转hrpZ_(psta)和chi双价广谱抗病基因大豆对疫霉根腐病抗性鉴定分析

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分类号：S330单位代码：10193密级：公开学号：2013018硕士学学位位论文转hrpZpsta和chi双价广谱抗病基因大豆对疫霉根腐病抗性鉴定分析IdentificationofPhytophthorarootrotfortheTransgenicSoybeanwithTwoBroadSpectrumDiseaseResistanceGeneshrpZpstaandchi作者姓名：李琦学位类别：农学硕士专业名称：作物遗传育种研究方向：作物重要性状的遗传和育种指导教师：王丕武教授所在学院：农学院2015年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日 摘要大豆含有丰厚的蛋白质，因蛋白质含较高被称为人类重要蛋白摄取来源。大豆不仅作为膳食佳品，其还是高蛋白粮饲兼用作物，为加工产业提供优质原料。虽然大豆具有极高价值，但受到真菌病害的困扰，已有126种大豆病害被证实，有30多种造成生产损失。其中大豆疫霉根腐病在大豆产量上是最具有破坏性的真菌病害之一，对感病品种能造成5%~10%的产量损失，最高可达90%以上，同时蛋白含量明显下降，在种子中最为突出。因此，培育抗病品种十分必要。通过转基因技术把外源抗病基因转化到大豆受体基因中，是提高大豆自身抗病能力的有效途径。在众多抗病基因中，来自于烟草野火病原菌的hrpZpsta基因可以编码出非特异性激发子Harpin蛋白，诱导植物自身发生过敏性反应（HR），刺激植物产生自然免疫机制，被侵染的组织细胞坏死，病原菌不能侵染其他植物组织，使植株具有广谱抗性。当植物受到外源因子病原菌侵染时，植物会被诱导在体内产生大量的几丁质酶，从而使病原菌的细胞壁被降解，导致真菌病原菌死亡，使植株具有广谱抗性。在前期工作中我们通过农杆菌介导法将hrpZpsta和chi双价抗病基因转入到大豆受体中获得3个T3、T4代株系。对三个株系进行分子水平上检测和抗病性鉴定。分析株系的拷贝数与其遗传稳定性和抗病能力之间的关系。经过研究，主要结果如下：1、对3个株系T2003-23-11（株系1）、T2004-28-321（株系2）和T2004-30-384（株系3）进行PCR检测和Southernblot杂交检测，结果证明hrpZpsta和chi双价抗病基因在株系基因组中整合良好，且以多拷贝形式整合，hrpZpsta基因已在大豆株系后代中稳定遗传。2、利用qRT-PCR技术检测3个T3、T4代株系的根、茎、叶、籽粒各组织中的表达量，结果表明hrpZpsta和chi双价基因在株系的不同组织中的相对表达量都超过对照植株，且在根和叶中表达量较高，籽粒和茎中表达量较低，说明hrpZpsta和chi双价基因在株系转录水平上得到表达。1 3、利用下胚轴侵染法对3个T3、T4代株系进行人工接菌实验，抗性鉴定结果表明3个株系抗病级别均为高抗，未转化植株的抗病级别为中抗，表明转化株系的抗病能力得到提升。4、经分子检测和抗病鉴定结果表明，虽然外源基因已多拷贝和单拷贝形式整合在3个T3、T4代株系基因组中，但其在后代中能够稳定遗传而且株系的抗疫霉根腐病的等级由中抗提高到高抗。关键词：大豆；hrpZpsta和chi基因；疫霉根腐病；抗病性2 AbstractSoybeancontainsrichprotein,anditshighproteincontentisknownasthehumanimportantsourceofplantprotein.Soybeanisnotonlyasagoodmeal,butalsoishighproteinfoodfeedingcombinationcrops,andprovidedqualityrawmaterialstotheprocessingindustry.Althoughsoybeanhasaveryhighvalue,buttroubledbyfungaldisease,morethan126kindsofsoybeandiseaseshavebeenconfirmed,andmorethan30havetheproductionloss.Soybeanphytophthorarootrotisoneofthemostdevastatingfungaldiseasestothesoybeanproduction,generalyieldlossofcultivarsis5%~10%,uptomorethan90%,andcanalsocausetheproteincontentinseedsignificantlylower.Therefore,Itisnecessarytobreeddisease-resistantvarieties.Usingbiotechnologytotransformexogenousresistancegenesintosoybeanreceptorgenomeisaneffectivewaytoimprovethesoybeandiseaseresistance.Inthenumerousresistancegenes,thehrpZpstagenewhichfromtobaccowildfirepathogencanencodethenonspecificelicitorHarpinproteins,indceplantitselftoproducehypersensitivereaction(HR),theinfectedtissuecellsnecrosis,pathogencan'tinfectotherplanttissue,andmadetheplantbroad-spectrumresistance.Whenplantsareinfectedbytheexogenousfactorspathogen,plantswillbeinducedtoproducealargenumberofchitinaseinthebody,sothatthepathogenofthecellwalldegradation,Ledtothedeathsoffungalpathogens,andmadetheplantsresistantspectrum.InthepreviousworkwethroughagrobacteriummediatedmethodtransformthehrpZpstaandchibivalentresistancegenesintosoybeanreceptorby3T3,T4generationstrains.Thethreestrainstoidentifythemoleculardetectionanddiseaseresistance.Analysisoftherelationshipbetweenthecopenumbersofthestrainswithgeneticstabilityanddiseaseresistance.Throughtheresearch,themainresultsareasfollows:1、ForthreestrainT2003-23-11(strain1),T2004-28-321(strain2)andT2004-30-384(strain3)detectionofPCRandSouthernblothybridizationdetection,theresultsshowthathrpZpstagenehasbeenintegratedintothegenome,andintheformofmulti-copyintegration,hrpZpstageneshasbeenstablegeneticinprogenysoybeanstrain.2、UsingtheqRT-PCRtechniquetodetect3T3,T4generationstrainsofroot,stem,leaf,seedamountofexpressionineachgroup,resultsshowthattherelativeexpressionofhrpZpstaandchibivalentgeneindifferentgroupsofstrainsarehigherthanthenon-transgeniccontrol,andhighexpressioninrootsandleaves,lowamountofexpressionintheseedsandstems,explainingthathrpZpstaandchibivalentgenehaveexpressedinthetranscriptionlevelofstrains.3、UsinghypocotylinfectionmethodconductartificialinoculationexperimentstotheT3,T4generationstrains,resistanceidentificationresultsshowedthatthethreestrainsresistancelevelsareresistance,non-transgeniccontrolresistancelevelsaremoderateresistance，showthatthediseaseresistanceoftransgenicstrainsare3 