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《造血干细胞移植后输注受者动员脾细胞对移植物抗宿主病的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号密级公开ＵＤＣ保密期限＿硕士学位论文题目造血干细胞移植后输注受者动员脾细胞对移植物抗宿主病的影响作者姓名王俊辉指导教师郭梅培养单位军事医学科学院附属医院专业名称内科学论文提交日期２０１７年６月１日学位授予单位中国人民解放军军事医学科学院答辩委员会主席沈建良中国人民解放军军事医学科学院制 军事医学科学院学位论文 军事医学科学院学位论文目录缩略词表........................................................................................................................1中文摘要........................................................................................................................3英文摘要........................................................................................................................6前言..............................................................................................................................10第1章MHC半相合小鼠造血干细胞移植GVHD模型的建立....................................121.1材料与方法....................................................................................................121.2实验结果........................................................................................................161.3讨论................................................................................................................241.4结论................................................................................................................25第2章移植后不同时间输注不同剂量的受者脾细胞对GVHD的影响..................262.1材料与方法....................................................................................................262.2实验结果........................................................................................................312.3讨论................................................................................................................462.4结论................................................................................................................48参考文献......................................................................................................................49已发表论著..................................................................................................................52个人简历................................................................................................................65致谢..............................................................................................................................66 军事医学科学院学位论文缩略词表缩略语英文全称中文全称异基因造血干细胞移Allo-HSCTallogeneichematopoieticstemcell植CCcompletechimerism完全嵌合体厘米cmcentimetreDCdonorchimerism供体嵌合（率）DLIdornorlymphocyteinfusion供体淋巴细胞输注FCMflowcytomery流式细胞术FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素ggram克GVHDgraft-versus-hostdisease移植物抗宿主病GVLgraftversusleukemia移植物抗白血病hhour小时Hbhemoglobin血红蛋白HEhematoxylineosin苏木素伊红HVGHostversusgraft宿主抗移植物ILInterleukin白细胞介素minminute分钟mlmililiter毫升MSCmesenchymalstemcell间充质干细胞1 军事医学科学院学位论文缩略语英文全称中文全称NKNaturalkillercell天然杀伤细胞PBMNCperipheralbloodmononuclearcell外周血单个核细胞PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PC5phycoerythrin-Cy5藻红蛋白-花青素PEPhycoerythrin藻红蛋白PLTPlatelet血小板PIpropidiumiodide碘化丙锭recombinanthumangranul-ocytecolony重组人粒细胞集落刺rhG-CSFstimulatingfactor激因子rpmrotateperminute每分钟转数TBITotalbodyirradiation全身性照射TccytotoxicTlymphocyte细胞毒T淋巴细胞ThhelperTlymphocyte辅助性T淋巴细胞TNF-αTumornecrosisfactor-αα-肿瘤坏死因子TregRegulatoryTcell调节T细胞WBCwhitebloodcell白细胞2 军事医学科学院学位论文中文摘要研究目的：造血干细胞移植（hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT）在血液系统恶性疾病和非血液系统疾病中有着广泛应用，但移植后的移植物抗宿主病（GVHD）仍是移植相关死亡的首要原因，限制了其应用。早在1966年Billingham提出了GVHD发病的三个要素：①移植物中含免疫活性细胞；②受体表达供体没有的组织抗原；③受体处于免疫抑制状态不能排斥移植物。大量研究发现，虽然去除移植物中的T细胞或抑制其功能均能使GVHD的发生率或其严重程度降低，但却增加了机会性感染及复发的几率。近几年，具有免疫调节作用的细胞调控GVHD成为新的研究热点，如间充质干细胞、NK细胞、NKT细胞、CD4+CD25+Tregs等，它们通过抑制供者的同种反应性T细胞对非己抗原的免疫攻击，从而使GVHD的发生降低，但是上述细胞的缺点是它们的获得、扩增等均需要特殊的条件及设备，限制了其在临床中广泛应用。另外一些研究报导，受者自身的某些细胞如骨髓细胞、外周血单个核细胞、脾细胞同样可以有效地降低GVHD的发生，而具有取材方便、易于获得、安全性高、便于直接应用等优点的受者淋巴细胞受到人们重视。本实验旨在研究MHC半相合小鼠造血干细胞移植后，不同时间输注不同数量的受者脾细胞，对GVHD的产生、发展的影响，并进一步的探讨其可能机制。研究内容：1，MHC半相合小鼠造血干细胞移植GVHD模型的建立2，移植后不同时间输注不同数量的受者脾细胞对植入及GVHD发生的影响3，移植后+4d输注受者脾细胞3×107，降低GVHD发生率的机制探讨研究方法：1.MHC半相合小鼠造血干细胞移植GVHD模型的建立将受体小鼠根据输注细胞数量的不同随机分为4组，每组用8只小鼠。将实验分为A组：单纯8GyTBI预处理。B、C、D三组：预处理相同（8GyTBI照射），分别输注供鼠脾细胞量为1×107、3×107、6×107，A组仅输注等量的生理盐水。在移植后，监控造血恢复情况、供体嵌合情况、受鼠的体征变化及组织病理学改变，并进行GVHD的评分和诊断。2.移植后不同时间输注不同数量的受者脾细胞对植入及GVHD发生率的影响3 军事医学科学院学位论文根据移植后的时间及输注受者细胞的数量，将实验分组为(1)移植后+1d输注组：在移植后+1d(以移植C57BL/6动员后脾细胞输注当天，作为第0天，下同)给予受鼠脾数量分别为1×107、3×107、6×107，对照组输注等量生理盐水。(2)移植后+4d输注组：在移植后+4d给予受鼠脾细胞数量分别为1×107、3×107、6×107，对照组输注等量生理盐水。(3)移植后+7d输注组：在移植后+7d输注受鼠脾细胞数量分别为1×107、3×107、6×107，对照组输注等量生理盐水。在移植后监控造血恢复情况、供体嵌合情况、受鼠的体征变化及组织病理学改变，并进行GVHD的评分及诊断。3.移植后+4d输注受者脾细胞3×107，降低GVHD发生率的机制探讨在移植后+1d、+4d、+7d输注等量受者细胞3×107，在移植后，监控外周血的淋巴亚群比例变化和T淋巴细胞FasL的表达变化。研究结果：1，受鼠CB6F1给予8GyTBI预处理，输注MHC半相合亲代供鼠C57经G-CSF动员后的脾脏单个核细胞，在输注细胞数量为1×107时，虽然受鼠能达到完全供者嵌合状态，但GVHD发生率仅为50%。而在输注细胞数量为3×107、6×107时，受鼠均能够形成完全供者嵌合，其GVHD发生率为100%，受鼠脾脏、小肠、皮肤、肝脏的病理结果呈现出典型的GVHD病理改变，表明成功的建立了H-2半相合小鼠Allo-HSCT移植物抗宿主病动物模型。2，在移植后+1d分别输注受者细胞数量为1×107、3×107的移植组，供体均获得完全嵌合状态（completechimerism，CC），其GVHD发生率和死亡率均为100%，中位生存时间为18d~21d，而输注6×107组，却导致了移植排斥，移植受鼠全部因造血衰竭而死亡，中位生存时间为14d；在移植后+7d时，分别输注受者细胞量1×107、3×107、6×107的移植组，供体均获得CC，其GVHD发生率和死亡率均为100%，中位生存时间为23d~28d；而在移植后+4d时输注受者细胞量为3×107、6×107的移植组，供体均获得CC，其GVHD发生率在20%~30%，显著降低了GVHD的发生率，中位生存时间>60d，显著延长受者存活时间；而在移植后+4d时输注1×107组，GVHD的发生率为80%，中位生存时间为45d。3，在正常供鼠（C57）中，CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率分别为（0.3±0.06）%、（0.4±0.11）%。在移植后+10d，阳性对照组（8GyTBI输注供4 军事医学科学院学位论文者细胞3×107）中外周血供者CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率为（72.12±19.05）%、（36.23±15.73）%，显著高于正常供鼠的表达（P<0.05）。而在+4d输注组（移植后+4d输注受者细胞3×107）中CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率分别为（10.14±7.26）%、（6.12±5.75）%，显著低于阳性对照组，具有统计学差异（P<0.01），与+1d输注组（移植后+1d输注受者细胞3×107）：CD3+CD4+FasL：（51.52±11.12）%、CD3+CD8+FasL：（13.13±3.35）%比较P<0.05，与+7d输注组（移植后+7d输注受者细胞3×107）：CD3+CD4+FasL：（68.16±13.25）%、CD3+CD8+FasL：（36.14±9.64）%比较P<0.01，具有显著性差异。研究结论：1，本研究成功建立了H-2半相合小鼠移植GVHD动物模型，为进一步研究GVHD的机制提供了理想的平台；2，在MHC半相合小鼠造血干细胞移植后+4d时输注受者细胞能显著降低GVHD发生率，延长生存时间；而在移植后+1d、+7d时，并不能降低GVHD发生率。3，MHC半相合小鼠造血干细胞移植后输注受者脾细胞，输注的时间不同，会导致T淋巴细胞的表面FasL的表达呈现出不同的状态。受者细胞在移植后+4d输注比+1d、+7d输注能更明显的降低T淋巴细胞FasL的表达。