《茄子ERF转录因子表达分析及参与抗青枯病的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：茄子ERF转录因子表达分析及参与抗青枯病的初步研究ExpressionanalysisofeggplantERFtranscriptionfactorandpreliminaryparticipationofresistancetobacterialwilt作者姓名：邵欣欣指导教师姓名：宇丽李涛及学位、职称：博士教授博士副研究员学科、专业名称：生物化学与分子生物学学位类型：（学术学位/专业学位）论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期： 独创性声明本人声明所呈交的学位论文趣本人在导师指导＇Ｔ进行的研巧１；作及取得的研究成果。除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其化教育机构的掌化或证书而伸巧ｉ寸的材拙。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作７明确的说明并表示谢普＇居、。ｉ学位论文作者签名签字日期：Ｗｉｉ年／月／巧学占论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解畳南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅。本人授权暨南大学可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：１＾）巧［！（！＾导师签名：＾Ｉ沸／Ｉ＾签字日期心知《月相签字日期：知月吨学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编： 暨南大学硕士学位论文摘要目的茄科类雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）是一种可侵染茄子植株并导致茄子青枯病的土传性病害，感染后的植株迅速萎蔫并导致茄子大量减产。前人研究表明，AP2/ERF转录因子(APETALA2/ethylene-responsivefactor)参与植物生长发育并在积极应对冷、热、盐碱、病害等环境胁迫过程中发挥重要作用。本研究对混合青枯菌菌株开展分离鉴定。通过生物信息学分析表明茄子含有130个AP2/ERF家族成员，通过组织表达、氧化胁迫及抗感病自交系接种青枯菌条件下的差异表达，对ERF转录因子抗青枯病的机制进行研究，为后续通过基因工程手段及利用分子生物学方法研究ERF基因功能参与茄子青枯病机制及品种改良提供理论依据。方法本研究利用ISSR分子标记分析34种青枯菌菌株的亲缘关系。运用生物信息学方法对茄子ERF转录因子进行分离鉴定，并通过Q-PCR验证其组织表达、氧化胁迫及抗感青枯病自交系接种青枯菌处理条件下的表达差异，建立了基于八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的VIGS沉默体系。通过构建ERF-VIGS表达载体，利用VIGS技术对8个SmERF基因开展沉默表型分析及抗病评价。结果1.利用ISSR分子标记对分离的34种青枯菌菌株多样性分析，结果表明：34种青枯菌菌株在遗传上的距离相近，可大致分为5类。其中39和40青枯菌菌株在遗传进化上基本相似，可认为是同一菌株。2.运用生物信息学方法对茄子AP2/ERF转录因子家族的成员、分布、结构和功能进行分析。结果表明：茄子AP2/ERF家族包含130个蛋白质，其中AP2、RAV、ERF亚家族分别含有20、2和108个成员，ERF分为DREB/CBF（41个成员）和ERF（67个成员）两大亚族，进化分析表明二者分为11个小亚族。对SmERF转录因子基序分析表明：AP2/ERF含有20个重要基序，其中相同亚族ERF成员蛋白序列的氨基酸保守域构成类似，表明这些基序的存在对ERF蛋白功能的执行是必需的。3.利用Q-PCR技术对38个SmERF基因进行组织表达分析，结果表明SmERF存在组织表达差异。33个SmERF基因受高温、低温、盐、重金属镉、SA和ABA胁迫处理诱导表达；其中高温和低温处理的诱导表达呈现互补现象；盐与镉胁迫处理条件下基因表达趋I 暨南大学硕士学位论文势一致；ABA和SA的处理后基因表达相似。结果表明ERF转录因子参与茄子逆境胁迫条件下的防御应答反应。本研究结果将为茄子AP2/ERF家族基因的深入研究提供理论依据，为进一步解析AP2/ERF基因功能奠定基础。4.利用Q-PCR技术对抗感青枯病自交系接种青枯菌后的差异分析结果表明：SmERF34、SmERF39、SmERF60、SmERF62、SmERF80、SmERF88、SmERF100等24个SmERF基因可能与茄子抗青枯病相关。5.建立了基于PDS（八氢番茄红素脱氢酶）的VIGS沉默体系并构建了青枯菌处理条件下存在显著表达差异的8个基因VIGS载体，沉默后表达分析及接种处理发现SmERF66,SmERF88参与茄子抗青枯病过程。结论本研究在进化水平上对青枯菌菌株进行了分析，为茄子抗青枯病研究提供数据支持。国内外首次对茄子ERF转录因子家族开展生物信息学分析，阐明茄子ERF转录因子的成员及家族划分。茄子ERF转录因子存在组织表达差异、氧化胁迫、激素胁迫分析表明ERF转录因子参与茄子逆境胁迫条件下的防御应答反应。在茄子抗感青枯病自交系接种处理后发现有24个基因受青枯菌诱导表达，ERF转录因子沉默植株在接种青枯菌条件下存在抗病性差异，初步研究了茄子ERF转录因子参与抗青枯病的抗病机理。关键词茄子；青枯病；ISSR分子标记；ERF转录因子；病毒诱导的基因沉默；基因功能研究；II 暨南大学硕士学位论文AbstractPurposeBacterialwiltoftheeggpantwasakindofsoil-bornediseasethatwasinfectedbyRalstoniasolanacearum,whichcausedtheplantrapidlywithered,itisamainreasonofcausingyieldreductionineggplant.SomepreviousresearchesshowthatAP2/ERFtranscriptionfactorsplayanimportantroleinplant’sgrowth,developmentandenvironmentalstress,suchascold,hot,saline-alkalianddiseasestresses.OurresearchseparatedandidentifiedmixedRalstoniasolanacearum.Weviabioinformaticsanalyzeshowthattherewere130AP2/ERFfamilymembersineggplantandresearchedthemechanismofERFtranscriptionfactorsinRalstoniasolanacearumresistancethroughtissueexpressions,oxidativestressesanddifferentialexpressionpatternsunderRalstoniasolanacearumtreatmentonresistantandsusceptiblevarieties.InordertoprovidesthetheorybasisinviageneengineeringandmolecularbiologicalmethodforfunctionalgenesinRalstoniasolanacearumresistance.MethodInthisstudy,applicationsofmolecularmarkersofISSRappraised34kindsofRalstoniasolanacearum’skinship.IsolationandidentificationofeggplantoftheERFtranscriptionfactorbyusedofbioinformatics,verifiedtheoxidativestress,tissueexpressionandanti-infectedvaccinationvarietiesR.solanacearumdifferentialofexpressionbyqPCR,builtedSilenceSystemofVIGSbasisonPDS.UsedofVIGStoanalysis8SmERFgene’sphenotypicofsilenceandevaluatedisease-resistant.Results1.Westudyof34kindsofRalstoniastrainsisolateddiseasedplantsthroughISSRmolecularmarkersandgeneticdiversityshowthatdistanceralstoniastrainsaregeneticallysimilartothe34kinds,itcanbebroadlydividedintofourcategories.39and40issubstantiallysimilartoR.solanacearumstrainsatthegeneticevolution,isconsideredtobethesamestrain.2.BioinformaticsmethodseggplantAP2/ERFtranscriptionfactorfamilymembers,distribution,structureandfunctiontoanalysis.Theresultsshowedthat:eggplantAP2/ERFfamilyincludes130proteins,includingAP2,RAV,ERFsubfamilyeachcontaining20,2and108members,ERFdividedDREB/CBF(41members)andERF(67members)twolargesubfamilyPhylogeneticanalysisindicatedthatbothdividedinto11smallsubfamilies.AP2/ERFcontains20importantmotifs,wheretheaminoacidsconserveddomainsonthesamesubfamilyERFmemberproteinsequencesconstitutesimilar,suggestingthatthepresenceofthesemotifsfortheimplementationofERFproteinfunctionisrequired:IndicatesSmERFtranscriptionfactormotifanalysis.III 暨南大学硕士学位论文3.qPCRfor38SmERFgenetissueexpressionanalysisshowedthatthepresenceoftissueSmERFdifferentiallyexpressed.33SmERFgenesbyheat,cold,salt,heavymetalscadmium,SAandABAinducedstresstreatments.Whichinducedhighandlowtemperaturerenderingcomplementaryphenomena;consistentgeneexpressionundersaltstresstreatmentwithcadmiumconditiontrend;geneexpressionABAandSAtreatmentsimilar.TheresultsshowthattheERFtranscriptionfactorsinvolvedindefenseundertheconditionsofeggplantStressresponses.Theresultsofthisstudywillprovidethetheoreticalbasisforin-depthstudyeggplantAP2/ERFfamilygenes,laythefoundationforfurtheranalyticAP2/ERFgenefunction.4.AfterinbredspeciestKangganR.solanacearumbacterialwiltdifferentialexpressionanalysisshowedthat:SmERF34,SmERF39,SmERF60,SmERF62,SmERF80,SmERF88,SmERF100andother24genesassociatedwithresistancetobacterialwiltmighteggplant.5.EstablishedbasedonthePDS(phytoenedehydrogenase)VIGSsilencingsystemandconstructedthepresenceofRalstoniasolanacearumtreatmentconditionssignificantlydifferentiallyexpressedgenesVIGSvectors,expressionanalysisandsilenceinoculatedfoundSmERF60,SmERF88participationeggplantresistantwiltprocess.ConclusionOurstudywasanalyzedRalstoniasolanacearuminthelevelofevolutioninordertoprovidingdatasupportforresearchofRalstoniasolanacearumresistanceineggplant.ItisthefirsttimetolaunchbioinformaticsanalyzinginERFtranscriptionfactorsfamilyofeggplantandillustratedthecompartmentalizationofthemembersandfamiliesoftranscriptionfactorsineggplant.Theoxidativestresses,hormonalstressesandtissueexpressionsanalyzingindicatedthatERFtranscriptionfactorsparticipatedthedefenseresponsesofeggplantunderdifferentstressconditions.ThereweredifferentialresistancesonresistantandsusceptiblevarietiesofeggplantafterERFtranscriptionfactorssilenceunderRalstoniasolanacearumtreatment.ItisinordertoresearchedthefunctionsofERFtranscriptionfactorsofeggplantinRalstoniasolanacearumresistance.KeywordsEggplant;ISSRmolecularmarker;ERFtranscriptionfactor;wilt;VIGSIV 暨南大学硕士学位论文目录摘要............................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1.1青枯菌及其致病机理研究进展.....................................................................................11.2茄子抗青枯病机制研究进展.........................................................................................61.3AP2/ERF转录因子家族及其抗病机制研究进展........................................................81.4病毒诱导的基因沉默研究进展...................................................................................101.5本研究的目的及内容...................................................................................................112实验材料与方法..................................................................................................................