improved.4、Throughthemoleculardetectionanddiseaseresistanceidentificationresultsindication,althoughtheexogenousgenehavemanycopiesandsinglecopyformintegrationinthegenomeof3T3,T4generationstrains,buttheycanstablegeneticintheoffspringandthelevelofstainsresistancetophytophthorarootrotareincreasedbymoderateresistancetoresistance.Keywords:Soybean;HrpZpstaandchigenes;Phytophthorarootrot：Diseaseresistance4 目录摘要.......................................................................................................................IAbstract.......................................................................................................................III目录..............................................................................................................................V前言.........................................................................................................................6第一章文献综述.........................................................................................................71.1大豆病害...........................................................................................................71.1hrpZPsta抗病基因.........................................................................................71.2chi抗病基因................................................................................................81.3双价抗病基因进展......................................................................................81.5转化基因株系后代检测...................................................................................8第二章研究内容.......................................................................................................112.1试验材料........................................................................................................112.2转基因株系hrpZPsta基因PCR检测............................................................122.3转基因大豆Southernblot检测....................................................................152.4转基因株系qRT-PCR检测.........................................................................182.5转化大豆抗病性鉴定.....................................................................................19第三章结果与分析...............................................................................................213.1转基因株系PCR检测...................................................................................213.2转基因大豆Southernblot检测....................................................................223.3转基因株系qRT-PCR检测..........................................................................243.4转基因大豆抗病性鉴定.................................................................................274.1讨论................................................................................................................294.2结论................................................................................................................30参考文献.....................................................................................................................32作者简介.....................................................................................................................37致谢.....................................................................................................................385 前言大豆最早源产于我国，种植历史达几千年之久，美国、阿根廷、巴西等国家的种植历[1]史仅有几十年。大豆是我国重要的经济作物，是人类重要的植物蛋白源，其蛋白质含量[2]约为40%左右，而且其脂肪含量非常丰富约为20%，极具营养价值。大豆还可以作为高[3]蛋白粮饲兼用作物，为加工产业提供优质原料。虽然各国工业得到了迅猛发展，但是世界大国的主要农业产业仍是大豆，大豆产业在国民经济中占据重要部分，大豆产业的发展不仅是一些国家走向兴盛的道路之一，并且对机械、食品和轻工等产业有巨大的推进作用，[4]更关乎到百姓日常最基本的质量能否提升。中国原是世界第一的大豆产量国和销售国，但现在需要靠大量的进口来维持食品业等行业的需求。究其原因，大豆病、虫害对我国大豆产量的冲击尤为严重，其中大豆病害不仅可以造成减产，同时大豆的品质也会下降，有30多种大豆病害被发现，根据病原分类[5-6]为真菌、病毒、细菌和病毒等，其中真菌病害病害多、分布广、危害也最为严重。在[7-8]真菌病害中大豆疫霉根腐病造成损失面积大，是最有破坏性的的真菌病害之一。所以防治真菌大豆病害来提升大豆产量作为重中之重的问题。1983年世界第一例转化烟草在美国诞生之后，利用生物技术将外源抗病基因导入受[9]体大豆基因组中，成为提高大豆抗病等级的重要方式。虽然转单个抗病基因在植物抗病性上取得了一定成效，但单个基因存在抗性狭窄和选择抑菌性等原因，所以越来越多双基因开始导入植株中，导入多个抗病基因可以提高对多种病害的抗性，抑制生理小种的变异[10]，在抗病品种培育过程中取得更多的使用。1996年全球只有100多个功能基因。但到2005年，在美国就有380个功能基因进行[11]安全评估。