【关键词】造血干细胞移植；移植物抗宿主病；FasL5 军事医学科学院学位论文TheEffectonGraftVersusHostDiseasebyInfusionofRecipientSpleenCellsafterHematopoieticStemCellTransplantation英文摘要AbstractResearchobjective:Hematopoieticstemcelltransplantation(HSCT)notonlycancuresomemalignantdiseasesofthebloodsystem,butalsoitiswidelyusedinnon-hematologicaldiseases.Howevergraft-versus-hostdisease(GVHD)remainsaleadingcauseofdeathrelatedtotransplantation.Asearlyas1966,BillinghamdefinedthreeessentialprerequisitesforthedevelopmentofGVHD:thepresenceofimmunologicallycompetentcellsinthedonorgraft,histocompatibilitydifferencebetweenthedonorandtherecipient,andtheinabilityoftheimmunosuppressedrecipienttomountaneffectiveimmuneresponsetorejectthedonorcells.Inrecentyears,thestudyfoundthattheremovalofTcellsintheallograftorinhibitionofitsfunctioncanreducetheincidenceofGVHDoritsseverity,butincreasetheopportunisticinfectionanddiseaserecurrencerate.Inrecentyears,theimmunoregulationcellofGVHDhasbecomeanewhotspot,suchasCD4+CD25+Tregs,mesenchymalstemcells,NKcells,NKTcells,whichcaninhibittheimmuneattackforTcellstoallogeneicantigen,soastoreducetheoccurrenceofGVHD.However,theisolation,purificationandamplificationofthesecellsrequirespecialconditionsandequipment,whichlimitstheirwideapplicationinclinic.Furtherstudieshaveshownthattherecipient'sowncellssuchasbonemarrowcells,peripheralbloodmononuclearcells,spleencellscanalsoeffectivelyreducetheincidenceofGVHD.Therecipientlymphocytehasbeenpaidmoreandmoreattentionbecauseofitsadvantagessuchasconvenient,easytoobtain,safeandconvenienttouse.TheaimofthisstudyistoinvestigatetheeffectsontheproductionanddevelopmentofGVHDbyinfusionofdifferentdosesofrecipientspleencellsatdifferenttimeafterMHChaploidenticalHSCTinmiceandfurtherexplorethepossiblemechanism.6 军事医学科学院学位论文Contentsresearch:1,TheestablishmentofGVHDmodelofMHChaploidenticalhematopoieticstemcelltransplantationinmice2,TheeffectsondonorchimeraandGVHDbyinfusionofdifferentdosesofrecipientspleencellsatdifferenttimeafterHSCT3,ThemechanismofreducingGVHDbyinfusionofrecipientspleencells3×107atthefourthdayafterHSCTResearchmethods:1,TheestablishmentofGVHDmodelofMHChaploidenticalhematopoieticstemcelltransplantationinmiceTherecipientmicewererandomlydividedinto4groupsaccordingtothenumberofcells,eachgroupwith8mice.TheexperimentwasdividedintoAgroup:8GyTBIpretreatment.B,C,Dgroups:thesamepretreatment,respectivelybyinfusionofspleencellswas1×107,3×107and6×107.Agroupwasinfusedsaline.Bloodrespectivelyviatailveinrespectivelyat+1d,+4d,+7d,+14dand+21d,monitoringhematopoieticrecoveryanddonorchimera.Thechangesofphysicalsignsandhistopathologicalchangesweremonitored,andtheGVHDscoreandthediagnosiswereperformed.2.TheeffectsondonorchimeraandGVHDbyinfusionofdifferentdosesofrecipientspleencellsatdifferenttimeafterHSCT(1)Recipientswererespectivelyinfusedbyspleennumber1×107,3×107and6×107atday1afterHSCT.Thecontrolgroupreceivedthesameamountofsaline.(2)Recipientswererespectivelyinfusedbyspleennumber1×107,3×107and6×107atday4afterHSCT.Thecontrolgroupreceivedthesameamountofsaline.(3)Recipientswererespectivelyinfusedbyspleennumber1×107,3×107and6×107atday7afterHSCT.Thecontrolgroupreceivedthesameamountofsaline.Thehematopoieticrecovery,donorchimerism,changesofphysicalsignsandhistopathologicalchangeswereobservedafterHSCT.3,ThemechanismofreducingGVHDbyinfusionofrecipientspleencells3×107atthefourthdayafterHSCTRecipientswereinjectedintothesamerecipientcells3×107atday1,day4andday7afterHSCT.ThechangesoftheproportionofperipheralbloodlymphocytesubsetsandtheexpressionofTlymphocytesintheperipheralbloodofFasLweremonitored.7 军事医学科学院学位论文Resultsofresearch:1.Recipientswerepretreatedwith8GyTBIirradiation,andtheincidenceofGVHDwasonly50%whenthenumberofcellswasabout1×107,althoughthemicewereabletoachievecompletedonorchimerism.Recipientsgiventhecellnumberby3×107and6×107,respectively,wereabletoformacompletedonorchimerism.TheincidencerateofGVHDwas100%,andthepathologicalspleen,intestine,skinandlivershowedpathologicchangesofGVHD.2.Atday1afterHSCTrecipientswererespectivelyinfusedbythenumberof1×107and3×107.Thedonorobtainedcompletechimerism(CC).TheincidenceandmortalityofGVHDwas100%.Themediansurvivaltimewas18d~21d.Howevertheinfusionof6×107hasledtothegraftrejectionandallrecipientsforhematopoieticfailureanddeath.Themediansurvivaltimewas14d.Atday7aftertransplantation,therecipientsweretransplantedwith1×107,3×107,and6×107,respectively.ThedonorchimerawasCC,andtheincidenceofGVHDandmortalitywerebothintherangeof100%,andthemediansurvivaltimewas23d~28d.Atday4afterHSCTtherecipientsweretransplantedwith3×107and6×107,respectively.ThedonorCCwasobtainedanditsincidencerateofGVHDin20%~30%,significantlyreducetheincidenceofGVHD,Themediansurvivaltimewasmorethan60d,andprolongedthesurvivaltimeofrecipients.However,theincidenceofGVHDwas80%andthemediansurvivaltimewas45dwhenrecipientswereinfusedthenumberof1×107atday4afterHSCT.3.TheexpressionratesofCD3+CD4+FasL+andCD3+CD8+FasL+innormaldonor(C57)were(0.3±0.06)%,(0.4±0.11)%.AfterHSCT,theexpressionrateofCD3+CD4+FasL+andCD3+CD8+FasL+intheperipheralblooddonorsinthepositivecontrolgroupwas(72.12±19.05)%,(36.23±15.73)%,whichwassignificantlyhigherthanthatinthenormaldonor(P<0.05).Theexpressionof+4dinfusiongroupCD3+CD4+FasL+,CD3+CD8+FasL+respectively(10.14±7.26)%and(6.12±5.75)%,weresignificantlylowerthanthepositivecontrolgroup(P<0.01),andhadstatisticaldifference(P<0.05)comparedto+1dinfusiongroup:CD3+CD4+FasL+:(51.52±11.12)%andCD3+CD8+FasL+;(13.13±3.35)%P<0.05,andalsohadstatisticaldifference(P<0.01)comparedto+7dinfusiongroup:CD3+CD4+FasL+:8 军事医学科学院学位论文(68.16±13.25)%,CD3+CD8+:FasL+(36.14±9.64)%comparedtoP<0.01.Researchconclusions:1,Inthisstudy,weestablishedaH-2haploidenticalmousemodelofGVHD,whichprovidesanidealplatformforfurtherstudyonthemechanismofGVHD;2,Infusionofrecipientcellsatday4afterHSCTcansignificantlyreducetheincidenceofGVHDandprolongthesurvivaltimeinmice,buttheincidenceofGVHDcannotbereducedatday1andday7afterHSCT.3,InfusionofrecipientcellsatdifferenttimeafterHSCTwillleadtotheexpressionofTlymphocytessurfaceFasLshowedadifferentstate.TheFasLexpressionofTlymphocytesissignificantlydecreasedatday4infusionthanatday1andonday7infusion.【Keywords】Hematopoieticstemcelltransplantation；GVHD；FasL9 军事医学科学院学位论文前言造血干细胞移植（hematopoieticstemcelltransplantation）不仅可以用于血液系统中的某些恶性疾病的治疗，而且也能用于不能根治的高危实体瘤、自免病免疫缺陷病的治疗[1]。在同种异基因造血干细胞移植过程中，存在的GVHD、移植物排斥、复发、机会性感染等并发症，严重影响了Allo-HSCT的疗效及临床应用。因此，Allo-HSCT的成功关键是提高GVL效应中的T细胞反应、增加干细胞植入，减轻GVHD的同时减少感染。目前为止，人们普遍接受的GVHD的理论可以概括为一个3步骤的过程。第一步：预处理所致的受者组织受损[2]。化疗或者照射导致了受者全身组织的损伤、活化，及TNF-a、IL-1炎症因子的释放，这些因子通过增加受者APC细胞表面MHC抗原分子和其他的分子的表达，提高供者T识别受者抗原。第二步：供者T细胞活化和克隆扩增。APC细胞以肽-MHC复合物形式提呈组织抗原给供体T细胞，在共刺激信号辅助下，T细胞增殖，Th1/Th2失衡[3]参与aGVHD的发生。第三步：炎症因子[4]及供者细胞攻击受者组织，T细胞通过分泌穿孔素和颗粒酶、Fas/FasL途径诱导凋亡引起宿主损伤；细胞因子，如TNF-α、IL-1等也可损伤宿主组织。GVHD三阶段病理生理过程表明，这种疾病是一种免疫系统组织损伤放大的失调反应。针对GVHD的预防和治疗，其基本的策略是减少allo-T细胞的生成和/或增加allo-T细胞的去除。大量实验证明，通过阻断T细胞的活化和第二信号[5]，可使GVHD的发生率有所降低。临床上的预防GVHD的药物，主要为免疫抑制剂，它作用于T细胞识别、活化、增殖、归巢及效应的不同环节，抑制T细胞的活化、增殖及发挥效应，从而抑制GVHD的发生，减轻GVHD的严重程度。这些药物虽能去除供体反应性T细胞，但它们在降低GVHD的同时也带来了机体免疫低下，增加了机会性感染及疾病的复发率问题。近年来的减低剂量预处理，能有效减少预处理所带来的损伤，并能降低GVHD的发生率。Storb[6]和BalonJ[7]进一步的研究证明，造血干细胞移植后，如果出现混合嵌合造血，则GVHD的发生率明显下降，如果早期即完全供者型造血,则有较高的GVHD发生率。Ildstad[8]及国内学者邓晓辉[9]研究发现，在造血干细胞移植后输注受者细胞能够一定程度的抑制GVHD的发生。上述的实验和观察提示受者自身细胞在降低GVHD方面发挥着重要作用,但具体机制尚不清楚。