戊型肝炎病毒(HEV)组成和结构的分析及其ORF2蛋白在昆虫细胞中表达的研究

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中文摘要戊型肝炎（HepatitisE，HE）是一种由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)引起的一种急性、自限性病毒性肝炎，其临床症状与甲型肝炎相似，但最近报道HEV在免疫缺陷或免疫抑制状态可引起慢性肝炎。HEV的传播途径主要是粪-口传播，常见方式是通过污染的水源和食物。我国是HEV的流行区，HE占我国急性病毒性肝炎10%左右，病死率为1.4％－5.3％，在孕妇中的病死率可达20％，这些数据证明，对戊肝的研究和防治是势在必行的。本论文包括了两部分研究内容，第一部分是通过对不同来源的HEV病毒进行比较分析，及细胞培养上清中HEV病毒结构蛋白的分析来探索HEV病毒的结构及组成蛋白；第二部分是应用昆虫细胞表达体系对HEVVLP的表达、提取进行优化，评价此条件下制备的HEVVLP的理化性质，纯度和免疫原性，进而为HEVVLP疫苗的生产制备奠定基础。一、HEV组成和结构的分析由于现有技术无法获取足够含量的HEV病毒，各研究团队通过HEV结构蛋白在体外表达和感染性克隆这两种手段对HEV的结构进行了研究。目前对结构蛋白（ORF2、ORF3蛋白）的研究认为，ORF2蛋白为衣壳蛋白，缠绕并保护HEVRNA，形成病毒颗粒；ORF3蛋白的功能主要是介导病毒出胞，Emerson等人认为ORF3蛋白除此作用外，可能对病毒在细胞间的传播也起到了一定作用。对病毒结构的研究认为：不同来源的病毒具有不同的结构，细胞培养上清中的HEV和血液中的HEV具有相似的结构：ORF2与RNA结合形成核蛋白，ORF3蛋白位于核蛋白表面介导出胞，出胞时病毒盗取细胞的脂膜覆盖于表面；粪便中的HEV病毒由于在排泄过程中，经过胆汁和消化道中各种酶的作用，病毒表面没有ORF3蛋白和脂膜的覆盖。虽然目前对病毒的结构蛋白和结构有一定的认识，由于没有得到足够含量的HEV病毒进行分析，所以对于病毒颗粒中ORF2蛋白是否为糖蛋白还没能达成共识；细胞培养体系中的病毒颗粒表面的脂膜上是否存在有ORF3蛋白，各研究团队也存在争议；同时，病毒在细胞间传播时，结构蛋白和脂膜对于病毒和细胞结合的影响也没有相关的研究。I 本实验室建立了有效的HEV培养体系，在此基础上，通过超速离心和亲和层析等方法，对体系中病毒颗粒进行了提取和分析，并与粪便中的病毒颗粒进行了比较，确定了培养体系中病毒颗粒表面脂膜的存在。研究结果表明，两种不同来源的HEV在超离纯化时，病毒RNA和ORF2蛋白分别富集于不同的超离层，通过PLC/PRF/5细胞的培养检测体系对各超离层的复制能力进行检测，结果显示，病毒的复制能力与超离层中RNA的含量呈现正相关性，这一结果提示细胞培养上清和粪便中大部分的ORF2蛋白并未结合RNA组装形成病毒颗粒，而是以非颗粒的形式出现在超离的顶层，不具有病毒复制能力。进一步对病毒颗粒所在超离层的密度进行比较发现，不同来源的病毒颗粒在超离中具有不同的沉降速率，而细胞来源的病毒颗粒在脱脂后，沉降速率与粪便中的病毒颗粒沉降速率一致，这一结果表明，细胞培养上清中的病毒颗粒的表面包裹有脂膜。研究进一步对培养系统中的病毒颗粒和ORF2蛋白分别进行分析。研究对培养体系中病毒颗粒在脱脂处理前后与ORF3抗体的亲和能力进行了比较，结果显示脂膜表面仅有少量ORF3蛋白的存在。细胞来源的病毒颗粒在脱脂前与ORF3抗体的亲和率仅为3%，脱脂后升至20%；粪便来源的病毒颗粒脱脂前后没有变化，均为0.03%，说明在细胞来源的病毒表面上，只有少量ORF3蛋白存在于脂膜的表面，粪便来源的病毒表面既没有脂膜的存在，也没有ORF3蛋白的存在。对病毒脱脂和脱ORF3处理前后与细胞结合率进行的比较发现，细胞来源的病毒在脱脂前后与细胞的结合速率在72小时内没有明显变化，而脱去脂膜和ORF3蛋白的细胞来源的病毒和粪便来源的病毒与细胞结合的速率均明显增高。该结果表明，脂膜对病毒与PLC/PRF/5细胞的结合没有影响，而ORF3蛋白则阻碍了这种结合。研究同时对体系中的ORF2蛋白进行了提取和分析，评价了其组装形成病毒颗粒的可能性。通过对ORF2蛋白的分析发现，病毒培养体系中的ORF2蛋白是以糖基化形式存在的88kDa的蛋白，能够结合RNA，并形成RNA-ORF2蛋白复合物。复合物具有一定的结构，能够在超离过程中表现与粪便病毒颗粒相似的沉降速率，这一结果提示，糖基化的88kDa的ORF2蛋白可能是HEV病毒颗粒的组成蛋白。II 二、ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达对天然HEV电镜观察发现：HEV为无胞膜的球形病毒颗粒，90%的颗粒直径为27-34nm。而对HEVVLP的研究表明，它也具有颗粒样的球形结构，电镜观察显示其直径约为27nm，即HEVVLP结构在形态上具有和天然病毒颗粒相似的形态；同时颗粒性结构使VLP在对机体进行免疫时有更强的免疫原性，所以HEVVLP有可能成为更好HEV疫苗。研究将4型HEVORF2蛋白的126-621aa序列构建于杆状病毒表达载体上，进一步大量感染昆虫细胞后，优化HEVVLP的表达条件，摸索VLP的纯化工艺，并对此工艺条件下制备的VLP进行评价，考察VLP成为候选疫苗，进一步扩大生产的可能性。本研究将构建成功的4型Bacmid-HEVORF2126-621aa大量感染昆虫细胞，表达HEVVLP。考察病毒感染复数（MOI）、收获时间和感染时细胞浓度等参数对HEVVLP形成的影响，发现在MOI=5，细胞浓度为2.0×106cells/ml时，攻毒后120小时的时候收获细胞，VLP可达到最大收获量，达到0.072mg/ml。研究在对HEVVLP的表达进行监测时发现，ORF2-126-621在昆虫细胞中进行表达时以两种形式出现，VLP颗粒和非VLP蛋白，由于非VLP蛋白没有颗粒性，会降低VLP的免疫原性，所以在表达工艺的优化时减少非VLP的形成，在纯化制备中去除非VLP蛋白。为了分离纯化HEVVLP，利用超声法将细胞破碎，高速离心去除细胞碎片，将混合有非VLP蛋白的细胞裂解液进行超离纯化，超离有效去除没有组装形成VLP结构的非VLP蛋白。为了将样品溶液中高浓度蔗糖去除并为VLP的柱层析纯化做准备，将超离后收获的样品对柱层析的上样缓冲液进行透析，同时在此过程中添加固定剂对VLP进行固定。将处理后的样品进行阴离子交换层析分离，研究发现，阴离子交换介质ANXSepheroseFF能够有效的实现对HEVVLP的分离纯化，经此步骤纯化制备的HEVVLP的电泳纯度由40.4%提高至97.7%，初步达到了精制分离的纯化要求，研究进一步采用了与精制纯化不同分离原理的分析手段（SEC-HPLC）对样品进行了分析，分析结果表明，经此方法制备的HEVVLP纯度达到100%。研究对经过上述优化后的表达和纯化工艺制备的HEVVLP进行了理化性质、纯度和免疫原性的评价，评价表明经此步骤制备的HEVVLP初步具备了HEV候选疫苗的条件，有进一步扩大生产的可能性。III 综上所述，研究首先对不同来源的HEV病毒结构和组成成分进行了分析，并对各组成成分对病毒与细胞结合速率的影响进行了研究。在此基础上，应用昆虫细胞表达系统对HEVORF2蛋白进行了表达，优化了HEVVLP的表达和纯化条件，并对经此步骤制备的VLP进行了初步评价，为研制HEVVLP疫苗奠定基础。本研究首次明确了细胞培养产生的HEV病毒颗粒表面仅有少量ORF3蛋白的存在；确定了ORF3蛋白对病毒与PLC/PRF/5细胞结合有阻碍作用，而脂膜对二者结合没有影响；研究首次提出糖基化的ORF2蛋白可能是病毒颗粒中衣壳蛋白的存在形式；另外，本研究还建立了适合于放大至生产规模的HEVVLP的表达、纯化及评价体系。关键词：HEV病毒，ORF2蛋白，脂膜，VLP，VLP表达，纯化。IV AbstractHepatitisE（HE）wascausedbyhepatitisEvirus,whichistransmittedwithcontaminativewaterandfoodbyfecally-orally.TheclinicalsymptomofHEwassimilartoHA.ChinaistheHEendemicarea.ThepercentageofacuteHEinacuteviralhepatitiswas10%andthefatalityratewas1.4-5.3%.ThedatawasshownthatthepreventionofHEVwasimportant.Thestudyhastwoparts,partonewastheanalysisandcomparisonofHEVfromdifferentsource,thenthecompsitionofviruswasanalyzed;parttwowastheexpression,purificationandcharacterizationofHEVVLPproducedininsectcells.PartOne:TheabsenceofenoughHEVhampereddetailedanalysisofthestructureandproteincompositionofthehepatitisEvirion.ThestudyofHEVwasmainlybasedontwoapproaches:thetransfectionofinfectiousHEVcDNAclonesandtheexpressionofindividualviralproteins.ThestudyofHEVstructureprotein(ORF2andORF3protein)shownthatORF2canbindRNAandassembleintoHEV;ORF3proteinreleaseHEVfrominfectedcells.EmersonalsospeculatedORF3proteinimprovethevirusinfectofcelltocell.ThestudyaboutHEVstructureshownthatthevirionfromdifferentsourcehavedifferentstructure.Thevirusfromcellculturesupernatantandserumhavesimilarstructure,ORF2proteinbindRNAandORF3proteinisresponsibleforvirusegresscellsonthesurface,thevirussteallipidwhentheyreleasedintosupernatent.ThevirusfromfeceshavenoORF3orlipidonthesurfacebecauseofthedigestionofbileandenzymeofdigestivetract.However,thereweresomequestionsaboutHEVstillremainunknown,suchastheformofORF2proteinintheviruswasnotconfirmed,whetherORF3proteinisonthesurfaceofvirusfromcellculturesupernatant,whatistheeffectofORF3proteinandlipidonbindingofvirustocell.Inthisstudy,hepatitisEvirusfromarobustHEVcellculturesystemwasproduced.Thenthevirusfromculturesupernatantandfromthefecesofinfectedmonkeysatthepeakofvirusexcretionwerepurifiedbyultra-centrifugation.ThecommonfeatureofthetwosamplesafterultracentrifugationwasthattheORF2proteinwasseparatedfromtheHEVRNA.AndtheHEVinfectivitywasvariedbyHEVRNAcontentoffractionsafterultracentrifugatin.ThiswasmeanthatmostORF2proteinwasnotformedthevirusparticleandwasinthenon-VLPform.ThedensityofRNA-richparticlesfromfecesandfromtheculturesupernatantweredifferent.AftertreatmentofthesampleswithV NP40toremovelipid,thedensityoftheparticlesfromthecellculturesupernatantwassametothedensityofthosefromfeces.Thissuggeststhatthevirusinthecellculturesupernatantwasenvelopedwithlipidandbandedatalowerdensity.3%ofvirionsfromthecellculturewerecapturedbythebeadsboundwithanti-ORF3proteinMAbandthisincreasedto20%aftertreatmentwithNP40.Thisthendecreasedto1.2%aftertreatmentwithNP40,2-MEandpronaseE.ThissuggestedthattheORF3proteinonthevirussurfacewascoveredinlipidandtherewaslittleORF3proteinonthelipidsurface.However,thepercentageofRNAcapturedfromthevirionsfromthefeceswas0.3%,withandwithouttreatmentwithNP40.ThiswasindicatestherewasverylittleORF3proteinonthesurfaceofthevirionsfromfeces.Thevirions,withorwithoutthesetreatmentswereincubatedwithcellstoanalyzetheinfluenceoflipidandORF3proteinonbindingtothecells.ThevirionsfromfecesandthevirionswithoutORF3proteinshowthestrongestbinding,thebindingcapacityofthevirionsbeforeandafterdelipidationwassimilarbutwaslowerthanthevirionsfromfecesandthosewithoutORF3protein.ThisimpliesthatthelipidonthesurfacehasnoinfluenceonthebindingofthevirionstocellsbuttheORF3proteininterfereswithbinding.WefoundthattheORF2proteinfromcellculturesystemwasglycosylated,withanapparentmolecularweightof88kDa,andwasnotinfectiousinPLC/PRF/5cells.TheORF2proteininthispartcanbindtoandprotectHEVRNAfromdigestionbyRNaseA.TheRNA-ORF2producthasasimilarsedimentationcoefficienttothevirusfromfeces.TheresultsuggestedthattheORF2proteincapturedfromcellculturesupernatantmaybethecapsidproteinofnativeHEV.Parttwo:ThenativeHEVwassphericalparticleswithoutenvelopeobservedusingEM.Theviralsizewas27-34nm.ThesizeofHEVVLPwas27nmandtheparticlewasalsospherical.ThiswasmeanthattheVLPissimilartonativeHEVinmorphology.ThegranularstructuremakesVLPhavemoreimmunogenicinimmunetobody.TheVLPisbetterthannon-VLPinimmunogeniceffectiveasHEVvaccinecadidate.Thestudyconstructedthe126-621aaof4genotypeHEVORF2inORF2-rAcNPV.ThentheHEVVLPwasexpressedininfectedsf9cells.TheconditionofexpresstionandpurificationofVLPwasoptimized,theVLPproducedusingtheschemewasevaluatedasvaccinecandidate.VI Theinfectionofexpressparameters,MOI,VLPharvesttimeandcellconcentration,wasinvestigatedaftertheinsectcellswasinfectedwithORF2-rAcNPV.WefoundHEV6VLPsproductioninthecellsreachedthemaximumat120hpiwithMOI=5and2.0×10cells/ml.ThemaximumyieldofVLPwasupto0.072mg/ml.Twoforms,VLPandnon-VLP,werefoundinthesf9cellswhentheORF2126-621aawasexpressedinthecells.Thenon-VLPwillreducetheproductionimmunityonaccountofitsnongranularity.Sotheproductionofnon-VLPshouldbedecreaseddurigtheexpressionoptimizationandberemovedduringtheVLPpurifacationbecauseitwillreducetheproductionimmunity.InordertoseperateandpurifyHEVVLPfromthenon-VLPandcellimpurities,thestudyusetheultrasonicmethodtolysatesf9cellsandthenthecentrifugationwasusedtoremovethecelldebris.Theultracentrifugationwasusedtoremovethenon-VLPfromtheproductionofcelllysate.ThesamplewasdialyzedtoloadingbufferofANXSepheroseFFtoremovethehighconcentrationsucroseaftertheultracentrifugationandtheVLPwasalsofixationduringthedialyzeprocess.ThedialyzedsamplewaspurifiedusingANXSepheroseFFandtheVLPwasseparatedfromotherimpurities.TheresultwasshownthattheVLPpuritywasincreasedfrom40.4%to97.7%usingSDS-PAGEandthepuritywas100%usingSEC-HPLCaftertheANXSepheroseFF.ThenweanalyzedandevaluatedtheVLPphysicochemicalproperty,purificationandimmunoresponseinmice.TheresultshowedthattheHEVVLPacquiredfromschemehashighpurityandstrongimmunoresponse.TheresultsuggestedthatweestablishedasimpleandefficientproductionofHEVVLPexpressionandpurificationscheme.ThispartstudyproducedthepreliminaryresearchforfurtherindustrializedproductionofHEVvaccine.Insummary,thestructureandcompositionofHEVfromdifferentsourcewasanalyzed.Theeffectonvirusbindingtocellsofthecompositionwasdetectedusingcellbindingassay.Ontheotherhand,thecapsidproteinwasexpressedusinginsectcell.ThentheVLPwaspruductedandpurifiredastheHEVvaccinecandidate.ThestudyfirstanalysistheORF3contentonthesurfaceofHEVfromcellculturesupernatant,ORF3proteinobstructthebindingeffectofvirustocellbutlipidhavenoinflunceonbindingeffect,theresultofstudyalsofirstsuggestedthattheglycosylateORF2proteinmaybethecapsidproteininHEVparticle.ThestudyalsooptimizedtheVII