维生素D缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响

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分类号：密级：＇ＵＤＣ：编号：安徽医科大学学位论文维生素Ｄ缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＶｉｔａｍｉｎＤＤｅｆｉｃｉｅｎｃｏｎｔｈｅＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡｌｃｏｈｏｌｉｃｙＦａｔｔｙＬｉｖｅｒｉｎＭｉｃｅ储兰兰指导教师姓名胡纯秋副教授安徽医科大学公共卫生学院申请学位级别硕士专业名称营养与食品卫生学提交论文日期２０１８年３月论文答辩日期２０１８年５月学位授予单位和日期安徽医科大学２０１８年６月答辩委员会主席周裔彬教授评阅人盲审２０１８年０５月 安徽医科大学ANHUIMEDICALUNIVERSITY硕士学位论文维生素D缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响EffectsofVitaminDDeficiencyonthePathogenesisofAlcoholicFattyLiverinMice作者姓名储兰兰指导老师胡纯秋副教授专业营养与食品卫生学研究方向营养与代谢性疾病工作时间2015年12月至2018年3月本课题由国家自然科学基金(81402676)支持 目录英文缩略词表..............................................................................................1中文摘要......................................................................................................2Abstract........................................................................................................41前言..........................................................................................................72材料和方法..............................................................................................83结果........................................................................................................203.1小鼠喂养6周期间摄食量和体重变化情况...............................203.2小鼠血清维生素D含量测定......................................................223.3维生素D缺乏对肝脏重量的影响..............................................223.4维生素D缺乏对酒精性肝损伤的影响......................................233.5维生素D缺乏对小鼠肝脏病理组织形态学和脂肪变性的影响253.6维生素D缺乏对脂肪酸合成代谢和TG合成的影响...............273.7维生素D缺乏对小鼠肝组织GSH和MDA含量以及氧化应激相关水平的影响......................................................................................313.8维生素D缺乏对炎性细胞因子和趋化因子表达的影响...........334讨论........................................................................................................365结论........................................................................................................40参考文献...................................................................................................41附录............................................................................................................50致谢............................................................................................................51综述............................................................................................................52 安徽医科大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称AFLAlcoholicfattyliver酒精性脂肪肝Terminaldexynucleotidyltransferase(TdT)-末端脱氧核苷酸转移酶介导TUNELmediateddUTPnickandlabeling的dUTP缺口末端标记测定法FASNFattyacidsynthase脂肪酸合成酶ACCAcetyl-CoenzymeAcarboxylase乙酰辅酶A羧化酶GSH-RdGlutathionereductase谷胱甘肽还原酶过氧化物酶体增殖物激活受PPARPeroxisomeproliferator-activatedreceptor体CRPC-ReactiveproteinC-反应蛋白CatalaseHydrogenPeroxidase过氧化氢酶FABPFattyacidbindingprotein脂肪酸结合蛋白VDDVitaminDdeficiency维生素D缺乏CytochromeP450,family4,subfamilyα,细胞色素P450，家族4，α亚CYP4α10polypeptide10家族，多肽10KCChemokine(C-X-Cmotif)ligand1趋化因子配体1GSH-PxGlutathioneperoxidase谷胱甘肽过氧化物酶LIPEHormonesensitivelipase激素敏感脂肪酶iNOSInduciblenitricoxidesynthase一氧化氮合酶TNFαTumornecrosisfactorα肿瘤坏死因子αP67phoxNeutrophilcytosolicfactor2中性粒细胞胞质因子2TGFβTransforminggrowthfactorβ转化生长因子βLPLLipoproteinlipase脂蛋白酯酶MCPMonocytechemotacticprotein单核细胞趋化蛋白SOD1Superoxidedismutase1超氧化物歧化酶1CPTCarnitinepalmitoyltransferase肉碱棕榈酰转移酶HO-1Hemeoxygenase1血红素加氧酶1ILInterleukin白介素CytochromeP450,family2,subfamilye,细胞色素P450，家族2，e亚CYP2E1polypeptide1家族，多肽1CD36Clusterofdifferentiation36分化抗原簇36SREBP-1cSterol-regulatedelement-bindingprotein-1c固醇调节原件结合蛋白-1c1 安徽医科大学硕士学位论文维生素D缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响中文摘要目的本研究采用Lieber-Decarli酒精液体饲料建立小鼠AFL模型，观察维生素D缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响。方法将6周龄C57BL/6J雄鼠按照完全随机分组原则分为正常对照组(Control)，维生素D缺乏组(VDD)，酒精组(EOH)和酒精+维生素D缺乏组(EOH+VDD)。酒精组小鼠喂养改进的含有乙醇的Lieber-DeCarli液体饲料（含4%(w/v)酒精），正常对照组以不含乙醇的普通液体饲料喂养小鼠，单纯维生素D缺乏组以缺乏维生素D且不含乙醇液体饲料喂养小鼠，酒精+维生素D缺乏组用不含维生素D的乙醇液体饲料喂养小鼠。喂养期间记录各组小鼠的每天饲料摄入量和每周体重，连续喂养6周，实验结束后对小鼠进行剖杀，眼球取血收集血清，用于检测后续血脂、ALT和AST活力、25(OH)D及炎症因子水平。肝脏取出后称重，部分迅速分装-80℃保存，用于检测GSH、MDA和甘油三酯含量、实时定量PCR及蛋白免疫印迹分析；另外一部分分别用4%多聚甲醛固定和OCT包埋后制备石蜡切片和冰冻切片用于肝损伤以及肝脂肪变性评价。结果造模6周后，VDD组和EOH+VDD组小鼠血清25(OH)D浓度分别为13.32±0.81ng/ml和12.78±2.1ng/ml，显著低于Control组（55.34±2.59ng/ml）和EOH组（51.68±3.53ng/ml），同时酒精引起了明显的肝损伤以及肝脏脂肪变性。与正常对照组相比，单纯酒精组小鼠肝重和肝脏系数以及血清ALT、AST活性均明显升高；肝组织中Ki67核表达、TUNEL凋亡细胞数显著升高，并且肝组织病理切片可见大量脂质沉积，有不同程度的脂肪变性以及炎性细胞浸润；血清和肝组织中TG水平以及部分脂质转运相关基因的表达水平均升高；肝组织匀浆中GSH活性2 安徽医科大学硕士学位论文降低，MDA含量以及促炎因子TNFα和趋化因子MCP1、KC的mRNA水平均显著升高。与单纯酒精组相比，维生素D缺乏显著升高了小鼠肝脏系数和血清ALT、AST水平，而对肝细胞增殖和肝细胞凋亡以及肝组织脂肪病变程度无显著影响，对于油红O染色的阳性面积率和积分光密度值有升高的趋势，但差异无统计学意义；维生素D缺乏对血清和肝脏中TG含量以及脂质合成、转运相关基因的表达无影响，但进一步上调了肝脏脂质分解相关基因的mRNA水平；维生素D缺乏对肝脏GSH水平无影响，但升高了MDA含量加重了酒精诱导的脂质过氧化，同时显著增强了一氧化氮合酶的表达水平并明显下调了GSH-Px、SOD1和catalase抗氧化酶基因的表达水平；维生素D缺乏显著上调了促炎因子TNFα、IL1β和TGFβ以及趋化因子MCP1和KC的mRNA水平。结论单纯维生素D缺乏并非脂肪肝发病的直接危险因素，但维生素D缺乏加重了酒精诱导的肝损伤，其机制可能与维生素D缺乏促发氧化应激、释放炎性细胞因子和趋化因子诱导的肝脏炎症有关。