10 军事医学科学院学位论文LeskovarP[10]的“微免疫手术”理论认为造血干细胞移植后，在受者体内存在着受者抗移植物和移植物抗宿主两个方向的的异体反应，介导受者抗移植物和移植物抗宿主的细胞分别源于受者和供者，移植排斥和GVHD分别是两种情况的极端。HVG和GVH是相互抵消和相互牵制的，在合适的情况下HVG和GVH处于平衡状态时，即互不排斥，处于双向免疫耐受。Hardy[11]在临床观察中也得到了同样的结果，该理论认为受者淋巴细胞降低GVHD的是对供者中异体反应性细胞的免疫攻击。CTL细胞主要效应机制为Fas/Fasl、穿孔素和颗粒酶途径。穿孔素和颗粒酶被储存在CTL细胞的细胞毒性颗粒中，通过TCR-MHC相互作用识别靶细胞之后，穿孔素被分泌并插入靶细胞表面，形成穿孔蛋白孔，它可以使颗粒酶进入下调各种效应通路诱导凋亡。Fas是TNF受体家族成员之一，Fas/FasL作为介导细胞凋亡的重要膜蛋白分子，在正常免疫反应、造血调控、机体细胞数量的恒定与调控等生理功能以及多种疾病的病理机制中具有十分重要的意义[12]。Fas表达于许多组织中，包括GVHD靶器官：胃肠道、肝脏、皮肤等；FasL主要表达在活化的T细胞，NK细胞上，此外MHC抗原可诱导T细胞激活表达FasL。在造血干细胞移植中，供者淋巴细胞在移植过程中被激活而表达FasL，作用于受者靶器官导致表达Fas阳性的细胞凋亡而产生全身多脏器、组织损伤[13-15]。国内学者冯晓勤[16]发现在aGVHD与T细胞及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达FasL呈正相关。目前，受者成分在预防GVHD发生中的作用越来越得到重视。造血干细胞移植后的受者细胞输注，能够在抑制GVHD的同时，保留了移植后的受者的整体免疫。无论在动物研究还是在部分临床病例报道中，移植后受者细胞输注抑制GVHD初步显露出可喜应用前景，但移植后受者细胞的最佳输注数量及输注时间、输注后对植入和造血重建的影响，其抑制GVHD的深入机制等，都需进一步的深入研究。有鉴于此，本实验旨在研究，MHC半相合造血干细胞移植后的不同时间输注不同数量的受者细胞，对GVHD的产生、发展的影响，并进一步的探讨其可能机制。11 军事医学科学院学位论文第1章MHC半相合小鼠造血干细胞移植GVHD模型的建立1.1材料与方法1.1.1材料1.1.1.1主要仪器1隔水式电热恒温培养箱：国光医疗器械厂2FCM流式细胞检测仪FACSCantoII：美国BD公司3HZ-9311K恒温振荡器：国光医疗器械厂4常温台式离心机：上海安亭科学仪器厂公司5X90-3型超净工作台：北京金色晨光净化设备研制中心6离心管：美国Corning公司7全自动血细胞分析仪：MEK-7222K日本光电公司8902-ULTS超低温冰箱：美国Thermo（赛默飞）公司937℃恒温、5%CO2细胞培养箱：ThermaForma公司10分析天平：METTLERAE20011微量加液器：Gilson公司12DYY-3-6B型稳压稳流电泳仪：北京市六一仪器厂13倒置显微镜和照相机：Olympus公司1.1.1.2实验动物12 军事医学科学院学位论文表1移植实验供鼠及受鼠情况说明项目移植供鼠移植受鼠品系C57BL/6CB6F1遗传背景H-2kb/bH-2kb/d性别雄性雌性年龄6-8周龄6-8周龄体重18-22g20-22g动物级别SPF级SPF级来源军事医学科学院北京维通利华实验动物技术动物中心有限公司1.1.1.3实验试剂1移植供鼠动员后脾脏单个核细胞分离主要试剂RPMI-1640培养液（美国GIBCO公司），红细胞裂解液（美国贝克曼库尔特公司），小鼠淋巴细胞分离液(密度1.082g/ml，Histopaque®-1083美国Sigma公司），PBS缓冲液(北京利维宁生物科技有限公司）。2移植供鼠造血干细胞动员所用试剂重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF（北京四环生物制药有限公司），PBS缓冲液（北京利维宁生物科技有限公司）。3检测供鼠脾脏单个核提取后成分所用试剂小鼠单抗FITC偶联的CD4、SCA-1、B220，PC5偶联的CD3、Gr1，PE偶联的CD8、C-Kit、Thy1.2以及同型对照FITC-IgG/PE-IgG/PC5-IgG均购自美国BD公司，红细胞裂解液（美国贝克曼库尔特公司）。④移植受鼠外周血供者嵌合检测所用试剂EDTA抗凝剂（江莱生物公司），APC-CY7偶联的CD45、FITC偶联的H-2Kb、PE偶联的H-2Kd均购自美国BD公司。13 军事医学科学院学位论文1.1.2方法1.1.2.1动物饲养清洁级雄性C57和清洁级雌性CB6F1受鼠均在层流架带盖鼠笼饲养，鼠笼、垫料经高温高压灭菌并定期更换，饲料及饮水均灭菌处理，动物房内温度(23±2)℃，相对湿度为40%～60%。在移植前一周受鼠（CB6F1）的饮水中添加红霉素、链霉素预防感染，移植后一个月改为正常用水，移植后每天更换垫料、饲料及饮水。1.1.2.2实验分组将受体小鼠根据输注细胞数量的不同随机分为4组，每组用8只小鼠。将实验分为A组：单纯8GyTBI预处理。B、C、D三组：预处理相同，分别输注供鼠脾细胞量为1×107、3×107、6×107，A组仅输注等量的生理盐水。1.1.2.3供鼠脾脏造血干细胞动员及脾单个核悬液制备⑴供鼠脾脏造血干细胞动员在移植前-5天给予供鼠（C57）连续5天，2次/天，时间间隔为12小时的rhG-CSF（10μg/kg）皮下注射，注射前用含有75%的酒精棉球，擦拭注射部位。⑵供鼠脾脏单个核细胞悬液的制备供鼠（C57）经皮下注射rhG-CSF5天后，采用颈椎脱臼法将其处死，然后置于75%酒精中15min；在超净台内，用无菌眼科剪和镊子，沿腹腔中线剪开小鼠腹腔,取出脾脏置于无菌培养皿中,剪去脂肪和筋膜组织；在无菌培养皿中加入适量RPMI-1640培养液，用5ml注射器芯轻轻挤压脾脏，混匀；用移液管将磨好的脾细胞通过200目细胞筛，残留在细胞筛中的组织，用注射器芯再次轻轻挤压，直至组织透明白色，获得脾细胞悬液；用移液枪将脾细胞悬液抽提混匀，吸取适量的混合液沿离心管壁轻轻加入至含等量淋巴细胞分离液的离心管中，注意加入过程缓慢匀速，不要破坏液体界面；室温（25℃）条件下，以转速为1700rpm离心25min，收集中间白色细胞层细胞；加入RPMI-1640培养液洗涤1次（1500rpm，5min）；用0.83%NH4CL裂解红细胞，室温（25℃），10min，之后进行离心（1500rpm，5min）；再次用RPMI-1640培养液洗涤一次，计数，将细胞浓度调整为6×107/ml。1.1.2.4供鼠脾单个核成分分析将提取的脾单个核细胞悬液分为四管，在四管中分别加入小鼠单克隆抗体14 军事医学科学院学位论文PC5-Gr1/PE-Thy1．2/FITC-B220、FITC-CD4/PE-CD8/PC5-CD3、PE-C-Kit/FITC-SCA-1，以及同型对照FITC-IgG/PC5-IgG/PE-IgG，4℃避光孵育30min，加入红细胞裂解液去除红细胞，再用PBS缓冲液洗涤2遍，弃上清液并用PBS重悬后上流式细胞仪检测。1.1.2.5受鼠移植前预处理受鼠CB6F18.0Gy全身照射（60Co放射治疗机），剂量率1.13Gy/min，照射源与动物之间距离73cm。在TBI后4小时内，经尾静脉输注已制备的供鼠脾单个核细胞。1.1.2.6造血功能恢复检测在移植前和移植后+1、+4、+7、+10、+14、+21、+28d经尾静脉取血20微升，使用全血细胞计数仪计数白细胞、血小板值，监控各组小鼠血象变化及造血重建情况。1.1.2.7流式细胞术检测受鼠外周血供鼠嵌合应用流式细胞术分析方法，用APC-CY7-CD45、PE-H2-Kb及FITC-H2-Kd单克隆抗体，来确定受鼠血液细胞中供者来源的细胞的构成比例。1.1.2.8GVHD诊断（1）大体观察在移植后，观察小鼠皱毛、姿势、活动度、皮肤完整度等体征，并每日称取小鼠体重，并以此进行GVHD临床评分，评分标准如下[17]：15 军事医学科学院学位论文表2GVHD临床体征评分标准项目0分1分2分体重下降<10%下降10%～25%下降>25%姿势无弓背只在静止时轻度弓背重度弓背影响到活动活动度无活动度下降轻度至中度的活动性刺激后才活动否则保下降持静止皱毛无毛改变轻度至中度的耸毛重度卷毛皮肤完整度皮肤完整尾巴及爪子鱼鳞状改重度毛脱落变（2）病理学检查取受鼠皮肤、肝脏、脾脏、小肠组织经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片后，HE染色，光镜观察并摄像。(3)GVHD的诊断标准病理检查可见肝脏、胃肠道、皮肤等组织淋巴细胞浸润，正常组织结构被破坏，并伴有局灶性坏死等改变且外周血白细胞计数>1.0×109/L，且伴有体重下降，弓背体位，皱毛脱毛，腹泻等临床体征表现。1.1.2.9数据处理采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示；方差齐性时采用单因素方差分析ANOVA分析，Dunnett-T检验，方差不齐采用非参数检验；绘制Kaplan-Meier生存曲线，P<0.05示差异有统计学意义。1.2实验结果1.2.1供鼠造血干细胞动员情况（1）供鼠动员前后血细胞变化在供鼠C57动员前后分别经尾静脉采血，经全自动血细胞分析仪进行血常规检测，结果显示：动员后白细胞计数（43.71±2.38）×109/L明显高于动员前（8.96±3.45）×109/L，约增高5倍（P<0.01），血红蛋白、血小板均低于供鼠动员前水平（P<0.05）（表3）。16 军事医学科学院学位论文表3供鼠C57动员前后外周血细胞变化表（n=10）分组白细胞血红蛋白血小板(×109/L)（g/L）(×109/L)动员前C578.96±3.45168.34±5.291385.52±178.19动员后C5743.17±2.18**152.32±7.98*823.94±89.98*注：*示与动员前相比P＜0.05，**示与动员前相比P＜0.01。（2）供鼠脾单个核细胞动员前后成分对比结果在供鼠动员前后，进行脾脏单个核悬液制备，应用流式细胞术检测供鼠脾单个核细胞中各细胞成分（图1），结果表明：动员后供鼠脾单个核细胞中造血干细胞SCA-1+/C-KIT+比例为（4.79±0.18）%，显著高于动员前（0.42±0.07）%（P<0.01），动员后NK1.1+：（3.00±1.55）%；THY1.2+：（24.35±3.16）%；CD3+CD4+：（11.98±3.96）%；CD3+CD8+：（10.64±2.26）%；B220+（33.05±6.70）%均较动员前比例分别为：（2.12±0.20）%、（23.01±1.20）%、（14.00±2.00）%、（8.12±1.02）%、（31.63±2.40）%无显著变化（P>0.05），粒细胞CD11b+（36.77±3.42）%比例与动员前相比无明显差异（P<0.01）。供鼠脾单个核细胞动员前后成分对比结果提示：动员后供鼠脾单个核细胞中造血干细胞显著增加，动员效果良好。图1供鼠动员前后脾单个核细胞成分17 军事医学科学院学位论文1.2.2造血恢复情况单纯照射组（A组）所有小鼠在照射之后，外周血中的各系细胞均出现明显下降，在+7d时，外周血中白细胞（WBC）的数量由照射前（6.96±1.42）×109/L降至（0.30±0.01）×109/L；血红蛋白(HB)由照射前（164.00±9.05）g/L降至为（152.05±8.11）g/L；血小板（PLT）由照射前（1240.75±101.42）×109/L降至（320.01±98.12）×109/L，而其他造血干细胞移植组的变化与单纯照射组的造血恢复情况存在着显著的差异。B组（输1×107）、C组（输3×107）、D组（输6×107）的外周血血象变化无明显的不同，白细胞的变化均是在照射后+4d降到最低点：（0.42±0.11）×109/L、（0.27±0.04）×109/L、（0.32±0.01）×109/L，于+7d开始恢复造血，随后又开始下降，死亡时白细胞的数量分别为（3.41±1.20）×109/L、（3.50±0.86）×109/L、（2.12±0.21）×109/L。B、C、D三组血小板的数量在移植后+1d也开始迅速下降，于+7d降至（365.12±86.11）×109/L、（355.50±39.66）×109/L、（300.12±89.03）×109/L，而后开始缓慢恢复，至死亡时又开始下降。B、C、D三组在照后+7d、+14d、+21d时间点与A组（单纯照射组）比较，移植组白细胞数及血小板数均明显高于对照组（P<0.01）(图2)，说明移植促进了造血恢复。A组、B组、C组、D组小鼠照射后血红蛋白的数值均无统计学差异（P>0.05）。图2各组小鼠外周血白细胞数的变化18 军事医学科学院学位论文图3各组小鼠外周血血红蛋白的变化图4各组小鼠外周血血小板的变化1.2.3供体植入情况B组小鼠移植后+7d，供体嵌合情况为MC，供体嵌合率为（56.12±5.23）%，与C组（95.25±3.24）%、D组（98.61±1.32）%存在着显著差异（P<0.01），B组在+14d转为供体完全嵌合状态(CC)，供体嵌合率为（98.23±1.56）%。C组、D组在移植后+1d、+4d、+7d、+14d、+21d无明显差异（P>0.05），提示移植成功。19 军事医学科学院学位论文供体嵌合率检测结果见图6。图5B组（输3×107）外周血的供体植入情况（注：A：移植前B：+1dC：+4dD：+7d）图6各组小鼠外周血供体植入的变化20 军事医学科学院学位论文1.2.4GVHD情况（1）大体观察A组（单纯照射组，n=8））于照射后体重进行性下降，伴活动减少、皱毛、弓背，但无腹泻、肛门红肿。照射后前3天体重下降最快，随后体重下降趋势有所减缓，至第7天开始有小鼠死亡，到14天单纯照射组小鼠全部死亡，与B组、C组、D组比较有显著差异（P<0.01）。B组受鼠在移植后+25d，4/8小鼠（n=8）出现一过性静止弓背，轻微的活动度下降，轻度耸毛等表现，但无皮疹、脱毛及腹泻，体重减轻<10%。B组小鼠只在移植后+24d、+26d各死亡1只，其余生存时间均>90d，较C组与D组存在显著差异（P<0.05）。C组、D组小鼠（n=8）在移植+14d时均出现典型的GVHD症状，临床GVHD评分7~9分。C组、D组的体重虽然在TBI照射后也迅速下降，但在+7d后体重明显回升，与A组在存在着显著的差异（P<0.01）。C组、D组在+14d再次出现体重进行性下降，C组、D组小鼠体重下降，降低幅度>25%，死亡时体重下降35%~40%之间（图7）。C组与D组的小鼠在移植+30d内全部死亡，中位生存期分别+21d、18d无显著统计学差异（P>0.5），见图9。图7各组小鼠体重的变化21 军事医学科学院学位论文图9各组小鼠生存生存曲线表3各组小鼠GVHD发生情况表分组TBI强度供体细胞GVHDGVHDGVHD中位生存时间输注剂量发生率评分死亡率A8Gy0------------------------10dB8Gy1×1074/81.252/8>90d**C8Gy3×1078/89.15100%24d**D8Gy6×1078/810100%18d*注：*示与A组相比P<0.05，**与A组相比P<0.01。（2）病理学检测在移植组+14d时，进行脾脏、小肠、皮肤、肝脏病理学检测，C组、D组病理结果呈现出典型的GVHD病理改变（图8）。