维生素B_(12)对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的抑制作用及机制研究

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１０１６０分类号Ｒ７７４单位代码：２０１５２０２１０学号：？碎叫馨科太ｆ硕士学位论文题目：维生素Ｂ１２对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的抑制作用及机制研究ＳｔｕｄｙｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔａｎｄａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｖｉｔａｍｉｎＢ１２ｏｎｒｅｔｉｎａｌｎｅｕｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ研究生：徐卫星导师：徐军目眼科学学科专业：—论文课题起止时间：２０１７年１月２０１８年３月论文完成时间：２０１８年３月 锦州医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包一含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处一，本入承担切相关责任。＇ｉ－＾论文作者签名：日期：＞％ｂ锦州医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解锦州医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属锦州医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为锦州医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为锦州医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外、），以采用影印缩印或其他手段保存论文－▲…论文作者签名：二户指导教师签名：轉嘗Ｉ 目录一、摘要中文论著摘要..............................................................................................1英文论著摘要...............................................................................................3二、英文缩略语表..............................................................................................5三、论文前言..........................................................................................................6材料与方法...................................................................................................7结果........................................................................................................13讨论........................................................................................................16结论........................................................................................................19四、本研究创新性的自我评价..........................................................................20五、参考文献...................................................................................................21六、附录文献综述....................................................................................................26在学期间科研成绩......................................................................................37致谢...........................................................................................................38个人简介....................................................................................................39 ·中文论著摘要·维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的抑制作用及机制研究目的评价维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的抑制作用并探讨其作用机制。方法清洁级SD大鼠36只，随机分为正常对照组（NC组）、糖尿病模型组（DM组）、维生素B12治疗组（VitB12组），每组12只。DM组和VitB12组大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。确定造模成功后，对VitB12组大鼠进行维生素B12（100µg/kg）灌胃，持续8w，NC组和DM组用同体积生理盐水替代。