关键词维生素D缺乏；酒精性脂肪肝；脂质沉积；氧化应激；肝脏炎症3 安徽医科大学硕士学位论文EffectsofVitaminDDeficiencyonthePathogenesisofAlcoholicFattyLiverinMiceAbstractObjectiveTheAFLmodelofmousewasestablishedbyusingLieber-DecarlialcoholicliquiddiettoobservetheeffectsofvitaminDdeficiencyontheincidenceofalcoholicfattyliverinmice.MethodsSix-week-oldC57BL/6Jmalemicewererandomlydividedintofourgroups.Theywerecontrolgroup(Control),vitaminDdeficiencygroup(VDD),alcoholgroup(EOH)andalcohol+vitaminDdeficiencygroup(EOH+VDD).AlcoholgroupmicewerefedmodifiedLieber-DeCarliliquiddiets(containing4%(w/v)alcohol).Thenormalcontrolgroupwerefednormalliquiddietswithoutethanol.ThevitaminDdeficiencygroupwerefeddietswhichdeficientinvitaminsDandwithoutethanol,miceinalcohol+vitaminDdeficiencygroupwerefeddietswithethanolanddeficientinvitaminsD.Duringthefeedingperiod,thedailyfeedintakeandweeklybodyweightofmiceineachgroupwererecordedandfedcontinuouslyfor6weeks.Aftertheexperiment,themiceweresacrificedandbloodsampleswerecollectedforthedetectionofsubsequentlipids,ALTandASTactivities,25(OH)Dandthelevelofinflammatorycytokines.Theliverwascollectedandweighed,partiallystoredrapidlyat-80°CfordetectionofGSH、MDAandtriglyceridecontent,real-timequantitativePCRandwesternblotanalysis;theotherpartwasfixedwith4%paraformaldehydeandembeddedinOCTtoprepareparaffinsectionsandfrozensectionsforliverinjuryandhepaticsteatosisevaluation.4 安徽医科大学硕士学位论文ResultsAfter6weeksofmodeling,serum25(OH)DlevelsinVDDgroupandEOH+VDDgroupwere13.32±0.81ng/mland12.78±2.1ng/mlrespectively,whichweresignificantlylowerthanthoseinControlgroup(55.34±2.59ng/ml)andEOHgroup(51.68±3.53ng/ml),whilealcoholcausedsignificanthepaticinjuryandhepaticsteatosis.Comparedwiththenormalcontrolgroup,theliverweight,livercoefficientandserumALTandASTactivityofthemiceinthealcoholgroupweresignificantlyincreased;theexpressionofKi67andthenumberofTUNELapoptoticcellsinthelivertissueweresignificantlyincreased,andthepathologicalsectionsofthelivertissuewerevisiblealargenumberoflipiddeposition,varyingdegreesofsteatosisandinflammatorycellinfiltration;TGlevelsinserumandlivertissueandmRNAlevelsofsomelipidtransportrelatedgenesweresignificantlyincreased;GSHactivitydecreasedsignificantlywhileMDAcontentelevatedinliverhomogenateandthemRNAlevelsofproinflammatorycytokinesTNFαandchemokinesMCP1andKCweresignificantlyincreased.Comparedwiththealcoholgroup,vitaminDdeficiencyfurtherincreasedthemouselivercoefficientandserumALT,ASTlevels,butnoeffectonhepatocyteproliferationandhepatocyteapoptosisandfatlesionsinlivertissue;thepositivearearatioandintegralopticaldensityvalueofOilRedOstainingtendedtoincrease,butthedifferencewasnotstatisticallysignificant.VitaminDdeficiencyhadnoeffectonthecontentofTGinserumandliver,andtheexpressionoflipidsynthesisandtransportrelatedgenes.Butfurtherupregulatedtheliverlipidmetabolism-relatedgenemRNAlevels;vitaminDdeficiencyhadnoeffectonliverGSHlevels,butfurtherincreasedMDAcontentaggravatealcohol-inducedlipidperoxidation,whilefurtherenhancednitricoxidesynthaseexpressionandsignificantlydecreasedtheexpressionofGSH-Px,SOD1andcatalaseantioxidantenzymegenes;vitaminDdeficiencyfurthersignificantlyupregulatedproinflammatorycytokinesTNFα,IL1βandTGFβandchemotaxisfactorsMCP1andKCmRNAlevels.5 安徽医科大学硕士学位论文ConclusionsVitaminDdeficiencyisnotadirectriskfactorforfattyliverdisease,butvitaminDdeficiencyaggravatesalcohol-inducedliverinjury.ThemechanismmayberelatedtovitaminDdeficiencytopromoteoxidativestress,toreleaseinflammatorycytokinesandchemokine-inducedliverinflammation.KeywordsVitaminDdeficiency,Alcoholicfattyliver,Lipiddeposition,Oxidativestress,Liverinflammation6 安徽医科大学硕士学位论文维生素D缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响1前言长期以来，酒精被视为全球慢性病的一个主要危险因素[1]，滥用酒精已成为一个重大的公共健康问题，每年造成近250万人死亡。而人体摄入的酒精主要在肝脏内氧化代谢，长期大量摄入酒精，肝脏会受到直接毒害作用[2]，导致酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)。流行病学调查显示，ALD是一种严重危害全球公众健康的肝脏疾病，其患病率逐年上升[3]。BrowningJD等人在2004年对美国城市人口中的嗜酒人群开展了脂肪肝患病率调查，结果高达84%，其中20%～30%有发展为肝硬化的可能[4]；随着经济的发展和生活水平的提升，我国饮酒人群也日益增多，ALD发病率逐年上升，对人类健康和社会发展构成了严重威胁[5]。酒精性肝病包括无症状脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化及其相关并发症肝细胞癌，脂肪肝通常是ALD的最初阶段，表现为肝脏脂质沉积[6-8]。最近一项关于酗酒人群的调查显示，其中90%以上的人都患有酒精性脂肪肝[9]，因此，酒精性脂肪肝已成为全球所关注的健康问题。维生素D（又称抗佝偻病维生素）是人体必需的一种脂溶性固醇类维生素，它在体内的活性形式是1,25-二羟基维生素D3(1,25-dihydroxyvitaminD3,1,25-(OH)2D3)，它能够发挥生物学效应主要是通过与维生素D受体(VDR)结合形成激素-受体复合物。以前认为1,25-(OH)2D3在体内主要影响机体钙、磷的吸收和贮存，现在发现其在抗炎、抗纤维化和免疫调节过程中也起到重要作用[10]，而且还参与维持机体生长发育及调控细胞增殖、分化和凋亡[11]。充足的阳光照射是人体获取维生素D的主要途径，仅很少一部分是通过食物获取[10]。因此，随着经济的迅速发展和生活方式的改变，加上人们对合理阳光照射的重要性缺乏认识，人们户外活动时间日趋减少，导致维生素D缺乏者日益增多[12,13]。近年来调查结果显示，全球近10亿人口维生素D缺乏或不足[14]，我国人群维生素D不足的现象也较为7 安徽医科大学硕士学位论文普遍[15,16]。25-羟基维生素D(25-hydroxyvitaminD,25[OH]D)由于较长的生物半衰期，其血清含量常被用于评价人体维生素D营养状况[17]，其含量在20-30ng/ml范围内被定义为维生素D不足，低于20ng/ml为维生素D缺乏[18]。本课题组前期研究发现，部分脂肪肝患者血清维生素D浓度显著低于对照组，而且维生素D缺乏加重了急性酒精暴露引起的小鼠肝脏脂质沉积。这些研究结果表明维生素D缺乏可加重酒精性脂肪肝发病。而且越来越多的研究提示，维生素D缺乏可能是脂肪肝发病的危险因素[19]。研究发现，西班牙成年人血清25(OH)D水平随着酒精摄入量的增加而降低[20]，并且有研究表明，酒精分解代谢异常和肝脏甘油三酯沉积可能是维生素D缺乏所致的结果[21]。Trepo等[22]研究发现酒精性肝病患者血清25(OH)D水平随着体内ALT、AST活性和肝静脉压力梯度的升高而减少，而且还发现长时间维生素D缺乏或不足能够增加ALD患者的肝损伤。Anty等[23]在以酒精性肝硬化患者为主的队列研究中发现，25(OH)D严重缺乏独立于Child-Pugh评分增加了细菌感染的风险，随后又发现维生素D缺乏与酒精性肝病患者脂肪性肝炎（ASH）的发生有关。然而，也有一些研究发现饮酒量与维生素D水平之间存在正相关[24-27]。由此可见，维生素D缺乏与酒精性脂肪肝之间的相关性仍然存在争议。因此，本研究旨在探讨维生素D缺乏对酒精性脂肪肝发病的影响及其作用机制。2材料和方法2.1生化试剂95%药用级乙醇从南京化学试剂股份有限公司订购；丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、油红O染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所；25(OH)D放射免疫试剂盒购自比利时DIAsource公司；甘油三酯试剂盒订购于浙江东瓯诊断产品有限公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；原位末端缺口标记细胞凋亡检测法(TUNEL)、RT和qPCR试剂盒从美国Promega公司购买；TRIzol购于Invitrogen公司；FASN、CD36、LPL、iNOS、TNFα、CRP和18S等所有PCR8 安徽医科大学硕士学位论文引物均由Invitrogen公司合成；血清TNFα、CRP、MCP-1和IL-10这四个ELISA检测试剂盒均购买于上海源叶生物科技有限公司；β-actin、HO-1和CYP2E1抗体在美国SantaCruzBiotechnologies公司购买；Ki67抗体购自Abcam公司；化学发光液(Enhancedchemilumines-cence,ECL)检测试剂盒购自Pierce公司；其它未作说明的生化试剂都是购买于Sigma公司。2.2动物来源和处理健康6周龄SPF级C57BL/6J雄鼠，体重(22±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验前所有小鼠先进食标准颗粒饲料适应性喂养一周，然后进食不含乙醇的普通Lieber-DeCarli液体饲料适应性喂养一周，动物房在整个喂养期间维持昼夜均衡，温度20℃~25℃，湿度(50±5)%。所有动物实验均得到安徽医科大学医学伦理委员会批准，实验过程中对实验动物给予人文关怀。本实验按照完全随机分组原则分为4组：①正常对照组(Control)10只；②维生素D缺乏组(VDD)10只；③酒精组(EOH)20只；④酒精+维生素D缺乏组(EOH+VDD)20只。