重组新城疫病毒诱导未分化甲状腺癌细胞死亡机制的研究

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密级硕士学位论文重组新城疫病毒诱导未分化甲状腺癌细胞死亡机制的研究匕作者姓名！全机：指导教师：孟松树教授学科专业：细胞生物学大连医科大学 中图分类号Q26密级重组新城疫病毒诱导未分化甲状腺癌细胞死亡机制的研究RecombinantoncolyticNewcastlediseasevirusdisplaysantitumoractivitiesinanaplasticthyroidcancercells孔令凯计：学位论文：41页表格：0个插图：6幅指导教师：孟松树教授申请学位级别：硕士学位学科（专业）：细胞生物学培养单位：大连医科大学完成时间：二〇一八年二月（肿瘤干细胞研究院）答辩委员会主席： 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研宄工作及所取得的研宄成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，也不包含，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宂成果为获得大连医科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：蝴３年［月Ｉ）日； √ 大连医科大学硕士学位论文目录一、摘要...........................................................................................................................1（一）中文摘要...........................................................................................................1（二）英文摘要...........................................................................................................3二、正文...........................................................................................................................5（一）前言...................................................................................................................5（二）材料和方法.......................................................................................................6（三）结果.................................................................................................................16（四）讨论.................................................................................................................25（五）结论.................................................................................................................26（六）参考文献.........................................................................................................27三、综述.........................................................................................................................31（一）综述.................................................................................................................31（二）参考文献.........................................................................................................35四、附录.........................................................................................................................40五、致谢.........................................................................................................................41 大连医科大学硕士学位论文一、摘要（一）中文摘要重组新城疫病毒诱导未分化甲状腺癌细胞死亡机制的研究摘要背景：未分化甲状腺癌（ATC）是死亡率较高的内分泌恶性肿瘤之一，由于其不稳定的遗传特性及复杂的基因改变，一直缺少有效的治疗手段。常规手段如手术切除、放化疗效果都不理想。目前，一系列新的治疗方法如基因治疗、诱导分化治疗、蛋白抑制剂治疗等远不够成熟。基因治疗尚处于起步阶段；诱导分化治疗还没有经过大规模的临床试验，治疗效果有待验证；而蛋白抑制剂治疗存在口服利用率低、特异性不高、副作用大等弊端，还需要进一步研究。已有报道，溶瘤新城疫病毒（NDV）能够感染并诱导多种肿瘤细胞死亡，但对正常细胞无杀伤作用，因此溶瘤病毒作为一种新颖的治疗手段具有广泛的应用前景。但是，溶瘤新城疫病毒是否感染未分化甲状腺癌细胞还未见报道。本次研究探讨重组新城疫病毒（rFMW/GFP）对未分化甲状腺癌细胞的溶瘤能力。方法：本次研究在体内、体外两种途径验证了重组新城疫病毒rFMW/GFP对未分化甲状腺癌细胞THJ-16T和THJ-29T的溶瘤能力。体外实验，重组新城疫病毒rFMW/GFP感染未分化甲状腺癌细胞，通过生物化学和形态学实验方法研究病毒溶瘤机制；体内实验，重组新城疫病毒rFMW/GFP尾静脉注射成瘤小鼠，研究重组病毒抗肿瘤能力。结果：（1）构建表达GFP荧光蛋白的重组新城疫病毒rFMW/GFP。（2）重组新城疫病毒rFMW/GFP与亲本新城疫病毒（NDV/FMW）都能感染1 大连医科大学硕士学位论文未分化甲状腺癌细胞，且病毒复制能力无明显差异。（3）在2D培养条件下，重组新城疫病毒rFMW/GFP感染ATC细胞THJ-16T和THJ-29T，诱导细胞发生早期及晚期凋亡，蛋白印迹法检测到Caspase-3及PARP(ADP-ribose)裂解条带；在3D培养条件下，rFMW/GFP抑制ATC细胞的成球能力。（4）重组新城疫病毒rFMW/GFP感染ATC细胞后活化p38MAPK信号通路；ATC细胞经p38MAPK通路的特异性抑制剂SB203580预处理后，抑制rFMW/GFP诱导的p38MAPK的活化并减少了Caspase-3及PARP裂解。（5）重组新城疫病毒rFMW/GFP与亲本NDV/FMW都能抑制THJ-16T诱导的小鼠成瘤。结论：本次研究中，我们鉴定出重组报告病毒rFMW/GFP通过p38MAPK通路诱导未分化甲状腺癌细胞发生凋亡，提示溶瘤新城疫病毒可作为一种新颖的手段治疗未分化甲状腺癌。关键词：未分化甲状腺癌（ATC）溶瘤新城疫病毒（NDV）p38MAPK绿色荧光蛋白(GFP)细胞凋亡2 大连医科大学硕士学位论文（二）英文摘要RecombinantoncolyticNewcastlediseasevirusdisplaysantitumoractivitiesinanaplasticthyroidcancercellsAbstractBackground:Anaplasticthyroidcancer(ATC)isoneofthehighmortalityendocrinemalignancies.Becauseofitsunstablegeneticcharacteristicsandcomplexgeneticalterations,therehasbeennoeffectivetreatment.Conventionalmethodssuchassurgicalresectionandradiotherapyarenotideal.Atpresent,aseriesofnewtreatments,suchasgenetherapy,induceddifferentiationtherapyandproteininhibitortherapy,arefarfrommature.Genetherapyisstillinitsinfancy.Thetreatmentofinduceddifferentiationhasnotyetundergonelarge-scaleclinicaltrials,andtheeffectoftreatmentisyettobeverified.However,thetreatmentofproteininhibitorshasthedisadvantagesofloworalutilization,lowspecificityandlargesideeffects.Italsoneedsfurtherstudy.Ithasbeenreportedthat,oncolyticNewcastlediseasevirus(NDV)caninfectandinducecelldeathinvarioustumors,buthasnocytotoxicityonnormalcells.Sotheoncolyticvirusasanoveltreatmentmethodhasthebroadapplicationprospect.However,whetherNewcastlediseasevirusinfectionATCcellshasnotbeenreported.Inthepresentstudy,weinvestigatedtheoncolyticeffectsofrFMW/GFPinATC.Methods:Inthisstudy,rFMW/GFPwasexaminedintwomainapproachesinvivo,inmice,usingtheATCcells.Initially,thecellswereinfectedwithrFMW/GFPandthemechanismofantitumoractivitiesdeterminedbybiochemicalandmorphologicalexperiments.NudemicewerealsotreatedwithrFMW/GFPforinvivostudy3 大连医科大学硕士学位论文Results:（1）WegeneratedarecombinantNDVexpressinggreenfluorescentprotein（rFMW/GFP）.