西酞普兰及视空间学习训练对不同阿尔茨海默病模型的AD样病理变化的作用及机制研究

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西酞普学校代码：10286兰分类号：R741及视密级：公开空UDC：616间学号：159271学习训练对不同阿尔茨海默病模型的AD样病理变西酞普兰及视空间学习训练对不同阿尔茨化的作海默病模型的AD样病理变化的作用及机制用及机研究制研究研究生姓名：公卫刚导师姓名：任庆国公卫刚申请学位类别博士学位学位授予单位东南大学一级学科名称临床医学论文答辩日期2018年5月30日二级学科名称神经病学学位授予日期2018年6月20日东南答辩委员会主席徐格林（教授）评阅人盲审大学2018年5月30日 博士学位论文西酞普兰及视空间学习训练对不同阿尔茨海默病模型的AD样病理变化的作用及机制研究专业名称：神经病学研究生姓名：公卫刚导师姓名：任庆国本论文获国家自然科学基金项目（91232707，81420108012,81271218）以及江苏省普通高校研究生创新计划项目（KYZZ16_0132）资助。 THEEFFECTANDMECHANISMOFCITALOPRAMANDVISUOSPATIALLEARNINGTRAININGONADLIKEPATHOLOGICALCHANGESINDIFFERENTALZHEIMER'SDISEASEMODELSADissertationSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofDoctorofMedicineBYGongWeigangSupervisedbyProfessorRenQingguoMedicalSchoolSoutheastUniversityMarch2018 东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司、万方数据电子出版社、北京万方数据股份有限公司有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布（包括以电子信息形式刊登）论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布（包括以电子信息形式刊登）授权东南大学研究生院办理。研究生签名：导师签名：日期： 中文摘要中文摘要西酞普兰及视空间学习训练对不同阿尔茨海默病模型的AD样病理变化的作用及机制研究第一部分西酞普兰对孤养大鼠诱导的认知功能障碍影响及内在机制研究背景：阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是痴呆的主要类型。AD是在基因和环境等危险因素共同作用下起病的。随着人口老龄化，社会孤立/孤独感已成为当前老年人群中的普遍现象，是一个广泛的社会问题。社会孤立/孤独感可导致认知功能下降，是AD的高危因素。而社会孤立/孤独感引起认知功能下降的机制尚不明了，也缺乏有效干预措施。另外选择性5-HT再摄取抑制剂（SSRIs）可以增加突触间隙的5-HT含量、促进脑内褪黑素的合成、改善海马突触可塑性、神经发生水平，发挥多靶点的神经保护作用，而SSRI类的药物西酞普兰是否能早期干预AD的危险因素并起到治疗作用还不清楚。方法：选用10个月龄的SD大鼠群养或者孤养8周。从第4周开始，给予西酞普兰（10mg/kgi.p.）干预28天。然后病理生理学用行为学表现、生物化学以及病理写分析来评估。结果：发现孤养能够导致认知损害，并且降低前额叶、背侧海马、腹侧海马、杏仁核以及尾壳核突触相关蛋白[突触素，突触后致密物93（PSD93）]的表达。西酞普兰治疗明显改善孤养大鼠的学习和记忆并能修复其前额叶、海马以及杏仁核突触素和PSD93的表达。另外孤养能够降低前额叶，背侧海马以及腹侧海马树突棘的数目，而西酞普兰可以修复这种损害。孤养还能够减少海马区BDNF、磷酸化Akt以及磷酸化的GSK-3β,总的GSK-3β和Akt没有变化，但是在后扣带区没有相应的变化，西酞普兰治疗明显修复这种损害。结论：我们的结果提示孤养诱导的认知损害可能通过降低认知相关脑区突触可塑性来影响的，而西酞普兰能够通过改善前额叶、背侧海马和腹侧海马的突触可塑性来修复这些损害。关键词：社会孤立，西酞普兰，阿尔茨海默病，突触可塑性I 中文摘要第二部分视空间学习训练通过NLRP3/caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究背景：阿尔茨海默病是一种以认知功能全面衰退、精神行为异常、日常生活能力最终丧失为临床表现的神经退行性疾病。临床上应用的药物疗效不佳且价格昂贵。目前认为，AD是在基因与环境等因素共同作用下起病的。2015年世界阿尔茨海默病协会分析痴呆的可调控危险因素后指出，低教育水平会明显增加AD的发病风险。在诊断为AD的患者中，具有高教育水平的人群认知能力的损害会明显减缓。给予AD患者认知刺激治疗可改善其认知功能，且疗效与胆碱酯酶抑制剂相当。越来越多的临床与临床前证据均提示，认知训练可改善AD和MCI患者的认知功能，延缓疾病进展，但其机制不清。方法：选用10月龄PR5转基因小鼠（表达人P301L突变Tau蛋白的小鼠）及同窝出生的野生型小鼠，分为四组：对照组、野生型鼠+水迷宫训练组（Wt+MWM组）、PR5小鼠组（Tg组）、PR5小鼠+水迷宫训练组（Tg+MWM组），水迷宫训练周期为4周。训练结束后一半的小鼠进行新奇认知试验检测，另一半继续饲养，三个月后行为学检测。另外应用PR5小鼠跟NLRP3敲除小鼠进行杂交获得NLRP3敲除的PR5小鼠，分为六组，在前面分组的基础上增加NLRP3敲除杂合的PR5小鼠+水迷宫训练组（PR5/NLRP3+/-+MWM组)、NLRP3敲除PR5小鼠+水迷宫训练组（PR5/NLRP3-/-+MWM组），进行为期1周的水迷宫训练。在行为学结束后分离小鼠海马，应用Westernblot方法检测小鼠海马中Tau蛋白磷酸化水平，突触相关蛋白的表达，NLRP3/caspase-1/IL-1β通路蛋白的表达，同时应用高尔基染色检测树突棘的数目。结果：在4周的视空间训练期间，PR5小鼠在第一周找到平台的潜伏期明显低于野生型小鼠。随着四周的水迷宫训练，PR5小鼠组找到平台的潜伏期明显降低。在4周的记忆检测中，在第一周训练结束时PR5小鼠组目标象限的时间百分比、目标象限的平台穿梭次数都较野生型小鼠明显减低，在四周的水迷宫训练过程中，PR5小鼠组的记忆指标逐渐增强。在4周水迷宫训练之后，新奇物体识别实验的结果显示，经过水迷宫训练的PR5小鼠较未训练的PR5小鼠情景记忆损害明显改善。另一半在3个月后记忆仍然有改善的趋势。分子生物学检测结果显示PR5小鼠海马pS396和pT231位点的磷酸化水平明显增加，未磷酸化的Tau1降低。同时与野生型小鼠相比PR5小鼠海马突触素、PSD93、II 东南大学博士学位论文PSD95的表达明显降低，树突棘的数目明显减少。而经过4周水迷宫训练之后Tau蛋白磷酸化水平、突触相关蛋白表达以及树突棘数目明显改善。PR5小鼠海马NLRP3、caspase-1、IL-1β表达明显增加，水迷宫训练之后明显逆转这三个蛋白的增加。在间隔三个月后这些指标在PR5水迷宫训练组仍然有改善趋势。在NLRP3敲除之后，结果显示PR5/NLRP3-/-+MWM小鼠较PR5+MWM小鼠海马pS396和pT231位点的Tau蛋白磷酸化水平明显降低，未磷酸化的Tau1增加。PR5/NLRP3-/-+MWM小鼠较PR5+MWM在海马突触素、PSD93、PSD95的表达明显增加，树突棘的数目明显增加。PR5/NLRP3-/-+MWM小鼠较PR5+MWM海马NLRP3、caspase-1、IL-1β表达明显降低。结论：长时间的视空间训练明显改善PR5小鼠的认知能力，并且具有远期疗效。同时水迷宫视空间训练可能是通过调控PR5小鼠的海马Tau蛋白磷酸化的水平，另外通过调控NLRP3/caspase-1/IL-1β通路影响PR5小鼠的突触可塑性来改善PR5小鼠的认知能力。关键词视空间训练，PR5小鼠，Tau蛋白磷酸化，突触可塑性，NLRP3III 英文摘要AbstractTheeffectandmechanismofcitalopramandvisuospatiallearningtrainingonADlikepathologicalchangesindifferentAlzheimer'sdiseasemodelsPart1TheeffectandmechanismofcitalopramoncognitiveimpairmentinducedbysocialisolatedratsBackground:Alzheimer'ssdisease(AD)isthemaintypeofdementia.ADiscausedbythecombinedeffectsofgeneticandenvironmentalriskfactors.Withtheagingofpopulation,socialisolation/lonelinesshasbecomeacommonphenomenonintheelderlypopulationandawidespreadsocialproblem.Socialisolation/lonelinesscanleadtocognitivedecline,whichisahigh-riskfactorforAD.However,themechanismofsocialisolation/lonelinesscausingcognitivedeclineisnotclear,andthereisalsolackofeffectiveinterventionmeasures.Inaddition,theselective5-HTreuptakeinhibitor(SSRIs)canincreasethe5-HTcontentinthesynapticgap,promotethesynthesisofmelatonininthebrain,improvethehippocampalsynapticplasticityandneurogenesis,andgiveplaytotheneuroprotectiveeffectofmultipletargets.WhethertheSSRIclassdrugcitalopramcanearlyintervenetheriskfactorsofADandplayatherapeuticroleisnotclear.Methods:Middle-agedrats(10months)weregrouporisolationrearedfor8weeks.Followingtheinitial4-weekperiodofrearing,citalopram(10mg/kgi.p.)wasadministeredfor28days.Then,pathophysiologicalchangeswereassessedbyperformingbehavioral,biochemical,andpathologicalanalyses.Results:WefoundthatSIcouldcausecognitivedysfunctionanddecreasesynapticprotein(synaptophysinorPSD93)expressionindifferentbrainregionsassociatedwithcognition,suchastheprefrontalcortex,dorsalhippocampus,ventralhippocampus,amygdala,andcaudalputamen,butnotintheentorhinalcortexorposteriorcingulate.CitalopramcouldsignificantlyimprovelearningandmemoryandpartiallyrestoresynaptophysinorPSD93expressionintheIV 东南大学博士学位论文prefrontalcortex,hippocampus,andamygdalainSIrats.Moreover,SIdecreasedthenumberofdendriticspinesintheprefrontalcortex,dorsalhippocampus,andventralhippocampus,whichcouldbereversedbycitalopram.Furthermore,SIreducedthelevelsofBDNF,serine-473-phosphorylatedAkt(activeform),andserine-9-phosphorylatedGSK-3β(inactiveform)withnosignificantchangesinthelevelsoftotalGSK-3βandAktinthedorsalhippocampus,butnotintheposteriorcingulate.Conclusions:OurresultssuggestthatdecreasedsynapticplasticityincognitionassociatedregionsmightcontributetoSI-inducedcognitivedeficits,andcitalopramcouldamelioratethesedeficitsbypromotingsynapticplasticitymainlyintheprefrontalcortex,dorsalhippocampus,andventralhippocampus.TheBDNF/Akt/GSK-3βpathwayplaysanimportantroleinregulatingsynapticplasticityinSIrats.Keywords：Socialisolation.Citalopram.Alzheimer’sdisease.Synapticplasticity.Part2ThemechanismofspatialtrainingtoimprovecognitiveimpairmentinPR5micethroughNLRP3/caspase-1/IL-1betapathway.Background:Alzheimer'sdiseaseisaneurodegenerativediseasecharacterizedbyacomprehensivedeclineincognitivefunction,abnormalmentalbehavior,andlossofdailylifeability.Thedrugsusedinclinicarenoteffectiveandexpensive.Atpresent,ADisthoughttohavebeenaffectedbyfactorssuchasgeneandenvironment.In2015,theAlzheimer'sdiseaseassociationoftheworldanalyzedtheriskfactorsofdementia,pointingoutthatloweducationlevelwillsignificantlyincreasetheriskofAD.InpatientsdiagnosedwithAD,theimpairmentofcognitiveabilityofpeoplewithhigheducationlevelwillobviouslyslowdown.CognitivestimulatingtherapyimprovesthememoryfunctionswiththesameefficacyasgalantamineortacrineinAD。MoreandmoreclinicalandpreclinicalevidencessuggestthatcognitivetrainingcanimprovecognitivefunctionanddelaydiseaseprogressioninADandMCIpatients,butitsmechanismisunclear.V 英文摘要Methods:10montholdPR5transgenicmiceandthesamebornwildtypemiceweredividedintofourgroups,Wtgroup,Wt+MWMgroup,PR5group,PR5+MWMgroup.Halfofthemicewereusednovelobjectrecognitiontesttoobservecognitiveafterspatialtraining.Anotherhalfofthemicewereusednovelobjectrecognitiontesttoobservecognitiveafter3monthlater.Inaddition,PR5micewerehybridizedwithNLRP3knockoutmicetoobtainNLRP3knockoutPR5mice.AddedPR5/NLRP3+/-+MWMgroupandPR5/NLRP3-/-+MWMgroup.Themiceweretrained1weeks.Aftertheendofthebehavioralstudy,thehippocampuswasisolated.TheWesternblotwereusedtodetectphosphorylationlevelofTauprotein,expressionofsynapserelatedproteins,expressionofNLRP3/caspase-1/IL-1βpathwayproteininthehippocampus.Meanwhile,Golgistainingwasusedtodetectthenumberofdendriticspines.Results:Duringthe4weekspatialtraining,thetimetoplatformofPR5miceinthefirstweekwassignificantlylowerthanthatofWtmice.With4weekspatialtraining,thetimetoplatformofPR5miceweredecrease.Inthe4weekmemorytest,thepercentagetargetandthetargetcrossingofthePR5miceinthefirstweekweresignificantlylowerthanthoseofthewtmice.Meanwhileinthefourweeksofspatialtraining,thememorylevelofPR5miceincreased.After4weeksofspatialtraining,theresultsofthenovelobjectrecognitiontestshowedthatthePR5micewithtrainingweresignificantlyimprovedintheepisodicmemorydamageofthePR5micethantheuntrainedmice.Theotherhalfmicestillhadanimprovementinmemoryafter3monthslater.MolecularbiologicalexaminationshowedthatthephosphorylationlevelofpS396andpT231sitesinPR5miceincreasedsignificantly,andthephosphorylatedTau1decreased.Atthesametime,comparedwiththeWtmice,thenumberofdendriticspinesandtheexpressionofsynaptophysin,PSD93andPSD95inhippocampusofPR5micedecreasedsignificantlyAfter4weeksofspatialtraining,Tauproteinphosphorylationlevel,synapserelatedproteinexpressionandnumberofdendriticspinesinPR5miceweresignificantlyimproved.TheexpressionofNLRP3,caspase-1andIL-1IL-1inhippocampusofPR5miceincreasedsignificantlycomparedwithWtmice,andtheincreaseofthesethreeproteinswasreversedafterspatialtraining.After3monthslater,theseindicatorsstillhaveanimprovementtrendinthePR5spatialtraininggroup.AfterNLRP3knockout,theresultsshowedthatthePR5/NLRP3-/-+MWMmicesignificantlydecreasedthelevelofphosphorylationofTauproteinatthepS396andpT231sitesandincreasedthephosphorylatedTau1inthehippocampuscomparedwiththeVI 