个SUS基因。根据SUS基因结构及进化关系，植物中的SUS家族基因被分为三类，分别为SUSI、SUSII、SUSIII（Zhangetal.2013）。研究植物发育过程中SUS家族基因，有助于我们5 进一步了解SUS参与蔗糖代谢或其他发育过程中的作用。目前，对植物SUS家族基因的功能研究报道越来越多。通常认为，SUS在调节碳分配对植物细胞的储存功能和结构等各种重要的途径起关键作用（Haigleretal.2001;Ruanetal.2008）。SUS活性也与纤维素合成有关，它可以提供UDP-葡萄糖作为细胞壁增厚和棉花纤维细胞发育的必需底物（Albrechtetal.2003;Fujiietal.2010）。例如，SUS强烈影响沉降强度并控制多少糖输入量和糖代谢能力，如与番茄果皮中淀粉含量呈正相关，在马铃薯中从蔗糖转化为淀粉（Geigenbergeretal.2003）。此外，SUS参与调节几种发育过程，如开花诱导（Ohtoetal.2001），种子发育（Iraqietal.2001），细胞分裂（Gaudinetal.2000）和储存产物的积累（Rooketal.2001）。因此，蔗糖代谢的研究对于植物生理学的许多方面是至关重要的。在水稻和柑橘等其他植物中观察到SUS基因的表达模式具有组织特异性和发育依赖性（Hiroseetal.2008;Komatsuetal.2002）。1.6本研究的目的和意义研究表明，糖含量及糖代谢在植物与病原菌互作过程中发挥重要的作用，一方面，植物的免疫反应在糖信号分子的调节下发生；另一方面，糖还可能作为病原菌的营养物质在微生物入侵过程中发挥功能，尽管已经有部分病原菌与植物互作引起糖代谢变化的研究，但关于苹果褐斑病侵染过程中糖含量及糖代谢方面的研究并不多。本研究以苹果褐斑病感病品种‘太平洋玫瑰’、抗病种‘山定子’的离体叶片为试材，人工接种苹果褐斑病病菌，通过测定褐斑病病菌胁迫下不同时期苹果叶片糖酸含量及糖代谢过程中关键基因的表达，从生理生化和分子机制水平探讨褐斑病病菌侵染对宿主糖代谢的影响。通过转基因‘绿袖’株系及‘嘎啦’叶片进行褐斑病接种试验，进一步验证苹果褐斑病病原菌对苹果叶片碳水化合物代谢的影响以及不同碳源对苹果褐斑病抗性的影响，同时测定苹果不同种质资源叶片糖酸含量并分析其与褐斑病抗性的相关性，为褐斑病病原菌侵染苹果叶片过程中碳水化合物的代谢响应机制分析提供理论依据，最后，我们通过分析苹果基因组中蔗糖合成酶基因家族成员的结构特征及表达特性，为后期苹果SUS基因参与的糖代谢机制及抗病机制研究提供理论基础。6 第二章苹果叶片可溶性碳水化合物对褐斑病的响应2.1材料与方法2.1.1试验材料苹果褐斑病感病品种‘太平洋玫瑰’（M.domesticaBorkh.cv.PacificRose/PR），‘嘎啦’（M.domesticaBorkh.cv.gala），抗病野生种山定子（MalusbaccataBorkh./S）（付聪慧等2014），Sor（IA3、IA4）和Suc（IS3、IS6）合成抑制的转基因及野生型（Wild）‘绿袖’盆栽二年生株系（冯凤娟2013）及种质资源苹果株系均定植于西北农林科技大学北校区园艺场。于苹果褐斑病流行月份从西北农林科技大学园艺场采摘带成熟分生孢子盘的新鲜苹果褐斑病病叶。用无菌水冲洗采集的新鲜病叶，随后自然晾干，室温25℃培养至有分生孢子溢出，将所得叶片置于灭菌的三角瓶内，瓶内加适量无菌水后封口，在适宜温度下震荡培养2-3h，纱布过滤即为分生孢子悬浮液，用血球计数板于显微镜下观察计5数，配制至浓度为10个/ml分生孢子悬浮液（赵晶等2012;Zhangetal.2016）。2.1.2试验方法2.1.2.1苹果褐斑病接种于2015年8月在西北农林科技大学园艺场采集大小、成熟度相近的‘太平洋玫瑰’、‘山定子’叶片，75%酒精消毒后用无菌水冲洗至无消毒液残留，于盛有无菌水的烧杯中剪去叶柄末端，用脱脂棉迅速缠绕叶柄，加无菌水使脱脂棉湿透，置于铺有湿润滤纸的不锈钢托盘中，自然晾干叶片表面水分，用软刷蘸取菌液均匀刷于叶片正反表面，对照用无菌水同样处理，完成后用保鲜膜敷盖托盘进行保湿。将托盘置于25℃进行培养，于接种后0h，6h，24h，48h，72h，96h，144h取样，液氮速冻后，-80℃保存备用，设三组生物学重复（Lietal.2014）。转基因株系接种后进行褐斑病病情指数统计试验，每个株系接种2-3盘共计80片左右叶片，于接种后7d统计转基因各株系接种叶片褐斑病发病及病斑大小。同时，设置接种组和对照组试验，于接种后0d，1d，4d，7d分别采样，液氮速冻后冻存于-80℃备用。2.1.2.2‘嘎啦’叶片糖饲喂用终浓度2%的不同类型糖溶液（CK（Sor：Suc=8：2）、Suc、Sor）饲喂‘嘎啦’枝条2h后，取下大小、生长一致的叶片消毒，蒸馏水洗后于不锈钢托盘内接种褐斑病病原菌，期间，不断补充不同饲喂糖溶液以保持水分，分别于接种后1d、3d和5d取样，冻存于-80℃。7 2.1.2.3RNA的提取及cDNA的合成RNA提取使用购自天根公司的RNAprepPurePlantKit（Polysaccharides&Polyphenolics-rich）试剂盒，并按照说明书步骤操作，完成后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，之后用NanoDropLite分光光度计（ND2000，USA）测定其-1浓度并将其调至200ng•μL。根据制造商的说明书，反转录使用PrimeScriptTMRT-PCRKitII（TaKaRa，Kyoto，Japan）试剂盒，将每个样品的1μg总RNA用于cDNA合成。用无RNase的水以1：10稀释，储存于-20℃备用。2.1.2.4实时荧光定量PCR分析表2-1定量PCR相关基因引物（F:正义引物；R:反义引物）Table2-1PrimersofgenesinappleforqRT-PCR.(F:forward;R:reverse)基因GeneFSequence（5’-3’）RSequence（5’-3’）ActinAACAATGCTAGGGAACACGGCTCTACAGGAAGTAGAAGATGGCGGACAPR1GCAGCAGTAGGCGTTGGTCCCTCCAGTGCTCATGGCAAGGTTTTPR5AACTAGCATCCAAAGCTAGCCCCACAGTCTGCAGTTTCACAAGβ-1,3-glucanaseTGCCGTAGGAAACGAAATTGATGGAGGAAAGGAATTChitinaseTGGAGGATGGGAAAGTGCGGGTGAGTTGGATGGGTCMdSUSY1CTCAAGCGTGTTAAGCAACAGCTGAATGGAACACGAAGAATATCMdSUSY2TGTGGTTGGTGGTTACATGGATGGCTGCTATCCATCGGAACTGACMdSUSY3TTATGGTTTCTGGAAGTATGTGTCGTCGATGGCTTCAGGAACAGATTMdSUSY4GACAGGAACAAGCCAATCATCTGCCTTCTCCTCATTGTCCTTGMdSDH1ATAGAGGAAGTTGGGAGTGAGGTTCTCCTGGATGGACAACCTGATTMdSDH2ACACCATCAAGATCCTACCTTTCCATTTCATGGTCTTGAGGTAGTGMdSPS1AGTGTAGTACTCAAGGGAGTTGGTGCTCATGGGGAAGGCTTTACMdSPS6AGGTTCTGTTGAGTATGGCAGTGAGGTGCTTCAAGTGCCGCTGAGAMdSWEET1.1/2AGAATAATGAGAAACCGTGCCACCTACTGAATTGACCGTCATAACCATMdSWEET1.3TGGTCGGATACCTGAGTGTTGCAGGGTCCTTGAGCACTCCMdSWEET1.4/5GGCAATATCTGTGCAATTTCGTCTTCACTATAGGCAGGCCATACCMdSWEET1.6CTTCATCATTTTTGCCCCAAAG'CGAGCTATACATGATGACGGAGAACMdSWEET1.13GCGACTGTCTTCATCATTTTCGCCCCACCAGGGGAGAAGCATACAMdSWEET2.1CACGGCACCAAGAACAGGTCTATGATGAGAGCATAAGCGGTCCAGMdSWEET2.3GTCAGTACAACTAAAGAGCGCGGTCTCCACCATTTGGAATCAGAATATTGATMdSWEET2.4TTGGCCTAGTTTGCATTCTAGGTAGGATGAGAGCATATGTGAACCAGMdSWEET3.9CGACAGAAGGATTCCACTCGGTGATGACGATGTAGATCATCTCTGCMdSWEET3.10/11CACTCGGTGCCATATCTGGTAGCTCACTGTCAACTTCCTAGCTTCCT用Premier5.0软件进行引物设计，以苹果cDNA序列（https://www.rosaceae.org/）为模板设计定量特异引物，并以MdActin基因（登陆号GQ339778）作为内参（Fanetal.2011）。试验相关引物序列见表2-1。RT-qPCR反应按照试剂盒SYBR®PremixExTaq™II说明书操作进行，将反转录产物浓度稀释至100ng/μL后取2μL作为模板。基8 因的相对表达水平为目的基因的拷贝数相对于内参基因actin拷贝数的倍数；计算方法采用-2-△△CT（邓文星等2007）。