schemeofHEVVLPexpressionandpurification,andthenevaluatedtheVLPproducedusingthescheme.Keywords：HEV,ORF2protein,lipid,VLP,expression,purification.VIII 目录中文摘要.....................................................................................................IAbstract.....................................................................................................V第1章前言........................................................................................11.1戊型肝炎病毒的分子生物学特征.............................................11.2HEV的结构蛋白........................................................................21.3戊肝病毒结构.............................................................................41.4HEV疫苗..................................................................................121.5论文设计...................................................................................19第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析..............232.1实验材料...................................................................................232.1.1细胞系..............................................................................232.1.2细胞培养所需溶液..........................................................232.1.3HEV病毒：.....................................................................232.1.4主要材料，试剂和溶液配制..........................................232.2实验方法...................................................................................252.2.1细胞培养..........................................................................252.2.2细胞培养上清中的病毒液的超滤浓缩..........................252.2.3HEV病毒的纯化.............................................................252.2.4病毒的裂解变性：..........................................................262.2.5变性后ORF2蛋白的检测：..........................................262.2.6病毒RNA含量的检测：...............................................272.2.7检测各个超离层的感染性：..........................................272.2.8病毒表面脂膜和ORF3蛋白的去除..............................282.2.9不同病毒样品与PLC/PRF/5细胞的结合性实验.........282.2.10亲和层析提取ORF2蛋白和HEV病毒......................282.2.11用ORF3单抗进行的免疫捕获....................................29I 2.2.12提取ORF2蛋白的检测................................................292.2.13ORF2蛋白和HEVRNA的自组装.............................302.2.14、自组装样品的透射电镜检测........................................302.3实验结果...................................................................................312.4讨论...........................................................................................382.5小结...........................................................................................43第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达......................453.1实验材料...................................................................................453.1.1细胞系..............................................................................453.1.2细胞培养所需溶液..........................................................453,1,3主要材料，试剂和溶液配制..........................................453.2实验方法...................................................................................473.2.1细胞培养..........................................................................473.2.2杆状病毒pfu检测..........................................................473.2.3VLP表达参数的优化.....................................................483.2.4蔗糖密度梯度层的制备及HEVVLP的初步提取.......493.2.5HEVVLP的柱层析纯化................................................493.2.6样品分子量检测..............................................................503.2.7样品的糖染色..................................................................503.2.8等电点的检测..................................................................503.2.9肽图检测..........................................................................513.2.10样品纯度检测................................................................513.2.11样品颗粒性的检测........................................................513.2.12铝结合率检测................................................................523.2.13免疫原性检测................................................................523.3实验结果：...............................................................................533.3.1HEVVLPs表达参数的优化..........................................533.3.2HEVVLPs分离纯化工艺摸索......................................583.3.3HEVVLPs评价体系的初步建立..................................60II 3.4讨论：.......................................................................................693.5小结..............................................................................................72结论......................................................................................................73参考文献..................................................................................................75个人简历..................................................................................................85主要学习经历..........................................................................................85后记和致谢..............................................................................................87III 缩略词（Abbreviation）HEHepatitisE戊型肝炎（戊肝）HEVHepatitisEvirus戊型肝炎病毒ORFOpenReadingFrame开放读码框架VLP(s)Viral-LikeParticle(s)类病毒颗粒PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应Real-timePCR实时荧光PCRRT-PCRReversetranscriptasepolymerasechainreaction反转录聚合酶链式反应BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白DMSODimethylsulfoxide二甲亚砜DTT1,4-Dithiothreitol二硫苏糖醇FBSFetalBovineSerum胎牛血清EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸Tris三羟甲基氨基甲烷NP40NonidetP40乙基苯基聚乙二醇PronaseE链丝菌蛋白酶RNaseARibonucleaseA核糖核酸酶AEGTAEthylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraaceticacid乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸BCAbicinchoninicacid聚氰基丙烯酸正丁酯PVDFPoly(vinylidenefluoride)聚偏氟乙烯MAbmonoclonalAb单克隆抗体WBWesternBlot蛋白质印迹SDS-PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳TMB3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine3,3',5,5'-四甲基联苯胺Pfuplaqueformingunit噬斑形成单位I MOImultiplicityofinfection感染复数TPCKtosyl-phenylalaninechloromethyl-ketoneL-1（对-甲苯磺酰）苯丙胺酰氯甲酮II 第1章前言第1章前言戊型肝炎（HepatitisE，HE）是一种由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)引起的一种病毒性肝炎，临床症状与甲型肝炎相似，以往被称为非甲非乙型肝炎。1955-1956年，在印度新德里发生了一场急性病毒性肝炎，感染人数达29000人，虽然人们开始认为是甲型肝炎的流行，但后来的回顾性血清检测表明这是一种新[1]的感染性病原体。这种疾病第一次在印度半岛被描述为非甲非乙型肝炎。1983年，Balayan等首次用免疫电镜从志愿者的粪便中观察到了戊肝病毒颗粒，在1989年的东京国际会议上正式命名为戊型肝炎病毒。1990年Reyes等首先获得HEV[2]的全基因，由此开始了对戊型肝炎病毒的全面研究。戊型肝炎的临床症状与甲型肝炎相似，传播途径主要是粪-口传播，常见方式是通过污染水源和食物，大的爆发流行主要发生在不发达、卫生条件差的国家。[3]人对HEV易感，发病重，病死率高，病死率为1.4％－5.3％，而孕妇中的病死[4,5]率可达20％。我国自1982年起就有关于戊型肝炎的报道,最大的一次暴发流行为1986～1988年新疆南部地区戊型肝炎流行，共计感染119,280例，死亡707[6]例。随后我国报道了多起散发流行，而且也在猪群中分离出HEV基因序列，并发现同一地区分离出的人与猪的HEV序列有相关性,说明猪是HEV的宿主之一[7-10]。随着HEV在猪、野猪、野鹿、鸡、兔子，大鼠等动物体内发现感染和复制，[11-15]以及接触人的感染，戊肝作为一种人畜共患病已经是不争的事实。同时，近[16-19]年来对戊型肝炎由血源性传播引起的病例也屡有发现。这些都说明，对戊型肝炎的研究和防治是势在必行的。1.1戊型肝炎病毒的分子生物学特征1983年，Balayan等首次用免疫电镜的手段观察到了HEV颗粒，研究者在电镜的观察中发现，HEV颗粒与甲肝病毒(HepatitisAvirus，HAV)颗粒形态相似，为二十面体的病毒颗粒，所以将HEV归类为小RNA病毒。但是，在1990年Reyes[2]等首先获得HEV的全基因克隆，并成功获得了HEV的序列后，发现HEV的核苷酸序列与小RNA病毒有很大不同。由于HEV在电镜形态上与诺沃克样病毒1 吉林大学博士学位论文具有相似性，所以又将HEV划归于杯状病毒科，设立单独的嗜肝病毒属。在后来的对HEV非结构基因的分析显示，HEV也不同于杯状病毒，分类学地位不能确定，于是在国际病毒分类学委员会第7次报告会上HEV被单独划为“戊型肝炎样病毒（”HepatitisE-likeviruses）。第8次国际病毒分类学委员会报告会上将HEV的分类地位最终确定为戊型肝炎病毒科（HepeviridaeFamily）戊型肝炎病毒属（HepevirusGenus）。HEV的分型有基因型和血清型两种方法。从基因型上区分，HEV有五种基因型，但能够在人群中传播的只有4种基因型，分别命名为1-4型。虽然有几种基因型的存在，但各基因型之间的ORF2氨基酸序列具有高度同源性，动物交叉保护[20-22]实验及不同基因型抗原血清一致性研究表明这些病毒株为同一血清型。所以HEV虽然有几种基因型，但是只有一种血清型，这也为HEV疫苗的研发提供了有利条件。通过对我国二十五年来的人与动物戊肝病毒基因序列的分析发现：前15年所报道的HEV均为1型，随后发现了4型，近10年来，4型HEV已经取代1型HEV成为我国的主要流行亚型，且病毒在人猪之间的传播是普遍存在的，在我国防治戊型肝炎的传播是非常必要的。1.2HEV的结构蛋白HEV为单链，正义RNA病毒，基因长度为7.2Kb，在5′端和3′端都含有一段短的UTRs（untranslatedregions）区。5′端的为帽子结构，3′端含有polyA尾，HEV的编码区有3个开放读码框组成，分别为ORF1、ORF2和ORF3。其中，ORF1编码非结构蛋白，如甲基转移酶，木瓜酶样丝氨酸蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶等；ORF2和ORF3主要编码结构蛋白，其中ORF2蛋白编码衣壳蛋白，与病毒的组装有关，而ORF3蛋白通过感染性克隆的研究，确定其功能主要与病毒出胞相关。2 第1章前言Figure1.1HEV基因组成ORF2蛋白：ORF2蛋白为病毒的衣壳蛋白，含有660个氨基酸。四种基因型[23]的氨基酸同源性超过85%。同其他无包膜病毒相比，它的衣壳蛋白的N末端含有一段信号肽序列，在其后面为一段富含精氨酸的区域，由于精氨酸的侧基是一个胍基。而这个胍基的pKa为12.48，在中性、酸性或碱性的环境下都是正电荷，所以易于结合RNA，在理论上是适合RNA结合的区域。ORF2蛋白含有三个N糖的位点（N137，N310，N562），同时这三个位点在序列中也是高度保守的。Figure1.2ORF2蛋白的功能区域[24]对ORF2蛋白在哺乳细胞中的表达，Jameel等研究认为：在哺乳动物细胞中，3 吉林大学博士学位论文它先表达为82Kd的前体蛋白，而后变为74Kd的蛋白，糖基化修饰后变为88Kd[25]的成熟蛋白。