东南大学博士学位论文PR5+MWMmice.Conclusion：LongtimespatialtrainingsignificantlyimprovedthecognitivedeficitsinPR5mice，andithasalongtermeffect.Meanwhile,thespatialtrainingmayregulatethelevelofphosphorylationofTauproteininhippocampusofPR5mice.Furthermore,theseresultsshowanimportantrolefortheNLRP3/caspase-1/IL-1βaxisinthespatialtrainingamelioratessynapticplasticitydeficitsinPR5mice.Keywords:Spatialtraining.PR5mice.Tauphosphorylation.Synapticplasticity.NLRP3inflammasome.VII 目录目录中文摘要·························I英文摘要·························IV缩略语··························X前言···························1文献综述·························6第一部分西酞普兰对孤养大鼠诱导的认知功能障碍影响及内在机制研究1.1背景························111.2材料与器材·····················121.3主要实验方法···················151.4统计方法······················251.5结果························251.6讨论························33第二部分视空间学习训练通过NLRP3/caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究2.1背景························362.2材料与器材·····················372.3主要实验方法···················41VIII 东南大学博士学位论文2.4统计方法······················562.5结果························562.6讨论························72全文总结与展望······················75参考文献·························76作者简介························102致谢··························104IX 缩略词本文所用缩略语注释表缩略词英文全称中文全称ADAlzheimer’sdisease阿尔茨海默病NMDAN-methyl-D-asparticacidreceptorN-甲基-D-天冬氨酸受体MCIMildcognitiveimpairment轻度认知障碍5-HT5-hydroxytryptamine五羟色胺SSRIselectiveserotonin-reuptakeinhibitors选择性五羟色胺再摄取抑制剂NLRPNod-likereceptorpyrincontainingNOD样受体热蛋白结构域相关蛋白MWMMorriswatermaze水迷宫DGdentategyrus海马齿状回BDNFbrainderivedneurotrophicfactor脑源性神经影响因子AktproteinkinaseB蛋白激酶BGSK-3βglycogensynthasekinase-3β糖原合成激酶3βAPPamyloidprecursorprotein淀粉样前体蛋白PS1senileplaque老年斑TrkBtyrosinereceptorkinaseB酪氨酸激酶含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解Caspasecysteinylaspartatespecificproteinase酶LTPlong-termpotentiation长时程增强Aβamyloid-betaβ淀粉样蛋白PI3Kphosphatidylinositol-3-kinases磷脂酰肌醇-3激酶DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白5-HT5-hydroxytryptamine五羟色胺5-HT1A5-HT1Areceptor五羟色胺1A受体X 东南大学博士学位论文PBSphosphatebuffersaline磷酸缓冲盐溶液8-Hydroxy-2-(dipropylamino)tetralin8羟基-2丙基氨基-四氢化萘-氢8-OH-DPAThydrobromide溴酸盐DMEMdulbecco′smodifiedEagle′smedium达尔伯克改良的伊格尔培养基PSDpostsynapticdensityprotein突触后致密物ODopticaldensity光密度glyceraldehydephosphateGAPDH磷酸甘油醛脱氢酶dehydrogenaseS.E.M.standarderrorofmeasurement标准误SDratspraguedawleyrat斯泼累格·多雷大鼠SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠APSammoniumpersulfate过硫酸铵RIPAradioimmunoprecipitationassay放射免疫沉淀试剂PMSFphenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟PVDFmicroporouspolyvinylidenefluoride微孔性聚偏氟乙烯3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二MTTdiphenyl-2-H-tetrazoliumbromide苯基四氮唑溴盐XI 东南大学博士学位论文前言阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是一种以认知功能全面衰退、精神行为异常、日常生活能力最终丧失为临床表现的神经退行性疾病。随着人口老龄化的加剧，AD患病人数急剧上升。数据显示，目前全世界AD患者达到4680万，中国AD患者已达950万，AD患者仍以每20年翻一番的速度急速增长，给家庭和社会造成极大的负担[1,2]。经过百余年的研究，AD仍病因、病机不明，新研发药物在Ⅲ期临床试验中均被证实疗效不佳[3,4]。目前临床上以胆碱酯酶抑制剂（安理申等）和NMDA受体阻断剂（美金刚）为主的治疗方案只能延缓疾病进展，并不能逆转病程，且价格昂贵。因此，针对AD危险因素进行干预或将可能成为阻止其发展的突破点。目前认为，AD是在基因和环境等危险因素共同作用下起病的。2015年世界阿尔茨海默病协会（Alzheimer’sAssociation）分析痴呆的可调控危险因素后指出，AD存在10余种可调控危险因素[5]；与此同时，我国学者进行的一项旨在评估AD及其可调控危险因素之间相关性的系统回顾和Meta分析显示，AD存在13种可调控危险因素[6]。其中，不良的生活方式被认为是AD的可调控危险因素。越来越多的研究提示，调控AD危险因素可能降低其发生风险[5,6]。社会孤立（Socialisolation）是一种可调控的不良生活方式，是与社会缺乏联系、交流的客观事实，是负性社会因素；孤独感（Loneliness）是一种主观的、令人悲伤的孤单感觉，是负性心理因素[7]。二者常合并存在[8]。随着现代生活模式的改变及人口老龄化的加剧，“空巢老人”的比率逐年增加，老年群体中社会孤立及具有孤独感的人口也急剧增多，但人们对老年社会孤立/孤独感人群的关注度较低。美国老龄化人口管理报告指出：2010年在非专门机构中的老年人约有29%是独居状态[7]。2000年，我国具有孤独感的老年人口比例为29.6%[8]。在我国某些地区，感觉孤独的老年人比例甚至更高达78.1%[9]。社会孤立/孤独感已成为当前老年人群中的普遍现象，是一个广泛的社会问题。社会孤立/孤独感与认知障碍的关系十分密切：一项针对75-85岁人群的10年随访研究发现：孤独感是预测认知功能下降的独立指标[10]；另一项大样本（>65岁）的4年随访研究显示：即使在基线期无认知障碍，社会孤立状态的老人在随1 前言访期认知功能下降也会更显著[11]；在剔除抑郁的作用因素后，孤独感仍可预示认知功能下降及AD的发生[12]；最近一篇系统回顾也表明：老年人群体中孤独感越强的个体，认知功能下降越明显[13]。孤养是目前公认的社会孤立的动物模型。动物研究同样显示：孤养的幼年大鼠或小鼠均出现了认知功能障碍[14,15]；此外，孤养也可加重老龄AD转基因小鼠的认知障碍及病理损伤[16]。综上，社会孤立/孤独感可导致认知功能下降，是AD的高危因素。而社会孤立/孤独感引起认知功能下降的机制尚不明了，也缺乏有效干预措施。突触可塑性、神经发生与认知功能密切相关[17,18]。与正常老化相比，AD及轻度认知障碍（Mildcognitiveimpairment，MCI）患者海马突触可塑性及神经发生受损更为显著：尸检研究发现，AD和MCI患者脑内神经元死亡明显增多、突触受损严重[19,20]；我们课题组研究发现MCI患者海马体积萎缩程度远高于正常老年人，其萎缩程度可预测认知功能受损程度[21]；且MCI患者海马网络功能连接降低[22,23]，这种降低可能与海马突触可塑性、神经发生受损有关[24]。此外，无论幼年[25]和成年期[26]啮齿类动物孤养后均出现了海马齿状回神经发生和突触可塑性的损害。遗憾的是，这些研究都没有深入探讨海马突触可塑性、神经发生与认知障碍之间的关系。我们推测，调控海马突触可塑性、增加海马神经发生水平可能是改善孤养导致认知障碍的有效靶点之一。褪黑素(Melatonin)主要是由人类或动物的松果体产生的一种胺类激素，5-HT是其合成前体物质。褪黑素是目前公认的具有多重神经保护作用的一种内源性物质，其可以通过清除自由基、抗氧化和抑制脂质的过氧化反应、降低体内过氧化物的含量、改善睡眠、调节免疫而起到抗衰老的作用[27]。研究显示，在AD患者及AD模式动物脑内均发现褪黑素水平明显减低，给予褪黑素后，可以明显改善AD模式动物的认知功能，降低tau蛋白磷酸化水平[28]。我们前期研究也发现了孤养大鼠海马褪黑素水平降低[29]。综上所述，无论AD还是孤养都可以导致海马突触可塑性、神经发生水平降低；脑内5-HT系统功能异常；褪黑素水平下降。因此寻找一种可针对上述靶点的药物将有可能改善孤养导致的认知功能障碍，降低AD发生风险。选择性5-HT再摄取抑制剂（SSRIs）可以增加突触间隙的5-HT含量、促进脑内褪黑素的合成[30]、改善海马突触可塑性、神经发生水平[31]，发挥多靶点的神经保2 东南大学博士学位论文护作用。SSRI类药物氟西汀可改善青春期大鼠孤养导致的海马新生细胞的损害[31]，增加海马突触可塑性，减少海马凋亡相关蛋白的表达[31]，提高空间记忆水平[14]。我们组前面在HEK293/Tau441细胞系、原代培养神经元和大鼠AD模型的研究中均发现，SSRI类药物可降低Tau蛋白磷酸化水平、改善AD大鼠空间学习记忆能力[32–34]。同时，我们课题组体外研究发现，SSRI类药物通过调控5-HT1A受体介导的Akt/GSK-3β[33]和PKMζ-MAPK信号通路[35]可分别降低Tau蛋白磷酸化及增加原代培养海马神经干细胞的神经发生，既往研究也发现5-HT1A受体激活可明显增加海马神经发生[36]，这些结果为我们在体内研究SSRI类药物对老年孤养的保护作用机制提供了重要线索。2015年世界阿尔茨海默病协会（Alzheimer’sAssociation）分析痴呆的可调控危险因素后指出，低教育水平会明显增加AD的发病风险[37]。在诊断为AD的患者中，具有高教育水平的人群认知能力的损害会明显减缓[38]。这提示低的教育水平是AD发生发展的危险因素。研究发现给予AD患者认知刺激治疗可改善其认知功能，且疗效与胆碱酯酶抑制剂相当[39]。不同形式的认知训练模式也能改善老年人的认知功能，明显减少其发展为痴呆和轻度认知障碍（MCI）的风险[40–43]。临床前研究也有类似的发现。水迷宫检测最早由Morris在1984年应用于检测大鼠的认知功能[44]，并一直作为啮齿类动物视空间学习记忆检测的金标准。水迷宫检测过程也是视空间工作记忆建立的过程。Billings在2007年首次把水迷宫训练作为一种视空间认知训练模式去干预3xTg-AD小鼠，发现其明显改善痴呆小鼠认知功能以及Tau病理。应用功能MRI检测发现经过水迷宫训练后的Wister大鼠和C57小鼠海马体积明显增加[45,46]。此外，水迷宫训练还能促进AD模型大鼠海马新生神经元的存活和分化[47]。越来越多的临床与临床前证据均提示，认知训练可改善AD和MCI患者的认知功能，延缓疾病进展，但其机制不清。突触可塑性与认知功能关系紧密。突触是AD患者中最早发生病理变化的部位，并且海马突触损害程度与AD患者的认知水平密切相关[48,49]；我们课题组研究发现MCI患者海马网络功能连接降低[50]，这种降低可能与海马突触可塑性下降有关；功能MRI检测还发现认知训练能明显提高老年人与处理速度相关的大脑区域神经元的活性[51]。AD模型Tg2576小鼠经过水迷宫认知训练后，认知能力明3 前言显改善，伴有海马齿状回和CA1区神经元的长时程增强，树突棘分枝生成[52]；我们前期研究也发现，水迷宫训练的PR5小鼠海马突触相关蛋白表达显著增加，树突棘结构明显改善。上述证据提示认知训练可能是通过提高海马突触可塑性改善AD的认知功能。近年来，AD神经炎症假说得到越来越多的关注，小胶质细胞活化是其核心内容。小胶质细胞是定居在脑内的固有免疫细胞，其主要功能包括参与免疫调节、影响神经传导和调控成年海马神经发生等。小胶质可以通过细胞表面的SCARA1，CD36，CD14，CD47以及Toll样受体绑定可溶性Aβ低聚物调节Aβ的清除[53]。Aβ能通过与细胞膜上的APP结合来激活小胶质细胞；Aβ也可以直接激活小胶质细胞内的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白（Nod-likereceptorpyrincontaining，NLRP）3炎性小体并引起IL-1β分泌来产生神经毒性作用[53,54]。NLRP炎性小体是由胞浆内模式识别受体参与组装的多蛋白复合物。目前已发现的炎性小体主要有4种，即NLRP1炎性小体、NLRP3炎性小体、IPAF炎性小体和AIM2炎性小体。其中，NLRP3炎症小体作为固有免疫的重要组分，在机体免疫反应和疾病发生过程中发挥重要作用。当机体遭遇有害因子刺激时，NLRP3炎性小体可诱导pro-caspase-1裂解成具有活性的caspase-1，促进IL-1β等的生成，从而参与宿主的炎症反应。在中枢神经系统中，NLRP3炎症小体只在小胶质细胞中表达。小胶质细胞介导的炎性小体激活是一种新的神经免疫性AD病理机制[55,56]。研究发现NLRP3炎性小体在AD患者和动物模型中明显激活并且促进Aβ的形成[57]。NLRP3炎性小体激活能够促进IL-1β等促炎性因子的分泌，IL-1β分泌增加会损害AD模型鼠的突触结构和功能[58,59]，特异性阻断IL-1β可减缓AD模型小鼠脑内Tau蛋白的过度磷酸化[60]。此外，丰富环境可明显抑制小鼠脑内IL-1β的分泌[61]。综上所述，小胶质细胞介导NLRP3/caspase-1通路调控突触可塑性的改变可能是认知训练改善认知损害的重要机制。针对目前研究现状，充分分析针对AD危险因素的干预措施我们提出两个假设：社会孤立/孤独感可导致突触可塑性损害，进而诱导认知功能下降，SSRI类药物西酞普兰可通过调控5-HT能系统介导的BDNF/PI3K/Akt信号通路来增加突触可塑性最终改善孤养导致的认知功能损害；视空间学习训练可以改善认知，其机制可能是通过影响脑内炎症小体NLRP3/caspase-1/IL-1β通路从而调控突触可4 东南大学博士学位论文塑性影响认知功能的。5 文献综述文献综述认知训练对阿尔茨海默病干预的研究进展摘要：阿尔茨海默病是痴呆的主要类型，经过百余年的研究，AD仍病因、病机不明，新研发药物在Ⅲ期临床试验中均被证实疗效不佳，药物治疗的研究令人失望，非药物治疗越来越受到关注。比如复杂的认知活动。大型的流行病学数据显示参加认知活动发生痴呆的风险明显降低。通过对正常成年人和具有认知损害的的成年人应用新奇和复杂的认知干预可能能够改善认知，降低痴呆的风险和延缓痴呆的进展。我们将寻找认知训练的疗效评估以及认知训练是否能够进行临床转化的证据。尽管随机对照的实验数目有限，初步的证据证实认知训练可能提供直接和长期的认知改善作用，并且小团体多领域的认知训练都能产生明显的效应。我们同时对认知训练改善AD的可能机制进行了讨论，希望能对未来的基础和临床研究提供一定的帮助。关键词：阿尔茨海默病，认知干预，认知训练，治疗背景：阿尔茨海默病是一种以认知功能全面衰退、精神行为异常、日常生活能力最终丧失为临床表现的神经退行性疾病。随着人口老龄化的加剧，AD患病人数急剧上升。数据显示，目前全世界AD患者达到4680万，中国AD患者已达950万，AD患者仍以每20年翻一番的速度急速增长，给家庭和社会造成极大的负担。经过百余年的研究，AD仍病因、病机不明，新研发药物在Ⅲ期临床试验中均被证实疗效不佳[3,4]。目前临床上以胆碱酯酶抑制剂（安理申等）和NMDA受体阻断剂（美金刚）为主的治疗方案只能延缓疾病进展，并不能逆转病程，且价格昂贵。因此，针对AD的非药物治疗越来越受到关注。已经证实了有多个因素可以对AD有保护作用，包括生活中的认知活动、物理运动以及社交活动等与认知刺激密切相关。前瞻性的人口和队列研究证明智力活动，甚至是在一生中的后期开始参加一些智力活动也能够明显减少认知功能的减退，减少痴呆的发生率和AD样病理变化[62–64]。