《加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中图分类号密级公开ＵＤＣ学号１５２５０６１０２３＿中医树＿ＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｔｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｙ博士学位论文ＤＯＣＴＯＲＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究ｍｅ＇ＳｔｕｄｙｏｆＭｏｄｉｆｉｅｄＤｉｏｓｃｏｒｅａＰｉｌｌｓａｇａｉｎｓｔＡｌｚｈｅｉｒｓＬｅｓｉｏｎｓｉｎＣｈｒｏｎｉｃＣｅｒｅｂｒａｌＨｙｐｏｅｒｆｕｓｉｏｎＲａｔｓｐ研究生姓名：陈延指导教师姓名、职称：谭子虎教授‘申请学位：医学博士学科（专业）名称：中医内科学学位类型：学术学位型、湖北中医药大学二〇一八年五月二十日 湖北中医药大学学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖北中医药大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料．对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担．学位论文作者签名年月曰ｈ／Ｓ￥２？关于学位论文使用授权的声明本人完全了解湖北中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部份内容，可以采用复印、缩印或其他手段保留学位论文；学校可以根据国家或湖北省有关部门的规定送交学位论文。同意《中国优秀博硕士论文全文数据库出版章程》的内容。同意授权中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密论文在解密后遵守此规定）论文作者签名玫导师签名，年？月ｚ诈＾ 目录摘要................................................................................................................IAbstract............................................................................................................IV英文缩略词表.................................................................................................IX前言...............................................................................................................1第一部分理论探讨.........................................................................................51慢性脑低灌注的现代医学认识...........................................................51.1慢性脑低灌注的病因和评估....................................................51.2发病机制....................................................................................52中医对慢性脑低灌注的认识...............................................................62.1病位在脑....................................................................................72.2肾虚髓减为本，涉及五脏........................................................72.3痰瘀是VCI的重要病理因素...................................................92.4健脾补肾、化痰祛瘀治法的确立..........................................10第二部分加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠行为学及海马病理学的影响131实验材料.............................................................................................131.1实验动物..................................................................................131.2中药制备..................................................................................131.3主要试剂..................................................................................141.4主要仪器..................................................................................142实验方法.............................................................................................142.1模型复制方法..........................................................................142.2分组和干预..............................................................................152.3Morris水迷宫检测.................................................................152.4HE染色.....................................................................................152.5尼氏染色..................................................................................162.6TUNEL检测...............................................................................16 2.7统计学处理..............................................................................173实验结果.............................................................................................173.1加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠学习记忆的影响..............173.2加减薯蓣丸对海马组织病理损伤的影响..............................18第三部分基于能量应激与自噬研究加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠海马Aβ沉积的作用..........................................................................................211实验材料.............................................................................................211.1实验动物..................................................................................211.2中药制备..................................................................................211.3主要试剂..................................................................................211.4主要仪器..................................................................................242实验方法.............................................................................................242.1模型复制方法..........................................................................242.2分组和干预..............................................................................252.3免疫组化检测..........................................................................252.4实时荧光定量PCR检测.........................................................252.5WesternBlot..........................................................................272.6透射电镜..................................................................................293实验结果.............................................................................................303.1加减薯蓣丸对AMPK能量调节信号的影响........................303.2加减薯蓣丸对应激信号ATF4/eIF2α的影响........................323.3加减薯蓣丸对自噬与Aβ42蛋白沉积的影响.......................34第四部分加减薯蓣丸调控内源性miR-132抑制慢性脑低灌注大鼠海马Tau磷酸化的研究..........................................................................................381实验材料.............................................................................................381.1实验动物..................................................................................381.2中药制备..................................................................................381.3主要试剂..................................................................................38 1.4主要仪器..................................................................................392实验方法.............................................................................................392.1模型复制方法..........................................................................392.2分组和干预..............................................................................392.3实时荧光定量PCR检测mRNA............................................392.4实时荧光定量PCR检测microRNA......................................392.5Westernblot..........................................................................403实验结果.............................................................................................413.1加减薯蓣丸对microRNA-132与GSK-3βmRNA的影响....413.2加减薯蓣丸对Tau磷酸化的影响..........................................41讨论.............................................................................................................431慢性脑低灌注.....................................................................................441.1慢性脑低灌注的病理机制分析..............................................441.2慢性脑低灌注与白质损伤......................................................451.3慢性脑低灌注与认知损伤......................................................452本实验中造模方法探讨.....................................................................463自噬与Aβ沉积..................................................................................493.1自噬损伤与慢性脑低灌注......................................................513.2慢性脑低灌注诱导Aβ沉积...................................................543.3能量代谢异常与自噬调节......................................................553.4中医对自噬的认识..................................................................574MicroRNAs与Tau蛋白磷酸化.........................................................584.1Tau蛋白磷酸化调节机制........................................................584.2MicroRNAs与Tau磷酸化......................................................595CCH干预方法的研究.........................................................................625.1临床前药物..............................................................................625.2环境及体育活动干预..............................................................636加减薯蓣丸临床及基础研究分析.....................................................64 6.1组方分析..................................................................................646.2机制研究..................................................................................64结语.............................................................................................................661结论.....................................................................................................662本研究创新点.....................................................................................663问题与展望.........................................................................................66参考文献.........................................................................................................68附录.............................................................................................................89附录一综述...........................................................................................89附录二博士期间发表论文情况.........................................................106致谢...........................................................................................................107 摘要目的：随着我国老龄人口的增加，老年痴呆发病人数日益增多，带来严重的医疗、社会和经济负担。慢性脑低灌注（CCH）是包括老年痴呆等神经退行性病变的重要诱因之一。尽管对CCH导致认知损伤发病机理研究的逐渐深入，目前临床对老年痴呆的预防和治疗缺乏有效的药物，需要寻找新的治疗思路和药物。CCH所致认知损伤的进展是多靶点的交互影响，研究针对单一靶点的治疗尚未收到令人满意的疗效。中医药复方具有多靶点干预、整体调节疾病病理的作用。因此，有必要研究具有治疗CCH相关认知功能障碍作用的神经保护类中药，探讨中药多靶点的干预作用，为痴呆的防治提供新思路。加减薯蓣丸临床应用于老年痴呆的治疗取得较好疗效，动物实验证实其具有改善CCH所致认知功能损伤的作用，因此本研究将进一步研究加减薯蓣丸的作用机理，探讨加减薯蓣丸对慢性脑低灌注模型大鼠阿尔茨海默样病理改变的作用，从该方对能量调节和应激信号介导的自噬角度探讨其对β淀粉样物质（Amyloidbeta，Aβ）沉积的作用机制，并从对microRNA-132信号的调节角度探讨其对Tau蛋白磷酸化的作用机制。初步阐明加减薯蓣丸改善CCH所致阿尔茨海默样病理改变的机制，为中医药临床推广应用提供理论支持。方法：选取Wistar雄性大鼠60只随机分为4组，分别是正常组、模型组、西药组和中药组，每组15只。除正常组外，其余各组大鼠均进行双侧颈总动脉分次结扎并剪断（改良2VO法），制作慢性脑低灌注大鼠模型，造模后第7天开始灌胃。中药组每日灌胃给予加减薯蓣丸（10g/kg）；西药组每日灌胃给予尼莫地平（10g/kg）；模型组及正常组给予相同剂量生理盐水，各组连续给药4周。4周后行Morris水迷宫行为学检测，观察慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力。行为学检测结束后，牺牲大鼠取全脑切片苏I 木素-伊红染色（HE）观察组织病理改变，尼氏染色（NISSL）观察神经元尼氏体水平，原位末端标记检测（TUNEL）神经元凋亡情况；取海马3CA1区新鲜组织3mm，固定包埋制作超薄切片，铀铅双染色后透射电镜观察海马神经细胞内自噬小体形成；免疫组化检测LC3B、Aβ42、AMPK、p-AMPK、eIF2α、ATF4；qRT-PCR检测microRNA-132及eIF2α、ATF4、GSK-3βmRNA水平；Westernblot检测eIF2α、ATF4、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Tau、p-Tau、GSK-3β蛋白水平。