停止灌胃2w后，于第10w末将所有大鼠处死，取颈静脉血，用于检测血清中丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）的活性；取视网膜组织，用于制备视网膜石蜡切片，采用原位末端标记（TUNEL）法进行视网膜凋亡细胞原位标记，行视网膜神经节细胞凋亡指数计数（apoptosisindex,AI）；采用免疫组织化学法检测视网膜组织Caspase-3蛋白的表达。结果MDA值：NC组（4.47±0.36）nmol/mL，DM组（8.27±0.23）nmol/mL，VitB12组（6.45±0.30）nmol/mL，三组间比较差异有统计学意义（F=471.061，P=0.000）；SOD值：NC组（112.77±4.55）U/mL，DM组（66.51±3.88）U/mL，VitB12组（86.61±4.30）U/mL，三组间比较差异有统计学意义（F=356.923，P=0.000）；AI值：NC组（11.32±6.43）％，DM组（27.29±8.95）％，VitB12组（19.60±5.71）％，三组间比较差异有统计学意义（F=14.926，P=0.000）；Caspase-3光密度值：NC组0.117±0.042，DM组0.388±0.048，VitB12组1 0.284±0.067，三组间比较差异有统计学意义（F=77.896，P=0.000）。结论维生素B12可以抑制糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡。其作用机制可能是维生素B12通过抗氧化作用降低Caspase-3的表达从而抑制视网膜神经细胞的凋亡。关键词维生素B12；糖尿病视网膜病变；氧化应激；Caspase-3；凋亡2 ·英文论著摘要·StudyoninhibitoryeffectandactionmechanismofvitaminB12onretinalneuronalapoptosisindiabeticratsObjectiveToevaluatetheinhibitoryeffectofvitaminB12onretinalneuronalapoptosisindiabeticratsandexploreitsmechanismofaction.MethodsThirty-sixSDratswererandomlydividedintonegativecontrolgroup(groupNC),diabeticmodelcontrolgroup(groupDM)andVitaminB12-treatedgroup(groupVitB12),12ratsineachgroup.TheanimalsofgroupDMandgroupVitB12weremadeintodiabetesmodel.Thediabetesmodelwasinducedbyintraperitonealinjectionofstreptozotocin(STZ).100µg/kgVitaminB12wasgivenbyintragastricadministrationonetimeperdayfor56consecutivedaysintheratsofgroupVitB12,andanequivalentamountofphysiologicalsalinewasutilizedatasamewayintheanimalsofgroupNCandgroupDM.After10weekslater,alltheratswerekilled,andthelevelsofmalondialdehyde(MDA)andsuperoxidedismutase(SOD)inserumweredetected.Theeyeballsofeachgroupwereexecutedforparaffinsection.TUNELstainingwasusedtoobserveneuronapoptosisinretinaandtheapoptosisindex(AI)wascounted.TheexpressionofCaspase-3inretinawasmeasuredbyimmunohistochemistry.ResultsThelevelsofserumMDAwereasfollows:groupNC(4.47±0.36)nmol/mL,groupDM(8.27±0.23)nmol/mL,groupVitB12(6.45±0.30)nmol/mL.Therewassignificantdifferenceamongthreegroups(F=471.061,P=0.000).SODwereas3 follows:groupNC(112.77±4.55)U/mL,groupDM(66.51±3.88)U/mL,groupVitB12(86.61±4.30)U/mL.Therewassignificantdifferenceamongthreegroups(F=356.923,P=0.000).AIwereasfollows:groupNC(11.32±6.43)％,groupDM(27.29±8.95)％,groupVitB12(19.60±5.71)％.Therewassignificantdifferenceamongthreegroups(F=14.926,P=0.000).AverageopticaldensityvalueofCaspase-3inretinawereasfollows:groupNC0.117±0.042,groupDM0.388±0.048,groupVitB120.284±0.067.Therewassignificantdifferenceamongthreegroups(F=77.896,P=0.000).ConclusionsVitaminB12caninhibitretinalnervecellapoptosisindiabeticrats.ThemechanismmightthatitsantioxidantstressinhibittheexpressionofCaspase-3andtheninhibitapoptosisofretinalnervecells.KeywordsVitaminB12;diabeticretinopathy;oxidativestress;Caspase-3;apoptosis4 ·英文缩略语表·英文缩写英文全称中文译名DRdiabeticretinopathy糖尿病视网膜病变DMdiabetesmellitus糖尿病VitB12VitaminB12维生素B12MDAmalondialdehyde丙二醛SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶RNVretinalneovascularization视网膜新生血管AIapoptosisindex凋亡指数ROSreactiveoxygenspecies活性氧簇STZstreptozotocin链脲佐菌素5 ·论文·维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的抑制作用及机制研究前言随着糖尿病(diabetesmellitus,DM)发病率逐年增加，DM已经成为严重威胁人类健康的重要疾病之一。