但是，Torresi等对ORF2蛋白在哺乳动物细胞中表达时，通过分析ORF2蛋白在胞质和胞膜中的分布，以及分布随时间的变化时发现，胞质中分布的主要是非糖基化的ORF2蛋白，而胞膜上分布的主要是糖基化的ORF2蛋白，这一现象表明，糖基化的ORF2蛋白不能和RNA结合并组装成病毒的，仅仅是这种异源性蛋白在细胞中的非天然表达。对天然病毒中ORF2蛋白的表现形式，主要的观点认为它是大小为75kDa的蛋白。Takashi等人通过感染性克隆的突变研究认为[26]，ORF2蛋白C末端的52个氨基酸在细胞表达的天然病毒中是存在的，同时研究认为，病毒中的ORF2蛋白是75kDa大小的蛋白。而Emerson等人通过对ORF2蛋白在肝细胞系中表达的[27]研究认为，ORF2蛋白能够缠绕并携带RNA感染其它细胞，同时研究也认为，ORF2蛋白在肝细胞中表达为75kDa大小的蛋白。由于HEV的VLP结构只有在昆虫细胞的表达体系中才能表达形成，所以对ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达研究的较为透彻。昆虫细胞表达的ORF2蛋白对蛋[28,29]白酶很敏感，表达时会裂解为几个不同分子量的片段。同时，要在昆虫细胞中形成VLP颗粒，表达的蛋白长度是有要求的，要组装成T=1的VLP，必须要去[30]除N端的精氨酸富含区和C末端的部分区域。而Li等人发现一段截短的、分子量为64kDa的蛋白能够自组装成为T=3的VLP颗粒，同时研究认为病毒RNA的[31]存在对天然病毒的组装至关重要。ORF3蛋白：ORF3蛋白包含114个氨基酸。通过对ORF3蛋白的表达发现，ORF3蛋白是分子量为13kDa、含有磷酸化修饰的蛋白。酵母双杂交的结果显示磷[32]酸化的ORF3蛋白与非糖基化的ORF2蛋白能够相互作用。而ORF3蛋白中含有富含脯氨酸的结构域，ORF3的C端含有保守的PXXP基序。而这段序列能够启动ESCRT(endosomalsortingcomplexrequiredfortransport)体系中的相关蛋白，如[33]TSG101。在以MVBs形式进行病毒出胞的活动中，ESCRT体系起到了十分重要的作用。1.3戊肝病毒结构研究者对HEV结构和组成的认知是经历了一个漫长的过程。对HEV病毒的4 第1章前言认识首先是通过免疫电镜观察，而后是通过对ORF2蛋白在昆虫细胞中形成的VLP的结构分析推测出天然病毒的结构，随着技术的成熟，对不同来源的病毒组成及其结构有了更多的认知。1.3.1.免疫电镜下的病毒结构最初对HEV的认知主要是通过免疫电镜完成的，由于HEV无论是临床症状还是在传播途径，都与甲肝病毒（HepatitisAvirus，HAV）相似，早期对HEV的结构和形态的探索，主要集中在HEV与HAV阳性血清间的区别和HEV在免疫电镜下的观察结果。在早期对天然病毒的研究中，研究的HEV病毒主要来源于粪便。Balayan等人于1983年从一个通过粪口途径自愿感染非甲非乙型肝炎的志愿[34]者的排泄物中分离了病毒颗粒，并在电镜下观察到了HEV颗粒。HEV为无包膜的球形病毒颗粒，其在CsCl中的密度为1.35g/cm3。[35]Sreenivasan等人（1984）也从免疫电镜中观察到了27nm的HEV球形颗粒，这些颗粒和病人康复期的血清在免疫电镜下有聚集反应。[36]Bradley等人（1988）从首次两个急性期病人的排泄物中提取了HEVVLPs，进行了蔗糖密度梯度超速离心，发现沉降速率为183S的VLPs与HEV的阳性血清混合后在电镜下有明显的聚集现象。并且发现，在相同的超离条件下，HEV病毒颗粒具有更快的沉降速率（HAV的沉降速率为157S），对纯化后的病毒颗粒的直径检测发现，90%的颗粒直径为27-34nm，而其中直径为32nm的颗粒最多，其直径要比HAV颗粒的直径大（HAV颗粒为27-30nm）。5 吉林大学博士学位论文Figure1.3HEV病毒颗粒1.3.2VLP的基本结构及其提供的信息对HEV的探索首先用免疫电镜和血清学研究确定了HEV的存在，并通过对HEV序列的分析确定了病毒的结构蛋白，在这些研究基础上，对HEV病毒结构的研究主要依赖于对病毒衣壳蛋白在昆虫细胞表达体系中形成的VLP结构的解析。1.3.2.1VLP的基本结构[31][37]HEV的T=1的VLP结构目前已经有三个亚型获得了结晶，分别为1,3[38]和4型。他们有相似的结构分布。VLP的直径大约为27nm，由60个单位组成，以二聚体为亚单位形成了T=1的折叠形式，在表面形成了3nm的突起。这些突起位于病毒结构的表面，易于暴露，容易与抗体结合，进而形成中和位点。VLP的结晶结构分为三个区，分别为S，M和P区（在Guu的研究中称为P1，P2和P区），其氨基酸构成分别为S区为N128-319，M区为N320-445和P区为456-606的部分。S区域形成完整的内部衣壳，衣壳的内表面富含精氨酸，能够和病毒的RNA结合；M区域位于中间的位置，参与病毒结构中位于中间的三聚体的[39]形成；P区域的氨基酸具有很强的疏水性，即使是P区域蛋白单独表达，也具有这种疏水性，正是由于这一性质的存在，能够让两个P区域之间形成了稳定的二聚体，突出于病毒的表面。6 第1章前言Figure1.4HEVVLP的结晶结构1.3.2.2病毒与细胞的接触区和相关的中和表位P区处于病毒突起的位置，从结构上来看，它突出于病毒表面，非常有利于病毒和细胞接触，同时也会较快的暴露于免疫系统中，所以病毒与细胞受体接触的位点和针对病毒的中和表位可能都位于这一区域。[40]在Yamashita等人的研究中发现，在T=1的HEVVLP的P区域中，位于突起顶部的暴露区域对VLP和Huh7和A549的细胞的结合至关重要，同时这些P区二聚体形式的存在对病毒与受体的结合也是不可缺少的。抗体与病毒的结合在空间上阻止了病毒与受体的结合，那么这些抗体就可以[40,41]起到中和抗体的作用。在一些文献中对这些抗体做了报道，其空间位置主要位于P区，尤其是有两个抗体覆盖在P区顶端的尖部，刚好能够覆盖病毒与细胞结合的位点。而在另一篇关于这种中和病毒与细胞结合位点的抗体的研究[37]中发现，有一种中和抗体结合的位置刚好将M区覆盖，进而提示M区可能也参与了病毒进入细胞的过程。1.3.2.3HEVVLP中N末端糖基化的可能性在衣壳蛋白上有三个保守的N糖基化位点，分别为N137，N310和N562。在对T=1的VLP的结晶结构分析时发现：N137和N310都被S区域的五聚体覆盖或隐藏其中，如果均含有糖基，则会阻滞T=1结构的组装。而N562的位置是在P7 吉林大学博士学位论文区域的突起的顶端，这一区域是病毒与细胞接触以及抗体中和位点的位置，如果有糖基化的修饰存在，糖链会覆盖这些位点，所以N562不是糖基化的蛋白。我们在对ORF2在昆虫细胞中表达产物做糖蛋白检测时发现，ORF2是以非糖蛋白的形式表现的。1.3.2.4HEV病毒T=3的推测[31]LiXing的研究发现，重组的T=1颗粒由60个拷贝构成，其外部直径为27nm，内部直径为10nm，这样的衣壳能够提供一个体积为5.3×105Å的腔隙，用以包裹折叠后的RNA，而这样的体积仅能容纳分子量小于1kb的RNA。如果想要容纳分子量为7.2kb的RNA，衣壳的内部直径至少要为20.5-21.5nm，再加上衣壳的厚度为8.5nm，这样病毒必须扩大衣壳来满足容纳RNA的需要，因此天然病毒至少要组装成T=3或更大的晶格才能满足需要。而在Guu的研究中，也证实了T=3[38]的晶格更有可能成为天然病毒颗粒的结晶结构。1.3.2.5RNA在HEV病毒组装中的作用LiXing等人于2010年的研究发现[31]，N末端的RNA结合区和RNA的存在对病毒组装成T=3颗粒十分重要。他们在研究中发现，如果仅删除N末端的13个信号肽序列，衣壳蛋白将会在昆虫细胞中产生两种VLP颗粒：T=1小颗粒和T=3大颗粒，其组成蛋白分别为53kDa和64kDa，T=3颗粒直径为41nm，由180个蛋白组成，而且有RNA包裹其中。这些研究结果表明：RNA与蛋白的结合在天然病毒的组装中是不可缺少的外部因素。1.3.2.6VLP的稳定性及与天然病毒的关系虽然HEVVLP的结构能够在昆虫细胞中表达，其结晶结构也已经被解析，但是它是否与天然的病毒结构一致还是未知的。[42]Li等人就VLP的稳定性做过研究，研究发现，这些VLP结构在10mMpH值为6.2的MES（2-吗啉乙磺酸）缓冲液中是稳定的，但是在Tris-HCl中是不稳定的，即使缓冲液的pH值为接近中性的7.4时是不稳定的。我们在关于VLP的研究中也发现，VLP的稳定性很差，即使是经过分子筛这种温和的层析条件，VLP的颗粒结构也会解聚，VLP的这种性质显然无法保护包裹于其中的RNA，那么天然病毒颗粒中还有哪些结构在维持着颗粒稳定的过程中起着重要的作用，需要开展进一步的研究。另外，构成VLP结构的氨基酸序列是被剪切后的ORF2蛋白的氨基酸序列，8 第1章前言这是ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达的特点以及蛋白自身对蛋白酶的敏感性所致。[26]但在Shiiota等人的研究中发现，如果C末端的52个氨基酸被切除，病毒的复制将无法维持，这52个氨基酸对病毒衣壳的正确折叠和维持衣壳的稳定是必须的，即在天然病毒中，这52个氨基酸存在的可能性很大，因此现有的VLP的折叠与天然的病毒折叠是不同的。1.3.3不同来源的HEV病毒的结构虽然通过对HEVVLP的研究获取了部分HEV病毒的结构的信息，但是，HEV的培养体系并不能高效表达病毒，因此对HEV病毒的研究始终停滞不前。近年来随着单抗技术，超离技术和病毒培养体系的完善，对不同来源的HEV病毒结构及组成蛋白的研究取得了一定的进展。HEV病毒主要有三种来源：粪便中的病毒，血液中的病毒和细胞培养上清中的病毒。从结构分析上看，细胞培养上清和血液中的病毒结构较为相似，而粪便中的病毒与二者的结构不同，其结构更为简单，主要缺少了前者的包裹成分。1.3.3.1血液和细胞培养上清中的病毒组成血液和细胞培养上清中的病毒构成主要有四个部分：RNA，ORF2蛋白，ORF3蛋白和脂膜，脂膜的外表面是否有蛋白的存在，各研究团队的结论并不一致，即使是同一团队，在前后的研究中也有矛盾之处。ORF2蛋白和RNA：在2006年，Emerson等人应用感染性克隆对病毒结构蛋[43]白的功能进行研究时发现，即使只有ORF2和RNA存在，转染细胞内的RNA也能够再次对敏感细胞进行感染，并启动复制，且胞内产生的含有RNA的颗粒结构在超离中具有和粪便来源病毒相似的沉降速率，说明ORF2能够和RNA结合，[27]并形成颗粒样结构。在研究组随后的研究中发现，将含有ORF2的全长的杆状病毒表达载体和启动就能够表达GFP的HEVRNA复制基因共转染，进入肝细胞时，二者能够组装，将含有组装产物的细胞裂解液对肝癌细胞再次进行感染时发现，组装产物能够感染细胞并启动病毒复制。这些研究提示，ORF2蛋白在病毒中缠绕RNA并对其进行保护。ORF3蛋白位置和功能的确定：对ORF3蛋白在病毒中的位置和作用主要是通[44]过感染性克隆确定的。在2005年Emerson的团队发表了关于ORF3的研究结果，研究显示ORF2和ORF3二者在表达上并不相关。但是ORF3对病毒在生物体内的感染和复制至关重要，将它沉默后，突变的感染性克隆无法在猴体内正常启动感9 吉林大学博士学位论文[43]染和复制。其随后的研究表明，ORF3蛋白对病毒的复制，组装和病毒在体外感染肝癌细胞是非必要的，同时在ORF2沉默的突变克隆中，ORF3对RNA没有保护作用，ORF3直接与RNA结合的可能性较小，对ORF3功能的猜测趋向于病毒[45]出胞和病毒在细胞间进行传播。接着在2009年，Yamada等人将沉默了ORF3蛋白的感染性克隆（ΔORF3HEV）转染进入细胞，对细胞内外的病毒含量进行比较时发现:ΔORF3HEV转染后的细胞内的RNA含量与wtHEV转染后的细胞内的RNA含量相比，没有很大变化，但在培养上清中，ΔORF3HEV的RNA的含量仅为wtHEV的RNA含量的百分之一。同时这百分之一的病毒在超离中的沉降速率与粪便中病毒的沉降速率相同，并且能够进一步感染细胞。这些实验结果证明ORF3蛋白对病毒的主要作用是帮助病毒出胞。没有ORF3的表达，病毒RNA会在细胞内大量聚集，无法出胞。至此，ORF2包裹核酸，ORF3位于ORF2外，介导病毒出胞，二者在病毒结构中的位置和功能基本确定。Emerson等人对ORF3功能的猜测主要有两个：负责病毒出胞和加强病毒在胞间的传播，而在Tanaka的实验中，只证实了帮助病毒出胞这一功能，那么ORF3蛋白是否能够帮助病毒在细胞间传播还需要进一步的研究。脂膜的存在：对脂膜位于病毒表面这一现象主要是通过超离粪便、血液和细胞[46]培养上清中的病毒是发现的，Takahashi等人通过超离对血液和粪便中的HEV病毒颗粒进行分析时发现：粪便中的HEV病毒颗粒位于密度为1.27-1.28g/ml的密度层，而血液中的HEV病毒颗粒位于密度为1.15-1.16g/ml的密度层，较粪便中的密度轻，他们同时发现细胞培养上清中病毒也只有一个超离层，其密度也比粪便中的低，同时经过Tween20或氯仿脱脂剂处理后，病毒密度有所提高，而经过NP40脱脂处理后密度提高至粪便中的密度相同，证实了脂类在病毒表面的存在。脂膜表面是否有病毒蛋白的存在：脂膜和ORF3蛋白存在于血液来源和细胞培养来源的病毒表面得到了证实。但是，在这层脂膜的表面是否会有蛋白的出现依然是值得探讨的问题。对ORF2是否存在于细胞培养中的HEV病毒表面的问题，Takahashi等人在[47]2008年的研究认为：针对ORF2的单抗H6225能够捕获病毒，并且在大剂量存在时，对细胞培养上清中的病毒有中和效果。但在随后的研究中发现即使有HEV[46]抗体阳性的血清存在，血液和细胞培养上清中的病毒依旧能够在敏感细胞中进[48]行复制。这两种结果有矛盾之处。而在Emerson等人的研究中发现，胞外的病10 第1章前言毒，无论是否脱脂，ORF2的抗体无法捕获，即使这些ORF2抗体针对粪便中的病毒是有效果的，所以对ORF2蛋白是否存在于病毒表面并没有达成一致看法。对ORF3的存在问题，在2008年，Takahashi等人用针对ORF3的C末端的[49]24个氨基酸的单抗能够捕获到细胞培养上清和血清中的HEV病毒颗粒，同时在大剂量单抗存在的情况下，能够部分中和细胞培养上清中的病毒，推迟病毒感染细胞后细胞的出毒时间，这一现象直接说明了ORF3是存在于病毒脂膜表面的。[46]但在这个研究团队之后的研究中发现，即使有HEV抗体阳性的血清存在，血液和细胞培养上清中的病毒依旧能够在敏感细胞中进行复制。这与之前的ORF3单抗对细胞培养上清中的病毒有部分中和作用有矛盾之处。在Emerson等人的研究[48]中发现，在没有脱脂的时候，包裹有脂膜的病毒与针对ORF3单抗的结合率很低，但是，经过处理后，结合率增加很大。1.3.3.2粪便中的HEV病毒颗粒：粪便中的HEV颗粒的主要来源是肝脏中的HEV，通过胆汁和消化道中各种酶的处理后获得。在对粪便中的病毒进行超离时发现：病毒所在层的密度要高于血液和细胞培养上清中的病毒密度层；同时ORF3抗体无法捕获粪便中的HEV病毒颗粒。所以粪便中的病毒是没有脂膜和ORF3蛋白的存在。这些无胞膜的HEV病毒颗粒也就是在HEV研究初期，在免疫电镜下观察到的病毒颗粒，它们具有典型的二十面体结构，病毒外表面没有脂膜的包裹。1.3.4戊肝病毒结构研究中的现有问题的思索虽然通过现有的技术手段，我们已经对HEV的结构有了一定的了解，但是，还远远不能说已经清楚HEV的组成，依然有很多问题让我们困惑，比如包裹病毒的脂膜上究竟有没有ORF3蛋白的存在？ORF3蛋白究竟在病毒的感染中起到什么样的作用？能否介导病毒对肝细胞以外的病毒的感染？HEV颗粒的衣壳蛋白究竟是糖基化的还是非糖基化的，分子量究竟是多大，氨基酸的起止究竟是多少？而这些问题都是困惑着HEV研究的问题。我们的课题也紧紧围绕着这些问题，尝试解决一些HEV结构和组成的疑惑。11 吉林大学博士学位论文1.4HEV疫苗1.4.1HEV备选疫苗的临床前评价HEV的备选疫苗主要包括：结构蛋白（ORF2和ORF3蛋白）亚单位疫苗、DNA疫苗和联合免疫疫苗。1.4.1.1HEVORF2蛋白在不同表达系统的表达和HEV亚单位疫苗ORF2为病毒的衣壳蛋白，能够引起中和抗体的抗原位点也集中于ORF2蛋白，所以各个研究团队建立了多种异源蛋白表达体系，用于研究ORF2蛋白，并将部分表达产物作为戊肝疫苗的候选抗原。主要的表达体系有哺乳动物细胞表达体系、大肠杆菌表达体系、昆虫细胞表达体系和昆虫幼虫表达体系。哺乳动物细胞的表达体系：Jameel等人将ORF2的全长构建在SV-40中，并[24]在COS-1和HepG2细胞中进行表达，并对其形成和糖基化做了研究，研究发现ORF2为糖基化的蛋白，它先表达为82Kd的前体蛋白，而后变为74Kd的蛋白，糖基化修饰后变为88Kd的成熟蛋白，同时也考察了ORF2和ORF3之间的相互作用，发现二者并没有较强的作用。[25,50]而Torresi等人也对HEVORF2在真核细胞中的表达做了研究,并对其糖基化的稳定性做了考察，他们利用SemlikiForestvirus（SFV）的表达载体将HEVORF2的全长片段在BHK21，HepG2,Huh7这三个细胞系中做了表达，认为在BHK21细胞中，有72kD，79kD和84kD的表达形式。在随后的实验中，通过目的蛋白的细胞定位发现，非糖基化的ORF2蛋白是胞质中ORF2蛋白的主要表达形式，而糖基化的ORF2蛋白主要表达在细胞膜上，并认为，糖基化的ORF2蛋白没有机会参与HEV病毒的组装，仅为ORF2蛋白在体外合成时，作为异源蛋白的表现形式，不是HEV病毒颗粒中的存在形式。虽然这两个研究团队都对ORF2在真核细胞中的表达做了研究，但并没有对这些蛋白的免疫原性做相关性评价。大肠杆菌表达体系：最先在大肠杆菌系统中进行HEV衣壳蛋白表达是的Purdy[51]等人，他们将N末端的一段长为37kDa的区域和C末端的一段区域进行了嵌合，这段蛋白在动物实验时表现了很强的免疫原性，并且这段蛋白含有很广泛的中和[52]表位，但是猴体内进行保护性实验时，对抗戊肝发病和感染的能力并不强。12 第1章前言pE2和HEV239都是由厦门大学研究并进行改进的。pE2的蛋白表达的是中国株的ORF2394-607aa，在研究中发现，这一段氨基酸有自发形成二聚体的趋势，并在兔体内能够引起较强的免疫反应，为了评价这一蛋白作为疫苗的可能性，将其在猴体内进行了病毒保护性实验，实验结果表明100μg的剂量能够保护猴子免[53,54]于高剂量的病毒感染。但是由于这一蛋白的表现形式是以非颗粒的形式存在，所以它需要高剂量才能产生高浓度的保护性抗体,所以并不适合作为疫苗进行免疫[55]。厦门大学在这段氨基酸序列的基础上进行了筛选和改进，在pE2的N末端增加了26个氨基酸，由HEVⅠ型中国株的368-606aa构成，构建了HEV239，这段蛋白能够自组装成蛋白颗粒，有颗粒结构，颗粒直径为23nm,小于天然病毒，但在HPLC和光散射等实验中均能够体现出其颗粒性，而HEV239具有颗粒性的最大优点体现在它的免疫原性要高于pE2200倍，同时有能够被两株中和抗体识别的位点[56],而且HEV239至少含有两个T细胞表位，能够在小鼠中产生细胞免疫效果。在HEV239的猴体实验中，高剂量组（10μg和20μg）所产生的抗体效果相似，而5μg在免疫程序进入第二个免疫剂量时也达到了相似的效果。免疫组在用1型HEV和Ⅳ型HEV（含有104的等价的RNA）进行攻毒实验时，能够免于感染和发生肝炎症状。虽然HEV239能够形成颗粒样结构，但是由于这一段氨基酸位于HEVVLP结晶结构中的最外层，在VLP结构中是由一段铰链区氨基酸支撑并突出于内层致密衣壳上的，所以这段序列在VLP结构中暴露的表位要远多于单纯这段氨基酸自行形成颗粒后所暴露的表位。昆虫细胞表达体系：由于大肠杆菌与真核细胞的表达系统在对蛋白质进行后修饰的过程中有许多不同之处，而且，HEVORF2蛋白在原核表达系统中没有形成VLP的报道，所以从90年代开始，几个实验室利用了昆虫细胞体系对ORF2做了表达，并对其特点做了详细的表述。日本国立传染病研究所最终表达，纯化得到了HEVVLP的颗粒，对其结晶结构做了大量详细的研究。美国NIH（NationalInstitutesofHealth）的研究团队从90年代起就对HEVORF2的表达和免疫原性进行了研究，他们将55kD的蛋白在昆虫细胞中进行了表达，测定了其免疫原性和免疫后动物对同源及异源性HEV病毒的保护作用，实验发现：这一蛋白同安慰剂相比，对动物有保护作用，能够使猕猴避免病毒血症和肝炎症状。这些研究数据表明，56kDa蛋白能够作为HEV疫苗参与HE的预防。在1997年，以NIH为首的几家研究团队将HEVORF2的全长在sf9中的表达进行了全面13 吉林大学博士学位论文[28]的研究，实验结果显示，HEVORF2的全长在昆虫细胞中会表达4种主要蛋白，分别为72kDa、63kDa、56kDa和53kDa。其中56kDa蛋白积累在细胞质中，而53kDa的蛋白却以VLP的形式分泌与细胞外。