酒精组小鼠喂养改进的含4%(w/v)乙醇的Lieber-DeCarli液体饲料（代码：TP4030B），正常对照组以不含乙醇的普通液体饲料喂养小鼠（代码：TP4030C），维生素D缺乏组以缺乏维生素D且不含乙醇液体饲料喂养小鼠，酒精+维生素D缺乏组用不含维生素D的乙醇液体饲料喂养小鼠,维生素D缺乏小鼠给予不含紫外线的黄光灯来源的光照。小鼠按饮食的不同干预被给予不同的饲料，喂养期间记录各组小鼠的每天饲料摄入量和每周体重，连续喂养6周后取材，眼球取血收集血清，用于检测后续血脂、ALT和AST活力、25(OH)D及炎症因子水平。肝脏取出后称重，部分迅速分装-80℃保存，用于检测GSH、MDA和甘油三酯含量、实时定量PCR及蛋白免疫印迹分析；另外一部分分别用4%多聚甲醛固定和OCT包埋后制备石蜡切片和冰冻切片用于肝损伤以及肝脂肪变性评价。2.3动物饲料和喂养方法所有液体饲料均在南通特洛菲饲料科技有限公司购买，Control组喂养Lieber-DeCarli对照液体饲料（TP4030C），饲料能量构成比为：蛋白质18%、碳水化合物47%、脂肪35%；EOH组喂养Lieber-DeCarli酒精液体饲料（TP4030B），9 安徽医科大学硕士学位论文饲料能量构成比为：蛋白质18%、碳水化合物19%、脂肪35%和酒精28%；VDD组和EOH+VDD组分别喂养缺乏维生素D对照液体饲料和缺乏维生素D酒精液体饲料。喂有酒精组为提高造模效果，采用2周过渡喂养法（酒精液体饲料与对照液体饲料混合的比例分别为1:2、1:1、2:1各喂养4天），然后以酒精液体饲料喂养。采取“自由饮食”喂养时，酒精液体饲料摄入量一般低于对照液体饲料摄入量，为了消除由此导致的热量摄入和营养素摄入的差别对造模的影响，各组小鼠采取“配对喂养”，控制对照组液体饲料摄入，保障对照组平均每天每只小鼠液体饲料摄入量与酒精组平均每天每只液体饲料摄入量相同，该饲料含热量1.0Kcal/ml。配对喂养的原理是对照液体饲料组24h摄入量=酒精液体饲料组前24h摄入量，酒精液体饲料组保持“自由饮食”。配对喂养是基于24h，这就要求固定每天更新液体饲料的时间，考虑小鼠在熄灯后开始进食，因此更换饲料要在熄灯前完成，但也不宜过早，因为酒精易挥发从而影响效果。基于这些考虑，每天固定在下午5点更换饲料。2.4血清25(OH)D检测采用放射免疫分析法检测小鼠血清25(OH)D水平[28,29]。操作步骤：在试剂盒平衡至室温后，为每个孵育校准品、对照品和样品的包被管编号标记；每个包被管中加入25μl校准品或对照或样品；然后每个包被管中加入500μl孵育缓冲液，在室温的管式摇床上（300-700rpm）孵育2小时；孵育结束后，每个包被管中加入50μl125I标记的25(OH)D，用手轻轻摇动管架去除管壁可能吸附的气泡，在室温的管式摇床上（300-700rpm）孵育1小时；孵育完成后吸去每个包被管中的反应液，用2ml洗涤溶液清洗试管两次并弃去洗液；最后在伽马计数器中读数自动确定样品的25(OH)D浓度。2.5血清ALT、血脂含量检测用瑞士罗氏公司的全自动生化分析仪测定小鼠血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHOL）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）含量。10 安徽医科大学硕士学位论文2.6肝脏HE染色取肝右叶上一小部分迅速放进装有4%多聚甲醛的7mlEP管中固定，常规脱水、石蜡包埋。制备厚度约5μm切片，常规HE染色，中性树胶封片，最后在光学显微镜下察看肝组织病理学改变，拍照（×200）用于评价脂肪变性程度，分级依据为脂肪病变的肝细胞数占肝细胞总数的比例：0级（正常的肝细胞）；1级（<25%肝细胞出现脂肪变性）；2级（25%～50%肝细胞出现脂肪变性）；3级（50%～75%肝细胞出现脂肪变性）；4级（>75%肝细胞出现脂肪变性）[30]。2.7肝脏油红O染色油红O染色试剂盒里包括试剂一：贮备液和稀释液，试剂二：复染液，试剂三：水性封固剂。实验开始前根据所需要的量配好试剂一应用液，配制方法为5倍贮备液对应2倍稀释液。试剂三水性封固剂提前放置60℃烤箱加热至液态状。具体步骤如下：取肝右叶上一小部分迅速用OCT包埋，制备厚度为10μm冰冻切片。用组化笔在切片组织周围画圈，向圈内滴加试剂一应用液染色10～15min，弃去染液，37℃温的蒸馏水洗去玻片上残留的试剂一应用液；滴加试剂二复染液染色3～5min，弃去染液后温水冲洗30～60s；待玻片表面液体快干时（不要完全干）滴加试剂三水性封固剂进行封片。60℃烤箱烤干后在光学显微镜下观察脂滴染色情况，拍照（×200）用于测定阳性面积率（定义细胞质呈红色为阳性）及积分光密度值(Integralopticaldensity,IOD)。2.8肝脏甘油三酯含量检测准确称量0.1g肝脏组织，加入Tris-甘露醇脂质匀浆液995μl和PMSF5μl放置冰上匀浆，一般匀75下；取400μl匀浆液，加入氯仿:甲醇（2:1）混合液4ml放置摇床过夜；加入800μl三蒸水，剧烈震荡10min使脂质与水分开，静置10min后再剧烈震荡10min；4500r离心10min后分成三层，弃去上层水相，剥开中间杂质层，吸取最下层脂质相，注意全部吸取，放置抽风机上抽干水直至析出脂质；加入磷酸盐缓冲液（PBS）：Triton-100=99:1混合液400μl，放至60℃烤箱，每隔半小时拿出混匀，直至溶解；分装，-20℃保存。用甘油三酯检测试剂盒按照试剂盒说明书方法测定肝脏TG含量。11 安徽医科大学硕士学位论文2.9酶联免疫吸附试验（ELISA）血清中TNF-α、CRP、MCP1和IL-10水平的检测采用双抗体一步夹心法ELISA试剂盒。实验前将试剂盒平衡至室温；取出包被了抗体的所需板条，向设置好的标准品孔中分别加50μl不同浓度（S0-S5）的标准品；样品孔按照待测样本与样本稀释液2:3的比例加入总体积50μl的混合液；在每个孔中加入100μl辣根过氧化物酶标记的抗体，用对应大小的封板膜封住板条上的反应孔后37℃温育1小时；弃去上述反应液体，加入用三蒸水1:19稀释后的1×洗液，1分钟后弃去洗液，在干燥的吸水纸上拍干反应孔中的残余液体，按上述方法重复洗板5次；每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min；每孔中加入50μl终止液，15min内用酶标仪测定各孔在450nm波长处的OD值，重复测量3次取均值。根据不同标准品浓度和其对应的OD值绘制出标准曲线，按照曲线方程以及各样品孔测得的吸光度值计算出待测样本中TNF-α、CRP、MCP1和IL-10水平。2.10还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定采用Beutler改良法[31,32]测定肝组织匀浆液GSH含量。试剂准备：(1)1mmol/L的GSH（标准品）；(2)1%柠檬酸钠；(3)0.04%二硫双基苯甲酸（DTNB）：用1%柠檬酸钠配制；(4)20%三氯醋酸（TCA）；(5)0.3mol/L磷酸氢二钠缓冲液。操作步骤：称取0.1g肝脏组织，加入500μl预冷的生理盐水放置冰上匀浆，制备20%组织匀浆液，静置10min左右，低温高速离心机4℃、12000g离心10min，取上清液200μl，按上清液：20%TCA为3:1的比例加入180μl上清液和60μl三氯醋酸后振荡器混匀（剩余20μl上清液用于Lowry法测蛋白），4℃离心机12000g离心10min，收集上清液待测。具体操作见表1（单位：ml）：表1Beutler改良法样品测定操作Tab1Beutlermodifiedmethodforsampledetermination试剂测定管空白管待测样品液0.10磷酸盐缓冲液4.44.4DTNB试剂0.50.5三蒸水00.112 安徽医科大学硕士学位论文混匀，5min内使用紫外分光光度计用1cm光径的比色皿以三蒸水调零在412nm波长处，测定各管吸光度值。代入表2（单位：ml）所绘制的标准曲线，计算出样品液的GSH浓度。表2GSH标准曲线的测定Tab2DeterminationofGSHstandardcurveGSH(μmol/L)010203040501mmol/LGSH00.050.10.150.20.25三蒸水0.50.450.40.350.30.25磷酸盐缓冲液4.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.50.50.50.50.50.52.11丙二醛（MDA）含量测定采用TBA法测定肝组织匀浆液MDA含量。操作步骤：称取0.1g肝脏组织，加入1ml预冷的生理盐水放置冰上匀浆，制备10%肝组织匀浆液，静置10min左右，低温高速离心机4℃、12000g离心10min，取上清液，具体操作见表3（单位：ml）：表3TBA法样品测定操作Tab3SampledeterminationofTBAmethod空白管标准管测定管对照管10nmol/ml标准品—0.1——无水乙醇0.1———测试样品——0.10.1试剂一0.10.10.10.1混匀（摇动几下试管架）试剂二应用液3.03.03.03.0试剂三应用液1.01.01.0—50%冰醋酸———1.013 安徽医科大学硕士学位论文混匀，EP管盖上刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，4000转/分离心10min。取上清后使用紫外分光光度计用0.5cm光径的比色皿以三蒸水调零在532nm波长处，测定各管吸光度值。按下列公式计算：MDA含量测定OD值-对照OD值标准品浓度待测样本蛋白浓度=×÷(nmol/mgprot)标准OD值-空白OD值(10nmol/ml）(mgprot/ml)2.12免疫组化检测肝细胞增殖每组选取肝组织石蜡切片各4张，60℃烤箱20min，经2次100%二甲苯脱蜡10min，2次100%乙醇3min和95%，85%，70%和50%梯度乙醇水化各3min，PBS浸洗5min，TritonX-100细胞通透30min，加入枸橼酸钠用微波高火1min，中火6min重复6次进行抗原修复，自然冷却至室温，PBS浸洗3min3次，擦干玻片，用组化笔在组织周围画圈，向圈内加入羊血清在湿盒中室温封闭20min，弃去血清，加入1:100的Ki67抗体50μl/片室温孵育1h后放入4℃冰箱过夜，第二天从4℃冰箱拿出后放入37℃恒温箱复温45min，PBS浸洗5min5次，使用加兔试剂盒滴上二抗工作液，37℃恒温箱孵育30min，PBS浸洗5min5次，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS浸洗5min5次，最后用二氨基邻苯胺(DAB)显色、苏木素复染、PBS返蓝、梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封片。在光学显微镜下拍照（×200）用于计数每张切片的增殖细胞数所占的百分比。2.13TdT介导dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测肝细胞凋亡每组选取肝组织石蜡切片各4张，60℃烤箱20min，经2次100%二甲苯脱蜡10min、2次100%乙醇3min和95%，85%，70%和50%梯度乙醇水化各3min、0.85%氯化钠和PBS各浸洗5min、20μg/ml蛋白酶K细胞通透37℃20min、PBS浸洗5min3次、擦干玻片用组化笔在组织周围画圈、向圈内加入平衡液湿盒孵育10min、TUNEL反应混合液37℃避光孵育1h、浸入2×核酸杂交漂洗液（SSC）15min终止反应、PBS浸洗5min3次、0.3%双氧水封闭内源性过氧化物酶15min、PBS浸洗5min3次、酶标反应30min，最后用二氨基邻苯胺(DAB)显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封片。在光学显微镜下拍照（×200）用于计数每张切片的凋亡细胞数所占的百分比。14 安徽医科大学硕士学位论文2.14肝脏总RNA提取和逆转录准备工作：1ml匀浆器泡酸24h，捞出后与量筒、酒精瓶、棉球瓶等玻璃器皿一同洗净后再用三蒸水冲洗，放置200℃烤箱烤2h；滤纸和棉球装不锈钢饭盒中用牛皮纸封住放到高压灭菌锅中121℃灭菌30min，然后拿出放置60℃烤箱烤干。取肝脏组织50mg左右放进1ml匀浆器内，加入1.2mlTRIzol试剂匀浆50次后转移至1.5ml无酶管中，室温下静置5-10min分离核酸蛋白复合物，上下颠倒数次置冰上。