我国现有DM患者约1.1亿人，位居世界第一，严重影响国人的生命健康和生活质量。糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)作为DM的主要并发症之一，是导致DM患者视力损伤的主要原因，是防盲治盲[1]的重要难题。DR被认为是一种微血管病变，关于其机制的研究主要集中在血管渗透性增加以及新生血管等方面，临床上治疗DR的方向主要集中在防止视网膜新生血管(retinalneovascularization,RNV)形成以及血管渗漏方面，而忽略了视[2]网膜神经元病变对DM患者视力的早期损伤。近年有研究表明，糖尿病视网膜神经细胞发生病变明显早于RNV产生，是导致DM患者早期视力损伤的主要原[3]因。其发病机制是由于DM患者体内产生过量的活性氧簇(reactiveoxygen[4]species,ROS)，导致体内过氧化反应增强，从而损伤视网膜神经元。有文献表[4-6][5-7]明：ROS在病理情况下可诱导神经细胞凋亡。Scatena发现ROS在皮摩尔[8]水平即可诱导细胞凋亡。Perdomo等发现ROS可通过诱导线粒体释放出蛋白激酶C，促使半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)激活，进而启动凋亡。另有研究表明，随着DM大鼠病程增加，锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因表达逐渐降低，超氧[5,9]化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)抗氧化应激能力随之下降。B族维生[10]素是一类水溶性维生素，在细胞代谢中发挥重要作用。它包括硫胺素、核黄素、[10]烟酸、泛酸、维生素B6、生物素、叶酸和维生素B12。大量研究表明，B族维生素在神经保护方面有很好的作用。维生素B6和维生素B12(VitaminB12,VitB12)[10,11]可帮助神经细胞逃避特定的伤害，在保护神经方面优于其他B族维生素。其[10,12]中，VitB12可显著减弱谷氨酸诱导的神经毒性对大鼠视网膜神经元的伤害。6 另外研究还发现，VitB12可以使神经细胞钙离子内流减少，进而保护大脑皮层神[10,13]经元免受谷氨酸诱导的神经毒性的伤害。VitB12还可明显提高腓神经的传导[10,14,15]速度，在减轻糖尿病周围神经病变患者临床症状方面具有疗效。VitB12可[6,16-19]加速受损伤轴突的生长，有助于受损神经的功能恢复。此外，硫胺素、核黄[20-23]素、叶酸、VitB12还是天然的抗氧化剂，可显著提高机体的抗氧化能力。刘欢[22]等发现叶酸、VitB12能降低血浆同型半胱氨酸浓度，提高机体的抗氧化能力，减轻脑缺血引起的氧化应激损伤。以上研究表明，VitB12不仅在周围神经保护方面有显著作用，而且具有抗氧化能力。糖尿病视网膜神经病变的发生与氧化应激密切相关，且远早于糖尿病微血管病变。但目前DR临床治疗忽略了视网膜神经元病变对DM患者视力的早期损伤。鉴于此，我们通过建立DM大鼠模型，用VitB12进行灌胃治疗，以评价VitB12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的抑制作用，并探讨其作用机制。材料与方法一、实验动物与分组从锦州医科大学实验动物研究中心购买SD大鼠。清洁级，雄性2月龄，体质量(250±20)g，共36只。随机分为正常对照组(NC组)，糖尿病模型组(DM组)、维生素B12治疗组(VitB12组)，每组12只。二、主要试剂和仪器链脲佐菌素、SOD试剂盒、MDA试剂盒（南京建成生物工程），维生素B12粉剂（合肥博美生物科技）。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒、免疫组化SP试剂盒（沈阳万类生物科技）。兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体（合肥博美生物科技）。分光光度计（上海谱元仪器有限公司）、光学显微镜（上海光学仪器厂）。三、实验方法（一）糖尿病模型的制作采用腹腔注射STZ法诱导大鼠糖尿病模型。取STZ粉剂600mg，加柠檬酸钠缓冲液60mL,制成浓度为10mg/mL的STZ液。所有SD大鼠夜间禁食12h7 后称重并记录，其中DM组、VitB12组大鼠，按60mg/kg体重一次性腹腔注射STZ液。3d后夜间禁食水，测次日清晨空腹血糖值（FBG）。若FBG高于16.7mmol/L纳入正式实验。NC组大鼠一次性腹腔注射相同剂量的柠檬酸钠缓冲液。[6]3d后测FBG在4.0-7.0mmol/L范围内纳入正式实验。（二）给药方式及观察连续监测空腹血糖7d，血糖值趋于稳定后进行用药干预。VitB12组：给予VitB12水溶液100µg/kg体质量，每日清晨用灌胃针进行灌胃1次，持续治疗8w。NC组和DM组：每日1次等体积生理盐水进行灌胃，持续8w。每周一次测量血糖、体重，观察饮水量及尿量变化。（三）取材及标本制备停止灌胃2w后，所有大鼠均于第10w末用10%水合氯醛0.2mL/g腹腔注射麻醉，迅速取颈静脉血，3500r/min20min离心，取上层血清，将血清分装并标记，于-80℃冰箱存放备用。迅速摘取右眼眼球，浸入FAA固定液固定10min后，再用4%多聚甲醛固定24h。所有眼球标本固定结束后，进行视网膜石蜡标本制作。视网膜石蜡标本制作具体步骤如下：（1）FAA固定液配制5mL冰醋酸、85mL95%酒精、10mL4%多聚甲醛[24]按比例混匀。（2）取材均用腹腔注射10%水合氯醛0.2mL/g诱导大鼠麻醉。摘除右眼[24]球，保留视神经，将多余组织去除，然后固定。[24]（3）标本固定FAA固定液固定10min后，再用4%多聚甲醛固定24h。（4）标本制作标本固定后，去除角膜、晶体等组织。眼杯进行脱水、透明、浸蜡和包埋。靠近视盘处连续切片6片，厚度5µm。放置于60℃烤箱内烤片2[24]h。（四）血清氧化应激指标的检测[25-31]1、采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定各组大鼠血清MDA含量。8 表1.