茼蒿提取物对西瓜枯萎病菌抑菌活性及主要活性成分分析

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本论文得到国家自然科学基金项目（20132BAB204016）与江西省自然科学基金项目（20132BAB204016）资助。ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(20132BAB204016)andthenaturalsciencefoundationofJiangxiprovince(20132BAB204016) 目录摘要.................................................................................................................IABSTRACT.....................................................................................................III第1章文献综述............................................................................................11.1引言..............................................................................................................................11.2西瓜枯萎病综合防治的研究进展..............................................................................11.2.1物理防治方法.......................................................................................................11.2.2化学防治方法.......................................................................................................11.2.3抗病育种...............................................................................................................21.2.4农业措施...............................................................................................................21.2.5生防菌防治...........................................................................................................21.2.6植物源杀菌剂.......................................................................................................31.3菊科植物的研究进展.................................................................................................41.3.1蓍属(Achillea).......................................................................................................51.3.2胜红蓟属(Ageratum).............................................................................................51.3.3蒿属(Artemisia).....................................................................................................51.3.4天明精属(Carpesium)............................................................................................51.3.5矢车菊属(Centaurea)............................................................................................51.3.6茼蒿属(Chrysanthemum)......................................................................................61.4植物提取物的抑菌机理.............................................................................................81.4.1孢子萌发及菌丝生长的抑制...............................................................................81.4.2菌丝细胞膜的破坏...............................................................................................81.4.3可溶性蛋白、核酸的变化...................................................................................81.4.4钝化作用...............................................................................................................91.4.5呼吸代谢...............................................................................................................91.4.6寄主抗性研究.......................................................................................................91.5研究目的.....................................................................................................................9第2章茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性........................................112.1前言............................................................................................................................112.2材料与方法...............................................................................................................112.2.1材料与仪器.........................................................................................................112.2.2实验方法.............................................................................................................112.3结果与分析...............................................................................................................122.3.1茼蒿粗提物中活性物质的最佳萃取剂的筛选.................................................122.3.2茼蒿粗提物最小抑菌浓度（MIC)和最小杀菌浓度(MFC)的确定...............132.3.3茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定.................................................132.3.4茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌孢子萌发的测定.................................................142.4结论与讨论...............................................................................................................15第3章响应面法优化茼蒿抑菌物质超声波提取工艺...............................163.1前言............................................................................................................................16i 3.2材料与方法.............................................................................................................163.2.1材料...................................................................................................................163.3茼蒿抑菌物质提取工艺研究.................................................................................163.3.1单因素试验.......................................................................................................163.3.2响应面法优化试验...........................................................................................173.3.3数据分析...........................................................................................................173.4结果与分析.............................................................................................................173.4.1单因素试验对茼蒿提取物抑菌效果的影响...................................................173.4.2响应面分析.......................................................................................................183.4.3最优提取工艺的验证.......................................................................................223.5结论与讨论................................................................................................................22第4章茼蒿提取物对西瓜枯萎病病菌抑制效果的初步研究...................234.1前言............................................................................................................................234.2材料与方法...............................................................................................................234.2.1材料与试剂.........................................................................................................234.2.2仪器.....................................................................................................................234.2.3菌种与培养液...................................................................................................234.2.4方法...................................................................................................................234.2.5数据分析.............................................................................................................274.3结果与分析...............................................................................................................274.3.1茼蒿提取液对西瓜枯萎病病菌细胞膜渗透性的影响.....................................274.3.2茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝生物量的影响.................................................284.3.3茼蒿提取液对西瓜枯萎病病菌可溶性蛋白的影响.........................................284.3.4茼蒿提取液对菌丝中总糖含量的影响.............................................................294.3.5茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌核酸泄露的影响.................................................304.3.6菌丝DNA的提取..............................................................................................304.4讨论与结论................................................................................................................30第5章茼蒿提取物对其他植物病原菌的测定以及GC-MS的成分检测325.1前言...........................................................................................................................325.2试验材料与仪器.......................................................................................................325.3试验方法...................................................................................................................325.3.1茼蒿抑菌谱的研究.............................................................................................325.3.2GC-MS分析........................................................................................................335.3.3数据分析.............................................................................................................335.4结果分析...................................................................................................................335.4.1茼蒿提取液对9种植物病原菌的抑菌作用.....................................................335.4.2茼蒿提取液GC-MS分析..................................................................................345.5结果与讨论...............................................................................................................36第6章全文结论............................................................................................37参考文献..........................................................................................................39致谢..............................................................................................................46ii 摘要西瓜枯萎病是我国瓜类作物最常见病害之一，它的发生导致西瓜产量以及品质的降低，造成了极大的经济损失，严重限制西瓜优质丰产和生产地域的发展。目前控制它的病害是通过化学合成农药的方法，但是它容易流失到环境中，土壤易形成板结，对人、环境与动物容易造成非常严重的危害。现今有越来越多的国内外学者大量的研究植物源杀菌剂，植物源杀菌剂是植物自身产生的次生代谢物，它通过对病原菌产生防御机制，并在这个过程中产生的多种抑菌物质，为生物杀菌剂提供更多的信息和合成模板，更最重要的是，它对环境、水、动物与人类无害或较小的危害，因此，利用植物提取物制成的药剂更加环保和安全有效。前期研究发现，茼蒿提取物中含有抑制西瓜枯萎病菌的活性物质，本实验是通过对其抑菌物质的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，响应面法优化提取工艺，初步抑菌机理的探究，以及抑菌谱进行初探。主要的研究结论如下：1、利用生长速率法，将茼蒿提取物二倍稀释，在PDA培养基下测定其抑菌活性。结果表明，茼蒿提取物对西瓜枯萎病具有一定抑制作用，以不同有机溶剂萃取，正丁醇萃取的效果最好，其粗提物抑菌率达到了97.5%。最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别为125mg/mL和500mg/mL，通过毒力方程的测定，它的半抑菌浓度(EC50)为206mg/mL。并以0、MIC、EC50和MFC的四种浓度粗提物对西瓜枯萎病菌孢子萌发的研究，在MFC浓度下的孢子萌发率最低。2、采用超声波提取茼蒿活性物质，通过单因素试验和响应面优化分析法比较了乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间对提取茼蒿抑菌物质的影响，并优化其提取工艺参数。结果表明：固定乙醇浓度为95%，各自变量对茼蒿抑菌物质提取率的主次关系为：X3(温度)＞X2(料液比)＞X1(提取时间)。超声波提取的响应面最佳优化工艺为：提取时间103min，液料比26mL·g-1，温度35℃，模型预测值为46.28%，实际平均值为45.56%，实际值与预测值的吻合度达到98.44%。3、以0、MIC、EC50和MFC为设置浓度，通过测定培养液的电导率、菌丝中总糖含量、蛋白质含量、核酸泄露和总DNA的提取验证以及菌丝干湿重的变化，进行抑菌机理的初步分析。结果表明，加入茼蒿提取物的菌悬液，电导率明显增大，其中浓度为EC50时的液体培养基中相对电导率最大，达到0.27ms/cm；培养一段时间的菌丝总糖和可溶性蛋白质含量均下降，此外，菌丝生物量也明显下降，湿重较对照减少64.34%，干重较CK对照减少78.63%；将菌丝中总DNA的提取并且通过琼脂糖凝胶电泳分离，结果显示经过茼蒿提取液处理后菌丝DNA电泳条带与对照组并没有差异，因此可能菌丝中DNA没有泄漏或者降解现象。4、将0.5g/mL的茼蒿提取液利用二倍稀释法配制成浓度梯度，对9种常见植物病原真菌的抑菌活性测定，得到病原菌的毒力方程、EC50、相关系数r和置信区间。其结果表明，茼蒿提取液对9种植物病原菌的抑菌作用由大到小的顺序依次为：辣椒疫霉菌、莴苣菌核核盘菌、水稻纹枯菌、枣拟茎点霉菌、葡萄座腔菌、猕猴桃灰霉菌、I 盘多毛、猕猴桃拟茎点霉菌和柑橘青霉。对辣椒疫霉菌、莴苣菌核核盘菌两种真菌的活性最强，它们的EC50分别为为76.87mg/mL和91.770mg/mL，说明茼蒿提取液对这两种真菌比较敏感，抑菌活性最强。利用气相色谱-质谱联用仪检测出茼蒿中主要成分化合物，共发现49种化合物，其中内酯类和酮类化合物分别含15种和9种，相对含量达到3.3%和3.92%，醇类占7种，相对含量1.91%；酸占3种，相对含量0.09%；烯、醛和酚各占1种，相对含量分别为0.8%、0.03%、0.01%，这说明茼蒿中的内酯类与酮类很可能是对西瓜枯萎病菌有抑菌活性的有效成分。关键词：茼蒿；西瓜枯萎病菌；抑菌活性，GC-MSII AbstractWatermelonFusariumWiltisoneofthemostcommondiseasesofcucurbits,itoccursthatcauseswatermelonyieldsandlowerquality,causinggreateconomiclosses,severelylimitinghighyieldandqualityofwatermelonproductionandlocaldevelopment.Currentlyincontrolofthediseaseisthroughthemethodofchemicalsynthesisofpesticides,butitiseasytolosstotheenvironmentsoileasilyformacompacted,andlikelytocauseveryseriousharmtopeople,theenvironmentandanimals.Nowadaysmoreandmorescholarsathomeandabroadalotofresearchplantsourcebactericide,botanicalfungicidesaresecondarymetabolitesproducedbyplantsthemselves.Ithaveadefensemechanismsagainstpathogens,producedintheprocessofavarietyofantibacterialsubstances,asbiocideprovidesmoreinformationandtemplatesynthesis,themostimportant,itharmtotheenvironment,water,animalandhumanharmlessorless.Therefore,theagentsfromplantextractsmoreenvironmentalprotectionandsafety.PreviousstudiesfoundthatChrysanthemumcoronariumL.extractcontaininginhibitorysubstancesofFusariumoxysporum.Thisexperimentisthroughoftheantifungalsubstancesoftheminimalinhibitoryconcentrationandminimuminhibitoryconcentration,responsesurfacemethodtooptimizetheextractionprocess,theinvestigationofthepreliminaryexplorationontheactionmechanismandantifungalspectrumofChrysanthemumcoronariumL.extract.Themainconclusionsareasfollows:1.Usingthegrowthratemethod,theChrysanthemumcoronariumL.extractwasdilutedtwotimes,inthePDAculturemediumanditsantibacterialactivitywasmeasured.Theresultsshowedthatthecrudeextractsfromgardenchrysanthemumhascertaininhibitoryeffectonwatermelonfusariumwilt.Crudeextractwithn-butanolextractioneffectisbest,itsbacteriostaticratereached97.5%.itsminimuminhibitionconcentration(MIC)andminimumfugicideconcentration(MFC)isrespectively125mg/mLand500mg/mL,throughthedeterminationofvirulenceequation,Throughthedeterminationofvirulenceequation,itshalfbacteriostaticconcentrationof206mg/mL.Tostudyandtofourconcentrationsofcrudeextractsof0,MIC,EC50andMFConsporegerminationofFusariumoxysporum,thelowestgerminationrateinMFCconcentration.2.UsingultrasonictoextracttheactivesubstancesofChrysanthemumcoronariumL.,throughthesinglefactorexperimentandresponsesurfaceoptimizationanalysismethodwasusedtostudytheethanolconcentration,extractiontemperature,solidtoliquidratioandextractiontimeontheextractionofchrysanthemumantibacterialsubstancesandoptimizedtheextractionprocessparameters.Theresultsrevealedthatthebestextractionconditionswereasfollows:intheethanolconcentrationof95%,relationofprimaryandsecondaryofeachvariableonextractionyieldofantifungalingredientofX3(temperature)＞X2(solid-liquidratio)＞X1(extractiontime),maximumextractionyieldwasachievedwhentheprocesswascarriedoutwithsolid-liquidratioof26mL·g-1for103minat35°C.Undertheoptimumextractionconditions,modelpredictivevalueof46.28%andtheactualaverageof45.56%,percentofcontactareaoftheactualvalueandthepredictedreached98.44%.3.To0,MIC,EC50andMFCforconcentration,throughdeterminationofthecontentoftotalsugarinthemediumconductivity,mycelium,proteincontentandnucleicacidleakageandtotalDNAextractionisvalidatedandthemycelialdryweightchanges,apreliminaryanalysisofthemechanismofantimicrobialactivity.TheresultsshowthataddingChrysanthemumcoronariumL.extractintobacterialsuspension,significantlyIII