低温高速离心机4℃、12000g离心10min，吸1ml上清，加入0.1ml溴氯丙烷（BCP），盖紧盖子，剧烈振荡2min后（粉红色）室温静置5min，12000g离心15min，离心后混合物分成三层，RNA存在于上层水相，枪头尖部剪去，贴液面上吸取上清300μl（分三次吸，注意不要吸到沉淀），按照上清：异丙醇为1:3的比例加入异丙醇900μl，盖紧盖子，轻轻上下颠倒混匀8-15min直至肉眼可观察到沉淀，12000g离心8min，离心后侧面和底面形成凝胶样沉淀。轻轻倒去上清液，加入1ml提前配制好放在4℃冰箱预冷的75%乙醇，加样器吹散清洗RNA，7500g离心5min，重复吹洗2-3次，最后一次10000g离心5min，弃上清，用小枪头吸残余液体，室温干燥5-10min，加入0.5‰DEPC水50-100μl（视RNA量多少而定）自溶5min后再用枪头混匀。吸取2μl混匀后的RNA用Take3测定其浓度，然后将所有样品稀释定量至同一浓度(0.5μg/μl)，分装-80℃保存。取0.5μg/μl的肝脏RNA溶液4μl用于cDNA合成，加入3μl无酶水，1μlDNase10×ReactionBuffer和2μlRNase-FreeDNase，放置PCR仪上37℃反应30min，然后向每管中加入1μlDNaseStopSolution，PCR仪65℃反应10min，灭活DNA酶，在9分40秒取出迅速插入冰上冷却2min，再向每管中加入9μl逆转录反应混合液，放入PCR仪上42℃反应1h后，迅速升至95℃反应5min灭活逆转录酶，合成的cDNA保存于-20℃冰箱，用于实时定量PCR分析。2.15实时定量-聚合酶链反应（real-timePCR）提前化冻无酶水和Mix溶液待用。用加样器向96孔板中加入7μl无酶水，10μlMix溶液，正向引物和反向引物各1μl，最后加入上述方法合成的1μl对应样品的cDNA，加样器混匀后用封板膜封住96孔板。使用罗氏公司LightCycler®480仪器15 安徽医科大学硕士学位论文上机扩增，设定循环数为45次，先进行95℃预变性5min后，依次进行95℃变性15s、60℃退火15s和72℃延伸30s。选择18S作为本实验的内参对照，所有实验数据采用实时荧光定量PCR统计分析软件进行相对定量分析，最后各基因mRNA水平以实验组和对照组的比值来表示。各种基因的引物序列和片段长度见表4。表4各基因的引物序列和片段长度Tab4Oligonucleotidesequencesofprimersandfragmentlength基因名称引物序列（5’-3’）片段长度（bp）18SForward：GTAACCCGTTGAACCCCATT151Reverse：CCATCCAATCGGTAGTAGCGFASNForward：CGCTCGGCTCGATGGCTCAG157Reverse：CCAGCACCACGGCATGCTCAMIP2Forward：TTGCCTTGACCCTGAAGCCCCC175Reverse：GGCACATCAGGTACGATCCAGGCNox4Forward：CCAAATGTTGGGCGATTGTGT133Reverse：TCCTGCTAGGGACCTTCTGTACCForward：CCGTTGGCCAAAACTCTGGAGCTAA149Reverse：GAGCTGACGGAGGCTGGTGACAMCP1Forward：GGCTGGAGAGCTACAAGAGG93Reverse：GGTCAGCACAGACCTCTCTCPPARγForward：GGGCTGAGGAGAAGTCACA144Reverse：TCAGTGGTTCACCGCTTCTTIL6Forward：AGACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGA146Reverse：GCCACTCCTTCTGTGACTCCAGCP67phoxForward：GCTGCGTGAACACTATCCTGG136Reverse：AGGTCGTACTTCTCCATTCTGTACD36Forward：CACAGCTGCCTTCTGAAATGTGTGG171Reverse：TTTCTACGTGGCCCGGTTCTAATTC16 安徽医科大学硕士学位论文gshpxForward：GGTGGTGCTCGGTTTCCCGT113Reverse：AATTGGGCTCGAACCCGCCACFABP1Forward：GGAAGGACATCAAGGGGGTG169Reverse：TCACCTTCCAGCTTGACGACSOD1Forward：GCGATGAAAGCGGTGTGCGTG143Reverse：TGGACGTGGAACCCATGCTGGFABP4Forward：GGATTTGGTCACCATCCGGT161Reverse：TTCCATCCCACTTCTGCACCTNFαForward：CCCTCCTGGCCAACGGCATG109Reverse：TCGGGGCAGCCTTGTCCCTTLPLForward：TCGTCATCGAGAGGATCCGA162Reverse：TGTTTGTCCAGTGTCAGCCAcatalaseForward：CGCGCTCGAGTGGCCAACT107Reverse：TGCTGCTCTGGTGCGCTGAALIPEForward：TGGGGAGCTCCAGTCGGAA112Reverse：AAGGCCATATTGTCTTCTGCGACYP4α14Forward：TGCTTACAGTGTCTCTCGGGGAGC177Reverse：CCGCCGATGCTGGAACCACTTIL1βForward：GCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT143Reverse：TCCTTTGAGGCCCAAGGCCACACYP4α10Forward：GATGGTTCTGGGGAAGCAAGGCC187Reverse：AAGGCTGGGGTTAGCATCCTCCTTGFβForward：CGGGAAGCAGTGCCCGAACC147Reverse：GGGGGTCAGCAGCCGGTTACCPT2Forward：TTCGCCCAGCTTCCATCTTT125Reverse：GGTCAGCTGGCCATGGTATTiNOSForward：GCTCGCTTTGCCACGGACGA14617 安徽医科大学硕士学位论文Reverse：AAGGCAGCGGGCACATGCAAPPARαForward：AGTGCAGCCTCAGCCAAGTTGAA120Reverse：AGGCAGGCCACAGAGCGCTAAGgshrdForward：GGGATGCCTATGTGAGCCGCC107Reverse：TGACTTCCACCGTGGGCCGAKCForward：ACTCAAGAATGGTCGCGAGG123Reverse：GTGCCATCAGAGCAGTCTGT2.16肝组织总蛋白提取准确称取50mg肝脏组织于1ml匀浆器中，加入500μlRIPA裂解缓冲液和5μlPMSF，冰上匀浆60下，静置15min后高速离心机4℃、15000g离心15min，取上清液400μl（注意不要吸到上层的脂肪和下层的沉淀）后4℃、15000g再次离心15min，最后取上清200μl于1.5ml离心管中放置冰上。取其中5μl上清液用于Lowry法测定蛋白含量，具体操作步骤：准备5mlEP管，加入1245（625+620）μl三蒸水，用加样器加入5μl上清液并吹打数次混匀，加入2ml提前配好的A液(4%碳酸钠：0.2mol/l氢氧化钠：2%酒石酸钠：1%硫酸铜=50:50:1:1)，混匀后37℃水浴10min，反应结束后向各管中加入200μlB液（50%福林酚：三蒸水=1:1）,37℃水浴30min，提前打开紫外分光光度计，三蒸水调零，反应结束后用紫外分光光度计在750nm波长下测定吸光度值，计算出样品蛋白质浓度，用RIPA将所有样品定量至相同浓度，定量后样品与2×上样缓冲液1:1混合，混匀后放PCR仪上98℃蛋白变性10min，冷却后分装-20℃保存待用。2.17蛋白质免疫印迹（WesternBlot）首先配制所需浓度的聚丙烯酰胺分离胶，将分离胶灌到指定高度后缓慢加入三蒸水压平分离胶，室温放置30min左右直至肉眼能看到折线，倒掉上面的水并用滤纸吸干。配制5%浓缩胶，灌满浓缩胶后，迅速将垂直槽样品梳子竖直插入浓缩胶中，放置45min左右待胶完全凝固后，将梳子轻轻拔出，用电泳缓冲液清洗上样孔避免有碎胶。在电泳槽内加满电泳缓冲液，取20-40μg蛋白（视不同指标而定）样品和蛋白Marker加入上样孔中，上好样先55V电泳约1h左右直至Marker18 安徽医科大学硕士学位论文开始分离（即跑到分离胶）时，可将电压调至110V电泳1.5h左右至溴酚蓝指示剂跑出即可终止电泳。电泳结束后，取出凝胶切成所需大小准备转膜。剪取一张比凝胶稍大点的PVDF膜，用甲醇浸泡20S活化后浸入三蒸水中待用，在电极板(阴极)上依次整齐叠放海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海绵垫，驱赶各层之间的气泡，放入转膜槽，加入转膜缓冲液，以200mA恒流冰浴转膜3h45min。结束后，用1×丽春红染液染膜约10s，按染出的蛋白条带印迹修剪膜至最合适大小并作标记，然后蒸馏水脱色。配制5%的脱脂牛奶用孵育袋浸泡含蛋白的膜摇床上室温封闭90min或4℃封闭过夜，三蒸水洗膜3次，3min/次；分别用相应的一抗(β-actin：1:3000、HO-1：1:1000、CYP2E1：1:2000)用孵育袋浸泡膜室温摇床孵育1-3h或者4℃过夜；用含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲溶液（PBST）放入脱色摇床上的平皿中洗膜3次，10min/次，最后一次只用PBS洗10min；将膜放入提前配好的辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(β-actin：1:10000鼠抗、HO-1：1:80000兔抗、CYP2E1：1:10000兔抗)孵育袋中室温摇床孵育1-3h或者4℃过夜，再次用含有0.05%Tween-20的PBST放入脱色摇床上的平皿中洗膜3次，10min/次，最后一次只用PBS洗10min。最后用等体积显色剂A和B混合配制的ECL显影液进行发光检测，将洗好的膜用滤纸控干液体后放置于Tanon化学发光显影仪的托板上，用移液器向膜上均匀滴加显影液，将托板放入显影仪中，选择合适的曝光时间，得到蛋白条带显影结果并保存。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件分析蛋白条带的灰度值，计算出目的蛋白相对表达量。2.18统计分析符合正态分布的实验数据用均数±标准误（Means±SEM）表示，统计分析采用SPSS20.0统计软件。组间差别采用单因素方差分析和SNK事后检验来比较；两组独立样本之间的均数比较用t检验；多时间点测量资料间的比较用重复测量方差分析，两两比较用LSD事后检验；等级计数资料采用Kruskal-WallisH检验。检验水准α=0.05。19 安徽医科大学硕士学位论文3结果3.1小鼠喂养6周期间摄食量和体重变化情况维生素D缺乏对体重增长的影响见图1。结果显示，在喂养期间，单纯维生素D缺乏组和正常对照组小鼠体重均缓慢增长，Control组和VDD组小鼠比较，体重无显著性差异（图1A）。酒精液体饲料组和酒精加维生素D缺乏组小鼠体重前2周缓慢增长，第3周有轻微下降，之后趋于稳定，整个喂养过程中体重几乎无变化，相对于EOH组，Control组小鼠体重的增加明显加快（P<0.01，LSDposthoctest）（图1A）。在实验结束时，对照组较之酒精组小鼠，体重显著升高（P<0.01），然而，EOH组与EOH+VDD组小鼠比较，体重无显著差异（图1B），表明维生素D缺乏对体重增长无明显影响。图1维生素D缺乏对体重的影响Fig1EffectsofvitaminDdeficiencyonbodyweight20 安徽医科大学硕士学位论文注：A图：四组间比较经重复测量方差分析得出P<0.01；经LSD事后检验进行两组间比较，Control组与EOH组，P<0.01；EOH组与EOH+VDD组，P>0.05。B图：液体饲料喂养6周后的各组体重数据比较资料。所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。**P<0.01(vsControl)。Note:A.P<0.01(repeatedmeasuresanalysisofvariance).P<0.01,ControlvsEOH;P>0.05,EOHvsEOH+VDD(LSDposthoctest).B.Dataofbodyweightforeachgroupafter6weeksoffeedingwerepresented.AlldatawereexpressedasMeans±SEM.