B组小鼠病理学改变与C、D两组相比，组织破坏程度减轻，皮肤组织切片中表皮层变薄，皮肤附属结构毛囊等部分减少，小肠组织中仅可见固有层轻度水肿伴有少量淋巴细胞和22 军事医学科学院学位论文单核及细胞浸润，其余未见明显变化。图8C组（输3×107）组小鼠病理学组织组织切片（注：A：脾脏B：小肠C：皮肤D：肝脏HE染色200×）A可见脾脏结构分界不清，部分脾小结凝固性坏死，如黑色箭头所示；白髓中可见中性粒细胞浸润，如红色箭头所示；可见少量巨核细胞，如黄色箭头所示。B可见肠绒毛局灶性坏死脱落，如黑色箭头所示；肠固有层血管扩张，血管内可见单个中性粒细胞，如红色箭头所示。C表皮层部分上皮细胞呈空泡状，如黑色箭头所示；真皮层胶原纤维增生，血管扩张，结缔组织水肿疏松、排列紊乱，如红色箭头所示；可见少量中性粒细胞和淋巴细胞，如黄色箭头所示D可见肝组织多处灶性坏死，中央静脉旁坏死细胞核溶解消失，如黑色箭头所示；并伴有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润，如红色箭头所示。23 军事医学科学院学位论文1.3讨论移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植严重并发症，严重制约着Allo-HSCT的临床应用。供者免疫活性细胞、移植物的异体抗原性、宿主免疫抑制是Billingham[18]认为发生GVHD的三个条件。GVHD的病理生理和免疫生物学已经通过动物实验得到大部分的阐明，常用的动物模型包括狗、大鼠、小鼠移植模型。犬类模型在研究不同照射强度和免疫抑制的预处理中有着重要作用，此外GVHD的治疗和预防药物也在犬类模型中进行，比如甲氨蝶呤，环孢素，抗胸腺血清[19]。大鼠模型在研究不同梯度的供者T细胞输注，引入自杀基因在体内去除反应性T细胞等研究也有报导[20]。通常由于饲养的方便性、花费、基因多态性，小鼠模型有其独特的优势，常用于研究MHC对GVHD的影响，探讨CD4及CD8在GVHD形成机制中的作用。MHC识别是特异性T细胞的本质特征，T细胞表达TCR来特异性捕获被MHC限制的抗原肽片段，小鼠是H2系统，大鼠是RT1，狗是DLA，人是HLA。在Allo-HSCT中，输注的供者T细胞与组成性的表达在受者APC抗原相遇，供者T细胞大量增殖，释放各种细胞因子，分化成不同的效应细胞，这一系列的事件组成了GVH反应。活化和/或效应T细胞聚集于受者的胃肠道、肝脏、皮肤等GVHD靶器官，形成明显的GVHD病理表现。供者T细胞克服受者的免疫抵制，形成供者嵌合状态，是形成GVHD重要的条件之一。在小鼠中，大剂量的同种异基因T细胞的输注，而没有形成典型的GVHD，是因为受者有直接针对供者同种异基因抗原的强烈免疫反应。在HVG反应中，主要涉及三类细胞：T细胞、B细胞、NK细胞[21-23]。去除它们最简单的方式：全身照射(totalbodyirrdiation,TBI)，它能够有效去除对放射敏感的T细胞和B细胞。为了避免NK细胞介导的HVG反应，增加照射很难去除受者的NK细胞，因为这群细胞有很高的抗辐射性，克服这个问题的最好方法是输大量的供者造血干细胞和淋巴细胞。在造血干细胞移植过程中，全身照射(totalbodyirrdiation,TBI)预处理不仅可以抑制受者的免疫功能，还能够降低受者肿瘤负荷、清除受者的骨髓造血组织，为供者的造血干细胞植入做准备。本实验采用的方式是国际通用的致死剂量全身照射（TBI）。本研究设计单纯照射组，主要目的是证实预处理的致死性和排除TBI所引起的效应，单纯照射后受鼠表现与GVHD的初期表现相类似，均可表现为体重下降，食欲下降及活动减少，但如果不进行造血干细胞移植，上述症状将进行24 军事医学科学院学位论文性加重，在照射后7~10天内受鼠会因造血衰竭死亡，死亡时外周血象白细胞在（0.1~0.6）×109/L之间，处于极度抑制状态。本研究的实验结果表明：单纯照射组小鼠照射后7~14天全部死亡，中位生存期10天，说明8GyTBI对受鼠CB6F1是致死剂量的。移植物中含有足够数量淋巴细胞是GVHD发生的关键因素之一。研究表明，在小鼠造血干细胞移植模型中，供鼠脾细胞必须大于1×107，才能形成典型的GVHD的征象[24]，小鼠骨髓中的淋巴细胞比例低，骨髓细胞的单独应用并不引起典型的GVHD发生，而使用G-CSF动员的脾细胞，既含有了足够的淋巴细胞又增加了造血干细胞的数量，因此既可以成功诱发GVHD又可以保证植入。本研究的实验设计方案是采用G-CSF动员的脾细胞作为供鼠移植成分，并进一步探讨了输注动员后供鼠脾细胞的数量对GVHD产生的影响。本研究的结果显示，在输注细胞数量为1×107时，虽然受鼠能达到完全供者嵌合状态，但GVHD发生率仅为50%。而在输注细胞数量为3×107、6×107时，受鼠均能够形成完全供者嵌合，其GVHD发生率为100%，受鼠脾脏、小肠、皮肤、肝脏的病理结果呈现出典型的GVHD病理改变[17;25]。综上所述，我们认为受鼠CB6F1接受8.0GyTBI预处理后，输注来自供鼠（C57BL/6）经G-CSF动员后的脾单个核细胞，作为MHC半相合造血干细胞移植GVHD动物模型，具有重复性好，GVHD表现典型，且实验方法简便易行，是研究如何防治GVHD发生的可靠的实验动物模型。1.4结论本研究成功建立了H-2半相合小鼠造血干细胞移植GVHD动物模型，为进一步探讨研究影响GVHD发生、发展的机制提供了理想的平台。25 军事医学科学院学位论文第2章移植后不同时间输注不同剂量的受者脾细胞对GVHD的影响2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1主要仪器①隔水式电热恒温培养箱：国光医疗器械厂②FCM流式细胞检测仪FACSCantoII：美国BD公司③HZ-9311K恒温振荡器：国光医疗器械厂④常温台式离心机：上海安亭科学仪器厂公司⑤X90-3型超净工作台：北京金色晨光净化设备研制中心⑥离心管：美国Corning公司⑦全自动血细胞分析仪：MEK-7222K日本光电公司⑧902-ULTS超低温冰箱：美国Thermo（赛默飞）公司⑨37℃恒温、5%CO2细胞培养箱：ThermaForma公司⑩分析天平：METTLERAE200⑪微量加液器：Gilson公司⑫DYY-3-6B型稳压稳流电泳仪：北京市六一仪器厂14倒置显微镜和照相机：Olympus公司2.1.1.2实验动物26 军事医学科学院学位论文表4移植实验供鼠及受鼠情况表项目移植供鼠移植受鼠品系C57BL/6CB6F1遗传背景H-2kb/bH-2kb/d性别雄性雌性年龄6-8周龄6-8周龄体重18-22g20-22g动物级别SPF级SPF级来源军事医学科学院北京维通利华实验动物技术动物中心有限公司2.1.1.3实验试剂①移植供鼠动员后脾脏单个核细胞分离主要试剂RPMI-1640培养液（美国GIBCO公司），红细胞裂解液（美国贝克曼库尔特公司），小鼠淋巴细胞分离液(密度1.082g/ml，Histopaque®-1083美国Sigma公司），PBS缓冲液（北京利维宁生物科技有限公司）。②移植供鼠造血干细胞动员所用试剂重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF（北京四环生物制药有限公司），PBS缓冲液（北京利维宁生物科技有限公司）。③检测供鼠脾脏单个核提取后成分所用试剂小鼠单抗FITC偶联的CD4、SCA-1、B220，PC5偶联的CD3、Gr1，PE偶联的CD8、C-Kit、Thy1.2以及同型对照FITC-IgG/PE-IgG/PC5-IgG均购自美国BD公司，红细胞裂解液（美国贝克曼库尔特公司）。4移植受鼠外周血供者嵌合检测所用试剂EDTA抗凝剂（江莱生物公司），APC-CY7偶联的CD45、FITC偶联的H-2Kb、PE偶联的H-2Kd均购自美国BD公司。27 军事医学科学院学位论文2.1.2方法2.1.2.1动物饲养清洁级雄性C57和清洁级雌性CB6F1受鼠均在层流架带盖鼠笼饲养，鼠笼、垫料经高温高压灭菌并定期更换，饲料及饮水均灭菌处理，动物房内温度(23±2)℃，相对湿度为40%～60%。在移植前一周受鼠（CB6F1）的饮水中添加红霉素、链霉素预防感染，移植后一个月改为正常用水，移植后每天更换垫料、饲料及饮水。2.1.2.2实验分组(1)移植后+1d输注组：在移植后+1d(以移植C57BL/6动员后脾细胞输注当天，作为第0天，下同)给予每只CB6F1受鼠经尾静脉注射CB6F1受鼠动员后的脾细胞悬液，数量分别为1×107、3×107、6×107，依次命名为E1组、E2组、E3组，输注等量生理盐水的对照组为E0组。(2)移植后+4d输注组：在移植后+4d给予每只CB6F1受鼠经尾静脉注射CB6F1受鼠动员后的脾细胞悬液，数量分别为1×107、3×107、6×107，依次命名为F1组、F2组、F3组，输注等量生理盐水的对照组为F0组。(3)移植后+7d输注组：在移植后+7d给予每只CB6F1受鼠经尾静脉注射CB6F1受鼠动员后的脾细胞悬液，数量分别为1×107、3×107、6×107，依次命名为G1组、G2组、G3组，输注等量生理盐水的对照组为G0组，具体详见表5。表5不同时间及不同数量输注受者细胞的各组实验方案受鼠细胞输注数量分组输注时间等量生理盐水1×1073×107×107+1d输注组+1dE0E1E2E3+4d输注组+4dF0F1F2F3+7d输注组+7dG0G1G2G328 军事医学科学院学位论文2.1.2.3供鼠脾脏造血干细胞动员及脾单个核悬液制备⑴供鼠脾脏造血干细胞动员在移植前-5天给予供鼠（C57）连续5天，2次/天，时间间隔为12小时的rhG-CSF（10μg/kg）皮下注射，注射前用含有75%的酒精棉球，擦拭注射部位。⑵供鼠脾脏单个核细胞悬液的制备供鼠（C57）经皮下注射rhG-CSF5天后，采用颈椎脱臼法将其处死，然后置于75%酒精中15min；在超净台内，用无菌眼科剪和镊子，沿腹腔中线剪开小鼠腹腔,取出脾脏置于无菌培养皿中,剪去脂肪和筋膜组织；在无菌培养皿中加入适量RPMI-1640培养液，用5ml注射器芯轻轻挤压脾脏，混匀；用移液管将磨好的脾细胞通过200目细胞筛，残留在细胞筛中的组织，用注射器芯再次轻轻挤压，直至组织透明白色，获得脾细胞悬液；用移液枪将脾细胞悬液抽提混匀，吸取适量的混合液沿离心管壁轻轻加入至含等量淋巴细胞分离液的离心管中，注意加入过程缓慢匀速，不要破坏液体界面；室温（25℃）条件下，以转速为1700rpm离心25min，收集中间白色细胞层细胞；加入RPMI-1640培养液洗涤1次（1500rpm，5min）；用0.83%NH4CL裂解红细胞，室温（25℃），10min，之后进行离心（1500rpm，5min）；再次用RPMI-1640培养液洗涤一次，计数，将细胞浓度调整为6×107/ml。2.1.2.4供鼠脾单个核成分分析将提取的脾单个核细胞悬液分为四管，在四管中分别加入小鼠单克隆抗体PC5-Gr1/PE-Thy1．2/FITC-B220、FITC-CD4/PE-CD8/PC5-CD3、PE-C-Kit/FITC-SCA-1，以及同型对照FITC-IgG/PC5-IgG/PE-IgG，4℃避光孵育30min，加入红细胞裂解液去除红细胞，再用PBS缓冲液洗涤2遍，弃上清液并用PBS重悬后上流式细胞仪检测。2.1.2.5受鼠移植前预处理受鼠CB6F18.0Gy全身照射（60Co放射治疗机），剂量率1.13Gy/min，照射源与动物之间距离73cm。在TBI后4小时内，经尾静脉输注已制备的供鼠脾单个核细胞。2.1.2.6造血功能恢复检测在移植前和移植后+1、+4、+7、+10、+14、+21、+28d经尾静脉取血20微升，使用全血细胞计数仪计数白细胞、血小板值，监控各组小鼠血象变化及造血重建29 军事医学科学院学位论文情况。2.1.2.7流式细胞术检测受鼠外周血供鼠嵌合应用流式细胞术分析方法，用APC-CY7-CD45、PE-H2-Kb及FITC-H2-Kd单克隆抗体，来确定受鼠血液细胞中供者来源的细胞的构成比例。2.1.2.8外周血淋巴细胞亚群比例检测受鼠移植后分别经尾静脉采血，与小鼠单克隆抗体APC-CY7-CD3、PE-CY7-CD4、APC-CD8及其同型抗体，4℃避光孵育30min，加入红细胞裂解液去除红细胞，PBS缓冲液洗涤2遍，弃上清液并用PBS重悬后上流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群比例。2.1.2.9外周血CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL比例检测经尾静脉采血，用小鼠单克隆抗体FITC-H-2Kb及Percp-cy5.5-H-2Kd及APC-CY7-CD3、PE-CY7-CD4、APC-CD8、PE-FasL及其同型抗体，经流式细胞仪检测外周血中供体的CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL细胞比例。2.1.2.10GVHD诊断（1）大体观察在移植后，观察小鼠有姿势、活动度、皮肤完整度、皱毛等临床体征，每日称取小鼠体重，并以此进行GVHD临床评分，评分标准如下：30 军事医学科学院学位论文表6GVHD临床体征评分标准项目0分1分2分体重下降<10%下降10%～25%下降>25%姿势无弓背只在静止时轻度弓重度弓背影响到活背动活动度无活动度下降轻度至中度的活动刺激后才活动否则性下降保持静止皱毛无毛改变轻度至中度的耸毛重度卷毛皮肤完整度皮肤完整尾巴及爪子鱼鳞状重度毛发脱落改变（2）病理学检查取受鼠小鼠皮肤、肝脏、脾脏、小肠组织经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片后，HE染色，光镜观察并摄像。(3)GVHD的诊断标准病理检查可见肝脏、胃肠道、皮肤等组织淋巴细胞浸润，正常组织结构被破坏，并伴有局灶性坏死等改变且外周血白细胞计数>1.0×109/L，且伴有体重下降，弓背体位，皱毛脱毛，腹泻等临床体征表现。2.1.2.11数据处理采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，方差齐性时采用单因素方差分析ANOVA分析，Dunnett-T检验，方差不齐采用非参数检验；绘制Kaplan-Meier生存曲线，P<0.05示差异有统计学意义。2.2实验结果2.2.1受鼠动员后脾单个核细胞成分检测经皮下注射G-CSF5d后，受鼠动员的脾细胞成分与正常的CB6F1脾细胞成31 军事医学科学院学位论文分对比（表7），T细胞比例无明显变化（p>0.05），细胞总量增加约3倍，较动员前有显著性差异（P<0.05）。表7受鼠动员前后脾单个核细胞成分细胞成分（%）分组总数量（107）Cikt+Sca1+Thy1.1+B220+Gr1+Normal-CB6F10.42±0.0726.80±1.0631.63±7.398.66±4.162.06±0.14G-CSF-CB6F14.73±0.5023.76±1.1215.60±2.4637.00±7.356.07±1.03*注：*示与Normal-CB6F1组相比P<0.05。2.2.2移植后+1d输注组（1）造血恢复情况E0组（+1d输注等量生理盐水）造血恢复的变化与单纯造血干细胞移植组无显著差异（P>0.05）。