另外一项针对22个队列研究的循证医学分析显示一生中参加智力活动越多能够明显降低发生痴呆的风险[65]和降低认知损害的程度[66]。还有一项针对1076名认知正常的成年人的5年随访的纵6 东南大学博士学位论文向研究发现参加智力活动的水平与后续的认知功能密切相关[64]。因此复杂的智力活动作为一种认知干预措施去治疗年龄相关的认知下降和痴呆具有较好的应用前景[67]。一、认知干预认知干预在AD疾病中的应用已经有数十年的时间[68]，其主要有三个类型：认知刺激、认知康复和认知训练。这些干预都是依据不同的理论进行划分的[69–72]。认知刺激只要是一些娱乐性的非特殊性的认知活动，通常是一些以团体为单位的团体任务。认知刺激对AD患者认知功能具有改善作用在以前的综述中有证据[73]。认知康复主要针对的是个体，是为了明显的功能障碍和减少残疾，比如是建立对什么时间用药的记忆的建立[70,71]。认知训练主要指通过认知活动去修复大脑和促进认知的恢复，主要针对的是神经病理变化[74]。认知训练在操作上主要是一些特殊的认知步骤的重复练习[75–77]。然而，这些认知干预的区分有些混乱，在一个临床试验中几种干预方式可能有重叠。另外，在痴呆预防的三个阶段，每一个阶段都有一个干预策略[[78,79]。在AD的第一阶段中通过恢复性的认知训练去促进认知修复。在第二阶段目的是增加有效的和多变的认知，主要需要认知训练以及增加认知康复训练去维持机体功能。第三个阶段为了延缓认知的下降，三个干预措施都要应用。有很多对正常成年人和认知功能有损害的成年人进行认知干预的综述比较多[80–83]。但是随机对照的临床研究增加比较有限。比如Cochrane的综述中额外的认知训练的研究在六年中只增加两项，认知康复的研究在六年中只增加一项。并且在前年的综述中对不同的认知干预划分的不是很清楚，存在潜在的模糊效应，这些都阻碍了该领域的发展[68]。更好的去区分这些认知干预的不同是很有必要的[78]。因此我们系统的去总结这三个认知干预的作用，并且包含了认知干预对正常人、轻度认知损害以及早期痴呆的人群。二、临床证据很多临床随机对照研究证实认知训练能够改善认知[84–87]。然而临床研究中所用的方式不同、是人体或者群体、持续时间的不同、结果不同，这些都使得直接进行比较很困难。为了去评估认知训练可能是一个潜在的干预AD的方法，一些临床考量必需解决。7 文献综述1．认知训练是否直接促进认知改善在正常人中，一项较早的循证医学研究提供了较大的加权平均数为1.07证明认知训练可以改善正常人的认知活动，尽管有阴性结果的报道[88]。另外一项对38个电脑相关的认知训练对正常人影响研究的回顾，有21项研究是关于电脑训练的即时效应，有9项是关于商业软件方面的认知训练，有8项是关于视频游戏的干预[89]，这些都证实认知训练能产生即时效应。另外一项针对2802正常人的研究发现认知训练可以对正常人的认知作用产生即时改善作用[89]。还有一些研究也证实认知训练可以改善正常人的认知功能[90–92]。因此，认知训练能够改善正常人的认知功能，并可能作为一种认知干预措施去治疗AD。与对照组相比认知训练明显改善具有痴呆风险或者有认知损害成年人的认知功能、反应能力以及学习记忆能力[84–87]。更早的一篇对7个认知训练对轻度认知障碍患者研究的系统回顾也有阳性的结果[93]。另外有几个认知训练对AD患者的实验证实其作用不止局限于改善机体功能，还能改善神经精神症状[94,95]。因此，这些证据都证实认知训练能够快速改善和修护有认知损害成年人的认知功能。然而在一些研究中不同的干预措施是组合的[96]，对单独分析认知训练的作用比较困难。2．认知训练产生的认知改善作用是否有持续性一项先前关于认知训练对正常成年人的纵向随访的回顾证实认知训练在停止后还能产生3-13个月的认知改善作用[97,98]。认知训练对有认知障碍的成年人认知改善作用可以维持3、5、12个月，并能降低AD的发生风险[94,95]。然而，很多的研究缺乏纵向的随访去确定认知训练对预防与治疗AD的作用。因此认知训练的改善认知能维持的时间需要更多，更长时间的随访研究。3．认知训练的量的重要性认知训练如果要应用到临床就涉及到要开具多少认知训练量的问题。比如一次多少分钟，一周几次以及一个疗程多长时间。一项针对AD患者的研究中采用一次15-25分钟，一周三次，持续24周的干预方案[99]。另一项针对轻度认知功能障碍患者的研究是采用一次60分钟，一周5次，持续12周时间的方案[100]。还有采取一次10分钟，一周3次，持续6周时间的缓和方案[100]。最近的研究发现认知训练一次30-45分钟一周3次进行3周时间认知功能就明显改善，并且能持续12周时8 东南大学博士学位论文间[86]。这些发现提示对AD患者的认知训练要采用个体化干预，根据严重程度来制定方案。4.认知训练是否需要监督在临床试验中，监督和辅导是可变的，比如电脑相关的认知训练可以是个体自己在家里完整，也可以是以以一个小团体来完成[86,101]。多项研究证实存在监督能够明显增加认知训练产生的疗效[86]。一项认知训练对精神分裂症的研究也证实缺乏监督会影响训练的效果。这些研究都提示认知训练时给予监督能更好的让其产生认知改善的疗效。5.认知训练的不良后果任何针对AD的干预措施都考虑不利因素和副作用。目前药物治疗不能改变AD疾病的进程[3,4]，并且药物治疗常常伴随严重副作用，特别是胃肠道副作用（恶心、呕吐和腹泻）。相比于药物治疗，认知训练对正常成年人和认知功能损害的人群都没有副作用[86]。胆碱酯酶的抑制剂被证实对AD患者认知功能有效[102]。同时一项循证医学研究证实认知训练对轻度认知功能障碍患者和AD患者都有认知改善作用[69,77]。有些研究甚至指出认知训练比胆碱酯酶药物的治疗效果更佳[103]。另外，认知训练比药物治疗更加廉价，更加容易满足人们的需求[104]大脑训练、电脑认知训练都已经开始应用，另外一些也正逐步被证实有明显的疗效[89]。6.认知训练能不能与其它干预措施一起应用认知训练常常与其它的认知干预结合使用。在多项研究中都证实在对轻度认知功能障碍和AD患者用认知训练时引入其它的认知干预措施能能明显降低其认知功能的损害[99,105]。最近的认知训练还常常同时与物理运动训练相结合。研究同时证实电脑认知训练结合物理训练能够明显增加改善轻度认知功能障碍患者的疗效[63]。临床随机对照研究也证实认知训练结合物理运动对正常认知功能的增强疗效也显著增加[106]，并能明显减少抑郁症状和改善生活能力[106,107]。尽管推荐认知训练与物理运动训练结合来治疗AD，但是只有一部分研究这样应用[108]。许多的研究同时证实电脑认知训练月胆碱酯酶抑制剂结合对轻度认知功能障碍和AD患者改善记忆和其它认知功能的作用比单纯应用胆碱酯酶抑制剂的疗效更佳[99,100]。另外有研究证实认知训练结合经颅磁刺激干预也比单一使用改善9 文献综述认知的疗效更明显[109]。初步的研究证实认知训练和经颅磁刺激具有协同效应。三、认知训练改善认知的可能机制目前认知训练改善认知的可能机制在一些动物和人的研究中都有开展。新的研究发现其可能的机制为促进神经可塑性的修复[110]，促进影响神经发生的脑神经营养因子的分泌，粒细胞集落刺激因子的分泌，增加脑灰质和海马体积，增加学习容量和突触可塑性[111–113]。动物研究发现认知训练能够增加神经再生，增加新生神经元在神经网络中的功能[111]。在人类应用功能磁共振发现认知训练改善认知的机制与神经可塑性密切相关[114]。在功能磁共振研究中发现正常人5周的工作记忆认知训练明显增加前额叶和顶叶的活动[115]。在轻度认知障碍的患者应用认知训练干预之后短时和长时记忆明显改善，在功能磁共振中发现左侧海马激活明显增加[116]。应用脑电记录研究也提示认知训练明显改善认知活动可能通过功能性神经可塑性的改变[117]。应用磁共振质谱分析提示认知训练可能通过改善轻度认知功能年障碍患者海马的神经化学的变化来改善认知[118]。未来还需要更多的研究去探索认知训练改善AD认知的机制。四、总结和展望证据提示认知训练能改善AD患者的认知功能。并且认知训练改善认知的过程中没有副作用，其疗效与药物治疗相当，并且可以与其它的认知干预措施相结合来增加疗效。更重要的是神经影像和功能脑电的研究都支持认知训练对改善认知的作用。但是真正应用于临床证据还有些薄弱。还需要进一步的研究，包括解决前面提到的一些问题，如明确的划分认知干预措施、认知训练的量、双盲的研究、大样本纵向随访的研究。剂量反应的灵敏性的研究也要深入。另外多种认知干预措施联合应用治疗AD已被推荐。政府对其进行一定的引导是有必要的。促进认知训练在一些小范围内的实施有助于降低老年相关的认知功能下降和AD的预防与治疗。10 东南大学博士学位论文第一部分西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究1.1背景阿尔茨海默病是老年人当中一种常见的神经退行性疾病，可以导致严重的社会和家庭负担[119]。经过百余年的研究，AD仍病因、病机不明，新研发药物在III期临床试验中均被证实疗效不佳[120–122]，关于AD发病机制与治疗的研究在短时间内难以取得突破性进展。因此，针对AD危险因素进行干预或将可能成为阻止其发展的突破点。社会孤立是一种可调控的不良生活方式，是与社会缺乏联系、交流的客观事实，是负性社会因素；孤独感（Loneliness）是一种主观的、令人悲伤的孤单感觉，是负性心理因素[123,124]。二者常合并存在[125]。社会孤立对个人的心身健康以及生长发育具有明显的损害[120]。孤养常常被用作幼年啮齿类动物的应激模型，并且是发生情绪和认知损害的危险因素。社会孤立还能够增加死亡率和发生神经精神疾病的风险，包括精神分裂症[124]、躁狂[123]以及痴呆[125]的风险。我们以前的结果显示孤养能够诱导SD大鼠记忆损害和Tau过度磷酸化。AD的主要病理假说包括Aβ淀粉样沉积形成的老年斑以及Tau过度磷酸化形成的神经原纤维缠结[126]。然而突触的损害往往发生在AD的早期并且与AD患者痴呆的严重程度明显相关[127]。在AD疾病的早期跟晚期都发现有突触结构和功能的损害[128,129]。突触是神经元间联系的基本单位，因此突触功能紊乱是AD早期核心病理变化并且与认知功能紊乱明显相关。许多研究发现慢性不可预测性应激模型能降低雌性大鼠腹侧CA1区神经元的树突棘密度，另外有些研究显示应激能够影响猴子和雄性大鼠CA1区的突触可塑性[130–132]。然而是否突触改变在海马以外的认知相关脑区与认知密切相关还不清楚。选择性五羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）是1980年发现的新型抗抑郁剂。有研究发现给予帕罗西汀干预之后CA1区Aβ和Tau阳性神经元的数目明显降低。我们前面的研究证实艾司西酞普兰和西酞普兰调节体内体外的Tau过度磷酸化[130–11 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究132]。我们同时发现西酞普兰能够调节孤养在中年大鼠诱导的空间记忆损害。然而具体的机制还不是很清楚。在本研究中，我们将评估预防性给予西酞普兰治疗是否能够影响孤养中年大鼠的突触可塑性改变，并探讨其机制。1.2材料与器材1.2.1主要试剂：1)西酞普兰：常州第四制药厂（西酞普兰常温下极易降解，密闭冰箱保存，用时现用现配），中国2)PBS缓冲液（SH30256.01B）：Hyclone公司，美国，美国3)蛋白Marker（10-180kDa）：Fermentas公司，美国4)二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）：Sigma公司，美国5)小牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）：BIOSHARP公司，中国6)脱脂牛奶：BD公司，美国7)丙烯酰胺/N,N-二甲基甲叉双丙烯酰胺（Acrylamide/Bis-Acrylamide，Acr/Bis）：AMRESCO公司，美国8)十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulphate，SDS）：BIOSHARP公司，中国9)四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：Sigma公司，美国10)甘氨酸（glycine，Gly）：BIOSHARP公司，中国11)三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane,Tris）：BIOSHARP公司，中国12)过硫酸铵（ammoniumpersulfate,APS）：汕头西陇化工有限公司，中国13)二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白测定试剂盒：Pierce公司，美国14)浓盐酸：上海久亿化学试剂有限公司，中国12 东南大学博士学位论文15)甲醇：国药集团化学试剂有限公司，中国16)Tween-20：BIOSHARP公司，中国17)RIPA裂解液：碧云天公司，中国18)100×PMSF：碧云天公司，中国19)Cocktail蛋白酶抑制剂：Roche公司，美国20)溴酚蓝：BIOSHARP公司，中国21)丙三醇：国药集团化学试剂有限公司，中国22)溴脱氧尿苷(5-溴代-2'-脱氧尿苷,BrdU)：Sigma，美国23)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（6X）：碧云天公司，中国24)ECL发光剂：MerckMillipore公司，美国25)小鼠单克隆抗体Synaptophysin：MerckMillipore公司，美国26)小鼠单克隆抗体SynapsinI：MerckChemical公司，美国27)兔单克隆抗体PSD93：Abcam公司，英国28)兔单克隆抗体PSD95：Abcam公司，英国29)小鼠单克隆抗体Spinophilin：Abcam公司，英国30)兔多克隆抗体BDNF：Abcam公司，英国31)兔单克隆抗体Akt：CellSignalingTechnology公司，美国32)兔单克隆抗体pSer473-Akt：CellSignalingTechnology公司，美国33)兔单克隆抗体:Brdu，英国34)小鼠单克隆抗体GAPDH：Abcam公司，英国35)山羊抗兔以及山羊抗小鼠过氧化物酶标记的二抗：Pierce公司，美国36)山羊抗兔荧光二抗：Pierce公司，美国13 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究1.2.2溶液配制1)西酞普兰溶液配制：取20mg艾司西酞普兰溶于4.83mL的无菌双蒸水。2)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris-Base:15.1g，甘氨酸：94g，SDS：5.0g，加超纯水至1000mL，搅拌溶解均匀。3)1×转移缓冲液：需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris-Base、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。4)TBS（TrisBufferedSaline）缓冲液：50mmol/LTris-Cl（PH7.5），150mmol/LNaCl。5)TBST：1×TBS，0.1%吐温-20，现用现配。6)丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（30%Acr/0.8%Bis）的配制：称取29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于50mL温热的去离子水中，搅拌使之充分溶解，定容至100mL，测定pH值不超过7.0，滤纸过滤后，置于棕色瓶中，4℃保存、备用。7)Tris-Cl1.5MpH=8.8：取Tris-Base18.165g溶于80ml双蒸水中，浓盐酸调PH为8.8后定容至100mL。8)Tris-Cl1.0MpH=6.8：取Tris-Base12.114g溶于80ml双蒸水中，浓盐酸调PH为6.8后定容至100mL。9)10%SDS：称取SDS10g，溶于50mL温热的去离子水中，搅拌使之充分溶解，定容至100mL，室温保存。10)10%APS：称取0.1gAPS溶于1mL去离子水中，4℃保存，保存一周。1.2.3主要实验仪器设备1)电子天平（BS224S型）：德国Sartorius公司2)PHA-10A数字式酸度仪：萧山市科学仪器厂3)磁力搅拌器：海门其林贝尔仪器制造有限公司14 东南大学博士学位论文4)10µL、20µL、100µL、200µL、1000µL移液器：Eppendorf公司5)小型高速冷冻离心机（Bioc-IR）：上海中科生物医学高科技开发有限公司6)医用超净工作台：吴江市净化设备总产，净化等级100级7)差像显微镜：Olympus公司8)电热高压蒸汽消毒锅：上海医疗器械厂9)超低温冷冻冰箱：日本SANYO公司10)制冰机：日本SANYO公司11)涡旋振荡器：麒麟医仪公司12)超纯水制造仪：美国Millipore公司13)多功能酶标仪：Thermo公司14)普通冰箱：德国BOSCH公司15)温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司16)电热恒温水浴箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂17)垂直电泳系统：美国Bio-Rad公司，包括电泳缸、玻璃板、灌胶支架、玻璃板间隔条、玻璃板夹18)转膜系统：美国Bio-Rad公司19)脱色摇床：海门其林贝尔仪器制造有限公司20)PVDF膜：MerckMillipore公司21)化学发光成像系统（MiniLAS4000）：GEHealthcare公司22)梯度降温盒：Nalgene公司23)量筒各型号：南京晚晴化玻仪器有限公司1.3主要实验方法：15 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究1.3.1实验动物10月龄实验用雄性SD大鼠60只（450±20g，SPF级）饲养于东南大学医学院实验动物中心，40只采用单笼（38cm长×22cm宽×20cm高）饲养，另外20只采用群养（每笼4只）。给予足够的饲料和饮水，同时给予大鼠每天12h光照（光照时间07:00-19:00），通风良好，室温控制在23-25°C，湿度55%。大鼠饲养及动物实验操作遵守国家健康指导中心发布的实验动物管理及使用规定。动物从10个月龄开始进行孤养8周，先孤养或者群养4周时间，从第五周开始有20只孤养的大鼠给予西酞普兰（10mg/kg，溶于0.9%的生理盐水）腹腔注射。另外20只孤养大鼠和20只群养大鼠给予等量0.9%的生理盐水腹腔注射，共干预4周时间。1.3.2行为学方法：1.3.2.1糖水偏爱实验：1)本实验期间实验大鼠都进行单笼饲养。2)实验前先给予大鼠1%蔗糖水适应性喂养24h，并于12h时调换水和糖水水瓶的位置，进行糖水训练；3)训练结束后各组大鼠禁食禁水20h，然后每只大鼠单笼喂养进行蔗糖水偏爱的测量，同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水和一瓶纯水，检测时间为2h，中间更换蔗糖水和纯水的位置，结束后取走两瓶并称重；4)计算大鼠的糖水消耗比例：糖水偏爱=蔗糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%。