处理样品顺序表试剂标准管空白管测定管对照管10nmol/mL标准品（mL）a*无水乙醇（mL）a*测试样品（mL）a*a*试剂一（mL）a*a*a*a*试剂二（mL）3333试剂三（mL）11150%冰醋酸（mL）1（1）按表1处理样品。（2）使用旋祸混匀器将各管混匀，用保鲜膜将试管口扎紧。用针扎出一小孔，放入95℃水浴40min。取出，流水冷却，离心10min（3500-4000r/min），[25-31]取上清。532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。（3）结果和计算血清（浆）中MDA测定OD值−对照OD值标准品浓度样本测试前=××含量（nmol/mL）标准OD值−空白OD值10nmol/mL稀释倍数[25-31]2、采用黄嘌呤氧化酶法测定各组大鼠血清SOD含量。表2.处理样品顺序表试剂测定管对照管试剂一应用液（mL）1.01.0样品（mL）a*双蒸水（mL）a*试剂二（mL）0.10.1试剂三（mL）0.10.1试剂四应用液（mL）0.10.1显色剂（mL）22（1）按表2处理样品。（2）充分混匀，室温放置10min。于波长550nm处，1cm光径比色杯，9 双蒸水调零，比色。（3）结果和计算SOD活力对照OD值−测定OD值反应体系的样本测试前=÷50%××（U/mL）对照OD值稀释倍数的稀释倍数3、每个指标重复操作5次，取平均值。（五）视网膜神经细胞凋亡的检测1、采用TUNEL法检测各组大鼠视网膜神经细胞的凋亡（1）按以下步骤进行：a.脱蜡，组织切片置于60℃恒温箱，烤片30-60min，[32]浸入装有新鲜二甲苯的染色缸，在室温下放置15min。重复操作一次。b.洗涤，[32]放入100%乙醇染色缸内，在室温下放置10min。重复操作一次。c.水化，放入梯度浓度乙醇溶液内（90%，80%，70%，50%），在室温下每种浓度溶液内[26,32-37][32]放置3min。d.浸入PBS溶液，在室温下放置5min。e.用柠檬酸缓冲液[32][32]（PH=6.2）中火修复5min。f.放入PBS溶液内，在室温下放置5min。重复操作3次。e.转至步骤2。（2）每张切片滴加50μL3%H2O2，室温避光静置10min。表3.准备用于封闭的3%H2O2缓冲液3%H2O250μL反应中所需体积反应数总体积30%H2O25μL×=μL甲醇45μL×=μL（3）组织切片浸入PBS，室温避光放置5min，重复漂洗2次。（4）阳性对照:阳性对照的组织滴加50μL阳性对照缓冲液（24孔板每孔加入120μL），室温静置10min，浸入PBS，室温放置5min，重复漂洗3次。表4.准备用于实验的阳性对照缓冲液阳性对照缓冲液50μL反应中所需体积阳性对照数总体积10xDNaseI5μL×=μL1×DNaseIBuffer45μL×=μL（5）每个组织滴加50μLTunel反应缓冲液（24孔板每孔加入120μL），10 37℃，避光孵育60-90min。表5.准备用于实验的TUNEL反应缓冲液Tunel反应缓冲液50μL反应中所需体积阳性对照数总体积10xEnzymeReagent5μL-7μL×=μL1xLabelingSubstrate43μL-45μL×=μL（6）阴性对照：用于进行阴性对照的组织滴加不含10×EnzymeReagent的TUNEL反应缓冲液（45μL1×LabelingSubstrate与5μL去离子水混合），37℃，避光孵育60-90min。（7）组织切片浸入PBS，室温放置5min，重复漂洗3次。（8）每个组织滴加50μLPOD转换缓冲液（24孔板每孔加入120μL），37℃，孵育30min。表6.准备用于封闭的POD转换缓冲液POD转换缓冲液50μL反应中所需体积反应数总体积10xPODReagent5μL×=μLPBS45μL×=μL（9）组织切片浸入PBS,室温放置5min，重复漂洗3次。（10）每个组织样本滴加50μLDAB显色剂（24孔板每孔加入120μL），室温孵育2-5min，根据实际显色情况摸索显色时间。表7.准备用于实验的DAB显色剂DAB显色剂50μL反应中所需体积反应数总体积20×DABReagentA2.5μL×=μL20×DABReagentB2.5μL×=μLPBS45μL×=μL（11）用苏木素复染细胞核1min。[32-37]（12）用1%盐酸酒精分化数秒，自来水返蓝。之后进行以下步骤：a.脱水，切片放入（50%，70%，80%，90%）梯度浓度乙醇溶液内，在室温下每种浓度溶液内放置3min。b.洗涤，放入100%乙醇染色缸内，在室温下放置10min。重复操作一次。c.透明，放入新鲜二甲苯染色缸内，在室温下放置15min。重11 复操作一次。d.封片，晾干，显微镜下观察。2、计算视网膜神经节细胞凋亡指数（AI）细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞。用Image-ProPlus显微图像分析系统进行定量分析。在200倍光学显微镜下以视网膜神经节细胞层为观察边框，每张玻片随机选5个视野，每个视野面积为0.2mm×0.2mm。计数阳性细胞数和视网膜神经细胞总数，求平均值。计算视网膜神经节细胞凋亡指数(apoptosis[37]index,AI)，即AI=凋亡细胞数/视网膜神经细胞总数。（六）视网膜Caspase-3蛋白的检测1、采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜Caspase-3蛋白的[38-41]表达（1）将切片用二甲苯和梯度浓度乙醇进行脱蜡及水化。（2）用PBS液冲洗5min。（3）阻断内源性过氧化物酶：用0.3%H2O2去离子水进行孵育30min。（4）用缓冲液冲洗5min。（5）血清封闭：在室温下，用稀释的正常血清对切片进行孵育20min。（6）倾去多余的血清。（7）用缓冲液稀释一抗，将切片孵育30min。（8）将切片用缓冲液冲洗5min。（9）滴加生物素标记二抗，将切片孵育30min。（10）用缓冲液将切片冲洗5min。（11）将切片放于VECTASTAINABC试剂内30min。（12）用缓冲液将切片冲洗5min。（13）用过氧化物酶底物溶液孵育切片。（14）将切片用自来水冲洗。（15）复染、分化、脱水、透明，封片。（16）光学显微镜下观察并照相。用Image-ProPlus显微图像分析系统分[38-41]析图像。12 2、计算视网膜Caspase-3蛋白平均光密度值（AOD）200倍光学显微镜下观察并照相，阳性细胞为细胞核及细胞浆呈黄色或棕黄[40,41]色染色者。在同等条件下进行照相，每张切片随机选取5个视野，每个视野面积为0.2mm×0.2mm。Image-ProPlus显微图像分析系统测定光密度值，求[40][40]平均值。