E1组（+1d输注1×107）、E2组（+1d输注3×107）、E3组（+1d输注6×107）均在移植后1~4d，白细胞值快速下降，由移植前（9.17±2.08）×109/L降至+4d时的（0.27±0.04）×109/L，且各组之间无显著差异（P>0.05），随后开始造血恢复，在移植后+7d时，E0组白细胞值为（11.58±1.64）×109/L，而E1组、E2组、E3组分别为（8.19±1.33）×109/L、（5.52±0.81）×109/L、（3.82±0.94）×109/L，与E0组均存在显著性差异（P<0.05）。随后各组白细胞又开始下降，死亡时仍没有恢复。移植后+21d时，E0组、E1组、E2组、E3组的白细胞数值分别为（2.50±0.86）×109/L、（1.30±0.16）×109/L、（1.50±0.46）×109/L、（3.03±1.90）×109/L，各组之间均无统计学差异（P>0.05）。图10各组外周血白细胞变化32 军事医学科学院学位论文（2）植入情况E1组的外周血的供体植入情况与E0组的外周血供体植入情况相比，在造血干细胞移植后的+1d、+4d、+7d、+14d、+21d等的时间点无显著性差异（P>0.05），具体的植入趋势是：移植后+7d时，E0组、E1组均达到完全嵌合（98.03±1.77）%、（97.93±0.59）%，之后供体嵌合比例一直维持在（99.35±1.56）%之间。E2组的植入趋势与E1组类似，但在+7d时，E2外周血嵌合比例为（92.48±6.86）%与E0组、E1组均有显著性差异（P>0.05），在移植后+14d达到完全嵌合水平（98.32±0.32）%。E3组在移植后+4d的外周血嵌合比例为：（34.73±4.91）%，显著低于E0组（53.80±3.25）%，存在着显著的统计差异（P<0.01），在移植+7d，E3组植入率为（85.40±3.49）%与E0组存在显著性差异（P<0.01），此后植入率达到完全嵌合水平，移植后+14d为（98.02±1.30）%。图11各组供体植入变化（3）GVHD情况1大体观察：E0组GVHD发生率为10/10，在移植后第1-7天体重进行性下降，并出现皱毛,一过性弓背但无腹泻，临床体征GVHD评分达到4.74±0.24，随后体重略有回升。在移植14天后，体重再度进行性下降,并伴有精神萎靡、食欲减退、活动性减少、弓背体位、头部腹部脱毛、皮肤少量脱屑、腹泻及肛门红肿等征象，GVHD临床评分在8.18~9.45之间，在移植16d后相继死亡，死亡时平均体重下降40%左33 军事医学科学院学位论文右，中位生存期为24d。E1组与E2组：GVHD发生率为10/10，中位生存期分别为18d和21d。E1组在移植后第1-7天也出现了E0组相同的症状：体重进行性下降，并出现皱毛,一过性弓背但无腹泻，临床体征GVHD评分达到4.51±0.34，但体重回升的时间晚于E0组：E0组的体重恢复在移植后+12d到最高点，而E1组在移植后+18d到达体重恢复至最高点。E2组在移植后第1-7天体重下降之后，并未出现体重回升，而是维持在较低水平，在移植后+18d，体重进行下降。E3组并未出现典型的GVHD症状表现，是由于输注受者细胞数量过多，发生移植排斥，造血功能未恢复，受鼠死于造血衰竭，中位生存期为14d。图12各组小鼠体重变化表8移植后+1d组小鼠生存时间及GVHD发生情况分组输注时间受鼠细胞GVHDGVHD中位生存期输注剂量发生率死亡率E0组+1d等量生理盐水10/1010/1024dE1组+1d1×10710/1010/1018dE2组+1d3×10710/1010/1021dE3组+1d6×107----------14d34 军事医学科学院学位论文图13各组小鼠生存曲线2病理观察：E0、E1、E2组在移植+21d行小肠、皮肤、肝脏病理组织检查，均表现出典型的GVHD病理表现，具体见图14。图14E2组移植后+21d病理结果（A：肝脏B：小肠C：皮肤）A:可见肝组织多处灶性坏死，坏死细胞溶解消失或被结缔组织所取代，如黑色箭头所示；并伴有大量的炎性细胞浸润，炎性细胞为中性粒细胞，如红色箭头所示；坏死灶周围有少量出血，如黄色箭头所示B:肠组织整体结构异常，粘膜层几乎全部糜烂坏死，坏死组织碎屑脱落至肠腔，如黑色箭头所示；部分腺体损伤严重，腺体上皮细胞坏死脱落，如红色箭头所示35 军事医学科学院学位论文C:表皮基底层部分细胞空泡性变，表皮基底层可见淋巴细胞浸润，如黑色箭头所示；表皮局部细胞坏死，胞核消失，如黄色箭头所示；真皮层轻度水肿伴少量炎性细胞（淋巴细胞，嗜酸性粒细胞）浸润，如红色箭头所示2.2.3移植后+4d输注组（1）造血恢复情况F0组为移植后+4d输注等量的生理盐水，其造血恢复的变化与单纯造血干细胞移植组无显著差异（P>0.05）。F1组（+4d输注1×107）、F2组（+4d输注3×107）、F3组（+4d输注6×107）均在移植后1~4d，白细胞值快速下降与F0组相比无显著性差异（P>0.05）。随后开始造血恢复，在移植+7d时，F2组的白细胞数值为（7.89±1.84）×109/L，低于F0组的（11.58±1.64）×109/L，但两组之间无统计学差异（P>0.05）。随后，F0组、F1组、F2组、F3组白细胞开始逐渐下降，F0组在死亡时白细胞仍没有恢复，而F1组、F2组、F3组在移植后+32d~37d之间达到各自的白细胞值最低点（2.10±1.01）×109/L、（2.70±1.17）×109/L、（3.20±1.20）×109/L。随后白细胞水平再一次的缓慢恢复。F2组最高值为（7.58±1.20）×109/L，恢复到正常值水平（4.00~12.00）×109/L，而F1组、F3组最高值分别为：（3.9±1.23）×109/L、（4.56±2.12）×109/L，维持在较低的水平，与F2组相比存在显著性差异（P<0.05）。图15移植后+4d输注各组小鼠外周血白细胞变化（2）植入情况F0组、F1组、F2组、F3组的外周血的供体植入情况，在造血干细胞移植后的+1d、+4d、+7d、+14d、+21d等的时间点无显著性差异（P>0.05）。移植后+7d36 军事医学科学院学位论文时，外周血供者嵌合率分别为：（97.03±3.77）%、（96.00±2.39）%、（97.12±1.84）%、（98.32±2.68）%，均到达完全供体嵌合状态（图16）。图16移植后+4d输注各组供体植入变化（3）GVHD情况1大体观察F0组移植后的体征改变与单纯造血干细胞移植（8Gy照射，输注3×107细胞量组）相似，均是在移植后第1-7天体重进行性下降，并出现皱毛,一过性弓背但无腹泻，之后体重略有回升。在移植14天后，体重再度进行性下降,并伴有精神萎靡、食欲减退、活动性减少、弓背、皮肤少量脱屑、腹泻及肛门红肿等征象，临床体征GVHD评分在9.18~10之间，GVHD发生率为10/10，中位生存期为24d。F1移植组小鼠GVHD发生率为8/10，GVHD死亡率为6/10，中位生存期为45d。受鼠出现一过性静止弓背，轻微的活动度下降，轻度耸毛等表现，但无皮疹、脱毛及腹泻，体重减轻<10%。F2及F3移植组GVHD发生率分别为2/10和3/10，GVHD死亡率均为2/10，中位生存时间大于60d，较F0移植组有显著差异（P<0.01）。移植+14d时，仅有一过性轻度耸毛，未见弓背、皮疹、腹泻，临床体征GVHD评分在0.46—3.45之间，较F0组有显著性差异（P<0.05）。各组小鼠生存情况见Kaplan-Meier生存曲线（见图17）37 军事医学科学院学位论文图17移植后+4d输注组小鼠体重变化表9移植后+4d输注组小鼠生存时间及GVHD发生情况分组输注时间受鼠细胞GVHDGVHD中位生存期输注剂量发生率死亡率F0组+4d等量生理盐水10/1010/1024dF1组+4d1×1078/106/1045d*F2组+4d3×1072/102/10>60d**F3组+4d6×1073/102/10>60d**注：*示与F0组相比P<0.05，**示与F0组相比P<0.01。38 军事医学科学院学位论文图18移植后+4d输注组小鼠生存曲线2病理观察：各组在移植+21d行小肠、皮肤、肝脏病理组织检查。F0组病理结果示：肠腺上皮细胞糜烂脱落坏死，腺体消失，淋巴及单核细胞浸润；皮肤附属结构减少，表皮层及真皮层细胞变性及淋巴细胞浸润；肝组织多处灶性坏死，小灶性或片状炎细胞浸润，肝细胞广泛水肿。F1、F2、F3组的受鼠组织病理结果示：学表皮部分细胞空泡化、个别淋巴细胞浸润，肝细胞肿胀程度；小肠组织黏膜层部分脱落坏死，腺体部分消失，组织内未见明显炎症细胞浸润，但较F0组有显著差异。具体见图19。图19F2组移植后+21d病理结果（A：肝脏B：小肠C：皮肤）A:肝小叶结构基本正常；中央静脉及汇管区有炎症细胞中度浸润；无明显肝细胞坏死，中央静脉无明显淤血B:黏膜层脱落，粘膜上皮细胞糜烂脱落坏死，如红色箭头所示；腺体部分消39 军事医学科学院学位论文失，如黑色箭头所示；组织内未见明显炎症细胞浸润C:组织可见皮肤表皮部分细胞空泡化，如黑色箭头所示；表皮无明显坏死脱落；真皮层纤维排列疏松，并可见个别淋巴细胞浸润，如红色箭头所示。2.2.4移植后+7d输注组（1）造血恢复情况G0组（+7d输注等量生理盐水）造血恢复的情况与单纯造血干细胞移植组无显著差异（P>0.05）。G1组（+7d输注1×107）、G2组（+7d输注3×107）、G3组（+7d输注6×107）在移植后+1d~3d，白细胞值快速下降，由移植前（9.12±2.48）×109/L降至+4d时的（0.30±0.03）×109/L，且各组之间无显著差异（P>0.05），随后开始造血恢复，在移植后+7d时，G0组、G1组、G2组、G3组白细胞值为（10.65±1.74）×109/L、（11.19±1.33）×109/L、（10.06±1.17）×109/L、（9.56±1.20）×109/L。各组白细胞值在+14d、+21d均无显著性差异（P>0.05）。图20移植后+7d输注组小鼠外周血白细胞变化（2）植入情况在造血干细胞移植后的+1d、+4d、+7d、+14d、+21d等的时间点，G0组、G1组、G2组、G3组的外周血的供体植入情况均无无显著的统计学差异（P>0.05）。在移植后+14d时，外周血供者嵌合率分别为：（98.60±0.89）%、（99.12±0.59）%、（97.32±0.89）%、（99.46±2.68）%，均到达完全供体嵌合状态。40 军事医学科学院学位论文图21移植后+7d输注组小鼠供体植入变化（4）GVHD情况1大体观察G0、G1、G2、G3组的GVHD发生率为均为10/10，GVHD死亡率也均为10/10。中位生存时间分别为24d、23d、28d、27d，各组之间并无显著性差异（P>0.05）。四组移植小鼠，均在在移植后第1-7天体重进行性下降，并出现皱毛,一过性弓背但无腹泻。G0组随后体重略有回升，在移植14天后，体重再度进行性下降,临床体征GVHD评分在9.56~10.00之间。G1、G2、G3组体重在移植后+7d至+14d之间，体重回升不明显，维持在降低的水平，随后体重进行性下降，临床体征GVHD评分在9.16~9.67之间。图22移植后+7d输注组小鼠体重变化41 军事医学科学院学位论文表10移植后+7d组小鼠生存时间及GVHD发生情况分组输注时间受鼠细胞GVHDGVHD中位生存期输注剂量发生率死亡率G0组+7d等量生理盐水10/1010/1024dG1组+7d1×10710/1010/1023dG2组+7d3×10710/1010/1028dG3组+7d6×10710/1010/1027d图23移植后+7d输注组小鼠生存曲线2病理检测G0组、G1组、G2组、G3组在移植+21d行小肠、皮肤、肝脏病理组织检查。四组小鼠均出现了典型的GHD病理改变（图24）。图24G2组移植后+21d病理结果（A：肝脏B：小肠C：皮肤）42 军事医学科学院学位论文A:肝小叶界限不明显，如左下图所示；中央静脉内膜增生伴炎症细胞中度浸润，如黑色箭头所示；肝组织灶性坏死伴炎症细胞重度浸润，如红色箭头所示B:肠腺内黏膜上皮糜烂坏死脱落，形态结构消失，粘膜层腺体消失，腺腔内可见坏死碎屑及中性粒细胞、淋巴细胞重度浸润，如黑色箭头所示C:皮肤组织中可见中量淋巴细胞浸润，如黑色箭头所示；组织疏松水肿，局灶性表皮和真皮分离，如红色箭头所示；部分区域表皮细胞中度缺损，如黄色箭头所示2.2.5移植后不同时间输注受者脾细胞3×107组（1）CD3+CD4+、CD3+CD8+亚群比例变化前期实验结果显示，在移植后+4d输注3×107，能够有效地抑制移植后GVHD的发生率，而在相同细胞数量3×107的情况下，在移植后+1d、+4d、输注受者细胞，却不能改善移植后GVHD。因此设计此实验，进行进一步的相关机制的探讨。在移植后+1d、+4d、+7d输注受者细胞3×107分别定义为：+1d输注组（+1dGroup）、+4d输注组（+4dGroup）、+7d输注组（+7dGroup）。阳性对照组（ControlGroup）为单纯造血干细胞移植组。在移植后+10d，各组外周血CD3+CD4+亚群比例分别为：（1.44±0.27）%、（1.63±0.43）%、（1.09±0.20）%、（2.14±1.07）%，各组之间并无统计学差异（P>0.05）。CD3+CD8+亚群比例分别为：（3.55±0.90）%、（3.41±0.79）%、（3.38±1.06）%、（4.99±1.30）%，各组之间仍无显著性差异（P>0.05）。表11各组移植+10dT细胞亚群比例变化分组受鼠细胞受鼠细胞CD3+CD4+CD3+CD8+输注时间输注剂量亚群比例（%）亚群比例（%）阳性对照组----------1.44±0.273.55±0.90+1d输注组+1d3×1071.63±0.433.41±0.79+4d输注组+4d3×1071.09±0.203.38±1.06+7d输注组+7d3×1072.14±1.074.99±1.3043 军事医学科学院学位论文图25各组移植+10d小鼠外周血T亚群比例变化（2）CD3+CD4+、CD3+CD8+亚群的FasL表达变化在正常C57供鼠中，CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率分别为（0.3±0.06）%、（0.4±0.11）%，而在移植后+10d，阳性对照组（ControlGroup）中外周血供者CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率为（72.12±19.05）%、（36.23±15.73）%，显著高于正常供鼠的表达（P<0.05）。而在+4d输注组（+4dGroup）中CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率分别为（10.14±7.26）%、（6.12±5.75）%，显著低于阳性对照组，具有统计学差异（P<0.01），与+1d输注组（+1dGroup）：CD3+CD4+FasL：（51.52±11.12）%、CD3+CD8+FasL：（13.13±3.35）%比较P<0.05，与+7d输注组（+7dGroup）：CD3+CD4+FasL：（68.16±13.25）%、CD3+CD8+FasL：（36.14±9.64）%比较P<0.01，具有显著性差异。