在对56kDa的纯化主要是采用了离子交换层析和分子筛等柱层析，而随后的对样品的分析中并没有确切的证据表明56kDa的蛋白具有VLP的性质。他们将53kDa、56kDa和63kDa的蛋白做了纯化和全面的分析，并在随后的动物实验中着重考察了56kDa和53kDa蛋白的免疫效果和对[57,58]动物的保护作用，发现56kDa的免疫效果最好，能够对Sar-55、Mex-14和US-2均有保护作用，虽然还有病毒的复制，但并无肝炎和病毒血症的表现；而53kDa虽然能够形成VLP，但是由于缺少抗原表位，免疫效果没有56kDa好。为了考察免疫剂量和免疫方案，50μg与铝佐剂结合后的HEVORF2蛋白用于猴体免34疫，抗体滴度达到1:100至1:10000不等，但用1.0×10和1.0×10MID50(MID50：monkeyinfectiousdoses)进行猴体的攻毒实验时，在免疫组中没有发现猴子发展成肝炎和病毒血症，但单一剂量组的猴子粪便中却有HEV病毒的排出。这项研究为56kDa蛋白的猴体免疫提供了初步的数据。在其后的猴体实验中，研究团队详细评价了疫苗剂量，免疫持续时间，和最低保护剂量。并评价了0.4μg，2μg，10μg和5650μg的免疫效果。攻毒剂量在3.0×10MID50（SAR55）和1.0×10MID50(Mex14)时，都不能在疫苗组引起肝炎症状，但在最小剂量组有病毒血症和粪便排毒现象的出现。而在其后的系列实验中，最终确定的免疫程序为0,1和6个月。之后的一次更大规模的动物实验确定了56kDa的免疫剂量，并在这次实验中确定了WHO关于保护效果的标准，当抗HEV的抗体滴度大于175个WHO单位时，能够保护动物免于肝炎和戊肝感染。虽然，56kDa蛋白在吸附了铝佐剂后在动物试验中有良好的免疫原性，但是没有证据能说明这段序列形成了VLP结构，在之后的日本国立传染病研究所针对VLP形成和保持条件的研究中，HEVVLP在昆虫细胞中的形成和结构保持需要[30][42]满足一定的条件，这些条件在56kDa蛋白的表达和纯化文献中并没有体现。日本国立传染病研究所的NaokazuTakeda等人在1997年成功的将1型HEV中的缅甸株在Tn5细胞表达并纯化了HEVVLP颗粒，并以此为平台，对HEVORF2在昆虫细胞中的表达特点，HEVVLP结构特点及免疫原性做了详尽的研究，同时以HEVVLP作为疫苗载体，将外源蛋白嵌合于VLP上或是将外源DNA组装进VLP内进行了探索。NaokazuTakeda等人在1997年先将HEVORF2的全长在昆虫14 第1章前言细胞中进行了表达，发现其裂解成72K,58K和56K的蛋白，与其他人的研究相似，没有能够形成VLP的蛋白片段，之后再将Ac5480/7126在昆虫细胞中表达，发现了分子组成为53K的HEVVLPs，并成功纯化了HEVVLP，在随后的研究中，对[30]ORF2在昆虫细胞中表达长度与VLP的形成关系做了详细的考察，研究发现：C末端的52个氨基酸的去除对VLP的形成至关重要，同时N末端也要去除部分氨基酸，当蛋白由126-601aa组成时，会组装成T=1的颗粒，由60个拷贝形成大小为27nm左右的颗粒；VLP的组成由112-608aa构成,同时加入核酸后，组装成T=3的颗粒，即由180个拷贝形成的大小为41nm的颗粒。T=3颗粒可以将RNA包裹在里面。VLP在sf9和Tn5中的结构相同。在获得了HEVVLPs（aa112-608）后，[59]NaokazuTakeda等人对HEVVLPs的结构和稳定性和免疫原性做了详细的研究，[60]并将之应用于口服疫苗。由于HEVVLPs在酸性环境例如胃液中稳定，有与天然病毒相似的结构，而且HEV是一种肠道病毒，所以口服疫苗有更类似于自然免疫的效果。在小鼠中进行的口服免疫和肌注免疫的比较中发现：两种免疫途径在小鼠的血清中均可产生IgG，但是只有口服疫苗才能够在血清和粪便中产生IgA。虽然肠道IgA在免疫程序结束后下降的很快，但在再次接触抗原后，它的滴度上升的很快，即可以获得快速的免疫应答。实验数据同时证明，HEVVLPs的口服免疫剂量在小鼠中并没有产生免疫耐受。在积累了初步的数据后，实验团队在猴体[59]4进行了疫苗的保护性实验，实验数据表明，口服免疫后的猴子对MID50大于10的HEV病毒的具有很好的保护作用。同样免疫耐受的情况也没有在猴体上出现。在确定了HEVVLPs具有很强的免疫原性后，研究团队以VLPs为疫苗载体，将小分子肽构建于VLP上，或者将DNA折叠在VLP内，进行了免疫效果的评价。[61]他们首先考察了HEVVLPs作为疫苗载体携带小分子肽的能力,将B细胞的抗原决定簇标签中的11个氨基酸构建在HEVVLPs的C末端后，表达并纯化了这一嵌合有外源多肽的VLPs，并将它作为口服疫苗对小鼠进行了粘膜免疫，发现有针对HEV和B细胞的抗原决定簇的肠道IgA产生，且含量较血清中的相应IgG要高，初次证明了HEVVLP完全可以作为口服疫苗的载体，提高免疫效果不佳的小分子[62]肽的免疫原性。并在随后的结晶结构解析中证明:这一嵌合的VLP结构能够引起[63]两种针对不同抗原的免疫反应。在2004年的实验中，他们将HEVVLPs解聚，混合HIVenv上的gp120的DNA疫苗后进行自组装，将DNA疫苗折叠在HEVVLP内部，通过肠道的粘膜免疫后检测了gp120的血清IgG，IgA和肠道的IgA,均含有15 吉林大学博士学位论文相应的特异性抗体，而且在脾，肠系膜淋巴结和Payer’spatches中均有CTL反应，而用裸露DNA疫苗进行皮下免疫的小鼠只产生了血清IgG,没有IgA和CTL反应。说明在HEVVLPs作为口服疫苗的载体，能够将包含其中DNA疫苗完整的传输给免疫系统，并产生特异的体液免疫和细胞免疫。日本国立传染病研究所利用昆虫细胞的表达体系和超离的纯化手段成功的获得了HEVVLP的病毒样颗粒。但是，研究团队对VLP的纯化方法是采用了多步超离的方法，这样的纯化步骤很难应用于疫苗的生产。所以这也限制了HEVVLP在戊肝病毒预防中的应用。但是，团队的研究还是给HEVVLP的应用拓宽了方向，在研究中，HEVVLP不仅仅可以作为HEV的预防疫苗，它还可以作为一种疫苗的载体，通过它的VLP结构携带更多的抗原信息递呈给机体，从而达到对两种或更多的疾病预防的作用。同时，研究还显示了HEVVLP作为口服疫苗的可能性，这也为疫苗的免疫途径提供了更为简单的方法，还和病毒的自然感染途径相似。[64]Genelabs的实验室在1995年开始进行HEV疫苗和诊断试剂的研究，他们将HEV缅甸株的ORF2读码框在昆虫细胞内进行了表达，获得了稳定的，可溶的单一蛋白，分子量大小为62kDa,氨基酸的起止为112-660aa。而后将这一蛋白与铝[65,66]佐剂结合后，进行了疫苗评价的动物实验，尽管评价显示这种蛋白对HEV的预防有一定的作用，但是却没有进一步的研究报道。[67]昆虫幼虫表达体系：印度Jameel等人从2002年起用昆虫幼虫作为表达载体，对N末端缺失111aa和586-610aa删除的HEVORF2蛋白进行了表达和纯化，并从幼虫的脂肪体中提取目的蛋白，确定其为糖基化的蛋白，并以此蛋白作为诊断试剂的检测蛋白。此种蛋白的表达方式可以作为一种高效，低成本的表达方式加以应用。但这种蛋白并没有作为疫苗蛋白进一步研究。[68,69]西班牙的Nereida等人也利用了昆虫幼虫作为表达载体，对Ⅲ型HEVORF2的蛋白进行了表达，并利用小鼠检测了它的免疫原性，同时检测了它所产生的抗体在母婴体内的传递，证明抗体可以通过胎盘和乳汁传给小鼠。1.4.1.2ORF3蛋白亚单位疫苗虽然ORF3蛋白的作用是负责HEV病毒的出胞，并不出现于粪便中的HEV表面上，但是，血液中有ORF3抗体的出现。Ma等人将HEVORF3蛋白作为免疫源[70]对猴体进行免疫时发现，针对ORF3的抗体虽然不能够保护疫苗组免于感染，16 第1章前言但是能够降低病毒滴度并且能够缩短病毒血症的时间以及粪便排毒时间，充分证[71]明在感染者体内ORF3蛋白与RNA的相关性。1.4.1.3DNA疫苗DNA疫苗作为一种新型的免疫手段，有不同于传统蛋白疫苗的优点，比如更容易产生细胞免疫，类似于天然的感染过程。含有HEVORF2全长或截短的质粒[72-76]在小鼠体内能够产生相应的抗体，并有免疫记忆。而在猴体上，HEV的DNA疫苗也能够产生免疫效果。并且在用HEVMex-14进行攻毒实验时，免疫组的部分猴子能够预防病毒感染和肝炎的发生。在采用低剂量的HEVDNA疫苗对猴体进行免疫时发现，genegun能够让疫苗在猴体内产生更强的免疫效果，而用同样剂量的DNA质粒通过传统免疫方式进行皮下免疫时，则没有相应抗体的出现。而且[77,78]无法对猴体形成相应的保护效果。1.4.1.4蛋白疫苗和DNA疫苗联合免疫将DNA疫苗作为初免方式，而蛋白疫苗作为加强免疫的方式成为一种新的免疫方式，在猴体中进行了免疫效果的考察，能够对疫苗组形成保护效果。而将HEV的全长和中和抗体对应位点的DNA片段做成DNA疫苗进行免疫，免疫效果并不[76]理想。1.4.2HEV疫苗的临床实验1.4.2.156kDa疫苗56kDa疫苗的Ⅰ期临床实验由WRAIR（WalterReedArmyInstituteofResearch）[79]于2001年完成，共有88名年龄为18-50的志愿者分别免疫了剂量为1,5,20，和40μg的疫苗。所有免疫组都有良好的疫苗耐受性和免疫原性：剂量为5,20，和40μg的疫苗组的抗HEV的滴度大于40U/ml的均占实验组的88%以上，但1μg的疫苗组只有66%。根据本次实验结果，从2001年起，以GSK为首的团队在尼泊尔的[80]军队做了戊肝疫苗的临床评价，共评价了1794名士兵，免疫方案为免疫3次，为0,1和6月接种，剂量为20μg，在最后一次免疫结束两周后到临床观察结束，长达两年多的考察中，共有69人感染戊肝，其中66人在安慰剂组（共896人，7.4%），3人在疫苗组（898人，0.3%），疫苗的有效免疫效果为95.5%，但是这次研究的分析还表明，疫苗所产生的抗体滴度持续时间不长：在第二次免疫结束后，17 吉林大学博士学位论文疫苗组的抗体滴度全部在20WRU/ml，但在研究结束时，滴度降为原来的56.3%。与之相对应的是在安慰剂组中，随着感染的出现，HEV抗体滴度在20WRU/ml以上的逐渐升至10.6%。这次临床实验的结论充分说明了重组HEV疫苗能够很好的预防HEV感染的临床症状的出现。但疫苗是否能够阻止无症状感染及HEV排毒的出现尚待探讨。而无症状感染是HEV散发病例的主要传染源。但遗憾的是此疫苗并没有进行下一步的临床实验。1.4.2.2HEV239疫苗在猴体证明了HEV239的保护效果后，厦门大学在中国江苏省进行了临床实[81]验。在临床Ⅰ期和Ⅱ期研究中，HEV239的安全性、耐受性和血清阳转率得到了有效的证实。在免疫程序的实验中，20μg的疫苗剂量分别以0,6月和0,1,6月的免疫程序进行免疫，对照组设置为免疫HBV。其后的实验进一步考察了免疫剂量，10,20,30，和40μg剂量的HEV239以0,1,6月的免疫程序，分别对4组志愿者进行了免疫。抗体滴度的检测发现，三次免疫程序所产生的抗体滴度明显高于两次免疫程序所产生的，并且在不同剂量组中，从10μg到40μg所产生的抗体滴度渐次升高。在Ⅰ期和Ⅱ期临床实验取得了成功后，从2007年起，HEV239在江苏省进行[82]了临床Ⅲ期实验，受试人群为16-65岁的健康人群，历时22个月。112,604人被随机分为两组，一组给予30μg的HEV239按照0，1,6月的免疫程序进行免疫，另一组则采用相同的免疫程序免疫了HBV疫苗。最终有97,356人完成了全部免疫程序。在完成全部免疫程序后的13个月内，疫苗组无人发病，而对照组有15人发病。在发病的15人中，检测了13人的RNA，其中12人为HEV4型，1人为1型，这也充分说明了HEV239对4型HEV所体现的交叉保护作用。同时，11,165名志愿者检测了抗HEVIgG,其中疫苗组的98.7%人在第三次免疫结束后的一个月内，HEVIgG的滴度有第四次的升高或高于HEVIgG的滴度基线。但是在相同时期的对照组中，仅有2.1%的比例出现了血清阳转。虽然HEV239的Ⅲ期临床实验还有一些局限性，如对低年龄段，孕妇，慢性病患者等人的提供保护所需的抗体滴度等没有明确指标，但这并不影响HEV239在提供HEV保护效果中的作用。Ⅲ期临床实验的结果证实了HEV239疫苗的安全性和有效性。虽然这两种（HEV239和p56kDa）疫苗的临床试验结果都显示，疫苗能够保18 第1章前言护受试人群免于HEV的感染，但是它们的临床试验还是有一些尚未解决和说明的问题，如免疫疫苗后的抗体能持续多久，如果延长疫苗免疫后的观察时间，那么疫苗的保护率与对照组之间是否还有差别，两种疫苗在面对戊型肝炎爆发时是否依然有效，二者对孕妇的保护是否有效等等。1.4.3已上市疫苗HEV239已经获得生产批件并通过GMP认证，但尚无上市后评价文献报道。1.4.4现有疫苗状况的思索虽然，现有的疫苗HEV239和56kDa显示了戊肝疫苗的有效性，但是在戊肝疫苗的生产和研究中还是有很多亟待解决的问题，如从VLP的结晶结构分析上看，HEV239所暴露的抗原位点与天然病毒的抗原位点还是有不相同的地方。ORF256kDa的蛋白虽然对戊肝病毒有预防效果，但是它与VLP在结构和抗原位点的暴露上还是有不同之处。T=1的VLP结构虽然具有病毒的二十面体结构，但是由于VLP的稳定性不高，其纯化步骤只能采用多步超离的方法，并不适合生产等等。这些都需要进一步的研究加以解决。1.5论文设计1.5.1论文目的HEV病毒是引起HE发病的主要原因。我国为HEV的流行区，HE占我国急性病毒性肝炎20%左右，病死率为1.4％－5.3％，而孕妇中的病死率可达25％，这使HE成为一个重要的公共卫生问题。由于HEV培养体系不完善，对HEV结构的研究依然存在许多疑惑。本课题主要对细胞培养上清中HEV结构和组成蛋白进行了分析和研究，并与粪便来源的HEV相比较，对HEV病毒的结构和组成进行初步探索。HEV239疫苗和HEV56kDa疫苗临床实验的有效性虽然让戊肝的防治有了较大的进展，但是，它们面对HEV大规模爆发时的防治还是有不确定性，而且其抗原位点同HEV颗粒相比还是有所不同；Li等人所表达的HEVVLP虽然具有颗粒性，免疫原性强，同天然HRV颗粒相似，但在疫苗生产中的大规模制备时又被多19 吉林大学博士学位论文步超离的繁琐纯化步骤所限制。本研究的另一目的是优化HEVVLP在昆虫细胞中的表达，摸索VLP的纯化条件并初步建立VLP的评价体系。为戊肝疫苗的大规模制备奠定基础。1.5.2实验设计第一部分：研究主要对细胞培养上清中和粪便中的HEV进行分析比较，根据HEV病毒在超离中的分层，对病毒ORF2蛋白和HEV颗粒进行了分析和比较，并对HEV的组成和结构进行了探讨。通过对富含RNA的超离层，即病毒层的密度分析和与粪便中病毒密度的比较，确定了细胞培养上清中HEV表面脂膜的存在，通过对病毒脱脂前后与ORF3单抗结合率的比较发现ORF3蛋白在脂膜上的几乎没有存在，而通过病毒脱脂后，脱去ORF3蛋白后与细胞的结合率分析了二者在病毒与PLC/PRF/5细胞结合中的作用。实验设计如图所示。Figure1.5不同来源的HEV病毒组成和结构研究实验设计图第二部分：课题主要是通过优化HEVVLP在昆虫细胞中的表达条件，摸索HEVVLP的分离纯化工艺，并初步评价通过此工艺制备的HEVVLP。20 第1章前言Figure1.6ORF2蛋白在昆虫细胞表达研究实验设计图21 22 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析2.1实验材料2.1.1细胞系PLC/PRF/5细胞（ATCC-CRL-8024），为实验室保存。2.1.2细胞培养所需溶液MEM培养基购自美国Hyclone，小牛血清购自杭州四季青公司。2.1.3HEV病毒细胞培养产生的病毒：在本研究中，HEVAJ272108用于感染细胞并进行病毒在PLC/PRF/5细胞中的扩大化培养。粪便来源的病毒：在本研究中，一只处于戊型肝炎病毒排毒期高峰的猴的粪便用含有10%FBS的PBS重悬后，0.45μm膜过滤，然后再用于病毒的纯化和分离，并进行病毒性质的检测。2.1.4主要材料，试剂和溶液配制2.1.4.1主要试剂蔗糖北京鼎国公司十二烷基肌氨酸钠、盐酸胍、Tris、盐酸、氯化锂和EDTA国药集团生产。EGTA、DTT、DMSO、Tris、HCl、CaCl、Na2HPO3、NaH2PO3、Hac国药集团LiDS和DTTSigma美国1×PBSHyclone美国NP40、2-巯基乙醇和PronaseESigma美国超滤管（截留分子量为100K）Millipore美国RNaseASigma美国RNART-kitThermo美国23 吉林大学博士学位论文2.1.4.2材料和仪器超速离心机（CP70ME）Hitachi日本小型振荡器IKA德国7500FASTABI美国6孔板BD美国蛋白分子量标准品（26617）Thermo美国AKTA纯化仪、rProteinGFF和CNBr-activatedSepharose4BGE美国PVDF膜GE美国糖染色检测试剂盒Thermo美国超滤管Millipore美国M5酶标仪MolecularDevices美国HEVRNA的核酸检测试剂盒、HEV的质粒北京金豪RNA提取试剂盒北京庄萌偶联由ORF3单抗的CNBr-activatedSepharose4B凝胶实验室制备SDS-PAGE电泳试剂和溶液、考马斯亮蓝染液和脱色液北京鼎国HEV抗原检测试剂盒北京万泰目的蛋白含量检测标准品实验室提取的HEVVLP蛋白2.1.4.3溶液配制10%蔗糖溶液的制备：取蔗糖10g，加入80ml去离子水溶解后，再定容至100ml。20%蔗糖溶液的制备：取蔗糖20g，加入80ml去离子水溶解后，再定容至100ml。30%蔗糖溶液的制备：取蔗糖30g，加入80ml去离子水溶解后，再定容至100ml。40%蔗糖溶液的制备：取蔗糖40g，加入80ml去离子水溶解后，再定容至100ml。60%蔗糖溶液的制备：取蔗糖60g，加入80ml去离子水溶解后，再定容至100ml。裂解液Ⅰ：称取2g十二烷基肌氨酸钠和38.2g盐酸胍用40ml去离子水溶解，再定容至100ml。24 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析裂解液Ⅱ：配制0.2M的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，配制方法同前；称取2.11g氯化锂，0.5gLiDS，0.02gEDTA和0.07gDTT用50mlTris-HCl缓冲液溶解，用去离子水定容至100ml。脱脂溶液的配制：抽取2mlNP40，加去离子水定容至10ml。（浓度为20%）去ORF3蛋白溶液的配制：抽取1mlNP40,1ml2-巯基乙醇，加去离子水至5ml，称取0.1gPronaseE加入其中，混匀，用去离子水定容至10ml。（为10×去ORF3缓冲液）上样缓冲液：称取2.17gNa2HPO4.2H2O，1.07gNaH2PO4.H2O,加水定容至100ml。洗脱缓冲液：抽取28ml冰乙酸，加去离子水至800ml，用NaOH调pH至3.0，加去离子水定容至1000ml。自组装溶液：称取8.775g氯化钠，抽取100mM的EGTA10ml，200mM的DTT100ml，加去离子水定容至1000ml。2.2实验方法2.2.1细胞培养PLC/PRF/5细胞（ATCCCRL-8024），细胞培养于含10%FBS的MEN中进行增殖，以1:3或1:4进行传代。当细胞生长满培养瓶后，将病毒HEVAJ272108混入含有2%FBS的培养基中共同孵育，3天后弃去含有病毒的培养基，改用含2%FBS的维持培养基进行培养，每3天进行换液，将含有病毒的培养上清收集，待用。2.2.2细胞培养上清中的病毒液的超滤浓缩⑴收取含有HEV病毒的细胞培养上清，3000rpm离心去除细胞碎片。⑵将澄清的培养上清加入截留分子量为100K的超滤管中，以4000g的转速离心20分钟，收取滤上液，完成病毒浓缩。2.2.3HEV病毒的纯化⑴配置浓度为10%至60%的蔗糖溶液，高压灭菌后待用。同时将超离所需的P40AT25 吉林大学博士学位论文离心管和长针头等物品同时灭菌待用。⑵将1ml的10%的蔗糖溶液铺于最底层，然后依次将2ml20%，2ml30%，1ml40%和1ml60%的蔗糖溶液用长针头逐个注入最底层，将上一层蔗糖溶液顶起，从而形成10%-60%的连续密度梯度层。⑶铺好蔗糖密度梯度，将3ml含有HEV病毒的样品缓慢铺于蔗糖层的最上方，避免干扰蔗糖密度层间的平衡。⑷将离心管小心的挂在离心机的甩平转头上，置于离心机内，以35000rpm，4℃的离心条件离心4小时。⑸离心结束后将离心管小心取出，不能破坏离心所形成的离心层。从上至下逐步抽取离心层。先以1ml/层的液体量抽取8层，抽取至浓度为30%的蔗糖层开始，以0.2ml/层的液体量抽取离心层，共抽取了24层。对各个蔗糖层的糖度进行检测。