（2）rFMW/GFP,replicatedrobustlyinATCcellsasdiditsparentvirus(NDV/FMW)，andtherewasnosignificantdifferenceintheabilityofthevirusreplicate.（3）In2Dcultureconditions,rFMW/GFPinfectionsubstantiallyincreasedearlyandlateapoptosisintheATCcelllines,THJ-16TandTHJ-29Tandincreasedcaspase-3processingandPoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)cleavageinATCcellsasassessedbyimmunoblotting.Inthree-dimensional(3D)cultures,rFMW/GFPinhibitstheabilityofATCcells’sphereformation.（4）WefurtherdemonstratedthatrFMW/GFPinfectionresultedintheactivationofp38MAPKsignalinginTHJ-16TandTHJ-29Tcells.Notably,inhibitionofp38MAPKactivitybySB203580decreasedrFMW/GFP-inducedcleavageofcaspase-3andPARPinATCcells.（5）BothrFMW/GFPanditsparentvirus(NDV/FMW)inhibitedtumorgrowthinmicebearingTHJ-16Tderivedtumors.Conclusion:Inthepresentstudy,wedemonstratedthatrecombinantreportervirusrFMW/GFPdisplaysoncolyticactivitiesinATCcellsviap38MAPKsignalingpathwayandrepresentsanovelpotentialtherapeuticstrategyforATC.Keywords:Anaplasticthyroidcancer(ATC)Newcastlediseasevirus(NDV)p38MAPKgreenfluorescentprotein(GFP)apoptosis4 大连医科大学硕士学位论文二、正文（一）前言甲状腺癌缺少特异性症状，目前诊断较为困难。在甲状腺癌的发生发展中，基因改变如基因突变、基因异常扩增及基因异常甲基化起着重要作用[1]。其中未分化甲状腺癌（ATC）是甲状腺癌中恶性程度最高的肿瘤[2]，由于其不稳定的遗传特性及复杂的基因改变，一直缺少有效的治疗手段。常规手段如手术切除、放化疗都不能明显提高病人的存活率，寻求新的治疗方法显得尤为重要[3]。目前，生物治疗方法如基因治疗、诱导分化治疗、蛋白抑制剂治疗等已经处于探索阶段[4-7]。但是这些新方法存在一些弊端：基因治疗尚处于起步阶段；诱导分化治疗还没有经过大规模的临床试验，治疗效果有待验证；而蛋白抑制剂治疗存在口服利用率低、特异性不高、副作用大等缺点，还需要进一步研究。溶瘤病毒是一种能在肿瘤细胞中特异性复制、扩增并杀伤肿瘤细胞的病毒，对正常细胞无杀伤作用[8-10]。因此溶瘤病毒作为一种新颖的治疗手段具有广泛的应用前景。溶瘤病毒分为两大类别：非基因重组型与基因重组型。溶瘤病毒感染并杀伤肿瘤细胞主要通过三种途径[11-13]：1、病毒特异性在肿瘤细胞中复制并直接裂解肿瘤细胞。2、病毒作为一种抗原可以刺激机体产生炎症因子从而引发抗肿瘤免疫反应。3、与其他传统治疗手段协同作用。与传统治疗手段相比，溶瘤病毒疗法具有如下优点[14,15]：1、治疗指数高2、通过病毒复制高效裂解肿瘤细胞3、能与其他手段协同作用。但目前仍有许多因素限制溶瘤病毒的抗肿瘤效应，比如实验证明瘤内注射病毒治疗效果最佳，但在体内环境中实现这一方式较为困难。另一方面，肿瘤细胞固有免疫系统可能会抑制溶瘤病毒的进入、复制和肿瘤内扩散，从而对溶瘤病毒的治疗效果产生影响。目前病毒生物学疗法已成为一种新型治疗肿瘤的生物学手段。现在已有新城疫病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒等数十种肿瘤增殖型病毒用于动物或人类抗肿瘤的研究中[16,17]，其中新城疫病毒（NDV）的治疗尤为突出。虽然溶瘤病毒NDV作为一种新颖的肿瘤治疗手段广泛应用于多种类型的肿瘤治疗[18-24]，但没有临床实验应用NDV治疗甲状腺癌。因此，本论文首次报道溶瘤病毒NDV在体内及5 大连医科大学硕士学位论文体外靶向于ATC。为了更好的在体外及体内示踪溶瘤病毒NDV，本实验中，我们将GFP基因插入NDV/FMW的cDNA中，转染敏感细胞，拯救出重组病毒rFMW/GFP。我们证实在体外实验中溶瘤病毒株NDV/FMW和构建的rFMW/GFP能在2D及3D培养条件下诱导未分化甲状腺癌细胞死亡；在体内实验，NDV/FMW和rFMW/GFP明显抑制ATC细胞诱导的小鼠成瘤。因此，我们的研究表明，溶瘤NDV能够作为治疗ATC的有效手段。（二）材料和方法1、实验材料1.1病毒、细胞NDV/FMW病毒株(GenBank序列号:GU564399)由农业部动物传染病重点实验室（扬州）提供。鸡成纤维细胞系DF-1,购自中国科学院细胞库(上海)。THJ-16T和THJ-29T细胞由梅奥医学教育与研究基金会QuentinLiu教授提供[25]。1.2实验试剂与药品实验试剂与药品厂商及来源细胞培养皿Corning,美国DMEM培养基Life,美国RPMI-1640培养基Life,美国胎牛血清（FBS）Gibco,美国SB203580（p38抑制剂）Selleckchem,美国0.25%胰酶Gibco,美国Opti-MEM优化培养基Gibco,美国苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma,美国氟化钠（NaF）Sigma,美国乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma,美国乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）Sigma,美国6 大连医科大学硕士学位论文矾酸钠（Na3VO4）Sigma,美国蛋白酶体抑制剂Leu、Apr、PepSigma,美国浓缩胶缓冲液(pH6.8)BIO-RAD,美国分离胶缓冲液(pH8.8)BIO-RAD,美国十二烷基磺酸钠（SDS）BIO-RAD,美国甘氨酸Amresco,美国Tris-baseAmresco,美国N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)Amresco,美国NC膜Millipore,美国Tween-20Promega,美国β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)上海生工公司二甲基亚砜(DMSO)上海生工公司30%聚丙烯酰胺上海生工公司1.3抗体抗体厂商及来源PARP抗体Promega,美国Erk1/2抗体Promega,美国p-Erk1/2抗体Promega,美国β-actin抗体Promega,美国GFP抗体Sigma,美国caspase-3抗体Sigma,美国p-JNK抗体CST,美国JNK抗体CST,美国p-p38抗体CST,美国p38抗体CST,美国HN抗体SantaCruz,美国1.4主要实验仪器实验仪器厂商低温离心机Eppendorf细胞培养箱NUNER7 大连医科大学硕士学位论文倒置显微镜LEICA激光共聚焦显微镜LeicaTCSSP5Ⅱ核酸蛋白测定仪Eppendorf微量加样器GilsonSDS-PAGE电泳仪器BIO-RAD转印仪器BIO-RAD-80℃冰箱Thermo-20℃冰箱、4℃冰箱中科美菱凝胶成像系统ImageLab超净工作台Boxun、ESCO电子天平METTLERTOLEDO1.5溶液配置（1）LysisbufferA配置方法如表组分浓度储存液体积（500ml）50mMTris-HCL(PH=7.5)1MTris-HCL（PH7.5）25ml150mMNacl5MNacl15ml1mMEDTA0.5MEDTA（PH8.0）1ml1mMEGTA100mMEGTA5ml5mMNa4PPiNa4PPi粉剂1.115g25mMNaFNaF粉剂0.525g（2）细胞裂解液：取上述LysisbufferA与1%的Triton-X-100，在15ml离心管中摇匀，再加入下表中的各组分抑制剂（PMSF易降解，现用现加）。终浓度储存液1mMNa3VO40.2MNa3VO42μg/mlaprotinin5mg/mlaprotinin2μg/mlleupeptin5mg/mlleupeptin0.7μg/mlpepstatin1mg/mlpepstatin100μg/mlPMSF100mMinIsopropanol（3）10%APS：现用现配，称取0.1gAPS1.5ml离心管中，加入1ml超纯水溶解，-20℃保存。（4）TBST溶液：1MTris-HCL(PH7.4)10ml、NaCl5.8g，Tween-200.5ml8 大连医科大学硕士学位论文超纯水定容至1L，室温保存备用。