在众多抗病基因中，本实验选择hrpZpsta和chi双价广谱抗病基因，对前期工作中我们通过农杆菌介导法将hrpZpsta和chi双价基因导入到大豆受体的株系进行分子检测及抗病鉴定，分析双价基因的拷贝数与其遗传稳定性、表达量和抗病性关系之间的关系，为选育遗传稳定、抗病能力强的转基因大豆提供基础材料。6 第一章文献综述1.0大豆病害大豆作为主要经济作物，因其含有高蛋白质和非常多的氨基酸成为人们的膳食佳品，近些年来随着百姓的生活水平提高促进我国大豆在私聊养殖业和压榨业的快速发展，进口[12]大豆数量逐年增加。有多种因素影响大豆产量，其中最主要的因素是大豆病害，分为真菌病害、病毒病害和细菌病害等，而在真菌病害中大豆疫霉根腐病是最为严重的病害之一。1.0.1大豆根腐病概述大豆根腐病(PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)是由大豆疫霉菌引发的全球性大豆病害，起初1948年于美国印第安纳州被发现，然后相继在巴西、澳大利亚、阿根廷、[13]印度等国发生。沈崇尧等人于1989年第一次从中国东北大豆产区中分离出该菌，随后[14-15]在吉林、山东、内蒙古山东出现。大豆根腐病是真菌病害，整个生长过程均可能发生，出现根腐、枯萎、植株矮化、茎腐、死亡等症状[16-17]。播种后可能使腐烂，在苗期可导致幼苗猝倒死亡，在复叶期可引发病茎干枯死亡，成株期能让根部产生深褐色不规则病斑，病株茎部皮层变黑坏死，叶片由[18-19]开始的上部褪绿到下部黄化，最终导致植株萎蔫死亡，但叶片一般不会脱落。1995~1998年李宝英对黑龙江省大部分县的大豆产区进行统计，多数地区大豆疫霉根腐病[20]的田间发病率为3%~5%，严重地区可达75%或绝产。1974~1994年中大豆根腐病和茎[21]腐病在美国16个州生产受损，高达900多万吨。1.1hrpZPsta抗病基因植物在进化阶段中时常会遭受病原菌的侵染，其中抗性寄主或非寄主植物在抵制病原菌的侵染时，自身会产生过敏性反应（hypersensitivereaction,HR），导致受侵染部位细胞[22]死亡，从而病原菌死亡，使植株对之后的随后侵染产生抗性。存在于革兰氏阴性植物的病原菌中的hrp基因能够产生过敏性反应，Hrp基因家族又包括hrpA、hrpB、hrpG、hrpX[23-26]和hrpZ等。本实验选择来自于烟草野火病原菌的hrpZpsta基因与hrpZ的同源性为100%，能够编码出非特异性激发子Harpin蛋白，诱导植物自身发生过敏性反应（HR），刺激植物产生自然免疫机制，被侵染的组织细胞坏死，病原菌不能侵染其他植物组织，使植株具有7 [27-28]广谱抗性。Hrp家族不仅可以产生过敏性反省，使植株更多的吸收营养，加强光合作用，加快种[29]子萌发和植株生长，使作物的产量和品质得到提升。基于hrpZpsta基因的优势，其大豆、[30-31][32]玉米等中均有转化，转基因大豆使植株的抗疫霉根腐菌能力提高。1.2chi抗病基因[33]几丁质是大部分真菌细胞壁的主要构成，1905年Benecke分离得到可以产出几丁质[34]的的物质，1921年Folpmers证明了该物质可以降解几丁质，几丁酶（chi基因）就是一种能够降解几丁质的水解酶，当植物受到外源因子病原菌侵染时，植物会被诱导在体内产生大量的几丁质酶，从而使病原菌的细胞壁被降解，破快细胞壁的结构，致使真菌病原菌[35-38]死亡。伴随对几丁质酶的生理特性、表达调控、作用机制的进一步了解，将chi基因转入到作物中得到更多的使用。1986年，Broglie首先将得到的几丁质酶基因转化到烟草中，使[39]烟草对根腐病有较高抗性，为几丁质酶在生物工程中的研究奠定基础。随着研究的深入，[40-44]chi基因相继的转化到大豆、小麦、棉花、烟草、野生蕉等植物中，刘伟华等将chi基因转化到小麦受体中，转化技术得到的植株通过实验发现其对白粉病的发病得到一定控制。程红梅等将几丁质酶基因转入到棉花中，转化棉花对抗黄萎病的抗性有所提高，对抗枯萎病抗性明显提高。1.3双价抗病基因进展随着转基因技术的发展，将多个基因转入到受体中得到更多的关注，多个基因的优势也得到体现。郭玉双将chi和RIPs双价基因导入大豆中，转化植株对疫霉根腐病等级由感[45]病提高到抗病。宋阳将NPR1和hrpZpsg12双价基因导入大豆中，转化植株对疫霉根腐[46]病和灰斑病抗病等级均由感病到中抗。黄钰将几chi和β-1，3-葡聚糖酶双价基因转化[47]到玉米中，转化玉米抗立枯丝核菌的能力得到明显的提高。张昕将chi和葡聚糖酶双价基因转化到棉花中，转化植株抗枯萎病和黄萎病的能力显著提升，同时对铃病和叶斑病的[48]抗性级别也得到提升。以上导入双价抗病基因的植株均抗真菌病害有所提升。1.5转化基因株系后代检测自从1983年首例转化植株在美国得到以来，生物技术得到迅猛的前进，近些年来，生物技术的提高和使用更多的改变和影响人类生活以及对社会的推动作用。生物技术在[49]农业、医学等领域更多使用，通过生物技术培育出来的品种在各方面都取得效果。利8 用转基因不仅可以缩短育种年限，同时还可以使基因之间相互交流，克服不同物种之间[50]的生殖隔离，更有利于推动物种的进化。正直如此，人们把以转化技术作为中心的分[51]子生物技术称为又一次“绿色革命”。当外源基因导入到受体植株中后，其在基因组整合情况、在不同组织中的表达量和[52]遗传稳定性都是比较关注的研究内容。本实验通过初级PCR检测3个株系的遗传稳定，通过Southernblot杂交检测双价抗病基因在株系基因组中的整合情况以及拷贝数，进一步验证其遗传稳定性，利用qRT-PCR检测双价抗病基因在株系不同组织中的表达量，同时本实验利用下胚轴侵染法鉴定转双价基因株系对大豆根腐病的抗病能力。1.5.1PCR检测sikid等在1985年建立了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)，是指以母链DNA为模板，经过高温热变性处理使DNA双链打开，加入特异引物，在DNA聚合酶的催化下，经过低温退火和适温延伸等相关反应，使单链复制成双链，经过PCR扩增后的产物经凝胶电泳进行检测，通过与目的基因片段大小来检测双价抗病基因在后代[43-55]株系中是否遗传。虽然PCR技术具有灵敏、快捷、特异、方便等诸多优点，但其灵敏度过高从而导致假阳性的出现，检测过程中也容易受到污染，所以我们常利用PCR技[56-58]术对转基因株系进行初级的筛选，通过其他的检测技术来加以验证。1.5.2Southernblot杂交检测1975年Southernblot杂交由英国人E.M.Southern等创建，该技术成为检测特定DNA[59]片段最权威的方法之一。该检测技术使用尼龙膜或硝酸纤维素膜能够收集DNA的作用，把经过酶切过的基因组通过吸附功能将DNA条带收集到膜上，让同位素标记探针与DNA之间进行杂交，之后使用放射自影技术查看杂交结果，然后得到外源基因在基因组中的整合[60]情况和拷贝数。Southernblot杂交技术具有灵敏度高，特异性强，可以辨别基因是否扩增重组与特变等，在外源基因检测、遗传病的诊断和DNA图谱分析等多个领域中等到广泛应用。随着Southernblot杂交方法的不断完善和成熟，其在遗传育种和基因工程基础研[61]究中被应用。1.5.3qRT-PCR检测技术自从聚合酶链式反应问世以来，人们实现了体外无限扩增目的片段的愿望，但是在进[62]行检测时，常规PCR技术不能准确定量，使其应用受到了很大限制。1992年Higuchi率先提出qRT-PCR的想法，之后到1995年美国PE公司通过研究得到极具影响的qRT-PCR技术，不仅继承了PCR高度灵敏性、DNA杂交高度特异性和光谱技术高度精确定量这些优势，又巧妙的把这些整合在一起，同时其操作简便，由于其动力学范围很大，所以较广的浓度范围能都可以进行定量，不光能做定量分析又能做定性分析，在同9 一反应系统中通过不同的特异引物可以对多个靶基因实行体外扩增，这个扩增和实时测定[63-64]的体系为封闭的，所以使受污染的可能性大大下降且扩增后无须再进行操作。1.5.4生物学功能验证本实验生物学功能验证即为抗病性鉴定，通过人工模拟病原菌侵染植株条件进行实验。通过分子水平检测之后，我们需要进行抗病性鉴定在实践中来验证hrpZpsta和chi双价抗病基因能否在后代株系中表现出我们需要的目标性状，这也是转化株系在检测水平上面最具说服力的方法之一，也是对转化株系的最终检验，看hrpZpsta和chi双价抗病基因能否真正赋予株系光谱抗病性。本实验利用下胚轴侵染法进针对大豆根腐病对转基因株系实施人工接菌，保证病原菌侵染的最适温度和湿度，进行多次重复，尽可能避免实验误差影响实验结果的准确性，一定时间对发病情况进行调查，并且对实验结果进行统计与分析，通过抗病结果与先前分子检测结果之间的关系，为培育新的优良大豆品种提供实验依据。10 第二章研究内容近年来，虽然我国大豆产量呈现波动性增长趋势，但过多还是依赖进口，造成如此现状大豆病害对大豆产量的减产是首要原因。为防止病害，人们开始大量使用化学试剂和生物防治来防治大豆病害，但是这样的做法不仅造成环境污染而且还造成食品安全问题，使人们的生活饮食带来了更多的危害。如何才能更安全高效的防治大豆病害的发生成为我们重中之重的问题。为选育抗病性强的大豆品系，本实验室在前期工作中，通过农杆菌介导法与花粉管通道法将hrpZpsta和chi双价抗病基因农艺形状较好、产量较高的大豆高世代品系种，经过加代获得了T1、T2代株系，且经验证hrpZpsta和chi双价抗病基因在T1、T2代株系中稳定遗传。