结果：1.Morris水迷宫检测：在逃避潜伏期，第1天和第2天模型组与西药组和中药组所花时间无明显差异，到第3天西药组和中药组与模型组的逃避潜伏期出现明显差别（P<0.05），至第4天中药组、西药组和模型组的逃避潜伏期的时间均减少，西药组显示出最接近正常组的逃避潜伏时间。第5天进行水迷宫空间探索实验结果显示，四组大鼠的游泳速度无明显差异，正常组大鼠会在原平台区域来回游动穿梭或者停留，在平台区域停留时间比例增加，穿越平台次数多。与正常组相比，模型组大鼠的原平台停留时间及穿越次数明显减少（P<0.05），西药组和中药组大鼠经过药物干预后，原平台停留时间比例及穿越次数均较模型组有明显增加（P<0.05）。2.HE染色：正常组大鼠海马CA1区神经元结构完整、排列整齐、核染色清晰，而2VO后的模型组大鼠海马出现神经细胞数量减少、排列疏松、核固缩等神经病理性改变；在中药和西药干预后，海马组织病理结果有所改善，神经细胞数量增多、排列较为规则，提示加减薯蓣丸对CCH大鼠海马区神经元具有保护作用。3.NISSL染色：正常组大鼠海马神经细胞内含有较多的尼氏体，2VO慢性脑低灌注后模型组大鼠海马尼氏体数量减少，经中药及西药干预，尼氏体数量有所恢复。4.TUNEL染色：正常组海马CA1区TUNEL荧光染色神经细胞数量较少，提示凋亡神经元较少；模型组海马CA1区TUNEL荧光染色神经细胞数量明显增多，提示凋亡神经细胞数量增多；经药物干预4周后，西II 药组和中药组海马CA1区TUNEL染色减少。5.透射电镜：在正常组神经细胞中，未观察到形成自噬小体，模型组电镜下可见大量自噬小体，形态多样，包括可见正在包裹胞浆成分的自噬小体；中药组和西药组中也可以观察到自噬小体的出现。6.实时荧光定量PCR检测：CCH后大鼠海马CA1区ATF4、eIF2αmRNA表达水平显著升高（P<0.001）；中药和西药干预后，ATF4、eIF2αmRNA表达水平降低；慢性脑低灌注后大鼠海马microRNA-132水平显著降低（P<0.001），GSK-3βmRNA水平显著升高（P<0.001）；中药和西药干预后，microRNA-132水平升高（P<0.01），GSK-3βmRNA水平降低（P<0.01）。7.Westernblot检测：AMPK、Tau蛋白表达无显著差异。与正常组相比，模型组经CCH后p-AMPK的蛋白表达显著增加（P<0.01），ATF4、eIF2α的蛋白表达显著增加（P<0.001），模型组LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值明显升高（P<0.01），GSK-3β和p-Tau（Ser396）蛋白水平升高，但不影响Tau蛋白的水平；中药和西药干预后，p-AMPK的蛋白水平降低，ATF4、eIF2α的蛋白水平降低，LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值降低，GSK-3β和p-Tau（Ser396）蛋白水平降低。8.免疫组化检测：与正常组相比，模型组经慢性低灌注诱导后p-AMPK表达显著升高（P<0.01），ATF4、eIF2α的蛋白表达显著升高（P<0.001），Aβ42沉积和LC3B均显著升高，可见神经炎性斑沉积；中药和西药干预后，p-AMPK降低，ATF4、eIF2α降低，Aβ42沉积和LC3B降低，中药组与西药组见无显著差异。结论：1.加减薯蓣丸调节能量应激介导的自噬，减少CCH大鼠海马Aβ沉积。2.加减薯蓣丸调节miR-132/GSK-3β信号，抑制CCH大鼠海马Tau磷酸化。关键词：加减薯蓣丸；慢性脑低灌注；阿尔茨海默样病理；自噬；microRNAsIII StudyofModifiedDioscoreaPillsagainstAlzheimer'sLesionsinChronicCerebralHypoperfusionRatsSpeciality:InternalMedicineofTraditionalChineseMedicineAuthor:ChenYanSupervisor:Prof.TanZihuAbstractObjective：Withtheincreaseofagingpopulation,seniledementiainmodernsocietyisaserioushealth,social,andeconomicburden.Chroniccerebralhypoperfusion(CCH)inducedAlzheimer'sandotherneurologicaldegenerativediseases.AlthoughtheCCHinducedcognitiveimpairmentpathogenesisresearchgraduallyproceded,butthecurrentclinicaltreatmentislimitedbyavailabilityandusage.TheinteractionofthedevelopmentoftheCCHdamageismoretargets,studyonthecurativeeffectofthetreatmentofsingletargetshavenotyetreceivedachronic.TraditionalChinesemedicinecompoundhasmultipletargetsforintervention,adjusttheactionofthediseasepathologyasawhole.Therefore,itisnecessarytostudythetraditionalChinesemedicine.ExplorethemechanismofModifiedDioscoreaPillsagainstchroniccerebralhypoperfusionmodelratswithAlzheimer'slesions.Fromtheenergyregulationandstresssignalsmediatedautophagy,exploreitsmechanismagainstbetaamyloiddeposition,andfromthefunctionofthemicroRNA-132signaltoexplorethemechanismagaintTauproteinphosphorylation.Methods：Select60maleWistarratswererandomlydividedintofourgroups,respectivelyisthenormalgroup,modelgroup,westernmedicineandChineseIV medicinegroup,eachgroupof15.Inadditiontothenormalgroup,therestofthegroupratswereperformedbilateralcommoncarotidarteryligationpointstimesandcut,maketheratmodelwithchroniccerebralhypoperfusion,7daysafterthebuildingbegantofillthestomach.ChinesetraditionalmedicinegrouptofillthestomachtoModifiedDioscoreaPillsdaily(10g/kg);Westernmedicinegroupdailylavagegivenimhorizon(10g/kg);Physiologicalsalinemodelgroupandnormalgroupwasgiven,suchascapacity,bothfor4weekscontinuously.4weeksafterMorriswatermazebehaviortest,observationofchroniccerebralischemiaratslearningandmemoryability.Behaviorafterthetest,takethewholebrainsectionwoodgrain-eosinstain(HE)toobservethehistopathologicalchanges,NISSLneuronswereobserved,insituapoptosisdetection(TUNEL)attheendoftheneuronapoptosis;InhippocampalCA1areaoffreshtissue,fixedembeddingproductionofultra-thinsectioning,uraniumleadafterdoublestainingtemobservationhippocampalautophagosomeformation;ImmunohistochemicaldetectionLC3B,Aβ42,AMPK,p-AMPK,eIF2α,ATF4;QRT-PCRtodetectmiR-132andeIF2α,ATF4,GSK-3βmRNAlevel;WesternblotdetectioneIF2α,ATF4,LC3B-Ⅰ,LC3B-Ⅱ,Tau,p-Tau,GSK-3βproteinlevels.Results:1.Morriswatermazetest:Intheescapelatency,the1stand2nddays,modelgrouphasnoobviousdifferencewasfoundinthetimespentwithwesternmedicineandChinesemedicinegroup,onthethirddayofwesternmedicinehasobviousdifferencewasfoundinthetimespentwithwesternmedicineandChinesemedicinegroup(P<0.05),Inthe4thday,theescapelatencytimeoftraditionalChinesemedicine,westernmedicinegroupandmodelgroupwerereduced,thewesternmedicinegroupshowedthemostclosetonormaltheescapelatencytime.5thdayofwatermazespaceexplorationexperimentresultsshowthattheswimmingspeedbetweenthefourgroupsV havenoobviousdifference.Normalgroupratsswimtoareaoftenandfromtheoriginalshuttleorstay,residencetimeratioincreases,passtheplatformareaoften;Comparedwithnormalgroup,thenumberofmodelgroupratsspentinoriginalresidencetimedecreasedsignificantly(P<0.05),westernmedicineandChinesemedicinegroupratsafterdrugintervention,timescaleandthenumberofpassingtheoriginalresidencehaveimprovedsignificantlyinthemodelgroup(P<0.05).2.HEstaining:NormalgroupofhippocampusCA1areaneuronsneatly,clearnuclei,andafter2VOmodelgroupratshippocampalnervecellsdecreased,looselyarranged,nuclearpyknosisneuropathyrationalchange,intraditionalChinesemedicineandwesternmedicineaftertheintervention,thehippocampusnervepathologyresultsimproved,nervecellnumberincrease,morerules,suggesttoModifiedDioscoreaPillsforchroniccerebralhypoperfusionratshippocampalneuronsplaysaprotectiverole.3.TheNisslstaining:NormalgroupratshippocampalneuronscontainedwithmoreNissl,2VOafterchroniccerebralhypoperfusionmodelgroupratsdecreasedinthenumberofNissl,thetraditionalChinesemedicineandwesternmedicineintervention,Nisslamountrecovered.4.TUNELstaining:NormalgroupofTUNELfluorescentdyecellnumberisless,lesstipapoptosisofnervecells;ModelgrouphippocampalCA1areaTUNELfluorescencestainingcellsincreasedobviously,promptapoptosisnervecellpopulations;BythewesternmedicineandtraditionalChinesemedicine(TCM)aftertheintervention,westernmedicineandChinesemedicinegroupdecreaseinthenumberofTUNELstainingcellsinhippocampalCA1area.5.Transmissionelectronmicroscopy(TEM):TEMinnormalgroupwasnotobservedintheformationofautophagosome,alargenumberofobservedinmodelgroupautophagosome,morphologicaldiversity,includingvisibleisVI theparcelautophagosomecytoplasmcomponents;IntraditionalChinesemedicineandwesternmedicinegroupautophagosomecanalsobeobserved.6.Real-timefluorescentquantitativePCRdetection:RathippocampalCA1regionafterchroniccerebralhypoperfusionATF4,eIF2alphamRNAexpressionlevelwassignificantlyincreased(P<0.001),thetraditionalChinesemedicineandwesternmedicineaftertheintervention,ATF4,eIF2alphamRNAexpressionlevels;AfterchroniccerebralhypoperfusionratshippocampalmiR-132weresignificantlyreduced(P<0.001),GSK-3betamRNAlevelincreasedsignificantly(P<0.001);TraditionalChinesemedicineandwesternmedicineaftertheintervention,microRNA-132levels(P<0.01),GSK-3betamRNAlevelswerelower(P<0.01).7.Westernblotdetection:eachgroupofrathippocampalCA1areaAMPK,Tauproteinexpressionhadnosignificantdifference.Comparedwiththenormalgroup,modelgroupafterinducedbychronichypoperfusion,p-AMPKproteinsweresignificantlyincreased(P<0.01),significantlyincreasedtheproteinlevelsofATF4,eIF2alpha(P<0.001),modelgroupLC3BⅡ/Ⅰratioincreasedsignificantly(P<0.01),GSK-3βandp-Tau(Ser396)proteinlevels,butdoesnotaffecttheTauproteinlevel,traditionalChinesemedicineandwesternmedicineaftertheintervention,reducedproteinlevelsofp-AMPK,ATF4,eIF2alpha,LC3BⅡ/Ⅰratio,GSK-3βandp-Tau(Ser396)proteinlevels.8.Immunohistochemicaldetection:Comparedwithnormalgroup,modelgroupafterinducedbychronichypoperfusion,p-AMPKproteinsweresignificantlyincreased(P<0.01),significantlyincreasedtheproteinlevelsofATF4,eIF2alpha(P<0.001),Aβ42proteindepositionandLC3Bproteinlevelsweresignificantlyelevated,nerveinplaquedeposits,traditionalChinesemedicineandwesternmedicineaftertheintervention,reducedproteinlevelsofp-AMPK,ATF4,eIF2alpha,LC3B,GSK-3β,thetraditionalChineseVII medicineandwesternmedicinegroupnosignificantdifference.Conclusion:1.ModifiedDioscoreaPillsregulatedenergystressmediatedautophagyaganistAβdepositioninducedbyCCH.2.ModifiedDioscoreaPillsregulatedmiR-132/GSK-3βsignalaganistTauproteinphosphorylationinducedbyCCH.Keywords:ModifiedDioscoreaPills;ChronicCerebralHypoperfusion;Alzheimer'sLesions;Autophagy;MicroRNAsVIII 英文缩略词表缩略语英文全称中文全称AβAmyloid-βpeptideβ-淀粉样蛋白ADAlzheimer'sdisease阿尔茨海默病ANOVAAnalysisofvariance方差分析APPAmyloid-βprecursorproteinβ-淀粉样前体蛋白AVAutophagicvacuole自噬泡APPAmyloidprecursorprotein淀粉样前体蛋白BBBBlood-brainbarrier血脑屏障BCASBilateralcommoncarotidarterystenosis双侧颈总动脉狭窄BDNFBrainderivedneurotrophicfactor脑源性神经营养因子CCACommoncarotidartery颈总动脉CREBcAMPresponseelement-bindingprotein环磷酸腺苷反应元件结合蛋白CCHChroniccerebralhypoperfusion慢性脑低灌注CBFCerebralbloodflow脑血流量EREndoplasmicreticulum内质网eIF2αEukaryotictranslationinitiationfactor2α真核生物的翻译起始因子2的α亚基FTDFrontotemporallobedementia额颞叶痴呆HEHaematoxylinandeosin苏木素和伊红HIF-1αHypoxiainduciblefactor-1α缺氧诱导因子1αHRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶LC3Microtubule-associatedlightchain3微管相关蛋白3MCIMildcognitiveimpairment轻度认知功能障碍MDPModifiedDioscoreaPills加减薯蓣丸MWMMorriswatermazetest水迷宫实验IX NFTsneurofibrillarytangles神经纤维缠结NMDAN-methyl-D-aspartateN-甲基-D-门冬氨酸NVUNeuro-vascularunit神经-血管单元PSPProgressivesupranuclearpalsy进行性核上性麻痹ROSReactiveoxygenspecies活血氧RT-PCRrealtime-polymerasechainreaction实时聚合酶链反应VCIVascularcognitiveimpairment血管性认知功能损伤2VO2-Vesselocclusion两侧颈总动脉结扎VDVasculardementia血管性痴呆VCINDVascularcognitiveimpairmentnodementia非痴呆血管性认知功能障碍WMIWhitematterinjury白质损伤X 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究前言老年期痴呆（Seniledementia）是老龄人常见的进展性认知功能下降，包括记忆、注意、空间、语言和问题解决能力的下降。老年期痴呆主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)、血管性痴呆(Vasculardementia，VD)和混合痴呆。