（5）抗体封闭液：取2g脱脂奶粉溶于40mlTBST中，充分溶解备用。（6）抗体稀释液（1%BSA+0.2%NaN3）：称取5gBSA、1gNaN3，溶于500mlTBST溶液中备用。2、实验方法2.1重组新城疫病毒的构建2.1.1GFP基因片段的克隆与序列分析根据pcDNA3.1/NT-GFP序列，设计带有ApaI酶切位点的上下游引物P1、P2以匹配NDV/FMW全长cDNA序列转录质粒中的ApaI酶切位点。引物由南京金斯瑞公司合成。GFP-P1:GCGGGCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG（上游引物）GFP-P2:GCGGGCCCTCTAGATCCGGTGGATCCAAGC（下游引物）利用PCR扩增出目的片段，反应体系如下（25μl体系）：Sw16μl10xbuffer2.5μl模板2μl（10ng）P1/P21μldNTPs2μlTaq酶0.5μl95℃预变性10min；95℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸1min；循环25次；72℃延伸5min。ApaI酶切目的片段与pND片段，37℃3.5h。DNA凝胶回收目的片段与pND片段。T4连接酶连接酶切产物，16℃过夜。将连接产物去磷酸化处理后，转化至DH5α感受态，氨苄抗性培养基筛选阳性克隆，提取质粒再次酶切鉴定。将鉴定正确的质粒测序。2.1.2表达GFP基因的全长病毒cDNA序列构建9 大连医科大学硕士学位论文上述测序正确的转录质粒命名为pGFP,质粒用AgeI、BstZ171双酶切，37℃3.5h。反应体系如下（10μl）：Sw6μl10Xbuffer1μl质粒1μl（200ng）AgeI1μlBstZ1711μl另外，pFMW病毒转录质粒同样用AgeI、BstZ171双酶切，反应体系同上。DNA凝胶回收pGFP片段与pFMW片段。T4连接酶连接酶切产物，16℃过夜。连接物转化，氨苄抗性培养基筛选阳性克隆，提取质粒再次酶切鉴定。将鉴定正确的质粒测序。测序正确的质粒命名为pFMW-GFP。图1重组新城疫病毒的构建流程2.2细胞培养鸡成纤维细胞DF-1用DMEM培养基培养（10%FBS，1%PS）。THJ-16T细胞用RPMI-1640培养基培养（含5%FBS,10mMHEPES和1mM丙酮酸钠，1%PS）。THJ-29T细胞用RPMI-1640培养基培养（含5%FBS,1mM丙酮酸钠，1%PS）。2.3Westernblot检测相关蛋白2.3.1蛋白样品的制备1、取出细胞，弃去培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一遍。将PBS吸尽，无残留。10 大连医科大学硕士学位论文2、根据细胞量以及培养皿的规格加入适量的裂解液。60mm培养皿中细胞融合度若达到80%以上时大约加细胞裂解液100~150μl，如果细胞融合度在50%~80%左右大约加细胞裂解液80μl。冰上裂解5分钟。3、清洗细胞刮子烘干并刮下裂解后的细胞，转移到1.5ml的离心管中，冰中静置25min；4、将细胞样品置于4℃离心机中，15000rpm/min离心10min，离心完成后，吸取上清液到新的1.5ml离心管中；5、加入SDS蛋白上样缓冲液，100℃加热6min。2.3.2WesternBlotting操作步骤1、制胶：按下表配置合适浓度的分离胶和4%浓缩胶；试剂分离胶浓度(15ml)浓缩胶（10ml）胶浓度7.5%10%12%15%4%Sw7.5ml6ml5ml3.5ml6ml1.5MTris-HCl(pH8.8)3.75ml3.75ml3.75ml3.75ml0.5MTris-HCl(pH6.8)2.5ml10%SDS0.15ml0.15ml0.15ml0.15ml0.1ml30%Acry/bis3.75ml5ml6ml7.5ml1.34ml10%APS75μl75μl75μl75μl50μlTEMED7.5μl7.5μl7.5μl7.5μl10μl2、灌胶：一般分离胶的量7ml即可。灌胶结束后加入1ml的无水乙醇，等待分离胶凝固；3、弃去上层无水乙醇，配制浓缩胶，选择合适规格的梳子插入浓缩胶中，避免产生气泡；4、配制电泳缓冲液，将胶板放入至电泳液中并拔出梳子；5、用微量移液枪吸取12μl左右的蛋白液垂直加入至胶孔中，上样量在30-50μg之间即可。加入标准蛋白marker；6、接通电源，先用80V电压跑0.5小时，再用120V电压电泳1小时左右；7、配制转膜缓冲液；8、等待电泳结束后，取出胶板，将胶板放于转膜缓冲液中；11 大连医科大学硕士学位论文9、准备滤纸、海绵（用转膜缓冲液湿润）；10、转膜铺板顺序：负极（黑色板）、海绵、滤纸、胶、NC膜、滤纸、海绵、正极（透明板）；11、将胶夹紧放于转膜槽中，接通电源，120V恒压转膜2小时；12、配制5%的脱脂牛奶封闭液；13、NC膜染色，蛋白大小做好标记，切膜；14、将剪裁好的膜放于孵育盒子中（注意蛋白面朝上），4℃封闭2小时；15、加一抗，做好标记，4℃过夜；16、回收一抗，用TBST清洗三遍，每遍10分钟；17、加入相应的二抗，4℃孵育2小时；18、二抗孵育结束后洗膜，TBST清洗三遍，每遍10分钟；19、按照说明配制ECL发光液；20、将一块干净的玻璃板预先放置于凝胶成像仪中，并将膜蛋白面朝上置于玻璃板上；21、滴加ECL发光液进行显色；22、用凝胶成像仪进行显影。2.4免疫荧光实验1、准备6孔板或12孔板，将爬片放到培养皿中，用培养基润湿，细胞稀释至适量铺到培养皿中，培养16-18h至细胞贴壁。2、细胞按实验要求处理后，固定细胞爬片。3、爬片细胞的处理：1)磷酸盐缓冲液轻洗细胞3遍；2)培养皿中4%的多聚甲醛，室温固定爬片20min；3)PBS洗三次，方法同上；4)0.2%TritonX-100透化细胞15-20min；5)PBS洗三次，同上；6)3%的BSA封闭1h；7)吸去封闭液，在爬片上（含细胞面）滴加50μl左右稀释后一抗，放置于4℃冰箱中孵育过夜；12 大连医科大学硕士学位论文8)PBS洗三次，同上；9)加荧光二抗，37℃孵育1h，避光；10)PBS洗三次，同上；11)DAPI复染5min；12)PBS洗三次，同上；13)封片（含抗荧光淬灭剂），晾干后进行后续实验。2.5细胞成球实验1、2D细胞消化后，完全培养液重悬离心1000rpm5min，去上清；DMEM/F12培养液重悬，再次离心1000rpm5min去上清；成球培养液重悬，细胞计数铺低粘附板（96孔板1000个细胞/孔）2、成球培养液的配置：无血清DMEM/F12（50ml）+20ng/mlbFGF（-20℃）+20ng/mlEGF（-20℃）+1:50比例b272.6病毒滴度的测定1、细胞准备：将状态良好的DF-1细胞消化计数后铺96孔板，8000个细胞/孔。2、病毒感染：细胞贴壁后，取1.5mlEP管，将病毒依次稀释10倍，连续10个梯度。方法如下：每种病毒准备10个1.5mlEP管，每管加入90μl无血清培养基，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸出10μl加入第二个EP管混匀。依此类推，稀释10个梯度。吸取96孔板中原有的培养基，分别加入稀释好的病毒液。3、病毒感染1h后，更换1%血清的培养基，培养七天。4、观察结果并计算滴度。观察细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算出病毒滴度。2.7小鼠肿瘤模型的建立1、六周龄雌性裸鼠随机分成两组（对照组、实验组），每组8只。两组鼠皮下接种THJ-16T细胞(5×106细胞数/100μlPBS/每只鼠)，当成瘤体积达到200mm3时，肿瘤模型构建成功。13 大连医科大学硕士学位论文2、对照组小鼠尾静脉注射PBS，实验组小鼠尾静脉注射rFMW/GFP（1×107TCID50perdose），每周三次，持续一周。取出小鼠肿瘤组织进行后续实验。2.8肿瘤病理学观察2.8.1包埋给药三周后处死小鼠，取下小鼠体内肿瘤组织，4%多聚甲醛溶液固定24小时，进行脱水，石蜡包埋操作：1、75%乙醇，12~24小时；2、85%乙醇，1~3小时；3、95%乙醇，1小时；4、95%乙醇，1小时；5、100%乙醇Ⅰ，1小时；6、100%乙醇Ⅱ，1小时；7、二甲苯Ⅰ，30分钟，组织呈透明状；8、二甲苯Ⅱ，30分钟，洗脱乙醇；9、低熔点石蜡（52~54℃），1小时；10、高熔点石蜡（60~62℃），1小时；11、自动包埋机进行石蜡包埋；12、切片，4μm厚的切片，60℃烘片2小时。2.8.2H&E染色1、二甲苯Ⅰ，10min；2、二甲苯Ⅱ，10min；3、100%乙醇Ⅰ，5min；4、100%乙醇Ⅱ，5min；5、95%乙醇，5min；6、85%乙醇，5min；7、双蒸水涮洗1min；8、苏木素染色15min（碱性染色剂，染细胞核）；9、流水冲洗2min（水流要小，避免把组织冲掉）；14 大连医科大学硕士学位论文10、盐酸酒精反蓝5s（洗去多余的苏木精，时间不宜太久，以免造成脱色）；11、流水冲洗15~60min；12、双蒸水浸泡1min；13、85%乙醇，5min；14、伊红（酸性染色剂，染细胞质等碱性细胞成分）1min；15、95%乙醇，5min；16、100%乙醇Ⅰ，5min；17、100%乙醇Ⅱ，5min；18、二甲苯Ⅰ，5min；19、二甲苯Ⅱ，5min；20、中性树胶封片，过夜晾干；21、正置显微镜拍照。2.8.3免疫组织化学染色1、二甲苯常规脱蜡1小时；2、梯度乙醇使其水化（100%乙醇，95%乙醇，85%乙醇各一小时）；3、抗原修复：柠檬酸盐缓冲液250ml中浸泡微波，常温冷却；4、内源性过氧化物酶的去除：0.3%双氧水中浸泡15~30min，PBS中洗三遍，每次1~2min；5、山羊血清A液室温封闭35分钟；6、一抗稀释液4℃过夜孵育，不同抗体的稀释比例不一样，一般为1:200-1:1000；7、PBS中洗三遍，每次2~3min；8、滴加生物素标记的抗体稀释液B，室温30分钟；9、PBS中洗三遍，每次2~3min；10、辣根过氧化物酶C工作液室温孵育30分钟；11、PBS中洗三遍，每次2~3min；12、DAB显色，显微镜下观察，显色时间依情况而定；13、自来水冲洗5分钟终止显色，双蒸水浸泡1min；14、用苏木素复染2分钟，流水冲洗，用1%盐酸酒精分色5秒；15、自来水冲洗10min，水流不宜过大；15 大连医科大学硕士学位论文16、常规的乙醇脱水（85%酒精，95%酒精，100%酒精各10分钟）；17、二甲苯透明10分钟，中性树胶封片，过夜晾干；18、正置显微镜下观察，采集图像，蓝色为细胞核着色部分，褐色为目标蛋白着色部分；19、利用ImageProPlus进行图像分析，统计结果。