用iQ5.0仪器（Bio-Rad，USA）进行PCR扩增。反应体系如下：10μLSYBRII、0.8μLForwardPrimier、0.8μLReversePrimier、2μLcDNA，之后用RNase-FreeWater补至20μL。实时荧光定量PCR程序为：95℃10min，95℃10s，58℃20s，72℃20s，收集荧光信号，40个循环；随后绘制溶解曲线56℃-95℃20s。2.1.3数据统计分析-ΔΔCt参考马新立（2014）方法，定量分析以MdActin为内参。用-2法计算检测基因相对表达量，每个基因表达测定重复3次。糖含量数据统计分析用SPSS16.0软件，作图使用sigmaplot10.0软件，采用one-wayANOVA方法对每个变量进行Duncan检验（P<0.05），所有数据均以平均数±标准差（SD）表示。2.2结果与分析2.2.1太平洋玫瑰和山定子叶片糖代谢对褐斑病的响应2.2.1.1接种褐斑病后叶片糖酸含量分析选用感病品种‘太平洋玫瑰’和抗病野生种‘山定子’作为材料进行试验（图2-1）。接种6d‘太平洋玫瑰’叶片出现病症，而‘山定子’未出现，接种10d后‘太平洋玫瑰’叶片发病严重，‘山定子’仍无明显变化。图2-1不同抗性材料叶片接种褐斑病结果Figure2-1EffectofdifferentresistenceappleleavesafterinoculatedwithDiplocarponcoronaria.9 40100PR-CKPR-CKPR-TPR-TS-CK35S-CK80S-TS-T306025402020Sucrose(mg/gFW)Sorbitol(mg/gFW)1500h6h24h48h72h96h144h0h6h24h48h72h96h144h80.6PR-CKPR-CKPR-TPR-T0.5S-CKS-CKS-T6S-T0.40.340.20.12Glucose(mg/gFW)Fructose(mg/gFW)0.00-0.10h6h24h48h72h96h144h0h6h24h48h72h96h144h180.7PR-CKPR-CKPR-TPR-T16S-CK0.6S-CKS-TS-T140.5120.4100.380.26Manntiol(mg/gFW)0.1Malicacid(mg/gFW)40.00h6h24h48h72h96h144h0h6h24h48h72h96h144hHoursafterinoculationHoursafterinoculation图2-2不同抗性材料叶片在接种褐斑病前后糖酸含量变化（CK表示未接种处理；T表示接种处理）Figure2-2Changesofsugarandacidinleavesofdifferentresistancematerialsbeforeandafterinoculation（CK-Control;T-Inoculation）一般认为，病原菌侵染植物后，会引起寄主植物碳水化合物代谢改变。如图2-2，与未接种‘山定子’相比，接种后的‘山定子’叶片中苹果酸含量下降，但在‘太平洋玫瑰’叶片中与之相反，苹果酸含量随接种时间先上升后下降。整体来说，‘山定子’叶片苹果酸含量明显高于‘太平洋玫瑰’叶片。甘露醇与葡萄糖变化趋势相似，其中，‘太平洋玫瑰’叶片在接种48h前低于未接种，随后高于对照，在144h后又接近未10 接种叶片，而‘山定子’在接种48h前与之相反，48h后差异不明显。果糖、蔗糖和山梨醇含量在‘山定子’叶片接种前后均无明显变化，但在‘太平洋玫瑰’叶片中含量随接种时间变化呈现折线变化，果糖和蔗糖在接种后期均高于未接种，尤其是果糖含量，在接种后144h达到了未接种的1.6倍，而山梨醇含量在接种后期低于未接种，山梨醇含量在‘太平洋玫瑰’叶片中显著高于‘山定子’中。2.2.1.2接种后褐斑病后叶片糖代谢与SWEET关键基因表达分析图2-3不同抗性材料接种褐斑病前后糖代谢相关基因表达测定（CK表示未接种处理；T表示接种处理）Figure2-3Determinationofsugarmetabolismrelatedgeneexpressionbeforeandafterinoculationindifferentresistancematerials（CK-Control;T-Inoculation）通过糖含量结果分析，我们认为接种褐斑病对苹果叶片糖代谢有影响，为进一步分析苹果叶片糖代谢对褐斑病病原菌侵染的响应，我们测定了山梨醇脱氢酶SDH1和SDH2和蔗糖磷酸合成酶SPS1和SPS6在两个材料接种前后的表达。其中，SDH1和SDH2在不同抗性材料中均无明显变化。但蔗糖磷酸合成酶SPS1和基因在不同材料中表达有所差异，其表达差异性可能与材料抗性有关，SPS表达高的‘太平洋玫瑰’感病性较强。此外，接种24h后SPS基因在抗病材料‘山定子’中表达明显降低。而蔗糖磷酸合酶（SPS）是一种可逆性酶，其主要的反应物为果糖-6-磷酸和尿苷二磷酸葡萄糖，它能催化产生蔗糖合成的前体物质蔗糖-6-磷酸（吕英民，张大鹏2000；王丽娟2013），11 说明在抗病材料中蔗糖合成降低，所以我们推测不同材料叶片蔗糖含量可能与褐斑病抗性有关。MdSWEET1.1/1.2MdSWEET1.3101024h24h48h48h72h72h11RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.1MdSWEET1.4/1.5MdSWEET1.6101024h24h48h48h72h72h11RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.1MdSWEET1.13MdSWEET2.1101024h24h48h48h72h72h11RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.1MdSWEET2.3MdSWEET2.41001024h24h48h48h72h72h10110.1RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.01MdSWEET3.9MdSWEET3.10/3.11101024h24h48h48h72h72h110.1RelativeExpressionLevel0.01RelativeExpressionLevel0.1PR-CKPR-TS-CKS-TPR-CKPR-TS-CKS-T图2-4不同抗性材料接种褐斑病前后SWEET基因表达测定（CK表示未接种处理；T表示接种处理）Figure2-4DeterminationofSWEETgeneexpressionbeforeandafterinoculationindifferentresistancematerials（CK-Control;T-Inoculation）此外，我们还分析了苹果叶片中SWEET基因在接种前后的表达变化。结果表明12 （图2-4），在感病品种‘太平洋玫瑰’中，MdSWEET1.3、MdSWEET2.4、MdSWEET3.9、MdSWEET3.10/11表达相比对照明显下调，MdSWEET1.4/1.5和MdSWEET1.13表达上调。在抗病种‘山定子’接种过程中，只有MdSWEET2.3表达上调，MdSWEET1.13、MdSWEET2.4表达下调。虽然不同的SWEET基因表达模式不同，但它们的表达均受到褐斑病病菌的影响，我们推测上调表达的SWEET基因可能为褐斑病病菌入侵提供碳源物质，而下调SWEET基因则多半参与植物自身的抗病及防卫反应。在这10个SWEET基因中，MdSWEET1.3表达量最高，其余则相对较低。2.2.2转基因‘绿袖’苹果株系褐斑病抗性鉴定2.2.2.1转基因‘绿袖’苹果糖含量测定及发病率统计图2-5不同转基因‘绿袖’苹果叶片接种褐斑病7d结果Figure2-5Effectofdifferenttransgenicplantleafphenotypeat7dafterinoculationwithDiplocarponcoronaria.为进一步确定蔗糖和山梨醇代谢途径对苹果褐斑病病原菌入侵的影响，我们利用蔗糖和山梨醇合成抑制的转基因株系进行验证。取生长一致的健康株系叶片表面消毒后接种褐斑病病原菌。根据接种7d后‘绿袖’叶片褐斑病结果来看（图2-5），山梨醇合成抑制的转基因株系（IA3和IA4）褐斑病接种后发病最重，蔗糖合成抑制转基因株系（IS3和IS6）发病最轻，野生型株系（Wild）发病居中。由此我们可以看出，相比野生型株系来说，蔗糖合成抑制的转基因株系增加了植株原本对褐斑病病原菌的抗性，而山梨醇合成抑制的转基因株系增加了褐斑病的感病性。这说明苹果叶片蔗糖和山梨醇含量的高低在抵抗苹果褐斑病病原菌的入侵过程中发挥着重要的作用。13 表2-2转基因株系发病率统计Table2-2Statisticsofincidencefortransgenicplantlines离体评价Invitro株系病斑直径发病率D（cm）Incidence（%）IS30.9941.51IS60.8539.39IA30.8893.75IA40.8887.10Wild0.7877.78统计接种后的发病率（表2-2），我们发现发病率与接种结果一致，蔗糖合成抑制转基因株系（IS3和IS6）发病率要低于山梨醇合成抑制转基因株系（IA3和IA4）。说明苹果叶片蔗糖含量降低后增加了对褐斑病病原菌的抗性。与糖饲喂‘嘎啦’叶片接种褐斑病结果相对应，蔗糖含量对苹果褐斑病入侵有着重要的作用，根据以上结果，我们初步认为蔗糖含量高可促进褐斑病病原菌对苹果叶片的侵染，蔗糖含量降低则减轻褐斑病病原菌的入侵。