**P<0.01(vsControl).我们进一步分析了维生素D缺乏对能量摄入的影响（图2）。EOH组小鼠的能量摄入量显著低于Control组（P<0.001，LSDposthoctest），而EOH组与EOH+VDD组小鼠比较，能量摄入量没有差异，表明维生素D缺乏对能量摄入无明显影响，这与体重变化情况一致。图2维生素D缺乏对能量摄入的影响Fig2EffectsofvitaminDdeficiencyoncaloricintake注：四组间比较经重复测量方差分析得出P<0.001；经LSD事后检验进行两组间比较，Control组与EOH组，P<0.001；EOH组与EOH+VDD组，P>0.05。所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。Note:P<0.001(repeatedmeasuresanalysisofvariance).P<0.001,ControlvsEOH;P>0.05,EOHvsEOH+VDD(LSDposthoctest).AlldatawereexpressedasMeans±SEM.21 安徽医科大学硕士学位论文3.2小鼠血清维生素D含量测定如图3所示，VDD组和EOH+VDD组小鼠血清25(OH)D浓度分别为（13.32±0.81ng/ml）和（12.78±2.1ng/ml），显著低于Control组（55.34±2.59ng/ml）和EOH组（51.68±3.53ng/ml），表明本次实验小鼠维生素D缺乏模型造模成功。图3维生素D缺乏对小鼠血清中25(OH)D浓度的影响Fig3EffectsofvitaminDdeficiencyonserum25(OH)Dconcentrationinmice注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH).3.3维生素D缺乏对肝脏重量的影响维生素D缺乏对肝脏重量的影响见图4。结果显示，小鼠酒精液体饲料喂养6周引起肝脏重量显著增加，而维生素D缺乏对肝脏重量无明显影响（图4A）。我们进一步分析了肝脏系数，结果发现，EOH组小鼠肝脏系数相对于Control组显著增加，并且维生素D缺乏进一步增强了该效应，然而单纯维生素D缺乏组相比与对照组小鼠的肝脏系数并没有显著变化（图4B），表明维生素D缺乏在酒精饮食基础上升高了小鼠肝脏系数，但单纯维生素D缺乏对小鼠肝脏系数无明显影响。22 安徽医科大学硕士学位论文图4维生素D缺乏对肝重以及肝脏系数的影响Fig4EffectsofvitaminDdeficiencyonliverweightandlivercoefficient注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH).3.4维生素D缺乏对酒精性肝损伤的影响维生素D缺乏对酒精性肝损伤的影响见图5。结果显示，与对照组相比，酒精组小鼠血清ALT和AST水平均显著升高，而且EOH+VDD组进一步增强了酒精诱导的ALT和AST水平的升高，其差异有统计学意义；然而单纯维生素D缺乏组小鼠血清ALT和AST水平与对照组相比并没有显著变化，表明维生素D缺乏在酒精饮食基础上加重了肝损伤血清酶学，但单纯维生素D缺乏对肝损伤血清酶学无明显影响（图5A、B）。我们进一步检测了肝脏切片中细胞的增殖与凋亡水平，研究结果显示，相对于Control组（1.95±0.64），EOH组（35.62±5.30）出现了大量的Ki67核增殖抗原阳性表达，但EOH+VDD组（30.33±2.13）对酒精诱导的肝细胞增殖没有影响（图5C）。TUNEL法检测细胞凋亡的研究结果显示，与Control组相比，EOH组小鼠肝细胞凋亡水平明显增加，且差异具有统计学意义（P<0.01），而EOH+VDD组与EOH组小鼠相比，细胞凋亡水平没有差异（P>0.05）（图5D）。23 安徽医科大学硕士学位论文图5维生素D缺乏对酒精性肝损伤的影响Fig5EffectsofvitaminDdeficiencyonalcoholicliverinjury24 安徽医科大学硕士学位论文注：A图：各组血清ALT水平数据比较资料。B图：各组血清AST水平数据比较资料。C图：各组小鼠肝脏切片的Ki67阳性表达（200倍放大倍数）。D图：各组小鼠肝脏切片的凋亡细胞表达（200倍放大倍数）。所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05(vsEOH)。Note:A.DataoftheserumALTwerepresented.B.DataoftheserumASTwerepresented.C.ExpressionofKi67+inmiceliversections(×200).D.Expressionofapoptosiscellsinmiceliversections(×200).AlldatawereexpressedasMeans±SEM.*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05(vsEOH).3.5维生素D缺乏对小鼠肝脏病理组织形态学和脂肪变性的影响肝组织石蜡切片H&E染色发现，Control组和VDD组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝窦正常，胞核结构清晰，肝小叶内偶见肝细胞脂肪变性，无坏死，少有炎症细胞浸润，整个肝脏无明显病理改变；而EOH组和EOH+VDD组小鼠肝小叶界限不清，肝细胞索紊乱，肝窦变窄，肝细胞中出现了明显的脂肪空泡，还可见多个散在肝细胞坏死和炎性细胞浸润（图6）。通过对肝组织脂肪病变程度分级（表5），得出Control组0级7只，1级1只，EOH组2级3只，3级3只，4级2只，VDD组0级6只，1级2只，EOH+VDD组2级1只，3级4只，4级3只。对肝组织脂肪病变程度分级结果采用Kruskal-WallisH检验发现，与对照组相比，酒精组病变等级明显升高，而EOH+VDD组与EOH组小鼠相比，病变等级没有明显差异。为了证实H&E染色中的空泡是脂滴，我们进一步对肝组织做了冰冻切片进行油红O染色，结果发现对照组的肝细胞几乎无着色，单纯维生素D缺乏组有些着色的脂滴，而酒精组肝细胞内的脂滴被染成了明显的红色（图7A），证实了酒精饮食诱导了肝脏的脂肪变性，对油红O染色结果进一步定量分析发现，EOH+VDD组的阳性面积率和积分光密度值相对于EOH组有升高的趋势，但差异无统计学意义（图7B、C）。25 安徽医科大学硕士学位论文图6维生素D缺乏对肝脏病理组织学的影响Fig6EffectsofvitaminDdeficiencyonhepatichistology注：肝脏石蜡切片H&E染色(×200)。Note:LiversectionswerestainedwithH&E(×200).表5各组小鼠肝脏脂肪病变分级Tab5Pathologicalgradingofhepaticsteatosisinmice肝细胞脂变程度分级组别n平均等级0级1级2级3级4级Control组8710008EOH组80033223.44**VDD组8620009EOH+VDD组80014325.56注：EOH组与Control组相比，**P<0.01；EOH+VDD组与EOH组相比，P>0.05。Note:**P<0.01,EOHvsControl;P>0.05,EOH+VDDvsEOH.26 安徽医科大学硕士学位论文图7维生素D缺乏对肝脏脂质沉积的影响Fig7EffectsofvitaminDdeficiencyonhepaticlipidaccumulation注：A图：肝脏冰冻切片油红O染色(×200)。采用阳性面积率（B图）和积分光密度值（C图）定量分析油红O染色结果。所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。**P<0.01(vsControl)。Note:A:LiversectionswerestainedwithOilRedO(×200).B:Quantitativeanalysiswasperformedusingpositivearearatioandintegralopticaldensity(IOD).AlldatawereexpressedasMeans±SEM.**P<0.01(vsControl).3.6维生素D缺乏对脂肪酸合成代谢和TG合成的影响维生素D缺乏对血清脂质的影响见表6。检测结果显示，小鼠血清总胆固醇、HDL、LDL和VLDL含量在各组间比较均无显著性差异。但相对于Control组，EOH组小鼠血清甘油三酯含量明显升高，且差异有统计学意义，而EOH+VDD组与EOH组相比较没有变化。我们进一步检测了小鼠肝脏中甘油三酯含量（图8），结果和血清中甘油三酯含量相似，酒精诱导了肝脏甘油三酯含量的增加，维生素D缺乏有增加该效应的趋势，但无统计学意义。接着，我们进一步检测了肝脏脂肪27 安徽医科大学硕士学位论文酸合成代谢相关基因的表达水平（图9-11）。首先，我们探讨了各组小鼠肝脏脂肪酸合成相关基因的表达水平（图9），研究发现小鼠肝脏组织中FASN、ACC、SCD1和DGAT2这些脂肪酸合成相关酶的基因表达水平在各组间均无显著性变化。随后我们又研究了各组小鼠肝脏脂质转运相关基因的表达水平（图10），结果发现，虽然酒精饮食没有明显上调肝脏PPARγ的基因表达，但显著上调了其下游靶基因CD36和反映脂肪酸摄取的基因FABP1和FABP4的mRNA水平，并且有上调脂肪酸转运蛋白4（FATP4）表达的趋势，较之EOH组，EOH+VDD组肝脏组织中PPARγ、CD36和FATP4的mRNA水平有上升的趋势，但其差异没有统计学意义。两个与VLDL组装有关的基因APOb和MTTP的表达水平在各组之间没有明显变化。最后，我们分析了各组小鼠肝脏脂质分解相关基因的表达（图11），研究结果得出，喂养酒精液体饲料的小鼠显著上调LPL、LIPE、CYP4α14、CYP4α10和CPT2的mRNA水平，并且有上调PPARα和CPT-1α表达水平的趋势。本研究还发现维生素D缺乏进一步增强了酒精饮食诱导的肝脏LPL和LIPE表达的上调，这可能与维生素D缺乏没有加重酒精诱导的甘油三酯含量的增加有关。表6维生素D缺乏对血清脂质的影响Tab6EffectsofvitaminDdeficiencyonserumlipid组别TGCHOLHDLLDLVLDLControl1.60±0.143.78±0.092.72±0.070.44±0.020.62±0.03EOH2.18±0.18*3.64±0.212.49±0.130.44±0.110.72±0.04VDD1.83±0.264.03±0.332.62±0.20.56±0.090.67±0.05EOH+VDD2.14±0.173.66±0.212.47±0.150.49±0.110.70±0.04注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示，单位(mmol/L)。*P<0.05(vsControl)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM,unit(mmol/L).*P<0.05(vsControl).28 安徽医科大学硕士学位论文图8维生素D缺乏对肝脏TG含量的影响Fig8EffectsofvitaminDdeficiencyonlivertriglyceridecontent注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。**P<0.01(vsControl)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.**P<0.01(vsControl).图9维生素D缺乏对肝脏脂肪酸合成相关基因表达的影响Fig9EffectsofvitaminDdeficiencyontheexpressionofhepaticgenesforfattyacidsynthesis注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.29 安徽医科大学硕士学位论文图10维生素D缺乏对肝脏脂质转运相关基因表达的影响Fig10EffectsofvitaminDdeficiencyontheexpressionofhepaticgenesforlipidtransport注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。*P<0.05(vsControl)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.