1.3.2.2旷场实验：1)在进行旷野实验之前，先将大鼠放在检测房间里一个上午使其适应房间环境；16 东南大学博士学位论文2)将大鼠轻放置于100cm长×100cm宽×50cm高的敞箱中，自由活动5min，运用置于敞箱上方的摄像头记录；3)由视频分析系统自动分析5min时间内的大鼠活动情况，包括中央活动区域的时间百分比、总的活动路程、中央活动区域的路程百分比以及垂直活动次数，每一次垂直活动以两个前肢完全抬离地面为准。1.3.2.3新奇物体识别实验：新奇物体识别实验：实验的基本程序主要有3个阶段组成：适应期、熟悉期和测试期。1)适应期：将大鼠依次放入没有任何物体的实验装置中，使其自由探索以便适应进行实验的环境10min，尽量减少动物进行实验过程中的应激性。2)熟悉期：在实验装置底板的相邻或相对位置放入两个完全相同的物体，将大鼠以背对两个物体的方式放入实验装置中，5min后将动物取出放回动物饲养笼中。间隔24h后，进行测试期实验。3)测试期和熟悉期过程类似，只是将两个完全相同的物体中的一个换成另一个不同物体，相对于熟悉期的两个物体测试期时的物体分别被称为熟悉物体和新奇物体。在测试期实验时，为了防止实验动物对某个物体或某个位置特别偏爱导致实验误差出现的现象，大鼠依次进行实验时熟悉物体和新奇物体的功能及位置要相互交换。当动物头部的至少是面向对象的最小距离为1-2cm或更近时，才被认为是探索过程，此外，为了排除气味的影响，物体和实验箱体及时使用70%的乙醇溶液清洗。4)认知指数＝［探索新物体时间/（探索新物体时间＋探索旧物体时间）］。1.3.2.4Morris水迷宫实验（Morriswatermaze，MWM）：1)设备准备：大鼠Morris水迷宫由一个直径为120cm，高为50cm圆水池构成，池壁为黑色，池内水深30cm，水温维持在25±1℃。水迷宫划分为东北（NE）、东南（SE）、西南（SW）、西北（NW）四个象限，NW象限作为目的象限，17 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究正中放入一个直径约11cm、高28cm的透明站台，站台在水面下1-2cm，水中掺入白色食用色素将站台屏蔽。水池周围悬挂蓝色围屏减少外界环境干扰，各象限悬挂不同形状图形作为可见的参照物。实验过程中水池及周围环境保持不变。2)大鼠在每天训练前1h移入水迷宫室，熟悉环境，训练时先将摄相装置与计算机、监视器连接好，保证整个系统的正常运行；3)将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图像经水面上方1.5米处的摄像机拍摄并连接于路径追踪系统采集，最后通过分析，可提供潜伏期(即大鼠从入水点找到隐藏平台所用时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期作为衡量大鼠学习和测试成绩的指标；4)每只大鼠每天在4个象限共训练4次，找到平台后，在平台上站立5s。每次游泳时限为60s，即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，平台站立30s后进行下一次训练；5)采用的实验策略为每组大鼠连续训练5天，训练时间每天固定在2:00PM到8:00PM。6)第6天时撤去平台，以距站台最远的SE点为入水点，将大鼠置入水中，记录各组大鼠在60s内目标象限内路程占总路程百分比、目标象限穿越次数以及平均游泳速度；7)实验过程中应尽量保持实验环境的稳定性，包括测试者、大鼠行为测试时间、投放姿势、采光条件、室内桌椅、窗帘的摆放位置等,尽量减少可引起大鼠行为改变的干扰因素并使得监测系统能如实检测大鼠行为。1.3.3WesternBlot1)样品的制备:①各项行为学检测结束后立即将大鼠断头处死，迅速取出脑组织置于0-4°C生理盐水冲洗表面血迹，置冰盘中快速分离双侧海马；18 东南大学博士学位论文②以1:9（即100μg样品加入900μL体积RIPA）的比例加入RIPA；③0-4°C冰水混合物中用匀浆器制成10%的蛋白匀浆，然后使用超声波破碎仪超声0.3s×15次，置于冰上裂解20min；④12000rpm离心15min，取上清，并进行蛋白质含量测定；加入6×SDS-PAGE上样缓冲液并混匀，100°C水浴10min，然后冷却后置于-20℃保存备用。2)测定蛋白浓度（BCA法）①蛋白标准液的配制：牛血清白蛋白（BSA）50mg，加双蒸水至25ml，终浓度为2μg/μL；②标准曲线的测定：将A液和B液按照50:1混合；取96孔板，按照每孔0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μL加入蛋白标准品，设置两个复孔，然后每孔加入AB混合液100μL。③取待测蛋白样品4μL加入16μL的灭菌蒸馏水，混合均匀，每孔加入5μL稀释液，同样设置2个复孔，加入100μLAB混合液。④将96孔板置于37℃温箱中避光孵育30min，上机检测，读取562nm处的吸光度值，计算标准曲线，根据标准曲线公式，计算出待测样品浓度。3)制备凝胶：按照如下配方制备凝胶①分离胶配方如下：分离胶浓度10％30%Acr/0.8%Bis（mL）1.71.5MTris-CIPH8.8（mL）1.310%SDS（μL）50dH2O（mL）1.910%APS（μL）5019 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究TEMED（μL）2②浓缩胶配方如下：积层胶浓度4％30%Acr/0.8%Bis（mL）0.671.5MTris-CIPH6.8（mL）1.2510%SDS（μL）50dH2O（mL）310%APS（μL）50TEMED（μL）44)样本准备和电泳：所得的蛋白与SDS-PAGE6×上样缓冲液混合，煮沸处理5min后冰上冷却上样。电泳条件：蛋白上样量为30-50μg，浓缩胶恒压80V约20min，分离胶120V约100min；5)湿电转移：①转膜准备：取出凝胶，在转移缓冲液中平衡15min。准备裁剪好的滤纸和PVDF膜，PVDF膜置于甲醇中45s，然后置于去离子水中；②湿电转移：平放底部极阳极板上面按顺序放置海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸和海绵，逐层排汽泡，放于夹层物上。按恒流300毫安通电，转移1h；6)封闭：取出PVDF，置于5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1h；7)抗体与靶蛋白结合：加入封闭液和相应一抗：Synaptophysin（1：1000）、SynapsinI（1：1000）、PSD95（1：1000）、Spinophilin（1：1000）、BDNF（1：2000）、Akt（1：1000）、pSer473-Akt（1：1000）、GAPDH（1：4000），摇床荡孵育（4℃，过夜）；第二天，TBST漂洗滤膜4次，每次10min；将膜20 东南大学博士学位论文置于辣根过氧化酶标记的二抗中，室温下孵育1h，然后用TBST充分洗膜4次，每次10min；8)ECL显影：将等量ECLA液和B液混合，将显影液加于PVDF膜上，室温放置1min，放入化学发光系统中，连续曝光至出现最佳条带。9)图像分析：使用Quantityone软件（Bio-Rad，Richmond，美国）进行信号分析，以各蛋白条带的光密度值来比较蛋白含量的多少。1.3.4高尔基染色1.使用FD快速高尔基染色试剂盒（FDRapidGolgiStain™kit）。2.试剂盒内容物（室温保存）型号PK401APK401溶液A125ml250ml溶液B125ml250ml溶液C125mlx2250mlx2溶液D125ml250ml溶液E125ml250ml玻璃取片器22毛刷22滴瓶11塑料夹11说明书113.需自备材料及试剂双蒸水或Milli-Q水,塑料/玻璃瓶或管，病理染色设备，明胶包被的载玻璃片(Cat.#PO101)，盖玻片，染色缸，乙醇，二甲苯，封片剂，显微镜操作注意事项①本试剂盒仅用于体外研究，不得用于药物、诊断等其它用途。21 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究②本试剂盒内试剂皮肤接触时为有毒有害，误服有致命危险，取用时用电动移液器或洗耳球吸取（不得用嘴吸取），并避免吸入或接触皮肤、眼睛。如有接触需立即用大量水冲洗并及时就医。加入误服，应吐出并用大量水漱口，并立即就医。③在通风橱内操作，穿戴防护服，手套，护眼眼睛。每次实验结束后彻底清洗手部。4.组织准备①实验动物须深度麻醉后处死，脑组织（或人尸体脑组织）应尽快并小心取出，避免损伤或压迫组织。注意：除绝对必要的情况下动物无需灌注，如确实需要以4%多聚甲醛灌注动物，应少于5分钟，并不用后固定。大的脑组织（包括大鼠脑）应以锋利小刀切割成约10mm厚的小块（重要）。②双蒸水或Milli-Q水冲洗组织以除去表面血液。③将组织浸入等体积的溶液A和溶液B混合而成的浸泡液中，室温避光保存约2周，在浸入6小时或第二天更换浸泡溶液。通常2周的浸泡时间可以获得满意的实验结果，但是不同大小及类型的组织需要的浸泡时间可能不同，因此，为获得最佳的实验结果，每种类型的组织在相同大小下仍需要预实验以确定最佳浸泡时间，一般而言3周的浸泡时间对大多数组织均足够。需要注意的是，浸泡时间越长，背景染色越深。注意事项：浸泡液需要在使用前24小时配置，并保持静止，使用无沉淀的上清作为浸泡液。配置好的浸泡液可以在室温下避光保存一个月。每一立方厘米至少使用5ml浸泡液，浸泡液过少可减少染色敏感性及可靠性。同时，为获得最佳染色效果，每周应轻柔旋转摇动浸有组织块的容器两次（切忌剧烈摇动），每次几秒即可。警告:溶液A及溶液B因含有有毒的氯化银，重铬酸钾及铬酸钾，避免接触皮肤，误服可能致死。实验应在化学通风橱或安全柜里进行，并穿戴适当的保护服，手套及眼/脸保护设备。用完的溶液不得倒入下水道，应装入专用的容器内，通知有害试剂回收部门进行处理。22 东南大学博士学位论文④将浸泡后的组织转入溶液C，室温避光保存72小时（最多一周）。浸泡24小时后换液一次。⑤在冰冻切片机上调整切片箱温度（-20°C到-22°C）将组织片切成100到200μm切片（切片前请仔细阅读本条下的注意事项）。除冰冻切片机外，其它如滑动式切片机或振动切片机等也可以使用（细节请看本条下注意事项）。然后用本试剂盒提供玻璃取片器将切片转移至滴有溶液C的明胶包被载波片上(Cat.#PO101)，为便于在载波片上滴加溶液C，本试剂盒提供了一只滴瓶。载波片上多余的溶液应以巴斯德管吸除，然后用吸水纸尽可能吸净，或者可导致脱片。然后将切片自然风干（切忌热风吹干或烤干）。为尽可能获得好的染色结果，切片应尽快进行染色，如确需保存，可在室温避光条件下保存最多3天。注意事项：（1）、切片准备：为避免组织冰冻是受到损坏，尽可能好的保持组织细胞形态，样品应在冰冻切片机上进心速冻。例如：样品可以如下方式进行速冻：将样品放在塑料勺中，缓慢浸入以干冰预冷的异戊烷（为获得最佳结果，预冷的异戊烷应低于零下70度，在1分钟内浸入，越慢越好），在组织完全浸入异戊烷后，等待几秒然后捞至干冰上放置一分钟，以确保样品达到最佳速冻状态。在切片前切忌速冻好的样品解冻。（2）切片机选择：能切出较厚切片的切片机均可选择（如100um）。如冰冻切片机只有一个温度控制，请在切片前设置切片箱温度至-22度至少4小时。如切片机有两个温度设置程序，请设置切片箱温度低于刀头温度1度。需要注意的是，-22度多数情况下可以获得满意的染色结果，然而不同的切片机与不同样品可能需要高一些或低一些的切片温度以保证切片的平滑与完整。（3）以下内容有助于冰冻切片机操作：1）使用双蒸水将样品装到样品盘上，并确保样品未融化（可以在干冰上操作）。也可以用其它样品凝固剂进行安装（如OCT）但是不要将样品完全包在凝固剂上，避免切片时刀片切到凝固剂。如果样品必须包埋后才能切片，请使用TFM（TBS,Durham,NC,USA,Cat.#TFM-5）包埋。2）样品装上样品盘后，干冰上放置10分钟，然23 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究后立即将装上样品的样品盘安装到冰冻切片机上相应位置，在切片前任其放置5分钟。3）先试切几片（勿使用防卷板），如样品过冷（可能表现为与刀片平行的切片易碎），那么请等待几分钟再切，如切片符合要求，则可继续切片。灌注的脑组织也可以用琼脂糖或白明胶包埋，然后用振动切片机进行切片，但是必须使用溶液C收集切片（切片机孵育槽里须注满溶液C）。否则切片在干燥时可能碎裂。如用滑动切片机切灌注的脑组织，刀台和刀片均需要维持在低温（低于零度），同样，切片必须覆盖在溶液C内。5.染色步骤：①双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。②将切片放入混有1份溶液D，一份溶液E及两份双蒸水或Milli-Q水的混合液中处理10分钟。如：溶液D10ml+溶液E10ml+双蒸水或Milli-Q水20ml注意事项：混合工作液须现用现配，100ml混合工作液最多处理100张小鼠脑片（根据切片大小确定）。染缸必须加盖以避免试剂蒸发，并不时旋转搅动孵育液。在整个染色过程中（封片前）均勿让切片啊干燥。③双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。(每次更换双蒸水).④甲酚紫或硫堇衬染（可选步骤），如要进行衬染，步骤3中清洗时间和次数均要增加，如清洗4次，每次5分钟或更长时间。⑤50%、75%、95%乙醇梯度脱水,每个梯度4分钟(不可跳过某个浓度).⑥无水乙醇脱水4次，每次4分钟（不可增加时间）⑦二甲苯透明3次，每次4分钟，用Permount®封片。注意事项：封片前切片可在二甲苯中存放几小时，为获得最佳染色效果，请使用纯的未稀释的Permount®封片。染色好的切片应随时避光。1.3.5免疫荧光1.组织准备24 东南大学博士学位论文10%水合氯醛腹腔注射大鼠腹腔进行麻醉，固定于一木板上，打开胸腔和腹腔，进行心脏灌注，首先用约250ml生理盐水冲洗血液，接着用500ml4%多聚甲醛灌注固定，速度先快后慢。灌注结束后，取出脑组织，并将左右半球分开后放入4%多聚甲醛固定液中，过夜，后固定。后固定的脑组织依次放入10%、15%、25%、30%蔗糖溶液中进行脱水处理，每个浓度脱水时间24h。脱水后放入液氮速冻1min，然后存放于-80℃冰箱。切片前，将脑组织先从-80℃取出，放入-20℃过夜后，用OCT包埋，冰冻切片机切片，厚度为30μm。从DG区开始出现到DG区结束，每200μm取一张，进行Brdu免疫荧光染色。2.Brdu免疫荧光染色操作步骤如下：1）标本复温2）PBST清晰，10min×3次3）1%BSA-PBST封闭，室温1小时4）加一抗（anti-Brdu，1:500）,4℃过夜5）将切片从4℃冰箱取出，室温复温0.5h6）PBST清洗10min×3次7）加二抗（羊抗兔488,1:1000），室温2h8）PBST清洗10min×3次9）观察拍照1.4统计方法运用IBMSPSSStatistic18.0软件分析数据。水迷宫潜伏期采用重复测量的方差分析。其余数据采用单因素方差分析，组与组之间的比较采用Bonferroni检验。数据用均数±标准差表示。p<0.05认为有统计学意义。1.5结果1.5.1西酞普兰治疗对孤养诱导的情绪障碍的影响有过应激的经历被认为与心理发生改变密切相关，应激能够诱导许多神经精神症状。旷场实验被用来检测啮齿类动物的焦虑或者探索行为。如图所示，在群25 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究养组和孤养组的总的穿梭距离没有差异，并且西酞普兰干预也没有影响（见图1-1a，b）。在旷场中间的活动距离在各个组间也没有明显的统计学差异（见图1-1c）。但是孤养组大鼠在旷场中的垂直起立次数较群养组明显降低，在给予西酞普兰治疗后明显改善（见图1-1c）。糖水偏爱实验是用来评估大鼠是否有快感缺失，快感缺失是抑郁的核心症状之一。在本实验中糖水消耗百分比在三组间没有发现明显的差异，提示孤养后没有抑郁样的症状（见图1-1d）。图1-1.西酞普兰治疗对孤养诱导的情绪障碍的影响。（a）各组在旷场实验中总的活动距离的结果。（b）各组在旷场实验中中间活动距离的结果。（c）各组在旷场实验中垂直起立次数的结果。（d）各组的在糖水偏爱实验中糖水消耗百分比的结果。数据用均数±SD（n=20）。*P<0.05,GHvsSI,#P<0.05SI+CIvsSI。1.5.2西酞普兰干预对孤养诱导的视空间学习和记忆损害的影响记忆损害是AD早期比较常见的症状之一。因此我们用新奇物体识别实验和水迷宫实验来检测孤养对情景记忆和视空间记忆的影响。在新奇物体识别实验中，群养组对新物体的识别时间百分比超过80%，而在26 东南大学博士学位论文孤养组对新物体识别时间百分比57%和对旧物体的识别时间百分比43%（见图2-1a）。给予西酞普兰治疗之后明显改善孤养诱导的认知指数的下降（见图2-1a）。因此，孤养能够损害情景记忆。图1-2西酞普兰治疗对孤养诱导的学习和记忆损害的影响。（a）在新奇物体识别实验中，用认知指数来检测各组的情景记忆能力。（b）在水迷宫训练期间，各组在5天训练期中找到平台的潜伏期。（c）在水迷宫训练第6天，各组在目标象限的时间百分比。（d）在水迷宫训练第6天，各组穿梭平台的次数。数据用均数±SD（n=20），*P<0.05,GHvsSI,**P<0.01,GHvsSI,#P<0.05SI+CIvsSI.在水迷宫中，我们发现孤养大鼠和西酞普兰干预的大鼠都不影响其运动能力（见图1-2a），另外有研究证实孤养并不能影响大鼠的游泳速度[133]。与前面的研究相一致，我们在水迷宫学习训练期间发现孤养后大鼠的游泳速度和能力并没有影响。但是在训练期间结果显示，在训练的第4天和第5天孤养大鼠找到平台的潜伏期较群养组明显延长（见图1-2b）。然而，西酞普兰干预明显改善孤养诱导的视空间学习能力的损害（见图1-2b）。在第6天的记忆力检测中，撤去平台后孤养大鼠在目标象限的时间百分比较群养组明显降低（见图1-2c），在西酞普兰干预组这一变化明显改善（见图1-2c）。同时我们还观察在大鼠穿梭平台的次数，27 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究发现孤养大鼠较群养大鼠穿梭平台的次数明显降低，而西酞普兰治疗能够明显改善这个变化（见图1-2d）。1.5.3孤养对中年大鼠认知相关脑区突触相关蛋白表达的影响突触相关蛋白是突触可塑性的基础，我们检测了7个认知相关脑区的突触相关蛋白的表达情况，检测的突触相关蛋白包括突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93（PSD93）、突触后致密物95（PSD95）。检测的脑区包括前额叶、背侧海马、复测海马、尾壳核、后扣带、内嗅皮层和杏仁核。结果显示，在前额叶中孤养大鼠突触素和PSD93表达明显降低，给予西酞普兰治疗后明显改善（见图1-3a）。在背侧海马孤养大鼠突触素和PSD93表达明显降低，给予西酞普兰治疗后明显改善（见图1-3b）。图1-3西酞普兰治疗对7个认知相关脑区突触相关蛋白表达的影响。（a）各组在前额叶突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93、突触后致密物95的表达。（b）各组在背侧海马突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93、突触后致密物95的表达。（c）各组在腹侧海马突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93、突触后致密物95的表达。28 东南大学博士学位论文在背侧腹侧海马孤养大鼠突触素和PSD93表达明显降低，给予西酞普兰治疗时候明显改善（见图1-3c）。在杏仁核孤养大鼠PSD93表达明显降低，给予西酞普兰治疗之后明显改善（见图1-3d）。