increasestheconductivity,theconcentrationEC50ofliquidculturemediumrelativeconductivityisthelargest,reaching0.27ms/cm;culturetimeofmyceliumoftotalsugarandsolubleproteincontentdecreased.Inaddition,mycelialbiomassalsodecreasedsignificantly,wetweightthanthecontrolreduce64.34%,dryweightcomparedwithCKdecreased78.63%;willmyceliumoftotalDNAextractionandbyagarosegelelectrophoresisseparation.TheresultsshowedthatafterChrysanthemumcoronariumL.extractliquidhyphaDNAelectrophoresisstripbeltandthecontrolgroupdidnotdiffer,mightthereforemyceliumDNAwithoutleakageordegradationphenomenon.4.The0.5g/mLChrysanthemumcoronariumL.extractliquidusingdoubledilutionmethodisformulatedasaconcentrationgradient,onthedeterminationoftheantibacterialactivityof9kindsofcommonplantpathogenicfungi,pathogenvirulenceequation,EC50correlationcoefficientsandconfidenceintervalsareobtained.Theresultsshowedthattheinhibitoryeffectsofchrysanthemumextractofninespeciesofplantpathogenicbacteriafrombigtosmallorderasfollows:PepperPhytophthora,lettuceSclerotiniasclerotium,ricesheathblightfungus,jujubeintendstoPhoma,grapeseatcavitybacteria,Botrytiscinereainkiwifruit,hairy,kiwiintendstoPhomaandcitrusPenicillium.ThestrongestactivityagainstPhytophthoracapsici,lettuceSclerotiniasclerotiumtwofungi.TheirEC50were76.87mg/mland91.770mg/mlthatchrysanthemumextractismoresensitiveofthetwofungi,thestrongestantibacterialactivity.Bygasphasechromatographymassspectrometrycombinedwithdetectorofcompoundsofmaincomponentsinchrysanthemum,49compoundswereidentified,includinglactonesandketonesrespectivelycontaining15and9,relativecontentreached3.3%and3.92%,alcoholaccountedfor7,relativecontentof1.91%;acidaccountedforthree,relativecontentof0.09%;alkenes,aldehydesandphenolseachaccountedfor1,relativecontentrespectively0.8%,0.03%,0.01%,indicatingthatchrysanthemumlactoneandketonesislikelytohaveantibacterialactivityofeffectivecomponentsofWatermelonFusariumwilt.Keywords:ChrysanthemumcoronariumL.;Fusariumwilt;antibacterialactivity;GC-MSIV 第1章文献综述1.1引言西瓜（Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum.etNakai）是双子叶植物葫芦科西瓜属的草本植物，是全球重要的园艺作物，其果实是夏季主要的水果之一。在2013年中国总栽培面积约为182.82万hm2，产量约为7294.40万吨，到2014年总栽培面积和产量为185.23万hm2和7484.30万吨，是夏季人们消暑所喜爱的水果[1-3]。在营养方面，含有多种矿物元素和维生素，夏季清凉爽口多汁，有很好的解暑止渴之功效，因此可以作为水果食用，从它的生长环境与条件来看，又具有蔬菜作物的生长习性[4]。此外，西瓜还有较高药用价值，现代医学认为,西瓜有助于利尿退热,降血压等功效，其中含有一种特殊的蛋白酶，它可以将不溶性的蛋白质转变为可溶性的蛋白质，因此，常吃西瓜对糖尿病、黄疸等患者有一定的疗效，从而大大改善身体素质。西瓜适应性较强,我国南北各地均可种植，根据不同的气候和生态环境,可将全国各地种植区划分为三大栽培区域:西北干早区,包括新疆、甘肃、兰州、青海、宁夏银川、内蒙古西部的巴彦绰尔盟等地；北方干燥区,包括淮河以北的华北、东北和内蒙东部;南方湿润区,包括淮河秦岭以南地区[5]。据不完全统计，世界有100多个国家种植西瓜，且全球西瓜生产面积逐年增加。由于现有耕地面积有限的原因，导致重茬西瓜面积进一步扩大，西瓜的病害也越来越多，其中被称为西瓜“癌症”的西瓜枯萎病的发生日趋普遍和严重，发病后轻者减产，重者绝收，给西瓜生产带来巨大的经济损失和资源浪费。因此，如何科学安全有效地防治西瓜枯萎病，是广大农业科技工作者非常关注的问题及工作重点之一。1.2西瓜枯萎病综合防治的研究进展西瓜枯萎病（WatermelonFusariumwilt）是由尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染所致，该病菌通过侵染根部伤口或从根毛生长点细胞间侵入，破坏维管束导管内生长发育，使吸收与运输水分困难，植株的代谢功能紊乱，从而萎蔫，直至死亡[6]。长期以来，对于防治西瓜枯萎病的方法主要是物理防治、化学防治、抗病育种、农业措施、生防菌防治、植物源杀菌剂等一系列综合防治措施[7-9]。1.2.1物理防治方法首先是通过筛选有活力的西瓜种子，将劣质种或生活力差的西瓜种子淘汰,达到培育壮苗的目的；其次是通过浸种杀死西瓜种子可能携带的尖孢镰刀菌，也可以用安全条件下的核辐射杀死西瓜种子表皮上的病原菌；最后用热蒸汽处理温室和苗床的土壤以杀死土壤中携带的病原菌[10]。1.2.2化学防治方法化学防治主要是通过采用化学农药喷雾，对西瓜种子和土壤进行消毒。用聚乙烯塑料薄膜覆盖地面,结合太阳能来增加温度,利用0.1%的多菌灵来浸种，播种之后再喷洒多菌灵,能明显降低枯萎病的发生[11]。研究发现己唑醇、嘧菌酯、多菌灵、嘧霉1 胺、醚菌酯、甲基硫菌灵等对瓜类枯萎病的有效抑制作用的浓度是在61.50%-95.90%之间,因此可作为土壤处理剂降低瓜类枯萎病的发生性[12]，采用浇灌、穴沟施和土壤翻混等土壤处理方式使用化学药剂,例如40%瓜枯宁可湿性粉剂、50%代森铵水剂以及70%甲基托布津可湿粉剂等来浇水,这样可以将残留在土壤中的西瓜枯萎病菌菌丝、孢子和菌种次生代谢物抑制和消灭。西瓜设施栽培有温室与塑料大棚栽培，而对于设施栽培中空气与环境进行化学杀菌，主要通过硫磺和氧化苦进行熏蒸，以及向空气中喷洒福尔马林与硫酸铜来杀菌，降低环境中可能存在的菌体。有时在西瓜植物生长过程发生枯萎病，可以在感染枯萎病菌的西瓜茎叶上喷洒化学药剂，这样可以及时除掉感染病菌的植株和减少枯萎病的蔓延[5,13,14]。但长期的化学防治对环境与人类存在危害。1.2.3抗病育种利用分子杂交、诱变与现在生物技术等方法培育出来的西瓜新品种，对预防与防治西瓜枯萎病是最有效的方法[15]。美国在早期就开始了抗病育种，并培育出抗病品种Conqueror.继它之后,又培育出IowaKing,IowaBelle,Jubilee,CalhounGray,CrimsonSweet,Summit,AU-Golden等抗病性强的品种[16-18]。近年来,我国也在抗病育种方面培育了丰抗八号、红冠龙、郑杂2号、西农八号、旭龙、伊姆、秀雅、秀丽、海农6号、汗梁1号、中育6号、多利、新植、京杭1号等抗病性强品种[19]。在1999年，研究发现运用RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA即随机扩增多态性DNA标记)技术，得到了抗性基因RAPD标记OPP01/700，它与西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因是连锁的，然后将这种抗性基因用Southern杂交方法进行克隆和测序，初步建立了西瓜抗枯萎病的抗病育种分子标记辅助选择技术系统[20]。研究学者发现，通过对材料PI296341-FR的实验，此材料为抗西瓜尖镰孢菌，经过处理后分别在不同时间段进行SSR测序，得到了EST序列3895条，其中28.3%的EST序列与信号传导、环境互作和防卫反应有联系[21]。同时，抗性易受环境的影响而变化或者消失等，因此，无法从根本解决问题。1.2.4农业措施通过轮作与间作的耕作方式，可以防止西瓜枯萎病菌的发病率，根系土壤尖镰孢菌或者菌毒素也会相应的减少，轮作作物的地下部分产生物质可以有效对枯萎病菌菌的孢子形成以及孢子萌发的产生抑制作用，但是对菌丝的营养生长没有影响[22,23]。也可以通过对土壤进行暴晒、熏蒸、太阳能等高温处理,可预防尖孢镰刀菌发生[24],但此操作耗费人力与物力，而且过程复杂,对深层土壤中的病原菌效果不明显,不能有效的防治尖孢镰刀菌。在轮作期间，如果能够及时拔除病株以及加强人工栽培管理，将会有效的防治西瓜枯萎病的发生及严重化，这是一项重要的农业措施。此外，土壤的酸碱性对尖镰孢菌的生长也有影响，尖镰孢菌主要生长在酸性土壤，因为土壤中的钙与酸结合，导致钙的含量降低，从而增加尖镰孢菌发生率，通常人们利用一些碱性介质来降低尖镰孢菌的生长发育。单国雷在CO2加富对西瓜苗期枯萎病发生的影响的试验中[25]，发现增施CO2的西瓜幼苗发病率和病情指数均能显著降低。1.2.5生防菌防治2 生防菌具有生产周期短、成本低、操作简便、无地域限制等的特点，因而可以更广阔的发展利用[26]。生防菌主要通过刺激植物产生酶和抗生素来抑制植物病原菌的生长发育与繁殖[27]。在2002年国外学者[28]研究显示寄生性真菌能够对土壤中的枯萎病菌产生抑制作用，从而减少西瓜植株的死亡率。Kaur等[29]研究发现非致病性的真菌与致病枯萎病菌相互竞争侵染位点和营养物质来减少植株的发病率，减少致病菌的孢子产生以及诱导植株产生抗性，这些都能够抑制致病菌的生长繁殖。马艳等[30]从西瓜植株体内分离鉴定到拮抗枯草芽抱杆菌BS11，并且测定了它的抑菌谱,进行盆栽试验,发现对西瓜枯萎病具有较好的抑制作用。绿色木霉Ta能够有效地抑制西瓜枯萎病的生长,保护瓜苗[31]。张洪涛等[32]筛选出内生菌XJUL-12对西瓜枯萎病有较强抗性,并将其鉴定为枯草芽胞杆菌。放线菌SC11、153和SF6对西瓜枯萎病菌有抑制作用，他们互配效果更强[33]。单一的生防菌的抗性持久效较短，为了弥补这一缺陷，利用筛选出的多种有益菌进行复配，制成复配菌剂，发挥它们的共同作用，实现优势互补，形成有益的生物菌群，从而达到对西瓜枯萎病的长久抑制效果[28]。1.2.6植物源杀菌剂地球上植物种质资源丰富多样，许多植物都具有植物杀菌剂的作用，秩青译[34]研究发现约有1389种植物有植物源杀菌剂的作用，植物中产生的次生代谢物有杀虫与杀菌的作用。马志卿等[35]也研究发现植物的次生代谢物能够防止病虫害的侵扰，主要是因为植物中的次生代谢物与病虫害相互竞争与适应演变的过程。通过对不同植物源杀菌剂的研究与整理，从表1.1中可以看出，植物中含有多种有效成分，它们可以分布在根茎叶等植物不同部位，而且不同部位的含量是不一样的。同科的植物也可能对相同的植物病原菌有抑菌作用，可能有相似的抑菌活性物质，发现菊科植物中有较多可作为植物杀菌剂。李玉平等[36]通过研究25种菊科植物对番茄灰霉病菌、苹果炭疽病菌和小麦白粉病菌的抑菌活性，其中对番茄灰霉菌有较强抑制作用的是大花金挖耳、大刺儿菜、阿尔泰狗娃花、苦蒿等16种植物提取物，对苹果炭疽病菌有较强抑制作用的是猪毛蒿、大花金挖耳和旋覆花，抑菌率均达到60%以上，而对小麦白粉病菌的治疗与保护作用中，其中大花金挖耳和旋覆花对该病菌的保护作用达到60%以上，蓼子朴、臭蒿、苍耳、天明精对该病菌的治疗作用达到60%以上。于平儒等[37]研究28种植物提取物离体条件下的抑菌作用试验，结果表明鹅掌揪、冬青、菝葜、银杏等12种植物提取物对供试植物病原菌中至少一种的抑制作用在60%以上,但其中菝葜对4种供试植物病原菌的抑菌率均在60%以上。3 表1.1具有抑菌作用的植物资源Table1.1PlantResourceshasantibacterialeffect科名称植物名称抑制病原菌活性部位菊科万寿菊Tagetespatula灰葡萄孢菌根胜红蓟AgeratumconyzoidesL.柑橘炭疽病菌、全株大籽蒿Artemisiasieversiana白粉病菌番茄灰霉病菌全株豆科苦参Sophoraflavescens突脐蠕孢菌根、茎花生ArachishypogaeaL.广谱叶伞形科孜然CuminumcyminumL.果蔬致腐真菌孜然籽卫矛科苦皮藤Celastrusangulatus离蠕抱菌假种皮百合科大蒜AlliumsativumL.西瓜枯萎病菌、鳞茎立枯丝核菌洋葱AlliumcepaLinn.广谱茎姜科姜ZingiberofficinaleRosc.稻瘟病菌、香蕉茎枯萎病菌、香蕉炭疽病菌唇形科黄芩Scutellariabaicalensis杧果炭疽病菌根罗勒Ocimumbasilicum玉蜀黍黑粉菌、地上部分稻绿核菌芸香科九里香MurrayaexoticaL.香蕉枯萎病菌、茎花椒香蕉炭疽病菌、种子ZanthoxylumbungeanumMaxim.辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌桃金娘科丁香Syzygiumaromaticum杧果炭疽病菌茎叶番石榴PsidiumguajavaLinn.细菌叶禾本科香茅MoslachinensisMaxim广谱全株樟科阴香Cinnamomumburmannii真菌茎叶桑科无花果FicuscaricaLinn.广谱全株郝明亮等[38]在9种植物提取物对植物病源真菌的生物活性试验中得出，当植物提取物的浓度为5mg/mL时，9种植物的乙醇提取物对供试病原真菌的菌丝生长都有不同程度的抑制作用。丁香乙醇提取物对小麦纹枯病菌、棉花枯萎病菌、玉米小斑病菌和柑橘绿霉病菌等4种植物病原真菌的抑菌效果均大于60%[39]。肉桂精油对茄灰霉病菌、苹果青霉病菌、番茄茎枯病菌和黄瓜镰刀菌4种病原真菌试验中，结果发现肉桂精油对番茄灰霉病菌的抑制效果达到最好，能够抑制它的菌丝生长[40]。目前越来越多国内外学者对植物源杀菌剂的抑菌物质以及抑菌机理的大量研究，使越来越多的植物被发现具有天然杀菌剂的作用，为现代研发高效、低残留、低污染的植物源杀菌剂提供理论与实践基础。1.3菊科植物的研究进展当今世界，植物源杀菌剂种类越来越丰富，大部分集中在菊科、豆科、百合科、姜科、唇形科、芸香科、禾本科、和樟科等植物中[41]。菊科作为其中重要的一类植物，它的抑菌活性具有很高的利用价值。菊科（Compositae）是被子植物中的一大科，大4 约1000属，25000-30000种，广泛分布在全世界，但是热带较少[42]，而我国约有230属,2300多种。菊科中有植物源杀菌剂作用的抑菌植物主要分布在蓍属、蒿属、胜红蓟属、天明精属、矢车菊属、茼蒿属等[36,43]。1.3.1蓍属(Achillea)蓍属植物的抑菌物质主要是精油，这些精油主要成分为母菊薁、樟脑、法呢烯、沉香醇、乙酸冰片酯、A-古芸烯、冰片、蓍草烯醇和胡椒酮,它们能够有效地抑制细菌活性，比如：链球菌属和葡萄球菌属，也可抑制真菌活性，如酵母、白假丝酵母和丝状真菌[44]。方美珠等对新疆一枝蒿提取物的抑菌测试中，结果表明它对10种供试菌种有抑菌活性，它的主要活性成分可能为香豆素类、苷类和黄酮类[45]。Simic等发现金口蓍精油对肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和革兰氏阴性菌具有抑制作用，其精油成分中含有borneo、萜品烯-4-醇、顺-p-孟-2-烯-1-醇、反-p-孟-2-烯-1-醇[46]。1.3.2胜红蓟属(Ageratum)胜红蓟对植物病原菌有抑菌活性，该属植物叶片中提出的精油具有广谱抑菌作用，它对青霉、曲霉、尖孢镰孢、玉米大斑突脐蠕孢、核盘菌和平头炭疽菌的菌丝生长均有抑制作用[47]。在动物方面也有杀虫作用的研究，主要是因为有些具有毒性可以毒杀害虫，它的味道较苦涩，防止害虫食用，以及抑制病虫的生长发育作用[48]，胜红蓟化感物质的主要成分是胜红蓟素和去甲氧基胜红蓟素,它们可以使昆虫早熟变态、抗促性腺效应、生长发育抑制、引起或解除滞育、行为干扰、杀卵及毒杀等多种效应[49]。1.3.3蒿属(Artemisia)大籽蒿、臭蒿和猪毛蒿都属于蒿属，它们的研究较多，对植物病原菌都有抑制作用。