AD作为老年人中最常见的痴呆症，其特点是慢性进行性神经退化导致进行性认知障碍和最终患者的死亡。AD在大多数情况下是散发，可能由多种因素引起，特征性组织病理学改变是脑内都存在的神经原纤维缠结(Neurofibrillarytangles，NFTs)和老年斑形成，伴随着大脑中[1]的神经退化。VD是由脑血管病变及其危险因素所致的认知功能损伤，与大脑血液供应相关。混合痴呆的病人是具有AD和脑血管疾病的证据时诊断，基于神经影像学临床或缺血性病变的证据。事实上，AD和VD经常在老年痴呆患者并存。据估计，多达40%的AD实际上是混合痴呆患者[2]。[3]慢性脑低灌注(Chroniccerebralhypoperfusion，CCH)又称慢性脑缺血，是脑血管疾病的主要机制之一，可以由高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、吸烟和心脏疾病导致。这些因素会影响大脑血管系统，导致脑血液供[4][5]应减少。CCH患者通常都有不同程度的认知损伤。CCH在痴呆领域[6]的作用已经在神经科学研究的前沿凸显，相对于无颅内动脉狭窄痴呆患[7]者，中度或重度颅内动脉狭窄的痴呆患者认知功能下降更快。在过去十年的研究中已经表明，CCH可能通过影响神经能量衰竭、产生活性氧、激活小胶质细胞产生促炎细胞因子，进而破坏神经元和诱导白质病变，促[8,9][12]进神经退化、VD以及AD进展。脑血流量减少是老龄人群常见病理表现，也是老年认知障碍的主要危[10]险因素之一。大量临床研究表明，脑血流量不足经常存在于轻度认知功[11]能障碍（Mildcognitiveimpairment，MCI）患者，表明大脑血流量不足[10]与认知功能的损伤具有重要的相关性。研究表明，慢性脑低灌注引起的脑血流的减少与老年人的认知功能下降有关，会导致临床认知功能损伤的1 湖北中医药大学2018届博士学位论文[13,14]出现以及促进痴呆的进展。CCH是老年人出现MCI、VD以及晚发型[15]AD等的主要病理因素之一。CCH是AD和VD重要病理机制，大量研究证实AD与血管病变诱[16]导神经退行性病变累积密切相关。CCH是神经退行性病变包括阿尔茨海默样脑病理改变的重要诱因之一。对于CCH导致阿尔茨海默样病理改变的分子机制尚不清楚，目前研究结果提示，CCH可以引起能量代谢障碍、细胞自噬异常、蛋白质合成及表观遗传调控异常、神经细胞凋亡、小胶质细胞激活等，这其中部分机制与β淀粉样物质沉积（Amyloidbeta，Aβ）和Tau蛋白的异常相关。AD的主要神经病理标志是Aβ沉积以及Tau过度磷酸化。大量临床[17,18]及动物实验证实，CCH可以导致Aβ、Tau等AD样病理产物的异常。微管相关蛋白Tau可以促进神经元内微管的组装和稳定，微管功能的正常发挥是轴突运输和神经突触生长的重要基础。Tau蛋白磷酸化异常沉积是多种神经退行性疾病的病理表现，包括AD、进行性核上性麻痹（Progressivesupranuclearpalsy，PSP）和额颞叶痴呆（Frontotemporallobe[17,18]dementia，FTD）等。Aβ是AD等神经退行性疾病重要的病理特征，Aβ的沉积主要与其生成和清除的障碍有关。Aβ的生成主要在神经细胞，包括Tau蛋白磷酸化也主要发生在神经细胞；而Aβ的清除主要分为细胞内外两部分，细胞外的Aβ沉积需要小胶质细胞吞噬降解清除，在细胞内的Aβ异常可以由神经细胞自噬降解清除。在AD实验研究中发现，自噬具有吞噬Aβ，促进其清除的作用，AD模型中由于自噬水平的降低，导致Aβ进一步沉积。但在CCH所致的VD模型中，自噬水平在CCH后的20周仍然显著高于正常水平，在CCH过程中自噬与Aβ的相关性与AD[19]明显不同，需要进一步研究分析。因此，我们推测CCH中自噬水平的异常，可能是其Aβ蛋白水平增加的潜在机制。自噬主要通过溶酶体对损伤细胞器和异常蛋白降解，是高度保守的细[20]胞反应。通过自噬，细胞可以对自身组织的吞噬消化以循环利用氨基酸及蛋白质，这对于细胞器的更新、能量的维持、蛋白质的合成等代谢途径2 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究[21]尤为重要。在机体组织出现营养缺乏、细胞器损伤以及非折叠蛋白沉积等多种应激刺激时，会影响细胞自噬过程，并且参与肿瘤、神经退行性疾[22,23]病进程。CCH导致神经细胞缺血缺氧，出现能量供应不足，能量代谢障碍导致蛋白质合成及功能紊乱，诱导自噬。目前研究发现，在受到内质网应激压力刺激时，自噬会作为一种生存机制被激活，而这种刺激主要[24,25]是诱导自噬小体的形成。有研究表明，eIF2α/ATF4信号参与调节自噬，[26,27]内质网应激以及缺氧等，并且与自噬重要基因Map1lc3b形成相关。在持续缺氧，ATF4水平的上调对于维持自噬流的高水平及促进细胞存活具有重要作用。有研究发现，在氨基酸缺乏时，eIF2α磷酸化以及GCN2激[28,29]酶的激活是诱导自噬的重要因子。但对于eIF2α/ATF4信号通路对自噬调节的精确机制尚不清楚，有研究证实ATF4参与调节自噬相关基因的表达，例如：p62、Atg16l1、Map1lc3b、Atg12、Atg3、Becn1、Gabarapl2[30]等。尽管对于CCH诱导认知损伤的发病机理的研究逐渐深入，但目前临[31]床治疗受限于有效性和使用情况。CCH损伤的发展是多靶点的交互影响。目前治疗多集中于单一靶点的治疗，未能收到令人满意的疗效。因此，有必要研究具有治疗CCH相关认知功能障碍作用的神经保护类中药，探讨中药多靶点干预作用，为痴呆的防治提供新思路，有助于为临床推广使用提供理论支持。加减薯蓣丸源自张仲景《金匮要略》的薯蓣丸，已故名老中医吕继端教授总结临床经验，结合临床老年人认知功能下降多因髓海不足的临床特点化裁而来，选用山药、熟地黄、制何首乌、党参、白芍、麸炒白术、茯苓、远志、当归、川芎、石菖蒲、枸杞、杜仲、五味子共14味中药，具有健脾补肾、化痰祛瘀的功效。临床研究发现，加减薯蓣丸可以有效早期干预非痴呆型血管性认知功能障碍（Vascularcognitiveimpairmentnodementia，VCIND）、VD和AD的进展，通过观察分析磁共振波谱的变化特点，发现其作用机制可能与调节中枢胆碱能神经系统，参与神经系统修[32-34]复相关。除此之外，在动物实验表明，加减薯蓣丸可以改善CCH所3 湖北中医药大学2018届博士学位论文致认知损伤模型大鼠的行为学表现，其作用机制与其升高神经营养因子的[35,36]水平、促进抗凋亡因子的表达等作用相关。这些研究表明，加减薯蓣丸具有干预痴呆进展的神经保护作用，在CCH所致的认知损伤动物模型研究中，初步证实了其可有效干预CCH所致的认知功能损伤，但对于其作用机制有待深入研究。CCH是老年人认知下降和痴呆进展的重要诱因，涉及多种病理进程。因此，从多角度抑制CCH病理进展是治疗临床老年认知功能损伤和痴呆的较为有效的策略。本研究将通过建立CCH大鼠模型，研究加减薯蓣丸对CCH所致大鼠学习记忆损伤及阿尔茨海默样病理的作用，并从能量代谢及应激异常诱导的自噬和microRNA调节途径探讨其作用机制。4 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究第一部分理论探讨慢性脑低灌注（CCH）常见于老年人群，与VD及AD密切相关。“慢性脑低灌注”是老年人常见的病理生理状态，但在临床上对CCH所导致的症候群的病变尚未统一，包括“慢性脑缺血”、“慢性脑供血不足”、“脑动脉硬化症”等，对于CCH导致的相关疾病的命名尚有争论。中医没有相对应病名，根据其临床特点，可见于“眩晕”、“中风”、“健忘”、“痴呆”等疾病过程中。本文主要针对CCH对认知障碍疾病病理改变的影响及中医药的认识进行分析。1慢性脑低灌注的现代医学认识1.1慢性脑低灌注的病因和评估CCH有多种病因，对VD、AD等神经退行性性疾病的发展起着重要的作用，导致CCH主要与三方面因素有关：(1)血管结构病变，包括动脉粥样硬化、动静脉畸形、大动脉炎等导致的动脉狭窄或阻塞引起；(2)脑血流动力学变化，包括慢性失血、长期低血压、因心力衰竭导致心输出量减少；(3)血液成分的变化，导致血液粘度增加的任何原因，如高血压、高脂血症、红血球增多症和高同型半胱氨酸血症，主要危险因素包括：吸[37]烟、肥胖、呼吸窘迫综合症等。现代医疗技术的发展使得评估非常实用。在门诊，脑灌注不足通常是通过经颅多普勒超声、计算机断层扫描血管造影、磁共振血管造影术、电脑断层摄影术灌注成像、灌注加权成像评估、正电子发射型计算机断层显[38]像等评估。动物研究评估CCH可以用激光多普勒血流仪或者信号分子[39]评估，例如缺氧诱导因子-1(HIF-1)、葡萄糖转运蛋白(GLUTs)1和3等。1.2发病机制慢性脑低灌注导致的神经病理损伤涉及多个机制，以往研究多集中在氧化应激、脑白质病变、突触脱失、神经元凋亡、神经递质代谢等方面。近年来发现能量代谢也在其发病过程中发挥重要作用。能量代谢障碍：脑细胞的主要能源供应来自糖有氧代谢,脑组织本身5 湖北中医药大学2018届博士学位论文能源储备较少。因此，脑组织易受缺血缺氧损伤。蛋白质信息之间的合成和磷酸化、突触传递、细胞内离子稳定维持都是消耗能量的过程，因此能[40]量代谢正常对维持细胞结构和功能至关重要。脑血液供应不足，能量供应不足不能满足组织的需求，造成脑功能障碍和脑组织损伤，导致认知障碍。研究发现，对Wistar大鼠进行双侧颈总动脉结扎（2VO）后1周，脑[41]皮质血流减少30-45%，海马部位减少了20%。并且局部大脑的葡萄糖利用率也显著降低，皮质的葡萄糖利用率在结扎后1周大脑皮质下降[42]20-30%，海马部位下降了15%。当脑血流量（CBF）减少，大脑的葡萄糖和氧供应不足，营养缺乏，影响葡萄糖的有氧氧化，影响ATP产生。ATP缺乏会导致氧化应激反应、酸中毒以及兴奋性氨基酸损失，导致神经元凋亡，影响认知功能。脑白质病变：脑实质的血流供应来源于软脑膜，脑白质相比脑皮质部位更深、血流供应较少，容易出现缺血损伤。脑血流量不足时，脑白质的组成成分胶质细胞易于损伤。脑白质是中枢神经系统重要的支撑结构，含有大量的神经纤维，是脑与人体感知器官的重要传递部分，参与感觉记忆等的形成；另外也是重要的支持成分，保护营养神经元。研究发现，CCH导致脑白质病变，诱导神经胶质细胞的增殖和激活，髓鞘脱失，影响着正[43]常功能的神经细胞生存，细胞间的信号传递，从而影响学习和记忆功能。2中医对慢性脑低灌注的认识慢性脑低灌注（CCH）是导致认知功能障碍的重要血管因素，而CCH导致的认知功能障碍称为血管性认知功能障碍（Vascularcognitiveimpairment，VCI）。VCI是由脑血管病及其危险因素导致的一类认知功能损伤的综合征，涵盖了非痴呆性的轻度认知功能障碍和VD。既往研究表明，CCH是导致VCI的重要病理因素，也是加重AD的重要病因。VCI属于中医的“健忘”、“痴呆”范畴，因疾病进展的阶段不同，最开始患者的主要临床表现是善忘，属于“健忘”阶段，随着疾病的进展，患者出现呆、傻、愚、笨的症状，属于“痴呆”阶段。因此，对于VCI的概念，可以从对“健忘”、“痴呆”疾病的记载中挖掘研究。6 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究VCI发病与血管因素密切相关，以血管疾病为因在前，认知功能障碍为果在后，其发病具有类似血管性疾病以及神经退行性疾病的特点。脑血管性疾病的特点较为符合中医“中风”病范畴，其病机特点可概括为风、火、痰、瘀、气、虚这六点。VCI的发病与中风病相关，以内伤积损，精气亏虚为本。可因风火相煽，气血逆乱，耗伤脏腑；肝肾阴虚或者脾肾阳虚，气血津精生化不足；中老年人五脏虚弱，运化乏力，精血亏虚，加上痰瘀等病理产物的堆积，以至脑髓失养，神机失用，灵机记忆损伤。因此，VCI的发生主要以肾精亏虚为本，痰瘀是疾病发展的重要因素，见于疾病的各个时期。2.1病位在脑VCI的临床表现主要归属于中医“神”的功能失常，包括善忘、痴呆等疾病。中医的“神”有广义和狭义的概念之分，广义的“神”指的是人体生命活动的外在表现，包括面色、语言、运动、眼神等表现；狭义的“神”指的是精神、意志和思维活动。VCI的表现主要指的是狭义的“神”的功能失常。脑主神明，脑为髓海，是精髓和神明的主宰，为元神之府。《灵枢·海论》记载：“脑为髓之海。”《素问·五脏生成》记载：“诸髓者，皆属于脑。”表明脑是最大的聚髓之处，并且支配调控髓的功能。《本草纲目》中提到“脑为元神之府”，《医林改错》中进一步论述“灵机记性皆在脑”，提到了脑对于狭义之神的主导作用。《本草备要·辛夷》中记载“小儿善忘者，脑未满也；老人健忘者，脑渐空也”，提示脑与认知功能相关。2.2肾虚髓减为本，涉及五脏慢性脑缺血好发于中老年人群，主要与中老年人的体质特点相关，元气虚衰，五脏渐弱，肾精不足，髓减脑消，遂致记忆减退。因此，慢性脑低灌注发病与肾虚密切相关。在《医学心悟》中提到“肾主智，肾虚则智不足”。《医碥》中提到“在下为肾，在上为脑，虚则皆虚”，《重庆堂随笔》记载有“水足髓充，则元神精湛而记忆不怠矣”，指的是肾精充足则髓海得养。《医林改错》中论述“年高无记忆者，脑髓渐空”，指的是中老年人群认知功能下降的主要原因在于脑髓失养、髓海渐空；并进一步阐述到“年高7 湖北中医药大学2018届博士学位论文肾虚，髓海空虚，发为呆病”，提出老年人髓减以致髓海空虚发为痴呆的原因，主要是和肾虚有关。所以这里我们就可以看到，认知功能的下降与年龄也相关。《素问·上古天真论》记载有“女子……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。丈夫……七八肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极”，指出中老年人随着年龄增长肾功能下降，肾精减少，出现年高肾虚精少，以致髓减致亏，表现为记忆下降，甚至痴呆的症状。另外进一步论述到“肾者主水，受五藏六腑之精而藏之”，指的是肾精受到五脏六腑之精的补充，而中老年人“五脏皆衰”，肾精得不到有效的补充，故而出现肾精亏虚。脾藏意，与记忆的形成相关；主运化，为后天之本，气血生化之源，与脑髓的充养密切相关。在《三因极一病证方论·健忘证治》中有提到“脾主意与思，意者记所往事，……今脾受病，则意舍不清，心神不宁，使人健忘”，指出脾与记忆相关。《素问·经脉别论》中提到“脾气散精”，中央脾土以灌四滂，五脏六腑得以充养，而肾“受五脏六腑之精而藏之”，因为脾胃的运化水谷精微的功能，五脏六腑之精得养，肾精得以补充。肾精得后天水谷之精和五脏六腑之精的充养，肾精充足则脑髓得养。脾主运化的功能，一方面使气血生化有源，五脏六腑得养，另一方面，脾运化水液，使得水津四布，若运化失常则聚湿生痰，上蒙脑窍。肝藏血，藏魂，司疏泄，五脏功能的发挥都离不开气机的正常，认知功能也与情志疏泄相关。《灵枢·本神》记载“随神往来谓之魂”，提到肝藏魂对于神的功能具有重要的辅助作用。在《辨证录·呆病门》中有论述到“呆病之成，大凡其始也，起于肝气之郁”，指出痴呆的发病与肝郁有关，并进一步论述到“肝郁则木克土，而痰不能化；盘踞于胸外，使神明不清，而成痴呆矣”，分析了肝郁致病的病机，与痰阻神昧相关。心主血脉，心藏神。心与VCI关系密切，心主血脉的功能包括了心生血和行血的功能，一方面心气血不足，心神失于濡养，则神失所主；另一方面，心气虚推动无力，气虚血瘀，脑络不畅，神明失养。《素问》记载“心者，君主之官，神明出焉”，提到心与神志密切相关。《医方集解·补8 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究养之剂》中论述到“人之精与智皆藏于肾，肾精不足则志气衰，不能上通于心，故迷惑善忘也”，说明了心肾相关与认知功能障碍的重要关系。在《类证治裁》中论述到“人之神宅于心，心之精依于肾”，清代陈士铎则提到“心肾相交而智慧生”，因此心肾相交也是认知功能正常的重要基础。肺主气，司呼吸，朝百脉，主治节，在志为魄。肺与心一样对于VCI的病因，也就是血管疾病具有直接的调节作用。《灵枢·天年》中记载“八十岁，肺气衰，魄离，故言善误”，提到了肺与语言功能或者思维活动相关。2.3痰瘀是VCI的重要病理因素痰瘀是中老年人常见的致病因素，也是五脏功能衰退和饮食情志不节等导致的常见病理产物，同样也是血管性认知功能障碍的常见病理因素。朱丹溪在《丹溪心法·健忘》中提到“健忘者，精神短气者多，亦有痰也”，指出对于健忘，即非痴呆性血管性认知功能障碍，多起于肝郁，但肝郁克脾，影响脾胃运化，产生痰邪。所以在《石室秘录》提出“痰势最盛，呆气最深”，说明痰是疾病发展的重要致病因素。在陈士铎《辨证录·呆病门》例专篇对本病的发生发展进行了详细阐述，提到“肝郁则木克土而痰不能化，胃衰则土不制水而痰不能消，于是痰积于胸中，盘踞于心外,使神明不清而成呆病矣”，指出病因与情志失调，饮食伤脾等相关，病机与痰有关,并进一步提出“治呆无奇法,治痰即治呆”。对于痰的代谢，主要与水液代谢相关，与肺脾肾三焦密切相关，脾的运化功能，肺的通调水道，肝的疏泄以及肾的气化功能出现异常，都会导致痰浊内生，痰随气升，上蒙脑窍，神志异常。《医林绳墨》中提到“夫人身之气血也，精神之所依附者”，血是神志功能发挥的基础。历代医家对瘀血和认知的关系也多有阐述，在《景岳全书》中提到“心有瘀血，则令人善忘”，在《千金翼方》中提到“腹中瘀血,令人善忘”，在《医林改错》则提出“凡有瘀血也令人善忘”。对于瘀血的形成，与气血亏虚有关，在《读医随笔》中提到“气血不虚不滞，虚则无有不滞者”，指出气血亏虚，推动无力导致瘀血产生。对于血管性认知功能障碍中瘀血的形成，主要与气虚血瘀相关，五脏功能减弱，气血生化不足，气虚9 湖北中医药大学2018届博士学位论文推动无力，瘀血内阻；另外就是与肝的疏泄相关的气滞血瘀、阳虚导致寒凝血瘀等较为常见。在对256例慢性脑缺血患者的中医临床证候进行统计分析调查中就气虚证、肾虚证和血瘀证所占比例分别为59%、53%和44%，并且病程越长，这三者所占的比例越高，这也提示了本病的证候特点[44]。2.4健脾补肾、化痰祛瘀治法的确立血管性认知功能障碍以正气虚衰为主，痰瘀病邪贯穿病程始终，因此对于本病的治疗应当攻补兼施。清代王清任《医林改错·脑髓》就提到饮食可以化髓，入脑充养髓海，“精汁之清者，化而为髓，由脊髓上行入脑名曰髓海”，因此，健脾可以益髓。李东垣《脾胃论》中也有类似论述“真气又名元气，乃先身生之精气也，非胃气不能滋之”，脾胃运化气血可以滋养肾精，即健脾可以滋养肾精。张景岳《类经》有进一步阐述了脾和肾的关系，“肾精之化因于脾胃，以火土而言，则土中阳气根于命门”，所以补肾温阳可助脾运，由此可见健脾补肾相辅相成。2.4.1VCI的中医证候研究VCI根据病情的轻重，分为VCIND、血管源性轻度认知障碍和VD三个阶段。在对VCIND患者的中医证候研究中，有学者发现，脾肾亏虚、痰浊蒙窍最为常见[45]。有研究对803例VaMCI患者的中医证候要素进行分析，发现疾病中肾虚、痰湿是其发病的重要因素，血瘀可能是影响疾病进展的关键因素，并进一步通过相关性分析发现，痰湿对视空间与执行功能有一定预测意义，虚证越重定向力下降越明显，而火热主要影响记忆功能[46]。通过中医辨证量表（SDSVD）对95例VD患者的中医辨证分型研究发现，以肾精亏虚、痰浊和瘀血证候最为常见，进一相关性分析发现，肾精亏虚、气血不足与记忆下降相关[47]。有学者对107脑血管病患者进行证候学研究，发现肾精亏虚以及热毒内盛是认知功能下降的重要因素[48]。在一项涉及2371例VCI患者的Meta分析中发现，脾肾亏虚证、痰浊蒙窍证以及瘀阻脑络证是临床常见中医证候，并存在较大的地区差异[49]。根据以上研究可知，VCI的中医证候以脾肾亏虚为主，痰瘀贯穿疾病始终，与疾病进展相关。10 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究2.4.2基于精血虚衰理论精血是人体生命活动的物质基础，在先天与肾相关，在后天由脾胃充养。精血与认知功能相关，《医林绳墨》中提到“夫人身之气血也，精神之所依附者”。VCI的重要病理因素是慢性脑低灌注，慢性脑低灌注是中老年人常见病因。VCI是多发于中老年人的疾病，与年高体衰相关。朱丹溪的《格致余论》中就提到“人生至六十、七十以后，精血俱耗”。并且对社区60岁以上的老年人研究发现[50]，92%老年人存在精血虚衰，剩余8%主要分布在60-69岁较年轻的年龄段，随着年龄增长，精血虚衰在老年人中的普遍存在。由此老年人本身存在着精血虚衰的生理病理基础。精血与认知功能相关，在《景岳全书》中记载记忆与精血相关，包括广义和狭义的神都与精血相关，“言动视听非此形乎，俊丑美恶非此形乎，勇怯愚智非此形乎，⋯⋯而形以阴言，实惟精血二字，足以尽之”，并进一步阐明“精血即形也，形即精血”，这里的形就是中医所说的“神”，精血与广义的神和狭义的神均相关。《寿亲养老新书》中提到老年人精血不足是出现认知功能下降的原因，“精血耗竭，神气浮弱，返同小儿”，提出认知功能下降与精血虚衰有关，文中的“精血”概念已经不再局限于描述生殖之精，而是具有维持人体正常生命活动的功能，属于“阴气”类物质，也指的是“年过半百，阴气自半”中阴气，将“精血”与认知下降的机制相联系。VCI是由于肾精和阴血不足，导致髓海失养，精血虚衰是VCI发病的重要病理机制之一。补益精血既包括健脾补血、补肾填精，以补益精血；也包括化痰祛瘀，助精血运行输布，以补益精血，攻补兼施。因此，慢性脑低灌注导致的认知功能障碍的发生与精血虚衰相关，需健脾补肾以补益精血。2.4.3基于精-血-髓一体论血管性认知功能障碍主要由于脑髓亏虚，神机失用导致。对于其治疗着重补益脑髓，对于脑髓的补益方法，历代医家多有论述。唐容川在《中西医汇通医经精义》中提出“记在何处，则在肾精。益肾生精，化为髓，而藏之于脑中”，提出了改善认知功能需要着重补肾生精11 湖北中医药大学2018届博士学位论文化髓。《诸病源候论》中论述“精者，血之所成也”，指出血可以化为精；《景岳全书》进一步提出“精之与血，若乎非类”，指出精与血属于同一类，可以相互转化，补血可以化精。《类经》中提到“血者，神气也”，说明血液是什么神志活动的物质基础，本身对于神志活动就具有重要作用。《四时刺逆从论》中指出“血气在中，内著骨髓”，提高气血可以营养骨髓，入髓通脑。《医林改错》中对髓的来源的论述中就提到“精汁之清者，化而为髓，由脊髓上行入脑”，由此可见，精血髓均来源于中焦，指出水谷精汁变化而赤成为血，血气可内灌骨髓，血中清者化为髓。因此血具有营养滋润、化生骨髓，以充养脑髓的作用，即补血可以化髓。气血的化生离不开补益脾胃，单纯补血不易吸收，加上老年人脏腑功能衰退，不宜峻补。在《冯氏锦囊秘录》方脉目病合参中就指出“髓者，胃之充也”，在前面脾与认知功能相关性中就提到《脾胃论·脾胃虚则九窍不通论》中论述，即肾中精气需要脾胃的滋养。