在尾壳核孤养大鼠突触素的表达明显降低，给予西酞普兰干预之后有改善的趋势，没有统计学差异（见图1-3e）。在内嗅皮层和后扣带回各项指标没有统计学差异（见图1-3f,g）。结果提示孤养能够引起前额叶、背侧海马、腹侧海马、杏仁核等脑区的突触相关蛋白表达降低，而西酞普兰干预可以逆转这些损害。图1-3（d）各组在杏仁核突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93、突触后致密物95的表达。（e）各组在尾壳核突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93、突触后致密物95的表达。（f）各组在内嗅皮层突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93、突触后致密物95的表达。（g）各组在后扣带皮层突触素、突触蛋白I、树突棘素、突触后致密物93、突触后致密物95的表达。数据用均数±SD（n=3），*P<0.05,GHvsSI,**P<0.01,GHvsSI,#P<0.05SI+CIvsSI。29 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究1.5.4西酞普兰干预对孤养诱导的突触结构损害的影响前面我们证实了孤养能够引起前额叶、背侧海马、腹侧海马、杏仁核等脑区的突触相关蛋白表达降低。我们接下来选择前额叶、背侧海马以及腹侧海马来观察突触结构的变化。我们应用高尔基染色来检测。我们观察了树突的尖部和基部树突棘的数目孤养大鼠在前额叶、背侧海马以及腹侧海马树突棘的数目都明显降低，而给予西酞普兰干预后树突棘的数目明显修复（见图1-4）。图1-4西酞普兰治疗对孤养诱导的突触结果损害的影响。（a，b，c）各组在前额叶的神经元树突尖部和基部的树突棘密度。（d，e，f）各组在背侧海马的神经元树突尖部和基部的树突棘密度。（g，h，i）各组在背侧海马的神经元树突尖部和基部的树突棘密度。数据用均数±SD(n=5)。标尺=1μm.*P<0.05,GHvsSI,#P<0.05SI+CIvsSI,##P<0.01SI+CIvsSI。30 东南大学博士学位论文1.5.5西酞普兰干预增加孤养大鼠海马DG区新生神经元的数目在实验结束阶段，各组大鼠在处死前6小时腹腔注射Brdu，用来标记新生神经元的数目。结果发现孤养大鼠较群养大鼠新生神经元的数目有降低的趋势，而给予西酞普兰干预之后能明显增加新生神经元的数目（见图1-5）。图1-5西酞普兰治疗对DG区新生神经元的数目的影响。（a）用Brdu标定的新生神经元，绿色荧光显示的是新生的神经元。（b）各组在DG区Brdu阳性的神经元数目。数据用均数±SD(n=5)。#P<0.05SI+CIvsSI。1.5.5BDNF/Akt/GSK-3β信号通路参与西酞普兰改善孤养诱导的突触可塑性损害的过程BDNF/Akt/GSK-3β信号通路被证实是调节神经元增殖、分化、突触形成和调控突触结构和功能改变[133]。我们检测了背侧海马BDNF、磷酸化Akt、总的Akt、磷酸化GSK-3β以及总的GSK-3β表达。结果发现孤养大鼠的BDNF、磷酸化Akt以及磷酸化GSK-3β表达明显降低，而给予西酞普兰治疗之后明显改善（见图1-6a,c,e）。总的Akt和总的GSK-3β表达无统计学差异（见图1-6c,e）。因为后扣带回突触相关蛋白的表达没有统计学差异，因此我们选择后扣带回BDNF、磷酸化Akt、总的Akt、磷酸化GSK-3β以及总的GSK-3β表达来作为对31 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究图1-6BDNF/Akt/GSK-3β通路参与西酞普兰改善孤养诱导的突触可塑性损害。（a）各组在背侧海马BDNF的表达。（b）各组在后扣带BDNF的表达。（c）各组在背侧海马总的Akt和磷酸化丝氨酸473位点Akt的表达。（d）各组在后扣带总的Akt和磷酸化丝氨酸473位点Akt的表达。（e）各组在背侧海马总的GSK-3β和磷酸化丝氨酸9位点GSK-3β的表达。（f）各组在后扣带总的和磷酸化丝氨酸9位点GSK-3β的表达。数据用均数±SD(n=3)。*P<0.05,GHvsSI,**P<0.01,GHvsSI,#P<0.05SI+CIvsSI。32 东南大学博士学位论文照。结果发现在后扣带回BDNF、磷酸化Akt、总的Akt、磷酸化GSK-3β以及总的GSK-3β表达没有统计学差异（见图1-6b,d,f）。1.6讨论先前的研究证实孤养对心理和身体健康损害很大。AD是一种常见神经退行性疾病，发病后随着认知能力的下降往往伴随着与社会和家庭脱离的状况[134]。有研究组就发现在幼年APP/PS1小鼠孤养能够导致早期AD样病理变化[135,136]。其他的研究证实在老年APP/PS1小鼠孤养能够诱导严重的认知损害和加重AD样病理变化[137]。SSRI类的抗抑郁药被证实有神经保护作用[138,139]，并且越来越多证据提示SSRI类抗抑郁药可能应用于AD的治疗[140,141]。然而是否西酞普兰（SSRI类抗抑郁药的一种）能够改善孤养诱导的认知损害，以及孤养诱导认知损害的机制也不是很清楚。在我们的研究中，我们证实孤养后大脑认知相关脑区的突触可塑性降低可能是其影响认知主要机制，同时我们发现西酞普兰治疗可以逆转这些损害，特别是在前额叶、背侧海马以及腹侧海马。同时我们证实BDNF/Akt/GSK-3β信号通路在调节孤养诱导的突触可塑性和海马神经发生损害中发挥重要的作用。焦虑和抑郁常常在AD患者中伴随发生，但是他们与认知功能损害的严重性不相关[142,143]。先前的研究发现在幼年期啮齿类动物孤养能够诱导许多行为学异常，比如易攻击性、焦虑以及多动[144–146]。在我们的研究中，旷场实验和糖水偏爱实验结果显示孤养不能诱导成年动物焦虑或者抑郁样症状。然而，在孤养的大鼠探索行为明显降低。同时，新奇物体识别实验和水迷宫实验结果显示孤养诱导严重的空间学习和记忆损害。在西酞普兰治疗之后，孤养诱导的空间学习和记忆损害明显改善。这些结果与我们之前的研究相一致。突触是神经元联系的功能单位，并且突触损害与认知紊乱明显相关[147]。在AD患者中突触的损害与其认知下降明显相关[148]。另外，在AD患者尸检标本中发现海马和皮层的突触的密度以及树突棘的数目明显降低[147]。突触素是突触囊泡的完整蛋白质，是观察突触囊泡运动的一个重要的标志物。PSD93是鸟苷酸激酶家族中的一员。鸟苷酸激酶家族是突触骨架的重要蛋白，并影响突触的功能[149–151]。突触素和PSD93的表达在调节突触转运和功能方面发挥重要的作用[148,152]。在我们的研究中，我们检测了突触相关蛋白在七个认知相关脑区的表达情况，其中包括包括前额叶、背侧海马、腹侧海马、尾壳核、后扣带、内嗅皮层和杏仁核。33 西酞普兰对孤养大鼠认知障碍的干预及内在机制研究我们发现孤养大鼠的突触前的突触素和/或突触后蛋白PSSD93在前额叶、背侧海马、腹侧海马、尾壳核、杏仁核几个脑区表达明显降低。我们的结果提示突触可塑性在这些认知相关脑区的损害是孤养诱导认知损害的基础，并且与一些MRI方面的研究相一致。像前额叶、海马、杏仁核以及尾壳核都与情景记忆密切相关，这些脑区在MCI和AD患者中都会发生一定的变化[153–156]。前额叶、背侧海马、腹侧海马以及尾壳核这几个脑区之间直接或者间接发生相关联系[157,158]，同时杏仁核和尾壳核都与海马之间存在直接或者间接的联系[159–161]。通过特殊的激活和相互联系，这些认知相关脑区在记忆的形成过程中发挥重要的作用。我们同时发现西酞普兰治疗能够明显增加前额叶、背侧海马、腹侧海马等脑区突触素和PSD93的表达，这些提示西酞普兰可以通过促进前额叶和海马的突触可塑性的修复来改善孤养诱导的认知损害。树突棘是树突的微小凸起并且对兴奋性突触传递密切相关[162]。在AD病人和AD动物模型中都发现树突棘数目的丢失和结构的改变[163,164]。突触结构的退化发生在AD疾病病理的早期[165]，并且突触结构和功能的损害是造成AD记忆减退的主要因素[163,164]。我们发现孤养大鼠前额叶、背侧海马以及腹侧海马的树突棘数目明显降低。认知相关脑区树突棘数目的降低以及突触相关蛋白表达的降低导致认知损害病理基础。先前有研究证实BDNF是调控突触可塑性的一个重要的蛋白[166]。BDNF可以通过PI3K/Akt、GSK-3β信号通路调节突触蛋白的表达[167]。在幼年大鼠通过PI3K激活Akt和GSK-3β能够增加原代皮层神经元的突触蛋白的表达来增加突触发生[166,168,169]。BDNF/PI3K/Akt信号通路除了促进突触发生还对神经发生和突触结构有重要作用[166,170–172]，先前一项研究显示激活这条通路可以增加海马的神经发生和树突棘的数目[173]。还有些研究证实艾司西酞普兰治疗能够增加出生后13小狗脑内BDNF信使RNA和蛋白的表达，并能够增加BDNF上游受体TriB的信使RNA的表达[174]，并且西酞普兰治疗也能通过激活TrkB表达促进BDNF的表达[175]。我们的结果显示孤养后显著降低背侧海马BDNF、磷酸化的Akt以及磷酸化的GSK-3β的表达，这与在孤养大鼠背侧海马突触素和PSD93以及树突棘数目降低的结果相一致。而西酞普兰干预明显逆转该损害。同时BDNF/PI3K/Akt信号通路、突触相关蛋白以及树突棘数目在后扣带回没有明显变化。这些结果提示34 东南大学博士学位论文BDNF/PI3K/Akt信号通路在调节孤养诱导的突触结构和功能变化中发挥重要的作用。另外，西酞普兰干预可以增加海马DG区新生神经元的数目。这些结果提示西酞普兰干预可以促进海马神经发生以及通过BDNF/PI3K/Akt信号通路影响下游GSK-3β来调控孤养诱导的突触可塑性损害。总之，我们的研究证实西酞普兰能够改善孤养诱导大鼠视空间记忆损害以及前额叶、背侧海马、腹侧海马突触可塑性的损害。同时，BDNF/PI3K/Akt信号通路对调控孤养大鼠海马神经发生和突触可塑性发挥重要的作用。35 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究第二部分视空间学习训练通过NLRP3/caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究2.1背景阿尔茨海默病是老年人中痴呆的主要类型，是一种以认知功能全面衰退、精神行为异常、日常生活能力最终丧失为临床表现的神经退行性疾病。随着人口老龄化的加剧，AD患病人数急剧上升。数据显示，目前全世界AD患者达到4680万，中国AD患者已达950万，AD患者仍以每20年翻一番的速度急速增长，给家庭和社会造成极大的负担[1-2]。经过百余年的研究，AD仍病因、病机不明，新研发药物在Ⅲ期临床试验中均被证实疗效不佳[3-4]。目前临床上以胆碱酯酶抑制剂（安理申等）和NMDA受体阻断剂（美金刚）为主的治疗方案只能延缓疾病进展，并不能逆转病程，且价格昂贵。因此，针对AD的非药物治疗具有极大的潜力和优势。2015年世界阿尔茨海默病协会分析痴呆的可调控危险因素后指出，低教育水平会明显增加AD的发病风险[175]。在诊断为AD的患者中，具有高教育水平的人群认知能力的损害会明显减缓[176]。给予AD患者认知刺激治疗可改善其认知功能，且疗效与胆碱酯酶抑制剂相当[177]。不同形式的认知训练模式也能改善老年人的认知功能，明显减少其发展为痴呆和轻度认知障碍（MCI）的风险[178–180]。临床前研究也有类似的发现。水迷宫检测最早由Morris在1984年应用于检测大鼠的认知功能[181]，并一直作为啮齿类动物视空间学习记忆检测的金标准。水迷宫检测过程也是视空间工作记忆建立的过程。Billings在2007年首次把水迷宫训练作为一种视空间认知训练模式去干预3xTg-AD小鼠，发现其明显改善痴呆小鼠认知功能以及Tau病理。应用功能MRI检测发现经过水迷宫训练后的Wister大鼠和C57小鼠海马体积明显增加[182,183]。此外，水迷宫训练还能促进AD模型大鼠海马新生神经元的存活和分化[184]。越来越多的临床与临床前证据均提示，认知训练可改善AD和MCI患者的认知功能，延缓疾病进展，但其机制不清。突触可塑性与认知功能关系紧密。突触是AD患者中最早发生病理变化的部36 东南大学博士学位论文位，并且海马突触损害程度与AD患者的认知水平密切相关[185,186]；我们课题组研究发现MCI患者海马网络功能连接降低，这种降低可能与海马突触可塑性下降有关；功能MRI检测还发现认知训练能明显提高老年人与处理速度相关的大脑区域神经元的活性[187]。我们在轻度认知损害的大鼠（孤养模型）中也发现了海马突触相关蛋白表达降低和树突棘结构的损害；AD模型Tg2576小鼠经过水迷宫认知训练后，认知能力明显改善，伴有海马齿状回和CA1区神经元的长时程增强，树突棘分枝生成[188]。上述证据提示认知训练可能是通过提高海马突触可塑性改善AD的认知功能。近些年来，炎症假说在AD的发生发展中发挥重要的作用，NLRP炎性小体是由胞浆内模式识别受体参与组装的多蛋白复合物。是初始免疫的重要生物分子。目前已发现的炎性小体主要有4种，即NLRP1炎性小体、NLRP3炎性小体、IPAF炎性小体和AIM2炎性小体。其中，NLRP3炎症小体作为固有免疫的重要组分，在机体免疫反应和疾病发生过程中发挥重要作用。当机体遭遇有害因子刺激时，NLRP3炎性小体可诱导pro-caspase-1裂解成具有活性的caspase-1，促进IL-1β等的生成，从而参与宿主的炎症反应。研究发现NLRP3炎性小体在AD患者和动物模型中明显激活并且促进Aβ的形成[189]。NLRP3炎性小体激活能够促进IL-1β等促炎性因子的分泌，IL-1β分泌增加会损害AD模型鼠的突触结构和功能[190,191]，特异性阻断IL-1β可减缓AD模型小鼠脑内Tau蛋白的过度磷酸化[192]。此外，丰富环境可明显抑制小鼠脑内IL-1β的分泌[193]。综上所述，小胶质细胞介导NLRP3/caspase-1通路调控突触可塑性的改变可能是认知训练改善认知损害的重要机制。本研究我们将观察长时间的视空间训练能否改善PR5小鼠的认知功能功能；观察其疗效的远期疗效；并且探讨NLRP3/caspase-1/IL-1β通路在其中发挥作用的机制。2.2材料与器材2.2.1主要试剂：1)PBS缓冲液（SH30256.01B）：Hyclone公司，美国，美国2)蛋白Marker（10-180kDa）：Fermentas公司，美国37 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究3)二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）：Sigma公司，美国4)小牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）：BIOSHARP公司，中国5)脱脂牛奶：BD公司，美国6)丙烯酰胺/N,N-二甲基甲叉双丙烯酰胺（Acrylamide/Bis-Acrylamide，Acr/Bis）：AMRESCO公司，美国7)十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulphate，SDS）：BIOSHARP公司，中国8)四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：Sigma公司，美国9)甘氨酸（glycine，Gly）：BIOSHARP公司，中国10)三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane,Tris）：BIOSHARP公司，中国11)过硫酸铵（ammoniumpersulfate,APS）：汕头西陇化工有限公司，中国12)二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白测定试剂盒：Pierce公司，美国13)浓盐酸：上海久亿化学试剂有限公司，中国14)甲醇：国药集团化学试剂有限公司，中国15)Tween-20：BIOSHARP公司，中国16)RIPA裂解液：碧云天公司，中国17)100×PMSF：碧云天公司，中国18)Cocktail蛋白酶抑制剂：Roche公司，美国19)溴酚蓝：BIOSHARP公司，中国20)丙三醇：国药集团化学试剂有限公司，中国21)溴脱氧尿苷(5-溴代-2'-脱氧尿苷,BrdU)：Sigma，美国22)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（6X）：碧云天公司，中国38 东南大学博士学位论文23)ECL发光剂：MerckMillipore公司，美国24)小鼠单克隆抗体Synaptophysin：Abcam公司，英国25)兔单克隆抗体PSD93：Abcam公司，英国26)兔单克隆抗体PSD95：Abcam公司，英国27)小鼠单克隆抗体Tau5：Abcam公司，英国28)兔单克隆抗体Tau1：MerckMillipore公司，美国29)兔单克隆抗体pS396：Abcam公司，英国30)兔单克隆抗体pT231：Abcam公司，英国31)小鼠单克隆抗体NLRP3：AdipoGen公司，美国32)兔多克隆抗体Caspase-1：Abcam公司，英国33)兔多克隆抗体IL-1β：Abcam公司，英国34)小鼠单克隆抗体GAPDH：Abcam公司，英国35)山羊抗兔以及山羊抗小鼠过氧化物酶标记的二抗：Pierce公司，美国36)DNA上样缓冲液（6×）：碧云天公司，中国；37)50×TAE：碧云天公司，中国；38)GelRed（10000×）：碧云天公司，中国；39)DNAMarker（100-1000bp）：TaKaRa公司，zh中国；40)2×PCRMasterMix：碧云天公司，中国；41)PCR引物：华大基因，中国2.2.2溶液配制1)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris-Base:15.1g，甘氨酸：94g，SDS：5.0g，加超纯水至1000mL，搅拌溶解均匀。39 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究2)1×转移缓冲液：需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris-Base、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。3)TBS（TrisBufferedSaline）缓冲液：50mmol/LTris-Cl（PH7.5），150mmol/LNaCl。4)TBST：1×TBS，0.1%吐温-20，现用现配。5)丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（30%Acr/0.8%Bis）的配制：称取29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于50mL温热的去离子水中，搅拌使之充分溶解，定容至100mL，测定pH值不超过7.0，滤纸过滤后，置于棕色瓶中，4℃保存、备用。6)Tris-Cl1.5MpH=8.8：取Tris-Base18.165g溶于80ml双蒸水中，浓盐酸调PH为8.8后定容至100mL。7)Tris-Cl1.0MpH=6.8：取Tris-Base12.114g溶于80ml双蒸水中，浓盐酸调PH为6.8后定容至100mL。8)10%SDS：称取SDS10g，溶于50mL温热的去离子水中，搅拌使之充分溶解，定容至100mL，室温保存。9)10%APS：称取0.1gAPS溶于1mL去离子水中，4℃保存，保存一周。