藏药大籽蒿全草和花蕾的水与乙醇提取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌标准菌株具有一定抗菌作用，并且全草与花蕾提取物的具有相同的抑菌活性[50]。大籽蒿提取物能够显著抑制番茄灰霉病菌生长，抑制率达80%以上，猪毛蒿提取物对苹果炭疽病菌的抑菌率有60%以上，臭蒿提取物对小麦白粉病菌达到50%以上的保护作用[35].徐汉虹等通过对猪毛蒿精油杀虫成分鉴定分析，发现能够杀虫的主要成分是1-苯基-2,4-己二炔[51]。1.3.4天明精属(Carpesium)天明精的丙酮提取物对辣椒疫霉病菌番、玉米大斑病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌和茄灰霉病菌5种病原真菌孢子萌发抑制率均大于93%，大花金挖耳的丙酮提取物对小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌5种病原真菌的孢子萌发与菌丝生长抑制率均在70%以上[52]。1.3.5矢车菊属(Centaurea)矢车菊属植物中分离出具有抑菌活性的物质大部分为倍半萜烯内酯[53]。在1999年，Vajs发现矢车菊nicolai中含有成分salograviolideA及其衍生物,它们对橄榄色曲霉、芽枝状枝孢、黑曲霉、拟茎点霉、三隔镰孢属具有抑制作用[54]。研究发现，矢车菊中含有两种黄酮类化合物矢车菊苷和矢车菊黄素，他们具有扩张血管和抑制血小板聚集作用，对大鼠主动脉潜在的舒张作用[55]。5 1.3.6茼蒿属(Chrysanthemum)茼蒿（ChrysanthemumcoronariumL.）作为5种茼蒿属中的其中一种，是一种一年或二年生草本菊科植物。在我国已经有上千年的栽培历史，并且种植区域范围比较广泛，在全国各地均有种植，主要分布在福建、广东、广西等南方各省区及河北、吉林等北方地区，又因种植产地的不同而被称为蓬蒿。由于茼蒿的外形及花与野菊十分相似，所以又被命名为菊花菜。茼蒿含有十分丰富的营养成分，其幼苗或嫩茎叶可以作为人们日常的蔬菜食用，另外茼蒿还是一种中草药植物，从古医书《千金方》中可知其根茎叶经晒干后均可作为药材入药用，是一种药食两用植物。茼蒿对人体无毒，它有利于安心定神，消痰利脾胃等。1.3.6.1茼蒿的主要化学成分研究茼蒿是一种具有十分重要的保健功能及营养价值的植物，含有各种蛋白质、碳水化合物、维生素、微量元素、胡萝卜素等营养成分。茼蒿特殊的功能价值引起了国内外众多学者的研究兴趣，目前研究报道较多的主要是对茼蒿中某种化学成分的分离纯化研究，对该成分的化学结构的鉴定以及茼蒿生物学活性的研究等等。目前，从茼蒿中分离出的化学成分主要有黄酮类[56]、聚乙炔类化合物[57]、酚酸类[57]、生物碱类[58]、甘油二酯糖苷类[59]、植物甾醇类[60]、杂环化合物类[61]、挥发油类化合物[62]、倍半萜内酯[63]和二萜类[64]。王丽芳等[56]通过二次回流提取工艺法，优化了茼蒿黄酮类成分的影响因素，得到的最佳提取优化条件是：料液比为1:8，乙醇浓度为55%，提取时间为2h，提取温度为95℃，在此优化条件黄酮得率最大，而且其中乙醇的浓度与温度对黄酮提取得率最为敏感。Mahahiro等[57]发现了茼蒿中存在异阿魏酸及对羟基苯甲酸甲酯两种酚酸类化合物，并检测得到了验证。其次发现茼蒿中含有阿魏酸甲酯[58]。在相继的两年内，Chuda等[65,66]又从茼蒿中分离鉴定了出4-琥珀酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰、绿原酸和异绿原酸，它们都具有抗氧化活性，并且都为奎宁酸类衍生物。Song等[59]又从茼蒿的地上部位分离鉴定出1-棕榈酰-2-亚麻酰-3-葡萄糖甘油酯和1,2-二亚麻酰-3-半乳糖糖甘油酯，它们为两个甘油二酯糖苷类化合物。生物碱的生物活性较为广泛，它是一种含氮类的有机化合物。2002年张冬冬等[67]通过茼蒿中生物碱的定性与定量研究，发现茼蒿中含有甾体类、喹啉类和吲哚类生物碱。Song等[58]从茼蒿植株的地上部位分离出了野黑樱苷、L-野黑樱苷、蕨内酰胺和腺苷酸等四种生物碱成分，这类生物碱类化合物主要是通过抑制低密度脂蛋白氧化和胆固醇酰基转移酶等生物活性，从而使胆固醇降低的原理，并且分离并鉴定出一个新杂环化合物5,5'-Dibuthoxy-2,2'-bifuran。在2007年Choi等[60]从茼蒿的地上部位分离出了一个植物甾醇—菜油甾醇，它具有抗血管生成的作用；另外从茼蒿植株中还分离出豆甾醇[57]Stigmast-4-en-6α-ol-3-one[68]、Stigmast-4-en-6β-o1-3-one[68]、β-谷甾醇[68]、胡萝卜苷[68,69]。1984年日本学者Mahahiro等[57]从茼蒿中分离鉴定出了两个含硫杂环化合物Chrycolide和Chrycorin，它们能够抑制植物生长作用，另外还分离鉴定出了两个聚乙炔类化合物，它们分别为顺螺烯醇醚和反螺烯醇醚。Ferdinand等[61]在茼蒿植株中也分离鉴定出了一系列含硫乙炔类化合物。挥发油通常被称作精油，是一种可以随水蒸气被蒸发出来的油状混合物，大部分6 具有香气，而且又不溶于水中，易被分离。阳等[62]通过顶空-固相微萃取技术（HS-SPME）和气质联用仪（GC-MS）分析了茼蒿植物体内的挥发性成分，并鉴定出了46种挥发性成分，其中烯烃类化合物及萜类化合物相对含量分别为35.8%和14.3%。1.3.6.2茼蒿生物研究1.3.6.2.1保健的作用古医书曾记载着茼蒿能够“消痰饮、利肠胃”，表明茼蒿对咳嗽祛痰等具有较好的疗效。现代仍有用新鲜的茼蒿茎叶能够治疗咳嗽痰多的症状，主要是泡水服用。康健等[70]研究发现茼蒿提取液具有明显减少小鼠咳嗽的作用，从而表明了茼蒿具有镇咳的作用。1.3.6.2.2化感作用茼蒿对西瓜等多种植物具有化感作用。姜丽等发现茼蒿水提液能够较强的抑制西瓜种子发芽，并且随着茼蒿水提液浓度的升高而显著增强[71]。在2011年范淑英等研究发现茼蒿水浸提液能明显提高西瓜幼苗中保护酶POD、CAT、SOD活性,而幼苗中MDA含量是明显下降，并且通过茎叶与花水提液分别处理西瓜幼苗，发现均能促进西瓜幼苗的生长，但是茎叶水提液的作用大于花水提液的作用[72]。1.3.6.2.3杀线虫2009年王海迎等[73]研究不同萃取剂提取茼蒿中的活性物质对南方根结线虫的活性试验中，结果得到茼蒿甲醇提取物杀害线虫作用相对较强，其次为水萃取部分，利用柱层析对水萃取部分进行更深入的研究，最后分离得到了小白菊内酯和金丝桃甙两个杀南方根结线虫的活性成分[74]。Meira等[75]也证实了茼蒿水提取物对杀南方根结线虫具有很强的生物活性，该研究还发现在茼蒿的成熟花期也具有杀虫活性，且茎叶部分要强于花的活性。1.3.6.2.4抗肿瘤作用研究发现，茼蒿中分离出的CumambrinA，TigloylcumambrinB等愈创木内脂型倍半萜内酯[63]、1,10-epi-pyrethrosin、Tulirinol等除虫菊内酯型倍半萜[76]以及Dihydrochrysanolide型[77]倍半萜内酯对前列腺、结肠以及肺等多种肿瘤细胞系均具有抑制作用。1.3.6.2.5抗氧化作用2007年林丹英等[78]研究发现茼蒿中总黄酮有较强的抗氧化活性，因此能够清除羟基自由基。ChoM等研究发现茼蒿中的甲醇提取物及氯仿萃取物均可以清除-NO自由基，且氯仿萃取物的活性要更高，另外甲醇提取物还可以清除超氧化物歧化酶（SOD）活性[69]。1.3.6.2.6抗菌活性茼蒿中分离鉴定的二萜成分如Kaurane-3β,16β-diol，它能够对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等多种病原菌有显著的抑菌活性[79]。2001年Alvarez-Castellanos等[64]研究发现茼蒿植株花序精油对链格孢属菌、黄曲霉、腐霉菌、黑斑病菌和核盘菌等多病原菌有很显著的抑菌作用，并且鉴定出茼蒿花序精油的3个主要成分为莰酮、α-蒎烯，β-蒎7 烯。试验发现从茼蒿中分离出的多种倍半萜内酯也具有抗微生物活性[80]。近来发现因为茼蒿不同部位提取物、不同的产地以及根、茎叶和花以及不同的采收时期、不同的品种等原因，使得茼蒿精油有不同的主要成分，说明这些因素都是影响茼蒿次生代谢物生成的原因。1.4植物提取物的抑菌机理目前，大多学者研究植物源杀菌剂的抑菌作用原理，但是深入研究比较少，并且停留在初步研究阶段，然而不同植物提取物中的活性物质对病原真菌具有不同的抑菌机制，但是归纳分析提取物对病原菌的抑菌作用主要包括三方面：物质代谢、能量代谢和信息传递[81]。植物中的活性物质对病菌的抑制作用很复杂，现今主要是利用植物粗提液对植物病原菌的抑制作用进行研究，结果表明主要对病原菌孢子萌发抑制、菌丝生长、游动孢子的抑制、体外钝化以及病毒植株的抑制等。而寄主对病菌产生作用的研究主要是刺激寄主产生抗性、增强寄主繁殖与生长能力[82].1.4.1孢子萌发及菌丝生长的抑制张国珍[83]等通过研究细辛和麻黄提取物：细辛油和麻黄油，结果发现它们能够对人参链格孢分生孢子和薏苡黑粉菌冬孢子萌发起到抑制作用,主要是它们提取物中活性成分含有-OH,可以与这两种病原菌中丙氨酸消旋酶形成氢键，从而影响菌丝内丙氨酸消旋酶正常的生物活性，进而导致菌丝内的代谢系统紊乱，进而抑制菌丝内孢子的萌发。Karavaev等[84]研究防风草与紫草叶子的水提取物的抗真菌试验中，结果发现对禾柄锈菌的孢子萌发和禾白粉菌的无性孢子有显著的抑菌作用，它们的水提物刺激了小麦的合成系统，从而使得光和系统2释放氧气。吴翠霞的白藜芦醇及其衍生物的抑菌活性及对番茄早疫病菌的作用机理研究中发现，白藜芦醇中活性物质鉴定出为3,5-二羟基-4’-甲氧基二苯乙烯，它能够抑制番茄灰霉病菌的菌丝生长以及该病菌的孢子产生与萌发，当浓度为12.5μg/mL时，产孢抑制率为67.96%,当浓度达到200μg/mL时，已经显著抑制孢子产生，得到孢子萌发的半抑制浓度EC50是48.3867μg/mL，其菌丝生长量测定，得到半抑制浓度EC[85]50值分别为32.7070μg/mL。1.4.2菌丝细胞膜的破坏真菌具有细胞膜，保护菌丝体内的细胞不受破坏，能够与周围的环境进行一系列的生物活动，保持它的生长繁殖稳定性。Goni等[86]研究表明植物中的精油可以使病原菌的细胞膜结构与功能遭到破坏，主要是因为精油具有疏水性，可以进入到细胞膜和线粒体膜内，破坏了膜的结构，增加膜的渗透性，使大量内含物泄露，从而扰乱代谢功能，致使其死亡。2010年钱丽红等发现茶多酚处理金黄色葡萄球菌后。其菌液的电导率和菌丝中总糖含量与其浓度是呈正相关,表明了茶多酚可以增加菌丝膜的通透性或者破坏菌丝膜的结构,进而使细胞内大分子物质糖外泄，电导率增加[87]。2012年刘梦茵等研究乌梅提取物对蜡状芽孢杆的抑菌机理，发现病原菌的细胞壁和细胞膜的结构均遭到破坏,由于细胞壁的不完整，从而使细胞膜渗透性增加,进而使细胞内大分子物质外泄[88]。1.4.3可溶性蛋白、核酸的变化8 张赟彬等[89]通过研究八角茴香精油及其各主要单体成分对大肠杆菌的抑菌作用发现，当柠檬烯和八角茴香精油的浓度为100mg/mL时，大肠杆菌菌液中还原糖含量已经达到0.89g/100g和0.87g/100g，当柠檬烯和八角茴香精油对大肠杆菌作用64h后,大肠杆菌菌液中可溶性蛋白质含量分别为12.5%和13.7%，当它们作用5min后,大肠杆菌菌液的电导率分别为182.4μs/cm和184.3μs/cm，都明显大于不加抑菌成分的菌液。乌梅提取液对李斯特菌的抑菌机理的试验研究中，以乌梅提取液MIC的不同倍数浓度为处理液，利用流式细胞仪和AnnexinV-FITC/PI双标记法，通过对前向散射光、DNA含量、细胞膜电位、细胞周期、细胞内Ca2+含量变化的5种指标进行测定，得到结果是乌梅提取液通过破坏菌丝的细胞膜、细胞壁和破坏DNA的合成，从而抑制其生长繁殖[90]。1.4.4钝化作用刘学端等通过研究植物源农药MH1124防治烟草花叶病作用机理试验中，结果发现MH1124对烟草的两种病毒CMV和TMV有较强钝化作用,该植物源农药能够抑制烟草病毒的在寄主体内繁殖，并且能够提高植物体内保护酶活增强，显著增高烟草的抗病毒性[91]。1.4.5呼吸代谢通过研究体外BTG505和董尼酮对细胞色素氧化酶、NADH、氧化磷酸化的作用,BTG505能够抑制线粒体细胞色素C氧化酶,而董尼酮是抑制线粒体氧化磷酸化[92]。1.4.6寄主抗性研究通过研究西芹根物质对黄瓜枯萎病菌的作用机理以及它的田间化感作用试验中，发现西芹根与根际土壤浸液处理过的叶片中的抗氧化保护酶酶活性均高于对照，如SOD、POD，而细胞壁降解酶的活性均低于对照，如吲哚乙酸氧化酶、羧甲基纤维素酶[93]。李美霞[94]利用植物提取物处理水果采后致腐真菌的抑制作用研究，当提取物2号浓度为25.00mg/mL时，它与M.fructicola共同作用可以诱导水果抗真菌酶多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性升高，而对过氧化物酶(POD)活性没有多大影响。1.5研究目的目前对于植物病原菌的防治方式主要是通过化学农药，但是长期使用一方面会使得病原菌产生抗药性，另一方面对环境造成严重污染，危害人类健康；而目前采用抗病育种由于病原菌容易产生变异，抗病育种工作难度较大；而嫁接技术要配合其它管理技术才能发挥优良的效果，因此，大面积推广嫁接技术还比较困难。为此，寻找广谱、高效、低毒、安全的杀菌剂，特别是从天然植物中研究和筛选具有抑菌效果，对人类健康和生态环境无害的抑菌活性成份并阐明其作用机理，具有十分重要的意义，已经成为广大农业生产者和科研工作者关注的热点，同时，也是确保农产品安全的有效途径。前期研究发现一定浓度的茼蒿水浸液可以提高西瓜种子的发芽率，并且在西瓜与茼蒿轮作或者间作可以降低西瓜枯萎病的发病率。因此本课题通过利用茼蒿提取物对9 西瓜枯萎病的抑制活性、茼蒿提取物的提取工艺及茼蒿提取物对西瓜枯萎菌抑菌机理等方面开展研究10 第2章茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性2.1前言西瓜枯萎病(WatermelonFusariumwilt）是一种土传和种传真菌性病害，它是由尖孢镰刀菌西瓜专化型引起，该病害在世界各地均有发生，严重影响了西瓜的产量和品质[95,96]。近年来对西瓜枯萎病的防治，主要以农业防治和化学药剂防治为主。对种子进行灭菌处理、选用抗病品种，通过嫁接、轮作倒茬等方法来降低西瓜枯萎病的发病率[97]。虽然起到一定的防治效果，但是消耗了大量的劳动力和财力，并且农药长期大量使用，容易使病原菌对其产生抗药性，降低防治效果，同时也对环境造成污染。因此，如何科学有效地防治西瓜枯萎病的发生，减轻其危害，越来越受到广大西瓜生产者及科研工作者的重视，同时它是确保瓜农增产增收的关键。为此，寻找广谱、高效、低毒、安全的杀菌剂，特别是从天然植物中研究和筛选具有抑菌效果，对人体健康和生态环境无害的天然植物源杀菌剂具有十分重要的现实意义。在2011年，范淑英等人，发现在种植过茼蒿的土壤上种植西瓜，其西瓜枯萎病死亡率只有3.3%，而在未种植过茼蒿的土壤上种植西瓜，则西瓜枯萎病的死亡率高达80%[72].由此可见，茼蒿中可能含有一种或者几种活性物质，能够有效的抑制西瓜枯萎病的发生。本研究是以西瓜枯萎病即尖孢镰刀菌西瓜专化型为指示菌，对茼蒿粗提物的抑菌活性进行研究，并对其粗提物的最佳萃取剂进行筛选，以其为生产上有效、安全、环保防止西瓜枯萎病提供一定的理论指导。2.2材料与方法2.2.1材料与仪器茼蒿采用江西农业大学农学院蔬菜基地种植，经风干后的茼蒿干品；化学试剂：95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿，均为分析纯；PDA培养基；尖孢镰刀菌西瓜专化型即西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)由浙江大学植物病理实验室提供。R-3旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；LX-300冷却水循环机：北京长流科学仪器公司；KQ-500B超声波清洗机：昆山超声仪器有限公司；HS-1300U超净工作台：苏静集团苏州安泰公司；MIR-254恒温培养箱：日本三洋公司；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；5804R冷冻离心机：德国Eppendorf公司；2.2.2实验方法2.2.2.1菌种活化和菌悬液的配制在无菌条件下，将西瓜枯萎病菌接种到PDA培养基上，于28℃的培养箱活化，3d后，用无菌水将菌洗到瓶中，并过滤，制成孢子悬浮液，用血球计数板制成浓度为106-108cfu/ml。剩余活化菌种的平板备用。