*P<0.05(vsControl).图11维生素D缺乏对肝脏脂质分解相关基因表达的影响Fig11EffectsofvitaminDdeficiencyontheexpressionofhepaticlipolysis-relatedgenes注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05(vsEOH)。30 安徽医科大学硕士学位论文Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05(vsEOH).3.7维生素D缺乏对小鼠肝组织GSH和MDA含量以及氧化应激相关水平的影响维生素D缺乏对酒精诱导的小鼠肝脏氧化应激的影响见图12、13。如图12A所示，酒精饮食引起肝脏GSH水平耗竭（P<0.05），维生素D缺乏对该效应没有影响；图12B显示，与对照组相比，酒精组MDA含量显著升高（P<0.01），而维生素D缺乏加重了酒精诱导的脂质过氧化（P<0.01）。为了进一步分析维生素D缺乏是否加重酒精诱导的肝氧化应激损伤，我们检测了肝脏中关于氧化应激酶基因的表达。图13A显示了维生素D缺乏对氧化酶基因表达的影响，可以看出喂养酒精液体饲料6周后显著上调了一氧化氮合酶（iNOS）的表达水平，并且维生素D缺乏明显加重了酒精诱导的iNOS表达水平的升高。NOX4和P67phox的mRNA水平在各组间没有差异。维生素D缺乏对抗氧化酶基因表达的影响见图13B，结果显示，酒精饮食导致小鼠肝脏GSH-Px、GSH-Rd和SOD1的mRNA水平显著升高，catalase的mRNA水平有升高趋势，而维生素D缺乏显著降低了酒精诱导的GSH-Px、SOD1和catalase表达的上调。图14显示了维生素D缺乏对小鼠肝脏氧化应激相关蛋白表达的影响，结果显示，酒精饮食明显上调细胞色素P4502E1（CYP2E1）和血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白表达水平，而且维生素D缺乏进一步上调了酒精诱导的HO-1蛋白表达水平的升高。图12维生素D缺乏对肝组织GSH和MDA含量的影响Fig12EffectsofvitaminDdeficiencyonliverGSHandMDAcontent31 安徽医科大学硕士学位论文注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。*P<0.05、**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.*P<0.05、**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH).图13维生素D缺乏对小鼠肝脏氧化应激酶基因表达的影响Fig13EffectsofvitaminDdeficiencyontheexpressionofhepaticoxidativekinasegenes注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05、##P<0.01(vsEOH)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05、##P<0.01(vsEOH).32 安徽医科大学硕士学位论文图14维生素D缺乏对小鼠肝脏氧化应激相关蛋白表达的影响Fig14EffectsofvitaminDdeficiencyontheexpressionofhepaticoxidativerelaedproteins注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.**P<0.01(vsControl);##P<0.01(vsEOH).3.8维生素D缺乏对炎性细胞因子和趋化因子表达的影响维生素D缺乏对小鼠血清中炎性细胞因子和趋化因子表达的影响见图15。结果显示，小鼠血清中TNF-α、CRP、MCP1和IL-10表达水平在各组间没有差异。33 安徽医科大学硕士学位论文图15维生素D缺乏对小鼠血清中炎性细胞因子和趋化因子表达的影响Fig15EffectsofvitaminDdeficiencyoninflammatorycytokineandchemokineexpressioninmiceserum注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.我们进一步分析了小鼠肝脏中炎性细胞因子和趋化因子mRNA表达的情况（图16），研究发现，单纯维生素D缺乏组小鼠肝脏中炎性细胞因子和趋化因子mRNA水平与对照组相比并无显著变化，而小鼠在喂养酒精液体饲料6周后，肝脏中促炎因子TNFα以及趋化因子MCP1和KC的mRNA水平均显著上调；较之EOH组，EOH+VDD组进一步显著上调了小鼠肝脏组织中促炎因子TNFα和IL1β以及TGFβ的mRNA水平，此外也进一步显著上调了趋化因子MCP1和KC的mRNA水平（图16A、B）。34 安徽医科大学硕士学位论文图16维生素D缺乏对小鼠肝脏中炎性细胞因子和趋化因子表达的影响Fig16EffectsofvitaminDdeficiencyoninflammatorycytokineandchemokineexpressioninmiceliver注：所有数据均用均值±标准误（Means±SEM）表示。*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05、##P<0.01(vsEOH)。Note:DatawereexpressedasMeans±SEM.*P<0.05、**P<0.01(vsControl);#P<0.05、##P<0.01(vsEOH).35 安徽医科大学硕士学位论文4讨论Lieber-Decarli酒精液体饲料模型[33]和胃内插管灌注酒精模型是国内外最常见的酒精性脂肪肝模型[34]，后者操作复杂，费用高而难以推广使用。Lieber-Decarli酒精液体饲料模型由Lieber等人于1963年创建[35]，该模型是让动物自主摄入含酒精的液体饲料，相对简单方便，也符合人类饮酒习惯。在本研究中，我们采用改进的含有4%(w/v)乙醇的Lieber-Decarli液体饲料连续喂养小鼠6周，为提高造模效果，各组小鼠采用2周过渡喂养法等热量喂养，这样能够保持各组小鼠能量平衡，避免营养摄入不均对实验结果造成干扰。最终我们成功建立了酒精性脂肪肝模型，表现为酒精组小鼠肝指数明显高于对照组，血清转氨酶活性、TG水平以及肝脏组织TG水平、氧化应激水平和炎性细胞因子以及趋化因子含量较正常对照组升高；肝脏病理组织形态学显示对照组小鼠肝脏细胞基本正常，而喂养酒精液体饲料组小鼠肝脏脂滴弥漫，有大量炎性细胞浸润，这些与ZoltanD等[36]以及DingRB等人[37]研究酒精性肝病的结果是一致的。血清ALT及AST的水平高低可以在一定范围内反映生物体内肝细胞的损伤程度大小[38]。本研究中，酒精组小鼠的血清ALT、AST水平与正常对照组相比明显增高，维生素D缺乏进一步升高ALT、AST水平，表明其对酒精诱导的肝损伤血清酶学有一定加重作用。关于VDD加重EOH诱导的ALT和AST升高的机制目前尚无定论，但研究发现维生素D能影响膜转运、基质稳态[39]，因此实验结果维生素D缺乏进一步升高小鼠血清ALT、AST水平可能是由于VDD损伤肝细胞膜，使肝细胞膜通透性增加，肝细胞内大量ALT泄漏进入血液所致。而且季建平等人[40]以及Trepo等[22]研究发现：ALT的升高与维生素D的缺乏具有相关性，且两者呈明显负相关。本实验结果与此一致。肝细胞损伤不仅表现为血清ALT、AST活性升高，还表现为体内清除自由基的物质，如GSH水平下降，脂质过氧化产物增多(MDA、ROS等)，因而导致细胞膜及细胞结构的破坏、膜流动性异常、肝代谢紊乱、肝功能异常、脂肪沉积，最终导致肝细胞坏死、肿胀死亡。本研究中，与酒精组相比，维生素D缺乏组小鼠肝脏系数、血清转氨酶活性、氧化应激水平和36 安徽医科大学硕士学位论文炎性细胞因子以及趋化因子含量进一步升高，加重了肝损伤。这些结果证实，维生素D缺乏能够加剧酒精性脂肪肝发病。关于VDD升高ALT与AST水平但没有加重细胞凋亡这一现象，分析可能的原因有：(1)本研究只用TUNEL法检测了细胞凋亡，没有进一步研究细胞凋亡的蛋白水平。TUNEL也有它的局限性，他只能标记中期及晚期的凋亡细胞，不能检测只发生DNA大片段断裂的凋亡细胞，也不能检测DNA断裂末端的准确数量，因为每个断裂末端结合的标记分子的数量可因不同反应动力学而不同[41]；(2)伏建峰等人[42]在慢性乙醇中毒所致大鼠肝损伤和肝细胞凋亡研究中表明乙醇诱发大鼠肝细胞凋亡与乙醇的作用时间和量均有关系，提示肝细胞凋亡程度与肝损伤的轻重密切相关。所以维生素D缺乏升高ALT、AST水平和加重肝细胞凋亡也存在时间性问题，可能在加重ALT、AST水平的时候还没有加重细胞凋亡。目前，酒精性脂肪肝的发病机制已经有了大量研究，RibeiroPS等[43]研究表明，酒精性脂肪肝的肝损伤会促发肝细胞凋亡，致使核转录因子Κb(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)激活，继而上调肝脏促炎性细胞因子（即肿瘤坏死因子α[TNF-α]，IL-1和IL17）表达。也有文献报道[44]，酒精消耗体内抗氧化酶使机体清除自由基能力降低，继而产生大量过氧化产物促发并加重氧化应激，有助于酒精性肝损伤的发生发展。还有研究发现，长期大量饮酒可阻碍机体消化吸收从食物中摄入的营养素，导致肝脂肪变性[45]。由此可见，ALD发病机制复杂，是多因素共同作用的结果，常见机制有乙醇代谢紊乱、自噬作用、氧化应激、内毒素、炎症介质、营养不良等[46-48]。当脂肪酸合成分解代谢中任何一个环节受到干扰时即可影响肝脏内脂肪的合成分解代谢，从而发生肝脏脂肪变性导致脂肪肝的形成[49]。肝脏脂肪变性有助于肝损伤的发生发展[50]，其特征在于TG浓度增加，主要由于固醇调节原件结合蛋白-1c(SREBP-1c)途经的激活导致肝脏脂肪生成增加和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)调控的脂肪酸分解代谢受损所致[51,52]。有文献报道，SREBP-1c在调控参与脂肪酸合成基因（包括FASN、ACC、SCD1和DGAT2）的转录中发挥着重要作用，而且饮用乙醇能够上调这些基因的表达[53,54]。为了阐明维生素D缺乏37 安徽医科大学硕士学位论文加重酒精性肝损伤的分子机制，我们研究了乙醇处理后脂肪酸合成相关基因mRNA表达的变化情况。研究结果显示，与正常对照组相比，酒精组小鼠肝脏中SREBP-1c的下游靶基因FASN、ACC与SCD1的基因表达水平有所降低，表明脂肪酸的合成速率比对照组下降，而维生素D缺乏也没有改变这些基因的表达。Venkatesan等人研究发现大鼠喂养乙醇1周后肝脏TG含量增加，而脂肪酸合成速率并无改变；喂养乙醇2周后脂肪合成速率却显著下降[55]。Lu等人发现慢性酒精性脂肪肝小鼠肝脏中SREBP-1c蛋白含量与对照组相比并无差异[56]。Ki等研究发现酒精性脂肪肝模型组大鼠肝脏中FASN含量较对照组显著降低[57]。这些结果提示某些模型中AFL的发生可能与SREBP-1c介导的脂肪酸合成增加无关，本研究中维生素D缺乏加重酒精性肝损伤的作用机制也不是通过增加脂肪酸合成所致。研究表明，肝脏脂肪酸氧化受损也可以导致脂肪肝发生[58]。为此我们进一步检测了脂肪酸分解途径的变化。PPARα是调控游离脂肪酸转运和氧化一系列基因转录的核激素受体[59]，CPT-1α和CPT2是肝脏长链脂肪酸β氧化的关键酶[60]，LPL、LIPE、CYP4α10和CYP4α14与肝脏脂肪酸ω氧化有关[61]。我们的研究结果显示，与对照组相比，喂养酒精液体饲料的小鼠肝脏中CPT2、LPL、LIPE、CYP4α10和CYP4α14的mRNA水平显著上调，表明脂肪酸氧化速率较对照组升高。WilliamsJA等人研究发现酒精性脂肪肝模型组小鼠肝脏中Acox1、CPT-1α和PPARα这些脂肪酸β氧化酶较对照组显著增加[62]，说明这可能是小鼠机体内一种减少酒精引起的肝脏脂肪变性的适应机制。本研究还发现维生素D缺乏进一步增强了酒精诱导的肝脏LPL和LIPE表达的上调，这可能是本研究中维生素D缺乏没有加重酒精诱导的甘油三酯含量增加的原因。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)已经被证实是一个促进肝脏脂质摄取和脂滴形成的促脂肪变性因子[63-65]。CD36是PPARγ下游的靶基因，可调控脂肪酸摄取，肝脏脂质沉积与肝脏中CD36的高表达有关[66,67]。