2.9数据分析本实验中所有体外实验均重复三次以上。统计学计算均用SPSS17.0软件进行统计学分析，用GraphPadprism5.0计算Ttest值并制作统计图，统计结果以P<0.05为有显著性差异，具有统计学意义。（三）结果3.1构建重组新城疫病毒rFMW/GFP已有文献报道新城疫病毒株NDV/FMW在体外及体内呈现出强溶瘤特性[20-23]。为了更直观地监测NDV/FMW感染肿瘤细胞的过程，我们构建表达GFP荧光蛋白的NDV病毒株（图.1A）。利用反向遗传操作系统拯救出表达绿色荧光蛋白的重组新城疫病毒rFMW/GFP，这一系统已经应用于拯救表达凋亡蛋白的重组NDV[24]。重组新城疫病毒感染未分化甲状腺癌细胞（THJ-16T和THJ-29T），利用免疫荧光及蛋白印记法检测绿色荧光蛋白的表达（图.1B和1C）。在NDV/FMW感染的细胞中检测到HN蛋白（NDV/FMW的基因组蛋白之一）的表达（图.1C）,在重组新城疫病毒rFMW/GFP感染的细胞中，GFP与HN蛋白表达一致（图.1C），提示rFMW/GFP在感染细胞中复制。另外，将重组新城疫病毒接种10-11日龄SPF鸡胚，连续传五代后检测病毒滴度，发现重组新城疫病毒滴度未发生改变，提示重组新城疫病毒具有良好的稳定性。为了确定rFMW/GFP在体内的分布情况，小鼠尾静脉注射rFMW/GFP，提取不同组织部位利用蛋白印记法检测GFP表达情况，GFP蛋白在脾和肺中表达（图.1D），表明rFMW/GFP的组织嗜性以及表达GFP蛋白的重组病毒构建成功。16 大连医科大学硕士学位论文17 大连医科大学硕士学位论文图1构建及鉴定重组rFMW/GFP(A)用带有ApaI酶切位点的引物PCR扩增出NDV基因组的cDNA片段，随后在扩增出的cDNA片段中插入GFP基因，转染敏感细胞后拯救出重组病毒。(B)THJ-16T和THJ-29T细胞分别经PBS、NDV/FMW(10MOI),带GFP标签的腺病毒载体和rFMW/GFP(10MOI)处理24h，在荧光显微镜下分别拍摄明场照片和荧光照片。(C)细胞处理方法同（B），蛋白印记法检测GFP蛋白及HN蛋白，β-actin作为内参。(D)rFMW/GFP(1×107TCID50perdose)尾静脉注射成瘤裸鼠，24h后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾组织裂解提蛋白，蛋白印迹法检测GFP蛋白的表达，β-actin作为内参。所有的IB实验重复两次。3.2rFMW/GFP的复制能力为了检测插入GFP片段是否引起NDV/FMW复制能力的缺失，利用一步生长曲线法在DF-1细胞系中检测rFMW/GFP及亲本NDV的复制能力。与亲本NDV比较，NDV/FMW基因组中插入GFP片段没有明显影响病毒生长动力学及病毒滴度（图.2A）。重组新城疫病毒感染未分化甲状腺癌细胞THJ-16T和THJ-29T，利用激光共聚焦检测到绿色荧光蛋白GFP的表达与HN蛋白表达一致（图.2B），显示rFMW/GFP成功感染未分化甲状腺癌细胞。18 大连医科大学硕士学位论文图2rFMW/GFP的病毒复制能力(A)THJ-16T和THJ-29T细胞分别用NDV/FMW(0.01MOI)19 大连医科大学硕士学位论文和rFMW/GFP(0.01MOI)感染24、48、72小时。不同的时间段分别检测病毒滴度，每个实验重复三次。(B)THJ-16T和THJ-29T细胞分别用NDV/FMW(10MOI),带GFP标签的腺病毒载体和rFMW/GFP(10MOI)感染24小时,使用兔源抗HN多克隆抗体染色，在共聚焦显微镜三种波长条件下拍照(405,488and643nm).DAPI对细胞核染色。3.3rFMW/GFP对未分化甲状腺癌2D及3D细胞的溶瘤能力我们进一步检测是否rFMW/GFP导致未分化甲状腺癌细胞生长抑制。与对照相比，rFMW/GFP感染THJ-16T和THJ-29T明显抑制细胞生长，rFMW/GFP抑制细胞生长现象依赖于病毒感染时间及病毒MOI值（图.3A）；亲本NDV感染THJ-16T和THJ-29T得出相似的结论。为了证明是否rFMW/GFP通过细胞凋亡途径抑制未分化甲状腺癌细胞生长，rFMW/GFP感染THJ-16T和THJ-29T细胞12h后，蛋白印迹法检测caspase-3和Poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)裂解蛋白，两种主要的凋亡标志蛋白（图.3B）。实验证明rFMW/GFP通过细胞凋亡途径抑制未分化甲状腺癌细胞生长。在体外环境中，细胞成球被认为是模拟肿瘤体内生物学特性的有效模型。我们检测rFMW/GFP是否抑制未分化甲状腺癌细胞的3D成球能力，与对照相比，10MOI值rFMW/GFP感染THJ-16T和THJ-29T细胞48h后细胞不能成球（图.3C）。20 大连医科大学硕士学位论文图3rFMW/GFP对未分化甲状腺癌2D及3D细胞的溶瘤能力(A)THJ-16T和THJ-29T细胞分别经PBS处理及不同MOI值的rFMW/GFP(0.01,0.1,1and10)感染24、48、72小时。MTT实验检测细胞生长抑制。(B)THJ-16T和THJ-29T细胞与A组处理相同，6、12、24小时后蛋白印迹法检测裂解的Caspase-3和PARP条，β-actin作为内参(C)THJ-16T和THJ-29T细胞经A组相同处理48小时后检测细胞成球能力。实验结果统计为成球个数/1000个细胞±SEM,***p<0.001.(Scalebar=100μm).数值以平均值±SEM(***p<0.001)统计。3.4rFMW/GFP调控MAPK/p38通路我们研究rFMW/GFP导致未分化甲状腺癌细胞死亡的潜在信号通路。之前的研究表明NDV/FMW裂解肺癌细胞通过MAPK信号通路[20,21]，我们检测MAPK的下游通路Erk1/2,JNK和p38。rFMW/GFP感染THJ-16T和THJ-29T细胞12h后以及感染THJ-29T细胞24h后，p38MAPK通路明显活化，然而磷酸化的Erk1/2和JNK在两种细胞系中都没有明显变化（图.4A）。在rFMW/GFP感染的未分化甲状腺癌细胞中，21 大连医科大学硕士学位论文Akt通路没有活化（AktS473位点的磷酸化没有明显变化）。为了进一步确认p38MAPK信号通路在rFMW/GFP诱导的未分化甲状腺癌细胞死亡中的作用，p38MAPK通路的特异性抑制剂SB203580在病毒感染THJ-16T和THJ-29T细胞前预处理30分钟。病毒感染THJ-16T和THJ-29T细胞24h后，与对照相比SB203580处理组明显减少了rFMW/GFP引起的细胞死亡（图.4B）。SB203580抑制p38MAPK通路的活化减少了rFMW/GFP诱导的THJ-16T和THJ-29T细胞中caspase-3和PARP的裂解（图.4C）。实验表明rFMW/GFP通过p38MAPK通路诱导未分化甲状腺癌细胞发生死亡。22 大连医科大学硕士学位论文图4rFMW/GFP调控MAPK/p38通路(A)THJ-16T和THJ-29T细胞分别经rFMW/GFP感染6、12、24h。免疫印迹法检测p-p38,totalp38,p-Erk1/2,totalErk1/2,p-JNKandtotalJNK，β-actin作为内参。(B)THJ-16T和THJ-29T细胞经p38MAPK抑制剂SB203580(10μM)预处理30分钟后，再分别用10MOIrFMW/GFP感染24小时，MTT法检测细胞活力。数值以平均值±SEM,0.001<**p<0.005统计(C)蛋白印迹法检测总蛋白及裂解的caspase-3andPARP。3.5rFMW/GFP对荷瘤小鼠的溶瘤能力rFMW/GFP以及亲本NDV的溶瘤能力通过感染小鼠荷THJ-16T细胞引起的肿瘤来鉴定。体内实验设计依据已报道的研究[21,22,24,26,27]。肿瘤组织切片进行H&E染色及TUNEL实验。注射rFMW/GFP的实验组中，肿瘤组织通过H&E染色实验显示出明显的凋亡特征(图.5A)。另外，TUNEL实验显示出注射病毒的实验组中肿瘤细胞染色质固缩(图.5A)。相反，注射PBS的对照组中很少出现坏死及凋亡细胞。注射rFMW/GFP的实验组中肿瘤组织裂解制样，蛋白印迹法检测出GFP蛋白及HN蛋白的表达；而注射PBS对照组中，肿瘤组织样品则检测不到(图.5B)。从感染rFMW/GFP的肿瘤组织中分离出病毒，依然具有感染能力（数据未显示），提示23 大连医科大学硕士学位论文rFMW/GFP在被感染的肿瘤组织中大量复制。与上述实验一致，注射rFMW/GFP和NDV/FMW的实验组可以观察到明显的肿瘤抑制现象(图.5C)。然而，在注射rFMW/GFP和NDV/FMW的实验组中，肿瘤抑制现象没有明显差别，进一步证明NDV/FMW中插入GFP基因没有改变病毒毒力。由于新城疫病毒主要感染禽类，对哺乳动物不具传染性。为了证明新城疫病毒具有安全性，我们发现在非荷瘤小鼠中不论注射rFMW/GFP还是NDV/FMW对小鼠的存活率没有影响。图5rFMW/GFP的体内溶瘤效应(A)注射病毒一周后,分别提取不同处理组中不同小鼠的肿24 大连医科大学硕士学位论文瘤组织(共8组)进行H&E染色实验(肿瘤坏死部分如箭头所示)和TUNEL实验(B)蛋白印迹法检测肿瘤组织样品中GFP和HN蛋白的表达情况，β-actin作为内参(C)荷瘤小鼠经尾静脉注射病毒三周，肿瘤体积每隔5天统计一次，共统计50天，数据以平均值±SEM(n=10)统计，并绘制肿瘤体积-时间曲线图。实验重复两次(0.001<**p<0.005;***p<0.0001).（四）讨论虽然溶瘤病毒NDV作为一种新颖的肿瘤治疗手段广泛应用于多种类型的肿瘤治疗，其中包括甲状腺癌[28]，但是仅有一篇Zamarinetal.的报道显示NDV在体外实验中对甲状腺癌细胞具有溶瘤效应[18]。另外，没有临床实验应用NDV治疗甲状腺癌。因此，本论文首次报道溶瘤病毒NDV在体内及体外靶向于ATC。我们证实在体外实验中溶瘤病毒株NDV/FMW和构建的rFMW/GFP能在2D及3D培养条件下诱导未分化甲状腺癌细胞死亡；在体内实验，NDV/FMW和rFMW/GFP明显抑制ATC细胞诱导的小鼠成瘤。因此，我们的研究表明，溶瘤NDV能够作为治疗ATC的有效手段。为了更好的在体外及体内示踪溶瘤病毒NDV，几种NDV溶瘤病毒株如D90、F3aa和Italien都已经构建出表达GFP荧光蛋白的病毒株[26,27,29-31]。