3030CKCKInoculationInoculation2525202015151010Sucrose(mg/g)Sorbitol(mg/g)5500WildIA3IA4IS3IS6WildIA3IA4IS3IS63.510CKCKCK3.0InoculationInoculationInoculation2.512.01.50.11.0Glucose(mg/g)Fructose(mg/g)0.50.00.01WildIA3IA4IS3IS6WildIA3IA4IS3IS62510CKCKInoculationInoculation20115100.1Malicacid(mg/g)5Myo-Inositol(mg/g)00.01WildIA3IA4IS3IS6WildIA3IA4IS3IS6图2-6‘绿袖’叶片接种褐斑病7d后糖酸含量变化（Wild为野生型株系，IA3、IA4为Sor合成抑制株系，IS3、IS6为Suc合成抑制株系）Figure2-6ChangesofsugarandMalicacidcontentafterinoculated7Daysin‘Greensleeves’(Wild-WT,IA3andIA4-decreationofsorbitol,IS3andIS6-decreasingofsucrose)14 接着，我们又测定了转基因株系接种褐斑病病原菌前后糖酸含量变化（图2-6）。整体来看，在接种褐斑病病原菌后叶片苹果酸含量均增加，葡萄糖和蔗糖含量在山梨醇合成抑制株系中增加且均高于野生型株系，在蔗糖合成抑制株系中减少至与野生型株系相近，而山梨醇含量在山梨醇合成抑制株系中增加，在蔗糖合成抑制株系中降低。25350d0d301d1d）20）4d4d257d7dmg/g15mg/g20（（101510Sucrose5Sorbitol500WildIA3IA4IS3IS6WildIA3IA4IS3IS63.5300d0d3.01d251d）4d）4d2.57d7d20mg/gmg/g2.0（151.5101.0Glucose0.5（Malicacid50.00WildIA3IA4IS3IS6WildIA3IA4IS3IS6DayafterinoculationDayafterinoculation图2-7‘绿袖’叶片接种褐斑病后糖酸含量随时间变化（Wild为野生型株系，IA3、IA4为Sor合成抑制株系，IS3、IS6为Suc合成抑制株系）Figure2-7ChangesofsugarandMalicacidcontentwithtimeafterinoculatedin‘Greensleeves’(Wild-WT,IA3andIA4-decreationofsorbitol,IS3andIS6-decreasingofsucrose)同时，我们还测定了不同株系在接种褐斑病过程中糖酸含量变化。分别测定了接种后0d、1d、4d和7d各株系叶片中糖酸含量的变化（图2-7），其中，苹果酸、山梨醇和蔗糖含量在各转基因株系中变化与野生型株系中变化一致，均表现为先上升后下降。2.2.2.2转基因‘绿袖’株系抗病相关基因表达接下来，我们测定了野生型和转基因株系中抗病相关基因PR1、PR5、β-1,3-Glucanase和Chitinase的表达量。结果表明（图2-8），未接种褐斑病时，抗病相关基因在各株系中表达量相近，但接种后抗病相关基因表达量明显高于未接种叶片，且随着接种时间的增加其表达量增加。抗病基因PR1和PR5在转基因株系中表达量均低于野生型株系，且接种初期在山梨醇合成抑制转基因株系中表达量低于蔗糖合成抑制转基因株系，接种后期各株系表达量相近。随着接种时间的增加，Chitinase和β15 -1,3-Glucanase表达量在蔗糖合成抑制转基因株系中均低于山梨醇合成抑制转基因株系。测定的四个抗病相关基因在未接种和接种1d各材料中表达量相近，但随接种时间变化表达量有所差异，其中PR5表达量最高，达到了接种初期的1000倍。本试验表明，叶片中山梨醇与蔗糖含量对褐斑病的抗性有着一定的影响。MdPR1MdPR5100010000IA3IA3IA4IA41000100IS3IS3IS4IS6Wild100Wild101011RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.1Chitinaseβ-1,3-Glucanase101IA3IA3IA4IA41IS30.1IS3IS6IS6WildWild0.10.010.010.001RelativeExpressionLevel0.001RelativeExpressionLevel0.0001CK1d4d7dCK1d4d7dDayafterinoculationDayafterinoculation图2-8转基因株系中抗病基因表达测定（Wild为野生型株系，IA3、IA4为Sor合成抑制株系，IS3、IS6为Suc合成抑制株系）Figure2-8Determinationofdisease-resistancegeneexpressionbeforeandafterinoculationindifferenttransgenicplantleafs（Wild-WT,IA3andIA4-decreationofsorbitol,IS3andIS6-decreasingofsucrose,CK-Control,1,4,7d-inoculation）2.2.3不同糖饲喂‘嘎啦’叶片糖代谢对褐斑病响应分析2.2.3.1‘嘎啦’叶片接种褐斑病后糖含量变化为验证感病品种叶片接种褐斑病过程中糖酸含量变化，我们又测定了感病品种‘嘎啦’叶片接种褐斑病前后糖酸含量变化。结果表明（图2-9），接种褐斑病后苹果酸、葡萄糖、山梨醇、蔗糖含量都有呈现下降趋势，其中，葡萄糖随接种天数增加下降最多。这可能是褐斑病侵入过程中利用了叶片中的蔗糖，从而导致葡萄糖来源减少，合成降低，含量下降。这充分说明了褐斑病接种后对苹果叶片的糖含量变化有明显的改变作用，于是，接下来我们又做了不同糖饲喂苹果叶片后对褐斑病的响应。结果如下：16 1430CKCK12inoculationinoculation25））1020mg/g8mg/g（（156104SucroseSorbitol52000d1d3d5d0d1d3d5d68CKCKinoculationinoculation5））64mg/gmg/g（（3422Glucose1Malicacid000d1d3d5d0d1d3d5dDayafterinoculationDayafterinoculation图2-9‘嘎啦’叶片接种褐斑病后糖酸含量变化Figure2-9ChangesofsugarandMalicacidcontentwithtimeafterinoculatedin‘Gala’leaves（CK-Control,0,1,3,5d-inoculation）通过对比抗病与感病材料叶片中糖代谢对褐斑病的响应后，我们认为蔗糖含量对褐斑病病原菌的入侵起着重要的作用，接下来我们用终浓度2%的不同类型糖溶液（CK（Sor：Suc=8：2）、Suc、Sor）分别饲喂‘嘎啦’叶片后接种褐斑病病原菌。接种结果表明，蔗糖饲喂的叶片最早发病，接种5d时出现褐色小点，随后出现褪绿症状，接种10d后出现坏死斑。ck饲喂叶片也是在接种5d时出现症状，但没有Suc饲喂症状明显，到接种10d时出现大面积褪绿症状，部分坏死斑。而山梨醇饲喂的叶片发病较晚，在接种7d时才出现黑色小点，10d时部分褪绿、坏死，发病较为明显，但相对于ck和Suc饲喂的叶片发病都要轻。同时，我们还观察到，饲喂蔗糖的叶片发病最严重，ck次之，而饲喂山梨醇的叶片发病最轻（图2-10）。17 图2-10不同糖饲喂‘嘎啦’叶片接种褐斑病结果（2%ck：80%Sor+20%Suc）Figure2-10Effectofdifferentsugarfed‘Gala’leafphenotypesafterinoculationwithDiplocarponcoronaria（2%ck:80%Sor+20%Suc）MdPR1MdPR51001000ckckSucSucSorSor100101011RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.1β-1，3-GlucanaseChitinase110ckckSucSucSorSor10.10.1RelativeExpressionLevel0.01RelativeExpressionLevel0.011d3d5d1d3d5dDayafterinoculationDayafterinoculation图2-11不同糖饲喂‘嘎啦’接种褐斑病前后抗病相关基因表达测定Figure2-11Determinationofdiseaseresistancerelatedgeneexpressionbeforeandafterinoculationindifferentsugarfed‘gala’leaves18 2.2.3.2接种褐斑病后‘嘎啦’叶片抗病相关基因表达分析根据糖代谢相关基因的表达我们认为褐斑病入侵苹果叶片过程中与糖代谢有着密切的关系，尤其是蔗糖的含量，因此，为了探究糖含量对病原菌入侵在分子水平的影响，我们测定了抗病基因PR、β-1,3-Glucanase和Chitinase在不同糖饲喂材料中的表达情况。