张景岳《类经》中提到“肾精之化因于脾胃”，以上均说明精髓的充养与脾胃运化功能密切相关，《素问·示从容论》中提到“夫年长则求之于腑”，对VCI一类老年人多发疾病需重视补益脾胃，健脾补血化髓。如上所述，慢性脑低灌注的产生，与脑血管疾病相关，类似中风疾病的特点，但其发病时间长，病情进展缓慢，在出现认知功能损伤时，已由血管功能异常为主，转为脑功能异常。中医归属为“神”的内涵，病位在脑，病性为本虚标实，以肾精亏虚，髓海不足为本，以痰瘀阻络为标。本病好发于老年人群，根据中老年人脏腑虚衰的特点，结合精血虚衰理论及精-血-髓一体论，予以健脾补肾，化痰祛瘀法治疗慢性脑低灌注所致的认知功能障碍。12 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究第二部分加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠行为学及海马病理学的影响本研究部分选取Wistar雄性大鼠进行双侧颈总动脉分次结扎并剪断，制作慢性脑低灌注大鼠模型，通过加减薯蓣丸灌胃干预4周后行Morris水迷宫行为学检测，取全脑切片苏木素-伊红染色（HE）观察组织病理改变，尼氏染色（NISSL）观察神经元病变，原位末端标记检测(TUNEL)神经元凋亡情况，探讨加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠行为学及海马组织病理学的影响，为进一步研究奠定基础。1实验材料1.1实验动物Wistar雄性大鼠60只，体质量150-200g，从湖北省实验动物研究中心购买，SPF级，生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。动物购买后饲养1周，自由进食进水，保持动物房环境温度在20-25℃，相对湿度在45%-70%。1.2中药制备加减薯蓣丸（又名薯蓣健脾益智合剂，湖北省中医院院内自制剂，批准文号为鄂药制字Z20150027），购自湖北省中医院，药用山药、制何首乌、熟地黄、党参、麸炒白术、茯苓、白芍、当归、川芎、杜仲、远志、石菖蒲、枸杞子、五味子。由湖北省中医院制剂中心制备，上十四味中药，加水煎煮三次，每次1小时，过滤合并，经物理方法浓缩提纯而成，每瓶250mL，生药含量为1g/mL，开盖后置于4℃冰箱中冷藏，备用。13 湖北中医药大学2018届博士学位论文1.3主要试剂试剂厂家货号苏木素SigmaH9627伊红Y(水溶性)国药集团71014544无水乙醇国药集团10009218二甲苯国药集团10023418盐酸国药集团10011018包埋石蜡国药集团69019361中性树胶国药集团10004160甲苯胺蓝国药集团71041284TUNEL试剂盒上海翊圣生物科技有限公司40308ES20DAPI碧云天C1002抗荧光淬灭封片剂southernbiotech0100-01DakoREALEnVisionDetectionDakoK5007SystemMBPabcamAb626311.4主要仪器仪器厂家抗原修复用微波炉美的KJ23B(C)-AN2实验方法2.1模型复制方法将动物试养1周后，采用颈总动脉分次结扎并剪断的方法（改良2VO法）复制CCH大鼠模型。给予5％异氟烷诱导，2.5％异氟烷维持麻醉，钝性分离右侧颈总动脉，注意分离迷走神经，迷走神经损伤易导致动物死亡，用0号手术线结扎右侧颈总动脉的近心端和远心端，动作应轻柔，以免拉断动脉，用剪刀从中间剪断，缝合皮肤。1周后在同样条件下，结扎[4]并剪断左侧颈总动脉。本次实验动物手术后1周存活率为90%。14 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究2.2分组和干预将大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和中药组。术后1周，中药组每日灌胃给予加减薯蓣丸（10g/kg，相当于成人剂量的10倍）；西药组每日灌胃给予尼莫地平（10g/kg）；模型组及正常组给予等剂量生理盐水。均连续给药4周。2.3Morris水迷宫检测空间学习和记忆评估是使用Morris水迷宫检测用药干预4周后效果。一个黑色圆形池(160厘米直径45厘米深度)，部分充满了不透明的水(23±1°C)，也同样分为4个象限和一个逃生平台(直径10厘米)，逃生平台放置在一个象限的中心，位于水面下2厘米。跟踪装置于水池中心上方，跟踪游泳轨迹。提前一天大鼠训练游泳，每只大鼠每天训练四次找到隐藏的平台。在每个试验中，每只大鼠都放置在同一个起始位置，面朝水迷宫的墙壁。到达平台时间(逃避潜伏)被记录为逃避潜伏时间。如果老鼠在120秒内没有找到隐藏的平台，它将引导到平台观察。动物被允许停留在平台20秒钟。在第五天，将平台撤除进行空间探索试验测试。大鼠放在目标象限对面象限，进行120秒自由游泳。记录大鼠在原始平台象限花的时间和穿过原平台位置的次数。实验流程图如下：2.4HE染色1）组织脱水：75%酒精4h，85%酒精2h，90%酒精1.5h，95%酒精1h，无水乙醇Ⅰ0.5h，无水乙醇Ⅱ0.5h。2）组织透明：无水乙醇-二甲苯（1：1）10min，二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ7min。15 湖北中医药大学2018届博士学位论文3）浸蜡：石蜡Ⅰ（60℃）1h，石蜡Ⅱ（60℃）1h，石蜡Ⅲ（60℃）1h，以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成。4）包埋。5）切片和烤片：先将蜡块在冻台上冷冻几分钟，切片4微米，贴附于载玻片上进一步处理。捞片然后用APES处理，于60℃烤箱烤片3个小时即可。6）切片脱蜡：依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。7）Harris氏苏木素染液染色6min-自来水洗浸洗-1％的盐酸酒精分化4s-自来水洗浸洗返蓝-1%水溶性伊红染液染色2min-自来水洗浸洗30s-无水乙醇脱水，二甲苯透明，风干后封片镜检拍照观察。2.5尼氏染色步骤1-6同HE染色，7）1%的甲苯胺蓝染液染色40min-蒸馏水洗3次-95%酒精-无水乙醇快速脱水，封片后镜检拍照观察。2.6TUNEL检测步骤1-6同HE染色7）首先PBS对切片进行浸润，并吸干切片周围多余的液体。油性笔标记原组织的轮廓，便于下面实验操作，在实验过程中需让切片组织保存湿润。8）将ProteinaseK溶液用PBS稀释，使其浓度到达20μg/ml。在切片标本上滴加100μl浓度ProteinaseK溶液，充分覆盖标本组织，在室温下孵育20min。9）再用PBS对切片进行清洗，并吸干多余的液体。切片组织保持湿润，放在湿盒中。10）按1:5的比例用去离子水稀释5×EquilibrationBuffer。在每个载玻片组织中滴加100μl1×EquilibrationBuffer充分浸润载玻片组织样本，在室温下孵育20分钟。在平衡细胞的同时在冰上解冻AlexaFluor647-12-dUTPLabelingMix，并且依照表1，预先制备足够体积的TdT孵育缓冲液。16 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究表1TdT孵育缓冲液组分体积（μl/50μl体系）ddH2O345×EquilibrationBuffer10AlexaFluor647-12-dUTPLabelingMix5RecombinantTdTEnzyme111）充分吸干组织周围液体，随即在标本上滴加TdT孵育缓冲液，时刻保持载玻片组织湿润。将塑料盖玻片充分盖在标本上保持组织的均匀分布，并用湿盒保持标本湿润。在37℃温度下孵育60min，并用铝箔纸包裹避免光照。然后用PBS洗涤3次，每次5min。12）核复染：加入DAPI并在避光条件下孵育5min，对样本组织进行染色，然后使用PBST5min清洗4次，以充分洗去多余DAPI。最后使用吸水纸吸干载玻片上多余的液体，保持干燥后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下拍照采集图像并分析凋亡指数。2.7统计学处理所有计量数据以均值±标准差（x±s）表示，采用SPSS22.0统计分析软件，对体重变化及水迷宫实验进行单因素方差分析；对免疫组化及RT-PCR结果采用双尾T检验。3实验结果3.1加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠学习记忆的影响Morris水迷宫检测2VO术后慢性脑低灌注模型大鼠灌胃4周后的行为学表现，观察慢性脑低灌注对大鼠行为学的影响及加减薯蓣丸的干预效果。在逃避潜伏期的检测发现，第1天和第2天模型组与西药组和中药组所花时间无明显差异，到第3天西药组和中药组与模型组的逃避潜伏期出现明显差别（P<0.05），至第4天中药组、西药组和模型组的逃避潜伏期的时间均减少，西药组显示出最接近正常组的逃避潜伏时间。（见图1a）第5天进行水迷宫空间探索实验，检测大鼠的经过4天逃避潜伏实验后的记忆能力，检测指标包括游泳速度，原平台停留时间比例及穿越原平17 湖北中医药大学2018届博士学位论文台次数。结果显示，去除原平台后，四组大鼠的游泳速度无明显差异（见图1b），正常组大鼠会在原平台区域来回游动穿梭或者停留，在平台区域停留时间比例长，穿越平台次数多；与正常组相比，模型组大鼠的原平台停留时间及穿越次数明显减少（P<0.05），西药组和中药组大鼠经过药物干预后，原平台停留时间比例及穿越次数均较模型组有明显改善（P<0.05）。（见图1c&d）图1各组大鼠Morris检测结果比较（a）逃避潜伏期检测结果比较；（b）平台探索实验各组大鼠的游泳速度对比；（c）平台探索实验各种大鼠在原平台期停留时间对比；（d）平台探索实验中各组大鼠穿越原平台的次数对比。（*P<0.05）3.2加减薯蓣丸对海马组织病理损伤的影响HE染色结果显示，正常组海马CA1区神经细胞排列整齐，核染色清晰，而2VO后的模型组大鼠海马出现神经细胞数量减少、排列疏松、核固缩等神经病理性改变，在中药和西药干预后，海马神经病理结果有所改善，神经细胞数量增多、排列较为规则，提示加减薯蓣丸对慢性脑低灌注18 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究大鼠海马区神经元具有保护作用。（见图2a中HE染色）Nissl染色结果提示，正常组大鼠海马神经元含有具有较多的尼氏体，2VO慢性脑低灌注后模型组大鼠海马尼氏体数量减少，经中药及西药干预，尼氏体数量有所恢复，提示加减薯蓣丸具有保护慢性脑低灌注所致海马神经细胞尼氏体损伤的作用。（见图2a&b）图2各组大鼠海马CA1区HE染色及Nissl染色结果对比（a）各组大鼠海马CA1区HE染色（细胞核呈蓝色，细胞浆呈不同程度的红色，200×）及Nissl染色图（尼氏体蓝紫色，核蓝色，200×）；（b）各组大鼠Nissl染色神*经细胞数量对比（P<0.05）。19 湖北中医药大学2018届博士学位论文TUNEL染色检测神经元凋亡结果显示，正常组TUNEL荧光染色细胞数量较少，提示凋亡神经细胞较少；模型组海马CA1区TUNEL荧光染色细胞数量明显增多，提示凋亡神经细胞数量增多；经西药和中药干预后，西药组和中药组海马CA1区的TUNEL染色细胞数量减少，提示加减薯蓣丸具有抑制慢性脑低灌注所致海马神经细胞凋亡的作用。（见图3）图3各组大鼠海马CA1区TUNEL染色结果比较（a）各组大鼠海马CA1区TUNEL染色结果图（凋亡的细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光200×）；（b）各组大鼠凋亡神经细胞比例的结果比较（*P<0.05）。20 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究第三部分基于能量应激与自噬研究加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠海马Aβ沉积的作用本部分的研究内容，是在第二部分加减薯蓣丸对CCH大鼠行为和病理学作用研究的基础上进一步深入。从对阿尔茨海默样病理产物Aβ42作用的角度入手，结合透射电镜、免疫组化、qRT-PCR和Westernblot检测，通过能量调节、应激与自噬信号，探讨加减薯蓣丸调节慢性脑低灌注大鼠海马Aβ沉积的可能机制。1实验材料1.1实验动物实验动物选择和具体操作方法同第一部分1.1。1.2中药制备加减薯蓣丸制备同第一部分1.2。1.3主要试剂苏木素、伊红Y(水溶性)、无水乙醇、二甲苯、盐酸、包埋石蜡、中性树胶同第一部分1.3。试剂厂家货号DakoREALEnVisionDetectionSystemDakoK5007LC3cst2775p-AMPK博奥森Bs-10666RAβ1-42abcamAb10148AMPKabcamAb131512eIF2αCST3597ATF4CST11815TrizolAidlabLot:252250AXHiScriptReverseTranscriptase(RNaseH)VAZYMER101-01/025×HiScriptBufferVAZYMER101-01/02ddH2O(DNase/RNaseFree)genecopoeiaC1D230A21 湖北中医药大学2018届博士学位论文RibonucleaseInhibitorTRANSLOT#J11202dNTPTIANGENLOT#P432550×ROXReferenceDye2VAZYMEQ111-02SYBRGreenMasterMixVAZYMEQ111-02TaqPlusDNAPolymeraseTIANGENET105-01DL2000DNAMarkerTIANGENMD114-02RandamPrimer(N6)AIDLABLot:271830AH引物合成天一辉远磷酸酶抑制剂碧云天S1873PMSF碧云天ST506RIPA裂解液碧云天P0013BBCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天P0010TEMEDAmrescoAmresc00761Trise-BaseAmrescoExp2017/12Tris-HClHCl信阳市化学试剂厂GB622-89SDS上样二硫叔糖醇（DTT）BiosharpAmresco0281缓冲液SDS国药集团化学试剂有限公司30166428溴酚蓝AmrescoBO449-5G甘油国药集团化学试剂有限公司10010618丙烯酰胺AmrescoExp201610930%丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺AmrescoAmresc00172西格玛奥的（上海）贸易有Tris-basev900483限公司TG甘氨酸BiosharpExp2017106SDS国药集团化学试剂有限公司10014118Tris-baseBiosharp电转液甘氨酸Biosharp甲醇国药集团化学试剂有限公司1001411822 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究NaCl国药集团化学试剂有限公司10016318KCl国药集团化学试剂有限公司10020318PBSNa2HPO4.12H2O国药集团化学试剂有限公司10017618KH2PO4国药集团化学试剂有限公司10019718北京全式金生物技术有限公蛋白marker(14-120KD)DM111司PVDF膜(0.45μm)MilliporeIPVH00010武汉博士德生物工程有限公小鼠单抗β-actin42KDBM0627司兔多抗gsk3β（48KD）武汉三鹰生物技术有限公司22104-1-AP兔单抗ampk（62KD）CST5832兔单抗p-ampk（thr172）（62KD）CST2535兔多抗eif2α（38KD）CST9722兔单抗atf4（49KD）CST11815兔多抗LC3B（14，16KD）CST#2775HRP标记羊抗小鼠二抗武汉博士德生物工程有限公BA1051司HRP标记羊抗兔二抗武汉博士德生物工程有限公BA1054司ECL底物液ThermoNCI5079X光胶片柯达XBT-1显影定影试剂盒天津市汉中摄影材料厂名称厂家货号戊二醛alfaAesarA17876硝酸铅SPI-CHEN#10088-74-8EPOXYresinmonomerSPI-CHEN#90529-77-4OsmiumtetroxideTEDPELLA18456丙酮国产分析纯23 湖北中医药大学2018届博士学位论文表2引物序列表NamePrimerSequenceSize(bp)Forward5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’b-actin240Reverse5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’Forward5’-ATGGGGAACAAACACTGCAC-3’RateIF2a221Reverse5’-AGGGCTATAGAATGCTGCGT-3’Forward5‘-ATTCTTGCAGCCTCTTCCCT-3’RatATF4213Reverse5’-AGGTAGGACTCAGGGCTCAT-3’1.4主要仪器脱水机、病理切片机、切片刀、组织摊烤片机、载玻片及盖玻片、抗原修复用微波炉、显微镜同第一部分1.4；名称厂家型号实时荧光定量PCR仪ABIQuantStudio6荧光定量PCR管EXTRAGENE/illumina-微量分光光度计杭州奥盛仪器有限公司Nano-100微波炉LG-Aquapro超级纯水仪艾科浦AJY-0501pH计德国Metter-ToledoGmbH公司LP1151ml无RNase袋装吸头EXTRAGENE-200μl无RNase袋装吸头EXTRAGENE-10μl无RNase袋装吸头EXTRAGENE-微量移液器Eppendorf酶标仪ThermomμlISKANMK3微量移液器Ependorf透射电镜日本HITACHIHT7700-SS2实验方法2.1模型复制方法同第一部分2.1。24 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究2.2分组和干预同第一部分2.1。2.3免疫组化检测LC3、p-ampk、Aβ1-42、免疫组化实验步骤同第一部分2.7。表3一抗稀释比一抗稀释比LC3B1:100p-AMPK1:100Aβ1-421:50AMPK1:50eIF2α1:50ATF41:502.4实时荧光定量PCR检测2.4.1Trizol法提取RNA1）取-80℃冰箱中冻存标本，质量约为100mg，再其中滴入1mlTrizol试剂，并使用匀浆器将组织充分研磨，移至无RNase的1.5mlEP管中，充分裂解10min。2）裂解后在滴入200ul氯仿，充分上下颠倒混匀，室温放置5分钟。3）4℃，12000rpm，离心15min，可见分成上（RNA）中（蛋白）下（DNA）三相。4）组织分层后，用移液器吸走400ul上层水相，并置于1.5mlEP管中，再滴入400ul异丙醇，充分颠倒混匀后室温静置10min。5）4℃，12000rpm，离心10min，管底可见白色的RNA沉淀。6）弃上清，加入无RNase的75%乙醇1ml，涡旋混匀后，4℃，10000rpm，离心5min。7）重复步骤6一次。8）用移液器吸去上清液，置于空气中干燥RNA沉淀5-10min，最后见沉25 湖北中医药大学2018届博士学位论文淀物溶于20ulDEPC水中。9）取溶解后的RNA1ul用DEPC水稀释200倍后，用紫外分光光度计测定OD260、OD280以及OD260/OD280值，计算RNA的纯度和浓度。根据OD260/OD280比值，估测组织标本RNA质量，比值在1.8-2.0之间的标本满足实验检测。根据吸光光度值按下列公式计算样品RNA的-3浓度：总RNA浓度（ug/ul）=OD260×40×200×10。将总RNA置于-80℃冰箱内冻存备用。2.4.2逆转录成cDNA逆转录反应体系：表4逆转录反应体系试剂剂量（μl）RNA3.881μgOligo(dT)18(10μM)2dNTP(2.5mM)45×HiscriptBuffer4HiscriptReverse1TranscriptaseRibonucleaseInhibitor0.5ddH2O(Rnasefree)Upto20反应条件：25℃5min，50℃15min，85℃5min，4℃10min2.1.3实时荧光定量PCR检测cDNA做10倍稀释，反应体系：表5实时荧光定量PCR反应体系试剂剂量cDNA(10×稀释）4μlForwardPrimer(10μM)0.4μlReversePrimer(10μM)0.4μl26 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究SYBRGreenMasterMix10μl50×ROXReferenceDye20.4μlH2O4.8μl反应条件：50°C2min，95°C10min；95°C30sec，60°C30sec，40cycles。-△△Ct绘制溶解曲线，最终数据以2进行分析。2.5WesternBlot2.5.1蛋白的提取取冻存海马标本组织，置于匀浆器中用剪刀充分剪碎，加入400μl单去污剂裂解液裂后，在匀浆器中充分匀浆。静置后反复匀浆，充分裂解后，用移液器吸除裂解液，放入低温离心机4℃下12000rpm离心5min，取上清液置于-20℃冰箱保存。2.5.2蛋白浓度的测定将海马组织蛋白标本稀释，标准品和待测样本个加入蛋白20μl，加入PBS的2个平行孔为空白对照。37℃避光孵育30min。用DG-3022A酶标仪测定OD568。根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。具体数据见表。2.5.3蛋白变性将提取的大鼠海马组织蛋白上清与蛋白上样缓冲液，沸水浴10min，检查样品。变性完后冷却至室温再放入-20℃保存。2.5.4电泳胶的制备首先制备分离胶，将分离胶灌入擦干净的玻璃板空隙内，无水乙醇充分覆盖分离胶，充分融合后倒出无水乙醇，用双蒸水轻轻冲洗，并用滤纸27 湖北中医药大学2018届博士学位论文吸干。再加入浓缩胶，插入梳齿。浓缩胶完全聚合后取出梳齿。表6电泳胶配置体系凝胶浓度成分体积/ml5%浓缩胶6水4.130%丙烯酰胺1.01.0Mtris-HCl（pH6.8）0.7510%SDS0.06APS0.06TEMED0.00612%分离胶20水6.630%丙烯酰胺8.01.5Mtris-HCl（pH8.8）5.010%SDS0.2APS0.2TEMED0.0082.5.5电泳分离电转移：将凝胶切条，根据标记用蒸馏水冲洗，按照说明书顺序依次排好PVDF模和滤纸等板垫，加满电转液进行操作。