本实验以T3、T4代株系为试验材料，通过初级PCR、Southernblot和qRT-PCR分子检测手段分析双价抗病基因在株系基因组的遗传稳定性、整合情况和不同组织中的表达量，通过抗疫霉根腐病实验来验证转双价抗病基因株系抗病能力是否提高，从而为培育新的大豆抗病品种提供参考。2.1试验材料2.1.1菌株重组表达载体pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta由本实验室提供的。2.1.2材料以农艺性状较好、产量较高的大豆高世代品系为受体，将重组表达载体pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta导入受体中，通过选育得到3个T3、T4代株系T2003-23-11（株系1）、T2004-28-321（株系2）、T2004-30-384（株系3），由本实验室提供。2.1.3试剂及药品植物DNA基因提取试剂盒；Fermentas公司出产的PCR分子检测试剂；Roche公司出产的DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit；Amersham公司出产的硝酸纤维素膜；TaKaRa公司出产RNAisoPlus试剂盒、SYBRPremixExTaqTM、Prime-ScriptTMRTMasterMix、RNAiso-mateforPlantTissue；V-gene公司出产的DNAGeLExtractionKit凝胶回收试剂盒试剂：公司出产的Maleicacid、RNase。2.1.4主要仪器与设备11 灭菌锅、超级工作台、PCR仪；电泳仪、凝胶成像仪、高速离心机、摇床、烘干箱、杂交仪、qRT-PCR仪、人工气候室等。2.1.5PCR特异性引物利用软件PrimerPremier5.0设计目的基因hrpZPsta（1026bp）、chi（816）、标记基因Bar(442bp)、启动子35S(500bp)和终止子NOS（250bp）的引物序列。选择TUB4（Genbankno:EV263740）基因为qRT-PCR实验的内参基因，同样设计TUB4基因和hrpZPsta和chi基因引物（见表2-1），上述引物由北京三博远志生物公司提供。表2-1引物序列Tab.2-1Premiersequence引物名称引物序列(5＇→3＇)hrpZPstaSGGGAGATCTATGCAGAGTCTCAGTCTTAAChrpZPstaASTTGGGTTACCTCAGGCAGCAGCCTGGTTGCchiSATGGGAAACAAATTGGTGTTAGchiASTTAGCAAGTGAGATTATCACCGbarSAAGTCCAGCTGCCAGAAACCbarASCTGCACCATCGTCAACCACTACA35STAGAGGACCTAACAGAAC35ASCCGTGTTCTCTCCAAATGNOSSAGATTGAATCCTGTTGCCNOSASCCCGATCTAGTAACATAGQTUB4GGCGTCCACATTCATTGGAQATUB4CCGGTGTACCAATGCAAGAAQHrpzPstaGACTTGATGACACAGGTGQAHrpzPstaACCATTGGAATTGCTGTT2.2转基因株系hrpZPsta基因PCR检测常规PCR检测要有目的基因的阳性质粒作为参照，所以我们从保留的菌液中提取阳性质粒，为确保后续实验避免质量丢失，首先对质粒进行验证，通过扩增来验证重组表达载体pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta。2.2.1.质粒DNA提取和PCR扩增步骤如下：A.收菌：收集6mL在36℃、190-230rpm摇床整夜的培养，装入2mL的已灭离心管中，12500rpm室温环境下离心2min，如果菌液过多可分几次离心，使其存在于同一离心管中，去掉上清，充分沉淀菌体。B.重悬：向上述离心管中加入重悬液200μLBufferP1，反复吸打菌体沉淀，使絮状12 物不在有。C.裂解：向重悬液中加入200μL裂解液BufferP2，完全混合，室温环境下静放2-4min，让菌液能够充分裂解，但裂解时间不宜过长。D.中和：向裂解液加入300μLBufferP3，完全混合，直到白色絮状物出来，在常温静放5min，12500rmp高速离心9min。E.柱平衡：这一步可以灵活的在以上过程中准备，向新套管离心柱上加入200μL平衡液BufferPE，在离心机中12500rmp离心1-2min，然后把管内的溶液去除，放置于室温备用。F.DNA结合：把中和离心后的上清液吸至新制备的套管内，切勿将沉淀吸上来，然后再次于12100rmp高速离心2-3min，倒掉套管中的溶液。G.清洗：向离心柱上加入600μL洗涤液BufferPWT，12500rmp离心2-3min，去除溶液，然后把离心柱再次放入原套管中。H.再清洗：向离心柱中加入700μL洗涤液BufferPW，12500rmp离心2-3min，去除废液。然后放入离心机中12500rmp空甩2-3min，尽可能去除离心柱的液体。I.DNA洗脱：取出空甩后的套管，将其转移至新的1.5mL离心管中，向柱中硅胶模上加入80μL洗脱液ElutionBuffer，注意勿将枪头触碰硅胶膜，常温静放3-4min后，再12500rpm离心2min，离心后溶液即为高纯度的质粒DNA，放-20℃储存使用。2.2.2大豆基因组DNA的提取及扩增利用试剂盒提取3个株系的基因组DNA，并对其扩增，初步检测hrpZPsta和chi双价抗病基因。步骤如下：A.取3个株系幼嫩组织约90-110mg或干重组织约18-20mg，倒入液氮后立即研磨。B.将研磨后物体迅速地放入自备的离心管中，加入400μLBufferLP1和7μLRNaseA，放在振荡器上振荡2-3分钟，在常温静放12分钟，让其能充分裂解。C.加入130μLBufferLP2，使其混匀，再振荡1-2分钟。D.12500rpm离心6min，把上清液吸取到新自备的离心管中。E.加入1.5倍上清液体积的BufferLP3（事先已按说明加入无水乙醇），充分混匀。F.把上步管中的溶液转移至收集管的吸附柱中，如溶液过多分多次转移，12500rpm离心2-3分钟，去除管内液体，把吸附柱再次放入其中。G.往吸附柱上加入700μLBufferGW（事先已按说明加入无水乙醇），12500rpm离心2-3分钟，去除管中溶液，把吸附柱再次放入其中。H.重复步骤G。I.12500rpm离心6分钟，再次去除管中溶液，把吸附柱放在室温晾干。J.把风干的吸附柱放置于新的离心管中，向吸附膜上面悬滴75μLBufferGE（切勿碰到13 吸附膜），室温静止4-5分钟，125000rpm离心3分钟，把离心后的DNA溶液，-20℃储存。以大豆株系基因组和重组质粒为模板，和目标基因hrpZPsta和chi、标记基因Bar、启动子35S和终止子NOS的引物，按照下表反应条件和体系（表2-2），分别进行PCR扩增，其中把大豆受体基因组作为阴性对照，重组质粒作为阳性对照。扩增后得到的产物通过电泳进行分离鉴定。表2-2PCR反应体系和条件Tab.2-2PCRreactionsystemandconditions基因反应体系反应条件Mix：13μL，引物各1μL，94℃预变性5min;94℃变性40s;hrpZPsta基因组2μL，无菌水补齐55℃退火40s;72℃延伸40s，至25μL。35个循环;72℃延伸8minMix：13L，引物各1μL，94℃预变性5min;94℃变性40s;chi基因组2μL，无菌水补齐56℃退火40s;72℃延伸40s，至25μL。30个循环;72℃延伸8minMix：13μL，引物各1μL，94℃预变性5min;94℃变性40s;Bar基因组2μL，无菌水补齐56℃退火40s;72℃延伸40s，至25μL。30个循环;72℃延伸8minMix：13μL，引物各1μL，94℃预变性5min;94℃变性40s;35S基因组2μL，无菌水补齐48℃退火40s;72℃延伸40s，至25μL。30个循环;72℃延伸8minMix：13μL，引物各1μL，94℃预变性5min;94℃变性40s;NOS基因组2μL，无菌水补齐48℃退火40s;72℃延伸40s，至25μL。30个循环;72℃延伸8min2.2.3凝胶回收步骤如下：（1）把特异条带处的凝胶在紫外灯下切下，把表明液体处理干净后放至1.5mL离心管（提前称取空管重量）,再称一遍放入后离心管重量，计算切下后的凝胶重量，当作凝胶体积（如100mg=100μL）。（2）加入三倍凝胶体积BufferDE-A，然后水浴75℃加热至凝胶完全化解。（3）加入0.5倍BufferDE-A体积的BufferDE-B，充分混匀，将混合后的液体转移至离心柱内，放入套管13300rpm离心2-4min，倒去溶液，重新放入；（4）向离心柱中加入500μLBufferW1，12500rpm离心2min，去除废液；14 （5）再次往离心柱中加入600μLBufferW2洗涤一次，12500rpm离心2min后去除溶液，再放入离心机空转离心4min，将离心柱取出晾干；（6）往晾干后的离心柱放一个新1.5mL离心管中，向制备膜上面处加25-30μLElutionBuffer，常温静放3min，再12500rpm离心2-3min，把离心后的溶液保存于-20℃备用。