2.2.4病毒的裂解变性在对病毒的超离层进行ORF2蛋白的检测时发现，在病毒RNA所在层无法检测到ORF2蛋白的存在，为了检测ORF2蛋白，我们将病毒裂解变性，然后再进行ORF2蛋白的检测。⑴取等体积的富含RNA的超离层，分别与同体积的裂解液Ⅰ（强变性裂解液）和裂解液Ⅱ混合。⑵静止5分钟震荡1分钟，以此时间间隔用振荡器震荡20分钟。⑶检测两种裂解液获得的RNA含量，计算裂解液Ⅱ相对裂解液Ⅰ的裂解效率，达到95%以上，才算裂解完全。2.2.5变性后ORF2蛋白的检测2.2.5.1ORF2蛋白标准曲线的制备⑴对昆虫细胞表达纯化的HEVVLP用BCA方法定量检测其蛋白含量。⑵将定量后的HEVVLP系列稀释至30ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、4ng/ml和3ng/ml。⑶用万泰生产的HEV抗原检测试剂盒检测样品的OD450值。⑷根据标准品的OD450值和蛋白含量做双回归曲线，结果显示二者具有良好的26 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析2线性，R为0.99，定量范围为2ng/ml-30ng/ml，高于该范围的样品可系列稀释检测。2.2.5.2变性后样品中ORF2蛋白含量的检测⑴将变性后的样品置于截留分子量为3K的超滤柱中，以14000g离心20分钟，×弃去滤下液，再加入1PBS缓冲液，再次离心。⑵重复步骤一，共计三次，完成缓冲液置换。⑶将确定含量的HEVVLP标准品作为校正标准品，进行同样处理。⑷将校正标准品在变性前后的样品和变性后的待检样品，同时用万泰的HEV抗原检测试剂盒检测ORF2蛋白含量，计算三者的ORF2蛋白含量。⑸计算校正标准品的回收率，如果为95%以上，则确保置换缓冲液后的样品内裂解液Ⅱ的残留不会影响ORF2蛋白的检测。此时变性后待检样品中的ORF2蛋白含量为样品中含有的ORF2蛋白含量。2.2.6病毒RNA含量的检测76⑴以ORF2全长质粒为标准品，系列稀释至7×10copies/ml,7×10copies/ml,547×10copies/ml和7×10copies/ml。⑵按照RNA提取试剂盒的标准操作步骤提取样品中RNA。⑶将提取的RNA和系列稀释的标准品按照HEVRNAreal-timeRT-PCR检测试剂盒的程序进行。⑷根据标准品的Ct值和质粒浓度做双回归曲线，结果显示二者具有良好的线性，274R为0.99，定量范围为7×10-7×10copies/ml，高于该范围的样品可系列稀释检测。⑸根据样品的Ct值，计算样品中RNA的浓度。2.2.7检测各个超离层的感染性⑴将PLC/PRF/5细胞铺于6孔板中，37℃培养至孔内铺满细胞。⑵每孔加入100μl样品，同时加入3ml含3%FBS的MEN，共同孵育3天。⑶三天后PBS洗5次，35℃培养，每3天收集细胞上清，—80℃冻藏，待检。27 吉林大学博士学位论文2.2.8病毒表面脂膜和ORF3蛋白的去除病毒表面脂膜的去除：⑴将细胞培养上清中病毒浓缩液进行超离，抽取超离层中富含RNA的离心层。⑵将富含RNA的超离层和脱脂液以1:10的比例混合，使其终浓度为2%，在37℃下孵育1小时。⑶将孵育后产物用100K的超滤柱进行溶液置换，步骤如前所述，将含有NP40的液体置换为PBS。⑷将脱脂后的样品再次超离检测沉降速率或进行细胞结合实验。病毒表面ORF3蛋白的去除：×⑴将去脂后的病毒溶液与10去ORF3蛋白的缓冲液以1:10的比例混合，使溶液中NP40，2-ME和PronaseE的终浓度均为0.1%，在37℃下孵育1小时。⑵将孵育后产物用100K的超滤柱进行溶液置换，步骤如前所述，将去ORF3蛋白的缓冲液置换为PBS。⑶将脱脂并且去除ORF3蛋白的样品再次超离后，进行细胞结合实验。2.2.9不同病毒样品与PLC/PRF/5细胞的结合性实验⑴将PLC/PRF/5细胞铺于12孔板中，37℃培养至孔内铺满细胞。⑵将样品的RNA含量稀释至相同含量，每个样品做三个平行孔，每孔加入101.00×10copies的RNA，同时加入3ml含3%FBS的MEN，共同孵育。⑶分别于8小时，24小时，48小时和72小时收集孔内细胞，-80℃冻存待用。⑷检测细胞内RNA含量，并对不同样品与细胞结合的RNA含量进行比较。2.2.10亲和层析提取ORF2蛋白和HEV病毒ORF2蛋白和HEV的提取都采用亲和层析的方法。⑴针对ORF2和ORF3蛋白的单抗的提取：两种单抗均用rProteinGFF(GEHealthcare)进行提取。用上样缓冲液平衡rProteinGFF凝胶，待基线平直时开始上28 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析样，样品为含有单抗的小鼠腹水（由万泰提供），待杂质去除后，用洗脱液洗脱，收峰，即为纯化后的单抗。⑵亲和层析凝胶的偶联：将纯化后的单抗以5mg/mlgel的浓度与CNBr-activatedSepharose4B(GEHealthcare,Fairfield,CT)进行偶联，偶联步骤按照说明书进行，偶联在4℃下进行，偶联时间在8小时以上。⑶ORF2蛋白的提取：将超离后富含ORF2蛋白的低密度层与偶联后的亲和胶在室温下共同孵育1小时，而后以5倍胶体积的PBS洗5次，最后用醋酸缓冲液进行洗脱。共洗脱2次。而后用3K的超滤柱进行浓缩。⑷HEV病毒的提取：对HEV的提取步骤与上相同，只是样品要进行脱脂的预处理后再进行亲和层析，同时在最后的洗脱后用100K的超滤柱进行浓缩。2.2.11用ORF3单抗进行的免疫捕获为了评价不同来源的病毒对ORF3单抗的亲和性，我们用偶联有ORF3单抗的凝胶与不同来源的样品混合，检测ORF3单抗捕获的RNA。⑴将偶联有anti-ORF3MAb的CNBr-activatedSepharose4B凝胶与样品在4℃的条件下孵育过夜。⑵3000rpm离心，弃上清，用PBS洗5次。⑶用提取RNA的LysisBuffer直接与胶孵育，提取并检测RNA。⑷计算提取的HEVRNA占样品中总HEVRNA的百分比，进而计算样品针对ORF3单抗的亲和率。2.2.12提取ORF2蛋白的检测2.2.12.1ORF2蛋白的WB检测⑴将亲和提取后的样品用非还原型上样缓冲液按1:3的比例混合，沸水煮5分钟。⑵用15%的SDS-PAGE胶进行分离。⑶当前沿线达到凝胶底部时，卸胶。⑷将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上。⑸当预染的分子量全部转印至PVDF膜上时，停止转印。29 吉林大学博士学位论文⑹将膜用10%的脱脂奶粉封闭2小时。⑺将膜用anti-ORF2或者anti-ORF3的单抗孵育，洗膜后二抗孵育，然后显色。2.2.12.2ORF2蛋白的糖染色⑴将亲和提取后的样品用15%的SDS-PAGE胶进行分离。⑵当前沿线达到凝胶底部时，卸胶。⑶将凝胶按照说明书的步骤进行糖蛋白的染色。⑷当阳性对照有明显紫色条带，而阴性对照没有条带显现时终止反应，对样品的反应结果进行观察。2.2.12.3质谱检测亲和提取的ORF2蛋白序列⑴将亲和提取后的样品用15%的SDS-PAGE胶进行分离。⑵当前沿线达到凝胶底部时，卸胶。⑶将凝胶进行考马斯亮蓝染色，脱色，将凝胶上在WB实验中呈现阳性反应的条带切下，送至军科院蛋白质检测中心检测蛋白质序列。2.2.13ORF2蛋白和HEVRNA的自组装[83]ORF2蛋白和HEVRNA的自组装条件是参照Touze等人的实验条件进行。⑴将550ng提取的ORF2蛋白溶解于自组装溶液中，室温静止1小时。⑵取RNA浓度为1μg/μl的样品60μl，加入DMSO，使其终浓度为1%，室温静止1小时后加至处理后的ORF2蛋白溶液中。⑶将RNA和ORF2蛋白的混合物在含有5mMCaCl2的透析液中4℃透析过夜。⑷将透析后的混合物加入RNaseA酶，使其终浓度为20μg/ml，37℃孵育1小时后超离检测。⑸ORF2蛋白含量范围的确定：为了检测ORF2在不同浓度下与RNA的结合效率，我们在RNA加入量为100μg时，将加入蛋白量从5500ng十倍稀释至5.5ng，而后超离混合物，检测形成颗粒的RNA含量。2.2.14、自组装样品的透射电镜检测将自组装的样品用2%乙酸双氧铀染色，而后用HitachiH-7500透射电镜进行电镜观察，电压80kV。电镜观察在中国农业大学完成。30 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析2.3实验结果2.3.1ORF2蛋白和HEVRNA含量的检测将变性后的样品用ELISA检测ORF2抗原和RT-PCR检测HEVRNA的方法确定后，以标准品做线性回归，结果表明，标准品的抗原含量在10-100μg/ml的74范围内和OD450呈线性相关，而RNA含量在7×10copies/ml至7×10copies/ml间和Ct至也呈线性相关。检测范围如图所示。图2.1ORF2蛋白（A）及HEVRNA（B）检测标准曲线。（A）：X轴为ORF2蛋白浓度，Y轴为相应的OD450检测值。（B）：X轴为HEVRNA含量，Y轴为RT-PCR检测CT值。Figure2.1.ThestandardcurveofORF2protein(A)andHEVRNA(B).(A):TheX-axisistheconcentrationofORF2proteinstandardandY-axisisthevalueofOD450.(B):X-axisistheconcentrationofHEVRNAstandardandY-axisistheCtvalueofrealtimeRT-PCR.2.3.2不同来源HEV超离后ORF2蛋白与RNA的分布为了分析HEV在蔗糖密度梯度离心中的分布情况，将RNA浓度相同的细胞培养上清浓缩产物和含病毒的粪便样品用蔗糖密度梯度进行超速离心，将超离后样品逐层收集，变性后检测ORF2蛋白和RNA含量。实验结果显示位于细胞培养上清中HEV和粪便中HEV的超离后HEVRNA和ORF2蛋白的分布于不同的密度层。将ORF2蛋白含量为18.06μg，RNA含量为7.6×107的细胞培养上清进行超速离心实验。超离后各层的ORF2蛋白和HEVRNA的分布结果如图所示，ORF2蛋白只有一个富集层，富集层的密度为1.008-1.015g/cm3，在这一层中ORF2蛋白约占总ORF2蛋白含量的69.9%，RNA约占总HEVRNA含量的10.2%；HEVRNA有两个含量富集层，大部分的RNA均富集于密度为1.209g/cm3的密度层，这一层中ORF2蛋白约占总ORF2蛋白含量的1.5%，RNA约占总HEVRNA含量的31 吉林大学博士学位论文42.47%；而另一个RNA富集层的密度为1.071g/cm3的超离层，这一层中ORF2蛋白约占总ORF2蛋白含量的28.0%，RNA约占总HEVRNA含量的39.86%。将ORF2蛋白为0.38μg，RNA含量为7.75×107的粪便上清用同样的方法进行超离实验。超离后各层的结果分析见图。ORF2蛋白的分布于细胞培养上清的产物分布相似，只有一个ORF2蛋白富集层，其中ORF2蛋白约占总ORF2蛋白含量的83.0%，而RNA只占总HEVRNA含量的0.07%；RNA的分布于细胞培养上清的分布不同，只有一个含量富集层，其密度为1.243g/cm3，其中ORF2蛋白占总蛋白含量的0.81%，而RNA含量占总含量的89.90%。以上检测显示，两者相同之处是ORF2蛋白的峰值均在密度为1.0008-1.015g/cm3的密度层，而不同之处是细胞培养病毒的RNA峰在1.209g/cm3的密度层，而粪便中RNA的峰值分布于密度为1.243g/cm3的密度层。为了验证超离条件是否会破坏病毒进而造成这种衣壳蛋白与病毒核酸分离的现象，我们将刚收获的病毒用4%的多聚甲醛固定，而后以相同的条件进行超离，再次对ORF2蛋白和HEVRNA进行检测，结果发现：ORF2蛋白依然和RNA分布于不同的超离层中。因此可以确定，在超离过程中，病毒结构并没有被破坏，这种衣壳蛋白与病毒核酸分离的现象在病毒出细胞时就存在了。图2.2细胞培养上清和粪便中病毒样品超离后，RNA与ORF2蛋白分布图Figure2.2AandBaredensity-gradientfractionofHEVincellculturesupernatant(A)andfeces(B).TheX-axisshowsthefractionnumber,theleftY-axisistheORF2proteincontentinthefractionandtherightY-axisistheRNAcontentinthefraction.32 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析2.3.3HEV病毒的感染和复制能力的检测由于在超离过程中出现了ORF2蛋白和RNA富集于不同蔗糖密度层的情况，为了确定具有复制能力的病毒所在位置，我们将细胞培养上清和粪便的样品超离所得各层均与PLC/PRF/5细胞共同孵育，进行病毒培养。结果发现无论是细胞培养上清的还是粪便的超离层，只有密度为1.174-1.245g/cm3的密度层才能在PLC/PRF/5细胞的培养体系中有效培养，而细胞培养样品密度为1.209g/cm3的密度层和粪便样品密度为1.243g/cm3的密度层的感染性和复制性最好。而细胞培养上清中密度为1.071g/cm3的超离层在于PLC/PRF/5细胞培养2个月后，依然没有能够检测到病毒的产生。对细胞培养样品的1.209g/cm3的密度层来说，当孵育病毒RNA含量为3.4×108copies/ml和3.4×107copies/ml时，子代HEV滴度为5×102copies/ml时间分别为27天和34天；而子代HEV滴度为1×106copies/ml时间分别为43天和47天。而后滴度持续增高，在攻毒60天后，病毒复制达高峰期。对粪便样品的1.243g/cm3的密度层，当孵育病毒RNA含量为1.08×109copies/ml和1.08×108copies/ml时，子代HEV滴度为5×102copies/ml的时间分别为27天和34天；而子代HEV滴度为1×106copies/ml的时间分别为50天和53天。而后滴度持续增高，在攻毒63天后，病毒复制达高峰期。图2.3超离各层与PLC/PRF/5细胞培养后，细胞培养上清中子代病毒增殖曲线Figure2.3ThequantificationofHEVRNAinculturesupernatantofPLC/PRF/5cellsincubatedwithvirusfromcellculture(C)andfromfeces(D).TheX-axisisthetimepostincubationandtheY-axisistheHEVRNAconcentration.33 吉林大学博士学位论文2.3.4不同来源HEV的构成分析及脂类、ORF3蛋白对病毒与细胞结合的影响细胞培养和粪便中感染性病毒的密度不同，细胞培养的HEV的密度为1.209g/cm3，而粪便中HEV的密度为1.243g/cm3。将细胞培养的HEV用NP40处理后再次离心，结果表明，HEV集中于1.243g/cm3的密度层，与粪便中的分布相同。此结果说明细胞上清中的HEV病毒颗粒被脂类所包裹，所以离心的密度较低，而去除了脂类后密度变为与粪便的HEV密度相同。图2.4不同来源病毒超离后RNA分布图Figure2.4Thedensity-gradientfractionofvirusfromdifferentsourcesandwithdifferenttreatments.TheX-axisisthefractionnumberandtherightY-axisisthedensityofthefraction.TheleftY-axisistheHEVRNAcontent.我们用偶联有ORF3抗体的Sepherose4B胶与样品混合孵育，然后检测胶上捕获的HEVRNA，进而检测ORF3蛋白在病毒中的位置和分布。细胞培养上清中的病毒，脱脂后的病毒，脱脂后又脱去ORF3蛋白的病毒，均与偶联后的胶孵育，而后被捕获的HEVRNA结果如图所示，细胞上清中的RNA有3%与胶结合，而同一样品经过NP40脱脂处理后，结合率升至20%，而后又经过脱ORF3处理后，结合率降至1.2%。这结果提示：暴露于病毒表面的ORF3蛋白含量很少，仅有3%，而脱脂后的ORF3结合率增加至20%，说明病毒表面的ORF3蛋白大部分是被脂类覆盖的。而脱ORF3后的结合率的降低，证明此步骤对ORF3的去除是有效的，可以用于下一步实验。对粪便来源的病毒，脱脂前后的ORF3结合率并无改变，均为0.03%，说明在粪便来源病毒的表面，几乎没有ORF3蛋白的存在。为了分析脂膜和ORF3蛋白对病毒与细胞结合的作用，将几种处理后的样品34 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析与细胞共孵育，按时间点对细胞进行收集，检测细胞结合的RNA含量，进而检测病毒与细胞的结合效率。结果如图所示：来源于粪便中的病毒和来源于细胞上清的病毒在去除了脂膜和ORF3蛋白后与细胞的结合率是最高的，二者在24小时时与细胞的结合量分别为2.5×108拷贝/孔和3.96×108拷贝/孔，而在72小时的时候，二者与细胞的结合量分别为3.00×109拷贝/孔和1.11×109拷贝/孔。二者的结合效率较为相似。而细胞上清中的病毒在脱脂前后，与细胞的结合效率相似，均低于不含有ORF3蛋白的病毒。细胞上清中的病毒在脱脂前后，在24小时的时候与细胞结合的RNA含量分别为3.62×107拷贝/孔和5.93×107拷贝/孔，而在72小时的时候，二者与细胞的结合量分别为3.72×108拷贝/孔和3.89×108拷贝/孔，是不含ORF3蛋白病毒的结合效率的33.51%和35.04%。这些结果说明：脂膜对病毒与PLC/PRF/5细胞的结合是没有影响的，而ORF3蛋白则对二者的结合是起到阻碍作用的。图2.5不同来源病毒与ORF3单抗结合率示意图（A）及病毒与细胞结合率示意图Figure2.5TheanalysisofthefractionrichinHEVRNA.(A)Thebindingabilityofvirustoanti-ORF3MAb,theY-axisisthepercentageofbindingHEVRNAtototalHEVRNAofsample.The*representsthePvalueofHEVvirusinthecellculturesupernatantwithNP40treatmentcomparedtothesamesamplewithoutNP40treatment.Pvalueislessthan0.05.(B)Thebindingeffectofvirustocells,theX-axisisthetimepostincubationwithsamplesandtheY-axiswasthebindingRNAcontenttocells.35 吉林大学博士学位论文为了检测ORF2蛋白和ORF3蛋白在病毒中的存在形式，将粪便中和细胞培养上清中的病毒层均用ELISA和WB进行检测。WB的检测结果发现，只有细胞培养上清中的ORF3蛋白在PVDF膜上呈现阳性反应，而其余均无阳性反应条带。在ELISA实验中，用现有的商业化HEV抗原检测试剂盒没能够将两种来源的病毒层中的ORF2检出，而对细胞培养上清中的病毒，通过对ORF3抗体偶联后的亲和层析的洗脱液的检测发现，将亲和后的洗脱液10倍浓缩后，样品中HEVRNA的浓度为7.68×108拷贝/ml，而HEVORF2蛋白的浓度为8.25ng/ml。这说明RNA、ORF2和ORF3蛋白均存在于细胞培养上清中的病毒结构里，病毒脱脂后能够被ORF3抗体捕获。我们还试图分析粪便来源的病毒中RNA和ORF2蛋白中间的关系，但由于不同样品间比例并不完全一致，所以这部分工作仍在进行中。Mr超离样品图2.6ORF3蛋白检测WB图（细胞培养上清中病毒样品超离后第15层）Figure2.6Thefraction15ofcellculturesupernatantwasdetectedbywesternblottingwithananti-ORF3MAb.2.3.5细胞培养上清中ORF2蛋白的分析由于富含RNA超离层中的ORF2蛋白无法在WB中检出，所以我们将低密度层中的ORF2蛋白进行提取，并对其进行分析，发现存在于低密度超离层中的ORF2蛋白是糖蛋白，能够结合HEVRNA，二者形成的结构在超离中位于高密度层，其密度与粪便中的病毒密度相似。WB的分析结果如图所示，在分子量为88kDa的位置有一条明显与ORF2单抗显示阳性反应的条带，将SDS-PAGE胶上的相应条带切下，进行质谱测序，共测出14片段，其范围分布于第101-643位氨基酸之间，说明该片段为HEVORF236 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析蛋白。