样本平均光密度值（AOD）用均数±标准差的方式表示。四、统计学方法数据分析采用SPSS20.0统计软件。计量资料用均数±标准差（X±S）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。结果一、实验纳入及观察DM组、VitB12组所有大鼠FBG均高于16.7mmol/L，均纳入正式实验。NC组大鼠FBG均在4.0-7.0mmol/L范围内，均纳入正式实验。实验过程中，VitB12组和DM组大鼠无血糖自行恢复者，每日饮水量、尿量明显高于NC组大鼠，体重明显低于NC组大鼠。二、各组血清氧化应激指标的比较三组血清MDA值比较差异有统计学意义(F=471.061，P=0.000)。NC组血清MDA含量低于DM组、VitB12组(均为P＜0.01)，VitB12组MDA含量低于DM组(P＜0.01)。三组血清SOD活性比较差异有统计学意义(F=356.923,P=0.000)。NC组SOD活性高于DM组、VitB12组(均为P＜0.01)，VitB12组SOD活性高于DM组(P＜0.01)。[见表8、表9]13 表8三组大鼠血清MDA含量的比较（X±S）分组数量MDA（nmol/mL）NC组124.47±0.36DM组128.27±0.23aVitB12组126.45±0.30abF471.061P0.000注：与NC组比较，aP＜0.01；与DM组比较，bP＜0.01。表9三组大鼠血清SOD活性的比较（X±S）分组数量SOD（U/mL）NC组12112.77±4.55DM组1266.51±3.88aVitB12组1286.61±4.30abF356.923P0.000注：与NC组比较，aP＜0.01；与DM组比较，bP＜0.01。三、各组视网膜神经细胞凋亡检测结果(TUNEL法)（一）显微镜观察细胞核中有棕色颗粒者为凋亡细胞。三组在视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见凋亡细胞；与NC组相比，DM组和VitB12组凋亡细胞数明显增多；与DM组相比，VitB12组凋亡细胞数有不同程度减少。[见图1]图1凋亡细胞在各组视网膜神经细胞中的表达（×200）14 注：A：NC组；B：DM组；C：VitB12组。（二）三组视网膜神经节细胞凋亡指数（AI）三组AI值比较差异有统计学意义（F=14.926，P=0.000），DM组、VitB12组AI值高于NC组（均为P＜0.01）,DM组AI值高于VitB12组（P＜0.05）。[见表10]表10三组视网膜神经节细胞AI值的比较（X±S）分组数量AI(%)NC组1211.32±6.43DM组1227.29±8.95aVitB12组1219.60±5.71abF14.926P0.000注：与NC组比较，aP＜0.01；与DM组比较，bP＜0.05。四、各组视网膜Caspase-3蛋白表达情况（一）显微镜观察各组切片中，Caspase-3蛋白呈棕黄色染色，在视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均有表达。DM组和VitB12组的表达明显多于NC组。DM组的表达明显多于VitB12组。[见图2]图2Caspase-3在各组视网膜中的表达（×200）注：A：NC组；B：DM组；C：VitB12组。（二）三组视网膜Caspase-3蛋白AOD值15 三组Caspase-3蛋白AOD值比较差异有统计学意义（F=77.896，P=0.000），DM组、VitB12组视网膜Caspase-3蛋白AOD值高于NC组（均为P＜0.01）,DM组视网膜Caspase-3蛋白AOD值高于VitB12组（P＜0.01）。[见表11]表11三组视网膜Caspase-3蛋白AOD值的比较（X±S）分组数量Caspase-3光密度值NC组120.117±0.042DM组120.388±0.048aVitB12组120.284±0.067abF77.896P0.000注：与NC组比较，aP＜0.01；与DM组比较，bP＜0.01。讨论一、糖尿病视网膜病变与氧化应激糖尿病视网膜病变(DR)作为DM的主要并发症之一，是导致DM患者视力损伤的主要原因。DR发病机制较为复杂，是多因素、多机制共同作用的结果。目前普遍认为其机制主要是糖尿病微循环代谢障碍引起视网膜缺血缺氧进而导致视[42][5,37,43,44]网膜微血管病变，高血糖、氧化应激及炎症反应等多种因素参与其中。高血糖通过激活体内几大代谢途径导致氧化应激反应的增强，导致视网膜组织的[45,46]损伤，从而在DR的发生中起重要作用。氧化应激是除高血糖外促使DR进展的另一重要因素。在病理条件下，由线粒体电子传递链产生的过量活性氧簇[4-6][5,6,8](ROS)在诱导细胞凋亡中起关键作用。Perdomo等发现ROS触发线粒体释放蛋白激酶C，这是激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的重要原因，并且是启动细胞凋亡的关键步骤。Caspases家族是哺乳动物中所有凋亡信号传导的共同[6]途径。Caspases通常在细胞质中作为无活性的酶原存在，它的激活被认为是进[6]入凋亡途径的特异性标志物。而且在整个细胞凋亡过程中，Caspase-3是其中[6,47]最关键的终末执行酶。正常生理状态下，抗氧化防御系统可以清除多余活性[5][4,5]氧簇。然而，DM大鼠抗氧化酶防御系统受损，活性氧簇破坏能力增加。作16 为机体最主要的抗氧化防御系统，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)[4,5]可以结合超氧阴离子使其变成无活性产物。还有文献表明，SOD可以降低氧[5,48]化应激反应水平，抑制神经细胞凋亡。线粒体的锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)[5,49]作为三种SOD亚型之一，在抗氧化损伤方面有着更为突出的作用。有研究发[5,9]现，Mn-SOD表达随DM大鼠病程的增加而逐渐减少，SOD抗氧化能力越弱。另外还发现，过量的Mn-SOD可以降低葡萄糖诱导的氧化应激水平，进而抑制视[5]网膜血管内皮细胞的凋亡。ROS还可以触发细胞膜上的多不和脂肪酸发生脂质[50]过氧化反应，产生MDA。MDA水平越高，氧自由基水平也越高,机体组织损伤也就越严重。在本实验中，糖尿病大鼠血清MDA含量明显高于正常对照大鼠，但是血清SOD含量明显低于正常对照大鼠，这表明DM大鼠体内氧化应激水平升高。二、糖尿病视网膜神经细胞的凋亡有研究表明，在糖尿病引起视网膜微血管发生病变前，已经发生了视网膜神[5,6,37]经细胞退行性病变。