10)1MTris-HCl（pH8.0）：取212gTris-Base，加入800mL去离子水，然后用HCl调pH至8.0，定容至1000mL；11)50mMNaOH：取40mgNaOH，溶于20mL去离子水中；2.2.3主要实验仪器设备1)电子天平（BS224S型）：德国Sartorius公司2)PHA-10A数字式酸度仪：萧山市科学仪器厂3)磁力搅拌器：海门其林贝尔仪器制造有限公司4)10µL、20µL、100µL、200µL、1000µL移液器：Eppendorf公司40 东南大学博士学位论文5)小型高速冷冻离心机（Bioc-IR）：上海中科生物医学高科技开发有限公司6)医用超净工作台：吴江市净化设备总产，净化等级100级7)差像显微镜：Olympus公司8)电热高压蒸汽消毒锅：上海医疗器械厂9)超低温冷冻冰箱：日本SANYO公司10)制冰机：日本SANYO公司11)涡旋振荡器：麒麟医仪公司12)超纯水制造仪：美国Millipore公司13)多功能酶标仪：Thermo公司14)普通冰箱：德国BOSCH公司15)温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司16)电热恒温水浴箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂17)垂直电泳系统：美国Bio-Rad公司，包括电泳缸、玻璃板、灌胶支架、玻璃板间隔条、玻璃板夹18)转膜系统：美国Bio-Rad公司19)脱色摇床：海门其林贝尔仪器制造有限公司20)PVDF膜：MerckMillipore公司21)化学发光成像系统（MiniLAS4000）：GEHealthcare公司22)梯度降温盒：Nalgene公司23)量筒各型号：南京晚晴化玻仪器有限公司24)水平电泳仪：美国Bio-Rad公司；2.3主要实验方法：41 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究2.3.1实验动物表达P301L突变的tau转基因小鼠，种鼠由第三军医大学王延江教授的课题组赠送，后由我实验组对其进行交配繁殖，子代经PCR进行基因型鉴定，鉴定后的转基因小鼠及同窝出生的野生型小鼠用于实验。NLRP3敲除小鼠是从Jackson实验室购买，然后跟PR5小鼠进行杂交，获得NLRP3敲除的PR5小鼠。对其进行交配繁殖，子代经PCR进行基因型鉴定，鉴定后的转基因小鼠及同窝出生的野生型小鼠用于实验。小鼠饲养于东南大学医学院SPF级实验动物中心，饲养光/暗周期为12h/12h，光照时间为7:00–19:00，（22±1）℃恒温，湿度为55±5%，通风良好。在小鼠的饲养、繁殖和实验过程中,均遵守东南大学实验动物中心实验动物管理与保护的相关准则。2.3.2PR5小鼠繁殖成年（约2月后）PR5小鼠与C57BL小鼠杂交，1只PR5雄性小鼠可配2-3只雌性C57BL小鼠，雌性PR5小鼠与雄性C57BL小鼠1：1配比交配；每周观察小鼠怀孕情况，怀孕小鼠分笼饲养。基因型鉴定1)DNA提取：①小鼠出生后3-4周左右进行基因鉴定，剪取小鼠尾巴长约2mm并收集于EP中，然后将小鼠尾巴止血消毒处理；②上述EP管中加入200μL50mM的NaOH，98℃煮沸约1h，再冷却到室温；③向上述EP管中加入20μL1M的Tris-HCl（pH8.0）；④4000rpm离心3min，吸取上清（即为所提取的DNA），进行PCR反应或置于-20℃备用。2)PCR反应①反应体系：42 东南大学博士学位论文2×PCRMasterMix12.5μL10×primers2μL（前后引物各1μL）ddH2O8.5μLDNA2μL总计25μL②PCR反应条件：95℃5min；94℃30s，61℃35s，72℃35s，共38个循环；72℃2min；4℃保存。③目的基因的引物序列：Thy1.2-F：5’-AAGTCACCCAGCAGGGAGGTG-3’Tau-R：5’-TGTCTCCAATGCCTGCTTCTTC-3’3)PCR产物凝胶电泳呈像①制备1.2%的琼脂糖凝胶，在微型离心管中加入样品和一定量的6×上样缓冲液，混匀后用微量移液器将混合物加至样品槽中；②以80V电压电泳25min左右；④电泳结束后，凝胶自动成像系统中观察并记录结果；43 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究⑤PCR结果如下图所示：2.3.3NLRP3敲除PR5小鼠繁殖成年（约2月后）PR5小鼠与NLRP3小鼠杂交，1只PR5雄性小鼠与一只NLRP3敲除雌小鼠或者一只雌性PR5小鼠与一只NLRP3敲除雄性小鼠交配；每周观察小鼠怀孕情况，怀孕小鼠分笼饲养。基因型鉴定1)DNA提取：①小鼠出生后3-4周左右进行基因鉴定，剪取小鼠尾巴长约2mm并收集于EP中，然后将小鼠尾巴止血消毒处理；②上述EP管中加入200μL50mM的NaOH，98℃煮沸约1h，再冷却到室温；③向上述EP管中加入20μL1M的Tris-HCl（pH8.0）；④4000rpm离心3min，吸取上清（即为所提取的DNA），进行PCR反应或置于-20℃备用。2)PCR反应①反应体系：44 东南大学博士学位论文2×PCRMasterMix12μL10×primers3μL（引物各1μL）ddH2O8μLDNA2μL总计25μL②PCR反应条件：95℃5min；94℃30s，61℃35s，72℃35s，共38个循环；72℃2min；4℃保存。③目的基因的引物序列：Wild：5’-CACCCTGCATTTTGTTGTTG-3’Common：5’-CGTGTAGCGACTGTTGAGGT-3’Mutant：5’-GCTACTTCCATTTGTCACGTCC-3’3)PCR产物凝胶电泳呈像①制备1.2%的琼脂糖凝胶，在微型离心管中加入样品和一定量的6×上样缓冲液，混匀后用微量移液器将混合物加至样品槽中；②以80V电压电泳25min左右；③电泳结束后，凝胶自动成像系统中观察并记录结果；⑤PCR结果如下图所示：45 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究2.3.4标本的获取使用10月龄PR5小鼠及同窝出生的野生型小鼠作为实验动物，将其分为对照组（Wt组）、野生型鼠+水迷宫训练组（Wt+MWM组）、PR5小鼠组（PR5组）、PR5小鼠+水迷宫训练组（PR5+MWM组），水迷宫训练周期为4周。训练结束后一半的小鼠进行行为学检测（新奇认知试验），另一半继续饲养，三个月后行为学检测。两批小鼠在行为学检测完之后留取脑组织。使用10月龄NLRP3敲除杂合及纯合的PR5小鼠作为实验动物，在前面分组的基础上增加NLRP3敲除杂合的PR5小鼠+水迷宫训练组（PR5/NLRP3+/-+MWM组)、NLRP3敲除PR5小鼠+水迷宫训练组（PR5/NLRP3-/-+MWM组），水迷宫训练周期为1周。练结束后小鼠进行行为学检测（新奇认知试验）。小鼠在行为学检测完之后留取脑组织。2.3.5行为学方法：2.3.5.1Morris水迷宫实验（Morriswatermaze，MWM）：1)小鼠Morris水迷宫由一个直径为120cm，高为40cm圆水池构成，池壁为白色，池内水深30cm，水温维持在21±1℃。水迷宫划分为东北（NE）、东南（SE）、西南（SW）、西北（NW）四个象限，NW象限作为目的象限，正46 东南大学博士学位论文中放入一个直径约11cm、高28cm的透明站台，站台在水面下1cm，水中掺入白色食用色素将站台屏蔽。水池周围悬挂蓝色围屏减少外界环境干扰，各象限悬挂不同形状图形作为参照物。实验过程中水池及周围环境保持不变。2)实验历时6天，分两个阶段：第一阶段为空间获取阶段，历时5天，实验者用手轻托小鼠，将小鼠以半随机顺序从NE、E、S、SW四个入水点（见表1），面向池壁轻柔缓慢入水。如果小鼠60s内找到爬上站台，并在站台上停留5s，将寻找和停留5s时间和定义为潜伏期。如果小鼠在60s内仍未找到站台，潜伏期记为60s，并将其牵引至站台停留30s，以让其根据不同参照物进行空间学习和记忆。每次训完成后，用毛巾擦干小鼠，并用吹风机将小鼠烘干，防止低体温造成应激。每只小鼠总计训练20次。计算各组小鼠每日平均潜伏期、平均游泳速度。第二阶段为空间探索（Spatialprobe）阶段，即第6天，撤走站台，以距站台最远的SE点为入水点，将小鼠置入水中，记录小鼠在60s内目标象限滞留时间占总时间百分比、平均游泳速度、目标象限穿越次数。表1Morris水迷宫空间实验起始象限天数实验1实验2实验3实验41SENESW2NESSWE3SWNEES4ESWSNE5SNEESW6SE3)后面三周每周更换一次平台的位置，然后进行视空间学习训练。2.3.5.2新奇物体识别实验：新奇物体识别实验：实验的基本程序主要有3个阶段组成：适应期、熟悉期和测试期。1)适应期将大鼠依次放入没有任何物体的实验装置中，使其自由探索以便适应进行实验的环境10min，尽量减少动物进行实验过程中的应激性。47 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究2)熟悉期在实验装置底板的相邻或相对位置放入两个完全相同的物体，将大鼠以背对两个物体的方式放入实验装置中，5min后将动物取出放回动物饲养笼中。间隔24h后，进行测试期实验。3)测试期和熟悉期过程类似，只是将两个完全相同的物体中的一个换成另一个不同物体，相对于熟悉期的两个物体测试期时的物体分别被称为熟悉物体和新奇物体。在测试期实验时，为了防止实验动物对某个物体或某个位置特别偏爱导致实验误差出现的现象，大鼠依次进行实验时熟悉物体和新奇物体的功能及位置要相互交换。当动物头部的至少是面向对象的最小距离为1-2cm或更近时，才被认为是探索过程，此外，为了排除气味的影响，物体和实验箱体及时使用70%的乙醇溶液清洗。4)认知指数＝［探索新物体时间/（探索新物体时间＋探索旧物体时间）］。2.3.5.3WesternBlot样品的制备:①各项行为学检测结束后立即将小鼠断头处死，迅速取出脑组织置于0-4°C生理盐水冲洗表面血迹，置冰盘中快速分离双侧海马；②以1:9（即100μg样品加入900μL体积RIPA）的比例加入RIPA；③0-4°C冰水混合物中用匀浆器制成10%的蛋白匀浆，然后使用超声波破碎仪超声0.3s×15次，置于冰上裂解20min；④12000rpm离心15min，取上清，并进行蛋白质含量测定；加入6×SDS-PAGE上样缓冲液并混匀，100°C水浴10min，然后冷却后置于-20℃保存备用。1)蛋白的提取：经过处理完毕的组织各加入200μL预冷的RIPA裂解液（含cocktail蛋白酶抑制剂和PMSF），混匀后冰浴30min，充分裂解；超声波破碎机破碎细胞0.3s×10次，4℃12000rpm离心15min，上清分装存于-80℃备用。48 东南大学博士学位论文2)测定蛋白浓度（BCA法）①蛋白标准液的配制：牛血清白蛋白（BSA）50mg，加双蒸水至25ml，终浓度为2μg/μL；②标准曲线的测定：将A液和B液按照50:1混合；取96孔板，按照每孔0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μL加入蛋白标准品，设置两个复孔，然后每孔加入AB混合液100μL。③取待测蛋白样品4μL加入16μL的灭菌蒸馏水，混合均匀，每孔加入5μL稀释液，同样设置2个复孔，加入100μLAB混合液。④将96孔板置于37℃温箱中避光孵育30min，上机检测，读取562nm处的吸光度值，计算标准曲线，根据标准曲线公式，计算出待测样品浓度。3)制备凝胶：按照如下配方制备凝胶①分离胶配方如下：分离胶浓度10％30%Acr/0.8%Bis（mL）1.71.5MTris-CIPH8.8（mL）1.310%SDS（μL）50dH2O（mL）1.910%APS（μL）50TEMED（μL）2②浓缩胶配方如下：积层胶浓度4％30%Acr/0.8%Bis（mL）0.671.5MTris-CIPH6.8（mL）1.2510%SDS（μL）5049 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究dH2O（mL）310%APS（μL）50TEMED（μL）44)样本准备和电泳：所得的蛋白与SDS-PAGE6×上样缓冲液混合，煮沸处理5min后冰上冷却上样。电泳条件：蛋白上样量为30-50μg，浓缩胶恒压80V约20min，分离胶120V约100min；5)湿电转移：①转膜准备：取出凝胶，在转移缓冲液中平衡15min。准备裁剪好的滤纸和PVDF膜，PVDF膜置于甲醇中45s，然后置于去离子水中；②湿电转移：平放底部极阳极板上面按顺序放置海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸和海绵，逐层排汽泡，放于夹层物上。按恒流300毫安通电，转移1h；6)封闭：取出PVDF，置于5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1h；7)抗体与靶蛋白结合：加入封闭液和相应一抗：Synaptophysin（1：1000）、PSD95（1：1000）、PSD93（1：1000）、Tau5（1：1000）、Tau1（1：1000）、pT231（1：1000）、pS396（1：1000）、NLRP3（1：2000）、Caspase-1（1：1000）、IL-1β（1：1000）、GAPDH（1：4000），摇床荡孵育（4℃，过夜）；第二天，TBST漂洗滤膜4次，每次10min；将膜置于辣根过氧化酶标记的二抗中，室温下孵育1h，然后用TBST充分洗膜4次，每次10min；8)ECL显影：将等量ECLA液和B液混合，将显影液加于PVDF膜上，室温放置1min，放入化学发光系统中，连续曝光至出现最佳条带。9)图像分析：使用Quantityone软件（Bio-Rad，Richmond，美国）进行信号分析，以各蛋白条带的光密度值来比较蛋白含量的多少。2.3.5.4高尔基染色：50 东南大学博士学位论文1.使用FD快速高尔基染色试剂盒（FDRapidGolgiStain™kit）。2.试剂盒内容物（室温保存）型号PK401APK401溶液A125ml250ml溶液B125ml250ml溶液C125mlx2250mlx2溶液D125ml250ml溶液E125ml250ml玻璃取片器22毛刷22滴瓶11塑料夹11说明书113.需自备材料及试剂双蒸水或Milli-Q水,塑料/玻璃瓶或管，病理染色设备，明胶包被的载玻璃片(Cat.#PO101)，盖玻片，染色缸，乙醇，二甲苯，封片剂，显微镜4.操作注意事项1)本试剂盒仅仅用于体外研究，不得用于药物、诊断等其它用途。2)本试剂盒内试剂皮肤接触时为有毒有害，误服有致命危险，取用时用电动移液器或洗耳球吸取（不得用嘴吸取），并避免吸入或接触皮肤、眼睛。如有接触需立即用大量水冲洗并及时就医。加入误服，应吐出并用大量水漱口，并立即就医。3)在通风橱内操作，穿戴防护服，手套，护眼眼睛。每次实验结束后彻底清洗手部。5.组织准备1)实验动物须深度麻醉后处死，脑组织（或人尸体脑组织）应尽快并小心取出，避免损伤或压迫组织。注意：除绝对必要的情况下动物无需灌注，如确实需要以4%多聚甲醛灌注动51 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究物，应少于5分钟，并不用后固定。大的脑组织（包括大鼠脑）应以锋利小刀切割成约10mm厚的小块（重要）。2)双蒸水或Milli-Q水冲洗组织以除去表面血液。3)将组织浸入等体积的溶液A和溶液B混合而成的浸泡液中，室温避光保存约2周，在浸入6小时或第二天更换浸泡溶液。通常2周的浸泡时间可以获得满意的实验结果，但是不同大小及类型的组织需要的浸泡时间可能不同，因此，为获得最佳的实验结果，每种类型的组织在相同大小下仍需要预实验以确定最佳浸泡时间，一般而言3周的浸泡时间对大多数组织均足够。需要注意的是，浸泡时间越长，背景染色越深。注意事项：浸泡液需要在使用前24小时配置，并保持静止，使用无沉淀的上清作为浸泡液。配置好的浸泡液可以在室温下避光保存一个月。每一立方厘米至少使用5ml浸泡液，浸泡液过少可减少染色敏感性及可靠性。同时，为获得最佳染色效果，每周应轻柔旋转摇动浸有组织块的容器两次（切忌剧烈摇动），每次几秒即可。警告:溶液A及溶液B因含有有毒的氯化银，重铬酸钾及铬酸钾，避免接触皮肤，误服可能致死。实验应在化学通风橱或安全柜里进行，并穿戴适当的保护服，手套及眼/脸保护设备。用完的溶液不得倒入下水道，应装入专用的容器内，通知有害试剂回收部门进行处理。4)将浸泡后的组织转入溶液C，室温避光保存72小时（最多一周）。浸泡24小时后换液一次。5)在冰冻切片机上调整切片箱温度（-20°C到-22°C）将组织片切成100到200μm切片（切片前请仔细阅读本条下的注意事项）。除冰冻切片机外，其它如滑动式切片机或振动切片机等也可以使用（细节请看本条下注意事项）。然后用本试剂盒提供玻璃取片器将切片转移至滴有溶液C的明胶包被载波片上(Cat.#PO101)，为便于在载波片上滴加溶液C，本试剂盒提供了一只滴瓶。载波片上多余的溶液应以巴斯德管吸除，然后用吸水纸尽可能吸净，或者可导致脱片。然后将切片自然风干（切忌热风吹干或烤干）。为52 东南大学博士学位论文尽可能获得好的染色结果，切片应尽快进行染色，如确需保存，可在室温避光条件下保存最多3天。注意事项：（1）、切片准备：为避免组织冰冻是受到损坏，尽可能好的保持组织细胞形态，样品应在冰冻切片机上进心速冻。例如：样品可以如下方式进行速冻：将样品放在塑料勺中，缓慢浸入以干冰预冷的异戊烷（为获得最佳结果，预冷的异戊烷应低于零下70度，在1分钟内浸入，越慢越好），在组织完全浸入异戊烷后，等待几秒然后捞至干冰上放置一分钟，以确保样品达到最佳速冻状态。在切片前切忌速冻好的样品解冻。（2）切片机选择：能切出较厚切片的切片机均可选择（如100um）。如冰冻切片机只有一个温度控制，请在切片前设置切片箱温度至-22度至少4小时。如切片机有两个温度设置程序，请设置切片箱温度低于刀头温度1度。需要注意的是，-22度多数情况下可以获得满意的染色结果，然而不同的切片机与不同样品可能需要高一些或低一些的切片温度以保证切片的平滑与完整。（3）以下内容有助于冰冻切片机操作：1）使用双蒸水将样品装到样品盘上，并确保样品未融化（可以在干冰上操作）。也可以用其它样品凝固剂进行安装（如OCT）但是不要将样品完全包在凝固剂上，避免切片时刀片切到凝固剂。如果样品必须包埋后才能切片，请使用TFM（TBS,Durham,NC,USA,Cat.#TFM-5）包埋。2）样品装上样品盘后，干冰上放置10分钟，然后立即将装上样品的样品盘安装到冰冻切片机上相应位置，在切片前任其放置5分钟。3）先试切几片（勿使用防卷板），如样品过冷（可能表现为与刀片平行的切片易碎），那么请等待几分钟再切，如切片符合要求，则可继续切片。（4）灌注的脑组织也可以用琼脂糖或白明胶包埋，然后用振动切片机进行切片，但是必须使用溶液C收集切片（切片机孵育槽里须注满溶液C）。否则切片在干燥时可能碎裂。如用滑动切片机切灌注的脑组织，刀台和刀片均需要维持在低温（低于零度），同样，切片必须覆盖在溶液C内。6.染色步骤：53 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究1）双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。2）将切片放入混有1份溶液D，一份溶液E及两份双蒸水或Milli-Q水的混合液中处理10分钟。如：溶液D10ml+溶液E10ml+双蒸水或Milli-Q水20ml注意事项：混合工作液须现用现配，100ml混合工作液最多处理100张小鼠脑片（根据切片大小确定）。染缸必须加盖以避免试剂蒸发，并不时旋转搅动孵育液。在整个染色过程中（封片前）均勿让切片啊干燥。