表12各组移植+10d外周血T细胞亚群FasL表达比例变化分组受鼠细胞输受鼠细胞CD3+CD4+FasLCD3+CD8+FasL注时间输注剂量亚群比例（%）亚群比例（%）正常供鼠----------0.3±0.060.4±0.11阳性对照组----------72.12±19.0536.23±15.73+1d输注组+1d3×10751.52±11.12*13.13±3.35*+4d输注组+4d3×10710.14±7.26**6.12±5.75**+7d输注组+7d3×10768.16±13.2536.14±9.64注：*示与阳性对照组相比P<0.05，**示与阳性对照组相比P<0.01。44 军事医学科学院学位论文图26各组移植+10dT细胞亚群FasL表达比例变化45 军事医学科学院学位论文2.3讨论在半个世纪前，研究发现，照射后的小鼠输注同种异基因骨髓和脾脏细胞，虽然小鼠从照射损伤和骨髓衰竭中恢复，但是它们死于第二种疾病，这种疾病表现为腹泻、体重下将，皮肤改变，肝脏功能异常等，这种现象被称为移植物抗宿主病（Graftversushostdisease，GVHD）[26]。1966年，Billingham[18]总结了GVHD发生的三个条件：移植物中必须含有免疫活性细胞，受者对移植物无抵制能力，受者表达了相对于供者来讲的外来抗原。目前普遍认为，GVHD的病理生理分为三步。第一步：预处理所致的受者组织受损[2]。化疗或者照射导致了受者全身组织的损伤、活化，及TNF-a、IL-1炎症因子的释放。这些因子通过增加受者APC细胞表面MHC抗原分子和其他的分子的表达，提高供者T识别受者抗原。第二步：供者T细胞活化和克隆扩增。APC细胞以肽-MHC复合物形式提呈组织抗原给供体T细胞，在共刺激信号辅助下，T细胞增殖，Th1/Th2失衡[3]参与aGVHD的发生。第三步：炎症因子[4]和供者细胞攻击受者组织。BauerleinCA[27]、BeilhackA[28]等的实验证明，在小鼠同种异基因的造血干细胞过程中，供者T细胞的动力学表明，在供者细胞输注之后，移植后+3d~+5d之内，供者T细胞迅速汇集到外周淋巴器官（淋巴结和肝脏），进行活化、扩增，进而向周围组织扩散，在+10d~+14d就可引起典型的GVHD体征表现，如腹泻、耸毛、体重下降。这些实验结果表明，进行GVHD的预防和治疗，应在移植早期就开始进行。鉴于此，本实验在设计时，选择了在移植后+1d、+4d、+7d进行受者细胞输注。本实验的研究结果表明，在移植后+1d分别输注受者细胞数量为1×107、3×107的移植组，供体均获得完全嵌合状态（completechimerism，CC），其GVHD发生率和死亡率均为100%，中位生存时间为18d~21d，而输注6×107组，却导致了移植排斥，移植受鼠全部因造血衰竭而死亡，中位生存时间为14d。在移植后+7d时，分别输注受者细胞量1×107、3×107、6×107的移植组，供体均获得CC，其GVHD发生率和死亡率均为100%，中位生存时间为23d~28d。而在移植后+4d时输注受者细胞量为3×107、6×107的移植组，供体均获得CC，其GVHD发生率在20%~30%，显著降低了GVHD的发生率，中位生存时间>60d，显著延长受者存活时间。而在移植后+4d时输注1×107组，GVHD的发生率为80%，中位生存时间为45d。因此，各组的实验结果表明，在移植后+4d时输注受者细胞能显著降低GVHD发生率，延长生存时间，而在移植后+1d、+7d时，并不能降低GVHD发生46 军事医学科学院学位论文率。[10]LeskovarP的“微免疫手术”理论认为造血干细胞移植后，在受者体内存在着HVG和GVH两个方向的的异体反应。介导HVG和GVH的细胞分别源于受者和供者，移植排斥和GVHD分别是两种情况的极端。HVG和GVH是相互抵消和相互牵制的，在合适的情况下HVG和GVH处于平衡状态时，即互不排斥，处于双向免疫耐受。在本研究中，输注的受者细胞与供者的细胞相互抵消和相互牵制，+4d受者细胞输注组在输注3×107时，可能在时间和细胞量上与供者细胞达到了平衡状态，有效的抑制或去除了Allo-T细胞，降低GVHD的发生率。为了进一步的研究移植后+4d输注受者细胞降低GVHD发生率的相关机制，我们探讨了在移植后不同的时间点（+1d、+4d、+7d），输注相同受者细胞数量（3×107）的实验，并检测了移植后受鼠淋巴亚群比例变化和T淋巴细胞的FasL的表达变化。Fas/FasL、穿孔素和颗粒酶途径是CTL细胞主要效应机制。穿孔素和颗粒酶被储存在CTL细胞的细胞毒性颗粒中，通过TCR-MHC相互作用识别靶细胞之后，穿孔素被分泌并插入靶细胞表面，形成穿孔蛋白孔，它可以使颗粒酶进入下调各种效应通路诱导凋亡。Fas配体能够导致死亡诱导信号复合物的形成及caspases的活化。Fas是TNF受体家族成员之一，它表达于许多组织中，包括GVHD靶器官：胃肠道、肝脏、皮肤等。在GVHD中，IFN-γ和TNF-α等炎症因子能增加Fas的表达。表达FasL的供者T细胞能增加GVHD的发生[29;30]。Fasl缺失的供者T细胞能显著的降低肝脏、皮肤的GVHD发生[13]。本实验的研究结果表明，分别在移植后+1d、+4d、+7d输注等量的受者细胞（3×107），移植+10d时，检测外周血CD3+CD4+和cd3+cd8+的亚群比例变化，各组之间并显著性差异（P>0.05）。在单纯造血干细胞移植组GVHD模型对照组中，移植+10d时，T淋巴细胞的Fasl表达率为93%，与前期的研究相符合。在移植后受者细胞输注的各组中，T淋巴细胞的Fasl表达率均低于对照组，其中+4d输注组,T淋巴细胞FasL表达率和GVHD发生率明显低于+1d、+7d两组，上述结果表明FasL的降低表达与减轻GVHD的发生密切相关。目前，受者成分在预防GVHD发生中的作用越来越得到重视。本实验的结果表明，造血干细胞移植后不同时间的受者成分的输注，会导致T淋巴细胞的表面FasL的表达呈现出不同的状态，而FasL的降低表达与减轻GVHD的发生密切相关，但受者的何种成分起到作用，还需要进一步的研究。47 军事医学科学院学位论文2.4结论（1）MHC半相合小鼠造血干细胞移植后+4d时输注受者细胞能显著降低GVHD发生率，延长生存时间，而在移植后+1d、+7d时，并不能降低GVHD发生率。（2）造血干细胞移植后不同时间的受者成分的输注，会导致T淋巴细胞的表面FasL的表达呈现出不同的状态，而FasL的降低表达与减轻GVHD的发生密切相关48 军事医学科学院学位论文参考文献[1]MagenauJ,RunaasL,ReddyP.Advancesinunderstandingthepathogenesisofgraft-versus-hostdisease.BrJHaematol,2016;173(2):190-205.[2]HillGR,CrawfordJM,CookeKR,etal.Totalbodyirradiationandacutegraft-versus-hostdisease:theroleofgastrointestinaldamageandinflammatorycytokines.Blood,1997;90(8):3204-3213.[3]CoghillJM,SarantopoulosS,MoranTP,etal.EffectorCD4+Tcells,thecytokinestheygenerate,andGVHD:somethingoldandsomethingnew.Blood,2011;117(12):3268-3276.[4]HendenAS,HillGR.CytokinesinGraft-versus-HostDisease.JImmunol,2015;194(10):4604-4612.[5]VillaNY,RahmanMM,McfaddenG,etal.TherapeuticsforGraft-versus-HostDisease:FromConventionalTherapiestoNovelVirotherapeuticStrategies.Viruses,2016;8(3):85.[6]BurroughsL,StorbR.Low-intensityallogeneichematopoieticstemcelltransplantationformyeloidmalignancies:separatinggraft-versus-leukemiaeffectsfromgraft-versus-hostdisease.CurrOpinHematol,2005;12(1):45-54.[7]BalonJ,HalaburdaK,BieniaszewskaM,etal.Earlycompletedonorhematopoieticchimerisminperipheralbloodindicatestheriskofextensivegraft-versus-hostdisease.BoneMarrowTransplant,2005;35(11):1083-1088.[8]IldstadST,SachsDH.Reconstitutionwithsyngeneicplusallogeneicorxenogeneicbonemarrowleadstospecificacceptanceofallograftsorxenografts.CahRevThe,1984;307(5947):168-170.[9]邓晓辉,梁辉,严云,etal.移植物与受体T细胞的平衡对移植物抗宿主病影响的实验研究.上海医学,2005;(04):312-314.[10]LeskovarP,PretnarG.Preventionofthegraft-versus-hostdisease(GvHD)byacontrolledhost-versus-graftreaction(HvGR)orbyspeciallypremanipulatedthird-partyeffectorcells.Someadvantagesofthecombinedallogeneicandautologousbonemarrowtransplantation,asdeducedfromanimalexperiments[C].BONEMARROWTRANSPLANTATION,1998:S35-S36.49 军事医学科学院学位论文[11]HardyNM,HakimF,SteinbergSM,etal.HostTcellsaffectdonorTcellengraftmentandgraft-versus-hostdiseaseafterreduced-intensityhematopoieticstemcelltransplantation.BiolBloodMarrowTr,2007;13(9):1022-1030.[12]魏家臣.Fas/FasL介导凋亡细胞机制及其病理生理意义(文献综述).国外医学.外科学分册,2003;(01):21-23.[13]ViaCS,NguyenP,ShustovA,etal.AmajorrolefortheFaspathwayinacutegraft-versus-hostdisease.JImmunol,1996;157(12):5387-5393.[14]ShustovA,NguyenP,FinkelmanF,etal.DifferentialexpressionofFasandFasligandinacuteandchronicgraft-versus-hostdisease:up-regulationofFasandFasligandrequiresCD8+TcellactivationandIFN-gammaproduction.JImmunol,1998;161(6):2848-2855.[15]BraunMY,LowinB,FrenchL,etal.CytotoxicTcellsdeficientinbothfunctionalfasligandandperforinshowresidualcytolyticactivityyetlosetheircapacitytoinducelethalacutegraft-versus-hostdisease.J.Exp.Med.,1996;183(2):657-661.[16]冯晓勤,周淑芸,刘启发,etal.T细胞表达FasL与急性移植物抗宿主病相关性研究.中华血液学杂志,2002;(10):37-38.[17]CookeKR,KobzikL,MartinTR,etal.Anexperimentalmodelofidiopathicpneumoniasyndromeafterbonemarrowtransplantation:I.TherolesofminorHantigensandendotoxin.Blood,1996;88(8):3230-3239.[18]BillinghamRE.Thebiologyofgraft-versus-hostreactions.HarveyLect.,1966;62:21-78.[19]StorbR,DeegHJ,AtkinsonK,etal.Cyclosporin-Aabrogatestransfusion-inducedsensitizationandpreventsmarrowgraftrejectioninDLA-identicalcaninelittermates.Blood,1982;60(2):524-526.[20]WeijtensM,VanSpronsenA,HagenbeekA,etal.Reducedgraft-versus-hostdisease-inducingcapacityofTcellsafteractivation,culturing,andmagneticcellsortingselectioninanallogeneicbonemarrowtransplantationmodelinrats.Hum.GeneTher.,2002;13(2):187-198.[21]SprentJ,KorngoldR.Acomparisonoflethalgraft-versus-hostdiseasetominor-versus-majorhistocompatibilitydifferencesinmice:implicationsformarrowtransplantationinman.Prog.Immunol,1983;5:1461.50 军事医学科学院学位论文[22]BennettM.Biologyandgeneticsofhybridresistance.Adv.Immunol.,1987;41:333-445.[23]MurphyW,KumarV,BennettM.Rejectionofbonemarrowallograftsbymicewithseverecombinedimmunedeficiency(SCID).J.Exp.Med.,1987;165:1212-1217.[24]BrubakerD.Immunopathogenicmechanismsofposttransfusiongraft-vs-hostdisease.P.Soc.Exp.Biol.Med.,1993;202(2):122-147.[25]CourielD,CalderaH,ChamplinR,etal.Acutegraft‐versus‐hostdisease:Pathophysiology,clinicalmanifestations,andmanagement.Ann.Ny.Acad.Sci.,2004;101(9):1936-1946.