2.3转基因大豆Southernblot检测将初级PCR检测后的阳性株系在整合水平上进行检测，验证抗病基因的整合情况和拷贝数，判断hrpZPsta和chi双价抗病基因能否在转化株系后代中稳定遗传。按照杂交试剂盒的说明方法进行Southernblot检测。2.3.1大量提取转化株系基因组DNA（CTAB法）A.把称好的1.3g左右新鲜叶片放在已灭的研钵中，加入液氮，用研棒把叶片研磨至粉末状，把粉末放入到已灭的50mL大离心管内，加入6mL66℃预热过的CTAB提取液和0.03gPVP，小心颠倒离心管让其混合。放到66℃水浴锅中32min，如果可以10min轻混一次，使其混合更充分。B.在天平上将装有溶液的大离心管配平，4℃条件下，12500rmp离心17min，把上清液小心地转移至新的空50mL离心管中，加入相同体积氯仿/异戊醇混合液体（24:1比例配制），慢慢颠倒轻混，静止11min后，12500rmp离心14min。C.把上清液抽取至新的空50mL离心管，相同体积的苯酚/氯仿/异戊醇的液体(按比例25:24:l)，上清再吸取到50mL离心管中，拿氯仿/异戊醇液体(配比为24:1)进行纯化。加入2倍体积无水乙醇、1/10体积冷处理的3MNaAC，充分混匀,-20℃沉淀3h。D.静置后5℃条件下l3300rpm离心12min，去除上清液，保留沉淀，将沉淀DNA用75%乙醇洗涤两次，。E.向试管中加入300μLRE缓冲液，使沉淀充分溶解，再加2μLRNA酶，37℃孵育2-3h。F.将回溶液吸到新1.5mL离心管中，用TE缓冲液使总体积增大至700μL，再加入相同体积氯仿/异戊醇（24:1配置），进行抽提。G.把抽提后上清液吸到新1.5mL离心管中，加入2倍体积冷处理的无水乙醇、1/10体积冷处理的3MNaAC，-20℃再次沉淀3h。之后4℃环境下12500rpm低温离心17min，除去上清，用75%乙醇充分清洗沉淀，然后晾干。H.最后根据实验需要加入TE缓冲液回溶沉淀，保存于-20℃储存。2.3.2Southernblot杂交溶液的配制A.变性液：称取87.65gNaCl固体，20.10gNaOH固体，用已灭的ddH2O分别溶解，15 等其解后再将两溶液在锥形瓶中混合，加ddH2O定容至1L，灭菌之后储存使用。B.中和液：称取87.65gNaCl固体，60.58gTris·HCl固体，使已灭的双蒸水溶解，用磁力搅拌器使其混匀，调溶液PH值为7.0，加ddH2O定容至1L，灭菌后储存使用。C.20×SSC溶液：称量175.33gNaCl固体，用适量已灭的双蒸水溶解，再称取88.25g柠檬酸钠固体放入NaCl溶液中，待其完全溶解后调节pH为7.0，加ddH2O定容至1L，灭菌后放置备用。D.6×SSC溶液：用量筒量取15ml已灭菌的20×SSC溶液，然后加入35mL已灭双蒸水均匀混合后，在容量瓶中定容至50mL放置备用。E.Maleicacidbuffer：称取5.82g马来酸固体，放入三角瓶中用已灭双蒸水将其溶解，再称取4.39gNaCl固体，在三角瓶中用已灭双蒸水溶解，然后将两溶液充分混匀，用NaOH溶液调节pH值至7.5，定容到500mL，放置常温下放着使用。F.Washingbuffer：称取5.85g马来酸固体，放入三角瓶中并用已灭双蒸水溶解，再称取4.4gNaCl固体，拿已灭的ddH2O混合，然后将两溶液充分混合，用NaOH溶液调节pH值至7.5，定容后加入1.5mlTween20到500mL，在常温下放着使用。G.Detectionbuffer：称取2.938gNaCl固体，在三角瓶中用已灭双蒸水溶解，再称取6.067gTris·HCl固体，用已灭双蒸水溶解，然后将两溶液充分混匀，调节pH值至9.5，定容到500mL，在常温下保存备用。H.洗膜液I：先量取50mL20×SSC溶液，再吸上2.5mL20%SDS溶液，用已灭ddH2O定容到500mL，现用现配。I.洗膜液II：先吸取2.5ml20×SSC溶液，再吸取2.5mL20%SDS溶液，拿已灭ddH2O定容到500mL，现用现配。J.抗体液：将-20℃条件下保存的试剂盒中的瓶4取出并在4℃12600rpm低温条件下离心2-3min，，小心地吸取上清，anti-DIG_AP溶液将按照5000:1的比例用blockingbuffer稀释，放置常温备用。2.3.3Southernblot杂交操作方法1）酶切反应将大量提取后的基因组DNA样品进行单酶切处理，用酶使其切成大小不同片段并用作杂交分析，本实验利用限制性内切酶HindⅢ来酶切基因组，按照酶切体系：20μL株系基因组；4μL限制性内切酶HindⅢ；4μL10×HindⅢBuffer；用无菌水补至40μL；在37℃环境下进行整夜酶切反应。2）电泳分离利用小板制备浓度为0.8%的琼脂糖凝胶（不加EB）进行酶切和转膜，利用另一个小板浓度为1%的琼脂糖凝胶（加EB）用于查看酶切效果，等胶凝固后，按顺序点入酶切样16 品，30V、50mA电泳分离3-4h，等溴酚蓝指示剂走到胶的2/3处时停止电泳即可。3）转膜A、变性与中和：将酶切后的0.8%凝胶轻轻放入已灭的搪瓷盘中，往盘中倒入变性液，液体没过胶面即可，放在脱色摇床上适当速度晃摇1.5h，在这过程中每20分钟时换新的变性液。当变性处理完成后倒掉变性液，用无菌水冲洗凝胶表面两次，倒去无菌水，再向瓷盘中加入碱中和液没过胶表面，在摇床上继续适当速度晃动1h，之间20分钟换一次中和液；B、搭建盐桥：将已灭的长方形玻璃板横放置在装有20×SSC溶液的搪瓷盘上面，把两张被20×SSC溶液全部浸湿的干净滤纸垂直平铺在玻璃板上，并把滤纸和玻璃板间的气泡全部赶出，同时把滤纸的两头都浸泡在盘内20×SSC溶液中；C、转膜：将中和处理后的胶块用已灭双蒸水小心冲洗3-4次，把其倒扣在上一步搭好的盐桥滤纸上，点样口朝上，把凝胶和滤纸之间的气泡赶出，拿保鲜膜逐次将胶四周封好。再裁取胶块大小的硝酸纤维素膜置于已灭双蒸水中，再放入20×SSC溶液中侵泡7min，将其取出后小心贴附在凝胶上，保证一次性放好以避免移动调整，小心将二者之间的气泡赶出，然后拿两张大小一样且在20×SSC溶液中浸泡过的滤纸平铺在膜上，再拿足够的吸水纸放在滤纸上面，用玻璃板和500g重物压好，常温下20h左右过夜转膜，期间注意观察吸水纸的情况以便随时更换新吸水纸，保持较好的吸附效率来达到更佳的转膜效果。4）探针的制备及标记A.以重组表达载体pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta为模板进行目的片段扩增，1%琼脂糖电泳进行分离并将扩增条带产物回收。B.取16μL回收产物加入到已灭菌的微量离心管中，并用封口膜将其封好后放在沸水浴中热处理12min，将DNA双链解旋。C.取出微量离心管马上放在碎冰上冷处理3min，使其稳定在单链状态，同时将放在-20℃下的试剂盒中的瓶1取出，向已解旋为单链的回收产物中加入4μL，慢慢混匀，37℃条件下反应20h。D.反应完成后进行65℃、10min热处理终止反应。E.等反应结束，往产物中加入1/10体积3MNaAc、1/10体积5MLiCl和2倍体积冷处理的无水乙醇，混匀后在-20℃、2-3h醇沉。F.醇沉反应后，将探针在4℃低温下，12500rpm离心16mim，去除上清液后用75%乙醇洗涤沉淀。G.沉淀后晾干，然后用20μL已灭双蒸水回溶沉淀，获得探针在-20℃储存使用。5）杂交A、干燥：当转膜完成，将硝酸纤维素膜从胶上小心分离开，放在充足的6×SSC溶液中，轻摇使碎块从膜上掉下来，将放在两张适当大小干净滤纸中，然后用锡箔纸包裹，17 放在80℃烘箱内持续烘干1-2h，让膜与单链结合更加紧密，期间观察膜烘干情况。B、预杂交：将烘干的膜小心取出放到已灭且干燥的杂交瓶中央，避免折叠，然后加8-10mL42℃预热过的杂交液瓶7，从膜的另一侧加溶液，轻轻地转动杂交瓶使杂交液慢慢浸湿杂交膜，避免二者之间出现气泡，放在之前已经预热过的杂交炉中42℃预杂交2h。C、杂交：预杂交完成后，把制备的探针放在沸水浴中热处理4-6min后，马上放在冰上冷处理2-3min，然后吸取4-6μL探针加到杂交液中，再补加4-5mL杂交液，杂交炉加温至50℃杂交17h以上。6）洗膜和显色A、洗膜：杂交结束后去除杂交液，往瓶中加入适量洗膜液I，在室温下轻轻手转杂交瓶5-6min洗涤杂交膜，去除洗膜液I，再加入洗膜液I重复洗涤，加入加热过65℃的洗膜液II，在66℃杂交炉中旋转洗膜15min，去除洗膜液II，再加入洗膜液II放进68℃杂交炉中旋转洗膜15min。然后在WashingBuffer溶液中清洗6-8min；B、封闭：将融化好的瓶6溶液与MaleicAcidBuffer按比例配制成1×BlockingSolution，然后将膜放溶液中封闭30min，然后在新配制的1×BlockingSolution中按1/5000比例加入anti-DIG-AP，将膜放溶液中继续封闭半个小时。等封闭结束后，将膜放入WashingBuffer中，在摇床上摇动洗涤两次，每次16min；C、平衡：洗膜后，将膜置于DelectionBuffer中平衡5-6min；D、显色：将杂交试剂盒中的NBT/BCIPstocksolution（瓶5）与DelectionBuffer按1:50比例配成显色液，全部混匀后将膜放入，在避光条件下显色，期间不要摇动，随时观察结果且记录保存。