3）双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。(每次更换双蒸水).4）甲酚紫或硫堇衬染（可选步骤），如要进行衬染，步骤3中清洗时间和次数均要增加，如清洗4次，每次5分钟或更长时间。5）50%、75%、95%乙醇梯度脱水,每个梯度4分钟(不可跳过某个浓度).6）无水乙醇脱水4次，每次4分钟（不可增加时间）7）二甲苯透明3次，每次4分钟，用Permount®封片。注意事项：封片前切片可在二甲苯中存放几小时，为获得最佳染色效果，请使用纯的未稀释的Permount®封片。染色好的切片应随时避光。2.3.5.5酶联免疫吸附实验样本收集:在-20温度下去小鼠海马组织组织匀浆，用预冷的PBS（0.01M，pH=7.4）冲洗组织，去除残余的血液，，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心5-10分钟，取上清检测。检测前准备：1）请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。提前15分钟打开酶标仪预热。54 东南大学博士学位论文2）洗涤液：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液。当日使用。3）标准品工作液将标准品于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，配成500pg/mL的标准品工作液。然后根据需要进行倍比稀释。建议配制成以下浓度：500,250,125,62.5,31.25,15.63,7.81,0pg/mL。倍比稀释方法：取7支EP管，每管中加入500μL标准品&样品稀释液,从500pg/mL的标准品工作液中吸取500μL到其中一支EP管中混匀配成250pg/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。提示：最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体。4）生物素化抗体工作液：实验前计算实验所需用量(以100μL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度。当日使用。5.酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度。当日使用。操作步骤：1）将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μL。待测样品加入到其他孔,每孔100μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜，37℃孵育55 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究90分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。2）弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。3）甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。4）每孔加酶结合物工作液100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。5）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。6）每孔加90μL底物溶液(TMB)，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。7）每孔加终止液50μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。结果判断1)计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的OD值为横坐标，浓度为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线（作图时去掉空白组的值）。2)若样品OD值低于于标准曲线下限，应适当稀释后重测。2.4统计方法运用IBMSPSSStatistic18.0软件分析数据。水迷宫潜伏期采用重复测量方差分析和多元方差分析，并进行不同时间点和不同组间的两两比较。其余数据采用多因素方差分析，组与组之间的比较采用Bonferroni检验。两组比较采用独立样本t检验。数据用均数±标准差表示。p<0.05认为有统计学意义。2.5结果：2.5.1持续的水迷宫视空间学习训练对PR5认知功能的影响在四周的水迷宫训练期间，我们发现PR5小鼠的找到平台的潜伏期明显比野56 东南大学博士学位论文图2-1水迷宫训练期间和训练之后PR5小鼠行为学表现。（A）行为学的时间轴线。（B，C,D,E）PR5小鼠和野生型小鼠在4周水迷宫训练期间找到平台的潜伏期。（F,G,H,I）PR5小鼠和野生型小鼠在4周水迷宫训练期间每周检测的到目标象限的时间百分比。（J,K,L,M）PR5小鼠和野生型小鼠在4周水迷宫训练期间每周检测的穿梭平台的次数。（N）一半的小鼠在经过4周水迷宫训练之后即刻检测新奇物体识别实验的认知指数。（O）另一半的小鼠在经过4周水迷宫训练之后3个月检测新奇物体识别实验的认知指数。数据用均数±SEM(n=15)。*P<0.05,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsWt+MWM,&P<0.05PR5vsPR5+MWM。57 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究生型小鼠时间长。但是随着4周的水迷宫训练，PR5小鼠的学习能力逐渐接近野生型小鼠的水平（见图2-1B,C,D,E）。在水迷宫训练期间检测小鼠记忆的结果显示，在第一周PR5小鼠在目标象限的时间百分比和穿梭平台的次数明显较野生型小鼠降低，但是随着水迷宫的训练，后三周PR5小鼠在目标象限的时间百分比和穿梭平台的次数没有统计学差异（见图2-1F-M），提示PR5小鼠随着水迷宫训练其记忆水平逐渐增强。在4周水迷宫训练之后我们紧接着进行新奇物体识别实验检测其情景记忆能力，结果显示PR5小鼠的认知指数较野生型小鼠明显降低，而在水迷宫训练之后PR5小鼠的认知指数明显增加（见图2-1N）。以上结果提示PR5小鼠存在明显认知功能降低，而在4周的水迷宫训练之后PR5小鼠的认知水平明显改善。另一半的小鼠在4周的水迷宫训练之后3个月，检测新奇物体识别实验，结果显示PR5小鼠认知指数较野生型小鼠明显降低，而经过水迷宫训练的PR5小鼠的认知指数较PR5小鼠还有改善的趋势（见图2-1O）。结果提示4周的水迷宫训练对PR5小鼠认知功能的改善有一定的长期疗效。2.5.2持续的水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠Tau病理的影响PR5转基因小鼠表达人类最长的FTDP-17P301L突变的Tau蛋白，受神经元特异性的mThy1.2启动子区调控，所以只在神经元特异性地表达突变的Tau蛋白，Tau蛋白主要在海马和皮层神经元表达。我们检测了水迷宫视空间训练对PR5小鼠Tau蛋白的影响。结果发现PR5小鼠较野生型小鼠海马Tau蛋白在pT231位点和pS396位点的表达明显增加，在视空间训练之后PR5小鼠pT231位点和pS396位点Tau蛋白磷酸化的水平明显改善（见图2-2A,B,C）。未磷酸化的Tau1在PR5小鼠海马的表达明显降低，而视空间学习训练之后PR5小鼠Tau1的表达水平明显改善。总的Tau蛋白Tau5的表达在各组间都没有明显变化（见图2-2A,D,E）。58 东南大学博士学位论文图2-2水迷宫训练之后各组间Tau病理的结果。（A-E）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中Tau蛋白在pS396，pT231，Tau-1位点的磷酸化水平以及总的tau蛋白Tau-5的水平。GAPDH为内参；数据用均数±标准误表示（n=3），数据用均数±SEM(n=3)。**P<0.01,PR5vsWt,***P<0.001,PR5vsWt,##P<0.01,PR5vsPR5+MWM。另一半的小鼠是在水迷宫训练之后间隔三个月检测的。结果发现PR5小鼠较野生型小鼠海马Tau蛋白在pT231位点和pS396位点的表达明显增加更加明显，但是在视空间训练之后PR5小鼠pT231位点Tau蛋白磷酸化的水平明显改善，pS396位点Tau蛋白磷酸化的水平有改善的趋势（见图2-3A,B,C）。未磷酸化的Tau1在PR5小鼠明显降低，水迷宫训练之后间隔3个月仍然明显回复（见图2-3A,D）。而Tau5在各组之间没有统计学差异（见图2-3A,E）。该部分结果提示，持续的视空间训练能够改善PR5小鼠海马Tau蛋白过度磷酸化的水平，并且具有一定的远期疗效。59 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究图2-3水迷宫训练之后间隔三个月小鼠各组间Tau病理的结果。（A-E）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中Tau蛋白在pS396，pT231，Tau-1位点的磷酸化水平以及总的tau蛋白Tau-5的水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM(n=3)。**P<0.01,PR5vsWt,***P<0.01,PR5vsWt,##P<0.01,PR5vsPR5+MWM。2.5.3持续的水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠突触相关蛋白表达的影响突触相关蛋白与突触的结构和功能密切相关。我们检测了一半的小鼠在水迷宫视空间学习训练之后小鼠海马突触相关蛋白的表达。结果发现，PR5小鼠海马突触相关蛋白突触素、PSD93以及PSD95的表达明显降低，而经过水迷宫训练的PR5小鼠突触素、PSD93以及PSD95的表达明显改善（见图2-4A,B,C,D）。60 东南大学博士学位论文图2-4水迷宫训练之后小鼠各组间突触相关蛋白的表达。（A-D）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中突触相关蛋白PSD93、PSD95以及Synaptophsin的表达水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM(n=3)。**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM,##P<0.01,PR5vsPR5+MWM。另一半小鼠在水迷宫训练之后间隔3个月后检测突触相关蛋白的表达，结果显示PR5小鼠海马突触相关蛋白突触素、PSD93以及PSD95的表达明显降低（见图2-5A,B,C,D）。而经过水迷宫训练的PR5小鼠在间隔三个月后PSD95的表达明显改善，而突触素、PSD93的表达有改善的趋势（见图2-5A,B,C,D）。该部分结果提示，持续的视空间训练能够改善PR5小鼠海马突触相关蛋白表达的水平，并且具有一定的远期疗效。61 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究图2-5水迷宫训练之后间隔三个月后小鼠各组间突触相关蛋白的表达。（A-D）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中突触相关蛋白PSD93、PSD95以及Synaptophsin的表达水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM(n=3)。**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM。2.5.4持续的水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠突触结构的影响上面我们检测了突触蛋白层面的情况，接下来我们观察持续的水迷宫视空间训练对PR5小鼠海马突触树突棘数目的影响，首先观察水迷宫视空间训练刚结束时突触树突棘的数目，结果发现PR5小鼠海马树突棘的数目较野生型小鼠明显减少，而经过持续的水迷宫视空间学习训练之后PR5小鼠海马树突棘数目明显改善（见图2-6A,B,C,D）。62 东南大学博士学位论文图2-6水迷宫训练之后间隔小鼠各组间海马树突棘的密度。（A,C）各组在海马的神经元树突尖部的树突棘密度。（B,D）各组在海马的神经元树突基部的树突棘密度。数据用均数±SEM(n=6)。标尺=1μm,*P<0.05,PR5vsWt,**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM。另外我们观察了水迷宫训练之后间隔三个月后的变化。结果显示在三个月后PR5小鼠海马树突棘数目较野生型小鼠仍然明显降低，而经过水迷宫训练组的PR5小鼠任然有改善树突棘数目作用（见图2-7A,B,C,D）。这些结果提示视空间训练能够改善PR5小鼠海马突触树突结构的变化，并且具有一定的远期疗效。63 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究图2-7水迷宫训练之后间隔3个月后小鼠各组间海马树突棘的密度。（A,C）各组在海马的神经元树突尖部的树突棘密度。（B,D）各组在海马的神经元树突基部的树突棘密度。数据用均数±SEM(n=6)。标尺=1μm,**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM。2.5.5持续水迷宫视空间训练对NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路的影响NLRP3炎性小体的激活对AD病程中突触损害和认知损害密切相关。因此我们检测在水迷宫视空间学习训练后是否通过NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路来改善PR5小鼠的认知功能。首先我们观察刚进行完水迷宫视空间训练之后的小鼠该信号通路的表达，结果显示PR5小鼠海马NLRP3、caspase-1以及IL-1β表达明显降低，而经过水迷宫训练的PR5小鼠NLRP3、caspase-1以及IL-1β表达明显改善（见图2-8A,B,C,D）。64 东南大学博士学位论文图2-8水迷宫训练之后小鼠各组间NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路蛋白的表达。（A-D）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中突触相关蛋白NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的表达水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM(n=3)。**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM,##P<0.01,PR5vsPR5+MWM。另一半小鼠在水迷宫训练之后间隔3个月后检测NLRP3、caspase-1以及IL-1β的表达，结果显示PR5小鼠海马NLRP3、caspase-1以及IL-1β表达明显降低。而经过水迷宫训练的PR5小鼠在间隔三个月后NLRP3和caspase-1表达明显改善，而IL-1β的表达有改善的趋势（见图2-9A,B,C,D）。该部分结果提示，持续的视空间训练能够改善PR5小鼠突触可塑性的变化，其机制可能是通过NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路发挥作用的，并且具有一定的远期疗效。65 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究图2-9水迷宫训练之后间隔3个月后小鼠各组间NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路蛋白的表达。（A-D）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中突触相关蛋白NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的表达水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM(n=3)。***P<0.001,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM。2.5.6NLRP3敲除之后水迷宫视空间训练对PR5小鼠认知功能的影响有研究证实一周的水迷宫训练就可以改善痴呆小鼠的认知功能和海马体积。因此我们杂合的NLRP3敲除的PR5小鼠和纯合的NLRP3敲除的小鼠进行水迷宫训练一周，结果发现杂合的NLRP3敲除的PR5小鼠和纯合的NLRP3敲除的小鼠在找到平台潜伏期较PR5小鼠明显减少（见图2-10A）。并且NLRP3敲除的PR5小鼠和纯合的NLRP3敲除的小鼠目标象限时间百分比和穿梭平台的次数都较PR5小鼠明显增加（见图2-10B,C）。在水迷宫视空间训练之后我们检测我们应用新奇物体识别实验检测小鼠的情景记忆能力。结果发现PR5小鼠认知指数较野生型小鼠明显降低。经过水迷宫训练之后的PR5小鼠、杂合NLRP3敲除的PR5小鼠以及纯合NLRP3敲除的PR5小鼠认知指数都明显增高（见图2-10D）。并且纯合NLRP3敲除的PR5小鼠水迷宫66 东南大学博士学位论文训练之后认知指数增高的水平较PR5小鼠水迷宫训练之后增高的水平更明显（见图2-10D）。以上结果得出NLRP3敲除之后更加有利于PR5小鼠认知功能的改善。图2-10NLRP3敲除之后水迷宫训练期间和训练之后各组小鼠行为学表现。（A）各组小鼠在水迷宫训练期间找到平台的潜伏期。（B）各组小鼠在水迷宫训练后检测的到目标象限的时间百分比。（C）各组小鼠在水迷宫训练期后检测的穿梭平台的次数。（D）各组小鼠在水迷宫训练后检测新奇物体识别实验的认知指数。数据用均数±SEM(n=15)。**P<0.01,PR5vsWt,##P<0.01,PR5vsWt+MWM,&P<0.05,PR5vsPR5+MWM,$$P<0.01PR5vsPR5/NLRP3-/-+MWM,^P<0.05,PR5+MWMvsPR5/NLRP3-/-+MWM。67 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究2.5.7NLRP3敲除之后水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠Tau病理的影响在水迷宫视空间学习训练之后我们观察了NLRP3敲除之后水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠Tau病理的影响，结果显示PR5小鼠较野生型小鼠海马在pT231、pS396位点Tau磷酸化的水平明显增加，未磷酸化的Tau蛋白Tau1的表达降低。而图2-11NLRP3敲除之后水迷宫训练对各组间Tau病理的影响。（A-E）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中Tau蛋白在pS396，pT231，Tau-1位点的磷酸化水平以及总的tau蛋白Tau-5的水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM表示（n=3），。