2.2.2.2粗提物中活性物质最佳萃取剂分别称取20g烘干的茼蒿4份，用200mL的95%乙醇超声提取2h，用滤纸过11 滤后，再用100mL乙醇超声波提取1h，蒸发浓缩，将其中三份加水稀释至30mL,并用相同体积的的乙酸乙酯、正丁醇和氯仿分别萃取，有机样分别蒸发浓缩到膏状，用乙酸乙酯溶解至4mL，浓度为5g/mL，4℃备用。同上方法，以多菌灵作为对照，测定其抑菌率。2.2.2.3最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)将干茼蒿粉碎过40目筛，称取100g用95%的乙醇超声提取两次，每次2h,粗提液减压浓缩至膏后称重，用乙酸乙酯配制成1g/mL的溶液。用二倍稀释法将粗提液稀释1000mg/mL-1.95mg/mL的梯度溶液，以1:9的比例与培养基混合成含药平板，多点涂布，每次加入2μL的菌液，以不含菌液为空白对照和菌液对照，每个处理重复三次将其放入28℃培养箱中2d，观察结果以无菌生长的培养皿的含药浓度为最小抑菌浓度(MIC),将无菌生长的平皿继续培养7d后观察，以无菌生长的含药浓度为最小杀菌浓度(MFC)。2.2.2.4茼蒿提取物对西瓜枯萎病抑菌活性的室内毒力测定利用生长速率法测定毒力方程，将1g/mL的粗提液稀释成250mg/mL、50mg/mL、10mg/mL、2mg/mL和0.4mg/mL的不同浓度溶液，在无菌条件下，与培养基混合制成含药培养基，用5mm的打孔器取活化好的菌种的边缘菌块，接种至含药培养基中间，以不含药培养基和溶剂培养基为对照[98]，每个处理重复三次放入28℃培养箱中7d,用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。校正菌落直径(mm)=菌落直径-打孔器直径抑菌率(%)=100×（溶剂校正菌落直径-处理校正菌落直径）/空白对照校正菌落直径2.2.2.5茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌孢子萌发的测定将茼蒿粗提物制成浓度分别为MIC、EC50和MFC，通过血球计数板使菌液浓度6-108cfu/mL，在每个凹玻片上加入72μL的菌液，分别加入0、MIC、EC为1050和MFC的粗提物浓度8μL，每个处理重复三次，在28℃培养箱中培养40h，通过显微镜观察100-200个孢子萌发的结果。2.2.2.6数据分析利用DPS7.05软件绘制标准曲线，求出毒力方程、相关系数、EC50和置信区间。2.3结果与分析2.3.1茼蒿粗提物中活性物质的最佳萃取剂的筛选通过乙酸乙酯、正丁醇、和氯仿分别萃取后，见图2.1与2.2，与粗提液相比较，结果发现正丁醇萃取后的溶液抑菌效果最好，与农药多菌灵达到同样的效果，抑菌率都达到90%以上，乙酸乙酯的抑菌率是77.9%，效果次之，氯仿的效果不明显，只有68.2%，因此，正丁醇萃取后的茼蒿溶液可以进行下一步茼蒿活性成分分离纯化。12 注：中间是CK对照,左边与右边无菌生长的平板分别为多菌灵和正丁醇，左上为粗提物，右上为乙酸乙酯，正下为氯仿。图2.1不同溶剂萃取后的菌丝生长情况Figure2.1TheMycelialgrowthofdifferentcrudeextracts图2.2不同溶剂萃取粗提物后的抑菌效果Figure2.2AntifungaleffectofdifferentcrudeextractsagainstFusariumoxysporum2.3.2茼蒿粗提物最小抑菌浓度（MIC)和最小杀菌浓度(MFC)的确定本实验通过二倍稀释法测定粗提物抑制西瓜枯萎病的MIC和MFC，结果显示MIC为125mg/mL，MFC为500mg/mL，可为田间试验粗提物对西瓜发苗期、生长期和坐果期的抑菌研究，以及在电导率、糖和蛋白质含量的测定提供一定的理论依据，2.3.3茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定不同浓度的粗提物对西瓜枯萎病菌的影响效果（见图2.3）。随着粗提物浓度的增大，抑菌效果逐渐明显，当浓度达到50mg/mL后，随着粗提物浓度的增大，抑菌效果更为显著，说明茼蒿中抑菌活性物质随浓度的增加，其含量也在增加，只有当抑菌活性物质含量达到一定浓度时，对西瓜枯萎病菌才有较好的抑制作用。13 图2.3不同浓度粗提物对西瓜枯萎病菌丝生长的情况Figure2.3Differentconcentrationofcrudeextractofwatermelonfusariumfilamentgrowth利用DPS软件绘制标准曲线，以茼蒿粗提物的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，求得毒力回归方程，相关系数(r)，EC50及置信区间如表2.1。EC50大小可以反映出粗提物对西瓜枯萎病菌抑制活性的大小，从表中可知，EC50为206.4058mg/mL,能更准确的反映出杀菌浓度及可以抑制西瓜枯萎病菌的粗提物浓度在置信区间内。表2.1茼蒿粗提物对西瓜枯萎病的抑菌效果Table2Crudeextractsfromgardenchrysanthemumbacteriostaticeffectofwatermelonfusariumwilt植物病原菌毒力回归方程/y=kx+b相关系数/r置信区间EC-150/mg.mlPhytopathogenVirulenceequationcorrelationindexconfidenceinterval西瓜枯萎病菌y=3.3460+0.7146x0.9429206.405845.3831~938.7490Watermelonfusarium2.3.4茼蒿粗提物对西瓜枯萎病菌孢子萌发的测定通过MIC、EC50和MFC的测定结果，在孢子萌发实验中利用这三组临界值作为处理组，以无茼蒿粗提物的菌液为对照，测定结果如下图2.4。随着浓度的升高，孢子萌发率越来越小，空白对照组孢子萌发达到92.9%，MFC时的孢子萌发率为17.4%，EC50的孢子萌发率为28.4%，而MIC时的孢子萌发率最大，萌发率为84.8%，从图中可以看出，MFC对孢子萌发的抑制作用较强，而MIC对孢子萌发的抑制作用较弱。图2.4不同浓度粗提物对枯萎病菌孢子萌发的影响Table2.4InhibitoryeffectofcrudeextractstonsporegerminationofFusariumoxysporum14 2.4结论与讨论试验证明，茼蒿对西瓜枯萎病菌有一定的抑制作用，同时正丁醇萃取的茼蒿粗提物抑菌效果较好，其抑菌效果达97.5%，正丁醇可以更好地将茼蒿中的活性物质提取出来，并且在西瓜枯萎病菌孢子萌发试验中，茼蒿粗取物能够较强的抑制孢子的萌发，在最小杀菌浓度(MFC)下的萌发率为17.4%。这说明茼蒿中含有某些活性物质，对植物病原菌有较好的抑制作用。从前人的研究中发现，茼蒿粗提物中的抑菌物质提高了西瓜中保护酶的活性，如SOD、POD与CAT，其中SOD与POD可以降低尖镰孢菌毒素对植物根系细胞膜的破坏，CAT可以分解植物体内过氧化物，从而提高植物的抗病性[99-101]，因此，可能是这些抑菌活性成分保护和提高西瓜细胞中的酶活性，从而保护膜不受损害，减轻枯萎病毒素对西瓜的侵染。在姜丽的研究中发现，茼蒿不同部位的水提液对西瓜植株的化感作用均有促进作用。在西瓜种子萌发时期，茼蒿水浸液能够加快种子发芽速度、发芽率、胚轴长，并且提高种子中淀粉酶的活性，同时降低了病原菌侵染发芽时期的种子[102]。在西瓜幼苗时期，茼蒿水浸液可以提高幼苗叶片保护酶酶活性与光合作用系统，降低膜的通透性，降低水分蒸发，从而加快幼苗的生长发育，增加叶片中干物质含量，增强幼苗自身防御功能，抵御病菌的侵害。此外，西瓜自身根系会分泌一些具有毒害作用的物质[103,104]，这些物质能够抑制幼苗生长与根系活力，并且破坏自身体内酶的活性等，研究证明这些毒害物质分别是苯丙烯酸、香豆酸等酚酸化合物，而茼蒿粗提物一方面可以增高毒素物质抑制下的西瓜幼苗叶片的POD、CAT与SOD的活性以及降低植物中MDA含量从而促进幼苗的正常生长发育，同时茼蒿提取物可能对根系分泌毒素物质具有钝化作用，从而阻碍毒素对西瓜幼苗的侵染，提高西瓜幼苗的抗病性与抗萎性[105,106]。综上所述，茼蒿能够促进西瓜幼苗生长和抑制西瓜枯萎病菌，但其作用机理有待进一步深入研究。为此，开展对茼蒿中活性成分的分离、纯化与结构鉴定等工作非常重要，它将为我们今后研制具有抑菌效果，而又对人类自身健康和生态环境无害的天然植物源杀菌剂，提供重要的理论指导，且具有重要的现实意义。15 第3章响应面法优化茼蒿抑菌物质超声波提取工艺3.1前言茼蒿为食药两用型植物，在营养方面，茼蒿中含丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、胆碱、谷氨酸、天门冬素、胡萝卜素、V[107]C及含有矿物质元素钙、磷和铁等营养成分。它的药用价值也很高，张金凤[108]等研究，茼蒿中的总黄酮具有降血糖、降血脂、抗肿瘤[109]、抗氧化[78]和增强机体免疫力等功能。Anakas等研究表明，茼蒿提取物是一种能增强免疫力的药物，通过激活Ⅰ型免疫，从而能够较好的预防一些感染性疾病、变态反应性疾病和癌症[110]。SongMyoung-Chong等[58]从茼蒿的茎叶中分离出四个生物碱成分Prunasin，Sambunigrin，Pterolactam和腺苷酸，它们主要通过对低密度脂蛋白氧化和胆固醇酰基转移酶等生物活性的抑制，从而促使胆固醇降低。在农药以及兽药中有可利用的价值，AttiasabRIne等的报道中，茼蒿提取物具有杀死螨虫的作用[111]。本试验利用有机溶剂浸提，采用超声波提取技术，在乙醇浓度、液料比、提取温度、提取时间等四个单因素优化的基础上，固定乙醇浓度，将料液比、提取温度和时间通过响应面分析法(ResponseSurfaceMethodology,RSM)设计三因素三水平的优化条件，得到茼蒿抑菌物质的提取工艺，为茼蒿的有效利用及天然植物源杀菌剂的开发和研制提供理论依据。3.2材料与方法3.2.1材料3.2.1.1植物材料茼蒿采用江西农业大学农学院蔬菜基地种植的茼蒿，经风干后的茼蒿干品，利用用小型粉碎机粉碎样品，并且将粉状样品过40目筛,置于干燥环境下使用。3.2.1.2供试菌株西瓜枯萎病菌由浙江大学农学院提供。3.2.1.3培养基PDA马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方：马铃薯、葡萄糖琼脂分别称取200g、20.0g、20g，加入水1000mL。3.3茼蒿抑菌物质提取工艺研究3.3.1单因素试验分别以乙醇浓度、时间、液料比和温度为单因素进行试验，研究各单因素对茼蒿提取液抑菌效果的影响。乙醇浓度的影响：称取5.0g的干茼蒿样品，倒入250mL的三角瓶中，按照液料比为20:1(mL·g-1)分别加入35、55、75、95%乙醇，在水温为40℃条件下超声波提取2h，过滤提取液，旋转蒸发(45℃)浓缩至5mL，用离心机（8000r/min，10min）离心后取上清液，放入4℃冰箱保存备用。以生长速率法测定西瓜枯萎病菌的抑菌率为考察指标，比较不同乙醇浓度对茼蒿提取物抑菌效果的影响。16 提取时间的影响：取5.0g的干茼蒿样品于三角瓶中，按照液料比为20:1(mL·g-1)加入95%乙醇，在水温为40℃条件下，超声波提取时间分别为30、60、90、120min，方法同上，比较不同提取时间对提取物抑菌效果的影响。液料比的影响：称取5.0g干茼蒿样品于三角瓶中，分别以液料比10:1、20:1、30:1、40:1(mL·g-1)条件下，加入不同体积95%乙醇，在水温为40℃条件下超声波提取90min，方法同上，比较不同液料比对茼蒿提取物抑菌效果的影响。温度的影响：称取5.0g的水黄连样品于三角瓶中，按照液料比为20:1(mL·g-1)加入95%乙醇，在水温为20、40、60、80℃条件下超声波提取90min，方法同上，比较不同提取温度对茼蒿提取物抑菌效果的影响。3.3.2响应面法优化试验结合单因素试验结果，固定乙醇浓度95%不变，自变量为提取时间(X1)、液料比(X2)、温度(X3)，以提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率为响应值(Y)，运用Design-Expert8.0.6软件中的Box-Benhnken方法，设计3因素3水平试验方案（表3.1）表3.1Box-Benhnken设计因素及水平表Table3.1FactorsandlevelsofBox-Benhnkendesign水平因素-101X1提取时间/min6090120X-12液料比/mL·g102030X3温度/℃2040603.3.3数据分析采用DesignExpert8.0.6和SPSS17.0统计软件进行分析。3.4结果与分析3.4.1单因素试验对茼蒿提取物抑菌效果的影响3.4.1.1乙醇浓度对茼蒿提取物抑菌效果的影响固定液料比为20:1(mL·g-1)时，取乙醇浓度分别为35%、55%、75%、95%，在温度40℃的超声波提取2h，观察乙醇浓度对提取物抑菌效果的影响。结果显示在其他条件相同的情况下，乙醇浓度对茼蒿提取物抑菌效果是随着浓度升高而增大，呈正相关，当乙醇浓度为95%时，茼蒿提取物的抑菌效果最强，抑菌效果达到38.51%。其原因是当乙醇体积分数低于50%时，茼蒿中的一些水溶性物质溶解度不断升高，茼蒿中抑菌活性物质将与水溶性物质竞争乙醇+水分子结合体系，使得抑菌物质溶解度不断下降，从而降低提取物的抑菌效果。因此选择95%乙醇为提取溶剂较好。3.4.1.2提取时间对提取物抑菌效果的影响固定液料比为20:1(mL·g-1)时，95%乙醇，在温度40℃的条件下分别用超声波提取30、60、90、120min，提取物抑菌效果如图1B所示。结果显示，超声波提取时间的不断延长，提取物抑菌效果呈缓慢上升的趋势，而提取时间达到90min时，抑菌效果出现快速上升的趋势。原因可能是抑菌物质为一些脂溶性的物质，但随着超声波17 提取时间的延长，达到软化脂溶性物质的效果，加速了一些脂溶性抑菌物质的溶解。因此最佳提取时间为90min。3.4.1.3液料比对提取物抑菌效果的影响在95%乙醇条件下，取液料比分别为10:1、20:1、30:1和40:1(mL·g-1)，温度为40℃的条件下超声波提取90min，提取物抑菌效果如图1C所示。随着液料比的增大，茼蒿提取物抑菌效果呈先上升后下降的变化趋势，在30:1时抑菌率达到最大。一方面由于固液两相抑菌物质的浓度梯度增加，扩散速度加快，有效抑菌成分提取率提高。而另一方面过大的液料比也会促进非抑菌物质的溶解，导致有效抑菌物质的抑菌效果下降。因此选择20:1作为茼蒿最佳液料比较好。3.4.1.4温度对提取物抑菌效果的影响固定液料比为20:1(mL·g-1)，乙醇为95%时，在温度20，40，60，80℃的条件下，采用超声波提取90min，提取物抑菌效果如图1D所示。提取温度在20℃至40℃之间，茼蒿提取物抑菌效果随着提取温度的升高显著增强，当提取温度高于60℃时，抑菌效果增强不显著。因此，最佳的茼蒿活性物质提取温度为40℃。柱形图标注不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)DifferentsmalllettersalongthecolumnindicatesignificantdifferenceatP<0.05.图3.1乙醇浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)和温度(D)对提取物抑菌效果的影响Fig.3.1Effectofethanolconcentration(A),extractiontime(B),liquid-to-solidratio(C)andtemperature(D)onantifungaleffectofextract3.4.2响应面分析3.4.2.1响应面法试验结果在单因素试验的基础上，设计3因素3水平响应面试验，结果如表3.2所示。