此外，将SDS-PAGE胶做高碘酸希夫碱染色，即利用高碘酸溶液将糖蛋白中的二元醇糖基团进行氧化，所形成的醛基基团与Schiff试剂呈现红色条带，当阳性对照呈现红色，而阴性对照蛋白依然无色时为实验的结束时间，而ORF2蛋白显现很强的阳性反应条带。糖基化现象很明显。结果如图所示。ORF2蛋白MrORF2蛋白Mr阳性对照阴性对照图2.7ORF2蛋白检测WB示意图（A）及高碘酸席夫碱染色示意图Figure2.7AnalysisoftheORF2proteinfromthecellculturesupernatant.(A)Westernblottingoftheproteinusingananti-ORF2MAb.(B)TheglycoproteinstainingoftheSDS-PAGEgel.Thesamplecontainsthesamemagentabandasthepositivecontrolandthenegativecontrolhasnoband.ThefirstwasthesampleofORF2proteincapturedbybeads.Thesecondwasthepositivecontrolandthethirdwasthenegativecontrol.为了确定提取到的ORF2蛋白是否能够保护RNA，并和HEVRNA进行组装，形成一定的结构，我们将ORF2蛋白和HEVRNA在5mMCaCl2存在的情况下进行了组装实验，并将组装产物进行分析。我们首先对组装产物的产量和加入ORF2蛋白含量之间的关系进行了检测，当RNA的含量为100μg时，分别加入5.5ng，55ng和550ng的ORF2蛋白时，RNA-ORF2的组装产物的含量分别为0.46μg，3.67μg和35.51μg。但是，当加入的ORF2蛋白的含量增至5500ng时，RNA-ORF2的组装产物的含量反而下降至33.23ng。37 吉林大学博士学位论文将ORF2蛋白，HEVRNA和二者的组装产物用超离分析RNA和ORF2的分布。结果如图所示：当加入550ng的ORF2蛋白时，ORF2蛋白主要富集在密度为1.008-1.015g/cm3的超离层；而RNA在超离中主要富集在密度为1.045-1.135g/cm3的超离层，但随着RNaseA的加入，此处的RNA会降解；如果将ORF2蛋白和RNA在组装的条件下进行混合后，再次进行超离，ORF2的富集层密度没有改变，但RNA富集层的密度则增加至1.240-1.249g/cm3，而且此层的RNA不会被RNaseA降解，含量会随着加入的ORF2蛋白的含量而改变，此层的ORF2蛋白占总ORF2蛋白含量的0.03%，此层的密度与粪便中HEV的密度相同。这些结果提示：从培养上清中提取的ORF2蛋白能够结合并保护RNA，形成一定的结构，其密度为1.209-1.242g/cm3。透射电镜结果分析显示，在视野内有37nm左右的颗粒出现。图2.8ORF2-RNA结合物超离示意图（A）及透射电镜检测结果（B）Figure2.8TheanalysisoftherefoldedRNA-ORF2proteinmixture.(A)TheRNAcontentindensity-gradientfractionsofthesamplesandcontrols.TheX-axisisthefractionnumber,theleftY-axisisthedensityofthefractionandtherightY-axisistheHEVRNAcontent.TheORF2proteincontentindensity-gradientfractionsofthesamplesandcontrols.TheX-axisisthefractionnumber,theleftY-axisisthedensityofthefractionandtherightY-axisistheORF2proteincontent.(B)Transmissionelectronmicroscopyofthesamplestainedwithuranylacetate.Thescalebarindicates200nm.2.4讨论由于缺少有效的细胞培养体系，对戊肝病毒的分子生物学研究主要是依靠两种途径：感染性克隆对敏感细胞的转染和单个病毒蛋白的高效表达。通过这些方38 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析法对戊肝病毒的结构研究，认为戊肝病毒的结构大致为：ORF2蛋白通过N末端的精氨酸富含区域与RNA缠绕结合，然后组装形成衣壳，ORF3蛋白包裹于ORF2的外侧，介导病毒出细胞，病毒在出胞的时候盗取了一部分宿主细胞的脂膜。但在脂膜的外侧是否有ORF3蛋白的存在没有定论。在本研究中，我们通过建立的病毒培养体系，对培养的病毒进行提取分析，并通过比较它与粪便来源的病毒的异同，进而分析戊肝病毒的结构和组成。首先，通过对粪便来源和细胞培养上清的病毒进行超离分析的结果发现：从二者的超离分布来看，大部分的ORF2蛋白并没有和RNA分布于同一超离层，而是以非颗粒的形式存在于超离的顶部，并且没有复制能力；RNA则位于超离的底部，在颗粒层的位置，是具有的复制能力的部分。进一步对两种来源的病毒进行详细分层发现：细胞培养上清中的病毒位于密度为1.209g/cm3的超离层，而粪便来源的病毒则位于密度为1.243g/cm3的超离层，密度为1.209g/cm3的超离层中的病毒用NP40处理后在再次超离，密度变为1.243g/cm3。这些结果提示：戊肝病毒的结构组成同甲肝病毒的结构组成很相似，当病毒从宿主细胞出胞时，盗取了细胞的脂膜用来形成包膜，从而导致病毒出胞后密度变轻，而脱脂后，密度变重，与粪便中的病毒密度相同。这一现象与甲肝病毒也有不同之处[84]；细胞培养获取的甲肝病毒在超离时存在有两个超离层，即甲肝病毒在出细胞时有两种形式的存在——有包膜病毒和无包膜病毒，但细胞培养的戊肝病毒在超离时仅有一个超离层的存在，即有包膜的超离层。这结果提示这种从细胞中释放的无包膜戊肝病毒的含量很低，无法达到检测限。戊肝病毒与甲肝病毒一样，病毒出胞时带有脂膜，但脂膜的表面上是否有病毒结构蛋白的存在，目前还没有确定。我们的研究中发现，当细胞培养上清中的病毒未经处理时，仅有3%的病毒结合在偶联有ORF3单抗的亲和胶上，但是如果将病毒做了脱脂处理后，病毒与亲和胶的结合率会提高至20%，这一实验结果与[49]之前的一些实验结果相符合，在Takahashi的研究中也显示，经过5%的Tween20处理后的戊肝病毒与ORF3抗体的结合率由最初的38.5%升高至90.4%。在Emerson[48]的实验中，ORF3抗体与未处理的细胞培养上清中的病毒没有很高的结合率，但在经过脱脂处理后，结合率也得到了很大的提高。虽然Takashi等人在2008年的研究中认为，针对ORF3单抗能够捕获病毒，并对病毒有部分中和作用，但在其2010年的研究中认为，血液和细胞培养上清中的病毒，无论是否有抗体的存39 吉林大学博士学位论文在，都能够在敏感细胞中培养，同时，同一株针对ORF3的抗体对脱脂后的病毒具有更高的亲和性。除了对病毒表面的组成成分进行了研究外，我们还对这些成分对病毒与PLC/PRF/5细胞的结合影响进了检测。在几种处理后的样品中，我们发现，去除了ORF3的样品，无论是经过体外处理（NP40,2-ME和PronaseE的处理）后获得的，还是来源于粪便的经过体内消化获得的，均和PLC/PRF/5细胞具有较高的亲和性，而含有ORF3蛋白的培养上清中的病毒，无论有没有脱脂，它们与PLC/PRF/5细胞的结合率都小于不含ORF3蛋白的病毒，而且病毒脱脂前后与细胞的结合效率没有改变。这些实验结果提示，脂类对病毒与PLC/PRF/5细胞的结合没有很大的影响，而ORF3蛋白却阻碍了病毒与PLC/PRF/5细胞的结合。这也说明，ORF3蛋白的功能仅仅是负责病毒的出胞活动，而对病毒在肝细胞间的传播是不起到推动作用的。而在粪便的病毒中ORF3是不存在的，这也意味着戊肝病毒在宿主之间的传播不需要ORF3蛋白的存在，这也是病毒进化的需要，因为如果病毒与细胞的结合需要ORF3的参与，那么，对不含有ORF3蛋白的粪便来源的戊肝病毒来说，进入宿主细胞进行感染和复制都是比较困难的，这将不利与病毒在自然界的传播。但病毒在宿主体内扩散时，在不同细胞间的传播是否有ORF3蛋白的参与还要进一步研究。总之，通过对不同病毒的比较和分析，我们认为，细胞培养上清中的HEV是以有包膜病毒的形式存在的，即衣壳蛋白的外面有ORF3蛋白的包裹，而后，在ORF3蛋白的外侧包裹有宿主细胞的脂膜，但在包裹的脂膜的表面，仅含有少量HEVORF3蛋白的存在。我们在研究中除了对病毒的结构进行了分析外，还对病毒的组成进行了探讨。由于没能够获取足够数量的病毒，不能够对其组成的衣壳蛋白的形式进行分析，但是，我们通过对病毒培养系统中存在的衣壳蛋白进行提取，并对其组成形式进行了分析和描述，并对其结合RNA组装形成病毒的可能性做了分析。通过对病毒培养体系中ORF2蛋白的提取，我们对表达体系中ORF2蛋白的性质进行了分析。对蛋白进行质谱测序，结果显示提取的ORF2蛋白中含有C末端的52个氨基酸。这一结果和之前Shiota等人的研究结果相符合，均说明C末端的52个氨基酸存在于天然病毒的结构中。虽然，目前进行了临床实验的戊肝疫苗[85][86]（GSK和厦门大学生产的疫苗）都不含有这一段氨基酸，但在Field和Wang40 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析的研究中均发现，C末端573-660aa这一段序列，尤其是600以后的序列，与戊肝抗体阳性的病人血清中的IgG和IgM呈现强阳性反应。这一研究是否提示我们，如果将这段序列加入戊肝疫苗的构成并进行免疫，能够产生更强的免疫和保护效果。通过针对ORF2单抗的WB显色反应，我们清楚的观察到，在分子量为88kDa的位置有阳性反应条带，为了确定检测的准确性，我们将阳性条带进行了质谱测序，测序结果证明为ORF2蛋白，这一结果与ORF2蛋白在哺乳动物细胞表达的结[27][26]果较为相似，均为糖基化的蛋白，但是和Emerson及Shiota的研究结果不符合，在Emerson等人的研究中，HEV颗粒中ORF2蛋白的分子量为75kDa。如果Emerson和Shiota的研究结果为正确的话，那么88kDa的ORF2蛋白是如何剪切为75kDa的分子并与RNA折叠形成病毒颗粒；或者形成病毒颗粒的糖基化蛋白是如何剪切变为75kDa的分子的，需要进一步进行研究。由于我们无法提取到病毒颗粒中的ORF2蛋白，所以我们对提取到的培养体系中的大部分ORF2蛋白进行了研究，以观察它是否有结合RNA组装成病毒的可能性。我们按照HPV自组装的条件对提取的ORF2蛋白和HEVRNA进行了组装实验，结果显示这种提取的糖基化的ORF2蛋白能够结合RNA，并形成一定的结构，这种结构在超离中具有和粪便中病毒相似的沉降速率。而透射电镜观察发现此超离层中有37nm颗粒的出现。这些结果均提示，这种糖基化的ORF2蛋白有可能是病毒颗粒的组成蛋白。对病毒颗粒中的ORF2蛋白的分子量究竟是多少，是否为糖基化的蛋白，一直以来没有定论。由于缺少有效的细胞培养体系，天然病毒的衣壳蛋白始终是未知的。Jameel等人以哺乳动物表达系统为表达系统，通过研究认为，ORF2蛋白是糖基化的蛋白，Torresi等人也用哺乳动物细胞的表达系统对ORF2蛋白在细胞内的胞质中和细胞膜上的表达进行了比较，研究认为：糖基化的ORF2蛋白可能无法介导戊肝病毒衣壳蛋白的的组装，而且糖基化的ORF2蛋白可能是ORF2蛋白在体外合成时，作为异源蛋白的人为构造的形式，不是天然的形式。Graffi等人通过感染性克隆的研究手段认为：在转染了感染性克隆的细胞内，聚集的ORF2蛋白大部分是非糖基化蛋白；3个N末端糖基化位点的沉默会导致病毒无法合成，但这种病毒合成失败的原因更多是由于突变位点的引起结构信息的改变，而不是糖基化的影响。上述这些研究都没有能够对病毒颗粒中ORF2的结构和形式做出准41 吉林大学博士学位论文确的定论。我们虽然也没能检测到颗粒中的ORF2病毒，但是我们的研究证明糖基化的ORF2蛋白是病毒表达体系中，在细胞上清中的主要存在形式，并且这种形式的蛋白有结合RNA并形成一定结构的可能性，即这种糖基化的ORF2蛋白有形成HEV的可能性。我们也试图检测蛋白的糖基化是否为病毒组装和出胞的关键。我们将正在出毒高峰期的PLC/PRF/5细胞用衣霉素做了N末端糖基化的抑制试验，试验结果显示实验组和对照组的病毒出毒滴度没有较大变化，提示N末端糖基化的抑制对病[87]毒的组装和出胞没有影响。这也和之前的Emerson等人的实验结果相似，他们的结果提示：三个保守的N糖位点的突变并不能够影响基因的复制和衣壳蛋白的合成。而这种位点突变对病毒的致命性不在于蛋白的糖基化，而在于位点自身对序列的影响。LiXing等人在利用HEVVLP的结构对病毒的组装信息进行研究时发现：RNA对病毒的组装很重要，在有RNA存在时，含有RNA结合区域的ORF2蛋白能够和RNA结合，组装成T=3的结构，同时推测RNA与蛋白的结合是天然病毒组装的重要因素。而我们的研究表明：病毒培养系统中的ORF2蛋白大部分都是以非颗粒形式出现的，而这些蛋白在与RNA共存于适合的组装条件时会组装成一定的结构，并具有与粪便中HEV相似的沉降速率，推测HEVRNA对HEV的组装是很重要的条件之一。综上所述，本研究主要发现ORF2蛋白和HEVRNA在超离中分布于不同的超离层。对细胞培养上清中的病毒结构进行分析发现，ORF3蛋白包裹于ORF2蛋白的外侧，而在二者的外面还有脂膜的包裹，脂膜的表面存在有少量的ORF3蛋白。而粪便中的HEV则只有ORF2蛋白包裹HEVRNA形成无包膜的HEV病毒颗粒。同时，研究还发现，存在于低密度层的糖基化的ORF2蛋白能够缠绕并保护RNA，形成一定的结构，在超离中具有一定的沉降速率，这些提示，这种ORF2蛋白可能是天然病毒颗粒的构成蛋白。42 第2章戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析2.5小结1、用超离对粪便和细胞培养上清中的病毒进行分离分析发现，无论是细胞培养上清还是粪便中的HEV样品，大部分ORF2蛋白和RNA分布于不同的超离层。2、HEV的感染和复制能力与RNA呈正相关。只有富含HEVRNA的超离层才具有感染和复制的能力。3、细胞培养上清中的病毒表面存在有ORF3蛋白，并被脂膜包裹，脂膜的表面有少量ORF3蛋白的存在。而在粪便来源的HEV表面则没有HEVORF3蛋白和脂膜的存在。4、脂膜对HEV与PLC/PRF/5的结合没有影响，ORF3蛋白则阻碍了HEV与细胞的结合。5、在超离中存在于低密度超离层中的ORF2蛋白为糖基化的蛋白，它能够结合病毒RNA，并保护RNA免于RNaseA的降解。二者的结合产物在超离中位于高密度超离层，具有和粪便来源病毒相同的沉降速率。43 44 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达3.1实验材料3.1.1细胞系昆虫细胞sf9，购自Invitrogen。3.1.2细胞培养所需溶液Sf9细胞所用培养基为SF-900Ⅱ培养基，货号10902070，购自Gibco，1.3×SF-900Ⅱ培养基购自Gibco，货号10967-032。3.1.3主要材料，试剂和溶液配制3.1.3.1主要试剂4%多聚甲醛溶液、SDS-PAGE电泳试剂和溶、考马斯亮蓝染液和脱色液、蔗糖、丙烯酰胺母液北京鼎国公司HRP标记羊抗鼠二抗北京中杉金桥甲醛、Tris、盐酸、氯化钠、氢氧化钠、尿素国药集团生产戊肝病毒抗原检测试剂盒、HEVIgG检测试剂盒北京万泰公司甲基纤维素Roche瑞士10×PBSHyclone美国蛋白分子量标准品（货号：26617）、糖染色检测试剂盒Thermo美国乙腈、甲酸Aldrich美国FBS、TMB显色、0.4%的台盼蓝染色液、TPCK处理的胰酶kitSigm美国抗HEVORF2单抗实验室自备3.1.3.2仪器6孔、96孔细胞培养板BD美国ELISPOT计数仪CTLELISPOT美国SDS-PAGE的电泳设备BioRad美国45 吉林大学博士学位论文凝胶成像仪AlphaImager美国超速离心机（型号为CP70ME）Hitachi日本Spinner瓶INTEGRA瑞士超滤浓缩离心管Millipore美国显微镜和细胞计数板奥林巴斯日本超声破碎仪购SONICS美国AKTA纯化仪、凝胶柱、ANX凝胶GE美国质谱仪（SYNAPTG2-S）Waters美国等电聚焦的制胶及聚焦设备GE美国高效液相色谱仪和C18分析柱安捷伦美国TSK5000岛津日本透析袋（透析分子量为3k）北京欣经科8-10周龄的BALB/c小鼠78只中国食品药品检定研究院3.1.3.3溶液配制1%甲基纤维素溶液的配制：取甲基纤维素20g，加入500ml去离子水，混匀，高压灭菌后4℃过夜溶解，培养细胞前，与1.3×SF-900Ⅱ培养基以1:3的比例混合均匀后置于铺好细胞的96孔板内。1×PBS溶液的配制：取10×PBS溶液100ml，加入900ml去离子水，混匀，备用。5%FBS溶液的配制：取5gFBS，加入100ml1×PBS溶液，混匀后待用。洗液：1×PBS溶液100ml加入Tween20溶液0.05ml，混匀待用。10%蔗糖溶液的制备：取蔗糖10g，加入80ml去离子水溶解后，再定容至100ml。40%蔗糖溶液的制备：取蔗糖40g，加入80ml去离子水溶解后，再定容至100ml。溶液：10%和40%的蔗糖溶液的配制如前所述。透析液的配制：配制0.2M的Tris母液和0.1M的盐酸母液，将250ml的Tris母液，400ml的盐酸母液混匀，加去离子水定容至1000ml。此溶液为pH值为7.5的透析液，浓度为0.05M。上样缓冲液（透析缓冲液）：缓冲液的离子浓度为20mMTris-HCl，pH值为7.5。洗脱缓冲液Ⅰ：在上样缓冲液内加入氯化钠，使其终浓度为0.05M。洗脱缓冲液Ⅱ：在上样缓冲液中加入氯化钠，使其终浓度为0.5M。46 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达在线清洗缓冲液：将40g的氢氧化钠加入800ml去离子水，溶解后用去离子水定容至1000ml。流动相A：在1000ml的去离子水中加入1ml甲酸，混匀，抽气过滤后超声脱气。流动相B：在1000ml的乙腈中加入1ml甲酸，混匀，抽气过滤后超声脱气。流动相C：配制20mMTris-HCl，加入氯化钠，使其终浓度为0.5M，pH值为7.5。抽气过滤后超声脱气。流动相D：去离子水抽气过滤后超声脱气。3.2实验方法3.2.1细胞培养Sf9细胞的贴壁培养：sf9细胞用SF-900Ⅱ培养基培养于27.5℃的生化培养箱内，每3-4天以1:3或1:4的比例传代。6Sf9细胞的悬浮培养：以1×10cells/ml的浓度将sf9细胞悬浮培养于spiner瓶中，转速为70rpm/min。3-4天后，以1:3或1:4的比例传代培养。3.2.2杆状病毒pfu检测用BacPAKBaculovirusRapidTiter法对病毒滴度进行检测。4⑴以6.5×10/孔的浓度将sf9细胞铺于96孔板中，在27.5℃条件下，于生化培养箱中培养，培养4小时。5⑵将待测的杆状病毒以1:10的比例进行系列稀释，病毒的滴度稀释至10至810IFU/ml，每空加入0.025ml，室温孵育1小时。⑶弃去上清，洗液洗三遍，加入浓度为1%的甲基纤维素培养基0.5ml，培养48小时。⑷直接加入4%的多聚甲醛室温固定10分钟。⑸洗液洗三遍，加入0.05ml的5%的FBS室温封闭10分钟。×⑹弃去封闭液，加入0.025ml的抗HEVORF2单抗（用1PBS溶液稀释抗体至0.2mg/ml,然后在以1:1000的比例稀释后使用。），37℃孵育30分钟。47 吉林大学博士学位论文⑺弃去上清，洗液洗三次，加入加入0.025ml的HRP标记羊抗鼠二抗（稀释比例为1:500），37℃孵育30分钟。⑻弃去上清，洗液清洗三次，加入TMB显色液，显色至阳性对照中有明显的斑点，而阴性对照中没有斑点形成，结束实验。⑼用ELISPOT计数仪对板内斑点进行计数。⑽计算病毒滴度。计算公式为：病毒滴度（IFU/ml）=每空阳性斑点数×稀释倍数×403.2.3VLP表达参数的优化3.2.3.1MOI的优化6⑴将sf9细胞以2×10cells/孔的数量铺于6孔板中，在27.5℃条件下，于生化培养箱中培养，培养至细胞铺满板内。⑵将已经确定了滴度的杆状病毒以MOI为1,3,5,7和9的值加入孔内，27.5℃条件下在生化培养箱中培养三天。⑶三天后弃去上清，将0.5ml的电泳上样缓冲液直接加在孔中，裂解细胞。⑷做浓度为12%的SDS-PAGE电泳凝胶，将裂解后的细胞上样，电泳。⑸电泳后卸胶，将凝胶进行考马斯亮蓝染色，脱色。⑹将脱色后的凝胶用AlphaImager凝胶成像仪进行扫描，检测不同MOI攻毒浓度下，细胞所产生的ORF2蛋白所占细胞总蛋白的百分比。