在本研究中，乙醇暴露显著上调了CD36和反映脂肪酸摄取的基因FABP1和FABP4的mRNA水平。这与LowePP等人[68]对酒精性脂肪肝模型组小鼠肝脏中调节脂质转运和贮藏相关基因的研究结果一致。38 安徽医科大学硕士学位论文关于EOH组脂肪酸氧化分解的能力显著增强，甚至强过肝脏吸收脂肪酸能力（因为上调的参与脂肪酸氧化分解的基因数目多于参与脂肪酸吸收的基因数目），而肝脏中TG却累积升高这一结果，分析可能的原因有：(1)南月敏等人[69]研究表明肝脏TG积累会诱发线粒体β-氧化代偿性增强，所以本实验结果酒精诱导肝脏TG升高但脂肪酸氧化分解同时显著增强可能与此有关；(2)只检测了部分脂质代谢基因；(3)未研究脂质代谢相关蛋白水平。本研究血清中TG升高的机制可能与炎性因子促进机体外周脂肪分解有关，其具体机制还有待进一步研究。维生素D缺乏对酒精诱导的血清、肝脏TG升高没有影响加上脂肪酸合成分解代谢的结果可表明维生素D缺乏加重酒精性肝损伤的作用机制与脂质代谢并无直接影响。细胞色素P4502E1在乙醇代谢中发挥重要作用，其活性随着乙醇处理而增加[70]，此外，CYP2E1是乙醇诱导氧化应激和ROS产生的重要因素[71-73]。CYP2E1除了能产生氧化剂ROS外，还能上调抗氧化剂如血红素加氧酶-1(HO-1)。Downard[74]和PossK.D[75]等研究认为：HO有抗氧化作用，HO-1可作为保护性蛋白被诱导，以防御细胞的凋亡。HO-1是诱导型HO，许多因素均能引起其活性及蛋白量增加[76]。目前有关NO对HO-1的诱导产生研究较多，有文献报道指出：NO作为一种经典的信号分子，其过度合成和释放能够诱导HO-1的表达[77]。何建伟[78]研究发现，HO-1的表达水平有伴随iNOS表达增强而增强的趋势，两者之间存在正相关。Roth等研究结果表明：高脂加维生素D缺乏饮食组的肝组织Toll样受体、抵抗素、白介素及氧化应激标志物血红素氧化酶1(HO-1)的mRNA表达均显著高于高脂饮食组，研究者认为，维生素D缺乏可提高肝组织抵抗素基因表达，上调炎症和氧化应激基因[79]。本研究结果与这些研究结果一致。氧化应激通常被定义为生物系统中的促氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡[80]，当这种平衡被破坏时，就会产生大量ROS并发生脂质过氧化[71]。MDA已被用作氧化应激的一个特定生物标志，MDA含量的增加表示过氧化脂质的增多[81]。在本研究中，我们发现乙醇暴露导致MDA水平升高，维生素D缺乏进一步升高MDA水平，表明维生素D缺乏能够增强脂质过氧化能力。关于酒精诱导氧化应激显著上升的同时，抗氧化基因GSH-Px,GSH-Rd,SOD1的表达也显著增加这一结果与39 安徽医科大学硕士学位论文HuaWang等人[82]在褪黑素缓解脂多糖诱导的小鼠胎盘细胞应激反应中的研究结果LPS在下调胎盘GSH含量和升高胎盘iNOSmRNA的同时，抗氧化基因GSH-Px,Catalase,SOD的表达也显著增加有相似之处，可能与机体对抗氧化应激损伤有关，其具体机制有待进一步验证。此外，维生素D缺乏显著升高了iNOS的mRNA水平并降低了GSH-Px、SOD1和catalase抗氧化酶基因的表达水平，这表明促氧化作用可能是维生素D缺乏加重酒精性肝损伤的一种作用机制。另外，通过CYP2E1激活和氧化应激发生所产生的ROS能促进核转录因子кB(NF-кB)的激活和ERK与p38MAPK的磷酸化[83,84]。NF-кB和MAPK的激活有助于增加炎性细胞因子的表达，包括TNFα和IL6，MAPK的激活则可以增加p53的表达[85-87]。p53的活化在乙醇诱导的肝细胞凋亡中起关键作用，因为敲除p53基因能够抑制乙醇诱导的肝损伤[88]。我们的研究结果显示，酒精饮食增加了肝脏炎性细胞因子以及趋化因子的表达，而且维生素D缺乏进一步上调了肝脏促炎细胞因子和趋化因子含量，这表明肝脏炎症可能参与维生素D缺乏加重酒精性肝损伤的作用机制。本研究仍然有很多不足之处，首先，本研究只是初步做了维生素D缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响，没有对其影响机制做深入研究；其次，本研究只是对肝脏脂质代谢、肝脏炎性细胞因子和趋化因子的mRNA水平进行了初步研究，没有进一步从蛋白水平探讨，对于酒精诱导血清和肝脏脂肪酸累积增加的机制没有研究透彻；最后，本研究仅做了维生素D缺乏模型，没有在维生素D缺乏的基础上探讨维生素D补充对酒精性脂肪肝发病的影响。对于本研究的不足之处将在课题组后续的研究中逐条完善。5结论本次研究探讨了维生素D缺乏对小鼠酒精性脂肪肝发病的影响。我们最终得出：维生素D缺乏并非脂肪肝发病的直接危险因素，但维生素D缺乏加重了酒精40 安徽医科大学硕士学位论文诱导的肝损伤，其机制与脂质代谢并无直接影响，可能与维生素D缺乏促发氧化应激、释放炎性细胞因子和趋化因子诱导的肝脏炎症有关。参考文献1.WilliamsJA,ManleyS,DingWX.Newadvancesinmolecularmechanismsandemergingtherapeutictargetsinalcoholicliverdiseases.Gastroenterol.2014,20(36):12908-12933.2.郝伟,杨德森,肖水源,等.国内六地区饮酒情况及相关问题调查/普通人群的饮酒相关问题[J].中国临床心理学杂志.1998,6(3):152-179.3.SchwartzJM,ReinusJF.Prevalenceandnaturalhistoryofalcoholicliverdisease.ClinLiverDis.2012,16(4):659-666.4.BrowningJD,SzczepaniakLS,DobbinsR,etal.PrevalenceofhepaticsteatosisinanurbanpopulationintheUnitedStates:impactofethnicity.Hepatology.2004,40(6):1387-1395.5.任燚,肖庆贵,邬吉伟,等.酒精性肝病临床流调现状[J].现代保健·医学创新研究.2008,5(35):55-56.6.PosticC,GirardJ.Contributionofdenovofattyacidsynthesistohepaticsteatosisandinsulinresistance:lessonsfromgeneticallyengineeredmice.JClinInvest.2008,118(3):829-838.7.GyamfiMA,WanYJ.Pathogenesisofalcoholicliverdisease:theroleofnuclearreceptors.ExpBiolMed(Maywood).2010,235(5):547-560.8.PurohitV,GaoB,SongBJ.Molecularmechanismsofalcoholicfattyliver.AlcoholClinExpRes.2009,33(2):191-205.9.GaoB,BatallerR.Alcoholicliverdisease:pathogenesisandnewtherapeutictargets.Gastroenterology.2011,141(5):1572-1585.41 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安徽医科大学硕士学位论文附录一个人资料储兰兰，女，1991年11月出生，安徽安庆人。二教育背景2015.07-2018.07安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学硕士2010.09-2015.06吉林医药学院公共卫生学院预防医学本科三在研究生期间获奖情况2017-2018学年二等学业奖学金、校研究生奖学金和“三好研究生”称号；2016-2017学年一等学业奖学金和校研究生奖学金；2015-2016学年二等学业奖学金；四在研究生期间发表的论文及参与课题储兰兰,王妍,许猛,等.小鼠急性酒精性肝损伤模型氧化损伤指标的动态监测[J].现代预防医学.2017,44(14):2605-2608+2622.参与国家自然科学基金“维生素D缺乏加重酒精性脂肪肝发病的分子机制”（编号:81402676）。50 安徽医科大学硕士学位论文致谢三年的研究生生活一转眼就过去了。在研究生期间，我从各位老师同学身上学到了很多东西，包括学习和生活方面，亲身体会到科研的艰辛。“春满江山绿满园，桃李争春露笑颜。东西南北春常在，唯有师恩留心间。”首先我要感谢我的导师胡纯秋副教授，胡纯秋老师不仅是我的良师更是益友，在我彷徨时指点迷津，在我困惑时授业解惑以及在生活中给予的关心和帮助。在此，我向胡纯秋老师表示衷心的感谢。我还要由衷地感谢营养与食品卫生学系教研室以及给我们授课的各位老师，他们不仅让我学习到如何专心致志的钻研科学，还学习到如何为人处事。感谢课题组的每位同学以及毕业的师兄师姐，感谢许猛师兄、张志辉师兄、付林师兄、于震师兄以及王博师兄在科研和生活中给予的帮忙和鼓励以及师弟师妹们在实验过程中的协助。感谢亲爱的同学们让我在困惑时少走弯路，彷徨时不言弃，迷茫时不放弃。我还要特别感谢卫生毒理学系给我提供了如此完善的实验平台，感谢毒理学系的徐德祥教授、王华主任、陈远华老师和张程老师在课题设计中提供的指引以及实验中提供的帮助，在此，致以我最诚挚的谢意！最后我要感谢我的父母在我无助的时候给我力量，在我迷茫的时候指明方向，在我伤心的时候给我安慰，在我要放弃的时候给与鼓励，却又在我收获喜悦的时候退到背后。他们总是默默无闻的奉献着，也正是他们的付出和支持才有了今天的我。雄关漫道真如铁，而今迈步从头越。即将告别美好学校生活独自踏入社会的我，在未来的道路上，必然会遇到各种各样的艰难险阻，但不论遇到什么样的挫折，我都会勇往直前，永不停止追求的脚步，充实地过着每一天。因为我们的人生是在追求中升华，思维在努力中沉淀，心情在成功时绽放。51 安徽医科大学硕士学位论文综述维生素D缺乏在酒精性肝病发生发展中的作用【摘要】酒精性肝病（ALD）是世界范围内发病和死亡的主要原因，进展过程从脂肪肝到脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化和肝细胞癌。除了饮酒的数量和持续时间之外，许多变量在酒精性肝病的发展和进展中起作用。维生素D缺乏症和不足是一个全球性的健康问题，在工业化国家已经达到了流行病的水平，主要是与当前的生活方式和有限的饮食来源有关。有研究表明，25(OH)D严重缺乏与酒精性肝硬化患者的死亡存在联系；同时，低水平25(OH)D与ALD中肝损伤和死亡率的增加有关。这些研究结果表明维生素D可能是ALD患者严重程度的生物标志物，也是其潜在的治疗靶点。本篇综述主要从维生素D简述、酒精性肝病发病机制以及维生素D缺乏在酒精性肝病发生发展中的作用三个方面进行讨论。【关键词】维生素D缺乏酒精性肝病1维生素D概述1.1维生素D结构与来源维生素D（又称抗佝偻病维生素）是一类脂溶性固醇类维生素，有多种存在方式，最主要的有维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)，其中维生素D3更为常见。充足的阳光照射是人体获取维生素D的主要途径，经远紫外线（UVB）辐射后（290-315nm），皮肤中7-脱氢胆固醇转化为维生素D3前体，这种热力学不稳定的类固醇会经历热异构反应形成热力学稳定的维生素D3，它一旦形成就会转运到肝脏经第一次羟化生成25(OH)D，然后这种代谢物进入肾脏经第二次羟化转化为具有活性形式的骨化三醇[1,25(OH)[1-3]2D3]，骨化三醇主要通过VDR发挥其生理功能[4]。通过膳食获取的很少[5]。维生素D为顺式三烯结构，极易受到紫外线、52 安徽医科大学硕士学位论文高热、自由基等影响[6]。1.2维生素D合成与代谢在日光照射下，皮肤中的7-脱氢胆固醇转化为维生素D3前体，这种热力学不稳定的类固醇会经历热异构反应形成热力学稳定的维生素D3，这种在皮肤中产生的维生素D3100%能与维生素D结合蛋白（DBP）结合。从膳食中获得的维生素D2和维生素D3与乳糜微粒结合，通过淋巴系统运输到静脉循环，大约60%能与维生素D结合蛋白结合，而其余40%在脂蛋白结合部分迅速清除。皮肤合成或膳食摄入的维生素D可以储存在脂肪细胞中，与膳食摄入相比，皮肤合成的维生素D3在体内循环中持续时间长2~3倍。血液中的维生素D与DBP结合后转运到肝脏，经25-羟化酶转化为25(OH)D。25(OH)D由于较长的生物半衰期和较高的浓度，在血清中也很稳定，临床上常被用于测量维生素D状态，它能反映维生素D的整个内源性和外源性产物[7,8]。但它无生物活性，必须通过25-羟基维生素D-1α-羟化酶转化为具有生物活性形式的1,25(OH)2D。