2.4转基因株系qRT-PCR检测利用TaKaRa公司生产RNAisoPlus试剂盒分别提取T3、T4代转化株系1、2、3中经PCR检测的阳性植株和对照受体植株的叶、根、籽粒、茎中的总RNA，同时利用核酸蛋TM白检测仪对其浓度进行测定；把提取的总RNA为模板，利用PrimeScriptRTMasterMixTM反转录试剂盒把总的RNA反转录为相应的cDNA；利用SYBR®PremixExTaq试剂盒对反转录上cDNA分别进行qRT-PCR扩增检测。2.4.1株系幼嫩组织总RNA的提取在提取RNA试验中要用到离心管、枪头等，这些需在配制成的0.1%DEPC水溶液中浸泡10h以上，然后经高温高压灭菌且烘干，才能使用。具体步骤：A.取株系测定部位幼嫩组织约1.2g放入研钵内，加入液氮后开始研磨，反复研磨使样品成粉末状，期间反复地加入液氮，最后用药匙把研磨后的固体装入已灭的1.5ml离心管中。18 B.马上加入1000uL经冷处理的RNAisoReagent试剂溶液，把离心管放在漩涡振荡器上充分振荡约2min，然后在室温静放13min。C.4℃、12500rpm，低温环境下离心15min，把上清吸入至另准备1.5mL离心管中，加1/5溶液体积的RNAisoplus，即200μL氯仿，再次充分振荡使其完全混匀，室温静止6min。D.4℃、12500rpm，低温条件下离心20min，把上清液吸入至另一1.5mL离心管中，加入相同体积异丙醇，小心翻转轻混，在常温条件下静放13min。E.4℃、12500rpm，低温离心15min，去除上清，加入1ml75%乙醇（由250μL的DEPC水和750μL无水乙醇配成）洗涤沉淀，在4℃低温条件、12500rmp离心12min。F.去除上清，保留沉淀，等其干燥后进行RNA的纯化。G.RNA纯化先用43µLDEPC水将沉淀回溶，然后加1µLRNaserihibitor，5µL10×DNaseBuffer和1uLDNase，形成50µL的反应体系，放在37℃恒温下孵育60min.H.孵育结束后，加50μL体积DEPC水将体积增加到100μL，加入150μL酚：氯仿（25:24比例配制）小心颠倒混匀，在常温环境下静放3-4min。I.4℃、12500rmp低温条件下离心17min，将上清吸取至另一1.5mL离心管中，加1/10体积冷处理的3MNaAc溶液，1μLDNAmate以及2.5倍体积倍经冷处理的无水乙醇，颠倒混匀，在-20℃条件下醇沉1-2h。J.醇沉结束后，4℃、12500rpm低温条件下，离心18min，加75%乙醇洗涤沉淀，12500rmp离心13min，去除上清液，等沉淀晾干后用20μLRNAFree水回溶沉淀，且测定其RNA浓度。2.4.2cDNA的合成cDNA合成体系(10μL)：2-3uL纯化RNA，2uLMasterMix，用无菌水补至10μL。反应条件：37℃反应45min，再84℃热处理5s即可，4℃保存备用。2.4.3qRT-PCR扩增○R扩增反应体系（20µL）：2μLcDNA模板（2mg/μL）、10µLSYBRGreenRealtimePCRMasterMix、分别加0.4μL引物（20umol/L）和7.2μL双蒸水，各个样本及其对照受体的mRNA均重复4次检测。扩增条件为：95℃下预变性30s；95℃下变性5s，55℃退火下-△△Ct30s，72°C延伸下30s，40个循环。然后通过相对定量中的2法进行定量结果的计算。－ΔΔCt最终计算公式：①改变的倍数（foldchange）＝2；②ΔΔCt＝（Ct靶基因－Ct内参）实验组－（Ct靶基因－Ct内参）对照组。2.5转化大豆抗病性鉴定首先对所用菌种进行扩增培养，在接菌时期利用下胚轴侵染对T4代转化株系分别进19 行人工接菌，在温度较高湿度较大条件下进行侵染，调查统计株系的发病情况。2.5.1菌种的培养和保存利用V8蔬菜汁固体培养基对大豆根腐病的病原物接种体进行培养，培养基配制配方：200mLV8蔬菜汁+20g琼脂+3g碳酸钙，拿双重水定容至1000mL，让入灭菌锅中灭菌，将其取出倒入玻璃平皿中，等培养基彻底凝固后，便可用于培养。2.5.1.1大豆疫霉根腐病接种方法将大豆疫霉根腐病病菌PmC-1用经已灭的接种铲放在V8固体培养基表面，在超净工作台中完成整个操作过程，使接菌过程在无菌条件下进行。接种完成后，用封口膜将培养皿封好，放在28℃培养箱中培养，大约一周左右观察病菌生长情况确定接菌时间。大豆疫霉根腐病菌培养基在4℃条件下保存，每半年培养一次，保证病原菌活力，若病原菌致病力下降需重新进行接菌保证其致病力。2.5.2接菌方法2.5.2.1大豆疫霉根腐病接菌方法使用“下胚轴侵染法”对大豆株系进行抗根腐病接菌实验，选择大豆植系生长初期对其进行侵染，因为此时疫霉根腐病菌对大豆植系侵染最合适，即为对生真叶完全平展时期[65]。用已灭的刀片将生长较好的菌体培养基切成大约0.5cm×0.7cm大小的菌斑块儿，再使用刀片在大豆子叶节下方大约1cm处划一道伤口，让伤口方向呈斜面向下，一般伤口[66]深度不超过大豆1/3茎粗，当刚看到液体流出时的伤口深度为最适宜。将割好的菌斑块儿取出，小心嵌入伤口斜面处，保证带有菌体一侧向内侧，慢慢按压伤口外侧豆茎，使菌块固定。将接菌后的株系放入塑料大棚中，在接菌后的七天当中，对伤口保持温度湿度，[67]温度在25℃左右，湿度在90%以上2.5.2.2病情调查和统计分析5天后对接菌大豆根腐病的株系进行调查，观察转化株系和对照受体的发病情况，统计死亡率并且记录。转化株系和对照受体死亡率低于30%抗病等级为抗病；死亡率处于[68]31%-69%之间抗病等级为中抗；植株死亡率70%以上抗病等级则为感病，具体抗性标准见表2-3。20 第三章结果与分析3.1转基因株系PCR检测3.1.1hrpZPsta基因PCR检测提取T3、T4代大豆转化株系1、2、3的基因组DNA，按上述反应条件对目的基因hrpZPsta进行PCR扩增检测，选用pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta重组质粒当作阳性对照，非转化的对照受体为阴性对照，扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳分离得到结果图3.1所示结果，T3代株系1、2、3均在阳性对照1028bp和816bp位置相同处出现特异性条带,同时我们对株系的筛选标记Bar基因、启动子35S和终止子NOS和分别进行PCR检测，均在阳性对照大小一致出现相应的的特异条带，分别为500bp的启动子35S、192bp的终止子NOS、552bp的筛选标记Bar基因。如图3.2所示为T4代株系hrpZpsta和chi基因、筛选标记Bar基因、启动子35S和终止子NOS的PCR扩增结果，也均在阳性对照大小一致出现相应的的特异条带，由此可以证明hrpZPsta和chi双价抗病基因已存在T3、T4代转化株系中，整个表达元件已在大豆株系中稳定遗传。图3.1T3代转化株系PCR检测A.hrpZpsta基因；B.chi基因；C.bar；D.35SE.NOS注：M:标注DNADL-2000；1:阳性对照；2:阴性对照；3：水；4-6:T3株系1；7-9:T3株系2；10-12：T3株系3Fig3.1PCRdetectionofT3transformationstrainsA.hrpZpstagene；B.chigene；C.bar；D.35SE.NOSNote：M:DNAMarkerDL-2000；1:Positivecontrol；2:Negativecontrol；3：H2O；4-6:T3strain1；7-9:T3strain2；10-12：T3strain321 图3.2T4代转基因株系PCR检测A.hrpZpsta基因；B.chi基因；C.bar；D.35SE.NOS注：M:标注DNADL-2000；1:阳性对照；2:阴性对照；3：水；4-6:T4株系1；7-9:T4株系2；10-12：T4株系3Fig3.2PCRdetectionofT4transformationstrainsA.hrpZpstagene；B.chigene；C.bar；D.35SE.NOSNote：M:DNAMarkerDL-2000；1:Positivecontrol；2:Negativecontrol；3：H2O；4-6:T4strain1；7-9:T4strain2；10-12：T4strain33.2转基因大豆Southernblot检测分别大量提取经PCR检测为阳性的T3、T4代株系1、2、3的基因组DNA，选用pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta重组质粒当作阳性对照，非转化的对照受体当为阴性对照，利用限制性内切酶HindⅢ对基因组进行酶切，酶切过后的产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后通过转膜、预杂交、杂交、洗膜和显色等步骤，以目的片段探针，通过碱基互补配对原则来进行Southernblot杂交,检测hrpZpsta和chi双价抗病基因在株系基因组中的整合情况以及拷贝数。如图3.3所示2号泳道无杂交信号为未转化对照，4、5、6泳道均产生杂交信号，4号泳道株系1阳性植株酶切基因组，5号泳道株系2阳性植株酶切基因组，6号泳道株系3阳性植株酶切基因组，证明hrpZpsta基因已经稳定整合在T3代转基因植株基因组中，杂交位点不同说明整合位点不同而且都为多拷贝。