[26]BarnesD,LoutitJ.TreatmentofmurineleukaemiawithX‐raysandhomologousbonemarrow:II.Brit.J.Haematol.,1957;3(3):241-252.[27]BauerleinCA,RiedelSS,BakerJ,etal.Adiagnosticwindowforthetreatmentofacutegraft-versus-hostdiseasepriortovisibleclinicalsymptomsinamurinemodel.BmcMed,2013;11:134.[28]BeilhackA,SchulzS,BakerJ,etal.Invivoanalysesofearlyeventsinacutegraft-versus-hostdiseaserevealsequentialinfiltrationofT-cellsubsets.Blood,2005;106(3):1113-1122.[29]UenoY,IshiiM,YahagiK,etal.Fas‐mediatedcholangiopathyinthemurinemodelofgraftversushostdisease.Hepatology.,2000;31(4):966-974.[30]WasemC,FrutschiC,ArnoldD,etal.Accumulationandactivation-inducedreleaseofpreformedFas(CD95)ligandduringthepathogenesisofexperimentalgraft-versus-hostdisease.TheJournalofImmunology,2001;167(5):2936-2941.51 军事医学科学院学位论文已发表论著不同时间输注受者动员脾细胞对小鼠半相合移植后移植物抗宿主病的影响摘要目的:研究小鼠MHC半相合造血干细胞移植后,不同时间输注G-CSF动员的自体脾细胞对移植物抗宿主病（GVHD）的影响，并初步探讨其可能机制。方法：将40只造血干细胞移植后的小鼠随机分为4组（n=10）：GVHD阳性对照组(ControlGroup)、+1d受者细胞输注组(+1dGroup)、+4d受者细胞输注组(+47dGroup)、+7d受者细胞输注组(+7dGroup)。输注3×10的G-CSF动员后的受++++者脾细胞，观察GVHD临床体征及病理变化，并检测各组外周血中CD3CD4、CD3D8细胞亚群及其FasL的表达变化。结果：+4dGroup的GVHD发生率明显降低，中位存活时间>60d，显著高于ControlGroup（24d）、+1dGroup（21d）、+7dGroup(28d)(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，而外周血中T淋巴细胞Fasl的表达显著低于其他三组（P<0.05，）。结论：MHC半相合的造血干细胞移植后+4d输注G-CSF动员的受者脾细胞能抑制供者T淋巴细胞的FasL的表达，显著减少GVHD的发生。关键词造血干细胞移植；移植物抗宿主病；淋巴细胞；凋亡相关因子配体TheEffectonGraftVersusHostDiseasebyInfusionofRecipientSpleenCellsatDifferentTimeafterMurineHaploidenticalHematopoieticStemCellTransplantationAbstractObjective:ToexploretheeffectofinfusionG-CSFmobilizationofrecipientspleencellsatdifferenttimeafterMHChaplotype-mismatchedhaploidenticalstemcelltransplantation（HSCT）ongraft-versus-hostdisease(GVHD)inmiceanditspossiblemechanism.Methods:40miceafterHSCTwererandomlydividedinto4groups(n=10)：GVHDpositivecontrolgroup(ControlGroup),+1drecipientcellinfusiongroup(+1dGroup),+4drecipientcellinfusiongroup(+4dGroup),+7drecipientcellinfusiongroup(+7dGroup).Controlgroupwereinjectedthesameequivalentnormalsalinewithexperimentalgroupwhichweregiventhesameamountof52 军事医学科学院学位论文G-CSFmobilizationofrecipientspleencells.ThegeneralmanifestationandpathologicalchangingofGVHDwereobserved.TheexpressionchangesofCD3+CD4+,CD3+CD8+cellsubsetsandFasLinperipheralbloodwasdetectedbyFlowcytometry.Results:GVHDwassignificantlydecreasedin+4dGroupandthemediansurvivaltimewaslongerthan60days,significantlyhigherthanthatofControlGroup(24d),+1dGroup(21d),+7dGroup(28d).(P<0.01，P<0.01，P<0.01)TheexpressionofTFasllymphocytesof+4dGroupinperipheralbloodweresignificantlylowerthanthoseoftheotherthreegroups（P<0.05，）.Conclusion:AfterMHChaplotype-mismatchedHSCT,+4dinfusionofG-CSFmobilizedrecipientspleencellscaninhibittheexpressionofFasLindonorTlymphocytes,andsignificantlyreducetheincidenceofGVHD.Keywordshematopoieticstemcelltransplantation;graftversushostdisease;lymphocyte;FasL造血干细胞移植（hematopoieticstemcelltransplantation）在血液系统恶性疾病和非血液系统疾病中有着广泛应用，但移植后的移植物抗宿主病（GVHD）仍是移[1]植相关死亡的首要原因，限制了其应用。19世纪后期出现的非清髓性移植，造[2-4]血干细胞移植后混合嵌合现象比较多见，而GVHD却有下降，人们认识到受者成分在预防GVHD发生过程中的重要作用，但具体机制尚不清楚。本研究建立小鼠GVHD模型，发现在移植后的不同时间输注受者成分，会导致T淋巴细胞的表面FasL的表达呈现出不同的状态，而FasL的降低表达与减轻GVHD的发生密切相关。材料和法实验动物受鼠:雌性CB6F1小鼠(H-2Kb/d)，60只，购自北京维通利华公司，动物质量合格证号：SCXK-（京）-2012-0001。供鼠:雄性C57BL/6J小鼠(H-2Kb/b)，70只，均为6－8周龄，SPF级，购自军事医学科学院动物中心，动物质量合格证号:SCXK-(军)2012-0004)。实验用鼠均置于清洁动物房内层流架带盖鼠笼中饲养。动物房内温度(23±2)℃，相对湿度为40%-60%，饲养设施合格证号：SCXY-（军）-2007-004。试剂与仪器IMDM培养液为（美国Gibco公司），FBS为杭州四季青产品，重组人粒细胞集53 军事医学科学院学位论文落刺激因子rhG-CSF(300μg/支（)北京双鹭药业）。小鼠淋巴细胞分离液Ficoll(密度1.082g/ml)（美国Sigma公司）,红细胞裂解液（北京凯诺春天），FITC-H-2Kb及Percp-cy5.5-H-2Kd及APC-CY7-CD3、PE-CY7-CD4、APC-CD8、PE-FasL直标抗体（美国BD公司），流式细胞检测仪FACSCantoⅡ（美国BD公司），GWXJ80型60Coγ辐射源（中国核动力研究设计院设备制造厂）。供体细胞制备供鼠C57于移植前-5d开始接受皮下G-CSF动员，100μg/kg，q12h×5d。于移植0d用颈椎脱臼法处死供鼠，超净台内分离脾脏，200目筛网研磨成单个细胞,以淋巴细胞分离液提取单个核细胞（MNC），用红细胞裂解液去除红细胞，计数并调整细胞浓度备用。受鼠照射及细胞回输60受鼠（CB6F1）于移植0d给予Coγ射线全身照射(TBI)8.0Gy,照射量率为1.03Gy/min,照射后4h内经鼠尾静脉接受雄性供鼠C57BL/6脾细胞悬液输入,7细胞量为3×10/鼠。受鼠脾细胞制备正常受鼠（CB6F1）于移植前-5d，给予皮下G-CSF动员，100μg/kg，q12h×57d。5d后处死，取脾脏，制成单个核细胞悬液，调整细胞浓度为6×10/ml备用。实验动物分组造血干细胞移植后受鼠随机分为4组，每组数量为10只：①HSCT+生理盐水（ControlGroup）、②HSCT+受者脾细胞（+1dGroup）、③HSCT+受者脾细胞（+4dGroup）和④HSCT+受者脾细胞（+7dGroup）外周血白细胞检测移植后每周2次用毛细吸管取尾静脉血20μl，EDTA抗凝，用全自动血细胞分析仪检测血常规。供体植入率检测受鼠移植后+1d、+4、+7、+14、+21和+28d分别经尾静脉采血，加入相应流式管中，然后分别加入小鼠单克隆抗体FITC-H-2Kb及Percp-cy5.5-H-2Kd及其同型抗体，4℃避光孵育30min，加入红细胞裂解液去除红细胞，PBS缓冲液洗涤2遍，弃上清液并用PBS重悬后上流式细胞仪检测外周血供体细胞比例。GVHD判断宏观观察每日秤取体重并观察小鼠精神倦怠、活动性减少、弓背、皱毛、54 军事医学科学院学位论文[5]皮疹或者皮肤溃疡等体征，并进行临床GVHD评分。①体重下降<10%为0分，下降10%-25%为1分，下降>25%为2分。②无弓背为0分，轻度弓背只在静止时为1分，重度弓背影响到活动为2分。③无活动度下降为0分，轻度至中度的活动性下降为1分，刺激后才活动否则保持静止为2分。④被毛改变为0分，轻度至中度耸毛为1分，重度卷毛或被毛凌乱。⑤皮肤完整为0分，尾巴及爪子鱼鳞状改变为1分，重度毛脱落为2分。病理组织学观察出现GVHD表现的小鼠,濒死前处死,取其肝、脾、小肠和皮肤标本，以10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察。++++外周血CD4FasL、CD8FasL比例检测受鼠于移植后+10d分别经尾静脉采血，用小鼠单克隆抗体FITC-H-2Kb及Percp-cy5.5-H-2Kd及APC-CY7-CD3、PE-CY7-CD4、APC-CD8、PE-FasL及其同型抗体，经++++流式细胞仪检测外周血中供体的CD4FasL、CD8FasL细胞比例。统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学处理。计量资料采用x±SD表示，两独立样本2采用t检验。计数资料采用χ检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果移植后白细胞恢复情况移植后，各组小鼠外周血白细胞数量均出现下降，在+4d降至最低（0.28±0.04）9×10/L，而后开始造血恢复，各组均在+7d达到峰值，其中ControlGroup为（11.5799±1.64）×10/L，+1dGroup为（5.51±0.81）×10/L与对照组有显著差异（P<0.01），9+4dGroup：（7.88±1.84）×10/L与对照组有显著差异（P<0.05），+7dGroup：9（10.06±1.16）×10/L与对照组无统计学差异（P=0.33）。各组小鼠外周血白细胞数量在达到峰值后，再次下降，+4dGroup在+28d降至最低（2.08±1.20）9×10/L，之后缓慢恢复到正常，其余各组白细胞进行性下降，死亡时白细胞值为9（2.44±1.1）×10/L(图1)。55 军事医学科学院学位论文Figure1．Changeofperipheralwhitebloodcells(PWBC).供体植入供体植入：ControlGroup在移植后+4d时，外周血（PB）的白细胞（WBC）中供者的比例为（53.80±3.25）%，而+1dGroup的外周血的供者比例为（52.32±8.31）%，两组无显著差异。在移植+7d后，各组外周血中供体嵌合均为完全嵌合（98.56±0.68）%，且4组之间并没有统计学差异（图2）。Figure2.Donorchimerismofperipheralwhitebloodcells(PWBC)GVHD情况（1）宏观观察：各组在移植后第1-7天体重进行性下降，并出现皱毛,一过性弓背但无腹泻，临床体征GVHD评分达到4.74±0.24，随后体重略有回升。ControlGroup：在移植14天后，体重再度进行性下降（图3A）,并伴有精神萎靡、56 军事医学科学院学位论文食欲减退、活动性减少、弓背体位、头部腹部脱毛、皮肤少量脱屑、腹泻及肛门红肿等征象，临床体征GVHD评分在8.18—9.45之间。+1dGroup：GVHD发生率为10/10，+7dGroup：GVHD发生率为9/10，与ControlGroup相比均无显著性差异。+4dGroup：移植+14d时，未见弓背、皮疹、腹泻，仅有轻度耸毛。临床体征GVHD评分在0.46—3.45之间，较其他三组均有显著性差异（P<0.05）（图3B）。**P<0.01,comparedwithcontrolgroup.Figure3．(A)weightchangesofmiceindifferentgroups.(B)clinicalscoreofGVHDindifferentgroups.（2）生存情况：ControlGroup在移植16d后相继死亡,中位生存期为24d；+1dGroup中位生存期为21d，+4dGroup仅2只发生GVHD，其死亡时间为+24d和+38d，其他8只CB6F1受鼠未发生急性GVHD且长期存活，中位生存时间大于60d，较ControlGroup、+1dGroup、+7dGroup均有显著性差异（P<0.05）。+7dGroup中位生存时间为28d，各组小鼠生存情况见Kaplan-Meier生存曲线（图4）。57 军事医学科学院学位论文Figure4．Thesurvivalrateindifferentgroups（3）病理组织学观察：各组在移植+21d行小肠、皮肤、肝脏病理组织检查。ControlGroup病理检查：小肠：肠腺上皮细胞糜烂脱落坏死，腺腔内可见坏死细胞碎屑，黏膜层脱落，腺体消失，肠绒毛固有层及粘膜下层可见少量的淋巴及单核细胞浸润。皮肤：皮肤附属结构减少，表皮层可见散在细胞变性及淋巴细胞浸润；真皮层大量淋巴细胞浸润。肝组织多处灶性坏死,肝实质及汇管区可见小灶性或片状炎细胞浸润，中央静脉可见淤血伴炎症细胞浸润，肝细胞广泛水肿。+1dGroup与+7dGroup的小肠、皮肤、肝脏病理变化与ControlGroup并无显著差异。