视网膜神经细胞退行性病变最终导致神经节细胞等视网[5,6,37,51]膜神经细胞凋亡的发生。研究表明，16w前是DR背景期，24w以后视[6,52]网膜血管内皮细胞才逐渐出现凋亡。本实验于第10w末处死所有大鼠以制备[6]视网膜的石蜡切片。TUNEL凋亡标记后通过显微镜进行观察。三组大鼠在视网[6]膜神经节细胞层、内核层和外核层均已可见凋亡细胞。而且NC组凋亡细胞数量明显少于DM组、VitB12组。这表明在DR中神经细胞病变出现在微血管病变[6]之前。高血糖引起的多元醇代谢途径的激活在糖尿病视网膜神经细胞凋亡中起[53,54]着十分重要的作用。醛糖还原酶(aldosereducase,AR)在高血糖状态下活性[55]升高，可以将葡萄糖转化成山梨醇，山梨醇通过山梨醇脱氢酶作用转化成果糖[54,55][53,55]。AR在视网膜神经节细胞、Mǜller细胞内含量较多。慢性高血糖状态会引起山梨醇和果糖在视网膜神经细胞胞浆内蓄积，进而促使视网膜神经细胞早[53,54,56,57]期病变凋亡。氧化应激是促使糖尿病视网膜神经细胞凋亡的另一重要机制。ROS可以触发线粒体释放蛋白激酶C，激活caspase-3，启动神经细胞凋亡[5,6,8,58]。正常生理状态下，SOD可以结合超氧阴离子使其变成无活性产物，降[4,5,48]低氧化应激反应水平，抑制神经细胞凋亡。然而，DM大鼠抗氧化酶防御系17 [5]统受损，清除多余活性氧簇能力下降。本研究发现，三组大鼠在视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见Caspase-3蛋白表达。而且DM组、VitB12组Caspase-3蛋白表达明显高于NC组。该结果表明糖尿病大鼠体内高水平的氧化应激可能促使caspase-3处于激活状态，并启动了糖尿病视网膜神经细胞的凋亡[6]程序。三、维生素B12对糖尿病视网膜神经细胞的作用大量研究表明，VitB12在神经保护方面有很好的作用。VitB12可以加速受损轴[6,12,16-19]突的生长，有助于受损神经的功能恢复。VitB12可以帮助神经细胞逃避特[10-12]定的伤害，显著减弱谷氨酸诱导的神经毒性对大鼠视网膜神经元的伤害。[10,13]Hung等发现VitB12可以使神经细胞钙离子内流减少，进而保护大脑皮层神经元免受谷氨酸诱导的神经毒性的伤害。VitB12在减轻糖尿病周围神经病变患者[10,14,15][59]临床症状方面有很好的疗效。乔芳发现对于糖尿病周围神经病变患者，甲钴胺与胰激肽原酶合用在治疗上有很好的作用。此外，VitB12还是天然的抗氧[20-23][22]化剂，可以显著提高机体的抗氧化能力。刘欢等发现叶酸、VitB12能降低血浆同型半胱氨酸浓度，提高机体的抗氧化能力，减轻脑缺血引起的氧化应激损伤。以上研究表明VitB12不仅在周围神经保护方面有突出作用，而且兼具抗氧化能力。糖尿病视网膜神经病变的发生与氧化应激密切相关。鉴于此，我们通过建立DM大鼠模型，用VitB12进行灌胃治疗，评价VitB12对糖尿病视网膜神经细胞凋亡的抑制作用，探讨其作用机制。本实验结果表明：NC组MDA值明显低于DM组、VitB12组；VitB12组MDA值明显低于DM组。NC组SOD活性明显高于DM组、VitB12组；VitB12组SOD[6]活性高于DM组。以上结果提示，VitB12溶液灌胃治疗8w后，VitB12组大鼠体[6]内氧化损伤水平较DM组降低,抗氧化能力有所提高。三组大鼠视网膜切片TUNEL法标记后神经节细胞层均可见凋亡细胞，但神经节细胞凋亡指数(AI)有显[6]著统计学差异。其中，NC组AI值明显低于DM组、VitB12组；VitB12组AI值[6]明显低于DM组。以上结果提示，VitB12可以抑制DM大鼠视网膜神经细胞的凋亡。此外，三组大鼠视网膜切片经免疫组化染色后，可见Caspase-3蛋白表达[6]于视网膜神经节细胞层、内核层和外核层。但三组Caspase-3蛋白AOD值有18 明显统计学差异，NC组AOD值明显低于DM组、VitB12组；VitB12组明显低于[6]DM组。以上结果表明，VitB12在一定程度上可以抑制DM大鼠视网膜Caspase-3[6]蛋白的表达。以上结果表明，VitB12可能是通过其抗氧化作用，降低Caspase-3[6]的表达，抑制DM大鼠视网膜神经细胞的凋亡，从而达到保护视神经的作用。综上所述，VitB12可以对糖尿病视网膜神经细胞起到一定程度的保护作用。该保护作用是通过其抗氧化作用降低视网膜Caspase-3的表达，进而抑制糖尿病[6]视网膜神经细胞的凋亡来实现的。VitB12已经广泛应用于治疗周围神经病变，且安全性高、副作用小。VitB12在DR视神经保护中具有良好的临床应用前景，有[6]望成为DR早期干预和治疗的常规用药。由于DR是多因素综合作用的结果，VitB12也可能是通过其他机制实现视神经保护作用的，所以实验有待进一步研究。结论VitB12可以抑制糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡。其作用机制可能是VitB12通过抗氧化作用降低Caspase-3的表达从而抑制视网膜神经细胞的凋亡。19 ·本研究创新性的自我评价·1.评价维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的抑制作用并探讨其作用机制。2.研究氧化应激在糖尿病视网膜神经细胞凋亡中的作用，为治疗早期DR提供理论依据。20 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·附录·一、文献综述糖尿病视网膜病变发病机制的研究及治疗进展随着糖尿病(diabetesmellitus,DM)发病率逐年增加，DM已经成为严重威胁人类健康的重要疾病之一。我国现有DM患者约1.1亿人，位居世界第一，严重影响国人的生命健康和生活质量。糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)作为DM的主要并发症之一，是导致糖尿病患者视力下降甚至失明的主要因素，[1]严重影响着糖尿病患者的生活质量，是防盲治盲的主要任务和重要难题。DR主要被认为是一种微血管病变，关于其机制的研究主要集中在血管渗透性增加以及新生血管等方面。DR早期临床治疗主要为控制血糖、血脂、改善微循环以及玻璃体腔注射抗新生血管药物等。近年研究发现，在糖尿病早期，视网膜微血管发生损害前，视网膜神经细胞即发生病理改变。这提示DR是多因素、多机制共同作用的结果。因此，DR作为眼科临床治疗的一个难题，如何有效预防和治疗DR是当今研究热点。本文将对近年来有关糖尿病视网膜病变发病机制的研究以及治疗的新进展进行综述。