我们之前的研究曾以溶瘤病毒株NDV/FMW作为载体，构建表达凋亡素蛋白的重组病毒株增强NDV/FMW的溶瘤效应[24]。本实验中，我们将GFP基因插入NDV/FMW的基因组中，拯救出重组病毒rFMW/GFP。与亲本NDV/FMW效应一致，重组病毒rFMW/GFP在ATC细胞中能够大量复制。经rFMW/GFP感染的ATC细胞及荷瘤小鼠的肿瘤组织中都能检测到GFP蛋白的表达，这表明rFMW/GFP可作为一种报告病毒，有助于我们探索体外和体内的感染过程。此外，对荷瘤小鼠尾静脉注射rFMW/GFP，通过检测荧光蛋白GFP的表达证实rFMW/GFP分布于小鼠的脾和肺，这与Schirrmacheretal.之前的研究结论一致[32]。有趣的是，在非人类的灵长类动物中，尾静脉注射溶瘤新城疫病毒导致RNA病毒在呼吸道、脾和肝中积累[33]。总之，我们的实验结论扩宽了目前我们对溶瘤病毒rFMW/GFP应用于临床治疗甲状腺癌的知识面，以及溶瘤病毒NDV在动物模型中的应用。25 大连医科大学硕士学位论文我们之前的研究表明NDV/FMW能诱导多种肿瘤细胞产生依赖于MAPK通路的细胞凋亡[20-23]。进一步研究表明，rFMW/GFP感染ATC细胞诱导的细胞凋亡依赖于p38MAPK通路而不是Erk1/2或JNK通路。抑制p38MAPK通路降低了rFMW/GFP对ATC细胞的溶瘤效应，证明p38MAPK通路在rFMW/GFP诱导的ATC细胞凋亡中起重要作用。这些数据与我们之前的报道p38MAPK通路在NDV/FMW诱导的肺癌细胞凋亡中起重要作用类似[20,21]。总而言之，我们现在证明重组报告病毒rFMW/GFP及亲本病毒NDV/FMW在体外及体内呈现出对ATC细胞的溶瘤效应。rFMW/GFP可能会作为NDV/FMW在靶向癌细胞中溶瘤过程中重要的示踪工具，有助于我们进一步阐述NDV/FMW导致溶瘤性细胞死亡机制。（五）结论本次研究中，我们鉴定出重组报告病毒rFMW/GFP诱导未分化甲状腺癌细胞发生凋亡通过p38MAPK通路，提示溶瘤新城疫病毒可作为一种新颖的手段治疗未分化甲状腺癌。26 大连医科大学硕士学位论文（六）参考文献[1]阿勒哈，孟庆彬，于健春，康维明，曹战江，田树波.甲状腺癌分子发病机制研究进展.中国医学科学院学报,2013，35(4):382－385[2]NagaiahG,HossainA,MooneyCJ,ParmentierJ,RemickSC:Anaplasticthyroidcancer:areviewofepidemiology,pathogenesis,andtreatment.Journalofoncology2011,2011:542358.[3]HalldenG,PortellaG:Oncolyticvirotherapywithmodifiedadenovirusesandnoveltherapeutictargets.Expertopinionontherapeutictargets2012,16(10):945-958.[4]ChristosFountzilas,SukeshiPatel,DevalingamMahalingam,ChristosFountzilas.Oncolyticvirotherapy,updatesandfuturedirections.Oncotarget.2017;8(60):102617-102639[5]LiuF,XuK,YangH,LiY,LiuJ,WangJ,GuanZ:Anovelapproachtogliomatherapyusinganoncolyticadenoviruswithtwospecificpromoters.OncolLett.2018;15(3):3362-3368[6]McCormackMP,RabbittsTH.ActivationoftheT-celloncogeneLMO2aftergenetherapyforX-linkedseverecombinedimmunodeficiency.NEnglJMed.2004;350:913–922.[7]LinY,ZhangH,LiangJ,etal.IdentificationandcharacterizationofalphavirusM1asaselectiveoncolyticvirustargetingZAP-defectivehumancancers.ProcNatlAcadSciUSA.2014;111:4504–4512.[8]ParkBH,HwangT,LiuTC,SzeDY,KimJS,KwonHC,OhSY,HanSY,YoonJH,HongSH,MoonA,SpethK,ParkC,etal.Useofatargetedoncolyticpoxvirus,JX-594,inpatientswithrefractoryprimaryormetastaticlivercancer:aphaseItrial.LancetOncol.2008;9:533–42.[9]EhrigK,KilincMO,ChenNG,etal.GrowthinhibitionofdifferenthumancolorectalcancerxenograftsafterasingleintravenousinjectionofoncolyticvacciniavirusGLV-1h68.JTranslMed.2013;11:79.[10]LiD,XuD,WangZ,etal.Immunogenicityevaluationofmodifiedadenovirusvaccinesexpressingporcinecircovirustype2capsidproteininpigs.ViralImmunol.27 大连医科大学硕士学位论文2017;30:111–119.[11]JamiesonAT,GentryGA,Subak-SharpeJH.Inductionofboththymidineanddeoxycytidinekinaseactivitybyherpesviruses.JGenVirol.1974;24:465–480.[12]TodaM,RabkinSD,KojimaH,MartuzaRL.Herpessimplexvirusasaninsitucancervaccinefortheinductionofspecificanti-tumorimmunity.HumGeneTher.1999;10:385–393.[13]ThorneSH,ContagCH.Integratingthebiologicalcharacteristicsofoncolyticvirusesandimmunecellscanoptimizetherapeuticbenefitsofcell-baseddelivery.GeneTher.2008;15:753–758.[14]MiyamotoS,InoueH,NakamuraT,etal.CoxsackievirusB3isanoncolyticviruswithimmunostimulatorypropertiesthatisactiveagainstlungadenocarcinoma.CancerRes.2012;72:2609–2621.[15]CassadyKA,HaworthKB,JacksonJ,MarkertJM,CripeTP.Toinfectionandbeyond:themulti-prolongedanti-cancermechanismsofoncolyticviruses.Viruses.2016;8:43.[16]HuangJH,ZhangSN,ChoiKJ,etal.Therapeuticandtumor-specificimmunityinducedbycombinationofdendriticcellsandoncolyticadenovirusexpressingIL-12and4-1BBL.MolTher.2010;18:264–274.[17]AghiM,ChouTC,SulingK,BreakefieldXO,ChioccaEA.Multimodalcancertreatmentmediatedbyareplicatingoncolyticvirusthatdeliverstheoxazaphosphorine/ratcytochromeP4502B1andganciclovir/herpessimplexvirusthymidinekinasegenetherapies.CancerRes.1999;59:3861–3865.[18]ZamarinD,Martinez-SobridoL,KellyK,MansourM,ShengG,VigilA,Garcia-SastreA,PaleseP,FongY:Enhancementofoncolyticpropertiesofrecombinantnewcastlediseasevirusthroughantagonismofcellularinnateimmuneresponses.Moleculartherapy:thejournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy2009,17(4):697-706.[19]GanarK,DasM,SinhaS,KumarS:Newcastlediseasevirus:currentstatusandourunderstanding.Virusresearch2014,184:71-81.28 大连医科大学硕士学位论文[20]BianJ,WangK,KongX,LiuH,ChenF,HuM,ZhangX,JiaoX,Ge506B,WuYetal:Caspase-andp38-MAPK-dependentinductionofapoptosisinA549lungcancercellsbyNewcastlediseasevirus.Archivesofvirology2011,156(8):1335-1344.[21]MengS,ZhouZ,ChenF,KongX,LiuH,JiangK,LiuW,HuM,ZhangX,DingCetal:Newcastlediseasevirusinducesapoptosisincisplatin-resistanthumanlungadenocarcinomaA549cellsinvitroandinvivo.Cancerletters2012,317(1):56-64.