结果表明（图2-11），抗病基因在不同糖饲喂材料中表达不一致，其中PR1和PR5表达量最高，且随着接种天数的增加表达量急剧上升。β-1,3-Glucanase和Chitinase随接种时间的增加先升高后降低。在接种初期，蔗糖饲喂叶片中PR5和β-1,3-Glucanase表达量最低，在ck饲喂叶片中表达次之，而在山梨醇饲喂叶片中表达量最高，这表明接种初期蔗糖对褐斑病菌的入侵起着重要的作用，可能为病原菌的入侵提供了营养物质，从而加速了病原菌入侵，抑制了植物的防卫反应，致使抗病基因的表达量在所有材料中最低，也解释了蔗糖饲喂叶片为什么在接种褐斑病后发病最严重。2.2.3.3接种褐斑病后‘嘎啦’叶片糖代谢及SWEET基因表达分析在2.2.1中我们通过不同抗性材料糖代谢对褐斑病病原菌的响应分析，认为叶片蔗糖含量与褐斑病病原菌的入侵可能有关，因此，我们又测定了蔗糖合成酶基因的表达（图2-12）。结果表明，测定的4个蔗糖合成酶基因MdSUSY1、2、3和4基因的表达在接种过程中均呈现上调趋势且随着接种时间的增加，其表达量上升更为明显。这表明了SUSY基因在褐斑病入侵过程中发挥重要的作用，因此，我们还分析了苹果中SUSY家族基因。另外，我们测定了山梨醇脱氢酶和蔗糖磷酸合成酶基因的表达，随着接种时间的变化，其表达量有小幅度的下调，但变化并不明显。MdSDH1MdSDH21010CKCKTT11RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.1MdSPS1MdSPS61010CKCKTT11RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.11d3d5d1d3d5dDayafterinoculationDayafterinoculation19 MdSUSY1MdSUSY21010CKCKTT11RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.11d3d5d1d3d5dMdSUSY3MdSUSY41010CKCKTT11RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.11d3d5d1d3d5dDayafterinoculationDayafterinoculation图2-12接种褐斑病后‘嘎啦’叶片糖代谢相关基因表达Figure2-12Determinationofsugarmetabolismrelatedgeneexpressionbeforeandafterinoculationin‘Gala’leaves（CK-Control,1,4,7d-inoculation）MdSWEET1.1/1.2MdSWEET2.41010CKCKTT110.1RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.01MdSWEET3.9MdSWEET3.10/3.111003.5CKCKT3.0T2.5102.01.511.00.5RelativeExpressionLevel0.1RelativeExpressionLevel0.0图2-13接种褐斑病前后‘嘎啦’叶片SWEET基因表达Figure2-13DeterminationofSWEETgeneexpressionbeforeandafterinoculationin‘Gala’leaves（CK-Control,T-inoculation）20 同样的，我们又测定了糖代谢相关基因在‘嘎啦’叶片接种前后的表达，首先是SWEET家族基因的表达，根据第二章结果我们选择了变化显著的四个SWEET基因（MdSWEET1.1/1.2、MdSWEET2.4、MdSWEET3.9和MdSWEET3.10/11）进行检测，结果显示（图2-13），MdSWEET1.1/1.2和MdSWEET2.4在接种过程中表达下调，而MdSWEET3.9和MdSWEET3.10/11接种后呈折线变化。2.2.4种质资源糖含量测定及其与褐斑病抗性相关性分析2.2.4.1野生种种质资源糖含量测定及其与褐斑病抗性相关性分析图2-14野生种质资源叶片主要糖酸含量Figure2-14ContentofSugarandacidinwildgermplasmleaves我们测定了33种野生种质资源叶片糖酸含量，如图2-14所示，不同种质资源糖酸含量有所差异，但总体叶片山梨醇含量最高，为16-29mg/g之间，苹果酸含量次之，为3-15mg/g之间，蔗糖含量略低于苹果酸含量，为5-16mg/g之间，葡萄糖含量最低，为0-6mg/g以内。其中，苹果酸含量在10-15mg/g之间最多，占总体的55%，5-10m/g之间占39%。葡萄糖含量在2-5mg/g比例最高，为64%，5mg/g以上和2m/g以下均占到18%。山梨醇在20-25mg/g之间比例最高，为58%，>25mg/g资源占27%，<20mg/g占15%。蔗糖含量在10-15mg/g比例为55%，>15mg/g占6%，<10mg/g占39%。21 表2-3野生种质资源糖酸含量与褐斑病相关性分析Table2-3RelationshipbetweencontentofSugarandacidandMarssoninacoronariaresisranceInwildgermplasmleaves苹果酸葡萄糖山梨醇蔗糖离体直径活体面积抗病性相关系数（Pearson）1-0.2390.048-0.045-0.165-0.1300.130苹果酸显著性（双尾）0.1810.7900.8030.3600.4710.472**相关系数（Pearson）10.2280.4580.158-0.079-0.020葡萄糖显著性（双尾）0.2020.0070.3800.6620.912相关系数（Pearson）10.279-0.222-0.2600.137山梨醇显著性（双尾）0.1160.2140.1450.447相关系数（Pearson）10.0320.058-0.029蔗糖显著性（双尾）0.8580.7500.874****相关系数（Pearson）10.655-0.820离体直径显著性（双尾）0.0000.000**相关系数（Pearson）1-0.762活体面积显著性（双尾）0.000相关系数（Pearson）1抗病性显著性（双尾）**相关系数<0.01，相关性在0.01水平显著*相关系数<0.05，相关性在0.05水平显著**Correlationcoefficient<0.01.Correlationissignificantatthe0.01level.*Correlationcoefficient<0.05.Correlationissignificantatthe0.05level.接下来，我们分析了野生种质资源叶片糖含量与苹果褐斑病抗性的相关性（资源接种试验数据引自殷丽华2012）。结果如表2-3所示，葡萄糖与蔗糖、离体直径与活体面积和抗病性在0.01上没有显著相关性，叶片糖酸含量与抗病性和离体直径、活体面积也未呈现显著相关。2.2.4.2品种种质资源糖含量测定及其与褐斑病抗性相关性分析我们测定了15种品种种质资源叶片糖酸含量，如图2-15所示，品种资源之间叶片糖酸含量同样差距较大。其中，山梨醇含量在11-36mg/g之间，30mg/g以上品种资源占总量的20%，20-30mg/g之间和20mg/g以下均占40%。苹果酸含量大于10mg/g占13%，5-10mg/g之间占73%，5mg/g以下占14%。蔗糖含量大于10mg/g占6%，5-1022 mg/g占80%，5mg/g以下占14%。葡萄糖含量高于10mg/g占6%，5-10mg/g占40%，低于5mg/g占54%。图2-15品种资源叶片主要糖酸含量Figure2-15ContentofSugarandacidincultivargermplasmleaves同样的，我们分析了品种种质资源叶片糖含量与苹果褐斑病抗性的相关性（资源接种试验数据引自殷丽华2012）。结果如表2-4所示，无论是山梨醇还是蔗糖均与离体直径、活体面积及抗病性无显著相关性。表2-4品种质资源糖酸含量与褐斑病相关性分析Table2-4RelationshipbetweencontentofSugarandacidandMarssoninacoronariaresisranceincultivargermplasmleaves山梨醇蔗糖苹果酸葡萄糖离体直径活体面积抗病性**相关系数（Pearson）10.8950.4460.288-0.1330.271-0.188山梨醇显著性（双尾）0.0000.1460.3650.6810.3940.558*相关系数（Pearson）10.6800.1290.2570.228-0.115蔗糖显著性（双尾）0.0150.6890.4210.4760.723相关系数（Pearson）1-0.130-0.264-0.1630.263苹果酸显著性（双尾）0.6880.4080.6130.409相关系数（Pearson）10.004-0.096-0.269葡萄糖显著性（双尾）0.9910.7670.398***相关系数（Pearson）10.614-0.740离体直径显著性（双尾）0.0340.006**相关系数（Pearson）1-0.770活体面积显著性（双尾）0.003相关系数（Pearson）1抗病性显著性（双尾）**相关系数<0.01，相关性在0.01水平显著23 *相关系数<0.05，相关性在0.05水平显著**Correlationcoefficient<0.01.Correlationissignificantatthe0.01level.