18 表3.2响应面分析实验设计及结果Table3.2Responsesurfaceexperimentaldesignandresults抑菌率(%)试验号X1/minX2/mL·g-1X3/℃实测值预测值10(90)0(20)0(40)42.4942.8621(120)0(20)1(60)26.8826.483-1(60)-1(10)0(40)25.4525.0041(120)-1(10)0(40)31.4231.765-1(60)0(20)-1(20)30.8631.266-1(60)0(20)1(60)16.5616.9570(90)0(20)0(40)43.2142.8681(120)0(20)-1(20)38.5438.1590(90)0(20)0(40)42.6442.86100(90)0(20)0(40)42.8542.86110(90)-1(10)1(60)15.1315.19120(90)1(30)1(60)30.3930.34130(90)1(30)-1(20)39.0138.95140(90)-1(10)-1(20)32.5032.55150(90)0(20)0(40)43.1142.86161(120)1(30)0(40)43.5243.9717-1(60)1(30)0(40)34.6534.313.4.2.2模型的建立及显著性检验通过DesignExpert8.0.6软件对表3.2进行多元回归拟合分析，得到的模拟回归方程，如下所示：Y=42.86+4.11X221+5.38X2-6.49X3+0.72X1X2+0.66X1X3+2.19X2X3-5.07X1-4.03X2-9.58X23响应面的回归显著性方差分析见表3.319 表3.3茼蒿提取物对西瓜枯萎病菌抑菌效果回归分析结果Table3.3Analysisofvarianceforregressionmodel项目平方和自由度均方F值P值显著性模型1343.739149.30634.82<0.0001显著X1(时间)134.811134.81573.19<0.0001**X2(液料比)231.881231.88985.92<0.0001**X3(温度)337.351337.351434.38<0.0001**X1X22.1012.108.940.0202*X1X31.7411.747.410.0297*X2X319.14119.1481.38<0.0001**X21108.391108.39460.87<0.0001**X2268.26168.26290.22<0.0001**X32386.121386.121641.76<0.0001**残差1.6570.24失拟误差1.2830.434.590.0875不显著纯误差0.3740.093总误差1345.3716说明：R2=0.9844；R2Adj=0.9972；*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)。Note:R2=0.9844,R2Adj=0.9972;*indicatesignificantdifferenceatp<0.05,**indicatesignificantdifferenceatp<0.01,byLSD从上面回归方程的差异分析(表3.3)可知，该回归模型各自变量间差异极显著(P<0.0001)，说明该模型具有高度差异显著性(F值=634.82，P值<0.0001)，这说明这种试验方法有可靠性；而它的失拟误差(P值=0.0875＞0.05)不显著，说明实验中产生的误差较小，此线性回归方程对试验拟合情况较好，能够用该方程预测各因素对茼蒿提取物中活性物质抑菌效果；同时该模型相关系数值为R2=0.9844，极为接近1，模型相关度很好。其响应值的变化有98.44%与所选变量有关，仅有1.56%是无效值[112,113]。模型一次项X222(P＜0.0001)1、X2和X3(P＜0.0001)差异极显著，二次项X1、X2、X3差异极显著,交互项X1X2(P=0.0202)差异显著，X1X3(P=0.0297)差异显著，X2X3(P＜0.0001)差异极显著，表明提取时间、料液比、温度对茼蒿提取液的抑菌效应显著，并且他们之间存在交互作用。由回归方程可知，各因素对茼蒿抑菌物质提取率的方程系数为提取时间（4.11）、料液比（5.38）、温度（6.49），影响因素的主次顺序为温度＞料液比＞提取时间。所选试验因素与响应值之间的交互作用通过绘制响应面曲线图进行可视分析，如下图所示。20 图3.2提取时间和液料比相互作用对茼蒿提取物抑菌效果影响的响应面趋势图Fig.3.23Dsurfaceandcontourplotsshowingtheantifungaleffectofextractiontime(A)andliquid-to-solidratio(B)onextract图3.3提取时间和温度相互作用对茼蒿提取物抑菌效果影响的响应面趋势图Fig.3.33Dsurfaceandcontourplotsshowingtheantifungaleffectofextractiontime(A)andtemperature(C)onextract图3.4液料比和温度相互作用对茼蒿提取物抑菌效果影响的响应面趋势图Fig.3.43Dsurfaceandcontourplotsshowingtheantifungaleffectofliquid-to-solidratio(B)andtemperature(C)onextract各图中表示X1、X2、X3中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对茼蒿提取物抑菌能力的影响[114,115]。而响应曲面图的坡度表示的是各因素对结果值的敏感度，若是坡度较平缓，说明他们对结果值的改变不是很敏感[116]，也能说明这两种自变量的交互作用比较强，从图中可以看出，料液比与温度的交互作用，以及提取时间与料液比的交互作用相比温度比与时间的交互作用要大。经分析X1、X2、X3的最优值分别为102.99min、26.39mL·g-1、34.97℃，理论的抑菌率为46.287%。21 3.4.3最优提取工艺的验证为验证响应面法的可行性，在优化条件下对茼蒿抑菌物质进行优化提取，由于小数不可准确设定，因此实际操作中将提取工艺参数调整为：提取时间103min，液料比26mL·g-1，温度35℃,模型预测值为46.28%，实际平均值为45.56%，实际值与预测值的吻合度为98.44%。3.5结论与讨论本试验以茼蒿提取物对西瓜枯萎病病菌的抑菌率为考察指标，固定乙醇浓度，以液料比、温度、提取时间为自变量，在单因素试验基础上，建立一个三因素三水平的响应面优化提取茼蒿中抑菌物质的工艺模型。回归方程分析表明，该模型的稳定性和可行性较好，通过显著性分析发现：各自变量对茼蒿抑菌物质提取率的主效应明显，各因素的主次关系为：X3(温度)＞X2(料液比)＞X1(提取时间)。超声波辅助条件下，茼蒿中抑菌物质的最佳提取工艺条件为：时间103min，乙醇浓度95%，液料比26mL·g-1，温度35℃，模型预测值为46.28%，实际值与预测值的吻合度为98.44%。目前常用超临界流体萃取、生物酶解提取、有机溶剂萃取、微波辅助提取、超声波提取等植物活性成分提取方法，但由于不同植物、不同的提取部位、不同活性成分等，应采用不同的提取工艺和方法[117]。周建华等[118]通过研究茼蒿中精油的提取工艺的试验发现，乙醇为提取茼蒿中精油的最佳提取溶剂，结合单因素与正交设计实验条件下，确定提取时间、温度、料液比和乙醇浓度最佳提取工艺条件为:提取时间6.5h,提取温度45℃,料液比1:15，乙醇浓度85%。2012年对茼蒿中黄酮成分的研究，利用超声波提取方法,得到响应面优化最佳的工艺条件是时间为60min，温度为53℃，乙醇浓度为63%，料液比为31:1[108]，张金凤等又发现利用微博辅助提取茼蒿中黄酮成分的响应面优化提取工艺的最佳条件是时间为2min、乙醇浓度为60%，并且是在微波功率保持在中下档[119]，因此不同的提取方法与不同的活性物质在提取工艺上都存在一定差异。综上所述，采取响应面分析法优化提取茼蒿抑菌物质的方法，在实践上是可行的，所获得的茼蒿提取物对西瓜枯萎病病菌有较强的抑菌效果，但茼蒿提取物中对西瓜枯萎病病菌有抑菌作用的主要成分的分离鉴定以及抑菌机理有待进一步研究。22 第4章茼蒿提取物对西瓜枯萎病病菌抑制效果的初步研究4.1前言从植物中提取活性物质来抑制有害微生物，成为开发和研制新型植物源农药的有效途径之一。近年来，蒲忠慧[120]从青刺果提取的生物碱、黄酮等对金黄色葡萄球菌有抑制作用。张静雅[121]从苦瓜中分离纯化出化合物A、B、C、D、E抑菌活性物质对大肠杆菌可能有抑菌作用。黄晓敏[122]也从马尾松针提取出抑菌活性物质黄酮类似物对常见的腐败菌及致病菌的抑菌作用。张赟彬提出许多植物提取物对微生物都有较强的抑制作用[123]。从目前绝大多数的研究结果分析，植物中提取的活性物质的抑菌机理大致可以分为：降解细胞壁[124]、破坏细胞膜[125]、胞内成分渗出[126]、破坏膜蛋白[127]、分子主动运输力损耗[128]、胞质凝结[129]等。本试验主要通过开展茼蒿提取物对西瓜枯萎病病菌的抑菌效果及抑菌机理的研究，以其为茼蒿活性物质的开发与利用提供一定的理论依据。4.2材料与方法4.2.1材料与试剂茼蒿采用江西农业大学农学院蔬菜基地种植且经风干后的茼蒿干品，实验时将茼蒿粉碎并且通过40目筛使用。葡萄糖、三水合乙酸铅、考马斯亮蓝、牛血清蛋白、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、草酸、蒽酮、浓硫酸、磷酸、乙酸、乙酸乙酯均为分析纯。4.2.2仪器其中有DDS-307A电导率仪（上海精密科学仪器有限公司）；普瑞斯仪器有限公司，可见分光光度计；智诚分析仪器制造有限公司，恒温振荡培养箱；SpectraMaxM2多功能酶标仪（山特电子有限公司）；紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；5804R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）等仪器；4.2.3菌种与培养液西瓜枯萎病菌由浙江大学农学院提供。PDB培养液4.2.4方法4.2.4.1茼蒿提取液制备将500g茼蒿干粉浸泡在90%乙醇中，利用超声提取2h，通过旋转蒸发仪成浸膏状，配制成500mg/mL的提取原液，4℃保存，备用。本实验的浓度设置MIC、EC50、MFC，分别为125mg/mL，206mg/mL，500mg/mL[130]4.2.4.2菌种活化与菌悬液的制备无菌条件下，将西瓜枯萎病菌接种到PDA培养基上，于28℃的培养箱活化，3d后，用无菌水将菌洗到瓶中，并过滤菌丝，制成孢子悬浮液，用血球计数板制成浓度为106-108cfu/mL。23 4.2.4.3茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌细胞膜渗透性的测定[131]无菌条件下，将1mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液接种于100mLPDB培养液中，分别加入0、MIC、EC50、MFC不同浓度的茼蒿提取液，对照组加入溶剂，均加入5mL溶液，在180r/min摇床震荡培养3天，温度设置28℃，培养期间，将各浓度处理液分别5h、10h、15h、20h吸取5mL在10000r/min离心10min，将菌丝过滤，得到上清液，测定其电导率，每个处理重复三次。4.2.4.4茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝生物量的影响[132]无菌条件下，将1mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液接种于50mLPDB培养液中，分别加入0、MIC、EC50、MFC不同浓度的茼蒿提取液，对照组加入溶剂，均加入5mL溶液，在180r/min摇床震荡培养7d，温度设置28℃，结束后，将各浓度处理液中的菌丝于5000r/min下离心20min,倒掉上清液，称量沉淀的重量，为菌丝湿重。称重后，将菌丝放入75℃烘箱24h，取出，称重，即为菌丝干重，每个处理3次重复。4.2.4.5茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝可溶性蛋白质含量的测定[133]4.2.4.5.1菌丝的预处理无菌条件下，将1mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液接种于100mLPBD培养液中，在180r/min摇床震荡培养5d，温度设置28℃，分别加入0、MIC、EC50、MFC不同浓度的茼蒿提取液，对照组加入溶剂，均加入5mL溶液，继续震荡培养2-3d，利用纱布过滤，用无菌水冲洗菌丝体3遍后，用磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH7.5)冲洗3次，之后用滤纸将菌丝中的水分吸干，于研钵冰浴中放入吸干0.5g菌丝，加入2mL磷酸缓冲液和1g石英砂，快速研磨到糊状，将其快速吸入离心试管中，没到5mL的加入磷酸缓冲液，在4℃离心机中以5000r/min离心15min,吸取上清液放入-20℃冰箱保存备用。4.2.4.5.2蛋白质标准曲线制作取6支试管，按表4.1依次编号并加各试剂后，摇匀混合各试管中的溶剂，静置2min后，在595nm波长下测定并记录其吸光值。以蛋白质的含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线图4.1。表4.1蛋白质标准曲线的制作Table4.1TheproductionofstandardcurveofproteinBSA标准品最终浓度/ug.ul-1管号稀释液用量/ulBSA标准品用量/ulBSAstandardfinalTubeNo.TheamountofdiluentBSAstandardamountconcentrationA01002B2002001C200200(从B管中取)0.5D200200(从C管中取)0.25E200200(从D管中取)0.125F200200(从E管中取)0.0625G20000(空白)24 图4.1蛋白质标准曲线Fig.4.1StandardcurveofProteinconcentration4.2.4.5.3菌丝可溶性蛋白的测定将测定的吸光值带入标准曲线的方程中，得到蛋白浓度，作图。4.2.4.6茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝总糖含量的测定4.2.4.6.1菌丝的预处理无菌条件下，将1mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液接种于100mLPDB培养液中，在28℃、180r/min震荡培养3d，分别加入5mL0、MIC、EC50、MFC不同浓度的茼蒿提取液，继续培养3d后，用纱布过滤除去菌液，用无菌水冲洗3次，晾干，取菌丝0.25g，研磨直到糊状后转入50mL三角瓶中，定容至50mL，水浴15min，待其冷却后定容至50mL加入10%醋酸铅溶液2mL，在过程中摇晃三角瓶将提取的蛋白质沉淀，当蛋白质沉淀后加入草酸结晶0.25g，待其与醋酸铅反应完后过滤沉淀，将溶液置于4℃保存备用。4.2.4.6.2葡萄糖标准曲线的制作取6支试管，按表4.2依次编号并加各试剂后，将其摇匀混合，在沸水浴中加热大约5min，待其于室温中冷去后，在620nm波长下测定并记录吸光值。以标准葡萄糖含量为（ug）为横坐标，A620为纵坐标，绘制标准曲线图4.2。表4.2葡萄糖标准曲线的制作Table4.2Theproductionofstandardcurveofglucose试管编号012345TubeNumber葡萄糖原液/mL0.00.20.40.60.81.0Liquidglucose蒸馏水/mL1.00.80.60.40.20.0Distilledwater浓硫酸/mLConcentrated5.05.05.05.05.05.0sulfuricacid蒽酮/mL0.50.50.50.50.50.5Anthrone葡萄糖含量/ug0.020.040.060.080.000.0Glucosecontent25 图4.2葡萄糖标准曲线Fig.4.2Standardcurveofglucose4.2.4.6.3菌丝总糖的测定将冰箱中提取菌丝总糖的液体向试管中吸取2mL，依次分别加入5mL浓硫酸和0.5mL蒽酮，摇晃试管后放入水浴锅反应5min，待其冷却后，在620nm波长下测定并记录其吸光值，每个处理重复3次，计算出各样品中的总糖含量。含糖量（%）=100*（A*V）/(Vs*W*106)其中：A为在标准曲线上查得的含糖量（ug）V为总体积（mL）Vs为测定取样体积（mL）W为样品重量（g）4.2.4.7茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌核酸泄露的测定无菌条件下，将1mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液接种于50mLPDB培养液中，分别加入0、MIC、EC50、MFC不同浓度的茼蒿提取液，对照组加入溶剂，均加入5mL溶液，摇床震荡培养7d后（180r/min，28℃），将各处理液在4000r/min离心15min后吸取上清液，测定260nm时各菌液的吸光值。4.2.4.8西瓜枯萎病菌菌丝DNA的提取4.2.4.8.1菌丝制备将茼蒿提取液配制成浓度为1g/mL，以二培稀释法将其配制成0.5g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL、0.0625g/mL、0.03125g/mL不同浓度的茼蒿提取液。