[22]JiangK,LiY,ZhuQ,XuJ,WangY,DengW,LiuQ,ZhangG,MengS:PharmacologicalmodulationofautophagyenhancesNewcastlediseasevirus-mediatedoncolysisindrug-resistantlungcancercells.BMCcancer2014,14:551.[23]HuL,SunS,WangT,LiY,JiangK,LinG,MaY,BarrMP,SongF,ZhangGetal:Oncolyticnewcastlediseasevirustriggerscelldeathoflungcancerspheroidsandisenhancedbypharmacologicalinhibitionofautophagy.Americanjournalofcancerresearch2015,5(12):3612-3623.[24]WuY,ZhangX,WangX,WangL,HuS,LiuX,MengS:ApoptinenhancestheoncolyticpropertiesofNewcastlediseasevirus.Intervirology2012,55(4):276-286.[25]MarlowLA,D'InnocenziJ,ZhangY,RohlSD,CooperSJ,SeboT,GrantC,McIverB,KasperbauerJL,WadsworthJTetal:DetailedmolecularfingerprintingoffournewanaplasticthyroidcarcinomacelllinesandtheiruseforverificationofRhoBasamoleculartherapeutictarget.TheJournalofclinicalendocrinologyandmetabolism2010,95(12):5338-5347.[26]SongKY,WongJ,GonzalezL,ShengG,ZamarinD,FongY:AntitumorefficacyofviraltherapyusinggeneticallyengineeredNewcastlediseasevirus[NDV(F3aa)-GFP]forperitoneallydisseminatedgastriccancer.Journalofmolecularmedicine2010,88(6):589-596.[27]WeiD,SunN,NanG,WangY,LiuHQ,PeetersB,ChenZN,BianH:ConstructionofrecombinantNewcastlediseasevirusItalienstrainforoncolyticvirotherapyoftumors.Humangenetherapy2012,23(7):700-710.[28]GuanM,RomanoG,CoronitiR,HendersonEE:Progressinoncolyticvirotherapyforthetreatmentofthyroidmalignantneoplasm.Journalofexperimental&clinical29 大连医科大学硕士学位论文cancerresearch:CR2014,33:91.[29]SilberhumerGR,BraderP,WongJ,SerganovaIS,GonenM,GonzalezSJ,BlasbergR,ZamarinD,FongY:GeneticallyengineeredoncolyticNewcastlediseaseviruseffectivelyinducessustainedremissionofmalignantpleuralmesothelioma.Molecularcancertherapeutics2010,9(10):2761-2769.[30]LiP,ChenCH,LiS,GiviB,YuZ,ZamarinD,PaleseP,FongY,WongRJ:Therapeuticeffectsofafusogenicnewcastlediseasevirusintreatingheadandneckcancer.Head&neck2011,33(10):1394-1399.[31]ChaiZ,ZhangP,FuF,ZhangX,LiuY,HuL,LiX:OncolytictherapyofarecombinantNewcastlediseasevirusD90strainforlungcancer.Virologyjournal2014,11:84.[32]BianH,WildenH,FournierP,PeetersB,SchirrmacherV:InvivoefficacyofsystemictumortargetingofaviralRNAvectorwithoncolyticpropertiesusingabispecificadapterprotein.Internationaljournalofoncology2006,29(6):1359-1369.[33]BuijsPR,vanAmerongenG,vanNieuwkoopS,BestebroerTM,vanRunPR,KuikenT,FouchierRA,vanEijckCH,vandenHoogenBG:IntravenouslyinjectedNewcastlediseasevirusinnon-humanprimatesissafetouseforoncolyticvirotherapy.Cancergenethera2014,21(11):463-471.30 大连医科大学硕士学位论文三、综述（一）综述溶瘤病毒在肿瘤治疗中的应用与展望孔令凯综述孟松树审校溶瘤病毒（OVs）是一种能在肿瘤细胞中特异性复制、扩增并杀伤肿瘤细胞的病毒，其对正常细胞无杀伤作用。因此溶瘤病毒作为一种新颖的治疗手段具有广泛的应用前景。溶瘤病毒分为两大类别：野生型病毒如呼吸道肠道病毒（reovirus），与基因重组型病毒如腺病毒（adenovirus）。在过去的一个世纪里，人们对多种溶瘤病毒有了深入的了解。例如,1910年，Pasteur第一次发现利用狂犬病减毒活疫苗能使宫颈癌消退[1]。20世纪40年代，人们对不同种类的溶瘤病毒有了新的认识[2]。上世纪90年代初，当一种经过基因改造后的胸腺嘧啶核苷激酶（TK）阴性单纯疱疹病毒（HSV株）减毒活疫苗局部注射入裸鼠胶质瘤模型，显示出良好的溶瘤性，预示着人类对溶瘤病毒的认识进入更高的层面[3]。目前，转基因单纯疱疹病毒Imlygic™（T-VEC/talimogenelaherparepvec）已经成为美国和欧盟第一个批准用于局部晚期或不能手术切除的黑色素瘤治疗的溶瘤病毒[4-5]。这篇文章将从溶瘤病毒的溶瘤机制、溶瘤病毒治疗的局限性、溶瘤病毒治疗的优势及未来的展望三个方面讨论溶瘤病毒在肿瘤治疗发面的应用前景。1、溶瘤机制溶瘤病毒（OVs）分为DNA病毒和RNA病毒，在此基础上还可进一步分为单链和双链病毒。OVs可以通过结合细胞表面受体或与质膜融合进入细胞，从而建立肿瘤的溶解周期，但对正常组织不具有杀伤作用。OVs的本质特征在于能够自然地利用肿瘤的固有特性如ras通路激活[6-8]或基因修饰，建立起肿瘤的溶解周期。例如，敲低HSV中的TK基因可导致HSV优先杀伤肿瘤细胞，因为分裂细胞中具有TK活性，TK阴性的HSV只能在分裂细胞中复制[3,9,10]。TK激酶在31 大连医科大学硕士学位论文G1期活化的细胞中高表达，对病毒DNA的合成和修复中起到重要作用[11-12]。溶瘤病毒能够在被感染的肿瘤细胞中持续复制，并招募未感染的细胞形成合胞体从而在体内稳定遗传，由于缺乏染色体整合，并不会导致重大疾病的发生[13]。Reovirus、HSV或痘苗病毒（vacciniavirus）能够导致肿瘤特异性免疫应答反应，从而间接导致肿瘤细胞的死亡[14-17]。腺病毒（Adenovirus）、CoxsackieB3病毒和麻疹病毒（measlesvirus）能够导致内质网(ER)应激并诱导细胞免疫性死亡[19-21]。溶瘤病毒还靶向肿瘤新血管。水泡性口炎病毒(VSV)可选择性地感染肿瘤微环境中的内皮细胞,并导致肿瘤血管血栓[22]。HSV和痘苗病毒也可以有选择地损害肿瘤内皮[23,24];溶瘤病毒优先在肿瘤血管中复制可能是由于肿瘤血管相较于正常内皮细胞具有高水平的血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)[24]。OVs可以通过基因工程改造而表达抗血管生成因子,如VEGF抑制剂[25,26]。痘苗病毒治疗可导致肿瘤生长抑制和VEGF水平降低,VEGF水平能在病毒清除后重新恢复,利用这一特征溶瘤病毒可与VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)联用起到协同抗癌作用[27]。但这也带来一个弊端就是可能导致细胞抗病毒防御蛋白的非靶向抑制[28,29]。32 大连医科大学硕士学位论文图1.病毒的溶瘤机制DAF–衰变加速因子,GM-CSF–粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子,HSV–单纯疱疹病毒,hTERT–人端粒酶,ICAM-1–细胞间粘附分子-1,ICP–感染细胞蛋白,INF-β–干扰素-β,NDV–新城疫病毒,VSV–水泡性口炎病毒.（ChristosFountzilasetal.Oncotarget.2017;8(60):102617-102639）2、溶瘤病毒治疗的局限性溶瘤病毒在治疗肿瘤方面也面临着诸多难题。限制溶瘤病毒治疗效果的难题之一便是如何使病毒精确地传递到肿瘤组织中。最理想的给药方式就是静脉注射（IV），这是由于在全身给药后，肝脏会吸收大部分的药物剂量[30]。对于少数肿瘤如黑色素瘤，易于接近皮肤并在皮下病变，直接瘤内注射病毒也是一种理想方式[31–34]。对大多数伴有内脏和骨转移的恶性肿瘤，瘤内注射病毒可能抑制其溶瘤效率。此外，大多数病毒广泛存在于自然界中，并且人类很早就会接种一些疫苗，这些因素都会抑制溶瘤病毒的治疗效果[35]。3、溶瘤病毒治疗：联合治疗及展望溶瘤病毒诱导肿瘤细胞死亡的间接机制是通过抗肿瘤免疫反应[34]。有理论提出肿瘤浸润淋巴组织可抑制病毒复制，最终清除病毒。体内已经存在的抗体也能与静脉注射的病毒结合，减弱病毒的治疗效果。对此，溶瘤病毒与化疗药物联用是克服这一缺陷的有效方法。