转膜条件：β-actin---200mA90min，β-actin-200mA90min，eIF2α、β-actin-200mA90min，AMPK、p-AMPK、ATF4-200mA120min。2.5.6免疫印迹显色：ECL显色系统封闭:用含5%脱脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，封闭2h。磷酸化蛋白用1%-3%的BSA封闭。一抗:使用封闭液充分稀释一抗，使PVDF膜浸泡于孵育液中。抗体稀释浓度如下。28 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究表7一抗稀释比例一抗名称稀释比例AMPK、p-AMPK、eIF2α、ATF4、1：1000LC3Bβ-actin1:200洗去多余一抗:TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次。一个皿中最多放3张膜，洗膜过程中注意膜是否贴到皿壁或膜是否重叠到一起。二抗标记及孵育，洗去多余二抗:TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次。PVDF膜上显色曝光。结果分析：晾干胶片，扫描胶片获取图片结果，用BandScan分析胶片灰度值。2.6透射电镜实验步骤：大鼠海马组织标本用2.5%的戊二醛·0.1M磷酸缓冲液（PH7.4）置于4℃下充分固定3小时。再用磷酸缓冲液清洗标本3次，持续时间15min。1%的锇酸·0.1M磷酸缓冲液（PH7.4）在20℃温度下充分固定2h。同样使用磷酸缓冲液清洗3次，持续时间15分钟。脱水：50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精上行脱水，每次15分钟。渗透：丙酮：812包埋剂=1:1混合液渗透过夜，纯812包埋剂渗透过夜。包埋：60度聚合48h。切片：60—80nm超薄切片。染色：铀铅双染色，切片室温干燥过夜。电镜观察。29 湖北中医药大学2018届博士学位论文3实验结果3.1加减薯蓣丸对AMPK能量调节信号的影响免疫组化结果显示，慢性脑低灌注主要影响AMPK信号中p-AMPK的蛋白水平，并不影响AMPK的蛋白水平。与正常组相比，模型组经慢性低灌注诱导后p-AMPK的蛋白水平显著升高（P<0.01），中药和西药干预后，p-AMPK的蛋白水平降低。（见图4）图4各组大鼠海马CA1区AMPK、p-AMPK蛋白免疫组化结果比较（a）各组大鼠海马CA1区AMPK、p-AMPK蛋白免疫组化图（200×）；（b）平均光密度n.s值分析各组大鼠海马CA1区AMPK、p-AMPK蛋白水平（*P<0.05，**P<0.01，P>0.05）。30 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究Westernblot结果显示，各组大鼠海马CA1区AMPK表达无显著差异。与正常组相比，模型组经慢性低灌注诱导后p-AMPK的蛋白水平显著升高（P<0.01），中药和西药干预后，p-AMPK的蛋白水平降低。综合免疫组化和WB结果，提示加减薯蓣丸通过调节p-AMPK蛋白表达影响能量调节信号途径。（见图5）图5各组大鼠海马CA1区AMPK、p-AMPK蛋白Westernblot结果（a）各组大鼠海马CA1区AMPK、P-AMPK蛋白的Westernblot免疫印迹条带图；（b）***各组大鼠海马CA1区AMPK、P-AMPK蛋白相对光密度值比较（P<0.05，P<0.01，n.sP>0.05）。31 湖北中医药大学2018届博士学位论文3.2加减薯蓣丸对应激信号ATF4/eIF2α的影响免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组经慢性低灌注诱导后ATF4、eIF2α的蛋白水平显著升高（P<0.001），中药和西药干预后，ATF4、eIF2α的蛋白水平降低，中药组与西药组见无显著差异。（见图6）图6各组大鼠海马CA1区ATF4、eIF2α蛋白免疫组化结果（a）各组大鼠海马CA1区ATF4、eIF2α蛋白免疫组化图（200×）；（b）平均光密度******值分析各组大鼠海马CA1区ATF4、eIF2α蛋白水平（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。32 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究为进一步探讨ATF4、eIF2αmRNA的表达，实时荧光定量PCR检测结果提示，慢性脑低灌注后大鼠海马CA1区ATF4、eIF2αmRNA表达水平显著升高（P<0.001），中药和西药干预后，ATF4、eIF2αmRNA表达水平降低。（见图7）图7各组大鼠海马CA1区ATF4、eIF2αmRNAs水平比较******（注：P<0.05，P<0.01，P<0.001）Westernblot结果显示，与正常组相比，模型组经慢性低灌注诱导后ATF4、eIF2α的蛋白水平显著升高（P<0.001），中药和西药干预后，ATF4、eIF2α的蛋白水平降低。综合免疫组化、WB和RT-PCR结果，提示加减薯蓣丸通过调节ATF4、eIF2α转录水平表达影响应激信号ATF4/eIF2α的表达。（见图8）33 湖北中医药大学2018届博士学位论文图8各组大鼠海马CA1区ATF4、eIF2α蛋白的Westernblot结果比较（a）各组大鼠海马CA1区ATF4、eIF2α蛋白的Westernblot免疫印迹条带图；（b）******各组大鼠海马CA1区ATF4、eIF2α蛋白相对光密度值比较（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。3.3加减薯蓣丸对自噬与Aβ42蛋白沉积的影响通过透射电镜观察各组大鼠海马CA1区神经细胞内的自噬情况，细胞在受到自噬信号诱导后，在胞浆形成双层脂质的扁平膜结构，并不是球形，通过不断扩张，将胞浆内的任何成分包裹，包括损伤的细胞器，形成自噬小体（见图9，红色箭头所指即自噬小体）。之后，自噬小体可与胞浆内的溶酶融合，将包裹成分降解再利用或排除细胞体外。在正常组电镜中未观察到自噬小体的形成，模型组中观察到大量的自噬小体的存在，形态多样，包括可见正在包裹胞浆成分的自噬小体；在中药组和西药组中34 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究同样可以观察到自噬小体的存在，提示慢性脑低灌注诱导自噬的激活。图9透射电镜下各组大鼠海马CA1区神经细胞的自噬照片（注：红色箭头所指为自噬小体，可见颗粒状的细胞质或退化的细胞器被双层膜包围；标尺:0.5μm；缩写:细胞核N，nucleus;线粒体M，mitochondria;溶酶体Ly,lysosome）为进一步明确各组大鼠海马CA1区自噬水平的情况，通过Westernblot检测LC3B蛋白的表达。LC3是自噬标志物，包括A、B、C三种亚型，目前研究较多的是LC3B。在自噬形成时，胞浆型的LC3B（即LC3B-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变成为膜型LC3B（即LC3B-Ⅱ），膜型LC3B35 湖北中医药大学2018届博士学位论文代表自噬小体的水平，因此通过LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值大小，可以评估细胞的自噬水平高低。Westernblot检测结果发现，与正常组相比，模型组LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值明显升高（P<0.01），经中药和西药干预后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值降低（见图10）。综合透射电镜及Westernblot结果，慢性脑低灌注诱导大鼠海马自噬水平的显著升高，加减薯蓣丸干预可有效调节自噬水平的过度升高，维持在稍高于正常自噬的水平，有助于减少过度自噬导致的神经损伤，促进自噬保护功能的发挥。图10各组大鼠海马LC3B蛋白Westernblot检测结果比较（a）各组大鼠海马海马LC3B-Ⅱ与LC3B-Ⅰ蛋白的Westernblot免疫印迹条带图；（b）***各组大鼠海马LC3B-Ⅱ/Ⅰ值比较（P<0.05，P<0.01）。免疫组化分析海马CA1区神经自噬与Aβ42蛋白沉积的相关性，结果提示Aβ42蛋白水平与自噬蛋白的表达情况一致，模型组Aβ42蛋白沉积和LC3B蛋白水平均显著升高，可见神经炎性斑沉积（见图11a，红色箭头所指为神经炎性斑）；经中药和西药干预后，Aβ42蛋白沉积和LC3B36 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究蛋白水平降低。提示过度自噬与Aβ42蛋白沉积形成神经炎性斑相关，加减薯蓣丸可通过调节自噬减少Aβ42蛋白沉积，影响神经炎性斑的形成。图11各组大鼠海马LC3B和Aβ42蛋白免疫组化结果比较（a）大鼠海马自噬与Aβ42的免疫组化结果图（标尺：20μm，×400），红色箭头所***指为神经炎性斑；（b）LC3B与Aβ42蛋白的平均光密度分析结果（P<0.05，P<0.01）。37 湖北中医药大学2018届博士学位论文第四部分加减薯蓣丸调控内源性miR-132抑制慢性脑低灌注大鼠海马Tau磷酸化的研究本研究部分是在第三部分基础上，对AD另一病理产物Tau蛋白磷酸化进行研究，结合qRT-PCR和Westernblot检测，探讨加减薯蓣丸对内源性miR-132抑制CCH大鼠海马Tau磷酸化影响，为进一步研究奠定基础。1实验材料1.1实验动物实验动物选择和具体操作方法同第一部分1.1。1.2中药制备加减薯蓣丸制备同第一部分1.2。1.3主要试剂苏木素、伊红Y(水溶性)、无水乙醇、二甲苯、盐酸、包埋石蜡、中性树胶同第一部分1.3。qRT-PCR使用通用试剂同第二部分1.3，引物见表8。WesternBlot通用试剂同第二部分1.3，兔单抗tau（79KD）（abcam，ab32057），兔单抗P-tau(S396)（79KD）（abcam，ab109390），兔多抗gsk3β（48KD）（武汉三鹰生物技术有限公司，22104-1-AP）。表8引物序列表NamePrimerSequenceSizeForward5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’Ratb-actin240bpReverse5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’Forward5’-ATGTATGGTCTGCAGGCTGT-3’RatGsk-3β184bpReverse5’-GGATGTGCCTTGATTTGGGG-3’Forward5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’U6Reverse5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’loopprimer5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCArno-miR-1CTGGATACGACCGACCATG-3’32-3pFprimer5’-TGCGCTAACAGTCTACAGCCAT-3’注：mircoRNA反义链通用引物Rprimer：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT38 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究1.4主要仪器实时荧光定量PCR和Westernblot所需实验仪器同第二部分1.4。2实验方法2.1模型复制方法同第一部分2.1。2.2分组和干预同第一部分2.1。2.3实时荧光定量PCR检测mRNA操作步骤同第二部分2.4。2.4实时荧光定量PCR检测microRNA2.4.1Trizol法提取RNA同第二部分2.4.1。2.4.2逆转录成cDNAMicroRNAs检测逆转录反应体系：表9逆转录反应体系试剂剂量（μl）RNA1.771μgLOOP(10μM)2dNTP(2.5mM)45×HiscriptBuffer4HiscriptReverseTranscriptase1RibonucleaseInhibitor0.5ddH2O(Rnasefree)Upto20反应条件：25℃5min，50℃15min，85℃5min，4℃10min。39 湖北中医药大学2018届博士学位论文2.4.3实时荧光定量PCR检测cDNA做2倍稀释反应体系：表10实时荧光定量PCR反应体系试剂剂量cDNA(10×稀释）4μlForwardPrimer(100μM)0.4μlReversePrimer(100μM)0.4μlSYBRGreen/FlouresceinqPCRMasterMix(2×)10μlH2O5.2μl反应条件：50°C2min，95°C10min；95°C30sec，60°C30sec，40cycles。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。2.5Westernblot实验操作步骤同第二部分2.5。转膜条件：β-actin---200mA90min；p-tau、tau---200mA，120min后300mA，15min；GSK-3β---200mA120min。表11一抗稀释比例一抗名称稀释比例β-actin1:200GSK-3β1:1000tau1:5000p-tau1:3000040 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究3实验结果3.1加减薯蓣丸对microRNA-132与GSK-3βmRNA的影响实时荧光定量PCR检测结果提示，慢性脑低灌注后大鼠海马microRNA-132水平显著降低（P<0.001），GSK-3βmRNA水平显著升高（P<0.001）；中药和西药干预后，microRNA-132水平升高（P<0.01），GSK-3βmRNA水平降低（P<0.01）。（见图12）图12各组大鼠海马microRNA-132与GSK-3βmRNA水平比较*****（P<0.01，P<0.001）。3.2加减薯蓣丸对Tau磷酸化的影响Westernblot检测结果发现，慢性脑低灌注促进了GSK-3β和p-Tau（Ser396）蛋白水平的升高，但不影响Tau蛋白的水平，中药及西药干预减少了GSK-3β和p-Tau（Ser396）蛋白水平，同样也不影响Tau蛋白的水平。（见图13）综合荧光定量PCR及Westernblot结果，提示慢性脑低灌注抑制了microRNA-132水平，导致microRNA-132对GSK-3βmRNA的抑制减少，促进GSK-3β蛋白表达，诱导Tau蛋白磷酸化水平升高；加减薯蓣丸可以升高microRNA-132水平，通过microRNA-132对GSK-3βmRNA的抑制41 湖北中医药大学2018届博士学位论文作用，降低GSK-3β蛋白表达，从而抑制Tau蛋白磷酸化。图13各组大鼠海马Tau、p-Tau、GSK-3β蛋白Westernblot检测结果（a）各组大鼠海马海马Tau、p-Tau蛋白的Westernblot免疫印迹条带图；（b）各组大鼠海马Tau、p-Tau蛋白相对表达量比较；（c）各组大鼠海马海马GSK-3β蛋白的Westernblot免疫印迹条带图；（d）各组大鼠海马GSK-3β蛋白相对表达量比较。（***Pn.s<0.001，P>0.05）42 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究讨论越来越多的证据表明，慢性脑低灌注与神经退行性改变密切相关，特[51,52]别是阿尔茨海默病和血管性痴呆。我们认为慢性脑低灌注不仅仅是因[53]为脑组织容量减少而导致供血需求减少的附带现象。慢性脑低灌注通过多种机制诱发或者加速神经退行性病变，包括氧化应激、β淀粉样物质的沉积和聚集、Tau蛋白磷酸化、突触功能障碍、神经元减少、脑白质疏松[54,55]以及神经炎症等。AD是老年人中常见的痴呆类型，其特征性病理改变是细胞外的Aβ形成老年斑(SP)和由tau磷酸化引起的细胞内神经原纤维缠结(NFTs)。本研究主要围绕加减薯蓣丸对慢性脑低灌注大鼠海马阿尔茨海默样病理产物作用及机制研究，包括Aβ42沉积和Tau蛋白磷酸化。慢性脑低灌注引起能量代谢障碍，出现能量不足的应激，相关机制有AMPK和eIF2α/ATF4信号诱导自噬形成。自噬与能量不足状态下的神经元的存活密切相关，在阿尔茨海默病中存在自噬水平不足，导致Aβ42过度沉积，而在慢性脑低灌注中则存在过的自噬，这种自噬与Aβ42沉积的相关性如何值得进一步研究。Tau磷酸化的调节机制主要与磷酸化蛋白酶GSK-3β和去磷酸化蛋白PP2A相关，本研究从microRNA-132对GSK-3β基因的机制作用入手，研究加减薯蓣丸对microRNA的调节作用，以及对慢性脑低灌注中Tau磷酸化的调节机制。在本研究中，我们通过建立慢性脑灌注不足大鼠模型，结合行为学、分子生物学及病理学检测手段，观察加减薯蓣丸对慢性脑低灌注所致的行为学损伤及阿尔茨海默样病理产物的作用。我们的研究发现：①加减薯蓣丸可以抑制海马神经细胞凋亡，改善慢性脑低灌注所致的大鼠认知功能的下降；②加减薯蓣丸可有效减少Aβ沉积，其作用机制可能与调节AMPK和eIF2α/ATF4能量应激信号,抑制神经细胞过度自噬有关；③加减薯蓣丸可有效减少Tau蛋白磷酸化，起作用机制与其升高microRNA-132水平，抑制GSK-3β基因的转录相关。43 湖北中医药大学2018届博士学位论文1慢性脑低灌注1.1慢性脑低灌注的病理机制分析大脑血管由两个血液供应系统，主要的其中的一个是颈内动脉系统大约占总数的70%脑血流量（Cerebralbloodflow，CBF），第二个是椎动脉系统占CBF供血的30%。这两大系统形成Willis环，供应大脑血流的动脉从这里发出。在脑动脉进入大脑皮质前在软脑膜形成致密的小动脉网[56]络。更深层次的脑白质（WM）由长分支的大脑血管供应灌溉,因此更容易受到缺血性损伤。软脑膜的小动脉是被认为是调节CBF的主要结构。神经血管单元(neurovascularunit，NVU)定义由大脑内组织结构形成，包括大脑微血管内皮细胞、星形细胞的内足、周细胞（pericytes）、神经元细胞和细胞外基质。像所有其他血管一样,大脑血管允许气体播散,形成一个物理屏障,参与者在炎症过程中的监管，在特殊的情况下促进或阻止血栓形成。脑血管系统最重要的结构是血脑屏障(Blood-brainbarrier，BBB)。BBB是由内皮细胞间的紧密连接(TJ)和粘附连接组成,以及其他细胞组件,如基底[57]膜、周细胞、星形胶质细胞足。作为在血循环与神经环境之间主要屏障,BBB防止来自血液循环的有害分子进入脑组织。研究报道痴呆BBB可渗[58]透性增加,导致神经退化和功能下降。脑血管结构是参与调节CBF的重要部分，主要大动脉和小动脉,甚至的毛细血管的在某种程度上都具有调节CBF的作用。脑重量只占总身体的2%体重，脑的血循环不成比例的[59]占有12-20%的心输出量，消耗20-25%的氧气和葡萄糖。这不成比例的分布表明大脑是最重要的器官，消耗大量的血供，并且对CBF变更更[60]加敏感，CBF减少最终导致VCIND的发生。脑白质WM是由长而深的小动脉供血，缺乏吻合的分支。此外,WM接收更少的血液流，只有灰质血供的2/3。这差异可能反映了WM突触的数量越少,由于大脑使用绝[61]大多数的能量供应离子泵维持离子梯度，以保证适当的突触活动。这些血管特征使得WM倾向于在缺血和能量缺乏时受损。此外,深WM和基底神经节是由直接从Willis环和它的近端分支的微动脉供血的，更容易受44 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究到高血压和动脉硬化的机械应力。1.2慢性脑低灌注与白质损伤与灰质相比，WM更容易受到CBF的影响，由于血流灌注减少。颅内盗血的现象是典型的例子,即血碳酸过多症或血管舒张药降低每血管单[62]位WM的CBF，由于上游血管的血管膨胀而“盗走”了WM的血流量。系统性血管老化如高血压和血管硬化损害脑血管自动调节和减少的CBF[63]储存量，并且是预测WM病变强指标。低灌注会损害蛋白质合成，这是突触可塑性的必要条件在学习和记忆整合，严重的灌注不足引起动作电位形成错误，改变酸碱平衡和电解液浓度，诱导神经元和轴突的水肿，神[64]经毒性的蛋白质（Aβ和谷氨酸）积累，导致白质损伤。多项研究表明，[65]局部缺血表示缺氧增加两个重要的Aβ生产的酶:β分泌酶和γ-分泌酶，[66]减少Aβ降解酶脑啡肽酶的水平，诱导Aβ沉积，损伤神经，影响认知功能。1.3慢性脑低灌注与认知损伤慢性脑低灌注是老年人常见的病理表现，随着年龄增长，老年人脑血流量会出现逐渐的减少，也相应的带来一些认知功能的损伤。阿尔茨海默病和血管性痴呆是临床上参见的两大类痴呆类型，这两大类痴呆存在的一[67]个共同病理基础就是血管病变。据此目前也提出了因血管病变所致的认知功能损伤的疾病概念，即血管性认知功能损伤（Vascularcognitiveimpairment，VCI），VCI的范围涵盖了所有血管病变所致的不同程度的认[68]知损伤，包括痴呆和轻度认知功能障碍。研究发现，VD和AD患者都[69]存在不同程度的脑灌注减少，这种脑灌注的减少可以在认知功能损伤出[70]现前就存在，表现在不同脑区MRI等影像的低灌注状态。并且在一项4759名普通人群的临床研究中发现，脑低灌注可以促进认知损伤进一步[71]加重，特别是对于白质高信号的患者，痴呆的风险进一步升高。在动物模型中也发现，慢性脑低灌注可以加速AD动物行为认知功能损伤和白质[72]病变，加速β样淀粉物质的沉积。因此，慢性脑低灌注是阿尔茨海默病和血管性痴呆的共同病理机制。本研究发现慢性脑低灌注诱导海马神经细45 湖北中医药大学2018届博士学位论文胞的凋亡，导致大鼠出现认知功能损伤。2本实验中造模方法探讨为了研究早期病理事件可能导致VCID，啮齿动物的慢性脑低灌注模型首次建立了使用阻塞或两颈总动脉结扎大鼠(2-Vesselocclusion，2VO)[73]。