如图3.4所示2号泳道无杂交信号为非转基因对照，4、5、6泳道均产生杂交信号，4号泳道株系1阳性植株酶切基因组、5号泳道株系2阳性植株酶切基因组、6号泳道株系3阳性植株酶切基因组均产生杂交信号，证22 明chi基因已经稳定整合在T3代转基因植株基因组中，杂交位点不同说明整合位点不同而且都为单拷贝。如图3.5所示2号泳道无杂交信号为未转化对照，4、5、6泳道均产生杂交信号，4号泳道株系1阳性植株酶切基因组，5号泳道株系2阳性植株酶切基因组，6号泳道株系3阳性植株酶切基因组，证明hrpZpsta基因已经稳定整合在T3代转基因植株基因组中，杂交位点不同说明整合位点不同而且都为多拷贝。如图3.6所示2号泳道无杂交信号为非转基因对照，4、5、6泳道均产生杂交信号，4号泳道株系1阳性植株酶切基因组、5号泳道株系2阳性植株酶切基因组、6号泳道株系3阳性植株酶切基因组均产生杂交信号，证明chi基因已经稳定整合在T3代转基因植株基因组中，杂交位点不同说明整合位点不同而且都为单拷贝。图3.3T3代转基因株系hrpZpsta基因Southern图3.4T3代转基因株系chi基因Southernblotblot检测检测图3.3T3代转基因株系hrpZpsta基因M:标注DNADL-20001：阳性对照；2：阴性M:标注DNADL-20001：阳性对照；2：阴性Southernblot检测对照；3:株系1；4：株系2；5：株系3；对照；3:株系1；4：株系2；5：株系3；M:标注DNADL-20001：阳性对照；2：阴Figure3.3SouthernblotdetectionforhrpZpstaFigure3.3Southernblotdetectionforchigene性对照；3:株系1；4：株系2；5：株系3；Figure3.3SouthernblotdetectionforgeneofT3transformationstrainsofT3transformationstrainsM:DNAMarkerDL-2000;1：Positivecontrol;M:DNAMarkerDL-2000;1：Positivecontrol;hrpZpstageneofT3transformationstrains2:Negativecontrol;3:strain1;4:strain2;2:Negativecontrol;3:strain1;4:strain2;1：Positivecontrol;2:Negativecontrol;5:stain3;5:stain3;3-6:T5JL30-187transgenic23 图3.5T4代转基因株系hrpZpsta基因Southern图3.6T4代转基因株系chi基因Southernblot检测blot检测M:标注DNADL-20001：阳性对照；2：阴性M:标注DNADL-20001：阳性对照；2：阴对照；3:株系1；4：株系2；5：株系3；性对照；3:株系1；4：株系2；5：株系3；Figure3.5SouthernblotdetectionforhrpZpstaFigure3.6SouthernblotdetectionforchigenegeneofT4transformationstrainsofT4transformationstrainsM:DNAMarkerDL-2000;1：Positivecontrol;M:DNAMarkerDL-2000;1：Positivecontrol;2:Negativecontrol;3:strain1;4:strain2;2:Negativecontrol;3:strain1;4:strain2;5:stain3;5:stain3;3.3转基因株系qRT-PCR检测经PCR检测结果、Southernblot检测结果证明hrpZpsta和chi双价抗病基因已成功整合在株系基因组中且稳定遗传，利用qRT-PCR检测技术测定双价抗病基因株系的各组织在转录水平上的表达量，分别提取T3、T4代株系1、2、3与未转化对照植株的叶、根、籽TM粒和茎中的总RNA；以提取的总RNA为模板，经TaKaRa生产的PrimeScriptRTMasterMix反转录试剂盒将各组织中的总RNA反转录为相应的cDNA，用cDNA为模板，利用SYBRGreenI作为染色剂，根据反应体系进行qRT-PCR扩增检测。3.3.1hrpZPsta基因在株系叶、根、茎和籽粒中的表达量结果计算得出hrpZPsta基因在T3、T4代株系中的表达量和未转化植株的表达量，如图3.7所示：hrpZpsta基因在T3代株系植株中的叶、根、籽粒和茎中都有表达量，而且在叶中相对表达量都是最高，其中株系1的平均表达量最高（平均值为6.9），株系3的平均表达量居中（平均值为6.2），株系2的平均表达量最低（平均值为5.7）。未转化植株的平均表达量接近为0。其次根中的表达量较高，其中株系1的平均表达量最高（平均值为6.0），株系3的平均表达量居中（平均值为3.7），株系2的平均表达量最低（平均值为2.9）。未转化植株的平均表达量接近为0。在籽粒和茎中的表达量较低，在籽粒中株系1的平均表达量最高（平均值为1.1），株系3的平均表达量居中（平均值为0.7），株系2的平均表达量24 最低（平均值为0.6）。未转化植株的平均表达量接近为0。在茎中株系1的平均表达量最高（平均值为1.2），株系3的平均表达量居中（平均值为0.8），株系2的平均表达量最低（平均值为0.4）。未转化植株的平均表达量接近为0。如图3.8所示：hrpZpsta基因在T4代株系植株中的叶、根、籽粒和茎中都有表达量，而且在叶中相对表达量都是最高，其中株系1的平均表达量最高（平均值为7.2），株系3的平均表达量居中（平均值为6.6），株系2的平均表达量最低（平均值为5.3）。未转化植株的平均表达量接近为0。其次根中的表达量较高，其中株系1的平均表达量最高（平均值为5.7），株系3的平均表达量居中（平均值为3.3），株系2的平均表达量最低（平均值为3.1）。未转化植株的平均表达量接近为0。在籽粒和茎中的表达量较低，在籽粒中株系1的平均表达量最高（平均值为0.9），株系3的平均表达量居中（平均值为0.7），株系2的平均表达量最低（平均值为0.5）。未转化植株的平均表达量接近为0。在茎中株系1的平均表达量最高（平均值为1.0），株系3的平均表达量居中（平均值为0.6），株系2的平均表达量最低（平均值为0.5）。未转化植株的平均表达量接近为0。8876株系1株系1654株系24株系232株系32株系3100图3.7hrpZPsta基因在T3代株系各不同组叶根籽粒茎图3.8叶hrpZ根籽粒茎Psta基因在T4代株系各不同组织相中相对对表达量结果织相中相对对表达量结果Fig.3.7hrpZPstagenerelativeexpressionFig.3.8hrpZPstagenerelativeexpressionresultsindifferenttissuesofT3eachstrainresultsindifferenttissuesofT4eachstrain3.3.2chi基因在株系叶、根、茎和籽粒中的表达量结果-△△Ct将扩增结果的Ct值带入2公式，计算得出chi基因在T3、T4代株系中的表达量和非转化植株的表达量，如图3.9所示：chi基因在T3代株系植株中的叶、根、籽粒和茎中都有表达量，而且在叶中相对表达量都是最高，其中株系1的平均表达量最高（平均值为7.3），株系3的平均表达量居中（平均值为6.7），株系2的平均表达量最低（平均值为4.8）。未转化植株的平均表达量接近为0。其次跟中的表达量较高，其中株系1的平均表达量最25 高（平均值为5.1），株系3的平均表达量居中（平均值为3.7），株系2的平均表达量最低（平均值为3.5）。未转化植株的平均表达量接近为0。在籽粒和茎中的表达量较低，在籽粒中株系1的平均表达量最高（平均值为1.0），株系3的平均表达量居中（平均值为0.6），株系2的平均表达量最低（平均值为0.5）。未转化植株的平均表达量接近为0。在茎中株系1的平均表达量最高（平均值为1.1），株系3的平均表达量居中（平均值为0.6），株系2的平均表达量最低（平均值为0.5）。未转化植株的平均表达量接近为0。如图3.10所示：chi基因在T4代株系植株中的叶、根、籽粒和茎中都有表达量，而且在叶中相对表达量都是最高，其中株系1的平均表达量最高（平均值为7.5），株系3的平均表达量居中（平均值为6.3），株系2的平均表达量最低（平均值为4.6）。未转化植株的平均表达量接近为0。其次跟中的表达量较高，其中株系1的平均表达量最高（平均值为5.4），株系3的平均表达量居中（平均值为4.0），株系2的平均表达量最低（平均值为3.3）。未转化植株的平均表达量接近为0。在籽粒和茎中的表达量较低，在籽粒中株系1的平均表达量最高（平均值为0.8），株系3的平均表达量居中（平均值为0.7），株系2的平均表达量最低（平均值为0.6）。未转化植株的平均表达量接近为0。在茎中株系1的平均表达量最高（平均值为1.2），株系3的平均表达量居中（平均值为0.8），株系2的平均表达量最低（平均值为0.6）。未转化植株的平均表达量接近为0。