在动物模型的实验中环磷酰胺（一种免疫抑制剂及33 大连医科大学硕士学位论文抗肿瘤药）能增强呼肠孤病毒靶向肿瘤细胞的能力，并中和体内抗体水平防止产生严重毒性[36]。吉西他滨（嘧啶类抗肿瘤药物）对呼肠孤病毒复制的晚期阶段具有抑制作用，然而，净效应是通过降低肿瘤微环境中免疫细胞的水平从而促进抗肿瘤免疫反应[37]。转基因单纯疱疹病毒T-VEC和CTLA-4抗体联合治疗晚期恶性黑色素瘤患者的Ⅰ期临床试验结果表明，联合治疗能大大提高肿瘤治疗客观应答率(联合治疗58%vs单药治疗26.4%)[38]。已有报道，在溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的过程中，免疫检查点被激活并应答病毒产生的溶瘤效应。免疫检查点抑制剂与溶瘤病毒联用能增强病毒的溶瘤效应。在小鼠模型实验中，相较于单独用药，溶瘤病毒Reolysin和anti-PD1抗体的联用能明显延长患有黑色素瘤小鼠的生命[39]。新城疫病毒（NDV）与免疫检查点抑制剂联用同样可以增强对肿瘤细胞的杀伤效果[34]。溶瘤病毒可与VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)联用起到协同抗癌作用。从Pasteur第一次发现利用狂犬病减毒活疫苗能使宫颈癌消退到第一个溶瘤病毒（转基因单纯疱疹病毒T-VEC）批准应用于黑色素瘤的治疗，人类对溶瘤病毒的探索已经经历了100多年。虽然溶瘤病毒在肿瘤治疗中呈现出良好的效果，但单独使用往往效果不理想。因此，溶瘤病毒与其他药物联用是当前行之有效的方法。目前常见的溶瘤病毒与化学药物联用方式主要分为三类：抗肿瘤靶向药物与溶瘤病毒的联合治疗；化疗药物与溶瘤病毒的联合治疗；免疫检验点阻断剂与溶瘤病毒的联合治疗。未来溶瘤病毒疗法的广泛应用还需要解决如何使溶瘤病毒更加直接有效的转运至肿瘤组织及其周围的肿瘤微环境这一难题。相信随着基因工程技术及分子生物学、生物信息学的发展，溶瘤病毒疗法会取得突破性进展。34 大连医科大学硕士学位论文（二）参考文献[1]SinkovicsJG,HorvathJC.Naturalandgeneticallyengineeredviralagentsforoncolysisandgenetherapyofhumancancers.ArchImmunolTherExp(Warsz).2008(Suppl1);56:3s–59s.[2]HosterHA,ZanesRPJr,VonHaamE.StudiesinHodgkin’ssyndrome;theassociationofviralhepatitisandHodgkin’sdisease;apreliminaryreport.CancerRes.1949;9:473–80.[3]MartuzaRL,MalickA,MarkertJM,RuffnerKL,CoenDM.Experimentaltherapyofhumangliomabymeansofageneticallyengineeredvirusmutant.Science.1991;252:854–56.[4]FDA(2015)."FDAapprovesfirst-of-its-kindproductforthetreatmentofmelanoma."RetrievedApril12th,2016[5]EMA(2015)."Firstoncolyticimmunotherapymedicinerecommendedforapproval."RetrievedJuly28th,2016.[6]AlainT,KimTS,LunX,LiaciniA,SchiffLA,SengerDL,ForsythPA.Proteolyticdisassemblyisacriticaldeterminantforreovirusoncolysis.MolTher.2007;15:1512–21.[7]MarcatoP,ShmulevitzM,PanD,StoltzD,LeePW.Rastransformationmediatesreovirusoncolysisbyenhancingvirusuncoating,particleinfectivity,andapoptosis-dependentrelease.MolTher.2007;15:1522–30.[8]StrongJE,CoffeyMC,TangD,SabininP,LeePW.Themolecularbasisofviraloncolysis:usurpationoftheRassignalingpathwaybyreovirus.EMBOJ.1998;17:3351–62.[9]FieldHJ,WildyP.Thepathogenicityofthymidinekinase-deficientmutantsofherpessimplexvirusinmice.JHyg(Lond).1978;81:267–77.[10]JamiesonAT,GentryGA,Subak-SharpeJH.Inductionofboththymidineanddeoxycytidinekinaseactivitybyherpesviruses.JGenVirol.1974;24:465–80.[11]WhitleyRJ,RoizmanB.Herpessimplexvirusinfections.Lancet.2001;35 大连医科大学硕士学位论文357:1513–18.[12]GasparriF,WangN,SkogS,GalvaniA,ErikssonS.Thymidinekinase1expressiondefinesanactivatedG1stateofthecellcycleasrevealedwithsite-specificantibodiesandArrayScanassays.EurJCellBiol.2009;88:779–85.[13]VerheijeMH,RottierPJ.Retargetingofvirusestogenerateoncolyticagents.AdvVirol.2012;2012:798526.[14]PrestwichRJ,ErringtonF,IlettEJ,MorganRS,ScottKJ,KottkeT,ThompsonJ,MorrisonEE,HarringtonKJ,PandhaHS,SelbyPJ,VileRG,MelcherAA.Tumorinfectionbyoncolyticreovirusprimesadaptiveantitumorimmunity.ClinCancerRes.2008;14:7358–66.[15]TodaM,RabkinSD,KojimaH,MartuzaRL.Herpessimplexvirusasaninsitucancervaccinefortheinductionofspecificanti-tumorimmunity.HumGeneTher.1999;10:385–93.[16]TodaM,MartuzaRL,KojimaH,RabkinSD.Insitucancervaccination:anIL-12defectivevector/replication-competentherpessimplexviruscombinationinduceslocalandsystemicantitumoractivity.JImmunol.1998;160:4457–64.[17]ThorneSH,ContagCH.Integratingthebiologicalcharacteristicsofoncolyticvirusesandimmunecellscanoptimizetherapeuticbenefitsofcell-baseddelivery.GeneTher.2008;15:753–58.[18]DiaconuI,CerulloV,HirvinenML,EscutenaireS,UgoliniM,PesonenSK,BramanteS,ParviainenS,KanervaA,LoskogAS,EliopoulosAG,PesonenS,HemminkiA.ImmuneresponseisanimportantaspectoftheantitumoreffectproducedbyaCD40L-encodingoncolyticadenovirus.CancerRes.2012;72:2327–38.[19]MiyamotoS,InoueH,NakamuraT,YamadaM,SakamotoC,UrataY,OkazakiT,MarumotoT,TakahashiA,TakayamaK,NakanishiY,ShimizuH,TaniK.CoxsackievirusB3isanoncolyticviruswithimmunostimulatorypropertiesthatisactiveagainstlungadenocarcinoma.CancerRes.2012;72:2609–21.[20]DonnellyOG,Errington-MaisF,SteeleL,HadacE,JenningsV,ScottK,PeachH,PhillipsRM,BondJ,PandhaH,HarringtonK,VileR,RussellS,etal.Measlesvirus36 大连医科大学硕士学位论文causesimmunogeniccelldeathinhumanmelanoma.GeneTher.2013;20:7–15.[21]KeppO,GalluzziL,MartinsI,SchlemmerF,AdjemianS,MichaudM,SukkurwalaAQ,MengerL,ZitvogelL,KroemerG.Moleculardeterminantsofimmunogeniccelldeathelicitedbyanticancerchemotherapy.CancerMetastasisRev.2011;30:61–69.[22]BreitbachCJ,DeSilvaNS,FallsTJ,AladlU,EvginL,PatersonJ,SunYY,RoyDG,RintoulJL,DaneshmandM,ParatoK,StanfordMM,LichtyBD,etal.Targetingtumorvasculaturewithanoncolyticvirus.MolTher.2011;19:886-94.