3.2.3.2细胞收获时间的优化6⑴蛋白的表达是在悬浮条件下进行的。将100ml细胞密度为2.0×10cells/ml的sf9细胞悬浮培养于spinner瓶中，悬浮培养的转速为70rpm。⑵计算细胞总数，加入杆状病毒，使病毒与细胞的比值—MOI值为5。⑶培养攻毒后的sf9细胞，从48小时后开始收取细胞，每24小时收取一次，每次20ml。⑷将收取的样品用离心机离心分离细胞与培养上清。细胞超声破碎，离心去除细胞碎片。将细胞裂解液和培养上清均用100K的超滤柱浓缩至3ml。⑸铺好蔗糖密度梯度，将浓缩后的细胞裂解液和培养上清铺于蔗糖层上。超速离心2小时，转速为20,000rpm。48 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达⑹将超离上清和10%的VLP样品层分别进行SDS-PAGE检测，扫描确定VLP含量。3.2.3.3在确定细胞收获时间过程中进行细胞存活率检测⑴抽取0.02ml细胞，加入0.02ml的台盼蓝染液，混匀。⑵取0.01ml混合液加入细胞计数板中，在显微镜下进行细胞计数。⑶被染色为蓝色的细胞为死细胞，计数细胞总数，并计算细胞存活率。3.2.4蔗糖密度梯度层的制备及HEVVLP的初步提取3.2.4.1蔗糖密度梯度层的制备⑴配置浓度为10%和40%的蔗糖溶液，高压灭菌后待用。同时将超离所需的P40AT离心管和长针头等物品同时灭菌待用。⑵将1ml的10%的蔗糖溶液铺于最底层，然后将7ml40%的蔗糖溶液用长针头逐个注入最底层，将上一层蔗糖溶液顶起，从而形成不连续密度梯度层。3.2.4.2细胞破碎及细胞碎片的去除7⑴将收获的细胞用1×PBS溶液，以1×10cells/ml的浓度进行重悬。⑵将重悬后的细胞超声破碎，超声9秒，间歇5秒，超声20分钟。⑶超声后的样品用高速离心机以12000rpm的速度离心10分钟，去除细胞碎片3.2.4.3HEVVLP的初步提取⑴将超声破碎后的，澄清的细胞悬液轻轻铺于蔗糖层上。超速离心2小时，转速为20,000rpm。⑵超离结束后，抽取40%蔗糖层上的白色蛋白带，此层为HEVVLP所在层。⑶将HEVVLP中加入1%的甲醛固定24小时。⑷固定后的样品用截留分子量为3k的透析袋对透析液透析过夜，透析温度为4℃。3.2.5HEVVLP的柱层析纯化⑴以5倍柱体积的上样缓冲液平衡层析柱至基线无明显变化。⑵将透析后的样品已1ml/min的速度泵入ANX阴离子凝胶柱中，待样品全部泵入层析柱后，用上样缓冲液清洗至基线归零。⑶洗脱缓冲液Ⅰ清洗层析柱，流速为1.0ml/min，直至基线归零。49 吉林大学博士学位论文⑷用洗脱缓冲液Ⅱ洗脱层析柱，流速为1.0ml/min，同时收样品峰。当收峰结束后，用在线清洗缓冲液对柱子进行在线清洗。3.2.6样品分子量检测3.2.6.1样品表观分子量的检测⑴将纯化后的样品用还原型上样缓冲液按1:3的比例混合，沸水煮5分钟。⑵用12%的SDS-PAGE胶进行分离。⑶当前沿线达到凝胶底部时，卸胶，染色。⑷脱色后用AlphaImager凝胶成像仪进行扫描，以分子量标准品的迁移距离和分子量大小做回归曲线。通过扫描所得的样品的迁移距离计算样品的表观分子量。3.2.6.2样品质谱分子量的检测测定在正离子模式下进行。质谱仪的校正是用Glu-fib的串联碎片校正的，质量误差小于1ppm。雾化气为氮气，碰撞气为氩气，源温为100℃，锥孔电压为40V，毛细管电压为3kV，采用DDA模式自动进行MS测定。将纯化后的样品上样直接进行质谱分子量检测。3.2.7样品的糖染色⑴将纯化后样品用12%的SDS-PAGE胶进行分离。⑵当前沿线达到凝胶底部时，卸胶。⑶将凝胶按照说明书的步骤进行糖蛋白的染色。⑷当阳性对照有明显紫色条带，而阴性对照没有条带显现时终止反应，对样品的反应结果进行观察。3.2.8等电点的检测⑴称取尿素3g，加去离子水2.5ml，再加30%的丙烯酰胺母液1.2ml，混匀，加热溶解。⑵尿素溶解后加入两性电解质3.75μl，10%的过硫酸铵80μl，10%的TEMED80μl，混匀后加入制胶的模板中，制备厚度为0.75mm的凝胶。⑶将凝胶放置在聚焦仪上，预聚焦至电压为1000V，上样，聚焦30分钟。50 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达⑷聚焦结束后，将凝胶用考马斯亮蓝染色。⑸凝胶脱色后用AlphaImager凝胶成像仪进行扫描，以等电点标准品的迁移距离和pI值做回归曲线。通过扫描所得的样品的迁移距离计算样品的等电点。3.2.9肽图检测⑴取纯化后的样品1mg，用2-巯基乙醇变性。⑵将变性后的样品用Sigman生产的TPCK处理的胰酶kit按说明书进行样品处理后，37℃过夜酶切。⑶酶切后样品用采用安捷伦公司的C18柱及进样和数据采集系统分析检测，流动相A液为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B液为含0.1%甲酸的乙睛，流速0.5ml/min.。样品用以下梯度进行梯度洗脱：5-40min乙睛浓度从10%上升至85%，40-60min乙睛浓度保持在85%，60-70minA液平衡分析柱。⑷收集检测器信号，为样品的肽图。3.2.10样品纯度检测3.2.10.1SDS-PAGE检测样品纯度⑴将纯化后的样品用非还原型上样缓冲液按1:3的比例混合，沸水煮5分钟。⑵用12%的SDS-PAGE胶进行分离。⑶当前沿线达到凝胶底部时，卸胶，染色。⑷脱色后用AlphaImager凝胶成像仪进行扫描，通过扫描计算样品纯度。3.2.10.2SEC-HPLC检测样品纯度⑴以1.0ml/min的流速用流动相C平衡TSK5000，至基线稳定，检测值归零。⑵将纯化后的样品由自动进样器进样，使其蛋白含量至少为1mg。⑶检测器检测样品在TSK5000中的分离峰，并计算样品纯度。⑷上样结束后，用流动相D清洗TSK5000。3.2.11样品颗粒性的检测样品的电镜观察由中国农业大学完成。51 吉林大学博士学位论文3.2.12铝结合率检测⑴将与铝佐剂结合后的样品以12000rpm的速度离心15分钟，至溶液中氢氧化铝全部沉淀至离心管底部。⑵抽取上清100μl，与ORF2蛋白的标准品同时用戊肝病毒的抗原检测试剂盒检测。检测步骤按说明书进行。⑶读取待检样品样品与标准品的OD450，以标准品的浓度和OD450的值做回归曲线，计算样品的目的蛋白的浓度。⑷将上清中的目的蛋白的含量与加入的目的蛋白的含量进行比较，计算目的蛋白与氢氧化铝的结合率。3.2.13免疫原性检测⑴将吸附铝佐剂后的HEVVLP和非VLP样品进行系列稀释，稀释至蛋白含量为0.08μg，0.4μg，2.0μg和10μg。并将没有和铝佐剂进行吸附的VLP稀释至同样含量，用铝佐剂与生理盐水的混合物为阴性对照。⑵将小鼠分组，共分为13组，用皮下免疫的方式对将样品进行免疫。⑶一个月后，眼眶采血，收取血清。⑷用万泰生产的检测HEVIgG的试剂盒检测血清的抗体滴度。⑸计算GMT。表1HEVVLP免疫程序免疫分组免疫剂量免疫方式免疫程序HEVVLP皮下免疫0周免疫HEVVLP+0.08μg/0.4μg/只2μg/只10μg/只4周取血铝佐剂只非VLP+铝佐剂52 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达3.3实验结果3.3.1HEVVLPs表达参数的优化研究主要考察了HEVORF2126-621aa在sf9细胞中表达时的感染滴度、收获时间和感染时细胞浓度等参数对HEVVLP形成的影响。3.3.1.1病毒感染复数的优化以BacPAKBaculovirusRapidTiter法测定20111102批杆状病毒的滴度，以ELISPOT计数仪检测三孔的平均斑点数计算，20111102批的病毒滴度为4.5×107IFU/ml。将生长良好的sf9培养于6孔板内，当细胞贴壁长满后，以MOI为1、3、5、7和9的病毒滴度与细胞共同孵育，三天后收取细胞，裂解细胞并检测细胞中目的蛋白的表达含量。检测结果如图所示，当MOI在1、3、5、7和9时，目的蛋白中细胞总蛋白含量的19.74%、22.17%、25.13%、23.93%和21.55%。显示当MOI为5时，细胞中HEVROF2蛋白的表达量最高。并以此MOI为下一步进行细胞悬浮培养表达HEVVLP时的所选取感染滴度。图3.1不同MOI感染条件下ORF2蛋白在sf9细胞中表达含量示意图Figure3.1TheanalysisoftheMOIintheculture.The1，3，5，7and9showntheMOIoftheinfectedcells.3.3.1.2收获时间的优化53 吉林大学博士学位论文研究对VLP的表达参数进行优化时，对细胞的培养方式采用了悬浮培养，这种培养方式更适合疫苗的生产。对培养48、72、96、120和144小时的细胞和培养基分别用超离实验检测形成的VLP的含量，在超离检测中发现，在VLP的表达过程中，目的蛋白在表达的开始阶段并不是以VLP的形式存在的，在表达的最初（感染后48小时，72小时）目的蛋白是以非VLP的形式存在于细胞之中，表现为对细胞裂解液进行超离分析时，ORF2蛋白主要在超离顶部存在，从感染后96小时开始，VLP的含量逐渐增加，并在120小时达到表达高峰。对感染后48、72、96、120和144小时，表达体系中的VLP和非VLP蛋白进行检测，结果显示，HEVVLP在细胞内的表达浓度分别为：0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.050mg/ml、0.072mg/ml和0.067mg/ml；在培养基中的表达浓度分别为：0.000mg/ml/、0.000mg/ml、0.010mg/ml、0.020mg/ml和0.023mg/ml。这一结果说明，在VLP的表达过程中，在120小时的时候，VLP在细胞内的表达量是最高的，达0.072mg/ml；培养基中的VLP含量随着表达时间的延长会有部分升高，这种升高现象可能是由于细胞的裂解，部分VLP释放进入培养基的结果。通过对VLP和非VLP的表达监测还发现，VLP的形成并不是在杆状病毒感染昆虫细胞后立即开始的，而是在感染后72小时才开始形成，并在120小时的时候达到高峰，而在此过程中非VLP蛋白是始终存在的，表达结果提示ORF2126-621aa在昆虫细胞中的表达时首先是以非VLP的形式存在的，通过修饰、折叠，非VLP蛋白进一步形成了VLP结构。54 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达图3.2HEVVLP表达示意图。（A）细胞培养上清细胞中HEVVLP表达示意图。（B）细胞中VLP及non-VLP表达示意图。泳道1,3,5,7,9为non-VLP的表达含量，泳道2,4,6,8,10为VLP的表达含量。Figure3.2TheExpressionofVLPs.(A)TheperiodofcultureandtheconcentrationsofVLPs.(B)ShowstheexpressionofthetwoformsofHEVORF2proteinsafterultracentrifugation.Lanes1,3,5,7,and9arenon-VLPsandlanes2,4,6,8,and10areVLPs.Lanes1and2aresamplesat48hpi;lanes3and4aresamplesat72hpi;lanes5and6aresamplesat96hpi;lanes7and8aresamplesat120hpi;lanes9and10aresamplesat144hpi.Lanes1,3,5,7,and9arethesupernatantsafterultracentrifugationandtheotherlanesaresamplesin10%sucrosesolution.ProteinbandswerevisualizedwithCoomassieBrilliantBluestaining.研究同时对杆状病毒感染细胞后各时间点的细胞存活率进行了检测，结果如图，研究发现：细胞在刚加入杆状病毒时存活率较高，在48小时依然高达90%，随着表达时间的延长，ORF2蛋白表达的增加，细胞存活率逐步下降，至120小时的时候降为50%，而此时的VLP表达达到高峰，随着培养时间延长至144小时后，细胞存活率已经下降至26%，同时VLP的表达含量也从升高的趋势转为下降趋势。55 吉林大学博士学位论文图3.3培养过程中细胞浓度及细胞存活率示意图。Figure3.3TheViabilityandconcentrationsofSf9cellsovertimeafterinfectionwithORF2-rAcNPVatMOI=5.TheX-axisshowsthecellculturetimesandtheY-axisshowsthecellconcentrationsandviability.3.3.1.3感染时细胞浓度的优化研究确定了感染时细胞的培养浓度与VLP的表达量之间的关系。结果显示随着细胞浓度的逐步提高，VLP表达量逐步减少，当细胞浓度提高至5.0×106cells/ml时，细胞内无HEVVLPs的表达。结果如图所示，当细胞浓度达到5.0×106cells/ml时，在144小时的表达过程中，始终没有VLP的表达，ORF2蛋白始终是以非VLP的形式存在的，即样品超离后始终没能在10%至40%的超离层间形成白色的VLP条带。由此可见，感染杆状病毒时，昆虫细胞浓度过高，虽然单位培养基中目的蛋白的产量有所提高，但VLP的表达量反而减少。56 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达6图3.4细胞浓度为5.0×10cells/ml时VLP及non-VLP的表达示意图，泳道1,3,5,7,9为non-VLP的表达，2,4,6,8,10为VLP的表达。Figure3.4TheExpressionofVLPswith5.0×106cells/ml.TheexpressionofthetwoformsofHEVORF2proteinsafterultracentrifugation.Lanes1,3,5,7,and9arenon-VLPsandlanes2,4,6,8,and10areVLPs.Lanes1and2aresamplesat48hpi;lanes3and4aresamplesat72hpi;lanes5and6aresamplesat96hpi;lanes7and8aresamplesat120hpi;lanes9and10aresamplesat144hpi.Lanes1,3,5,7,and9arethesupernatantsafterultracentrifugationandtheotherlanesaresamplesin10%sucrosesolution.ProteinbandswerevisualizedwithCoomassieBrilliantBluestaining.综上所述，HEVVLP的表达含量受多个参数的影响，当昆虫细胞以悬浮培养的方式进行HEVVLP的表达时，细胞浓度为2.0×106cells/ml，MOI为5时，在120小时收获细胞，VLP的收获量最多，达到0.72mg/ml。57 吉林大学博士学位论文3.3.2HEVVLPs分离纯化工艺摸索3.3.2.1细胞破碎将培养时间为120小时，细胞存活率为50%左右的sf9细胞以离心的方式进行收获，并以PBS对细胞进行重悬，使细胞浓度约为1.0×107cells/ml，超声破碎后，以12000rpm的转速离心去除细胞碎片，检测裂解液中ORF2蛋白的含量，占总蛋白含量的20.3%。这一步主要是将目的蛋白从细胞中分离出来。3.3.2.2HEVVLP的初步提取由于ORF2126-621aa在昆虫细胞中表达时会有非VLP蛋白的形成，所以需要用超速离心的方式去除非VLP蛋白。将澄清的细胞裂解液以20000rpm的转速离心2小时后，取超离后离心管检测发现，VLP会在40%蔗糖层的上方形成白色条带，而非VLP的蛋白依然存在于蔗糖层的顶部，抽取VLP的白色条带层检测，结果显示经此步骤，VLP的纯度为29.9%，同超声破碎后的细胞裂解液相比，目的蛋白的纯度并没有大幅度提高，但是非VLP蛋白通过此步骤从VLP中去除，不会带入下一纯化步骤。3.3.2.3VLP的透析和固定[42]Li等人认为HEVVLP仅在MES缓冲液中呈现稳定状态，所以将超离作为HEVVLP的主要纯化手段，本研究在超离纯化后添加了固定的步骤，增加了VLP的结构稳定性，使VLP在进一步的纯化过程中能够维持形态结构的稳定。超离后收取的VLP样品中含有高浓度的蔗糖，VLP在此缓冲液中无法和ANX凝胶结合，需要进行缓冲液的置换。对样品进行缓冲液的置换有超滤和透析两种方法，超滤置换样品缓冲液具有处理时间短、样品处理量大等优点，而透析实验条件温和。在本研究中，由于VLP样品在进行柱层析纯化前需要固定处理，此步骤需要样品与固定剂接触一定时间，因此采用透析的方法置换缓冲液。在透析液中加入固定剂，将固定和透析同时进行，并在此过程中以温和的方式去除了部分小分子杂质。检测透析后的样品，VLP纯度提高至40.4%。3.3.2.4VLP的柱层析纯化[28]Robinson的研究发现，ORF2在昆虫细胞中表达的56kDa的蛋白能够结合QSepharoseFF阴离子凝胶。所以研究应用了QSepharoseFF，DEAESepharoseFF，58 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达ANXFF等阴离子凝胶，及Bulty-S4FF等凝胶对VLP进行了纯化摸索，结果显示，ANXFF能够特异性结合HEVVLP，无需其他凝胶的辅助纯化，纯度即可从40.7%提高至97.6%。对HEVVLP与ANX凝胶的结合及洗脱条件，在研究中也进行了摸索，研究发现，VLP与ANX凝胶结合后，在50mMNaCl的盐浓度下，VLP无法从凝胶上解离，而部分细胞裂解液中的杂质开始从凝胶中解离，直至NaCl浓度提高至200mM，VLP开始从凝胶中解离，而在NaCl浓度提高500mM时，80.5%的VLP从凝胶中解离，当NaCl浓度提高至2M时，大部分杂质蛋白均从凝胶上解离。因此，将含有50mMNaCl的缓冲液用于清洗杂蛋白，将500mMNaCl的缓冲液用于洗脱VLP，并用2MNaCl缓冲液洗脱全部杂质，并在洗脱杂质后用0.5MNaOH进行凝胶的在线清洗。图3.4VLP的纯化过程检测示意图（A）及纯化过程示意图（B）。Figure3.4PurificationofVLPs.(A)TheSDS-PAGEanalysesofthepurificationproducts.LaneMr,molecular-weightmarker;lane1to4werethepurificationproductaftersteponetofourrespectively.(B)TheschematicrepresentationofthepurificationprocessusedforrecombinantHEVVLPs.59 吉林大学博士学位论文3.3.3HEVVLPs评价体系的初步建立研究主要对经此工艺制备的VLP的理化性质、纯度和免疫原性进行了评定。3.3.3.1ORF2蛋白理化性质的考察对HEVORF2在sf9中表达的VLP，分别对其分子量、糖基化程度、等电点、胰酶裂解后，HPLC检测的肽图等方面进行考察。ORF2蛋白的分子量：转入杆状病毒表达载体中的ORF2基因在sf9细胞中表达的蛋白有496个氨基酸，理论分子量为53.3178kDa。以分子量标准品中的蛋白大小和迁移距离做二次回归曲线，用样品的迁移距离来计算样品的大小，样品的分子量为58.23kDa，结果如图所示，显然样品的表观分子量要高于其理论分子量，所以推测蛋白在表达时出现了糖基化现象，从而导致样品的表观分子量增加。图3.5ORF2蛋白的分子量检测示意图Figure3.5TheanalysisofORF2molecularweightbySDS-PAGE.TheleftwasthecalculationofthemolecularweightandtherightwastheSDS-PAGEgel.60 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达为了准确检测样品的分子量，用MALDI-TOF质谱对样品的分子量进行了进一步的测定，经过质谱检测，其质谱分子量为53.327、53.370和53.411kDa，这与蛋白的理论分子量最大的相差仅97Da，而加糖后的分子量的变化至少大于100Da，所以HEVORF2蛋白在sf9细胞中并没有被糖基化修饰，质谱检测结果如图：图3.6ORF2蛋白质谱检测示意图Figure3.6TheanalysisofmolecularweightbyMS.TheY-axisshowntheweightoftheprotein.61 吉林大学博士学位论文ORF2蛋白的糖染色为了进一步确定ORF2蛋白在sf9细胞中的表达是否有糖基化现象，我们对提取的三批ORF2蛋白进行检测，样品经过SDS-PAGE电泳后，将SDS-PAGE胶做高碘酸希夫碱染色，即利用高碘酸溶液将糖蛋白中的二元醇糖基团进行氧化，所形成的醛基基团与Schiff试剂呈现红色条带，而在阳性对照反应强烈，阴性反应没有呈现颜色变化的时候，观察样品的反应，结果如图所示，样品处并没有阳性反应条带，说明HEVORF2蛋白在sf9细胞中表达时，并没有被糖基化修饰，与质谱检测的结论相同。