*Correlationcoefficient<0.05.Correlationissignificantatthe0.05level.2.3讨论2.3.1叶片糖含量与褐斑病抗性病原菌侵染植物后引起寄主植物体内糖代谢发生变化。不同抗性苹果叶片接种褐斑病后其糖酸含量变化不同。在‘山定子’中，苹果酸含量接种后下降，而在‘太平洋玫瑰’中恰好相反，接种初期苹果酸含量升高，接种褐斑病后苹果酸在两种材料中变化趋势相反，可能是由于病原菌的入侵，不同抗性寄主引发的防御反应不同，从而导致了叶片酸含量的变化不同。可溶性单糖甘露醇与葡萄糖在‘太平洋玫瑰’叶片接种48h内低于未接种，随后高于对照，在144h后又接近未接种叶片，而‘山定子’在接种48h内与之相反，48h后差异不明显，果糖与葡萄糖变化趋势在接种初期相反，可能是接种初期病原菌利用可能利用的糖分来生长繁殖，加速了糖代谢反应，使得可溶性单糖含量下降，这可能是由于可溶性单糖积累所需的碳源受到病原菌的限制所引起的。在接种后期，可能由于苹果叶片对褐斑病病菌侵染逐渐产生适应性，随着病原菌入侵增多，寄主抗病基因被诱导表达，促使植物体内小分子多糖水解，引起可溶性单糖的增加，从而为病原菌的生长发育提供充足的营养物质（李佐同等2009）。此外，山梨醇的含量在感病材料叶片接种过程中稍低于未接种叶片，而在抗病材料叶片中含量没有明显变化，说明苹果叶片碳水化合物代谢的紊乱是由于褐斑病病原菌的入侵引起的，可能降低了植株抵御外界不良环境的能力，继而出现光合作用下降，导致树体衰弱等现象（Jang&Sheen1994）。总体来说，苹果褐斑病病原菌的侵染使感病材料叶片中的甘露醇、葡萄糖、果糖和蔗糖在接种后期含量增加，山梨醇含量下降，而在抗病材料叶片中无明显变化，从而可以推测，感病材料叶片接种后期各类糖含量升高可能是受褐斑病病原菌诱导，山梨醇含量降低是受病菌对光合作用的抑制而产生的。通过对转基因‘绿袖’株系褐斑病抗性鉴定，我们发现相对于野生型株系，蔗糖合成抑制的转基因株系发病较轻，而山梨醇合成抑制的转基因株系发病较重。这与我们对‘嘎啦’叶片糖饲喂处理的结果一致，即当叶片蔗糖含量增加或者叶片山梨醇合成受到抑制时，褐斑病发病加重，而当叶片蔗糖合成受到抑制或者叶片山梨醇含量增加时，褐斑病发病减轻。这表明，苹果叶片褐斑病的入侵与其蔗糖和山梨醇的含量有关。通过测定不同转基因株系接种褐斑病前后叶片糖酸含量的变化，我们发现接种后叶片苹果酸含量均高于未接种，而葡萄糖、山梨醇和蔗糖在不同株系中呈现不同的变化趋势。其中，葡萄糖和山梨醇在野生型和山梨醇合成抑制的株系中均表现为接种后上升，24 但在蔗糖合成抑制株系中呈现下降。而蔗糖含量在各株系中变化与葡萄糖和山梨醇含量变化趋势相反，在野生型株系和山梨醇合成抑制株系中下降，而在蔗糖合成抑制株系中上升。同样的，在各株系接种过程中，苹果酸、山梨醇和蔗糖含量均表现为先上升后下降。谢为龙等研究表明，营养条件对褐斑病病原菌的孢子萌发有明显的促进作用（谢为龙和冷怀琼1988）。因此，试验中蔗糖和山梨醇合成抑制株系对褐斑病侵染后的反应会有所不同。病原菌入侵植物后会激发寄主产生一系列防卫反应来抵抗病原菌的侵染。其中包括产生ROS、HR反应、PR蛋白及植物保护素的合成和细胞壁的加厚等。这些反应大多发生在病原菌侵染植物的几小时至几天之内，这些反应需要消耗植物的大量能量，因此，糖代谢在植物防卫反应中的作用十分重要。通过糖酸含量测定，我们认为糖酸在苹果叶片抵御褐斑病病原菌入侵过程起着重要的作用，其中，酸的变化与糖的变化相反，苹果酸含量在接种后先下降后上升，而糖含量随接种时间下降幅度增大，可能是糖酸在褐斑病病原菌入侵过程中参与不同的防卫机制，从而导致含量变化的差异。已经有许多研究表明，糖含量在植物与病原菌的互作中发挥重要的作用，其中，细胞壁蔗糖转化酶通过水解质外体途径中的蔗糖，降低胞质中的蔗糖，从而蔗糖卸载中发挥关键作用（Patrick1997）。“库”加强的信号可以激发植物的防卫反应来抵抗病原菌的侵染（Hayesetal.2010;Hilletal.2011）。2.3.2糖代谢关键基因及抗病相关基因对褐斑病响应在褐斑病病原菌侵染过程中，不同阶段各种糖代谢关键基因对褐斑病病原菌的响应也有所不同。在‘太平洋玫瑰’叶片中，接种褐斑病病原菌后糖转运蛋白MdSWEET1.3、MdSWEET2.4、MdSWEET3.9、MdSWEET3.10/11表达相比对照明显下调，MdSWEET1.4/1.5和MdSWEET1.13表达上调。在‘山定子’接种过程中，只有MdSWEET2.3表达上调，MdSWEET1.13、MdSWEET2.4表达下调。虽然不同的SWEET基因表达模式不同，但它们的表达均受到褐斑病病菌的影响，我们推测上调表达的SWEET基因可能为褐斑病病菌入侵提供碳源物质，而下调SWEET基因则多半参与植物自身的抗病及防卫反应。研究表明，糖转运蛋白在植物中参与韧皮部装载、影响生殖发育、参与宿主-病原菌互作的抗病反应和胁迫反应等多个生理过程（Chenetal.2010）。糖转运蛋白表达模式不同，可能与各自的分工及家族分类有关，从而导致了其对病原菌的不同响应。其中表达上调的基因MdSWEET1.4/1.5和MdSWEET1.13可能对病原菌入侵起协同作用，这与水稻细菌性枯萎病的黄单胞菌与SWEET协同从寄主细胞中获取贮存的养分模式可能一致（Liuetal.2011）。糖不仅为新陈代谢提供能量，还在信号转导途径中发挥作用，进而影响植物生长发育过程中的部分基因的表达，而且许多物种中都存在糖诱导的反馈抑制光合作用得现象（Smeekens2000;Jang&Sheen1994）。此外，SWEET基因在植物与病原菌互作过程也发挥着重要的作用。研究表明水稻OsSWEET是一类重要的糖转运因25 子，可以受到水稻白叶枯病原菌分泌系统诱导，给病菌提供足够的营养来完成自身的增值和侵染过程（Chenetal.2010）。本试验中，MdSWEET基因在‘嘎啦’叶片感病初期均受到苹果褐斑病的不同诱导，这表明MdSWEET确实参与了褐斑病病原菌入侵过程，可能的原因是为其成功入侵提供营养物质，从而呈现出在接种后期表达下调的现象。除糖转运蛋白外，山梨醇脱氢酶（SDH1、SDH2）基因在不同抗性材料接种前后均无明显变化。蔗糖磷酸合成酶（SPS1、SPS6）基因在不同材料中表达呈现小幅下降，与图2-1蔗糖变化一致。高等植物体中蔗糖合成分别通过蔗糖合酶和磷酸蔗糖合酶催化。而蔗糖磷酸合酶（SPS）是一种双向酶，在光合组织中活性高，其主要的反应物为果糖-6-磷酸和尿苷二磷酸葡萄糖，它能催化产生蔗糖合成的前体物质蔗糖-6-磷酸（吕英民，张大鹏2000），说明在抗病材料中蔗糖合成降低，所以我们推测不同材料叶片蔗糖含量可能与褐斑病抗性有关。在测定糖代谢相关基因表达时，我们发现SUS表达被不同程度的诱导升高，SPS表达则持续下降，这与吴越（2014）在柑橘黄龙病中的结果一致，在库组织中SUS可能主要起分解蔗糖的作用，而在源组织中不具有明显的代谢功能。在正常生理条件下SUS的表达水平较低，但胁迫条件下在叶或其它器官中刺激表达，如在缺氧胁迫、渗透胁迫条件下诱导表达（Ricardetal.1991）。SPS主要起蔗糖合成作用，SPS表达下调，蔗糖合成降低，这也符合所谓的“高糖信号”现象（Horsfall&Diamond1959）。近年来，一些测序分析结果表也明，在病原菌与植物互作过程中，大量与糖代谢相关的基因表达显著上调或下调（Albrechtetal.2008）。本实验中，除SUS和SPS表达被诱导外，SDH的表达被诱导先升高后下降，这可能与褐斑病病原菌入侵后引起苹果叶片光合作用下降有关。此外，也有很多实验证明糖含量增加在植物与病原菌互作中起很重要的作用。在不同糖饲喂材料中，抗病基因的表达有所差异，尤其是在接种初期差异最为明显，说明糖含量在病菌入侵初期的作用尤为重要。其中，蔗糖饲喂材料接种褐斑病初期抗病基因表达最低，说明在苹果叶片中，高糖可能会抑制植物防卫反应的产生。同样的，不同转基因株系对褐斑病的抗性还可以通过其诱导的抗病相关基因的表达来分析。抗病基因表达量高说明抗病性强，本实验中，山梨醇和蔗糖合成抑制的转基因株系中抗病基因的表达均低于野生型株系，但在蔗糖合成抑制转基因株系中表达又高于山梨醇合成抑制的转基因株系，这表明叶片山梨醇合成抑制后降低了苹果植株对褐斑病的抗性。2.3.3种质资源褐斑病抗性评价我们通过对野生种质资源和品种种质资源的糖酸含量的测定，比较其糖酸含量的差异，我们可以明显的发现野生种质资源叶片的苹果酸含量明显高于品种资源叶片苹果酸含量，且其苹果酸含量大约为品种叶片苹果酸含量的1.5倍。同时，我们还发现，品种的可溶性碳水化合物含量比野生种叶片中含量也要稍高。这种现象可能的原因是随着苹26 果种质资源的进化和栽培品种的不断优化，叶片糖酸含量发生了明显的变化。而叶片碳水化合物含量的改变可能是作为源器官的叶片，其结构在进化过程不断改变，且向利于积累源器官碳水化合物的方向进行，从而使得果实库器官碳水化合物含量增加。我们比较分析了多种苹果叶片材料接种褐斑病前后糖酸含量的变化及糖代谢相关基因表达与苹果叶片褐斑病的关系，结果表明，苹果叶片褐斑病的发生及抗性与叶片的糖含量有显著的关系，尤其是蔗糖的含量与褐斑病的关系最为密切。因此，我们推测在种质资源中糖含量与褐斑病是否具有相关性。所以，在本章的试验中，我们测定了33种野生种质资源和15种品种种质资源糖酸含量，并分析了其与叶片褐斑病抗性的相关性。