一、DR发病机制1、高血糖高血糖是公认的DR发生与发展的主要危险因素。高血糖引起的多元醇代谢[3,70]途径的激活在糖尿病视网膜病变发病机制中有着十分重要的地位。醛糖还原酶[2](aldosereducase,AR)在高血糖状态下活性升高，可以将葡萄糖转化成山梨醇。[2,71]然后，山梨醇通过山梨醇脱氢酶作用转化成果糖。AR在RGCs、Mǜller细胞、[2,3]血管内皮细胞内含量较多。慢性高血糖状态会引起山梨醇和果糖在胞浆内蓄[3-5,71]积，进而促使细胞病变凋亡。在AR的作用下，NADPH损耗增加和抗氧化[6,7,18]剂谷胱甘肽含量减少。这将诱导核因子-kB的活化、促炎细胞因子、趋化因[6,7]子及生长因子的表达，从而促进DR的进展。高血糖诱导糖基化终产物的增加26 是促使DR进展的另一重要机制。研究发现，葡萄糖可引起体内DNA、蛋白质和[3,8,9,70,71]脂类。长期高血糖状态可以促使机体非酶促糖基化反应增强，最终在机体[3,8,9,70,71]内形成大量糖基化终产物(AGEs)。AGEs大量堆积，是促使DR发生的[3,8,9,70,71]重要因素。大量的AGEs最终引起微血管内皮细胞功能失调、血管通透[3,8,9,70,71]性增加、神经细胞凋亡等病变。这些是促进DR发生与发展的主要因素[10-12]。另有大量研究表明，高血糖诱导蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)通路的激活也是DR发生的重要危险因素。高血糖提高组织内甘油二酯(DAG)的含量，[13-16]并活化PKC系统。活化的PKC系统将会增加细胞外基质蛋白的表达，使血[3,13-16]管基底膜变厚，继而引起微血管血流动力学改变。最终使视网膜微血管血流[3,13-16]分布异常，导致毛细血管扩张，形成毛细血管微血管瘤。此外，PKC可以促使内皮细胞高度表达血管内皮素和血管内皮生长因子，引起微血管收缩，加重[3,16,17,71][3,16,17,71]视网膜血流分布异常。视网膜缺血缺氧加重，最终形成新生血管。其他高血糖诱导途径还包括氨基己糖途径通量增加，最终导致氧化应激的增加[18,19,71]。2、氧化应激氧化应激是除高血糖外促使DR进展的另一主要机制。在病理条件下，由线粒体电子传递链产生的过量活性氧簇(ROS)在诱导细胞凋亡中起关键作用[18,20,72][18,21,72]。Scatena在实验中发现ROS在皮摩尔水平即可导致细胞凋亡。[18,22,72]Perdomo等发现ROS触发线粒体释放PKC，这是激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的重要事件，并且是启动细胞凋亡的关键步骤。活性氧过量会引起[18,23]线粒体肿胀和通透性增加，进一步导致细胞凋亡的发生。正常生理状态下，[18]抗氧化防御系统可以清除多余活性氧簇。然而，DM大鼠抗氧化酶防御系统受[18,20]损，活性氧簇破坏能力增加。作为机体最主要的抗氧化防御系统，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)可以结合超氧阴离子使其变成无活性产物[18,20][18,24]。还有文献表明，SOD可以降低氧化应激反应水平，抑制神经细胞凋亡。线粒体的锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)作为三种SOD亚型之一，在抗氧化损伤方[18,25]面有着更为突出的作用。有研究发现，Mn-SOD表达随DM大鼠病程的增加[18,26]而逐渐减少，SOD抗氧化能力越弱。另外还发现，过量的Mn-SOD可以降27 [18,27,28]低葡萄糖诱导的氧化应激水平，进而抑制视网膜血管内皮细胞的凋亡。综上，氧化应激在糖尿病视网膜病变发生与发展中有着极其重要的作用。3、兴奋毒性代谢产物谷氨酸是参与DR病变的主要神经毒性代谢产物。研究表明，在DR中谷氨酸的代谢平衡被打破，细胞外谷氨酸毒性水平在视网膜中不断增加，引起早期视[18,29-31]网膜神经细胞的凋亡，这将导致DR的发生与发展。研究发现，谷氨酸通[18,32]过激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体诱导视网膜神经细胞凋亡发生。Bai[18,34]等发现，NMDA受体诱导的兴奋性毒性可以导致GLAST基因敲除小鼠视网膜神经细胞的凋亡。此外，同型半胱氨酸(homocysteine,Hcys)也参与了DR的病变。高Hcys水平可以直接激活NMDA受体，并通过氧化应激机制诱导RGCs[18,35,36,37]凋亡。4、神经营养因子研究表明，神经营养因子的失衡可导致神经元变性以及病理性新生血管形成[18]。视网膜主要由神经元组成，它产生大量的神经营养因子，如神经生长因子、[18]脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子等。DM患者长期高血糖状态下，体[18][18]内神经营养因子水平失衡。这导致细胞存活信号减弱，凋亡水平升高。神经生长因子是最早发现的生长因子，在DR中表达降低，被认为是引起RGCs凋亡[18][18,38]的其中一个因素。Mantelli等发现:NGF在DM大鼠视网膜中的水平在DR早期增加，保护RGCs，但随着NGF在视网膜中水平的下降该保护机制受损。[18,39,40]此外，外源性补充NGF可减少糖尿病引起的RGCs凋亡。脑源性神经营[18]养因子是在突触可塑性方面有重要作用。研究发现：外源性注射脑源性神经营[41,42]养因子可以延缓糖尿病视网膜RGCs的凋亡。在缺氧条件下，脑源性神经营养因子还可以提高Müller细胞对谷氨酸的摄取能力，并使谷氨酰胺合成酶表达[18,43][3]增加，进而保护神经。血管内皮生长因子具有增加血管通透性的作用。血管内皮生长因子一般在生理状态下呈低水平表达，这对维持血管正常功能十分重要[3,44]。在糖尿病视网膜病变中，血管内皮生长因子表达水平较高，使毛细血管通透[3,45]性增加。最终引起糖尿病视网膜渗出，出血、黄斑水肿，新生血管形成等病变，28 [3,45]严重损伤视力。二、治疗1、系统治疗降低血糖、血压，调整血脂水平是预防和治疗DR的前提条件。长期高血糖[46]导致机体代谢紊乱是DR病变进展的基础。此外，高血压也是加速DR进展的[46]危险因素之一。大量临床资料表明，控制血脂可以延缓DR进展。DM患者血[46,47,48]浆胆固醇及低密度脂蛋白含量升高，长期作用下将导致眼底脂质的渗出。因此，控制DM患者血糖、血压、血脂水平将有助于延缓DR的进展。2、治疗DR的药物[46]①改善微循环的药物：通过改善微循环可以改善视网膜缺血缺氧状况。