9108786株系1株系1564株系2株系2.43株系32株系32100叶根籽粒茎叶根籽粒茎图3.9chi基因在T3代株系各不同组织相图3.10chi基因在T4代株系各不同组织中相对对表达量结果相中相对对表达量结果Fig.3.7chigenerelativeexpressionFig.1.0chigenerelativeexpressionresultsindifferenttissuesofT3eachstrainresultsindifferenttissuesofT4eachstrain26 3.4转基因大豆抗病性鉴定3.4.1大豆疫霉根腐病抗病性鉴定结果利用下胚轴侵染法对T4代的株系1、2、3进行人工接菌鉴定其抗疫霉根腐病的能力，对接菌后的株系和未转化植株进行调查，结果图3.11、3.12如下：图3.11T4代转化株系疫霉根腐病接菌鉴定实验注：a:株系1接菌后照片；b:株系2接菌后照片c:株系3接菌后照片；d:非转基因植株接菌后照片Fig.3.11T4generationtransgenicstrainswithphytophthorarootrotInoculationexperimentalidentificationNote：a:strain1photoafterinoculation；b:strain2photoafterinoculationc:strain3photoafterinoculation；d:non-transgenicplantsphotosafterinoculation图3.11T4代转化株系疫霉根腐病接菌鉴定实验注：e:株系1与非转基因植株植株接菌后对比照片f:株系1与非转基因植株植株接菌后对比照片g:株系1与非转基因植株植株接菌后对比照片Fig.3.11T4generationtransgenicstrainswithphytophthorarootrotInoculationexperimentalidentificationNote:e:strain1andnon-transgenicplantsphotosafterinoculation;f:strain2andnon-transgenicplantsphotosafterinoculation;g:strain3andnon-transgenicplantsphotosafterinoculation;27 对接种疫霉根腐病菌后的T4代植株死亡率进行数据统计，表3-1为分别统计后各转化株系与非转化植株多次重复实验的死亡率结果表3-1T4代接种疫霉根腐病菌转化株系死亡率T测验Table3-1T-ExaminationofmortalityrateonT4transgenicstrainsinoculatedwithPhytophthorasojae抗性株系重复1重复2重复3平均数评价株系10000R株系20000R株系30000R非转基因植株20%20%60%33%MR由以上图片可知，三个株系在接疫霉根腐病菌以后均为未出现死亡，在抗病性上得到明显的提高，且植株的生长发育正常，对株系的农艺性状上没有任何影响。从表3-1得出各株系在接疫霉根腐病菌后，转化植株死亡率全都明显低于未转化植株。株系1经过3次重复实验，其平均死亡率为0，比非转化受体的死亡率较低了33%；株系2经过3次重复实验，其平均死亡率为0，比非转基因受体的死亡率较低了33%；株系3经过3次重复实验，其平均死亡率为0，比非转化受体的死亡率较低了33%，通过抗病性评价标准分析表明株系1抗疫霉根腐病的抗性由中抗提高为高抗；株系2抗疫霉根腐病的抗性由中抗提高为高抗；株系3抗疫霉根腐病的抗性由中抗提高为高抗。以上数据表明了hrpZpsta和chi双价抗病基因的导入使株系抗疫霉根腐病的能力得到提高。28 第四章讨论与结论4.1讨论（1）大豆作为一年生的豆科草本植物，因其营养极其丰富，已经成为人们日常饮食中必不可少的食用原料，同时在其他领域也发挥着重要的的作用。在大豆的需求量不断增大的条件下，使大豆的产量不断增加是解决需求问题的最好途径。但近些年来随着病害的不断加重和变化，不仅大豆产量受到了很大的影响，而且品质上面也下降了许多。在这种环境下，大豆研究者和生产者都在通过自己的努力来防止大豆病害给大豆造成的损失，随着科学技术的进步，基因工程技术相应诞生，在其快速发展下人们将此技术应用到抗病育[69-70]种上，发现此方法是控制病害发生最便捷、安全、经济和有效的方式。在利用基因工程技术培育抗病品种的过程中，研究者利用通过农杆菌介导方法将外源基因导入到大豆受体中，得到的转化植株经过检测技术在进一步的确定，为获得遗传稳定的抗病品种提供基础依据。（2）本实验室在前期工作中将hrpZpsta和chi双价抗病基因通过农杆菌介导法和花粉管通道法转化到高世代优良品系种，获得三个具有抗病基因的株系。来自于烟草野火病原菌的hrpZpsta基因能够编码出非特异性激发子Harpin蛋白，诱导植物自身发生过敏性反应（HR），刺激植物产生自然免疫机制，被侵染的组织细胞坏死，病原菌不能侵染其他植物[71]组织，使植株具有广谱抗性。几丁质酶可以降级病原菌细胞壁的重要成分几丁质，当植物受到外源因子病原菌侵染时，植物会产生大量的几丁质酶，从而使病原菌的细胞壁被降[72-73]解，导致真菌病原菌死亡。在前期的查阅文献的过程中却很少看到hrpZpsta和chi双价抗病基因在植物中的转化报道。（3）Southern杂交在转化植株的检测中是最具权威的检测方法之一，在实验过程中取得巨大的应用。随着生物技术的不断发展，外源基因大量导入受体基因组中，外源基因插入方式多样，有单位点插入、不同染色体多位点插入、相同染色体多位点插入等方式。而且插入的拷贝数有单拷贝和多拷贝，所以植物在种植过程中的遗传稳定性越来越值得关注。华志华等对低拷贝的转化植株京引119连续种植，通过对高世代材料进行跟踪表明，[74]转化基因bar和cecropinB能够稳定遗传和表达。li等发现通过农杆菌转化的部分烟草无GUS活性，进一步检测证明，无GUS活性的转化烟草为多拷贝植株，而检测到GUS29 [75]活性的转化烟草为单拷贝植株。Bavage等研究发现插入单拷贝外源基因到白菜中能检[76]测到GUS活性，而插入多拷贝外缘基因却无GUS活性。（4）qRT-PCR检测技术自己问世以来，以其自身的优点更多的应用在海关检验检疫、[77-78]医学诊断、国防军事、基础研究、新型农业等领域。目前尤其在基因工程研究领域十分广泛的应用，而且很多研究者利用qRT-PCR检测技术来测定外源基因的拷贝数。王育花等人利用qRT-PCR检测技术测定8株转基因水稻株系，其中假阳性为1株，单拷贝为1[79]株，2个拷贝数为3株，3、4和7个拷贝数的各一株。杨立桃等人通过qRT-PCR检测技术定量分析了14株T[75]0代转基因水稻植株其中外缘基因的拷贝数为1、2、3和4本实验通过southernblot杂交检测结果和qRT-PCR检测检测结果，初步分析一下拷贝数与表[80]达量之间的关系，为以后二者之间的研究提供参考。（6）双价抗病基因转化株系在分子检测上面进行了一系列的测定，但最终还需在生物学鉴定上面取得效果，那么对于株系的实际抗病效果的实验显突显重要，因此，通过下胚轴亲染法对转化株系进行抗病鉴定更加直观地表现目标性状的抗病效果，作为一个最终检验看能否得到我们想要的性状。而后把分子水平上的检测结果与生物学水平上的鉴定结果相结合，全面的分析外源基因的遗传稳定性、拷贝数、表达量和抗病之间的关系为具有稳定遗传性好、农艺性状良好、抗病能力强的双价抗病基因后续开发提供基础的参考。4.2结论4.2.1转化株系在整合水平上的检测以T3、T4代转化株系为实验材料，经初级PCR检测得知，hrpZpsta和chi双价抗病基因、筛选标记基因Bar基因、启动子35S和终止子NOS均在阳性对照出出现明显的扩增特异性条带。将经初级PCR检测为阳性植株的目标基因在整合水平上进行Southernblot杂交检测，结果表明，hrpZpsta和chi双价抗病基因分别杂交出条带，hrpZpsta基因在转化株系中以多拷贝形式整合在基因组中，chi基因在转化株系中以单拷贝形式整合在基因组中，证明hrpZpsta和chi双价抗病基因成功的整合在转化株系基因组中，而且在转化株系后代植株中稳定遗传。4.2.2转基因株系qRT-PCR检测通过Southernblot杂交检测结果证明hrpZpsta和chi双价抗病基因在后代株系中成功实现整合以后，利用qRT-PCR技术在转录水平上检测T3、T4代各转化株系叶、根、籽粒和茎中目标基因的表达量，结果得到，hrpZpsta和chi双价抗病基因在后代株系各组织中均有表达量，并且叶中的表达量为最高，其次根中的表达量也相对较高，但籽粒和茎中的表达量却较低。双价抗病基因在不同株系间的表达量也不相同，并且在T3、T4两代转化株系30 相同组织中的表达量也有区别，但并不明显。4.2.3转化株系抗病性鉴定利用下胚轴侵染法对T4代转化株系和非转基因植株进行抗病性鉴定，在高温高湿条件接菌之后，观察并统计植株接菌之后的发病情况和死亡率，发现各植株的抗病能力均得到了提高。株系1、2、3对疫霉根腐病的抗病等级也均由中抗提高到高抗，在抗病等级提高的同时，导入外源基因并没有影响各株系的生长发育过程。4.2.4分子学鉴定与生物学鉴定之间关联根据分子学鉴定和生物学鉴定的结果，初步的分析二者之间存在的关联，得知：无论hrpZpsta和chi双价抗病基因是以单拷贝还是多拷贝的形式整合在转化株系的基因组中，都不影响外源基因在后代株系中的遗传稳定性。而且整合形式对各后代株系各组织中的表达量的多少没有影响，均是在叶和根中的表达量高于籽粒和茎中的表达量。其次整合形式对各接疫霉根腐病菌的转化株系的抗病没有影响，各转化株系的抗疫霉根腐病的能力均得到提高，而且不影响各株系的农艺形状和产量。31 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