然后1,25(OH)2D被靶细胞吸收与靶细胞内维生素D结合蛋白（IDBP）结合转运至线粒体24-羟化酶或维生素D受体发挥生理功能[4]。过去认为维生素D只参与骨代谢，现在发现它还有抗炎、抗纤维化、抗肿瘤活性和免疫调节作用[9]。此外，维生素D还影响氧化应激、膜转运、基质稳态，还参与维持机体生长发育及调控细胞增殖、分化和凋亡[10,11]。1.3维生素D缺乏的定义维生素D缺乏和不足是一个全球性的健康问题[12-18]，全球大约有十亿人缺乏维生素D[19]。孕妇，有色人种（黑人、西班牙裔、皮肤色素增加的人），肥胖儿童及成人，很少直接暴露于阳光下的儿童及成人都是维生素D缺乏和不足的高风险人群[17,18,20]。2011年，在《内分泌学会关于维生素D的实践指南》中，维生素D缺乏被定义为25(OH)D<20ng/ml，不足为21-29ng/ml，>30ng/ml才被认为维生素D充足，这一定义得到国际骨质疏松基金会，美国临床内分泌学家和美国老年病学协会的认可[21]。53 安徽医科大学硕士学位论文2酒精性肝病发病机制长期以来，酒精被视为全球慢性病的一个主要危险因素[22]，滥用酒精已成为一个重大的公共健康问题，每年造成近250万人死亡。而人体摄入的酒精主要在肝脏内氧化代谢，长期大量摄入酒精，肝脏会受到直接毒害作用[23]，导致酒精性肝病。流行病学调查显示，ALD是一种严重危害全球公众健康的肝脏疾病，其患病率逐年上升[24]。BrowningJD等人在2004年对美国城市人口中的嗜酒人群开展了脂肪肝患病率调查，结果高达84%[25]；随着经济的发展和生活水平的提升，我国饮酒人群也日益增多，ALD发病率逐年上升，对人类健康和社会发展构成了严重威胁[26]。酒精性肝病包括无症状脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化及其相关并发症肝细胞癌。ALD发病机制复杂，是多因素共同作用的结果，常见机制有乙醇代谢紊乱、自噬作用、氧化应激、内毒素、炎症介质、营养不良等，在概念上可总结为三点：乙醇介导的肝损伤、炎症对损伤的免疫反应以及肠通透性和微生物组的变化。2.1乙醇介导的肝损伤在肝细胞中，乙醇代谢的主要途径是通过细胞质中的乙醇脱氢酶代谢成乙醛，乙醛随后被细胞质中的乙醛脱氢酶（ALDH）和线粒体中的乙醛脱氢酶（ALDH2）代谢为乙酸。但由于ALDH2相对缺乏会导致乙醛的积累，乙醛具有高度反应性，可以形成各种蛋白质和DNA加合物[27]。加合物的形成一方面会引起DNA修复蛋白功能障碍从而进一步引起肝细胞损伤与坏死，另一方面，加合物可以作为新抗原引起机体的免疫应答反应，导致肝细胞的炎性反应与坏死。乙醇代谢的次要途径涉及微粒体乙醇氧化酶系统（MEOS），长期大量饮酒，机体产生过量的活性氧导致脂质过氧化，线粒体谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸消耗。MEOS的细胞色素CYP2E1在长期饮酒过程中被诱导激活，进一步导致氧化应激和肝损伤。损伤的肝细胞释放内源性损伤相关分子模式（DAMPs），DAMPs进一步激活模式识别受体（如Toll样受体），导致无菌性炎症。其特征包括促炎细胞因子的产生，以及一种称为“炎性体”的胞质蛋白复合体将DAMP信号转化为促炎性细胞因子（例如白细54 安徽医科大学硕士学位论文胞介素-1）。随着造模时间的延长和肝组织损伤的加重，肝细胞中甘油三酯，磷脂和胆固醇酯含量逐渐增加。一项早期研究将脂肪变性归因于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸之比（NADH/NAD）增加，它能抑制线粒体中脂肪酸的β-氧化。最近的研究表明，酒精可通过其代谢物乙醛直接上调固醇调节元件结合转录因子1c(SREBP-1c)或通过内质网应激，腺苷，细菌易位和下游脂多糖（LPS）信号间接上调SREBP-1c来促进脂肪生成[28]，并下调PPAR-α的转录活性来抑制脂肪酸氧化[29]。酒精还可以间接地改变许多因素，包括低氧诱导因子-1(HIF-1)[30]，补体C3[31]，补体C1qa，ε蛋白激酶C(PKCε)[32]以及诱导型一氧化氮合酶[33]来促进脂肪变性的发展。2.2炎症对损伤的免疫反应肝脏免疫系统主要由固有免疫系统组成，其在ALD早期的无症状脂肪变性甚至在炎症发生之前就已涉及。内质网应激通过衔接分子激活干扰素调节因子3(IRF3)，单次乙醇暴露后，在炎症发生之前，IRF3就被磷酸化[34]。肝细胞特异性IRF3是线粒体凋亡途径所必需的，而枯否细胞由于IRF3缺乏仅造成轻微的肝损伤[35]。临床和实验证据显示在ALD患者体内细菌会大量繁殖、肠道通透性增加[36]，导致肠源性内毒素通过肠粘膜进入血液，随着血循环到达肝脏。进入肝脏的LPS迅速激活Kupffer细胞Toll样受体4(TLR4)，通过TLR4/MyD88和TLR4/TRIF两种信号转导途径激活NF-kB信号，上调肝脏促炎性细胞因子（即肿瘤坏死因子α[TNF-α]，IL-1和IL17）表达。酒精还会激活补体系统（C3,C4），补体和枯否细胞之间的相互作用也会导致促炎细胞因子（TNF-α）上调,继而导致肝细胞和肝星形细胞产生趋化因子造成嗜中性粒细胞聚集。适应性免疫反应也参与了ALD的免疫应答，慢性酒精导致脂质过氧化。脂质过氧化产物（如丙二醛和4-羟基壬烯醛）可形成蛋白质加合物并作为抗原激活获得性免疫水平。已经有研究表明ALD患者和动物模型发生炎症时肝脏抗脂质过氧化加合物的抗体和T细胞数目增加[29]。2.3肠通透性和微生物组的变化酒精会引起肠道微生物群的定量和定性改变。已经有许多动物模型的实验研55 安徽医科大学硕士学位论文究表明，酒精摄入会改变肠道微生物群的组成（生态失调），并导致细菌过度生长。例如，慢性乙醇喂养的小鼠显示出拟杆菌和厚壁菌类数量的下降，同时革兰氏阴性变形菌和革兰氏阳性放线菌类过度生长，病因包括小肠运动障碍和胆汁酸池改变和乙醇破坏小肠紧密连接完整性[37,38]。并且在动物模型中，通过基因突变[39]或抗生素[40]防止细菌过度生长，或者抑制非功能性TLR4(LPS受体)的表达[41]都能减轻酒精引起的肝损伤。对人群的研究也显示了类似的结果，伴有或不伴有ALD的慢性酒精中毒患者有一个“泄漏的肠道”，血浆内毒素水平高于健康对照组[42]。Bode等报道，与对照组相比，慢性酒精中毒患者的小肠细菌过度生长的患病率显著升高[43]，这一结果也得到了其他研究的进一步证实[44,45]。酒精除了引起小肠细菌过度生长，还能诱导人类肠道的菌群失调，尽管微生物群的变化模式仍然存在争议[46-48]。目前已经提出了酒精引起的肠道微生物群变化的几种可能原因，包括降低胃肠动力和通过酒精抑制先天性和获得性免疫力，但是具体的机制尚未完全阐明。3维生素D缺乏与酒精性肝病关于NAFLD患者维生素D缺乏有很多报道，但研究表明ALD与维生素D缺乏也高度相关。科学研究显示，大约有66%的中度失代偿性肝硬化患者、96%等待肝移植患者和91%慢性非胆汁淤积性肝病患者都表现为维生素D缺乏[49,50]。最近的一项研究显示，90%的酒精性肝硬化患者维生素D不足，Child-PughC级肝硬化患者血清维生素D水平最低[51],而且发现维生素D缺乏是酒精性肝硬化患者肝功能减退表现而不是引起肝脏疾病的病因[52]。关于酒精对维生素D代谢的影响，有研究认为酒精诱导的肝损伤可能降低了维生素D结合蛋白的水平，并降低肝脏将维生素D羟化成其活性形式的能力[53,54]。另外，Trepo等[55]研究发现酒精性肝病患者血清25(OH)D水平随着体内ALT、AST活性和肝静脉压力梯度的升高而减少，而且还发现长时间维生素D缺乏或不足能够增加ALD患者的肝损伤，并且经1,25(OH)2D3治疗后能够抑制酒精诱导的肝脏TNF-α高表达，因此推断25(OH)D56 安徽医科大学硕士学位论文关系着ALD患者的预后，给ALD患者补充维生素D十分有必要。而且已经有研究表明，维生素D缺乏通过上调肝脏炎症基因的表达加剧了大鼠NAFLD的发生[56]。然而，也有一些研究发现饮酒量与维生素D水平之间存在正相关[53,57-59]，但导致这一研究结果的机制尚不清楚[53,60-61]，有研究者认为是酒精抑制了负责将血清25(OH)D转化为1,25(OH)2D的甲状旁腺激素分泌，从而提高了可被测量的血清25(OH)D水平，但这种可能性机制具有很强的推测性[61]。其他研究发现酒精摄入量与维生素D水平无显著关联[62]。因此，关于酒精是否会削弱维生素D的吸收或抑制25(OH)D羟化合成内源性活性维生素D仍然存在争议。维生素D可能通过调节ALD患者体内T调节细胞来调控早期免疫反应，也可能通过调节酒精代谢的基因。最近的一项研究结果表明，酒精分解代谢异常和肝脏甘油三酯沉积可能是维生素D缺乏所致的结果[63]。维生素D不仅被证实在人类骨骼健康中的重要性，而且还有其他健康益处，包括降低CLD的风险或进展[64]。维生素D活性形式通过直接或间接调节细胞增殖、分化、细胞凋亡和血管生成调控200多种基因的表达[65,66]。Anty等[67]在以酒精性肝硬化患者为主的队列研究中发现，25(OH)D严重缺乏独立于Child-Pugh评分增加了细菌感染的风险。随后又发现维生素D缺乏与酒精性肝病患者的脂肪性肝炎（ASH）发生有关，这些患者多数有维生素D严重缺乏和桥接纤维化[68]。4总结充足的阳光照射是人体获取维生素D的主要途径，从膳食中获取的很少。体内维生素D在肝脏和肾脏依次代谢为主要循环形式的25(OH)D和具有生物活性形式的1,25(OH)2D。25(OH)D由于较长的生物半衰期，其血清含量常被用于评价人体维生素D营养状况。1,25(OH)2D与维生素D受体结合发挥生物学效应，而体内大多数细胞和器官都有维生素D受体，因此1,25(OH)2D可影响很多生物学途径。但随着经济的迅速发展和生活方式的改变，加上人们对合理阳光照射的重要性缺57 安徽医科大学硕士学位论文乏认识，人们户外活动时间日趋减少，导致维生素D缺乏者日益增多。酒精性肝病患者常表现为维生素D缺乏，维生素D缺乏也可能是ALD发病的辅助因素，并且酒精性肝病患者维生素D缺乏可能与预后不良有关。但维生素D作用于ALD的机制尚不清楚，可能通过与维生素D受体结合后抑制肝内脂肪生成，促进脂肪酸氧化，发挥抗炎抗纤维化等生物学效应，其分子机制需要进一步深入研究。参考文献1.HolickMF.VitaminDdeficiency.NEnglJMed.2007,357(3):266-281.2.Hossein-nezhadA,HolickMF.VitaminDforhealth:aglobalperspective.MayoClinProc.2013,88(7):720-755.3.WackerM,HolickMF.SunlightandVitaminD:aglobalperspectiveforhealth.Dermatoendocrinol.2013,5(1):51-108.4.LoganVF,GrayAR,PeddieMC,etal.Long-termvitaminD3supplementationismoreeffectivethanvitaminD2inmaintainingserum25-hydroxyvitaminDstatusoverthewintermonths.BrJNutr.2013,109(6):1082-1088.5.KitsonMT,RobertsSK.D-liveringthemessage:theimportanceofvitaminDstatusinchronicliverdisease.JHepatol.2012,57(4):897-909.6.HollisBW.Measuring25-hydroxyvitaminDinaclinicalenvironment:challengesandneeds.AmJClinNutr.2008,88(2):507S-510S.7.ShuL,WangXQ,WangSF,etal.Dietarypatternsandstomachcancer:ameta-analysis.NutrCancer.2013,65(8):1105-1115.8.ZittermannA,ProkopS.TheroleofvitaminDforcardiovasculardiseaseandoverallmortality.AdvExpMedBiol.2014,810:106-119.9.ReddyKK.VitaminDmetabolites,vitaminDlevelandbasalcellcarcinoma,squamouscellcarcinoma,andmelanomarisk.JInvestDermatol.2013,58 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