**P<0.01,PR5vsWt,***P<0.001,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM，&P<0.05,PR5+MWMvsPR5/NLRP3-/-+MWM,&&P<0.01,PR5+MWMvsPR5/NLRP3-/-+MWM。68 东南大学博士学位论文水迷宫训练之后PR5小鼠Tau蛋白磷酸化的水平明显改善（见图2-11A,B,C,D）。并且我们发现纯合NLRP3敲除的PR5小鼠在水迷宫训练之后较PR5小鼠水迷宫训练之后Tau蛋白磷酸化水平改善更明显（见图2-11A,B,C,D）。以上结果就提示NLRP3敲除之后水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠Tau病理改善更加明显。2.5.8NLRP3敲除之后水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠突触可塑性的影响在水迷宫视空间学习训练之后我们观察了NLRP3敲除之后水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠突触可塑性的影响，结果显示PR5小鼠较野生型小鼠海马PSD93、PSD95和突触素的表达水平明显降低（见图2-12A,B,C,D）。而水迷宫训练之后PR5小鼠PSD93、PSD95和突触素的表达水平明显改善（见图2-12A,B,C,D）。并且我们发现纯合NLRP3敲除的PR5小鼠在水迷宫训练之后较PR5小鼠水迷宫训练之后突触相关蛋白表达水平改善更明显（见图2-12A,B,C,D）。图2-12NLRP3敲除之后水迷宫训练对小鼠各组间突触相关蛋白的表达影响。（A-D）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中突触相关蛋白PSD93、PSD95以及Synaptophsin的表达水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM(n=3)。数据用均数±SEM表示（n=3）。*P<0.05,PR5vsWt,**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM，&&P<0.01,PR5+MWMvsPR5/NLRP3-/-+MWM。69 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究同时我们还检测了在水迷宫视空间训练之后树突棘数目的变化。结果显示PR5小鼠较野生型小鼠海马神经元树突棘数目明显降低（见图2-12A,B,C,D）。而水迷宫训练之后PR5小鼠树突棘数目明显增加。并且我们发现纯合NLRP3敲除的PR5小鼠在水迷宫训练之后较PR5小鼠水迷宫训练之后树突棘数目增加更明显。以上结果提示NLRP3敲除之后水迷宫视空间学习训练对PR5小鼠Tau病理改善更加明显。图2-13NLRP3敲除之后水迷宫训练对PR5小鼠海马树突棘密度的影响。（A,C）各组在海马的神经元树突尖部的树突棘密度。（B,D）各组在海马的神经元树突基部的树突棘密度。数据用均数±SEM(n=6)。**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM，$$P<0.01,PR5vsPR5/NLRP3+/-+MWM,&&P<0.01,PR5vsPR5/NLRP3-/-+MWM。2.5.9NLRP3敲除之后持续水迷宫视空间训练对NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路的影响在水迷宫视空间学习训练之后我们观察了NLRP3敲除之后持续水迷宫视空间训练对NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路的影响，结果显示PR5小鼠较野生型小鼠海马NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达水平明显增高。而水迷宫训练之后PR5小鼠NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达水平明显改善。并且我们发现纯合NLRP3敲除70 东南大学博士学位论文图2-14NLRP3敲除之后水迷宫训练对PR5小鼠海马NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路蛋白表达的影响。（A-D）Westernblot检测并定量分析了各组小鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的表达水平。GAPDH为内参；数据用均数±SEM(n=3)。*P<0.05,PR5vsWt，**P<0.01,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM,&&P<0.01,PR5vsPR5/NLRP3-/-+MWM。的PR5小鼠在水迷宫训练之后较PR5小鼠水迷宫训练之后NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达水平改善更明显（见图2-14A,B,C,D）。同时我们用酶联免疫吸附试验检测了NLRP3敲除之后小鼠海马IL-1β和TNF-α的量，结果发现IL-1β的量PR5小鼠较野生型小鼠海马中明显降低，而水迷宫训练之后PR5小鼠海马IL-1β的量明显改善（见图2-15A,B）。并且我们发现纯合NLRP3敲除的PR5小鼠在水迷宫训练之后较PR5小鼠水迷宫训练之后IL-1β的量改善更明显（见图2-15A,B）。而TNF-α在各组间没有统计学差异。71 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究图2-15NLRP3敲除之后水迷宫训练对炎性因子分泌的影响。（A）Elisa检测各组小鼠海马组织中IL-1β的分泌的水平。（B）Elisa检测各组小鼠海马组织中TNF-α的分泌水平。数据用均数±SEM(n=6)。*P<0.05,PR5vsWt,#P<0.05,PR5vsPR5+MWM,&&&P<0.001,PR5+MWMvsPR5/NLRP3-/-+MWM。2.6讨论：阿尔茨海默病是老年人中痴呆的主要类型，常常伴随记忆力的丧失。大型的流行病学数据显示低教育水平人群患AD的风险更高，并且一旦患AD这些低教育水平的患者往往进展迅速，预后较差。研究同时证实人在成年之后仍然具有一定的认知储备能力。这些都提示认知训练可以通过调节神经可塑性来改善年龄相关的认知水平下降。并且先前的研究显示丰富环境或者水迷宫视空间训练能够延缓3xTg-AD小鼠的神经病理的发展和记忆力的降低[194,195]。另外有些组证实水迷宫视空间学习训练可以影响新生神经元的增殖和分化[196]。然而视空间训练改善AD认知的机制还不是很清楚。在我们的研究中，我们证实持续的水迷宫训练可以改善PR5小鼠的Tau病理，还能够通过调控NLRP3/caspase-1/IL-1β通路来改善PR5小鼠突触可塑性来促进PR5小鼠认知功能的恢复，并且改善PR5小鼠认知功能的作用有长期效应。PR5小鼠是AD模型鼠的常见类型，PR5小鼠是模拟AD患者Tau过度磷酸化形成的神经原纤维缠结病理[197,198]。PR5小鼠表达人类最长的FTDP-17P301L突变的Tau蛋白，这个基因与AD密切相关。PR5小鼠会表现出海马依赖的行为学损害[199]。同时PR5小鼠6个月龄在水迷宫训练中就会出现视空间记忆损害，11月龄在Y迷宫72 东南大学博士学位论文中出现视空间工作记忆的损害[200]。PR5小鼠在6月龄的杏仁核先发生神经原纤维的缠结，紧接着在海马的CA1区出现[201]。Aβ和Tau的协同效应出现在8月龄的PR5小鼠[199]。在我们的研究中，我们选择了10个月龄的PR5小鼠，这个月龄的小鼠有明显的认知损害和AD样病理变化。我们发现PR5小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力较野生型小鼠明显下降。PR5小鼠的新奇物体识别实验中的情景记忆能力也较野生型小鼠下降。经过水迷宫视空间学习训练之后PR5小鼠认知功能明显改善，并且改善作用具有长期疗效。Tau蛋白过度磷酸化是AD的主要病理变化之一。先前的研究发现学习训练可以明显减少Aβ的Tau的病理[194,202]。在我们的研究中我们发现水迷宫视空间训练明显改善PR5小鼠海马Tau蛋白磷酸化的水平，比如pT231、pS396以及Tau-1位点的变化。这些结果与前面研究的结果相一致。突触是神经元联系的基本单位，并且突触的功能与认知能力密切相关。在AD患者中，突触的损害与认知功能的降低明显相关[203]。另外在AD患者尸检标本当中皮层和海马的突触密度和树突棘数目都明显降低。在我们的研究中我们检测了持续的水迷宫视空间训练对突触相关蛋白的表达情况。发现PR5小鼠海马突触前突触素和突触后PSD93、PSD95的表达明显降低，经过水迷宫训练之后PR5小鼠突触相关蛋白的表达明显改善。并且在水迷宫训练之后3个月还有改善的作用，提示其作用具有长期疗效。树突棘是树突上的微小凸起，与突触间信息的传递密切相关[204]。在AD患者尸检标本和AD模型标本中都发现了树突棘的改变[205,206]。树突棘的数目与突触的功能密切相关，并且与AD患者记忆力的降低存在密切的联系。我们的实验中检测了海马神经元的树突棘密度，发现持续的水迷宫视空间学习训练明显改善PR5小鼠海马神经元的树突棘密度的降低。并且在水迷宫训练之后三个月还有明显的疗效。近年来，AD神经炎症假说得到越来越多的关注，初始免疫和炎症反应在AD的发生发展中发挥着重要的作用。有研究发现抑制NLRP3炎性小体这个初始免疫的重要分子能够明显改善AD小鼠模型的记忆降低和Aβ的聚集[207]。一项最近的研究显示AD转基因小鼠海马NLRP3或者Caspase-1缺陷能够通过影响LTP的降低来改善其空间记忆能力[208]。NLRP3炎性小体能够影响突触功能，认知功能以及73 视空间学习训练通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路改善PR5小鼠认知损害的机制研究小胶质细胞的清除工能[209]。NLRP3炎性小体可诱导pro-caspase-1裂解成具有活性的caspase-1，促进IL-1β等的生成和分泌，从而参与宿主的炎症反应[210,211]。许多的研究证实IL-1β分泌增高能够加重AD病理变化中Tau过度磷酸化的水平，同时可以影响突触可塑性的变化以及抑制LTP来影响学习和记忆能力[212,213]。另外，在AD小鼠模型中抑制IL-1β信号通路能够明显改善其认知水平[208]。先前的研究还发现对小鼠丰富环境干预能够明显降低IL-1β的分泌，丰富环境也是对啮齿类动物探索行为和学习的一种锻炼[214]。这些都提示NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路可能参与了认知训练改善认知功能的机制。在我们的结果中发现持续的水迷宫视空间学习训练明显改善PR5小鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路蛋白的表达水平。同时我们还应用了NLRP3敲除的PR5小鼠进一步验证，发现NLRP3敲除之后水迷宫训练对PR5小鼠认知功能、Tau病理以及突触可塑性的变化盖上更加明显。这些结果进一步验证了其他组的研究结果，并且证明NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路在水宫视空间训练改善PR5小鼠认知功能中发挥重要作用。总之，持续的视空间训练能够通过改善PR5小鼠海马Tau病理以及突触可塑性的改变来促进认知功能的恢复，并且改善作用具有长期疗效。NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路在持续的视空间训练改善PR5认知功能中发挥重要。这可能为AD的治疗提供新的治疗靶点。74 东南大学博士学位论文全文总结与展望本课题第一部分通过观察孤养大鼠后的认知功能，发现孤养能够诱导SD大鼠发生明显的认知损害。并能够诱导大鼠的一些重要的认知相关脑区发生AD样的病理变化，特别是影响突触可塑性的改变。这些结果充分验证了社会孤立是AD发生的一个重要的危险因素，实验中采用西酞普兰干预后明显逆转这些重要脑区的突触可塑性的损害。本实验的造模方式接近于AD的发病早期，西酞普兰的治疗效果提示其在AD的早期预防和治疗中能够起到一定的作用。课题的第二部分，通过非药物的治疗策略去观察对AD转基因鼠的治疗疗效。结果发现视空间训练能够明显改善PR5小鼠的认知功能，同时能够改善Tau病理变化和突触塑性的损害。同时我们发现视空间训练的治疗疗效具有长期疗效，其机制可能是通过NLRP3/caspase-1/IL-1β通路发挥作用。这为针对AD患者的认知训练治疗策略提供了理论支持，同时还为AD的药物研究提供新的干预靶点。实验中还存在一些不足：1.西酞普兰的早期干预可以在AD转基因鼠进一步去验证其预防的疗效。2.课题第二部分发现NLRP3/caspase-1/IL-1β通路在视空间训练改善PR5小鼠认知中发挥重要的作用，但是NLRP3上游的机制还有待于进一步探讨。75 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作者简介作者简介公卫刚，男，1988年4月出生，籍贯山东省邹平县。2012年6月毕业于滨州医学院临床医学专业；2012年9月考入东南大学医学院攻读神经病学硕士专业；2015年3月硕转博，师从于任庆国副教授，主要从事阿尔茨海默病的发病机制及防治策略研究。攻读博士学位期间共修课程6门，其中学位课程学分9分，选修课程学分5分，学分已修满，规格化平均成绩80.22分。攻读博士学位期间获得江苏省普通高校学术学位研究生科研创新计划基金1项，现已结题。攻读博士期间获得校“三好研究生”、“优秀学生干部”、博士国家奖学金。博士研究生期间发表的论文：1.2016江苏省普通高校学术学位研究生创新基金一项：视空间学习训练对PR5小鼠认知功能影响及其机制研究。经费:3.6万；负责人：公卫刚。2.GongW-G,WangY-J,ZhouH,etal.(2017)CitalopramAmelioratesSynapticPlasticityDeficitsinDifferentCognition-AssociatedBrainRegionsInducedbySocialIsolationinMiddle-AgedRats.Molecularneurobiology.Apr;54(3):1927-1938.（IF=6.19）3.RenQ-G*,GongW-G*,WangY-J,etal(2015)Citalopramattenuatestauhyperphosphorylationandspatialmemorydeficitinducedbysocialisolationrearinginmiddle-agedrats.Journalofmolecularneuroscience:MN56:145–53（IF=2.352）（与导师并列一作）4.WuChao*,GongW-G*,WangY-J*,etal.(2018)Escitalopramalleviatesstress-inducedAlzheimer’sdisease-liketaupathologiesandcognitivedeficitsthroughreducingHPAaxisreactivityandinsulin/GSK-3βsignalpathway.NeurobiologyofAging.(67)137-147.(IF=5.23)5.公卫刚，任庆国。西酞普兰对成年孤养大鼠认知功能及皮层Tau蛋白磷酸化的影响。（2016）中华行为医学与脑科学杂志卷:25期:3页:193-1976.任庆国，公卫刚。孤养对成年大鼠认知行为与不同脑区突触相关蛋白表达的影响。（2016）中华行为医学与脑科学杂志卷:25期:10页:877-8817.WangY-J,RenQ-G,GongW-G,etal(2016)Escitalopramattenuatesβ-amyloid-inducedtauhyperphosphorylationinprimaryhippocampalneuronsthroughthe5-HT1AreceptormediatedAkt/GSK-3βpathway.Oncotarget102 东南大学博士学位论文7:13328–39.8.RenQ-G,WangY-J,GongW-G,etal(2015)EscitalopramAmelioratesTauHyperphosphorylationandSpatialMemoryDeficitsInducedbyProteinKinaseAActivationinSpragueDawleyRats.JournalofAlzheimer’sdisease :JAD47:61–71.9.RenQ-G,WangY-J,GongW-G,etal(2015)EscitalopramAmelioratesForskolin-InducedTauHyperphosphorylationinHEK239/tau441Cells.Journalofmolecularneuroscience :MN56:500–8.10.LiX-L,YuanY-G,XuH,WuD,GongW-G.etal(2015)ChangedSynapticPlasticityinNeuralCircuitsofDepressive-LikeandEscitalopram-TreatedRats.Theinternationaljournalofneuropsychopharmacology18:pyv046.11.RenQ-G,ChangJ-H,LuW-J,GongW-G,ZhouH.(2017)LowplasmaBDNFisnotabiomarkerforcognitivedysfunctioninelderlyT2DMpatients.NeurolSci38:1691–1696103 作者简介致谢古有十年寒窗而扬天下，今已二十余载苦读。光阴似箭、岁月如梭，回想起2012年研究生入学，到今天博士论文的完成，仿佛感觉就像是昨日。这六年的点点滴滴将是我人生中最值得珍藏的美好回忆。值此论文完成之际，特向在这六年学习和生活中帮助和支持我的老师、同学、朋友、家人表示衷心的感谢!首先谨以最诚挚的敬意感谢我的导师任庆国副教授。六年来，导师为我的课题研究提供了完备的平台，给予我悉心的课题指导，为我创造了大量学习和交流的机会，使我的科研能力有了很大提高。导师严谨的治学态度、渊博的学术知识、创新的科研思维和高尚的人格魅力给我留下了深刻的印象，并将使我受益终身。衷心感谢中大医院领导及神经精神科的张志珺主任、闫福岭主任、周红主任等全体老师和东南大学医学院领导及姚绍莲、唐天奎、徐希宇老师对我的帮助。感谢东南大学神经精神病学研究所吴芳芳老师对我课题的指导帮助，感谢王燕娟师姐从我硕士一入学到后面实验的带领和指导，感谢这六年中与我同甘共苦的师兄师姐师弟师妹们：叶冬青、吴迪、李晓莉、王迎新、王赞、汤香、祁鑫洋、顾丽华、吴超、师亚晨、朱琳等，共同拼搏的岁月中有泪水也有欢乐，愿我们的友谊长存！感谢我的研究生期间各位同学以及我的舍友吴韬、单永峰、孙佳楠、肖旻、潘天帆对我的支持与关心，同窗之情永生难忘！感谢东南大学医学院见证了我12年到18年的学生生涯，在这里我收获了学业，收获了友情。最后，感谢我的家人，是亲情给予了我最大的感情支撑，感谢关心我，关怀我的所有亲人！104