+4dGroup的皮肤病理学改变与ControlGroup相似，但肝细胞肿胀程度较ControlGroup减轻；小肠组织黏膜层部分脱落坏死，腺体部分消失，组织内未见明显炎症细胞浸润，较其他3组有显著差异。58 军事医学科学院学位论文Figure5．Morphologicalchangesoftissuesindifferentmiceat+21dafterHSCT．A:ControlGroup．B:+1dGroup．C:+4dGroupD.+7dGroup.a:intestine．b:skin．c:liver(HE×200)．外周血CD4、CD8亚群及其FasL的表达++++++在正常C57供鼠中，CD3CD4FasL、CD3CD8FasL的表达率分别为（0.3-±0.06）%、（0.4±0.11）%，而在移植后+10d，ControlGroup中外周血供++++++者CD3CD4FasL、CD3CD8FasL的表达率为(72±19)%、(36±15)%，显著高于正常++++++供鼠的表达（P<0.05）。而在+4dGroup中CD3CD4FasL、CD3CD8FasL的表达率+++分别为（10±7）%、（6±5）%，显著低于阳性对照组和+1dGroup（CD3CD4FasL：++++++(51±11)%；CD3CD8FasL：（13±3）%）和+7dGroup（CD3CD4FasL：（68±13）%；+++++++CD3CD8FasL：(36±9)%）（图6H）。但4组的外周血中的CD3CD4、CD3CD8亚群比例均无显著差异(图6E)。59 军事医学科学院学位论文Figure6．FlowcytometricanalysisofFasLstainingisshownforgateddonorCD4+(E)andCD8+(F)peripheralTcells(unshadedcurves)at10daysafterHSCT.ShadedcurvesrepresentFasLisotypecontrol.(G):ThepercentageofdonorCD4+anddonorCD8+ofperipheralbloodcells(H):ThepercentageofCD4+FasL+andCD8+FasL+ofperipheralbloodcellsindifferentgroupsdetectedbyflowcytometryat10day.*P<0.05，**P<0.01comparedbetweencontroland+4dgroup.讨论[6]早在1966年Billingham提出了GVHD发病的3个要素：①移植物中含免疫活性细胞;②受体表达供体没有的组织抗原;③受体处于免疫抑制状态不能将移植物排斥掉。近一步的研究发现，移植前的预处理强度、供受者的MHC配型、受者的基础疾病状况都会影响GVHD的发展进程，但是同种异体反应性T在GVHD的发生、[7]进展过程中起着关键性的作用。针对GVHD的预防和治疗，其基本的策略是减少allo-T的生成或增加allo-T60 军事医学科学院学位论文的去除。大量实验证明，通过阻断T细胞的活化和第二信号，可使GVHD的发生率[8]有所降低。临床上的预防GVHD的药物，主要为免疫抑制剂，它作用于T细胞识别、活化、增殖、归巢及效应的不同环节，抑制T细胞的活化、增殖和发挥效应，从而抑制GVHD的发生，减轻GVHD的严重程度。近年来的减低剂量预处理，能有效减少预处理所带来的损伤，并能降低GVHD[9][10]的发生率。Burroughs和Balon进一步的研究证明，造血干细胞移植后，如果出现混合嵌合造血，则GVHD的发生率明显下降，如果早期即完全供者型造血,则[11][12]有较高的GVHD发生率。Ildstad及国内学者邓晓辉等研究发现，在造血干细胞移植后输注受者细胞能够一定程度的抑制GVHD的发生。上述的实验和观察提示受者自身细胞在降低GVHD方面发挥着重要作用,但具体机制尚不清楚。本研究的结果表明，在经典GHVD模型中，移植后输注受者成分，能减少供者CD4/CD8FasL的表达，减少GVHD的发生率，延长生存时间。在移植后+4d时输注受者成分，抑制T淋巴细胞FasL的表达，显著优于+1d、+7d时输注受者成分，且+4d输注能更好的降低GVHD的发生率。Fas/FasL作为介导细胞凋亡的重要膜蛋白分子,在正常免疫反应、造血调控、机体细胞数量的恒定与调控等生理功能以及多种疾病的病理机制中具有十分重要[13]的意义。Fas广泛存在于各种组织和器官,如胸腺、肝脏、心脏、肾脏等。FasL分布则相对较为限制，主要表达在活化的T细胞，NK细胞上,HLA抗原可诱导T细胞激活表达FasL。造血干细胞移植中，供者淋巴细胞在移植过程中被激活而表达FasL,作用于受者靶器官导致表达Fas阳性的细胞凋亡而产生全身多脏器、组织[14-16][17]损伤。国内学者冯晓勤等发现在aGVHD与T细胞及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达FasL呈正相关。本研究的结果表明，在经典GVHD模型对照组中，T淋巴细胞的FasL表达率为93%，与前期的研究相符合。在移植后受者输注的各组中，T淋巴细胞的FasL表达率均低于对照组，其中+4dGroup中,T淋巴细胞表达率和GVHD发生率明显低于+1和+7d2组，上述结果表明，FasL的降低表达与减轻GVHD的发生密切相关。受者淋巴细胞降低GVHD的另一机制是对供者细胞的免疫攻击。[18]Leskovar等的“微免疫手术”理论认为造血干细胞移植后，在受者体内存在着HVG和GVH2个方向的的异体反应。介导HVG和GVH的细胞分别源于受者和供者，移植排斥和GVHD分别是两种情况的极端。HVG和GVH是相互抵消和相互牵制的，在合适的情况下HVG和GVH处于平衡状态时，即互不排斥，处于双向免疫耐受。[19]Hardy等在临床观察中也得到了同样的结果。在本研究中，输注的受者细胞与供61 军事医学科学院学位论文者的细胞相互抵消和相互牵制，+4dGroup在时间和细胞上达到了平衡状态，有效的抑制或去除了allo-T，进而T淋巴细胞的FasL表达水平处于较低水平。目前，受者成分在预防GVHD发生中的作用越来越得到重视。本实验的结果表明，造血干细胞移植后不同时间的受者成分的输注，会导致T淋巴细胞的表面FasL的表达呈现出不同的状态，而FasL的降低表达与减轻GVHD的发生密切相关，但受者的何种成分起到作用，还需要进一步的研究。参考文献[1]MagenauJ,RunaasL,ReddyP.Advancesinunderstandingthepathogenesisofgraft-versus-hostdisease.BrJHaematol,2016;173(2):190-205.[2]StikvoortA,GertowJ,SundinM,etal.Chimerismpatternsoflong-termstablemixedchimerasposthematopoieticstemcelltransplantationinpatientswithnonmalignantdiseases:follow-upoflong-termstablemixedchimerismpatients.BiolBloodMarrowTransplant,2013;19(5):838-844.[3]RingdenO,ErkersT,AschanJ,etal.Aprospectiverandomizedtoxicitystudytocomparereduced-intensityandmyeloablativeconditioninginpatientswithmyeloidleukaemiaundergoingallogeneichaematopoieticstemcelltransplantation.JInternMed,2013;274(2):153-162.[4]FrassoniF,StradaP,SessaregoM,etal.Mixedchimerismafterallogeneicmarrowtransplantationforleukaemia:correlationwithdoseoftotalbodyirradiationandgraft-versus-hostdisease.BoneMarrowTransplant,1990;5(4):235-240.[5]CookeKR,KobzikL,MartinTR,etal.Anexperimentalmodelofidiopathicpneumoniasyndromeafterbonemarrowtransplantation:I.TherolesofminorHantigensandendotoxin.Blood,1996;88(8):3230-3239.[6]BillinghamRE.Thebiologyofgraft-versus-hostreactions.HarveyLect,1966;62:21-78.[7]ChoiSW,ReddyP.Currentandemergingstrategiesforthepreventionofgraft-versus-hostdisease.NatRevClinOncol,2014;11(9):536-547.[8]BrionesJ,NovelliS,SierraJ.T-cellcostimulatorymoleculesinacute-graft-versushostdisease:therapeuticimplications.BoneMarrowRes,2010;2011:976793.62 军事医学科学院学位论文[9]BurroughsL,StorbR.Low-intensityallogeneichematopoieticstemcelltransplantationformyeloidmalignancies:separatinggraft-versus-leukemiaeffectsfromgraft-versus-hostdisease.CurrOpinHematol,2005;12(1):45-54.[10]BalonJ,HalaburdaK,BieniaszewskaM,etal.Earlycompletedonorhematopoieticchimerisminperipheralbloodindicatestheriskofextensivegraft-versus-hostdisease.BoneMarrowTransplant,2005;35(11):1083-1088.[11]IldstadST,SachsDH.Reconstitutionwithsyngeneicplusallogeneicorxenogeneicbonemarrowleadstospecificacceptanceofallograftsorxenografts.CahRevThe,1984;307(5947):168-170.[12]邓晓辉,梁辉,严云,等.移植物与受体T细胞的平衡对移植物抗宿主病影响的实验研究.上海医学,2005;(04):312-314.[13]魏家臣.Fas/FasL介导凋亡细胞机制及其病理生理意义(文献综述).国外医学.外科学分册,2003;(01):21-23.[14]ViaCS,NguyenP,ShustovA,etal.AmajorrolefortheFaspathwayinacutegraft-versus-hostdisease.JImmunol,1996;157(12):5387-5393.[15]ShustovA,NguyenP,FinkelmanF,etal.DifferentialexpressionofFasandFasligandinacuteandchronicgraft-versus-hostdisease:up-regulationofFasandFasligandrequiresCD8+TcellactivationandIFN-gammaproduction.JImmunol,1998;161(6):2848-2855.[16]BraunMY,LowinB,FrenchL,etal.CytotoxicTcellsdeficientinbothfunctionalfasligandandperforinshowresidualcytolyticactivityyetlosetheircapacitytoinducelethalacutegraft-versus-hostdisease.JExpMed,1996;183(2):657-661.[17]冯晓勤,周淑芸,刘启发,等.T细胞表达FasL与急性移植物抗宿主病相关性研究.中华血液学杂志,2002;(10):37-38.[18]LeskovarP,PretnarG.Preventionofthegraft-versus-hostdisease(GvHD)byacontrolledhost-versus-graftreaction(HvGR)orbyspeciallypremanipulatedthird-partyeffectorcells.Someadvantagesofthecombinedallogeneicandautologousbonemarrowtransplantation,asdeducedfromanimalexperiments.BoneMarrowTransplant,1998;S35-S36.[19]HardyNMHakimF,SteinbergSM,etal.HostTcellsaffectdonorTcellengraftmentandgraft-versus-hostdiseaseafterreduced-intensityhematopoieticstem63 军事医学科学院学位论文celltransplantation.BiolBloodMarrowTransplant,2007;13(9):1022-1030.64 军事医学科学院学位论文个人简历姓名：王俊辉性别：男婚姻状况：未婚出生年月：1990.03民族：汉健康状况：良好学历：硕士出生地：河南郸城政治面貌：党员毕业院校及专业：军事医学科学院，血液病学学习/工作经历：2009.09—2014.06郑州大学本科2014.09—2017.06军事医学科学院硕士攻读硕士期间所获奖励及科研成果：获得2014年度军事医学科学院优秀学员。获得2016年度军事医学科学院二等奖学金发表与学位论文相关的论文1篇。65 军事医学科学院学位论文致谢衷心感谢我的导师—郭梅副主任医师！感激导师对我的辛勤培育和谆谆教导，无论是在临床实习期间，还是在课题研究阶段，郭老师都给予了我无私的帮助！我也从老师严谨治学的态度、敏锐犀利的洞察力以及谦虚谨慎的学风中受益匪浅！同时，我要感谢艾辉胜主任医师，正是艾主任的关心和帮助，才让我能顺利完成学业！还要感谢孙琪云副主任医师，感谢她在临床实习阶段对我生活和学习上给予的无微不至的关怀和鼓励！感谢胡锴勋副主任医师，感谢他在课题研究阶段给予的耐心指导和无私帮助，让我在有限的时间里迅速掌握了实验的技巧和方法！衷心感谢余长林副主任医师、乔建辉副主任医师在学习期间给予的指导。衷心感谢血液室王一老师、黄雅静老师、姚波老师和刘铁强老师在实验技术方面给予的指导和帮助。衷心感谢王璐博士、邓磊博士、王晓娜师姐対实验方面的指导。衷心感谢我的家人，感谢他们多年来一直对我的支持和理解！66