结果表明，种质资源叶片糖酸含量与叶片褐斑病抗性并没有表现出明显的相关性，其中，野生种和品种种质资源叶片蔗糖含量与褐斑病的抗性均表现为弱负相关，而与离体直径和活体面积表现为弱正相关，且品种资源叶片蔗糖含量与褐斑病抗性弱相关性更高一些，这种相关性也和我们的接种试验结果一致，但试验结果并没有表现出蔗糖含量与褐斑病抗性呈现显著相关，这与我们的预期结果不一致，可能是因为虽然本试验个别品种糖含量于褐斑病抗性有关，但在种质资源中其褐斑病抗性可能受多种因素影响，单一的糖含量变化与褐斑病抗性的相关性并不能说明其在整体中的关系。同时，种质资源的糖含量数据材料与接种数据材料（殷丽华2012）不是同一批材料，因此可能存在一定的误差，从而出现了相关性不显著的现象。27 第三章苹果SUSY基因家族分析第二章中，我们通过对苹果褐斑病感病品种太‘平洋玫瑰’和抗病种‘山定子’接种褐斑病试验结果表明，接种后期感病品种‘太平洋玫瑰’叶片蔗糖含量高于未接种叶片。接着，我们用不同类型糖饲喂嘎啦叶片，研究其对苹果褐斑病抗性的影响，结果表明，蔗糖饲喂叶片发病加重，这表明蔗糖含量对苹果褐斑病的发生有重要作用。随后，我们又利用sor/suc合成抑制转基因株系进一步验证山梨醇和蔗糖对苹果褐斑病抗性的影响，接种结果再次证明了蔗糖含量的降低增加了褐斑病的抗性，同时山梨醇含量的降低使得苹果褐斑病抗性下降。上述结果均表明蔗糖对苹果褐斑病的发生有重要的作用，除此之外，接种褐斑病后苹果蔗糖合成酶基因的表达也发生了显著的变化，均表现为接种材料中表达被诱导，这表明SUSY基因在褐斑病侵染过程中也具有十分重要的作用，然而，苹果中有关SUSY基因家族的研究并不全面，为系统分析SUSY在糖代谢和抗病中的作用，接下来我们对苹果基因组中SUSY家族基因的结构及其功能进行了分析。3.1材料与方法3.1.1试验材料本试验材料为西农北校区园艺场九年生‘嘎啦’苹果树。取幼芽尖端和成熟叶用以提取RNA，取样后将样品立即在液氮中冷冻并储存在-80℃直至使用。在开花后16，34，55，75，98和122天（DAB）随机收集果实，每个发育阶段收集10个果实，三次重复。果实去皮后切成小块，立即在液氮中冷冻后冻存于在-80℃。所有样品同Wei等（2014）所述。3.1.2苹果SUS基因家族的搜索与注释先从拟南芥数据库（TAIR,http://www.arabidopsis.org/）中获得AtSUS基因的氨基酸序列，然后在蔷薇科植物基因组数据库网站（GDR,https://www.rosaceae.org/）中查找苹果参考基因组序列的同源基因（Velascoetal.2010）。筛选出Evalue<0.001且除去冗余序列并排除短的和同一性序列。然后使用蛋白质家族数据库（Pfam，http://pfam.xfam.org/）及（SMART,http://smart.emblheidelberg.de）检索候选基因的蛋白结构域，收集同时含有sucrosesynthasedomain和glycosyltransferasedomain的蛋白，即为预测到的苹果SUS基因3.1.3苹果SUS基因蛋白序列比对及进化分析用ClustalX2.0对筛选的苹果SUS基因序列进行比对，参数均为默认值。使用MEGA5.0软件对苹果、模式植物拟南芥、水稻SUS基因构建进化树，并按照拟南芥的分类方法进行分组，选择邻接法（Neighbor-joining,NJ）构建进化树，参数分别为：28 模型为JTT+G，缺失设置为“CompleteDeletion”，校验参数Bootstrap=1000。3.1.4苹果SUS基因外显子-内含子结构分析利用苹果SUS基因组和CDS序列在（GSDS,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）网站上生成苹果SUS基因的内含子-外显子结构图。3.1.5苹果SUS基因酶活性的测定根据Li等（2012）方法提取SUS酶。即称取0.5g样品加入2mL200mMMgCl2，2mMEDTA，2.5mMDTT，2mMBenzamidine，0.1mMleupeptin，0.1%BSA，2%glycerol，1%TritonX-100和4%polyvinylpyrolidone（PVPP）混匀，提取物于4℃，16000g离心20min，立即在SephadexG25PD-10柱中脱盐；然后测定SUS酶活性。将酶提取物（20μL）放于含有20mMHepes-KOH（pH7.0），100mM蔗糖和4mMUDP的测定培养基于27℃下孵育30min，定容至终体积为100μL后煮沸3min以终止反应，空白含有与变性提取物相同的测定物。以每小时UDPG产量计算SUS活性。3.2结果与分析3.2.1苹果SUS基因的鉴定与同源性分析参考拟南芥SUS蛋白序列，从苹果基因组（v1.0）序列中鉴定得到25条苹果SUS基因的相似序列（Velascoetal.2010）。在去除冗余序列及同一性序列，保留含有sucrosesynthase和glycosyl-transferase结构域的序列后，在染色体2，9，10，11，13，14，15和17上鉴定到11个SUS基因（图3-1），具体信息包括genebank登录号，染色体位置，蛋白质相关性质等（表3-1）。图3-1苹果中SUS基因在染色体上位置Figure3-1ChromosomallocalizationoftheappleSUSgenes,forwhichtheaccessionnumbershavebeenretrievedfromtheGenomeDatabaseforRosaceaeDatabase（http://www.rosaceae.org/）.29 表3-1苹果蔗糖合酶基因特征Table3-1.ThecharacteristicsofgenesencodingsucrosesynthaseinapplegenomeSuroseGlycosylCDS大小脂肪族拟南芥相似度%sythase结transferase结构分子质量蛋白等电基因名称基因IDMDP号（bp/氨基酸亲水性同源基因（A.a.）构域域（Da）点A.a）指数（N端）（C端）AT3G43190.1MdSUS1.1XM_008340067.1MDP00001605782421/80679.118-554564-74392588.416.0092.75-0.292（AtSUS4）AT3G43190.1MdSUS1.2XM_008393559.1MDP00002158892415/80476.148-551561-74092115.536.0094.08-0.241（AtSUS4）AT3G43190.1MdSUS1.3XM_008384702.1MDP00008722622424/80779.738-554561-74392350.576.0593.49-0.265（AtSUS4）AT3G43190.1MdSUS1.4XM_008339589.1MDP00002500702424/80781.588-554557-74392371.035.8795.18-0.266（AtSUS4）AT4G02280.1MdSUS2.1XM_008388452.1MDP00001269462526/84179.109-585588-77396349.525.7590.34-0.244（AtSUS3）AT5G49190.1MdSUS2.2XM_008352962.1MDP00005814061611/53655.451-320323-51060560.005.8090.39-0.172（AtSUS2）AT5G49190.1MdSUS2.3XM_008352963.1MDP00002932142403/80080.201-544547-73491241.175.9090.05-0.232（AtSUS2）AT1G73370.1MdSUS3.1XM_008348668.1MDP00002125932652/88364.8610-545548-73899251.776.9983.09-0.284（AtSUS6）AT5G37180.1MdSUS3.2XM_008383171.1MDP00001380042460/81967.679-542546-73292678.286.7987.89-0.306（AtSUS5）AT5G37180.1MdSUS3.3XM_008364350.1MDP00002048702268/75560.811-453459-64585364.757.1786.03-0.274（AtSUS5）AT5G37180.1MdSUS3.4XM_008355679.1MDP00002048712376/79163.729-358524-71190064.936.5885.80-0.284（AtSUS5）30 我们构建了苹果、拟南芥和水稻共23个SUS基因的进化树，来研究这3个物种SUS基因的进化关系。系统发育分析结果显示，这些SUS基因与拟南芥、水稻均分为三个基因家族：SUSI，SUSII和SUSIII（图3-2）。SUSI和SUSIII家族各包含四个成员；MdSUS1.1，MdSUS1.2，MdSUS1.3和MdSUS1.4,MdSUS3.1，MdSUS3.2，MdSUS3.3和MdSUS3.4。SUSII家族包含三个同源基因MdSUS2.1，MdSUS2.2和MdSUS2.3。整体来看，没有出现物种特异性的群体，表明SUS基因在植物进化中是较为保守的。