图3.7ORF2蛋白高碘酸席夫碱糖染色检测示意图。Figure3.7TheglycoproteinstainingoftheSDS-PAGEgel.Thesamplecontainsthesamemagentabandasthepositivecontrolandthenegativecontrolhasnoband.Thesamples1-3wereORF2proteinpurifiedafterstep4.Thefirstlanewasthepositivecontrolandthesecondlanewasthenegativecontrol.62 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达ORF2蛋白的等电点检测将提取的ORF2蛋白在变性等电聚焦的胶片上进行聚焦，检测pI值，经考马斯亮蓝染色后，ORF2蛋白有四个条带出现，经扫描计算，其等电点分别为6.11,5.94,5.75和5.56。结果显示，即使是在离子交换、分子筛和WB上都显示为单一蛋白，但在等点聚焦上显示了不同的条带，这可能是一种蛋白有不同的修饰。结果如图：图3.8变性等电聚焦检测ORF2蛋白等电点检测示意图Figure3.8TheanalysisofpIusingisoelectricfocusing(IEF).TheleftwasthecalculationofthepIandtherightwastheIEFgel.63 吉林大学博士学位论文ORF2蛋白被胰酶裂解后的肽图检测将提取后的ORF2蛋白用胰酶裂解后，用HPLC检测肽图。ORF2蛋白在理论上共切出肽段24条，但由于少数肽段仅有几个氨基酸，容易造成丢失现象。在进行肽段检测时，仅有20个特征峰的出现，结果如下：图3.9ORF2蛋白肽图检测示意图Figure3.9ThepeptidemapsofORF2protein.SamplesweredigestedtopeptidesusingtrypsinandthepeptidesweremappedbyHPLConaC18column.3.3.3.2ORF2蛋白纯度检测对样品纯度的检测共采用两种方法，分别为SDS-PAGE电泳检测纯度和SEC-HPLC检测纯度。ORF2蛋白的SDS-PAGE电泳纯度用非还原SDS-PAGE对样品的纯度进行检，在分离胶的浓度为12%时，检测纯化后的ORF2，检测结果如下，样品纯度达到97.7%。64 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达图3.10VLP纯度检测示意图（电泳法）Figure3.10ThepurificationofVLPsusingSDS-PAGE.Theleftwasshownthecalculationofstep4andtherightwasshowntheSDS-PAGEgelofthepurificationscheme.ORF2蛋白的SEC-HPLC纯度纯化工艺的终末步骤为离子交换层析，所以在进行纯度分析时，采用了与终末纯化步骤不同分离原理的分子筛层析进行检测。在流速为1.0ml/min的分离条件下，样品的纯度为100%。这说明样品在SEC的凝胶颗粒中体现了良好的蛋白均一性。结果如图：图3.11VLP纯度检测示意图（SEC-HPLC）Figure3.11ThepurificationofVLPsusingSEC-HPLC.TheY-axiswasshowntheadsorptionofOD280.65 吉林大学博士学位论文3.3.3.3样品颗粒性检测对样品的颗粒性检测是通过透射电镜进行观察的，样品在电镜的视野中可见颗粒，颗粒直径分布于25-45nm，如图所示：图3.11VLP透射电镜照片。Figure3.11TheMicrographofVLPs.VLPswasstainedwithuranylacetateandexaminedwithelectronmicroscopy.Thescalebarindicates200nm.3.3.3.4样品免疫原性的检测对样品的免疫原性进行评价前，先要将样品吸附与铝佐剂之上，将与铝佐剂吸附好的样品给小鼠免疫，检测样品在小鼠体内的免疫原性。样品与铝佐剂的吸附效率为了确保加入的铝佐剂能够将样品完全吸附，需要检测铝佐剂对样品的吸附效率。以20111217批的结合率为例，将终浓度为100μg/ml的样品加入铝佐剂，充分混合后，用ELISA方法检测上清中HEVORF2的浓度，其OD450值为0.038，按照标准品的回归曲线进行计算，得到上清中HEVORF2蛋白浓度仅为：14.33ng/ml，这说明绝大部分的样品已经与铝佐剂进行了吸附。其吸附效率约为99.90%。66 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达图3.12样品与铝佐剂吸附率检测示意图Figure3.12Theadsorptionofsampletoaluminiumadjuvant.TheredshowntheresidualORF2proteininthesupernatantaftercentrifugationwhichdosenotadheretoadjuvant.样品的免疫原性评价为了评价样品的免疫原性，将混合后的、吸附率大于99%的样品以五倍稀释的梯度免疫小鼠，检测GMT（geometricmeantiter）。同时，为了比较样品的颗粒性对样品免疫原性的影响，将纯化后的、吸附于铝佐剂的非VLP颗粒和没有吸附铝佐剂的VLP颗粒在同样条件下免疫小鼠，一同检测GMT。结果如图所示，当免疫剂量为10μg/只小鼠时，VLP与铝佐剂吸附后的GMT为1:426.6，而没有吸附铝佐剂的VLP颗粒的GMT为1:384，与之对比明显的是非VLP颗粒的GMT为1:44。当免疫剂量为2μg/只小鼠时，VLP颗粒的GMT依然有弱阳性反应，但非VLP的已经没有阳性反应。从上述实验结果可以看出，VLP的免疫原性较好，而且无论其是否与铝佐剂混合，其免疫原性没有明显差别，但非VLP抗原即使与铝佐剂混合，其免疫原性也明显低于VLP。在这组实验数据中可以看出，HEVVLP颗粒有比较好的颗粒性和免疫原性。67 吉林大学博士学位论文图3.13VLP及non-VLP抗体滴度检测示意图Figure3.13GMTofVLPsandnon-VLPs.GeometricmeantitersforeachgroupofBALB/cmice4weeksafterinjectionwithVLPsandnon-VLPs.TheX-axisshowsthedoseadministeredtoeachmouseandtheY-axisshowstheaveragegeometricmeantiterforsixmicepergroup.68 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达3.4讨论HEV是引起戊型肝炎发病的主要原因，戊型肝炎的发病症状与甲型肝炎相似，但是它能在孕妇中引起较高的致死率，最终预防和控制戊肝的主要手段之一是免疫接种戊肝疫苗。戊肝病毒的中和抗体的位点主要存在于ORF2蛋白。所以戊肝疫苗的主要抗原都是ORF2的蛋白。对天然HEV电镜观察发现：HEV为无胞膜的球形病毒颗粒，对纯化后的病毒颗粒的直径检测发现，90%的颗粒直径为27-34nm，而其中直径为32nm的颗粒最多。而对HEVVLP的研究表明，它也具有颗粒样的球形结构，电镜观察显示其直径约为27nm，研究表明具有VLP结构的蛋白在形态上和天然病毒颗粒相似；其次，这种颗粒性让VLP结构在对机体进行免疫时有更强的免疫原性；最后，衣壳蛋白在一定的条件下能够形成VLP结构，即衣壳蛋白能够在这种条件下进行自组装，其组装后所暴露的抗原位点与天然病毒暴露的抗原位点有部分的相似性。目前对ORF2蛋白作为疫苗抗原已经进行了系统的研究，其中大肠杆菌表达的HEV239和昆虫细胞表达的56kDa蛋白虽然临床试验获得了一定的效果，但是他们并没有形成VLP结构。日本国立传染病研究所的构建的ORF2蛋白（112-608aa）虽然能够形成VLP结构，但是其纯化步骤繁琐，很难应用于生产。在本研究中，我们选取中国大陆主要流行的基因型，即4型HEV的ORF2蛋白（126-621aa）为目的蛋白，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统，摸索了4型HEVVLP的表达和纯化条件，考察了此条件下制备的VLP的蛋白性质，纯度和免疫原性。为进一步的扩大化生产HEVVLP奠定了基础。NIH将ORF2全长构建在杆状病毒表达载体上，并在sf9细胞中表达后发现，仅有53kDa的蛋白能够形成VLP的结构，而免疫效果好的56kDa蛋白并没有文献证明其具有VLP结构，其颗粒性尚待考察。日本国立传染病院最先获得了HEVVLP[30]结构，并对其进行了解析，研究认为只有去除C末端的52个氨基酸，并将N末端的部分氨基酸同时去除后的ORF2蛋白才能在昆虫细胞中形成VLP结构，但对这段氨基酸序列在昆虫细胞中表达时，是否所有的目的蛋白都是以VLP的形式表达的，在什么样的表达参数下能够形成VLP结构并没有进行研究。我们研究发69 吉林大学博士学位论文现，即使是这段特定的氨基酸序列在昆虫细胞中进行表达时，也不是所有的目的蛋白都形成了VLP结构，有以非VLP的形式表达的目的蛋白，同时VLP的形成对细胞浓度和培养时间等表达参数都有要求。在本研究中，将理论上能够形成VLP的氨基酸序列（4型HEVORF2126-621aa）在昆虫细胞中进行表达时发现，HEVVLP在sf9细胞中的表达类似一种目的蛋白在细胞中不断表达、修饰，然后正确折叠形成VLP的过程。研究发现，在MOI为5的攻毒条件下，蛋白表达的初始阶段（48小时内），目的蛋白仅仅是以非VLP的形式进行表达的，而后随着时间的延长，非VLP的蛋白并没有停止表达且含量没有显著的变化，但VLP的含量却在逐步增加。研究还发现，VLP的含量在120小时的时候达到最大值，而后两种蛋白均表达减少，这可能是由于随着细胞的裂解，蛋白被各种酶降解的原因。这也是VLP在昆虫细胞中独特的表达和组装特点。我们还考察了其它VLP表达参数的影响，如不同培养方式对VLP的形成有不同影响，贴壁培养的细胞形成VLP的时间要比悬浮培养的时间短，大约短24小时；对培养时所要求的细胞浓度的研究发现，虽然细胞浓度增加会让ORF2蛋白的表达增加，但是VLP的含量并没有增加，反而会减少，当悬浮培养时的细6胞浓度达到5×10时，细胞中已经没有VLP的产生。对VLP分布的研究发现，VLP主要是分布于细胞内，这可能是因为目的蛋白的信号肽已经切除的原因。[42]Li的研究认为，VLP的结构不稳定，所以Takashi等人对VLP的提取以超离为单一的纯化手段，没有柱层析这一纯化手段的介入，这也导致这种纯化方案很难进一步的放大，应用于生产。本研究的纯化步骤中虽然也有超离的参与，但它只是作为细胞裂解液的初步分离步骤，并不会成为整个工艺的限速步骤，还能够将影响VLP免疫原性的非VLP蛋白去除，成为纯化分离的有利因素。对HEVVLP结构的不稳定性的克服，主要是应用了固定剂，固定剂的应用让VLP的结构[28]具有足够的稳定性，在离子交换层析中保持颗粒性。在Robison等人针对56kDa的蛋白纯化中应用了两次的QSepharoseFF这种常规的阴离子交换介质作为纯化步骤，而且还有S200这种分子筛层析介质的参与，步骤较为繁琐，同时在纯化后无法形成VLP结构。而在本研究中发现，HEVVLP对ANX阴离子交换介质有很强的特异的结合作用，在应用中，仅用一步离子交换层析，纯度就能够由40.4%提高至97.6%，同时研究还发现，虽然还有一部分VLP仍残留在ANX中，但80.5%的VLP能够在洗脱液中获取。70 第3章ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达确定了VLP的表达和纯化条件后，我们初步建立了样品的评价体系，其目的是能够对制备样品的理化性质、纯度和免疫原性等方面进行评价。对SDS-PAGE和SEC-HPLC这两种不同的检测手段对样品的纯度进行检测时发现，纯化后的样品具有95%以上的纯度。而通过电镜对样品颗粒性的检测证明，在这种表达、纯化条件下制备的HEVVLP具有颗粒性。这些均为进行扩大化生产提供了支持。样品免疫原性的检测首先证明了样品成为疫苗的可能性，而通过对VLP加铝佐剂前后，以及非VLP加铝佐剂后免疫原性的相互对比，还证实了样品的颗粒性对免疫原性的影响。在比较中发现，VLP在加入铝佐剂前后，免疫原性没有巨大的改变，但是与非VLP加入铝佐剂后的免疫原性对比明显。这说明样品本身的颗粒性足以引起小鼠的免疫系统对抗原的认知，并产生相应的抗体。在Li等人的实验中，对颗粒性的HEVVLP以口服途径作为免疫途径进行了研究，结果表明，HEVVLP完全能够通过肠道引起机体的免疫反应。这也为4型HEVVLP的应用开辟了更为广阔的前景。虽然，研究在VLP的表达、纯化和检测等方面进行了一系列的探索，并取得了一定的成果，但研究中依然有一些问题需要进一步的探讨，例如对HEVVLP的稳定性的思索。众所周知，天然的HEV病毒颗粒在自然界是稳定存在的，所以才会引起传播和流行，但是Takashi等人的研究表明，HEVVLP的结构要维持稳定需要MES缓冲液的存在，而我们在研究中发现，即使是通过分子筛这种层析条件很温和的分离介质，VLP也无法维持其颗粒性，VLP这种结构不稳定的特点显然与天然病毒的特点不符合，所以在天然病毒颗粒中，还有那些结构的存在对病毒颗粒的维持是必不可少的条件，需要进一步探索和研究。再如，我们在对VLP的表达条件进行优化时发现，即使是相同的序列在同样的细胞中进行表达，也不是所有的目的蛋白均形成了VLP结构，在一定的条件下，总有一部分蛋白是无法形成颗粒的，在有些条件下，所有的目的蛋白均无法形成颗粒，如细胞培养浓度过高时。那么，在目的蛋白向VLP转化的过程中，究竟有哪些修饰是必须存在的，又有哪些修饰的存在阻碍了VLP的形成，需要进一步探索和研究，这些进一步的研究不但能够对生产进行指导，还能够为天然病毒结构的研究提供有价值的线索。我们也正在通过对两种结构的组成蛋白的肽图指纹图谱对比，进行相关的研究。71 吉林大学博士学位论文3.5小结1、对感染滴度、收获时间和感染时细胞浓度等表达参数进行优化，研究发现将浓6度为2.0×10cells/ml的sf9细胞做悬浮培养，以MOI为5进行攻毒，培养120小时后，当细胞的存活率降为50%左右时，细胞中的VLP表达量达到最高值，为0.072mg/ml。2、摸索了HEVVLP的纯化方案：超声破碎细胞并离心去除细胞碎片；蔗糖密度梯度离心去除非VLP蛋白；超离后样品对上样缓冲液透析，同时进行VLP颗粒固定；利用ANX阴离子交换层析纯化VLP。3、对经此表达、纯化方案后制备的HEVVLP进行理化性质，纯度和免疫原性的评价。确定制备的VLP纯度和免疫原性具有成为疫苗的可能。72 结论结论HE是由HEV引起的急性病毒性肝炎，是一个重要的公共卫生问题，由于现有技术无法获取足够含量的HEV病毒，对HEV的结构和组成了解很少。在本研究中，我们对通过有效的病毒培养体系，对HEV的病毒组成蛋白和结构等进行了分析，并对衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达进行了研究。本研究主要结果如下：1、细胞培养上清中和粪便中的大部分ORF2蛋白并没有形成HEV病毒颗粒或VLP颗粒，而是以非颗粒的形式存在的。2、细胞培养上清中的HEV病毒表面的脂膜上仅有少量ORF3蛋白存在。3、ORF3蛋白对病毒与PLC/PRF/5的结合有阻碍作用，而脂膜对二者的结合没有影响。4、病毒培养体系中的ORF2蛋白是分子量为88kDa的糖蛋白，能够与HEVRNA结合并组装成颗粒样结构，提示其有可能是病毒的组成蛋白。5、对病毒感染复数、收获时间和感染时细胞浓度等表达参数进行优化，确定HEVVLP的表达条件；确定HEVVLP的纯化方案；对经此表达、纯化方案后制备的HEVVLP进行理化性质，纯度和免疫原性的评价。确定制备的VLP纯度和免疫原性具有成为疫苗的可能。通过上述实验，我们不仅初步获得了HEV病毒组成和结构的信息，并将病毒的衣壳蛋白在昆虫细胞的表达进行了优化，确定了简化的VLP纯化流程，为HEV疫苗的生产研究积累了经验和数据，为获得HEVVLP疫苗奠定了基础。73 74 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个人简历个人简历个人基本情况姓名：齐影出生年月：1976年2月性别：女籍贯：吉林省长春市民族：汉族政治面貌：群众主要学习经历1995.09～2000.07北华大学临床医学专业本科2003.09～2006.07吉林大学生命科学学院生物工程硕士2009.09～至今吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室微生物学专业攻读博士学位85 吉林大学博士学位论文已发表或待发表文章第一作者发表文章：ExpressionandcharacterizationofhepatitisEvirus-likeparticlesandnon-virus-likeparticlesfrominsectcellsa，bccccc作者：YingQi,JinpingFan,WeijinHuang,ChenyanZhao,YouchunWang,WeiababKong,ChunlaiJiang*发表杂志：BiotechnologyandAppliedBiochemistry影响因子：1.322预计发表日期：201506第二作者发表文章：Overexpressionofα-2,6sialyltransferasestimulatespropagationofhumaninfluenzavirusesinVerocells作者：LiN,QiY,ZhangFY,YuXH,WuYG,ChenY,JiangCL,KongW发表杂志：actavirologica影响因子：1.037发表日期：201102,55(2):147-153HepatitisEgenotype4virusfromfecesofmonkeysinfectedexperimentallycanbeculturedinPLC/PRF/5cellsandupregulatehostinterferon-induciblegenes1,234333作者：FengZhang,YingQi,TimJ.Harrison,BaobinLuo,YanZhou,XiuhuaLi,333,*AijingSong,WeijinHuangandYouchunWang发表杂志：JournalofMedicalVirology影响因子：2.217发表日期：201410,Volume86,Issue10,pages1736–1744整理待发表文章：HEVfromcellculturehasalipidenevelopa,bbbcb作者：YingQi,FengZhang,LiZhang,TimJHarrison,WeijinHuang,Chenyanbaaa,b,Zhao,WeiKong,ChunlaiJiangandYouchunWang*86 后记和致谢后记和致谢本研究课题是在王佑春研究员悉心指导下完成的，衷心感谢王老师几年来在学习和工作中所给予的关心、支持和耐心的指导。衷心感谢于湘晖教授，姜春来教授对我的耐心帮助和悉心指导。衷心感谢中国食品药品检定研究院性病艾滋病室黄维金副主任、李秀华、宋爱京、许四宏、刘强、赵晨燕、聂建辉老师；细胞室袁宝珠主任、孟淑芳副主任、赵翔、吴雪玲、樊金萍、冯建平、周亚玲等老师和单抗室张峰、刘春雨、王文波、李萌等老师各位老师在实验过程中给予的宝贵意见和建议，以及给予的大力支持和帮助。并在生活中对我的关心和帮助。衷心感谢张峰、张黎、王萌等诸位博士以及田亚宾、赵娟、马健、陈晴晴等同学在实验和生活中给予的支持和帮助。衷心感谢艾滋病疫苗国家工程实验室的孔维等老师和各位同学对我的帮助和指点。特别感谢我的父母、兄长、爱人和女儿多年来对我的理解和支持。没有他们的支持，我无法走过这漫长的求学道路。最后，真诚感谢几年来所有给予我关心和帮助的师长和朋友们。i87