这种模型导致的脑血流减少非常严重,手术后皮质血流量立即下降超[74]过70%，到1个月恢复到减少40%。在C57Bl/6j小鼠,双侧颈动脉完全闭塞导致死亡由于不良的Willis动脉环代偿，因此选择颈动脉短暂阻塞不超过30分钟的方法，这种方法会导致暂时性全脑缺血伴随着血流量减少[75]了80-90%。所以这些模型，并没有精确的模型血管性认知功能损伤相[76]关的慢性脑低灌注的脑血流下降，其可能仅仅下降20-30%。更加精确的脑低灌注的大鼠模型的研究更好地模拟了微妙的VCI中脑血流量的减少。双侧颈总动脉狭窄(Bilateralcommoncarotidarterystenosis，BCAS)，微动脉环减少了年期C57Bl/6j小鼠管腔直径的50%。这种方法利用C57Bl/6j小鼠动脉环的缺陷,使用微动脉环0.18毫米直径导致手术后立[77]即血流量减少30-40%。随着时间增加,在激光多普勒超声或激光散斑成像，在年轻小鼠1月后脑血流可以恢复基线水平15-20%。这些变化已归因于年轻老鼠脑血管重塑，但对老年(>1年)老鼠影响仍然未知。脑血流检测方法通常是使用激光散斑或进行多普勒血流图检测，受制于有限的渗透深度和这些技术限制在皮质表面血管。研究使用动脉自旋标记MRI测[78]量BCAS后老鼠在皮层和皮层下脑区血流量。从第一天到第14天手术后,血液流动被发现是皮质和皮质下区域的减少了基线水平的50%,然而在28天,血流量恢复到基线的70%；也利用动脉自旋标记展示BCAS手术后24小时全脑缺血流量减少50%，在4周恢复到基线的75%。尽管脑血流量的恢复，这些研究重要的是强调低灌注并不局限于脑皮质血管和支持BCAS作为慢性脑低灌注模型。因此,动脉自旋标记可作为定量和非侵入性的工具来评估脑低灌注模型中全脑和区域脑血流灌注不足的变化。BCAS模型的一个限制是应用微动脉环导致的CBF急性减少。为了克服这一点，新的逐渐狭窄模型是巧妙使用缩窄环应用于大鼠颈总动脉和46 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究[79]小鼠。随着时间的推移，这些缩窄环吸收细胞外液，最终结果逐步收缩动脉导致慢性低灌注的过程。在大鼠中,观察到手术后3天最大血流减少30%，评估时28天紧随其后复苏的血液流向85%的基线,类似于2VO模型。然而在小鼠，脑血流量逐步减少超过28天,并没有恢复,达到70%的基[80]线水平。到目前为止，还没有公开的研究数据发现脑血流量的减少可以持续超过1个月的时间。2VO被广泛应用于啮齿类动物复制慢性脑低灌注模型。这种动物模型可以较好地模型AD和VD患者的病理特征。2VO被开发为低氧低灌注的模型，导致继发性白质损伤。双侧颈总动脉闭塞导致了暂时性的严重脑[81]血流量减少，在数周至数月时间后逐渐恢复到闭塞前的水平。在2VO模型中，星形胶质细胞对脑血容量不足反应，动物的年龄影响了星形细胞[82]的生长，随着年龄较大的动物表现出更多的变化。基底动脉扩张以代偿受限制的脑血流量，这可能解释了脑血流量随着时间的推移回归正常的原因。在2VO的一周后，视神经显示了星形细胞增生，最终导致了严重的[83]视束收缩，视觉系统的损坏会干扰认知功能的测试。2VO后,还有与缺氧和BBB的崩溃有关的脱髓鞘。辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP)研究使用光学和电子显微镜显示了HRP渗透到大脑胼胝体的旁中央部位，在BBB完整性修复之前可以在术后3小时就观察到，并持续3[84]天时间。基质金属蛋白酶MMPs是在缺氧组织中表达，并促进在BBB开放和髓鞘损伤，在慢性脑低灌注模型，导致了MMP-2而不是MMP-9[85]的增加。认知行为测试，包括Morris水迷宫任务、气味辨别任务和新对象测试，在造模后4-5个星期显示出不同形式的认知障碍。这些不同的认知障碍伴随着因神经炎症导致的脑白质的病变，少突胶质细胞减少，髓[86]鞘密度的衰减，可由组织学和MRI扩散张量成像检测证明。继发于2VO的慢性脑低灌注被建议作为阿尔茨海默病的模型，模型存在因缺氧导致的[87]淀粉样蛋白和Tau的蛋白质的改变。这也可以解释组织缺氧后导致的淀粉样蛋白和Tau蛋白病理变化的二次形成，存在与那些年轻的血压正常的患者中的病理改变似乎是相关的神经功能障碍相关。47 湖北中医药大学2018届博士学位论文2VO模型的一个缺点是它的变化脑血流量(CBF)发生剧烈变化。为了克服这个限制，使用一种随着时间推移而收缩逐渐闭塞的设备已经被使用。开发的模型是约束条件两个颈动脉都有一个小的线圈，产生了BCAS。线圈的最优内径是0.18毫米。BCAS导致脑血流量的减少与老2VO模型鼠的相似也会随着时间的推移而恢复从临床的角度来看，这个模型类似于颈动脉狭窄的病人，这些鼠标模型有其独特的优势用于转基因动物。使用缩窄环导致颈动脉和颈动脉的逐渐变窄，减少2VO模型结扎导致的急性CBF减少出现的急性炎症反应。缩窄环逐渐收缩产生的病理变化类似于是由2VO在白物质中产生的，但不是损害灰质。临床研究表明，与健康同龄老年人相比，AD患者的海马、顶叶和颞[88]叶皮层的脑灌注要低近73%。一步法的2VO动物模型，CBF可以较造模前减少35-45%，而本实验所采用的两步法模型的CBF可以在造模后减[89]少65.8±12.5%。这个水平就与临床AD患者的脑低灌注水平比较接近。除此之外，两步法阻断颈总动脉时，当一侧的颈总动脉首先阻断后，CBF的基线水平任然可以维持，这主要是反映了侧枝循环的代偿，CBF快速地重新分配到大脑相关区域，例如Willis环的代偿功能是在人类中比较重要的，而选择的动物Wistar大鼠也具有完整的Willis环，比较符合人体的这种侧枝循环的代偿功能。虽然目前的模型没有模拟所有临床痴呆病理，每个模型都存在着其优点和缺点。2VO和BCAS模型的优点是它们可以用在正常血压模型上，比转基因模型实验更加经济，并且造成病理损伤所需的试剂过程很短。模型的缺点包括通过限制血液来迅速诱导缺氧，会逐渐回归正常，并且视神经束的营养收阻塞动脉分支的供应，会影响视神经束导致损伤，会影响认知功能的检测。由于所有可用的模型都有缺点，所以选择最优的一项研究需要考虑说明研究的主要目的。本实验采用的改良的双侧颈总动脉结扎方式，通过分次结扎并且剪断颈总动脉的两步双侧颈总动脉阻塞法，两次颈总动脉剪断的时间间隔1周，而一步法是一次性同时结扎双侧颈总动脉，与原2VO48 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究法相比，主要区别在于双侧颈总动脉阻断时间间隔一周，并不是同时阻断，这可以避免2VO一次性双侧颈动脉阻断导致的血流量急性减少。改良后的方法是间隔一周时间阻断颈总动脉较一步法更类似慢性脑缺血的发展过程，第二是采用结扎并剪断的方式可以避免因为结扎不牢而出现的缺血再灌注的情况。另外，减少对动物的刺激，可以较好的保证动物存活，本实验1周存活率就达到90%。在本研究中，我们采用改良的2VO动物模型来模型慢性脑低灌注状态，研究加减薯蓣丸对慢性脑低灌注相关的学习记忆功能损伤的作用。在这项研究中，我们对7个月大的大鼠进行改良的2VO手术，探索慢性脑低灌注相关的神经病理学特点以及脑组织的神经退行性病变，尤其是与空间学习和记忆密切相关的海马结构。永久双边颈总动脉闭塞(two-vesselocclusion，2VO)广泛应用于啮齿动物复制慢性脑低灌注模型，导致进展性的和不可逆转的认知障碍与阿尔茨海默样病理损伤。3自噬与Aβ沉积本研究发现，慢性脑低灌注可能通过能量调节信号AMPK诱导自噬，以及压力适应eIF2α/ATF4通路影响自噬相关基因的转录，导致过度自噬，Aβ清除障碍；而加减薯蓣丸可以作用于AMPK信号和eIF2α/ATF4信号调节自噬，促进Aβ清除，发挥神经保护作用。自噬过程存在于所有哺乳动物细胞和组织中，包括中枢神经。神经系统(中枢神经系统)，专门用于包裹不必要或损伤的细胞内物质到达溶菌体，来消化和回收所有类型的大分子。自噬作为一种基本的细胞机制，参与了存在时间较久蛋白质和细胞器的清除回收，作为一个细胞质量控制的检查点，扮演着重要的角色。另一方面，压力应激条件下，例如能量不足或功能损伤等情况会引发作为自我调节适应的自噬反应恢复细胞内稳态。因此，自噬反应的正确完成是中枢神经系统的生理机能重要的组成，促进神经元的生存。根据自噬底物的选择和用于将目标蛋白或组织运送到溶酶体的途径，目前主要有三种类型的自噬，即伴侣介导的自噬（chaperone-mediated49 湖北中医药大学2018届博士学位论文autophagy）、小自噬（microautophagy）和大自噬（macroautophagy）。而我们研究的主要是和大脑老龄化和退行性病变相关的大自噬，也就是我们通常所说的自噬。大自噬是一种动态过程，主要指的是将退化细胞基质成分提供给溶酶体，形成一种中间结构称为自噬小体（autophagosome）或者自噬泡（autophagicvacuole，AV）。导致自噬级联反应启动的信号通路是复杂和多样的，简单来说，自噬是由细胞内和细胞外营养和损伤传感器调节的，主要集中在MTORC1（mechanistictargetofrapamycincomplex1）[90]信号的调节，这个信号具有抑制自噬的作用。在经典自噬程序中，抑制MTORC1可以激活unc-51样自噬激活酶1（unc-51likeautophagyactivatingkinase1，ULK-1），ULK-1包含自噬起始复合物。之后BECN-1/Vps34（beclin-1/vacuolarproteinsorting34）复合物被募集来催化PI3P（phosphatidyl-inositol-3-phosphate）的形成，这是自噬小体形成的重要的信号。这个结构的延伸是受自噬相关(ATGs)蛋白质的有序和协调作用调节[91]的，然后形成自噬小体。自噬小体是双层膜结构的囊泡，包裹细胞内的异常蛋白和组织。此后，ATG-3，ATG-4和ATG-7蛋白催化微管相关蛋白3（microtubule-associatedlightchain3，LC3）的脂化，LC3在自噬小体膜上积累，并通过结合自噬的基质调节对目标蛋白或组织的吞噬。另外，ATG-7协同ATG-10促进ATG-5/ATG-12/ATG-16L1复合物的形成，这能够使自噬体具有延伸性。一旦复合物形成，自噬小体就会在微管中通过细胞质进行转运，并在此过程中成熟，通过与细胞核内的成分相互作用而酸[92]化。最后，一旦它们到达细胞核周围溶酶体丰富的区域，自噬小体融合与这些酸性细胞器，形成自噬溶酶体。由于溶酶体包含所有的必要的酶，将会消化降解细胞内的异常蛋白和组织，分解为必需的分子，然后再回到细胞质循环利用。自噬反应的选择性取决于细胞的环境和诱导的刺激。因此，当自噬的基质如错误折叠/聚集蛋白或受损时细胞器积累，自噬有选择性地识别有毒的目标并将其定位于溶酶体降解。这一选择性的过程受自噬受体的激活调节，包括Sequestosome-1（SQSTM-1/p62）、neighborofBRCA1(NBR1)、50 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究[93]NIP-3likeproteinX（NIX）等，作为自噬小体和自噬目标底物的桥梁。选择性自噬可见与对线粒体，蛋白毒性聚集，以及细胞内的病原体等的自噬。与之相反，非选择性自噬发生在自噬底物中，以维持代谢平衡所必要的营养素和基本的细胞功能，例如营养缺乏情况下的自噬。在这种情况下，相对非选择性的机制导致吞噬完整的细胞质部分，在溶酶体部分中被消化以获得营养和能量。自噬的生理水平对于促进细胞的保护和生存是至关重要的。应对各种[94]应激情况如饥饿、蛋白毒性和细胞器损伤、感染。然而，一个长期存在争议的问题是过度自噬可能在某些情况下导致细胞死亡。自噬细胞死亡被描述为程序性细胞死亡的一种形式，和细胞死亡类似。尽管如此,对自噬死亡细胞的评估是基于形态学观察，与细胞死亡过程中大量的自噬组织结[95]构的出现相关。没有评估自噬对死亡过程的影响。后来的工作挑战了这个概念，提除了关于自噬诱导是否是一种不成功的促进细胞生存的尝试。因此，尽管自噬会在特定环境和细胞中对死亡过程进行调节，例如发育组织或细胞凋亡受到损害，但总体来说自噬对细胞死亡的贡献似乎不太大。总之，自噬是一个多步骤的过程，需要在实验水平仔细评估，由于细胞或组织的损伤存在时间依赖的不同节点的改变。因此，在特定的病理环境下自噬可能在早期会产生细胞保护作用，促进生存作用，然而在持续存在损伤刺激的情况下，长期诱导自噬会导致有害物质清除流障碍导致细胞[96]死亡或损伤细胞的死亡。本研究所设计的就是长期慢性脑低灌注这个损伤刺激下，长期诱导自噬处于高水平，会导致Aβ清除障碍，导致细胞死亡，产生认知功能损伤。3.1自噬损伤与慢性脑低灌注在中枢神经系统（CNS），自噬主要作为蛋白和细胞器质量监控的角色，神经元作为有丝分裂后的细胞，不能通过细胞分裂稀释有毒分子或受损细胞器的累积效应，基本上依赖于基本水平的自噬来维持生存。因此，[97][98]神经细胞内关键自噬基因的删除，例如ATG-7或ATG-5，会诱发形成细胞质毒性物质沉积和神经退化。正因如此，越来越多的证据表明，中51 湖北中医药大学2018届博士学位论文枢神经系统的自噬在提升神经元的健康和生存中起着重要的作用。目前对于慢性脑低灌注所致的认知功能损伤的机制研究较为广泛，主要包括神经元损伤、胶质细胞激活、胆碱能神经元损伤、炎症反应以及白质病变（White[99]matterlesions，WMLs）等，但对自噬的作用研究较少。CCH诱导过度自噬和随之而来的神经元细胞凋亡是认知损害的主要[100]机制。自噬可由不同的应激反应所诱导，包括饥饿、氧化应激和缺氧。自噬参与许多疾病的病理过程。在即将死亡的细胞中出现的自噬小体表明自噬存在于细胞死亡的过程中。事实上，过度自噬活动可能破坏部分细胞质和细胞器,导致细胞功能的崩溃。研究已经证实,慢性脑低灌注所致的痴[101]呆模型中存在自噬的激活。自噬功能障碍发生于CCH早期，对神经损伤，认知能力下降,细胞内Aβ聚合具有重要影响。在慢性脑低灌注模型中，大鼠皮质2周后就出现激活自噬水平的显著升高，而海马体则在4周后出[102]现,自噬在神经元损伤和认知下降的过程中发挥了重要作用。在目前的研究中,慢性脑低灌注后自噬的明显激活伴随着神经元病变,认知能力下降和Aβ聚合。一项研究报道,在慢性脑低灌注大鼠，自噬的诱导与LC3B定位在营养不良的轴突相关。电子显微镜显示，大量的自噬泡(AVs)出现在[103]模型动物中，与轴突肿胀和突触和神经缺失有关。自噬在AD和VD中的表达有所不同，在AD患者的新皮层活组织中观察到自噬小体的病理积累。这被归因于异常的运输或酸化的自噬小体，[104]反过来会阻止溶酶体对它们的有效清除。Presenilin-1(PS-1)突变引起早发性AD，损害溶酶体酸化，并诱发AD患者的成纤维细胞的自噬流阻[105]滞。通过对组蛋白酶家族成员溶酶体半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatinb的敲除，恢复溶酶体的降解蛋白作用可以抑制AD转基因鼠神经自噬流的[106]降低，减少Aβ沉积，改善学习和记忆功能。虽然这一研究表明，自噬降解参与Aβ的降解，但是APP23模型鼠中敲除ATG-7基因减少了细胞外Aβ斑块沉积，同时引起细胞内Aβ积累，表明自噬可能对Aβ分泌具有一定作用。除此之外，淀粉样变性加速ATG-7基因敲除带来的神经退行性病变和认知功能的损伤，表明神经自噬的缺乏促进AD病理进展52 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究[107]。最后，对转基因的P301S小鼠模型模拟人Tau蛋白病理，通过二糖海藻糖增强其自噬流，减少了包含Tau蛋白的神经元数目，以及减少脑皮质和脑干的脑桥核I-III层中神经元的死亡，表明自噬可能也会参与Tau[108][109]蛋白的病变。研究发现，在VD的海马存在自噬激活。在临床组织标本的研究中发现，AD的临床前期、中期和晚期三个阶段均与自噬减少[110]有关。然而与对照组相比，AD患者脑脊液CSF中LC3B的水平又是[111]明显升高的。另外有研究发现，在转基因AD小鼠早期，在营养不良的轴突中自噬与LC3B的定位有关。电镜观察到大量的自噬小体的出现导[112]致轴突肿胀，最终突触和神经元缺失。这些不成熟自噬小体在营养不良神经突起的聚集，自噬小体转运到溶酶体和其成熟过程可能损伤，影响[113]自噬的神经保护功能。自噬是相对保守的细胞过程，能够降解和回收细胞内的营养成分，从而通过选择性地清除聚集的蛋白来维持细胞内的稳态。有研究报道，Aβ[114]可由自噬泡（AVs）产生并储存在其中。在AD模型中，研究发现是由于自噬水平降低导致了Aβ清除障碍而大量沉积，而在慢性脑低灌注的模[115]型当中，研究发现其脑内的自噬水平是被激活了的。而这种因为脑低灌注后过度激活的自噬却并不能使Aβ沉积减少，我们认为可能是自噬产生的Aβ数量大于其能够清除的Aβ数量，并且在慢性脑低灌注的缺氧应激下，神经元中这种激活的自噬会对细胞组织过度降解，诱导神经元凋亡，对神经元具有损伤作用。由于自噬系统损伤，损伤的细胞组织和异常蛋白（例：Aβ）不能及时的清除，诱导了认知功能的下降。我们认为细胞内的Aβ沉积与认知功能下降相关，但只有Aβ斑块沉积于海马时才会与认知功能的损伤相关。[116]细胞内的Aβ已经证实比细胞外的Aβ斑块更具有神经毒性。细胞内的Aβ可以由自噬小体（AVs）产生和降解，自噬小体可以维持Aβ的产生和降解的平衡。在自噬小体大量形成时，自噬溶酶体的降解过程损伤导致大量Aβ沉积。相关性分析研究表明，Aβ阳性细胞的比例与海马和皮质部位的自噬蛋白（Beclin-1，LC3B-II和P62）的水平相关；同样，前提条件53 湖北中医药大学2018届博士学位论文也是自噬小体大量形成同时自噬溶酶体过程损伤。MSD显著减少慢性脑低灌注4周后的自噬水平以及Aβ的沉积。与此同时，加减薯蓣丸治疗后海马神经元变性明显改善。这些发现表明加减薯蓣丸可能通过抑制过度自噬改善慢性脑低灌注所致的海马神经元变性和Aβ沉积。3.2慢性脑低灌注诱导Aβ沉积Aβ是36-43氨基酸的肽，是AD中淀粉样斑块的主要成分，具有神经毒性，其在神经细胞外沉积是AD发生和进展的触发因素。Aβ在大脑内主要由Aβ40和Aβ42两种蛋白分子形成。Aβ是由通过β-和γ-分泌酶蛋白水解淀粉样前体蛋白（APP）产生。BCAS诱导的CCH可以提高Aβ[117]纤维化，诱导Aβ细胞内沉积。在年轻的APP/PS1小鼠行永久性单侧颈总动脉闭塞(UCCAO)引起CCH导致空间学习障碍，与皮质Aβ斑块的[118]数量相关。在脑淀粉样血管病小鼠模型(C57BL/[119]6-Tg(Thy1-APPSwDutIowa)]，BCAS增加Aβ沉积在手术后12周。CCH也可能导致野生型动物的Aβ沉积。时间依赖的低聚物的Aβ在海马体中积累，特别是在老年大鼠的轴突末端，在BCCAO引起的CCH后发生，值得注意的是,短暂性大脑中动脉闭塞9个月后的淀粉样蛋白沉积不能被刚[120]果红染色或硫磺素染色。通常用来检测β折叠片构象，是AD中成熟Aβ斑块的典型表现。因此，急性脑缺血可能导致Aβ沉积不同于AD脑中的成熟Aβ斑块。大量的证据表明，CCH和其他缺氧条件上调β和γ分泌酶调控的APP[121]。CCH上调APP进程导致Aβ积累可能的机制是诱发HIF-1表达，然[122]后结合β分泌酶增加其表达。对大鼠双侧颈总动脉的阻塞诱导缺氧诱导因子1α(Hypoxiainduciblefactor1α，HIF1α)的核转录，因而增加β分泌酶1的产生，而β分泌酶1有可以促进淀粉样前体蛋白（amyloidprecursor[123]protein，APP）转化成Aβ42。Aβ沉积在小动脉造成的CCH可能会进一步诱发脑血管病变和恶化脑灌注不足,最终导致一个恶性循环和不可逆转的损伤。通过免疫组化的检测方法，我们的研究结果证实了在慢性脑低灌注模54 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究型大鼠中Aβ低聚物的沉积。而这种Aβ低聚物的沉积可能不仅存在于神经组织，也可能会诱导脑血管淀粉样蛋白沉积，这种脑血管的病变也是缺血缺氧最终导致痴呆的重要病因。3.3能量代谢异常与自噬调节ATP水解为ADP的作用为细胞的生命活动提供几乎所有的能量，维持充足的能源供应是一种生存的基本需求。在单个细胞水平上，这意味着保持直接的能量来源ATP在一个相对较高的浓度。尽管对ATP的需求有很大的波动，在大多数真核细胞内的ATP浓度保持在非常显著的恒定水平。为了达到这个目的，细胞需要监测ATP水平变化，以及通过感受器来应对这些变化以恢复ATP水平。而调节这一变化的AMP激活蛋白激酶(AMPK)和AMPK的同源物存在于所有的真核生物。AMPK一个主要的功能就是监测ATP的水平变化，调节下游基质的磷酸化作用从而增加ATP生产途径和/或降低了ATP利用途径的速率。体内能量平衡失调被认为是多种疾病的重要促进因素，AMPK在维持体内能量平衡具有中心作用，使它成为了预防或治疗能量代谢异常疾病的一个有吸引力的靶标。2+慢性脑灌注不足会导致细胞内钙水平的升高，升高的Ca通过钙调素[124]依赖蛋白激酶CaMKKb磷酸化AMPK的Thr172位点，激活AMPK。AMPK对自噬具有调节作用，自噬是一个重要的分解代谢的程序，用来处理各种细胞大分子物质，从聚集的蛋白质、功能失调的细胞器、被感染的病原体，到储存营养的糖原和脂滴，均可被降解以维持细胞的内稳态。值得注意的是，自噬是消除有害威胁的一种降解途径，同时也是一个重要的回收系统。在溶酶体中产生的代谢产物，是作为能量的来源，或者是合成大分子的材料。长期以来，自噬一直被认为在氨基酸代谢中起着重要作用。自噬的研究中长期存在的一个问题是自噬对细胞内稳态的多种条件的反应，正如前面所演示的，AMPK是一个中央调控器，它能感知细胞能量水平来平衡新陈代谢。同样地，mTORC1在细胞生长和营养信号传递中也扮演着重要的角色，mTORC1是由氨基酸直接调控的。在葡萄糖饥饿的情况下，AMPK被转到溶酶体部分作为AXIN/LKB1复合体，可以抑55 湖北中医药大学2018届博士学位论文制RagGTPase-Ragultor复合体来抑制mTORC1促进自噬。在溶酶体中对AMPK和mTORC1的招募可能对营养信号与自噬信号的整合至关重要。[125]越来越多的证据显示了自噬和AMPK/mTORC1的复杂信号。在能量不足时，AMPK通过直接活化ULK1复合物来诱导自噬。在营养丰富的条件下，mTORC1在Ser758位点磷酸化ULK1，抑制了AMPK-ULK1的相互作用。然而，一旦细胞能量水平在饥饿中降低，mTORC1的活性就会降低，同时，mTORC1上的抑制磷化的抑制作用也会减弱，从而允许使用AMPK-ULK1相互作用为ULK1激活。