在无菌条件下，将1mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液接种于50mLPDB培养液中，加入上面不同浓度的茼蒿提取液5mL，以不加茼蒿提取液为对照组，每个处理重复三次，摇床震荡培养7d后（180r/min，28℃），取出培养物，离心（4000r/min，15min)，取出菌丝，将其水分吸干，晾晒，备用。4.2.4.8.2菌丝DNA提取[132]以改良的CTAB来提取菌丝DNA，方法如下：（1）称取已经吸干的新鲜西瓜枯萎病菌丝50mg，加入CTAB缓冲液1mL,并加入少许石英砂迅速研磨成粉末。之后移入1.5ml离心管中，加入100μL蛋白酶K与RNA26 降解酶,得到最后浓度为100μg/mL，将其放置30min于65℃保温箱中,培养间摇匀离心管。到时间后，加入等体积酚:氯仿=1:1，赶紧混匀并且立即放入冷冻离心机(4℃,12000r/min)离心5min，将上清液吸入新离心管中，再次离心。加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积浓度为3M的醋酸钠，在4℃冰箱静置30min后，放入冷冻离心机(4℃，12000r/min)中再次离心5min。离心结束后弃掉上清液，用70%乙醇洗管壁2次，通风处瞭干，用适量水溶解沉淀，放置于-20℃冰箱保存。（2）利用琼脂糖凝胶电泳分析实验结果。琼脂糖凝胶电泳方法：称取0.5g琼脂糖加入50mL蒸馏水，微波加热至琼脂糖完全融化，并将其摇匀，这就是0.1%琼脂糖凝胶电泳。将电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)，要清洗干净并且凉干，固定位置放好。加入1-2μL染料于65℃左右的1%琼脂糖凝胶液，然后将它们混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢的铺开在玻璃板上，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，室温下静置至凝胶完全凝固。垂直轻拔梳子，然后将凝胶及内槽放入电泳池中，将6xloadingbuffer与DNA样品均匀混合后,吸取10μL点入胶板小槽内。开通电源进行电泳。4.2.5数据分析采用DPSv7.05进行统计分析，Origin8.0进行图表分析，Spss17.0进行显著性差异分析。4.3结果与分析4.3.1茼蒿提取液对西瓜枯萎病病菌细胞膜渗透性的影响渗透压决定着细胞内外的水平衡，水能通过半透膜进或出入细胞，蔗糖与蛋白等大分子则不能通过，因此通过测定溶液电导率的变化，可以了解细胞膜渗透性的变化。由图4.3可知，各处理溶液的电导率随着浓度增大而增大，处理5d，各处理的相对电导率与对照相比有差异，而随着培养时间的延长，在10d，各处理的相对电导率与对照相比差异不明显，处理20d，EC50处理的相对电导率达到最大，为0.27ms/cm，从整个过程看，随着培养时间的延长，各处理的相对电导率均缓慢增大，说明各处理对西瓜枯萎病病菌的细胞膜透性改变均有影响，其中EC50处理的影响最大，与对照相比，有明显的差异，因此，茼蒿提取液对西瓜枯萎病病菌的活性有较好的抑制作用。0.30CKSMICECMFC500.250.20Conductivity)0.15ms/cm（0.100.05电导率0.005101520时间（h)Time图4.3茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌细胞渗透性的影响Figure4.3EffectofChrysanthemumcoronariumL.extractoncellpermeabilityofFusariumoxysporum27 4.3.2茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝生物量的影响本实验分别用CK、MIC、EC50、MFC不同浓度的茼蒿提取液，并以S溶剂对照，处理西瓜枯萎病病菌，观察其在PDB液体培养基中对西瓜枯萎病病菌的抑制效果，在7d后测定其菌丝的湿重和干重。图4.4A表示茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝的湿重影响，图4.4B表示茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝的干重影响。从图A和B中可知，随着浓度的增大，菌丝的干湿重均逐渐减小(P<0.05)，各处理与CK相比差异显著，此外，各处理之间也存在显著性差异，其中MIC处理，菌丝湿重较CK减少13.1%，干重减少25.64%；EC50处理，菌丝湿重较CK减少23.58%，干重减少43.59%；MFC处理，菌丝湿重较CK减少64.34%，干重减少78.63%，说明茼蒿提取液能够抑制西瓜枯萎病菌丝生的生长。图4.4茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝生物量的影响Figure4.4EffectofChrysanthemumcoronariumL.extractonmassgrowthofFusariumoxysporum4.3.3茼蒿提取液对西瓜枯萎病病菌可溶性蛋白的影响可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，其增加和积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用。本实验分别用CK、MIC、EC50、MFC不同浓度的茼蒿提取液，来处理西瓜枯萎病病菌，观察其对病原菌可溶性蛋白的影响。从图4.5可知，随着茼蒿提取液浓度的增大，蛋白含量显著降低，其中MIC处理，蛋白浓度为0.27ug/u；EC50处理，蛋白浓度为0.23ug/ul，；MFC处理，蛋白浓度为0.17ug/ul，与CK（蛋白浓度为0.34ug/ul）差异显著（P<0.05），说明茼蒿提取液导致西瓜枯萎病菌丝可溶性蛋白质的严重流失。28 图4.5茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝蛋白的影响Figure4.5EffectofChrysanthemumcoronariumL.extractonmyceliaproteincontentofFusariumoxysporum4.3.4茼蒿提取液对菌丝中总糖含量的影响糖是细胞内生物活动的能源，它影响着蛋白质与脂肪的合成，同时能够在细胞中维持渗透压的作用。由图4.6可知，经茼蒿提取液处理后的西瓜枯萎病菌丝内的总糖含量下降，MIC、EC50和MFC中还原糖含量分别为64.68ug/mL、61.04ug/mL和62.33ug/mL，而CK中菌丝糖含量为86.42ug/mL，各种处理与CK相比均差异显著（P<0.05）。说明茼蒿提取物破坏了菌丝的细胞膜结构，使大分子还原糖可以通过细胞膜渗出，导致了还原糖含量下降，因此，茼蒿提取液能有效地抑制菌丝生长。图4.6茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌丝糖含量的影响Figure1.6EffectofChrysanthemumcoronariumL.extractonmyceliasugarcontentofFusariumoxysporum4.3.5茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌核酸泄露的影响在260nm下，通过测定不同溶度的茼蒿提取液处理后的西瓜枯萎病菌液的吸光值，了解茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌核酸泄露的影响，吸光值越大说明核酸泄露越多。29 从4.7可知，MFC处理后菌液的吸光值最大，与CK相比差异显著；而MIC和EC50处理与CK相比差异不显著（P<0.05）。图4.7茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌核酸泄露的影响Figure4.7EffectofChrysanthemumcoronariumL.extractonNucleicacidleakofFusariumoxysporum4.3.6菌丝DNA的提取茼蒿提取液浓度处理的西瓜枯萎病菌菌丝中DNA的凝胶条带的亮度与对照组相比，没有显著差异，这说明菌丝细胞中的DNA没有出现泄漏现象，或者说DNA没有被茼蒿提取液一系列抑菌作用所降解，如下图：注：1代表Marker,2表示对照，3表示1g/mL，4表示0.5g/mL，5表示0.25g/mL，6表示0.125g/mL，7表示0.0625g/mL，8表示0.03125g/mL。图4.8西瓜枯萎病菌菌内DNA电泳图Table4.8EffectofChrysanthemumcoronariumL.extractontheproteincontentofFusariumoxysporum4.4讨论与结论试验结果表明，采用茼蒿提取物处理后的西瓜枯萎病菌菌液经一段时间的培养，菌液电导率发生了改变，在相同的时间内，MIC和MFC处理后的菌液电导率变化相对比较小，而EC50处理的电导率变化最大，为0.27ms/cm。说明茼蒿提取物中的活性物质引起的细胞膜透性的改变，导致细胞内含物外渗，从而使电导率增大。据刘小红等[134]研究发现罗默碱对梨锈病菌的细胞膜有破坏作用,从而使菌丝体体细胞内的大分子物质如可溶性糖类、可溶性蛋白等外渗,导致电解质浓度增大,从而电导率上升。30 试验采用一定浓度的茼蒿提取物处理西瓜枯萎病菌的菌丝体，其菌丝生物量明显下降,在MFC的浓度处理下菌丝湿重减少64.34%，干重减少78.63%。说明茼蒿提取物可有效地抑制菌丝的生长，其结果可能是通过抑制菌丝体细胞内的蛋白质、生物活性酶从而导致菌丝体生物量下降。菌丝的生长离不开蛋白质，蛋白质可以构成生物体的结构成分，也可以是参与代谢的酶，蛋白质含量的降低，则说明细胞的结构受到不可逆破坏，蛋白质积累减少甚至停止，同时参与各种生理活动的酶被大量分解或合成受到抑制这些变化将导致细胞代谢功能下降或紊乱，直至细胞死亡[135]，从而使菌丝生长受到抑制，生物量下降。试验证实，经茼蒿提取物处理一段时间后的西瓜枯萎病菌病菌，菌丝体的可溶性蛋白质、还原糖含量均下降，还原糖含量的下降是因为菌丝体的细胞膜受到破坏，从而使大分子物质穿透细胞膜渗出到液体培养基中。而可溶性蛋白质的降低可能是：1)它的合成受到抑制，2)渗出到细胞外。据李冲伟等[136]研究发现，木霉菌株T-33培养液提取物对杨树烂皮病菌的蛋白质合成有抑制作用，或者导致菌丝体的蛋白质变性。通过核酸泄露的测定，可以看到茼蒿提取物浓度在MFC时，核酸泄露与CK相比差异显著，有可能是茼蒿提取物破坏了菌丝体体细胞的细胞膜，从而使核酸大分子泄漏到体细胞外，从而影响吸光值，通过DNA提取验证，处理后的菌丝与对照之间的电泳条带无显著差异，这表明核酸大分子没有泄露现象。以上试验充分证明茼蒿提取物能有效地破坏西瓜枯萎病病菌的细胞膜，使电导率增加，大分子渗漏，并抑制细胞中的蛋白质以及酶的合成。此外，如何采用茼蒿提取物处理西瓜活体叶片并测定其细胞壁降解酶，如纤维素酶、果胶酶等[137]的含量变化，以及是否影响西瓜抗病基因[138,139]等，还有待进一步研究，这将为更全面了解茼蒿提取物安全有效防治西瓜枯萎病提供理论依据。31 第5章茼蒿提取物对其他植物病原菌的测定以及GC-MS的成分检测5.1前言通过前期的研究发现，茼蒿提取物对西瓜枯萎病具有抑菌活性，但植物中还存在很多种病原菌，为了更好地利用茼蒿中的活性物质，就必要筛选出茼蒿提取液对哪些病原菌也有抑制作用，对茼蒿进一步的开发利用具有更重要的意义。本次实验采用生长速率法，对8种病原真菌的抑菌活性进行测定，为茼蒿充分开发利用提供一定的基础。GC-MS是气相色谱-质谱联用仪,由于柱中填充材料对不同成分的吸附能力强弱的不同，将其分离开来，所以化合物进入色谱柱运行一段时间后，有些成分吸附能力弱，很容易被淋洗剂冲洗下来，运行速度较快，而有些成分吸附能力强，很难被淋洗剂冲下来，运行速度比较慢，这样吸附能力弱的成分先进入检测器，得到检测和记录，吸附能力强的成分后进入检测器，这样使得各组分化合物得以分离。姜红霞等[140]通过对泰山野生白苏叶挥发油成分GC-MS分析，其主要成分是紫苏酮、戊基苯酚、石竹烯、芳樟醇，含量分别为18.16%、17.3%、14.79%、7.69%。刘杰等[141]对佩兰挥发油的提取与GC-MS分析研究中，发现其主要成分为-石竹烯、2，4-二叔丁基苯酚、β-蛇床烯、别香橙烯、-雪松醇。本实验通过对茼蒿提取液进行GC-MS检测分析，得到茼蒿提取液中所有可能的活性成分，为接下来验证茼蒿提取液主要活性成分提供科学的理论依据。5.2试验材料与仪器茼蒿采用江西农业大学农学院蔬菜基地种植且经风干后的茼蒿干品，实验时用小型粉碎机粉碎成粉末状样品，过40目筛使用。柑橘青霉菌(Penicilliumitalicum)；枣拟茎点霉菌(Phomopsismauritiana)、猕猴桃灰霉菌(Botrytiscinerea)、猕猴桃拟茎点霉菌(Phomopsisasparagi)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriaparva)、莴苣菌核核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、水稻纹枯菌(Rhizoctoniasolani)、盘多毛(Pestalotiopsistheae)均由江西农业大学植物病理实验室提供。于南昌大学进行活性成分检测，RTx-1MS色谱柱（30m×0.25mm，0.5μm），Restek公司；PolarsQ气相-质谱联用仪(美国热电公司)5.3试验方法5.3.1茼蒿抑菌谱的研究5.3.1.1菌种活化在无菌条件下，用打孔器取各病原真菌边缘菌块，并将其转接到PDA培养基上，在28℃下培养一周，备用5.3.1.2活性的测定将茼蒿提取液配制成浓度为250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL、32 15.625mg/mL的浓度梯度，利用生长速率法，在无菌条件下，茼蒿提取液与PDA培养基的比例为1:9，混匀后倒入平板，制成含药培养基，将活化好的菌种放置含药培养基的中间，以不加茼蒿提取液我的培养基为对照，每个处理重复三次，放置培养箱培养1-2周，利用十字交叉法测量菌丝生长情况，计算抑菌率。抑菌率%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径*1005.3.2GC-MS分析5.3.2.1气相色谱条件进样口温度220℃，柱箱温度：初温40℃，保持3min，以10℃/min的速率上升至120℃，再以5℃/min的速率上升至250℃，保持3min；载气为氦气，柱流量为1.0mL/min，柱前压50kPa，进样量100μL，分流比50∶1。5.3.2.2质谱条件电子源为EI，离子源温度250℃，检测电压0.8kV，质量扫描范围扫描范围40~300m/z。根据CAS编号查出相关名称与结构，通过相对含量确定主要成分。根据CAS编号查出相关名称与结构，通过相对含量确定主要成分。5.3.3数据分析采用DPSv7.05进行统计分析，并且求得毒力方程、相关系数、EC50、置信区间。5.4结果分析5.4.1茼蒿提取液对9种植物病原菌的抑菌作用以茼蒿提取液浓度为横坐标，平均抑制率为纵坐标，用软件绘制出的标准曲线，得出茼蒿提取液对9种供试植物病原菌的毒力回归方程、EC50、置信区间和相关系数，结果如下表所示。从表中可以看出，茼蒿提取液对9种植物病原菌都有抑菌作用，只是抑菌强弱有差别，相关系数是表示两个变量之间的线性关系，说明两个变量之间存在关系，不是独立的个体，因此茼蒿提取液与病原真菌之间又相互的影响。而EC50能有效的反应植物源杀菌剂对植物病原菌抑菌活性的大小，当EC50的值越小的时候，反映出植物源杀菌剂对病原菌的抑菌活性越大。茼蒿提取液对9种植物病原菌的抑菌作用由大到小的顺序依次为：辣椒疫霉菌、莴苣菌核核盘菌、水稻纹枯菌、枣拟茎点霉菌、葡萄座腔菌、猕猴桃灰霉菌、盘多毛、猕猴桃拟茎点霉菌和柑橘青霉。茼蒿提取液对辣椒疫霉菌的抑菌效果最好，它的EC50为76.87mg/mL，其毒力回归方程为Y=1.2769+3.4025X，其斜率最大为3.4025，说明该植物病原菌对茼蒿提取液比较敏感，能够抑制该病原菌的生长，对于莴苣菌核核盘菌，它的EC50为91.770mg/mL，相对而言结果也是抑菌效果很好，而对水稻纹枯菌、枣拟茎点霉菌、葡萄座腔菌、猕猴桃灰霉菌、盘多毛和猕猴桃拟茎点霉菌的抑菌效果属于中间，均在100~350mg/mL之间，对柑橘青霉的抑菌效果最差，EC50已经达到6251.91mg/mL，说明茼蒿提取液对柑橘青霉不敏感，抑菌效果不强。