图3-2苹果、拟南芥和水稻进化树Figure3-2PhylogentictreederivedfromaminoacidsequencesoftheSUSgenesinapple,ArabidopsisthalianaandOryzasativaL.Thenumbersnearthebranchesindicatebootstrapvaluescalculatedfrom1000replicateanalyses编码SUS的CDS和氨基酸序列分别为1611-2652bp和536-883aa。MdSUS与拟31 南芥中相应基因氨基酸序列相似度为55.45％-81.58％，两个保守结构域被鉴定为蔗糖合酶结构域和糖基转移酶结构域，其位于N末端和C末端（表3-1）。3.2.2苹果SUS基因结构和蛋白序列分析图3-3苹果基因组中11个MdSUS基因结构。（A）MdSUS基因的结构，内含子和外显子分别由黑色线和黄色框表示（B）MdSUS蛋白保守基序Figure3-3SchematicgenestructureofelevenMdSUSgenesinapplegenome.（A）StructureofMdSUSgenes.Intronsandexonsarerepresentedbyblacklinesandyellowboxesrespectively.（B）AnalysiswithMEMEtoinvestigate15conservedmotifsofMdSUSproteins.Eachcoloredboxrepresentsconservativemotif.通过对苹果SUS基因cDNA序列及其相应的基因组序列在线分析，得到苹果中SUS基因的内含子-外显子结构图（图3-3），结果显示苹果SUS基因中外显子和内含子的数目分别为8-16和7-15。MdSUS2.2具有较少的外显子（8个外显子），而MdSUS2.1含最多的外显子（16个外显子）。苹果SUS基因外显子/内含子结构具有高度的保守性，该保守型特征与比对11个MdSUS基因氨基酸序列结果具有一致性（图3-3，表3-2）。除此之外，归类于同一组的SUS基因在外显子数目、大小和长度分布方面也具有相似的特征。MdSUS基因的ORF大小范围为2316bp（MdSUS3.3）-2700bp（MdSUS3.1），平均为2454bp（表3-2）。32 表3-2苹果MdSUS基因核苷酸/氨基酸序列的同一性/相似性分析Table3-2.Identity/similaritymatrixoftheelevenMdSUSnucleotide/aminoacid核酸序列相蛋白序列相似度%似度%MdSUS1.1MdSUS1.2MdSUS1.3MdSUS1.4MdSUS2.1MdSUS2.2MdSUS2.3MdSUS3.1MdSUS3.2MdSUS3.3MdSUS3.4MdSUS1.1100.0095.7795.5391.6967.2069.7267.1354.2553.9256.1152.54MdSUS1.299.21100.0092.5389.0564.6365.9864.5252.1051.9053.9950.59MdSUS1.396.1296.11100.0092.4367.7069.5367.2554.3753.4255.8252.28MdSUS1.492.3292.3492.66100.0054.5271.7868.9354.6854.2456.8852.99MdSUS2.166.4266.5466.3866.42100.0077.2476.7554.5255.0856.7853.62MdSUS2.270.0270.2967.6369.9074.98100.0096.8364.6865.0764.4963.88MdSUS2.367.9768.1869.4068.0175.0998.20100.0054.7254.5257.3453.94MdSUS3.159.2559.4059.2159.8158.5965.0159.92100.0071.1569.9370.76MdSUS3.259.5159.5859.3559.6560.7067.1160.8473.06100.0091.1091.36MdSUS3.360.0060.0360.1060.2060.8866.1661.3371.6091.38100.0093.46MdSUS3.458.7758.8058.9158.8759.5266.6060.2372.3191.7796.67100.0033 结合ClustalW2程序序列比对分析，与其他旁系同源物相比，MdSUS2.2与MdSUS2.3和MdSUS2.1氨基酸/核苷酸序列均具有高度的相似性/同一性（氨基酸水平分别为96.83％和77.24％，核苷酸水平分别为98.20％和74.98％），具体来说，MdSUS1.1和MdSUS1.2相比其他基因关系更为密切（氨基酸水平和核苷酸水平相似度分别为95.77％和99.21％）。MdSUS基因由536-883个氨基酸组成，其脂肪酸指数范围为85.09-95.18。11个MdSUS蛋白的预测分子量范围为85364.75-99251.77Da，平均值为89539.63Da，而预测的理论PI范围为5.75（MdSUS2.1）-7.17（MdSUS3.3），与大多数植物中的SUS蛋白相似（Komatsuetal.2002;Haradaetal.2005）。GRAVY指数表明所有的MdSUS蛋白都是亲水的（表3-2）。MEME网页用于分析11种MdSUS蛋白质中的保守基序。11个MdSUS基因家族成员不仅共享至少10个共同的保守基序组成，而且具有一致的基序排列顺序（基序4，7，12，3，2，13，5，8，1，6）（图3-3B）。此外，每个蛋白质序列中的基序3，2和13紧密连接（图3-3B，图3-4），尽管基序4，7和12之间的距离稍长。这些结果表明，保守结构可能使得MdSUS基因家族功能相似（Hu&Liu2011）。图3-4苹果SUS蛋白序列多重比对。相同（100％）和保守（81-91％）的氨基酸分别以深蓝色和粉红色阴影，保守基序用红色线标示Figure3-4MultiplesequencealignmentofSUSgenesinapple.Identical（100%）andconservative（81-91%）ofaminoacidareshadedindeepblueandpinkrespectively.Theconservedmotifswereorderedmarkedbyredlines.34 3.2.3苹果不同组织中MdSUS基因的表达和酶活分析为研究苹果不同组织器官中SUS基因的表达水平，我们利用qRT-PCR方法分析了苹果不同组织（茎尖、成熟叶片、幼果和成熟果）中11个SUS基因的表达。如图3-5所示，尽管MdSUS基因显示出不同的表达模式，但在四种不同的组织中均检测到表达。六个基因（MdSUS2.2，MdSUS2.3，MdSUS3.2，MdSUS3.3，MdSUS3.4和MdSUS3.1）在茎尖中表达量最高，而MdSUS1.1，MdSUS1.2和MdSUS1.3在幼果中较高表达。MdSUS2.1和MdSUS1.4在成熟果实中表达量最高。之后，我们还测定了SUS酶活性，在所有检查的组织中，SUS酶活性在茎尖中最高，并且在成熟叶中最低（图3-5D）。图3-5不同组织（茎尖，成熟叶，幼果和成熟果实）中MdSUS基因表达和SUSY酶活分析A.MdSUSI的表达；B.MdSUSII的表达；C.MdSUSIII的表达；DSUS酶活性（U/mg蛋白）Figure3-5ExpressionandSUSYenzymeactivityprofileofMdSUSgenesindifferenttissues:ShootTips,MatureLeaves,YoungFruitandRipeFruit;A.ExpressionofMdSUSI;B.ExpressionofMdSUSII;C.ExpressionofMdSUSIII;D.SUSenzymeactivity（U/mgProtein）.35 3.2.4果实发育阶段MdSUS基因的表达及酶活分析接下来，我们测定了MdSUS基因在苹果果实不同发育阶段的表达模式（图3-6）。结果显示，这11个MdSUS基因在果实发育的所有阶段均具有表达，其中MdSUS2.2，MdSUS2.3，MdSUS3.1，MdSUS3.2和MdSUS3.4表达量较低，而MdSUS1.1/1.2和MdSUS1.4在各阶段高度表达。虽然MdSUS2.1随果实发育阶段表达量增加，但多数基因如MdSUS1.3，MdSUS2.2，MdSUS2.3，MdSUS3.3和MdSUS3.1随果实发育阶段表达量降低。图3-6不同果实发育阶段MdSUS基因的表达分析：16DAB，34DAB，55DAB，75DAB，98DAB和122DAB；A.MdSUSI的表达；B.MdSUSII的表达；C.MdSUSIII的表达；D.SUS酶活性（U/mg蛋白）Figure3-6ExpressionprofileofMdSUSgenesatdifferentfruitdevelopmentalstages:16DAB,34DAB,55DAB,75DAB,98DABand122DAB;A.ExpressionofMdSUSI;B.ExpressionofMdSUSII;C.ExpressionofMdSUSIII;D.SUSenzymeactivity(U/mgProtein).同时，我们还测定了果实不同发育阶段SUS酶活性。结果表明，SUS酶活性在果实发育过程中逐渐下降。