因此，两种营养传感分子，AMPK和mTORC1，协同调节ULK1来诱导自噬，以响应细胞的营养水平。从整体上来看，AMPK-mTORC1-ULK1信号通过多重调控机制将细胞营养/能量状态与自噬连接起来。哺乳动物细胞进化出复杂的信号调节细胞对压力的反应，包括紫外线照射，缺氧，内质网（endoplasmicreticulum，ER）压力和营养的缺乏。这些反应是适应机制，有些最终导致程序性细胞死亡。为应对不同应激，可逆性的真核生物的翻译起始因子2的α亚基(eukaryotictranslationinitiationfactor2，eIF2α)的[126]磷酸化是高度的保守的。为了应对不同的环境压力，eIF2a磷酸化抑制全部基因的翻译，但是优先促进ATF4翻译，ATF4是对适应相关转录基因控制的关键调节元件。eIF2a的磷酸化可以抑制启动子抑制大多数信使的翻译,其中一种蛋白质激活转录因子4的翻译是增加的。ATF4是一个主要的调节者，在调节对压力应激相关的许多基因转录过程中扮演着重要[127]角色。研究表明，在内质网应激压力下的细胞适应性反应引起的自噬，作为一种生存机制被激活，引发了自噬的初始形成。多方面的证据建议eIFα/ATF4路径可以在自噬调节中发挥关键作用。最近研究表明，ER压力和严重的缺氧导致了通过ATF4的激活促进自噬相关基因Map1lc3b的转录。这些调控具有在持续缺氧时维持高水平自噬的作用，从而促进细胞的生存。据报道在氨基酸缺乏的背景下，GCN2激酶激活和eIF2a磷酸化[128]是诱导的酵母和哺乳动物的自噬所必须的。eIF2α/ATF4通路作用自噬56 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究相关基因的转录程序参与压力适应，在能量缺乏等条件应激下，自噬在降解细胞器和细胞质内容物中起着关键作用，从而使细胞能够循环利用氨基[129]酸以及维持蛋白质合成和ATP生成的成分。几个信号转导途径调节自[130]噬激活，例如mTORC1和AMPK基因等，作为对营养供给的反应。另外，应力依赖性转录因子ATF4和CHOP在涉及到自噬小体形成，延伸和功能的基因转录激活中是至关重要的。这些自噬基因能够表达主要通过eIF2α/ATF4通道激活，可以分为三个功能组:①包括Becn1基因编码参与自噬体形成和成熟的蛋白质；②基因编码的蛋白质属于泛素类蛋白质(ubiquitinlikeprotein，Ubl)系统，它对自噬形成有重要作用，主要包含Ubl蛋白质（Map1-lc3b,Gabarap,Gabarapl2）和Atg12，Atg7，Atg12等；③编码目标基因受体的基因，涉及到泛素基质的特定降解(p62和Nbr1)构[131]成第三组。3.4中医对自噬的认识细胞自噬也类似于细胞的适应和自我修复过程。细胞自噬的产生主要由于组织损伤，包括细胞器的衰老和蛋白结构损伤，细胞通过囊泡回收这些损伤的细胞组织，并且将原料再次利用。慢性脑低灌注导致细胞能量供应不足，细胞会产生缺氧诱导因子，诱导自噬的产生，这种自噬过程，是为了适应能量供应不足的环境，因而通过自噬来减少细胞数量，加重细胞凋亡。CCH所致的脑组织损伤，主要与脑府正气虚衰，气血不足、失于濡养，虚衰日久痰瘀内生、脑府损伤有关。因此对于CCH所致的认知功能损伤，应当主以健脾补肾、扶助正气，辅以活血化瘀、化痰开窍治疗。有学者认为，自噬的清除功能与中医脾的运化功能一致，脾为后天之本，脾主运化，在脾虚生痰、脾失健运的情况下出现脂质代谢异常，类似于巨噬细胞的自噬乏力，胆固醇转运异常，导致动脉粥样硬化发生，因此[132]为从脾调节自噬功能治疗动脉粥样硬化疾病提供依据。有学者提出，自噬可以清除细胞内的有毒有害物质，维持神经功能的正常发挥，在认知功能障碍疾病中，自噬可以防止淀粉样蛋白的沉积、抑制Tau蛋白磷酸化以及神经保护的作用，与中医痰瘀互结有相似之处。故临床上有采用化瘀57 湖北中医药大学2018届博士学位论文[133]祛痰的治法干预自噬。也有学者认为自噬是中医气的功能表现，自噬[134]异常也就是中医气功能的失调，会导致痰、瘀、毒等病理产物生成。因此，有提出运用补气活血法干预自噬调节缺血性脑损伤。通过文献整理研究发现，自噬、卫气、免疫三者在组成和功能上具有一定联系，提出提[135]高卫气来调节自噬，增强机体抗病能力。Aβ的代谢途径与中医的湿、痰具有相似的特征，提出从调节自噬的角度对中医痰湿进行干预具有一定的科学意义。自噬功能的失调，包括过度激活或抑制，都会导致细胞功能障碍，细胞内代谢异常，影响细胞生理功能导致细胞死亡。加减薯蓣丸通过纠正神经细胞能量代谢异常，调节过度自噬，抑制β样淀粉物质的沉积，发挥神经保护作用。4MicroRNAs与Tau蛋白磷酸化Aβ和Tau蛋白是AD特征性病理改变的主要成分，所以临床新药试验会选取这两种标志物来进行研究，但是在前期的临床研究发现，单纯的抑制Aβ水平，患者的临床表现并没有得到改善，因此考虑对Tau蛋白的抑制，或许对患者的记忆改善可以有较好的效果。Tau蛋白是神经元轴突功能发挥的重要成分，具有稳定微管的作用，但Tau蛋白过度磷酸化后，会影响微管的物质传送，影响包括突触在内的神经信号传递结构的损伤，从而影响记忆信号的传递以及形成。本实验中，我们发现CCH促进了Tau磷酸化，而不影响Tau蛋白水平，减少神经元细胞凋亡和改善认知功能障碍，并发现主要通过miR-132/GSK-3β信号相关的机制。有学者研究发现[136]类似结果。VD患者脑内的总Tau蛋白水平较正常下降，但p-Tau水平[137]未见下降；并且在脑灌注不足时，大鼠脑内可以检测到异常升高的p-Tau，但TaumRNA的表达未见明显改变。4.1Tau蛋白磷酸化调节机制Tau主要表现在神经元上，并且在神经轴上也很丰富。蛋白的正常磷酸化作用于微管动力学并影响轴突的生长和运输。Tau蛋白的超磷酸化发生在丝氨酸396/404和苏氨酸231位点，出现在内部神经纤维缠结阶段，而在丝氨酸199、202和409位点的超磷酸化蛋白主要出现在神经缠结前58 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究阶段。研究表明，神经元细胞凋亡可以通过减少Ser199和205的其他磷[138]酸化位点来抑制。但目前仍不清楚，在Ser396位点上Tau蛋白的超磷化效应。在本研究中，对Tau-ser396进行了评价，以评价其磷化程度，并在CCH后发现其含量增加。在CCH模型中，神经元细胞凋亡的增加，这也意味着在Ser396位点的效应，tau的超磷化可能也会促进细胞凋亡。Tau磷酸化的水平受Tau蛋白激酶和Tau蛋白磷酸酶的调节。蛋白激酶包括糖原合酶激酶-3（GSK-3），周期蛋白依赖型激酶-5（CDK5），cAMP依赖性蛋白激酶（PKA），微管亲和力调节激酶（MAPK）等，其中GSK-3由α和β两个异构体，研究发现GSK-3β随年龄增长上升，并且与Tau蛋[139]白磷酸化密切相关。蛋白质磷酸酶1(PP1)、PP2A、PP2B、PP2C和PP5都与Tau的脱磷酰化有关。其中，PP2A是主要的磷酸酶:它占了人类大脑70%的Tau磷酸酶活性，PP2A的表达在AD大脑灰质和白质分别减[140]少了20%和40%。磷酸化在调节微管的生理功能上起着至关重要的作用，包括它与微管的结合，从而调节微管自身的稳定和组装。Tau的超磷酸化可能通过其他机制引起病理反应。首先，磷酸化的Tau可能会诱导Tau从轴突到树突区域，从而导致突触功能障碍。第二，磷酸化Tau蛋白可能改变蛋白酶体或自噬对它的降解。第三，由于在AD中Tau蛋白的磷酸化和聚合都增加了，所以Tau的磷酸化通常被认为是增强了Tau的聚合。最后，磷酸化可能会改变Tau与其它蛋白之间的相互作用。例如，磷酸化的Tau但不是未磷酸化的Tau可以与金蛋白相互作用相关的蛋白质JUNN-末端激酶-相互作用蛋白1(JIP1)作用，从而削弱了该复合物的形成，该[141]复合物可调节轴突运输。4.2MicroRNAs与Tau磷酸化MicroRNAs（miRNAs）是19-24个核苷酸组成非编码单链小分子RNA，在大脑中大量表达，对于大脑发育和维护至关重要。miRNAs功能主要是抑制蛋白转录相关的目标mRNA序列，通常结合3’端非翻译区(3’UTR)。每个miRNAs可以调节多个基因，因此可能作用于信号通路。miRNAs对成熟神经元存活必不可少，而异常miRNAs的表达存在于人类59 湖北中医药大学2018届博士学位论文神经退行性疾病。虽然许多大量的miRNAs可以参与疾病相关基因的调控，但是miRNAs的失调和疾病发展之间存在着因果关系，特别是在哺乳动物体内的改变仍然是一个有待解决的问题。miRNAs主要是“监管机构”，在不同的生理和病理条件下调节mRNA基因的表达。在神经系统中，miRNAs在神经发育、代谢、神经可塑性、应激反应和生存中扮演着重要角色。MicroRNA是基因的重要调控因子涉及到各种生物过程。许多大脑特定的和富集的microRNAs已经被识别出来了，其中一些与正常的大脑发育和神经元分化有关。最近的研究表明一些microRNAs调控的Aβ产生[142]和Tau磷酸化，控制突触可塑性，或参与记忆的形成。AD患者和AD[143,144]小鼠模型中，microRNAs的表达发生改变。由于miRNAs调控机体约60%以上基因的表达，在正常生命活动和神经元发生、学习及记忆中起到非常重要的作用，miRNAs也可能直接或间接参与多种与CCH发病相关基因的表达调控，在CCH发病进程中的作用是本研究的重点。在AD等神经退行性疾病研究中，显示miRNAs可通过直接或间接调节Aβ代谢、Tau磷酸化、细胞凋亡、神经免疫炎症、轴突损伤等病理过程中相关关键基因的表达，但是对于CCH作用机制的研究并不多。特定microRNAs的表达从AD早期就开始出现异常;这些分子控制着这种疾病中多个目标基因和关键信号通路的改变，并最终可能会调节细胞死亡机制。尽管实验存在大脑样本和研究中使用的检测和分析技术的差异，以及这些结果数据集的异质性，在不同的结果研究中只有几个重叠的发现有作[145,146]为AD神经元疾病的标志，其中包括miR-132。在存在Tau磷酸化[147]的神经元中，miR-132降低最值得注意。并且不溶性的Tau与认知障[148]碍相关。最后，一个全基因组对700个背外侧前额叶皮质标本进行研究，miR-132是AD中降低最明显的miRNA，并显示与Tau病理和NFTs[149]有显著联系。因此，miR-132可能与Tau病理密切相关。miRNAs的功能主要是针对其下游目标，StarBasev2.0(http://www.starbase.sysu.edu.cn/)用于搜索miR-132潜在的目标，GSK-3β60 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究包含了miR-132作用的潜在位点。GSK-3β是一种基本的丝氨酸/苏氨酸激酶，它在许多疾病中扮演着重要的角色，如免疫疾病、慢性炎症疾病和神经变性疾病。GSK-3β通过不同信号途径调节细胞分裂、细胞分化、发育[150]和细胞凋亡等进程。GSK-3β在中枢神经系统中是丰富的，而活化的GSK-3β主要局限于退化的神经元。GSK-3β的激活与神经元功能障碍的不同方面有关，例如神经元结构的损伤、可塑性和生存；GSK-3β失活可以维持神经元的极性、生存和活性。大量的证据表明，GSK-3β在[151]ser198/ser202位点和ser39/ser404位点对Tau超磷酸化进行了调控。我们假设在CCH的老鼠中，miR-132可以通过对Tau信号蛋白的转录后调控，影响信号传导途径，例如对蛋白质的磷酸化来调节蛋白质的代谢。在寻找直接目标和下游信号传导途径的过程中，发现miR-132和Tau病理学之间的联系，我们确定一种重要的Tau异常磷酸化的激酶蛋白GSK-3β，作为一种直接特异性的miR-132靶标。GSK-3β的过度活化促进Tau蛋白过度磷酸化。在我们的研究中，CCH不仅减少了miR-132的表达，而且也增加了GSK-3β在mRNA和蛋白水平上的表达，以及Tau的磷酸化，并且没有影响Tau蛋白的变化。经过加减薯蓣丸干预后，miR-132的表达升高，同时减少了GSK-3β在mRNA和蛋白质水平上的表达，降低了Tau的磷酸化。课题组前期对痴呆及认知障碍等相关疾病进行了广泛研究，表明中药“加减薯蓣丸”可有效干预痴呆的进程，动物实验提示加减薯蓣丸通过调节[152,153]AKT和PTEN信号升高CREB的表达水平。借助StarBasev2.0软件[154]及参考相关文献，显示miR-132是CREB的靶点。而GSK-3β包含了miR-132作用的潜在位点。本实验中，我们发现加减薯蓣丸通过PTEN/CREB/miR-132/GSK-3β信号调节CCH中Tau磷酸化。（见信号示意图）61 湖北中医药大学2018届博士学位论文PTEN/CREB/miR-132/GSK-3β信号示意图5CCH干预方法的研究5.1临床前药物由于慢性脑低灌注的发病时间较长，病程持续较久，很难短期治愈，经常伴随终身，导致认知功能损伤。临床治疗仍然以药物为主。在临床前的模型试验中，具有治疗VCID潜力的药物并不多。其中一种化合物是西洛地唑（cilostazol）,一种强力三磷酸二酯酶抑制剂，可以用作抗血小板剂预防和治疗外周动脉疾病。西洛地唑通常不穿过BBB，但增加血管细胞中cAMP，可以发挥多种功效保护血管内皮。维护微血管完整性、舒张[155]血管、抗氧化、抗炎作用和调节平滑肌细胞。此外,体外实验表明,西洛地唑促进OPCs分化。在BCAS模型，预处理和后处理的西洛地唑降低内皮细胞激活,抑制小胶质细胞增殖,改善认知功能，不影响CBF和白质完整性。灌注不足3个月后，BBB结构保存,表明西洛地唑通过内皮保护而不直接影响白质纠正胶质血管的紊乱。这些研究表明，西洛地唑对VCID渐进发展具有有益影响,特别是在早期阶段。在大鼠2VO模型中，西洛地唑62 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究显示具有显著的防止脑低灌注所致的白质损害的作用，包括改善髓鞘脱失导致的认知障碍。在大鼠2VO模型中，西洛地唑似乎承受更大的效应，可能跨越损伤的BBB直接影响白质。在AD相关实验研究，西洛地唑可能防止淀粉样蛋白诱导认知缺陷和氧化损伤。西洛地唑也已被证明能够降[156]低血管淀粉样物质沉积，促进清除。二甲胺四环素是另一种化合物，在几个VCID相关模型表明具有临床前效用。二甲胺四环素是一种半合成四环素，FDA批准用于治疗寻常痤疮。它是高度亲脂性，能够穿过BBB。这种药物是一种潜在的炎症反应的有效抑制剂，在小胶质细胞被激活的血管疾病，包括中风、高血压。研究发现，在BCAS模型中使用二甲胺四环素治疗3个月，恢复脑低灌注诱导的白质功能障碍与小胶质细胞数量的减少有关。其他研究中，通过单侧颈总动脉的脑灌注不足导致脑白质受损，2VO模型和在有高血压倾向的2VO模型也显示出二甲胺四环素的保护作用。二甲胺四环素也被证明[157]在脑淀粉样变性动物模型中通过炎症/氧化应激机制改善认知。有趣的[158]是，二甲胺四环素还可以减少白明胶酶（gelatinase）活性和自发出血。这些观察结果表明二甲胺四环素可能是一种很有前途的VCID治疗的候选，目前已经在轻度AD中进行试验研究。增加的基质金属蛋白酶（MMP）与白质的病理生理学损伤密切相关，也被证明是在人类VCID中水平升高，基因敲除MMP2在BCAS小鼠模型中具有保护作用。在大鼠2VO模型中，抑制MMP2能够防止低灌注白质损伤和减少胶质激活。广谱的MMP抑制剂在BCAS模型也能防止BBB开放和随后的白质病变和认知损伤。MMP抑制剂的使用，虽然在低灌注的临床前模型具有潜在的保护作用，但仍然还需要在人类VCID中进一步研究，MMP在VCID中的影响可能是复杂的，一方面导致病理损伤，另[159]一方面也参与组织修复的过程。5.2环境及体育活动干预生活方式的因素，包括环境丰富度和体育活动已经被提议作为减轻VCID认知障碍的重要策略。研究显示,在BCAS模型中丰富环境的有利63 湖北中医药大学2018届博士学位论文[160][161]影响包括促进脑白质重塑、工作记忆损伤修复、大幅减少星形胶质细胞损伤和小胶质增生。并且发现有限的而不是全天暴露于丰富的环境更有益。因此,即便是实现有限的丰富环境对VCID患者可能也是有益的。实验研究为临床前药物和生活方式的改变提供基础支持，可能在SVD和VCID具有潜在的临床应用价值。虽然还需要进一步的实验研究,中度的丰富环境可能是未来脑血管疾病,尤其是对VCID患者的安全有效的策略。6加减薯蓣丸临床及基础研究分析6.1组方分析加减薯蓣丸由《金匮要略》中主治“虚劳诸不足，风气百疾”的薯蓣丸化裁而来。仲景原方薯蓣丸由山药、当归、桂枝、神曲、干地黄、豆黄卷等21味中药组成。湖北省中医院已故名老中医吕继端教授在总结临床经验的基础上，针对老年人痴呆本虚标实的病机特点，继承经方薯蓣丸的组方特点，去掉方中桂枝、干姜、白蔹、防风、大枣、豆黄卷、甘草、麦门冬、杏仁、柴胡、桔梗、阿胶，以去除祛风理气一类的中药，加炙远志、制何首乌、石菖蒲、杜仲、枸杞子、五味子，干地黄改成熟地黄、人参改成西党参主要加强补肾滋阴、化痰开窍的作用，组成经验方加减薯蓣丸。20世纪90年代初，研究团队先后对该方进行一系列临床及实验研究，在痴呆疾病发生基础为“肾虚髓减、痰瘀阻络”理论指导下，以熟地黄、枸杞子、制何首乌、五味子补肾填精益智，当归、白芍、川芎活血祛瘀通络，党参、山药、白术、茯苓、石菖蒲、远志健脾化痰开窍，共凑“健脾补肾，化痰祛瘀”之效，在干预认知障碍方面取得了很好的临床疗效。6.2机制研究对43例VCIND患者用加减薯蓣丸治疗16周后，加减薯蓣丸与多奈多奈哌齐均可显著增加简易智能精神状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MOCA)评分，并且加减薯蓣丸还可有效减少中医痴呆证候[32]量表评分，改善患者临床中医症候。通过磁共振波谱的进一步研究发现，加减薯蓣丸具有调节右丘脑、海马NAA/Cr及右角回、左丘脑Cho/Cr的64 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究水平，其改善认知功能的作用机制可能与调节中枢胆碱能系统，促进神经[33]修复有关。在对47例血管性痴呆患者的临床研究发现，加减薯蓣丸可[34]有效改善肾精亏虚、痰浊阻窍及瘀血内阻证患者的临床证候。在动物实验中发现，加减薯蓣丸具有改善血管性痴呆大鼠认知功能，减少神经细胞凋亡、抑制炎症、促进星形胶质细胞及少突胶质细胞增生、促进神经营养[36][162]因子的表达及突触再生等作用。本研究进一步发现，加减薯蓣丸能抑制能量不足诱导的应激反应，调节自噬水平，促进病理产物的清除；并且通过调节microRNAs水平，抑制Tau蛋白磷酸化，发挥神经保护作用。加减薯蓣丸主治肾虚髓减，痰瘀内阻。方中重用山药平补三焦，滋肾补脾，收涩固精，益精生髓；熟地黄、制何首乌补益肝肾，补血滋阴，生精填髓；党参益气补血、当归活血补血、白芍养阴补血，三药同用以加强补血之功；白术健运脾气，茯苓健脾渗湿；石菖蒲、远志化痰开窍；川芎活血祛瘀；杜仲、枸杞补肝肾、益精血；五味子敛肺滋肾，涩精敛汗。全方共奏健脾补肾、化痰祛瘀之功。本方以滋阴补肾为主，但兼顾其阳，使“阳生阴长”，脾肾强壮，精血生化泉源不竭，髓海得充，精神得养。由此我们认为，加减薯蓣丸健脾补肾、化痰祛瘀，具有扶助正气、祛除病理邪气的作用，对CCH所致的神经损伤具有较好的改善作用。一方面促进机体能量供应，从而调节神经组织因能量不足而产生的应激相关性自噬，减少对自身组织的损伤，促进对Aβ等病理产物的清除，减少神经凋亡；另一方面促进特定microRNAs表达，调节相关信号通路，抑制Tau蛋白磷酸化，减轻对神经组织的损伤作用，发挥神经保护作用。本研究从能量代谢、内质网应激、细胞自噬、microRNAs失调、凋亡等神经退行性疾病相关的多个角度，揭示加减薯蓣丸干预CCH的作用机制，具有多靶点干预、标本兼治的作用。研究为中医药治疗CCH为代表的神经病理过程提供了新思路。65 湖北中医药大学2018届博士学位论文结语1结论1）自噬具有“双刃剑”的作用，在慢性脑低灌注模型中，我们观察到了能量AMPK和应激eIFα/ATF4信号的激活，诱导自噬水平显著升高，而过度自噬会导致有害物质清除障碍导致细胞死亡或损伤，包括Aβ沉积和神经细胞凋亡；加减薯蓣丸通过调节能量AMPK和应激eIFα/ATF4信号抑制神经细胞过度自噬，减少Aβ沉积。因此我们得出以下结论：加减薯蓣丸调节能量应激介导的自噬，减少慢性脑低灌注大鼠海马Aβ沉积。2）MicroRNA-132与Tau病理密切相关，而miRNAs的功能主要是针对其下游目标，通过搜索发现GSK-3β包含了miR-132作用的潜在位点，而GSK-3β促进Tau磷酸化，因此对其相关性进行实验验证。慢性脑低灌注抑制了miR-132水平，同时GSK-3βmRNA水平进一步升高，GSK-3β蛋白和Tau磷酸化水平升高；加减薯蓣丸干预后可升高miR-132水平，GSK-3βmRNA水平出现下降，GSK-3β蛋白和Tau磷酸化水平均得到抑制。因此我们得出以下结论：加减薯蓣丸调节miR-132/GSK-3β信号，抑制慢性脑低灌注大鼠海马Tau蛋白磷酸化。2本研究创新点1）本研究从能量应激介导的自噬角度，探讨加减薯蓣丸对慢性脑低灌注所致Aβ沉积的作用，阐述加减薯蓣丸改善认知功能的机理；2）基于microRNA-132在Tau病理中的重要性，阐述了其在慢性脑低灌注中的作用及加减薯蓣丸的干预机理。3问题与展望慢性脑低灌注对认知功能的影响正在逐渐被重视，其对阿尔茨海默病、血管性痴呆的作用仍有待进一步研究。对慢性脑低灌注的中医病因病机认识需要更加广泛的认证及研究，根据其临床表现，本研究只研究了其66 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究对认知功能作用的可能机制，未对中风、眩晕等疾病进行分析，是否发病机制有所不同有待研究。由于所选用的是中医复方制剂，其多靶点的作用可能是有某些单味中药或药对，或者由整体配伍发挥作用，随着网络药理学的成熟，阐明中药复方多途径、多靶点的作用成分，需要进一步的研究分析；并可在此基础上对组方进一步优化，筛选有效成分，以提高临床疗效。本研究初步探讨了自噬与Aβ沉积的相关性，仍未明确自噬影响Aβ沉积的明确通路，有待进一步研究论证。本研究模型仅针对了CCH的病理状态进行研究，未联合其发病的常见病因，包括动脉粥样硬化、心衰、糖尿病等进行研究，联合病理因素进行研究可以从其发病角度进一步分析中医药的干预机制，即符合中医“治未病”角度早期干预危险因素。此外，动物实验未能充分反映人体的中医病机基础，不能完全模拟人体肾虚髓减、痰瘀阻络的中医证候学特点，这一部分内容目前仍然需要设计规范的临床随机对照研究，进行进一步论证。