33 表5.1茼蒿提取液对各种植物病原菌的抑菌效果Table5.1inhibitoryeffectofchrysanthemumextractionliquidofplantpathogens植物病原菌名称毒力回归方程（Y）相关系数(r)EC50置信区间phytopathogenVirulenceequationcorrelationindex（mg/mL）confidenceinterval葡萄座腔菌Y=1.447+1.6220X0.9657258.689116.44~566.117盘多毛菌Y=1.6164+1.3395X0.9685352.116132.264~958.979莴苣菌核核盘菌Y=1.3830+1.8534X0.922091.77052.431~160.371水稻纹枯菌Y=2.4983+1.2619X0.9698104.5868.506~158.018枣拟茎点霉菌Y=1.7861+1.4764X0.9927166.871144.19~205.66辣椒疫霉菌Y=1.2769+3.4025X0.992176.8766.161~88.100柑橘青霉Y=1.7599+0.8592X0.95826251.911021.16~40960猕猴桃拟茎点霉菌Y=1.8052+1.2564X0.9921360.89264.44~467.14猕猴桃灰霉菌Y=3.3.1467+0.7470X0.9460305.67150.83~633.625.4.2茼蒿提取液GC-MS分析经过GC-MS联用技术，得出了茼蒿提取液有49种主要化合物。由表可以看出，茼蒿提取液中内酯类占15种，相对含量为3.3%；酮类占据9种，相对含量3.92%；醇类占7种，相对含量1.91%；酸占3种，相对含量0.09%；烯、醛和酚各占1种，相对含量分别为0.8%、0.03%、0.01%。内酯类含量较高为棕榈酸乙酯和(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸甲酯，相对含量为1.1%、1.07%；其次为棕榈酸丁酯、硬脂酸乙酯、3,7-二甲基-6-辛烯醇丙酸酯和肉豆蔻酸乙酯，相对含量分别为0.3%、0.25%、0.22%、0.11%。酮类化合物中含量较高的是环己酮，含量为1.28%；其次2,4-戊二酮、2-甲基-3-戊酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、甲基异丁酮和2,4-二甲基-3-戊酮，它们的相对含量分别为0.84%、0.65%、0.61%、、0.31%和0.13%。表5.2茼蒿提取液的GC-MS成分分析结果Table5.2resultsofextractionofGC-MScomponentsofchrysanthemumliquor序号化合物化学式分子量保留时间相对含量1正己醇1-HexanolC6H14O102.172.09970.15%2正丁醇1-ButanolC4H10O74.122.14661.38%32,4-二甲基戊烷2,4-dimethyl-PentaneC7H16100.202.15630.43%42,4-戊二酮2,4-PentanedioneC5H8O2100.122.16380.84%甲基异丁酮C6H12O100.162.16380.31%5Methylisobutylketone丙位毋内酯C5H8O2100.122.17170.01%64,5-Dihydro-5-methyl-2(3H)-furanone73-甲基己烷3-methyl-HexaneC7H16100.202.23260.15%2,3,4-三甲基戊烷C8H18114.232.26990.12%82,3,4-trimethyl-Pentane92-甲基-3-戊酮3-Pentanone,2-methyl-C6H12O100.152.44870.65%103-庚酮3-HeptanoneC7H14O114.192.5180.06%112,3-二甲基戊烷2,3-dimethyl-PentaneC7H16100.202.5180.25%12糠醇2-FurylmethanolC5H6O298.102.46630.02%13正庚醇1-HeptanolC7H16O116.202.49070.1%34 序号化合物化学式分子量保留时间相对含量14环己酮cyclohexanoneC6H10O98.142.75421.28%15环己烷CyclohexaneC6H1284.162.44572.35%16庚烷HeptaneC7H16100.202.42281.58%4-甲基-3-戊烯-2-酮C6H10O98.142.82770.61%173-Penten-2-one,4-methyl-182,5-己二酮2,5-HexanedioneC6H10O2114.142.84010.03%19甲基环己烷Cyclohexane,methyl-C7H1498.192.75420.28%202,5-二甲基己烷Hexane,2,5-dimethyl-C8H18114.222.84320.22%2,4-二甲基-3-戊酮C7H14O114.192.84980.13%213-Pentanone,2,4-dimethyl-223-甲基庚烷Heptane,3-methyl-C8H18114.232.91470.09%23辛烷OctaneC8H18114.233.23070.15%24山梨酸SorbicacidC6H8O2112.133.26810.04%4-甲基环己酮C7H12O112.174.46210.01%25Cyclohexanone,4-methyl-26辛酸OctanoicacidC8H16O2144.2112.06880.01%27丁香酚EugenolC10H12O2164.2014.76750.01%4-异丙基甲苯C10H14134.2214.91030.01%281-Methyl-4-(1-methylethyl)benzene29癸酸丁酯ButylcaprateC14H28O2228.3715.6360.01%月桂酸乙酯Dodecanoicacid,ethylC14H28O2228.3715.71850.01%30ester2-Cyclohexen-1-ol,2-methyl-5-(1-methC12H18O2194.27016.07310.02%31ylethenyl)-,acetate,(1R-cis)-32十三醛TridecanalC13H26O198.3417.27720.03%3,7-二甲基-6-辛烯醇丙酸酯C13H24O2212.32817.67530.22%336-Octen-1-ol,3,7-dimethyl-,propanoate3,7-二甲基-6-辛烯乙酸酯C12H22O2198.3017.68020.06%343,7-Dimethyl-6-octen-1-ylacetate35肉豆蔻酸乙酯EthyltetradecanoateC16H32O2256.4218.05430.11%36肉豆蔻酸TetradecanoicacidC14H28O2228.3718.09440.04%3,7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯ButanoicC14H26O2226.3618.34030.02%37acid,3,7-dimethyl-6-octenylester十一酸乙酯Undecanoicacid,ethylC13H26O2225.3619.42480.03%38ester39肉豆蔻酸丁酯n-ButylmyristateC18H36O2284.47720.73570.03%棕榈酸乙酯Hexadecanoicacid,ethylC18H36O2284.4820.94861.10%40ester异薄荷醇C10H20O156.26522.83230.05%41Cyclohexanol,5-methyl-2-(1-methylethyl)-,[1S-(1.alpha.,2.beta.,5.beta.)]-42异植物醇IsophytolC20H40O296.5322.83830.17%43叶绿醇PhytolC20H40O296.5322.8450.04%棕榈酸丁酯Hexadecanoicacid,butylC20H40O2312.5323.8350.3%44ester硬脂酸乙酯Octadecanoicacid,ethylC20H40O2312.5323.97640.25%45ester油酸甲酯(Z)-9-OctadecenoicacidC19H36O2296.4924.08660.03%46methylester47(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸甲酯C19H34O2294.4724.28261.07%35 序号化合物化学式分子量保留时间相对含量9,12-Octadecadienoicacid(Z,Z)-,methylester香茅烯C10H18138.24924.29650.8%48R(-)3,7-Dimethyl-1,6-octadiene硬脂酸丁酯Octadecanoicacid,butylC22H44O2340.5826.89320.05%49ester5.5结果与讨论通过生长速率法对9种病原真菌的抑菌活性的测定，表明茼蒿提取液对9种病原真菌均有一定的抑菌活性，其中对辣椒疫霉菌、莴苣菌核核盘菌两种真菌的活性最强。从茼蒿花中提取的精油对交链孢属、黄曲霉和腐霉具有显著地抑菌作用[142]。在茼蒿地上部分的提取物进行成分检测，发现它的主要成分倍半萜烯化合物对大部分细菌，比如伤寒沙门氏菌和奇异杆菌有抑菌活性，MIC值达到1.25×10-2Lg/mL[80]。利用气相色谱-质谱联用仪检测出茼蒿中主要成分化合物，其中内酯类和酮类化合物分别含15种和9种，相对含量达到3.3%和3.92%。通过国外学者研究发现，利用HPLC-MS测定了茼蒿水提取物中的化感物质主要为绿原酸，二咖啡酰奎宁酸，杨梅素-3-O-半乳糖苷，芦丁，木犀草素，木犀草素-7-O-葡萄糖苷和麦黄酮[149]，含有酚类与酮类化合物。LeeKD等[143]从茼蒿中分离出的十几种倍半萜内酯具有抗微生物活性，萜类与挥发油类具有广谱的抑菌活性，而生物碱、黄酮类、脂肪类、脂类、酚类、[144]噻吩类等均对尖镰孢菌有很强的抑菌作用，这就说明茼蒿中的内酯类与酮类很可能是对西瓜枯萎病菌有抑菌活性的有效成分。在前人的实验中发现，菊科植物中含有独特的天然产物即倍半萜内酯，还有不同结构的炔类化合物，其中倍半萜内酯带有苦味，并且其中有一些倍半萜内酯是带有毒性的，它可以防御食草动物和植物中的寄生物，由于它的苦味浓，对一般的昆虫有拒食作用[145]。同时研究发现倍半萜内酯的生物活性与它的生物结构有关系，它的结构中含有不饱和内酯环，与不同的昆虫作用，得出的结果有差异，总体来说它的结构与它的活性是相关的。综上所述，说明茼蒿提取液具有较广谱抑菌作用，并且茼蒿中含有可以抑制真菌生长的活性成分物质，这为茼蒿的进一步开发利用提供了理论基础，而且对更多病原真菌的抑菌活性有待验证，以及它们的抑菌机理和大田实验需要进一步研究。36 第6章全文结论本文通过茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌的抑菌活性的研究，发现茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌具有较好的抑菌作用，因此可以将茼蒿提取物继续深一步研究。本实验通过体外系统研究了茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌的生长抑制作用，并且初步探究茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌的抑菌机理，以及茼蒿提取液对其他病原真菌的抑菌作用，研究结果如下：6.1确定了茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌的MIC、MFC以及EC50利用生长速率法，以西瓜枯萎病菌为指示菌，在体外条件下，用茼蒿提取液处理病原菌后的抑菌作用。结果显示茼蒿提取液浓度越大，对菌丝的生长有较强的抑制作用，它的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别为125mg/mL和500mg/mL，通过毒力方程的测定，它的半抑菌浓度(EC50)为206mg/mL。6.2茼蒿提取液对西瓜枯萎病菌的孢子萌发有抑制作用在茼蒿提取液不同浓度的设定下，发现对西瓜枯萎病菌的的孢子萌发有显著的抑菌作用，随着浓度的升高，孢子萌发率越来越小，空白对照组孢子萌发达到92.9%，MFC时的孢子萌发率为17.4%，EC50的孢子萌发率为28.4%，而MIC时的孢子萌发率最大，萌发率为84.8%，这说明茼蒿提取液可以抑制菌丝的繁殖。6.3茼蒿中抑菌物质的提取工艺利用超声波提取技术，采用单因素法对茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌的活性物质的提取，结果显示95%乙醇为提取溶剂较好，最佳提取时间为90min，选择20:1作为茼蒿最佳液料比，最佳的提取温度为40℃。在单因素结果的前提下，通过响应面优化试验，设计3因素3水平试验方案，结果得到乙醇浓度为95%，提取时间103min，液料比26mL·g-1，提取温度35℃,达到的模型预测值为46.28%，而实际抑菌的平均值为45.56%，实际值与预测值的吻合度达到98.44%。这为粗提茼蒿中的活性成分提供了理论依据。6.4初步探讨茼蒿提取物的抑菌机理通过菌丝细胞电导率的测定、菌丝生物量、可溶性蛋白、细胞内总糖含量、核算泄露及胞内DNA含量的变化初步探讨了茼蒿提取液抑制西瓜枯萎病菌的抑制机理。结果显示,经过茼蒿提取液处理过的病原菌细胞的相对电导率显著升高,且在EC50时的达到最大;菌丝生物量、蛋白质和总糖含量明显减少,且与浓度呈正相关；DNA条带没有发生显著变化，说明核酸没有发生泄漏。通过以上结果推测:茼蒿提取液可能破坏病原菌细胞膜,影响其通透性,使得细胞内大分子物质蛋白质、糖降解或泄露,最终使病原菌丧失功能。37 6.5对其他病原真菌有抑制作用通过对9种植物病原菌的抑菌活性的测定，发现它对这几种真菌都具有抑菌作用，其中对辣椒疫霉菌和莴苣菌核核盘菌两种真菌的抑菌活性最强。这说明茼蒿具有广谱抑菌效果。6.6GC-MS的成分鉴定茼蒿中含有内酯类、酮类化合物较多，并且含量较高，可能是抑制西瓜枯萎病菌的主要活性物质。6.7课题展望1）本次试验主要在体外进行实验，而在体内实验中，由于多种因素交叉作用与限制,使得茼蒿提取液抑菌效果在植物体内作用的抑菌效果较差,此外，本试验只是采用了从茼蒿提取的粗提液进行试验，并未获得和利用抑制西瓜枯萎病菌的抑菌活性单体物质，因此分离纯化出抑菌活性的单体物质是下一步非常重要的工作内容。2）进一步研究温度、保存时间、PH、离子以及紫外线条件下对茼蒿提取物的稳定性的影响，利用活性单体在不同条件下抑菌作用，并且优化出最佳的稳定条件，能够更好地利用茼蒿中的活性物质。3）将单体与其他预防手段比如物理方法、农业防治等措施的综合作用，来降低生产上防治病害的成本，并达到理想预防效果。4）本次试验初步探讨茼蒿粗提液的抑菌作用，其抑菌机理错综复杂，而本试验只是局限于通过一些细胞内物质的含量与活性成分的测定来推断出一些可能的结果，而没能阐述其在植物体内具体的调节机制以及防御病原菌的入侵途径，因此进一步深入研究抑菌机理的作用原理非常重要。5）可将茼蒿的活性物质通过体外与体内的试验，以更多的植物病原菌为试验对象，进一步了解茼蒿活性物质的抑菌效果，为茼蒿进一步开发利用提供更为科学的理论依据。38 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致谢时光飞逝，三年的硕士研究生学习生涯即将结束，感谢范淑英教授、吴才君教授、杨有新老师、万春鹏老师在学习上给予的关心、指导和支持，本论文从选题到实施，再到论文的撰写都凝聚着老师的心血与汗水。他们不仅仅在学习上给予我很大的帮助，还教会我很多书本上学不到的为人处事的道理及对待处理事情的态度与方法，让我更有信心面对社会的各种挑战。在此，谨向导师们表达我最崇高的敬意和衷心的感谢！感谢我的同窗好友张新龙对我各方面的帮助与支持，感谢陈楚英师姐给予我实验技能的指导，感谢师兄师姐、师弟师妹的在生活与学习上的帮助，另外，感谢好友朱隆荣与龚剑明七年来的关心与陪伴。最后，感谢我的家人一直以来对我的支持和理解，感谢他们的付出，感谢他们在精神与物质上最大的支持。再次感谢所有帮助过我的人，谢谢你们！46