然后，通过分析MdSUS基因的表达与酶活之间的相关性（表36 3-3），我们发现在果实发育过程中与SUS酶活性和MdSUS2.2，MdSUS2.3，MdSUS3.1和MdSUS3.3的表达有显著相关性。表3-3苹果果实发育过程中MdSUS基因与SUSY酶活性相关性分析Table3-3CorrelationcoefficientbetweenrelativeexpressionabundanceofMdSUSwithSUSenzymeactivityduringfruitdevelopmentofappleMdSUSMdSUSMdSUSMdSUSMdSUSMdSUSMdSUSMdSUSMdSUSMdSUSMdSUS1.11.21.31.42.12.22.33.13.23.33.4SUS0.6770.6770.909*-0.456-0.8040.985**0.985**0.947**0.848*0.939**0.830*酶活0.1400.1400.0120.3630.0540.0000.0000.0440.0330.0050.041**相关系数<0.01，相关性在0.01水平显著*相关系数<0.05，相关性在0.05水平显著**Correlationcoefficient<0.01.Correlationissignificantatthe0.01level.*Correlationcoefficient<0.05.Correlationissignificantatthe0.05level.3.2.5山梨醇抑制和蔗糖抑制转基因苹果株系茎尖中MdSUS基因表达分析苹果中山梨醇和蔗糖从源器官产生，最后在库器官被利用（例如茎尖，果实）。为了研究MdSUS基因的表达水平与蔗糖浓度之间的关系，我们利用‘Greensleeves’苹果的三个转基因品系（A27，A04和A10）和未转化的对照株系来确定MdSUS活性是否受转录调节（Zhouetal.2006）。如图3-7所示，与对照相比，MdSUS在转基因株系茎尖中表达较高，而在所有表达的基因中，MdSUS1.4和MdSUS3.3表达量较高。图3-7不同转基因株系茎尖中MdSUS基因的表达分析（野生型，A27，A04，A10）Figure3-7ExpressionlevelofMdSUSgenesinshoottipsofdifferenttransgeniclines:WildType,A27,A04andA10.37 3.3讨论通过拟南芥同源序列在苹果数据库中Blast后我们得到苹果中的11个SUS基因。根据不同基因特征和表达模式，我们推断MdSUS基因可能在不同组织中或相同组织不同发育阶段的蔗糖代谢中起到不同的作用。根据系统发育进化树分析，植物SUS蛋白主要被分为三个主要组（SUSI，SUSA和新组/NG）。在我们的工作中，植物同源物证实了这种分类（在本研究中，我们将其改名为SUSI，II和III），进一步支持高等植物物种在三个组中的每一个中具有至少一个基因的想法。内含子和外显子的长度和位置对基因的进化具有重要的指导意义（Huetal.2011）。通过基因结构分析表明，MdSUS基因具有10-14个内含子（表3-1，图3-4），这与先前的研究一致，SUS成员在其编码区有11-14内含子（Zhangetal.2015）。类似地，棉花SUS基因编码序列中内含子的数目为11至14（Chenetal.2012）。此外，PtrSUS具有9-14个内含子（Zhangetal.2011）。上述研究表明，在植物中SUS家族基因中，这些相似特征可能决定着它们功能的相似性。为了研究每个MdSUS基因的作用，我们首先测定了11个MdSUS基因在不同组织中的转录水平，包括茎尖、成熟叶、幼果和成熟果实。结果表明，11个MdSUS基因表现出不同的表达模式。MdSUS3.2，MdSUS3.3，MdSUS3.4和MdSUS3.1与拟南芥的AtSUS5/6和水稻的OsSUS5/6属于亚家族III，而OsSUS5/6主要在茎尖中表达（Zhangetal.2011;Hiroseetal.2008）。因此，这4个基因可能是蔗糖新陈代谢的关键基因。此外，所有SUS没有基因仅在一个组织中表达，也没有一个组织仅有一个基因表达。这些结果表明MdSUS基因功能是多样化和复杂的。糖是苹果果实品质重要的组成部分，主要依赖于可溶性糖的积累，其次是葡萄糖和果糖。我们测定了苹果果实发育过程中11个MdSUS基因的表达（图3-6），结果表明，多数MdSUS基因在苹果果实发育过程中表达下降。在本实验中，MdSUS2.1和MdSUS1.1/1.2主要在幼果和成熟果中表达，表明这些基因可能在果实发育中发挥关键作用，这是苹果果树最有经济、有价值的部位。此外，MdSUS3.4在整个果实发育阶段表达量最低，这与先前报道的在不同组织中一致。相比之下，MdSUS2.1在果实发育过程中高度表达，表明其可能在果实发育过程中发挥关键作用，尤其是在成熟果实的蔗糖代谢中发挥作用。MdSUS酶活性与果实发育期间的MdSUS1.3，MdSUS2.2，MdSUS2.3，MdSUS3.1和MdSUS3.3表达一致。38 第四章结论本论文通过对苹果叶片接种褐斑病病菌后糖酸含量变化及糖代谢关键基因表达分析，研究山梨醇/蔗糖含量对苹果褐斑病抗性的响应，主要结论如下：1.感病品种‘太平洋玫瑰’和抗病种‘山定子’接种褐斑病后，相比未接种材料，感病品种叶片糖含量变化显著，可溶性糖含量在接种后期均上升，而抗病种叶片糖含量无明显变化。进一步验证蔗糖和山梨醇合成抑制的转基因‘绿袖’株系和不同碳源饲喂‘嘎啦’叶片接种苹果褐斑病后认为，蔗糖含量增加或山梨醇含量下降抗病性降低，而山梨醇含量增加或蔗糖含量降低抗病性增强。2.感病品种‘太平洋玫瑰’和抗病种‘山定子’叶片接种苹果褐斑病后，糖代谢关键基因MdSDH和MdSPS表达不同程度上调，MdSWEET基因表达变化呈现多样化，在‘嘎啦’叶片接种褐斑病后，MdSUSY基因表达被高度诱导，表明糖代谢关键基因特别是MdSUSY基因可能调控叶片对褐斑病原菌的响应机制。3.SUSY基因家族分析获得了11个苹果蔗糖合成酶基因并将其划分为SUSI、SUSII和SUSIII三个亚家族，各基因表达在不同组织及果实发育过程中呈现多样化。39 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缩略词Abbreviations缩略词中文名称英文全称SUSY/SUS蔗糖合酶SucrosesynthaseSDH山梨醇脱氢酶SorbitoldehydrogenaseSPS蔗糖磷酸合成酶SucrosephosphatesynthaseHR过敏反应hypersensitiveresponseSor山梨醇SorbitolSuc蔗糖SucroseGC-MS气相色谱-质谱联用GasChromatograph-MassSpectrometer46 致谢临近毕业，回首三年研究生生活，感慨万千。三年的研究生生活和学习让我学到了太多，每天的生活可以说是学习也可以说是工作，但对我来说更是一种挑战，试验的不顺是最大的挑战，但静下心后认真思考，慢慢的就会豁然开朗。这样的经历也渐渐的锻炼了我的意志和心性，这对我来说是一份特殊的收获。在此之际，我要向所有给予我关心、帮助和指导的老师、同学、实验室兄弟姐妹及亲人呈上我最诚挚的感谢。首先感谢我的指导老师李明军，研二时我有幸成为了李老师的学生，那时候试验不顺利，心情也很低落，针对我的情况，李老师认真指导我的试验，在学业和生活上给了我极大的鼓励和支持，让我终生难忘。在这三年的时间里我学到的不仅仅是丰富的理论知识，更重要的是思考、解决问题的方法以及待人接物等做人的道理，这些将使我受益终身。同时，我还要真心的感谢张军科老师对我的悉心指导，师从张老师的一年时间里，在生活、学习、科研中遇到困难时，老师都会给我指点迷津，耐心指导，开拓我的思路。同时，我要特别感谢马锋旺和李翠英老师为我提供试验材料，百忙之中为我查找材料，老师们踏实的工作作风、严谨求实的治学态度是我今后工作和学习的楷模。值此论文完成之际，再次对几位老师的帮助和鼓励表示衷心的感谢。在论文开题过程中，感谢李鹏民教授等提出了许多宝贵意见与建议。本实验中所用植物材料来自中科航天园艺基地以及西北农林科技大学北校区园艺场，感谢我的师兄师姐们对我实验基本操作的指导。在实验进行过程中，感谢实验室同门杨静静、原玉林、王正阳，师妹徐靓、李会霞，师弟张晨、祝令成的帮助和支持。感谢我的家人在我求学生涯中给予我的理解和支持，没有你们为我提供的强大动力，就没有今天的我。最后，向所有关心、支持和帮助过我的各位老师、同学和家人表示最衷心的感谢。同晓蕾2017年5月于杨陵47 作者简介同晓蕾，女，1991年3月生，陕西延安人，中共党员，汉族。教育经历：2010/09-2014/06就读于西北农林科技大学园艺专业，获农学学士学位；2014/09-2017/06读于西北农林科技大学园艺学院果树学专业，师从李明军副教授，研究方向为果树生理生态。在读硕士期间发表论文如下：1.JunkeZHANG，PengJIAO，ChongZHANG，XiaoleiTONG，QinpingWEI，LingfeiXU.2016.AppleNPR1homologuesandtheiralternativesplicingformsmaycontributetoSAanddiseaseresponses.Treegenetics&genomes.12:92.2.原玉林，同晓蕾，侯长明，马锋旺，李明军.2016.不同基因型猕猴桃果实中抗坏血酸合成与代谢的差异.植物生理学报.52(12):1877–1883.48