临床常用的改善微循环的药物有：羟苯磺酸钙、胰激肽原酶、复方樟柳碱注射液、银杏提取物、丹参川穹嗪注射液、复方丹参滴丸、转酮醇酶激活剂、芪明颗粒、[46]脉络宁注射液等。它们能降低血液高黏滞性，减轻视网膜微血管渗漏，阻止微[46,49,50]血管基底膜增厚。②针对病因治疗的药物：抗新生血管药物在治疗各种新[51,52]生血管性眼病中已显示出很好的疗效。醛糖还原酶抑制剂在平衡多元醇代谢[46,53,54]途径，减少凋亡细胞数方面有重要作用。糖基化终末产物抑制剂可以改善[46,55,56]DR微血管和视网膜Muller细胞的功能。抗氧化应激药物可以显著改善2型糖尿病患者胰岛素敏感性，并能降低促红细胞生成素、血管生成素Ⅱ和VEGF[46,57,58]的表达。蛋白激酶C抑制剂改善组织缺氧状态，抑制VEGF表达，延缓视[46,59,60]网膜新生血管形成。肾素-血管紧张素系统抑制剂可以抑制网膜新生血管的[46,61,62]产生。③靶向治疗：基因靶向药物治疗已成为热点，现已有临床研究表明基[46,63,64]因靶向药物可以提高DR患者最佳矫正视力。④玻璃体腔内注射药物：玻[46,65,66]璃体腔注射纤维蛋白溶酶可以使新生血管退化，提升DR患者视力。3、DR的手术治疗①激光治疗：视网膜激光光凝分为全视网膜激光光凝、局部视网膜光凝、黄[46,67,68]斑区格栅样光凝或“C”字形光凝，是保全患者视功能的重要治疗方法。②玻璃体切割术：不仅可以解除机化条索对视网膜的牵拉，还可以置换出大量新生血29 [46]管生长因子。玻璃体切割术能有效地控制增殖期DR的病情，是挽救严重增殖[46,69]期DR患者视功能的主要治疗方式。三、小结综上所述，糖尿病视网膜病变是在长期高血糖状态下，多因素、多途径共同[3]作用的结果，发病机制较为复杂，有待我们继续深入研究。目前治疗DR的方案多种多样，不同的患者需要根据实际情况选择相应的治疗方案。因此，只有积[46]极预防，针对病因，多方面综合治疗才能降低DR的致盲率。参考文献1.葛坚·眼科学·第2版·北京：人民卫生出版社,2010·305-308.2.DagherZ,ParkYS,AsnaghiV,etal.Studiesofratandhumanretinaspredictaroleforthepolyolpathwayinhumandiabeticretinopathy.Diabetes,2004,53(9):2404-2411.3.卢百阳,武志峰.糖尿病视网膜病变发病机制研究进展.国际眼科杂志,2008,8(11):2308-2311.4.AsnaghiV,GerhardingerC,HoehnT,etal.Aroleforthepolyolpathwayintheearlyneuroretinalapoptosisandglialchangesinducedbydiabetesintherat.Diabetes,2003,52(2):506-511.5.ObrosovaIG,MinchenkoAG,VasupuramR,etal.Aldosereductaseinhibitorfidarestatpreventsretinaloxidativestressandvascularendothelialgrowthfactoroverexpressioninstreptozotocin-diabeticrats.Diabetes,2003,52(3):864-871.6.OlaMS,NawazMI,KhanHA,etal.Neurodegenerationandneuroprotectionindiabeticretinopathy.IntJMolSci,2013,14(2):2559-2572.7.邹敏书,余健,聂国明,等.维生素D对糖尿病大鼠的保护作用.中华实用儿科临床杂志,2014,29(12):927-930.8.WautierJL,GuillausseauPJ.Advancedglycationendproducts,theirreceptorsanddiabeticangiopathy.DiabetesMetabSyndrObes,2001,27(5):535-542.9.JindalV.Neurodegenerationasaprimarychangeandroleofneuroprotectionindiabeticretinopathy.MolNeurobiol,2015,51(3):878-884.30 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二、在学期间科研成绩1.徐卫星,李勇,徐军.维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响.眼科新进展,2017,37(12):1114-1118.2.徐卫星,徐军.外周血CD4~+T细胞表面信号淋巴细胞激活分子在过敏性结膜炎发病中的作用.眼科新进展,2018,38(04):334-338.3.徐卫星,徐军.糖尿病视网膜病变患者血清同型半胱氨酸、维生素B12及叶酸与氧化应激的关系探讨.眼科新进展,2018,38(06):556-559.37 三、致谢转眼间三年的研究生生活就要结束了，心中感慨万千！一路走来，得到了众多老师、同学、朋友的关心和帮助，借此机会表达我最衷心的感谢！首先向我尊敬的导师徐军教授表示最衷心的感谢，感谢他这三年来对我的学习和生活关怀备至，感谢他对我的悉心指导和严格要求。本课题的选定、实验的设计与进程，资料的整理以及论文和综述的修改成文，均在导师的悉心指导和严格要求下完成。导师渊博的知识、严谨的治学态度、认真求实的科学作风、忘我的工作精神是我学习的榜样，令我终生受益！衷心感谢锦州医科大学附属第一医院眼科刘丹教授、李兵教授、庞东渤教授、张琦副教授、马晓爽老师、李佳老师、李游老师、伍大洋老师等全体医护人员在临床学习中对我的指导和帮助！衷心感谢答辩委员会各位老师在百忙之中莅临指导，以及为评改论文所付出的辛勤劳动和提出的真知灼见。衷心感谢齐志敏老师、朱丽华同学、梁慧岷同学、李勇同学、汪曌同学、张云敬同学、杨柳师妹、赵梦帆师妹、刘俊杰师妹在实验过程中给予我最无私的指导和帮助。衷心感谢研究生部各位老师三年来对我的关心和培养。衷心感谢我的家人三年来对我的关心、理解和全力无私的付出。再次真挚感谢在我硕士期间帮助和支持我的所有老师和同学!38 四、个人简介基本信息姓名：徐卫星性别：男籍贯：河南省新蔡县出生日期：1991年06月01日民族：汉族教育经历2007年9月-2010年7月驻马店高级中学2010年9月-2015年7月长江大学临床医学2015年9月-2018年7月锦州医科大学眼科学39 厚德修身精术济世．■