[23]BenenciaF,CourregesMC,Conejo-GarcíaJR,BuckanovichRJ,ZhangL,CarrollRH,MorganMA,CoukosG.OncolyticHSVexertsdirectantiangiogenicactivityinovariancarcinoma.HumGeneTher.2005;16:765–78.[24]BreitbachCJ,ArulanandamR,DeSilvaN,ThorneSH,PattR,DaneshmandM,MoonA,IlkowC,BurkeJ,HwangTH,HeoJ,ChoM,ChenH,etal.Oncolyticvacciniavirusdisruptstumor-associatedvasculatureinhumans.CancerRes.2013;73:1265–75.[25]ZhangZ,ZouW,WangJ,GuJ,DangY,LiB,ZhaoL,QianC,QianQ,LiuX.Suppressionoftumorgrowthbyoncolyticadenovirus-mediateddeliveryofanantiangiogenicgene,solubleFlt-1.MolTher.2005;11:553–62.[26]GholamiS,MaranoA,ChenNG,AguilarRJ,FrentzenA,ChenCH,LouE,FujisawaS,EvenoC,BelinL,ZanzonicoP,SzalayA,FongY.Anovelvacciniaviruswithdualoncolyticandanti-angiogenictherapeuticeffectsagainsttriple-negativebreastcancer.BreastCancerResTreat.2014;148:489–99.[27]HouW,ChenH,RojasJ,SampathP,ThorneSH.OncolyticvacciniavirusdemonstratesantiangiogeniceffectsmediatedbytargetingofVEGF.IntJCancer.2014;135:1238–46.[28]JhaBK,PolyakovaI,KesslerP,DongB,DickermanB,SenGC,SilvermanRH.InhibitionofRNaseLandRNA-dependentproteinkinase(PKR)bysunitinibimpairsantiviralinnateimmunity.JBiolChem.2011;286:26319–26.[29]JhaBK,DongB,NguyenCT,PolyakovaI,SilvermanRH.Suppressionofantiviral37 大连医科大学硕士学位论文innateimmunitybysunitinibenhancesoncolyticvirotherapy.MolTher.2013;21:1749–57.[30]AlemanyR,SuzukiK,CurielDT.Bloodclearanceratesofadenovirustype5inmice.JGenVirol.2000;81:2605–09.[31]HuJC,CoffinRS,DavisCJ,GrahamNJ,GrovesN,GuestPJ,HarringtonKJ,JamesND,LoveCA,McNeishI,MedleyLC,MichaelA,NuttingCM,etal.AphaseIstudyofOncoVEXGM-CSF,asecond-generationoncolyticherpessimplexvirusexpressinggranulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor.ClinCancerRes.2006;12:6737–47.[32]AndtbackaRH,KaufmanHL,CollichioF,AmatrudaT,SenzerN,ChesneyJ,DelmanKA,SpitlerLE,PuzanovI,AgarwalaSS,MilhemM,CranmerL,CurtiB,etal.TalimogeneLaherparepvecImprovesDurableResponseRateinPatientsWithAdvancedMelanoma.JClinOncol.2015;33:2780–88.[33]SenzerNN,KaufmanHL,AmatrudaT,NemunaitisM,ReidT,DanielsG,GonzalezR,GlaspyJ,WhitmanE,HarringtonK,GoldsweigH,MarshallT,LoveC,etal.PhaseIIclinicaltrialofagranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor-encoding,second-generationoncolyticherpesvirusinpatientswithunresectablemetastaticmelanoma.JClinOncol.2009;27:5763–71.[34]ZamarinD,HolmgaardRB,SubudhiSK,ParkJS,MansourM,PaleseP,MerghoubT,WolchokJD,AllisonJP.LocalizedOncolyticVirotherapyOvercomesSystemicTumorResistancetoImmuneCheckpointBlockadeImmunotherapy.SciTranslMed.2014;6:226ra32.[35]DubinG,FishmanNO,EisenbergRJ,CohenGH,FriedmanHM.Theroleofherpessimplexvirusglycoproteinsinimmuneevasion.CurrTopMicrobiolImmunol.1992;179:111–20..[36]QiaoJ,WangH,KottkeT,WhiteC,TwiggerK,DiazRM,ThompsonJ,SelbyP,deBonoJ,MelcherA,PandhaH,102635CoffeyM,VileR,HarringtonK.Cyclophosphamidefacilitatesantitumorefficacyagainstsubcutaneoustumorsfollowingintravenousdeliveryofreovirus.ClinCancerRes.2008;14:259–69.38 大连医科大学硕士学位论文[37]GujarSA,ClementsD,DielschneiderR,HelsonE,MarcatoP,LeePW.Gemcitabineenhancestheefficacyofreovirus-basedoncotherapythroughanti-tumourimmunologicalmechanisms.BrJCancer.2014;110:83–93.[38]LolkemaMP,ArkenauHT,HarringtonK,RoxburghP,MorrisonR,RoulstoneV,TwiggerK,CoffeyM,MettingerK,GillG,EvansTR,deBonoJS.AphaseIstudyofthecombinationofintravenousreovirustype3Dearingandgemcitabineinpatientswithadvancedcancer.ClinCancerRes.2011;17:581–88.[39]RajaniK,ParrishC,KottkeT,ThompsonJ,ZaidiS,IlettL,ShimKG,DiazRM,PandhaH,HarringtonK,CoffeyM,MelcherA,VileR.CombinationTherapyWithReovirusandAnti-PD-1BlockadeControlsTumorGrowthThroughInnateandAdaptiveImmuneResponses.MolTher.2016;24:166–74.39 大连医科大学硕士学位论文四、附录缩略词表缩略词英文全称中文全称APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜ECLEnhanced化学发光自显影chemiluminesceneFBSFetalBovineSerum胎牛血清NDVNewcastledisease新城疫病毒virusPAGEPolyacrylamidegel十二烷基磺酸钠electrophoresisPBSPhosphateBuffer磷酸盐缓冲液SalinePMSFPhenylmethy苯甲基磺酰氟SulfonylfluoridePARPPoly(ADP-Ribose)多聚（ADP-核Polymerase糖）聚合酶SDSSodiumdodecyl十二烧基硫酸钠sulfate40 大连医科大学硕士学位论文五、致谢岁月如梭，如歌。转眼间，三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔，奋斗和辛劳成为丝丝的记忆，甜美与欢笑也都尘埃落定。大连医科大学以其优良的学习风气、严谨的科研氛围教我求学，以其博大包容的情怀胸襟、浪漫充实的校园生活育我成人。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。本论文是在导师孟松树教授的悉心指导之下完成的。三年来，导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。本论文从选题到完成，几易其稿，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血，在此我向我的导师孟松树教授表示深切的谢意与祝福!本论文的完成也离不开其他各位老师、同学和朋友的关心与帮助。在此也要感谢姜珂老师在论文开题、中期环节所提出的宝贵意见。同时，还要感谢同门的师兄师姐师弟师妹们三年来在科研过程中给我以许多鼓励和帮助，愿友谊长存!回想整个论文的写作过程，虽有不易，却让我除却浮躁，经历了思考和启示，因此倍感珍惜。感谢大连医科大学公共实验平台的程为教授，陈海波老师，杜莎老师，感谢SPF的姜新老师，感谢你们三年来对我的帮助。还要感谢父母在我求学生涯中给与我无微不至的关怀和照顾，一如既往地支持我、鼓励我。2018年2月41 ＿厘士连關找所有