67 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加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究附录附录一综述慢性脑低灌注神经病理机制研究进展摘要：慢性脑低灌注(Chroniccerebralhypoperfusion，CCH)是常见的由各种脑血管病变、血流动力学障碍和血液成分变化所致的病理状态，最近的研究揭示了其在老年痴呆症等神经退行性改变的重要作用，包括血管性痴呆和阿尔茨海默病(AD)。CCH通过多种机制促进神经退行性改变，包括诱导氧化应激、Aβ积累、tau蛋白磷酸化、突触功能障碍、神经元丢失、脑白质病变、神经炎症等。本文回顾了CCH所导致神经退行性改变相关的认知功能障碍和神经病理学的进展，分析CCH的病因、诊断、病理学和神经退化的可能机制以及动物模型。更好的理解CCH的机制将有助于为开发预防和治疗神经退行性疾病提供新的策略。一、引言血管疾病与认知障碍密切相关，越来越多的证据表明，血管危险因素导致神经退行性改变以及痴呆的发生。最近大样本研究发现，在阿尔茨海默病神经影像学中，早期血管功能障碍在阿尔茨海默病(AD)发病中起到[1]重要作用。血管性认知损害(vascularcognitiveimpairmentanddementia，VCID)最常见的原因之一是脑小血管疾病(cerebralsmallvesseldisease,SVD)，影响小动脉、小静脉和毛细血管，在大脑中导致小动脉的闭塞、腔梗和脑白质病变。VCID主要临床特征可能包括纯运动、感觉、轻偏瘫[2]步态障碍、构音障碍、认知损伤。脑淀粉样血管病(Cerebralamyloidangiopathy，CAA)是另一种形式的SVD，几乎在所有AD患者和50%以[3]上超过90岁的老年人均可发现。CAA主要导致大叶性出血，脑白质损伤和皮质微型梗塞。中度的CAA也被认为是老年痴呆症的一个独立危险因素。慢性脑低灌注正成为导致认知能力下降和神经退行性改变的主要因89 湖北中医药大学2018届博士学位论文素。脑灌注减少与痴呆的严重程度相关，并且能够预测轻度认知障碍(MCI)患者进一步发展痴呆的可能性。在T2加权MRI横断面研究表明低脑血流[4]量(CBF)的严重程度与脑白质疏松严重程度相关。神经病理调查显示[5]AD白质髓鞘密度显著减少，尤其是在VaD，这些证据表明这可能是减少的脑白质灌注有关。目前尚不清楚CBF变化是脑白质病变的结果或者诱因。尽管如此，成像研究表明这些白质变化的存在和程度，特别是在额[6]叶，是决定认知功能的重要因素并影响痴呆。因此，了解导致白质变化的早期病因，有助于早期干预脑损伤的病理基础，改善其对痴呆的认知能力下降的影响。除了人类相关病理和影像学研究，还需要进一步深入对脑白质变化的机制研究，借助相关动物模型的发展，并将这些研究发现转化应用到临床。过去五年，各种动物模型研究描述了全脑和局部缺血性损伤的病理生理变化。这些模型开发主要用于测试药物对脑梗死后干预的作用，减少脑缺血[7]再灌注损伤或缺血半阴影区的进展。几个模型已经被开发来模拟VCID[8]或遗传原因相关的病理。本综述，我们主要集中于对啮齿动物模型的分析，模拟VCID中慢性脑低灌注的状态和探索脑低灌注的机制。重点分析双侧颈总动脉阻塞大鼠模型(通常称为2-vesslocclusion，2VO)、双侧颈总动脉狭窄(bilateralcommoncarotidarterystenosis，BCAS))模型小鼠和新开发的双侧颈总动脉逐渐闭塞模型大鼠和小鼠。我们也探讨脑灌注不足和β淀粉样蛋白(Aβ)之间的相互作用。二、神经病理改变1脑实质改变正如前面指出的VCID的突出特征是脑白质的改变导致认知障碍，脑白质病变也是一个潜在改善痴呆的靶标。在2VO大鼠模型中的研究发现[9]了类似于人类的进展性脑白质疏松。然而，这些病变会在严重脑低灌注[10]或者脑灌注骤降诱发的阻塞后很快发生。此外，2VO模型缺血性神经元损伤可能在术后1-3天出现在大脑皮层和海马，在7天时纹状体出现梗死灶，尽管这在不同研究之间相差很大。与白质或者灰质的病理改变一90 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究致，小胶质细胞数量明显增加，可以早到闭塞后1天在白质检测到并保持[11]显著升高到28天。明显的星形胶质反应在这个模型中也可以出现，但与其他病理改变相比出现较晚。微动脉环BCAS模型对2VO模型进行了改进以克服血流量的严重减少。对这个模型的研究发现脑白质病变在神经元细胞没有明显损伤前就被[12]破坏。Sibata等在小鼠中使用这个模型，首次报道了2周后出现明显的脑白质稀疏和空泡的形成（Kluver-Barrera染色），伴随着时间的推移而形成显著的神经胶质反应。脑低灌注也会导致选择性破坏轴突胶质连接的关[13]键蛋白质，这对有髓鞘的轴突稳定性和白质功能至关重要。在没有严重的局部缺血影响下，这种微妙的白质病变可以在术后1月的胼胝体用扩散张量(diffusiontensor,DT)或磁化传递(magnetizationtransfer,MT)MRI检[14]测到，进展超过6个月，在胼胝体、内囊、伞部和皮层下部出现明显改[15]变。低灌注模型的突出特点之一是显著的小胶质数量增加。为了应对长期的脑低灌注，小胶质细胞逐渐增加与有髓鞘的轴突损伤一致，导致明显和持续的小胶质数量增加，特别是在白质。在BACS模型中存在弥漫性的脑白质损伤，并且伴有星形胶质细胞的损伤，这种严重受损的GFAP阳性星形胶质细胞不可逆转地损伤，很容易检测到，但这些变化似乎比小胶[16]质细胞病变发生晚。2微小血管和BBB改变在大鼠2VO模型，最早在手术后3h可以观察到BBB破坏，最有可能的解释是这个模型CBF急剧下降或者严重减少的结果。然而CBF从第[17]七天开始恢复，BBB的变化看上去不那么明显。在BCAS模型，目前还不清楚BBB是否破坏，明显的BBB破坏直到在低灌注6个月后才发现，包括纤维蛋白原在脑实质中的检测和紧密连接蛋白claudin-5的水平明显减少。其他的研究中，白质损害出现更严重，显示早些时候BBB破坏在[18]BACS后3天和7天观察到。超微结构研究表明，BBB微妙的变化在[19]BCAS手术后2h出现，导致内皮功能紊乱，包括开发紧密连接。BBB的系统研究，包括紧密连接蛋白，在不同模型的脑低灌注发生后的一段时91 湖北中医药大学2018届博士学位论文间，需要评估BBB动态变化，以及这些变化是否是暂时的或是持续的。持续脑低灌注也能导致小血管形态的变化，如增加毛细血管壁的增厚和纤维化，这是一个SVD的重要特征。这些特性已经被确认在2VO大鼠模型术后12周出现和在BCAS模型术后6个月低灌注后出现。关键的SVD神经病理发现，纤维蛋白沉积或玻璃样物质积累，也在BCAS小鼠6个月低灌注后出现。在动脉逐渐狭窄模型，小血管和BBB的变化尚未被研究。3脑萎缩[20]临床影像学研究在VCID中明显的全脑萎缩和部分区域的脑萎缩。脑萎缩，特别是内侧颞叶萎缩和皮层下萎缩，与认知功能减退密切相关，[21]增强脑白质损伤对认知功能的影响。脑萎缩的纵向发展与白质病变密切[22]相关，脑白质病变最近发现容易导致皮层灰质萎缩。尽管VCID中常见与认知功能损伤密切相关的脑萎缩，但目前在临床研究仍然缺乏证据证明[23]脑低灌注与脑萎缩的相关性。有研究发现，在BCAS手术后8个月皮层或胼胝体没有明显改变，然而海马体积被发现显著减少。与这一发现一18致,海马葡萄糖吸收在F-FDGPET检测时也发现减少。通过MRIT2成像研究发现，脑容量减少在手术后6个月而不是1个月，萎缩也与缺血性和出血性病变相关。这些发现表明，脑萎缩发生在脑低灌注后一段时间，仅次于神经元损失和白质损害。未来的研究可能会利用临床前体内成像，为了长时间测量整个大脑的体积变化，以明确描述低灌注后萎缩的模式。脑白质病变已经被提出可导致皮质萎缩。因此使用较大的动物模型，以更大体积的白质，例如非人类的灵长类动物，可能更好地了解这种机制。因为脑萎缩是认知能力下降的主要基础，萎缩的变化可能是临床干预研究纳入时的一个有用的终点。4认知功能损伤[24]许多年前就已经提出慢性脑灌注不足导致认知障碍，但是人类临床研究只是显示适度的相关性。动物模型研究的证据表明，慢性脑灌注不足[25]可导致认知障碍。大多数研究使用水迷宫评估空间参考学习能力或径向92 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究臂迷宫任务来评估空间工作记忆能力。受损的空间学习被广泛报道存在于[26]2VO大鼠模型。在一些研究中已发现早在手术后7天就出现认知缺损。这些行为的变化反映在海马的病变，伴有CA1区星形胶质细胞增生和神[27]经元细胞减少。在以后空间工作记忆受损观察到与白质病变的发展关[28]联。有趣的是，气味区分任务表现不佳表明嗅觉相关的认知功能也受损。这也被视为各种神经退行性疾病患者的认知障碍的早期迹象，表明这个模型与人类VCID的相关性。BCAS小鼠模型中，使用传统8-臂径向迷宫或Y迷宫测试发现，慢[29]性脑灌注不足导致认知损伤主要在空间工作记忆。需要注意的是，术后1月，空间工作记忆受损而参考记忆仍然完好无损，可能由于选择性的额叶皮层下环路损伤。值得注意的是，轴突胶质完整性的破坏和小胶质细胞[30]增殖与工作记忆的损伤密切相关。最近的报告也证实该模型导致工作记忆受损，在手术后4个月评估一个创新的3D9臂径向迷宫以及受损筑巢[31]能力。长期之后，即6个月BCAS手术低灌注之后，空间参考记忆和空间工作记忆受损。工作和参考记忆的损伤可能会反映出脑白质和灰质病[32]理的出现，包括全脑和海马萎缩。因此，长期低灌注诱发明显的认知障碍，与病理改变相符，能更准确地复制人类SVD的特性。在逐渐动脉狭窄的小鼠模型中，空间工作记忆受损同样显示与脑白质病变相关，而海马依赖的参考学习和记忆保存下来，可能由于相对于其他小鼠模型，该模型对海马病理损伤较小。同样，在大鼠逐渐闭塞模型，空间工作记忆受损。表明逐渐颈动脉闭塞模型存在空间工作记忆受损，这突出了这些模型与人类VCID相关性，都存在额叶皮质下通路的损伤。三、脑低灌注损伤相关机制啮齿动物的低灌注模型模拟了VCID中的一些病理特征，如脑白质完整性的破坏、微血管的改变和萎缩，这些改变与认知缺损有关。然而，导致这种变化的精确的分子和细胞机制目前正在被逐渐阐明。1缺氧诱导脑白质损伤血管阻塞或颈动脉狭窄后，脑灌注明显减少，但目前还不太清楚这些93 湖北中医药大学2018届博士学位论文变化是否影响组织氧张力和对白质和灰质影响是否有差异。在BCAS小鼠模型中，组织的氧水平检测发现，在术后3天、1周和6周，胼胝体中[33]水平显著下降。组织的氧水平在正常白质比在灰质中少，表明脑白质的[34]氧气供应更容易减少。有学者研究发现，BCAS手术后3周缺氧增加，但并未比较不同大脑区域的差异性。[35]少突胶质细胞对缺氧的损伤和少突胶质细胞数量的快速损失存在在不同的低灌注模型中。在BCAS术后3天，我们发现在轴突胶质完整性受损，成熟的少突胶质细胞和少突细胞前体的数量减少。早期低氧信号可能导致少突胶质细胞的退化以及丧失轴突的营养支持，导致关键轴突蛋白定位错觉，可能削弱信号传导。人类大脑标本，发现邻近白质也存在腔[36]隙梗塞，白质病变表明了缺氧环境的特征并诱导了缺氧相关标志物的异常，包括缺氧诱导因子1(HIF-1)、HIF-2和基质金属蛋白酶7(MMP-7)。缺氧除了减少少突胶质细胞数量外，还可以直接诱导BBB通透性的[37]变化。少突胶质细胞和少突细胞前体细胞(OPCs)也被证明通过改变紧密[38]连接蛋白表达调节BBB功能。在BCAS鼠模型中的少突细胞前体被证明是通过增加MMP调节BBB开放，导致低灌注白质损伤。BBB障碍[39]也观察到在SCD脑低灌注白质和正常灌注的白质出现。少突胶质细胞核内皮细胞信号的异常可能也会允许血液中有害物质进入大脑造成VCID[40]的病理改变。[41]小胶质细胞是大脑中常驻巨噬细胞，对大脑环境变化非常敏感。通过释放促炎细胞因子/趋化因子，小胶质细胞也可能导致低灌注白质损伤。在灌注不足3天后炎性相关基因，例如Jak-STAT相关信号通路、细胞因子和细胞因子受体相互作用，在白质表达显著上调。同样活化的小胶[42]质细胞病变已发现存在于老年人类大脑白质，转录组分析发现了细胞免[43]疫相关的基因改变。在年长的灵长类动物大脑，小胶质反应主要集中在[44]与认知障碍相关的白质区域。值得注意的是，我们已经确定小胶质细胞[45]数量明显与低灌注后神经节长度和轴突胶质的异常相关。小胶质细胞数量与神经节距离减小、轴突胶质异常的增加为应对低灌注的结构性变化，94 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究仅次于继发性炎性改变。持续脑低灌注导致进行性的髓磷脂分解的增加，[46]吞噬髓鞘碎片也可能导致小胶质细胞功能障碍，激活的小胶质细胞的神经促炎表型，有助于进一步退化性变化。2微血管炎症内皮功能障碍被认为是SCD大脑血管结构性和功能性改变的一个关键机制导致VCID。早期内皮损伤和随后的BBB破坏被认为是散发SVD的主要原因。脑灌注不足上调粘附分子的表达，如细胞间粘附分子[47]1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、内皮细胞激活标记物等。在2VO大鼠模型中，内皮激活标记物在术后1天到28天增加，在3天出现高峰。BCAS模型表明轻度低灌注逐渐诱发ICAM-1上调，在术后3个月最显著。增加内皮细胞表面粘附分子的表达功能促进白细胞的附着和通[48]过BBB外渗。为了支持白细胞激活，体内辐射成像研究显示白细胞滚[49]动粘附在软膜的血管，发生在BCAS术后24h。这些变化发生在没有显著血管结构、星形胶质细胞或血管周细胞变化时，表明这是一个早期的机制。然而没有证据表明脑低灌注后有单核细胞或T细胞渗入大脑实质[50]，对于脑低灌注后骨髓细胞群的研究是必需的。开放的BBB和血液纤维蛋白原等产品进入大脑，也可能启动固有小胶质细胞的炎症反应。低灌注后小胶质细胞数量的增加与在临床前研究中发现是一致的，在低灌注小鼠和大鼠中小胶质细胞的激活与MMP2释放有关，炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)1β和IL-6产[51]生，促进脑部白质病变的进展相关。增加的MMPs一直存在低灌注模型中和增加表达已被证明在白质中表达，定位与局部小胶质细胞和内皮细胞。MMPs作为蛋白酶降解细胞外基质(ECM)和内皮细胞之间的紧密连接，已经在神经退行性疾病的BBB破坏中发现。此外增加MMPs也可以[52]损伤髓鞘。活化的小胶质细胞增加活性氧的产生，也可能影响一氧化氮[53]信号促使内皮功能障碍。8-羟基脱氧鸟苷作为氧化应激的标记，在[54]BCAS模型中发现在脑低灌注内皮细胞是增加的。因此炎性级联反应可能会进一步损害BBB，通过基质金属蛋白酶和促进氧化损伤降解ECM。95 湖北中医药大学2018届博士学位论文微血管炎症是一种常见的低灌注模型特征，慢性炎症标记物和内皮激活与其进展变化有关。尚不知道炎症是否是VCID的一个主要推动力。当[55]然从临床观察中枢神经系统和周围炎症之间存在相互作用,导致VCID。[56]此外，年龄是VCID的关键风险因素，也与小胶质表型和功能改变有关。[57]从最近的一篇论文表明，与年轻的老鼠相比，白质、神经胶质和认知变化在老年小鼠BCAS模型更明显，高龄的影响机制仍有待在不同低灌注模型探讨。3神经-胶质-血管功能如上所述，没有单一的细胞类型可能是负责VCID的病理生理。相反,破坏神经血管单元的细胞间相互作用(少突胶质细胞、内皮细胞、星形胶[58]质细胞、血管周细胞、小胶质细胞和神经元)，可能导致不同的病理改变。神经血管单元的破坏损伤BBB，削弱了血液和大脑之间的物质交换,改变了免疫系统。至关重要的是，有效神经血管单元内的细胞之间的沟通确保大脑血管的直径受到精细调控，以维持神经活动适应脑灌注和满足代[59]谢需求，这一过程称为神经血管耦合。有学者报告单侧颈总动脉狭窄后7天，血管对神经刺激的反应受损。研究显示血管对血碳酸过多和药理血[60][61]管舒张药低灌注后反应受损。在临床研究中，也观察到受损的脑血管反应性通常出现在脑白质，先于脑白质病变前出现。星形胶质细胞终足系统与突触和脉管系统联系，具有调解神经与血管的耦合，受星形胶质细胞钙信号和从终足末端释放血管活性的物质影响[62][63]。星形胶质细胞激活在BCAS手术后7天的小鼠脑白质发现，有可能破坏星形胶质细胞和血管之间的联系。事实上，慢性脑灌注不足已被证明在BCAS术后3个月诱导AQP4位移和再分配。这种普遍胶质血管功能的紊乱可能损害血液流动的调节，减少大脑血管应对低灌注的能力，加剧缺氧。在人类，这可能会进一步加剧与年龄相关的血管硬度和微血管稀[64]疏。然而，受损的神经血管单元和白质病变发展之间的直接因果关系还有待证明，由于其他的病理过程的影响，破坏的神经血管单元可能反映了组织代谢需求下降。星形胶质细胞终足的位移或血管终足接触的AQP496 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究[65]定位错觉可能会进一步影响淋巴的途径。迄今为止，低灌注对淋巴或血管周的清理路径的影响尚未研究。星形胶质细胞也被证明支持少突胶质细胞再生通过分泌脑源性神经生长因子(BDNF)，促进BCAS术后小鼠白质[66]损伤修复。这个星形胶质细胞和少突胶质细胞之间的保护机制也可能随[67]着年龄增长，神经炎性环境的损伤，并加剧白质损伤。因此，神经血管单元内的细胞间的相互作用可能对维持组织的健康至关重要。血管周细胞是收缩细胞包裹毛细血管内皮细胞，能够调节毛细血管的[68]血液循环，可能早缺血性损伤后不可逆地收缩血管。虽然血管周细胞可能具有调节BBB功能的重要作用，但其在低灌注模型中的作用在很大程度上仍是个未知数。血管周的巨噬细胞也没有在低灌注模型研究，但已被[69]证明通过产生活性氧调节高血压模型血管功能障碍，因此可能是未来需要研究的一个重要细胞类型。维护神经血管单元完整性的核心是基底膜(BM)/ECM复合体，一个在内皮细胞、壁细胞和星形胶质细胞终足中的关键组分，通过一个复杂[70]ECM蛋白质网提供基本结构和功能稳定性。正如前面已经表明，缺氧和炎症变化包括释放基质金属蛋白酶可能损坏ECM和其功能的完整性。ECM相关的蛋白质的突变导致SVD家族性发生。因此，似乎ECM也可能是散发SVD的一个重要目标。综上所述，低灌注可能是驱动与缺氧、炎症和BBB破坏有关的关键路径，导致进行性神经血管单元恶化。完整性的丧失可能会影响不同的功能，包括大脑清除途径、CBF调节通路，可能导致有毒废物的积累和缺血性损伤。此外，共存的血管危险因素如年龄、CAA和高血压可能会加剧神经血管单元的障碍。参考文献[1]Iturria-Medina,Y.,Sotero,R.C.,Toussaint,P.J.,etal.Earlyroleofvasculardysregulationonlate-onsetAlzheimer’sdiseasebasedonmultifactorialdata-drivenanalysis.Nat.Commun，2016Jun21;7:11934.[2]Pantoni,L.Cerebralsmallvesseldisease:frompathogenesisandclinical97 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湖北中医药大学2018届博士学位论文附录二博士期间发表论文情况[1]ChenY（陈延）,GuoZ,PengX,XieW,ChenL,TanZ*.NimodipinerepressesAMPKphosphorylationandexcessiveautophagyafterchroniccerebralhypoperfusioninrats.BrainResBull.2018,140:88-96.（IF=3.0）[2]TanZ,ChenY（陈延）*,XieW,LiuX,ZhuY,ZhuY.NimodipineattenuatestauphosphorylationatSer396viamiR-132/GSK-3βpathwayinchroniccerebralhypoperfusionrats,EuropeanJournalofPharmacology,2018,819:1-8.（IF=2.9）[3]陈延,谭子虎*,吴永贵,梅应兵,杨琼.基于因子分析与聚类分析的218例痉病药证规律的研究[J].辽宁中医杂志,2017,44(11):2241-2243.[4]陈延,谭子虎*,刘进进,刘茜,祝媛玥,杨琼.加减薯蓣丸抑制单磷酸腺苷活化蛋白激酶活性对慢性脑灌注不足大鼠的神经保护研究[J].安徽中医药大学学报,2017,36(06):64-68.[5]陈延,谭子虎*,刘茜,祝媛玥,杨琼,刘煜.基于p-Akt信号评价加减薯蓣丸对脑缺血大鼠海马神经元损伤的保护作用[J].上海中医药大学学报,2017,31(05):76-80.[6]谭子虎*,陈延,刘茜,祝媛玥,李红兵.加减薯蓣丸对血管性痴呆大鼠海马CA1区细胞凋亡及PTEN信号通路的影响[J].中华中医药学刊,2017,35(10):2471-2474.[7]谭子虎*,陈延,吴永贵,李贤炜,柳泓汉,杨琼.基于因子分析的非传染性痉病证素提取及证型分布研究[J].中华中医药杂志,2017,32(08):3435-3438.[8]谭子虎*,陈延.加减薯蓣丸对血管性痴呆大鼠海马BDNFmRNA表达的影响[J].上海中医药大学学报,2016,30(04):69-72.[9]谭子虎*,陈延.血管性痴呆大鼠海马区神经营养因子表达及加减薯蓣丸的干预机制[J].现代中西医结合杂志,2016,25(18):1939-1941+1956.106 加减薯蓣丸对慢性脑低灌注致阿尔茨海默样病理改变作用的研究致谢衷心感谢母校十年的培养和教育。回首三年来的奋斗历程，以及七年的本硕阶段，母校带给我们太多的回忆，使我们有机会接触优秀杰出的杏林大家，传承经典，格物致知，使我们受益匪浅。衷心感谢敬爱的导师谭子虎教授对我们深切关怀和悉心指导，给我们研究生提供学习发展的平台，不断激励我们进取，授业解惑，导师高尚的医德和精湛的医技将使我们终身受益。衷心感谢学校医院的领导、老师、医生及护士们，对我们的关心和爱护，以及工作实习中的耐心指导，让我们学会敬业、学会感恩，也使我们顺利完成学业。衷心感谢学校及湖北省中医院肝病研究所的各位老师，提供实验场地、实验器材，并给予我实验指导。最后，衷心感谢齐心协力、共克难关的师门，我们一起努力、一起奋斗、一起成长，让我们不忘初心、继续前行。再次真诚地感谢陪我顺利完成学业的各位老师、同学及家人。107
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