132.1材料...............................................................................................................................132.2实验方法.......................................................................................................................182.3幼苗培养处理...............................................................................................................192.4载体构建.......................................................................................................................202.5Q-PCR检测茄子ERF表达........................................................................................263实验结果..............................................................................................................................283.1基于ISSR分子标记的青枯菌遗传进化分析.............................................................283.2茄子ERF转录因子生物信息学分析..........................................................................293.3茄子ERF转录因子家族基因的表达分析..................................................................383.4茄子病毒诱导基因沉默体系的建立...........................................................................433.5基于VIGS的茄子ERF基因功能研究......................................................................444.讨论......................................................................................................................................474.1青枯菌的分离鉴定.......................................................................................................474.2茄子ERF转录因子家族生物信息学分析..................................................................474.3茄子ERF转录因子家族组织表达分析......................................................................484.4ERF转录因子参与非生物胁迫..................................................................................484.5ERF转录因子参与青枯病的分子机制......................................................................495结论与展望..........................................................................................................................50参考文献.................................................................................................................................50附录I.......................................................................................................................................64附录II氧化胁迫、组织胁迫Q-PCR引物..........................................................................64附录III青枯菌Q-PCR补充引物........................................................................................67附录ⅣSSR引物序列............................................................................................................68在读期间的学术成果及课题基金资助.................................................................................69致谢.........................................................................................................................................70 暨南大学硕士学位论文1前言1.1青枯菌及其致病机理研究进展青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，简称青枯菌)所引起的世界范围内严重的土传细菌病害，在高温高湿的环境下爆发传染，其感染范围分布于热带亚热带和温带大部分地区[1]。青枯菌菌株复杂多变，寄主范围广范，除危害多种茄科作物外，还能侵染包括花生、香蕉在内约50多科近450种植物[2]。茄子青枯病是典型的破坏维管束类病害。在茄子植株中根、茎、叶均可受到病害影响。具体病害表现为发病中期枯萎的叶片由绿变为浅绿，然后逐渐变黄直至叶片完全萎蔫[3]。植株一旦感染青枯菌会难以控制，造成植株茎叶萎蔫下垂至全部枯死，严重影响作物的产量及质量，造成很大的经济损失[4]。近年来，受全球气候变暖等因素的影响，青枯病在我国呈现由南向北的蔓延势头，对我国茄科作物造成了严重的威胁[4]。1.1.2青枯菌的形态青枯菌属革兰氏阴性菌，根据寄主不同分为不同菌系，菌体大小不一，形状多变。大小约为0.9-2×0.5-0.8(um)，有鞭毛1-4根，多单极生，菌体无荚膜。病菌生长的温度范围为10℃-37℃。研究证明青枯菌处于52℃环境时10分钟可致死。1.青枯病的致病因子随着分子生物学研究的不断进步，从分子水平上对青枯菌致病因子的研究成了一个热点研究方向。已有研究表明青枯菌致病因子主要包括：胞外多糖I、III型分泌系统、细胞壁降解酶和II型分泌系统、青枯菌的运动性以及其他毒性因子的相互作用[6]。Husain通过比较青枯菌自发无毒突变株和野生型菌株的特点，发现无毒突变株不产生胞外多糖从而造成致病力丧失，得出胞外多糖是青枯菌致病因子之一[7]。青枯菌的胞外多糖是由多种化学成分构成的复杂化合物，不同青枯菌的生理小种胞外多糖成分不同，即使是同一小种也会有不同的胞外多糖，这就造成了青枯菌复杂性的原因之一。胞外多糖作为主要的致病因子表现为以下方面：首先胞外多糖分泌到胞外将植物维管束堵塞，造成植物因缺水，营养运输不畅[8]；其次，胞外多糖能够促进其他细菌的生长，使植株在茎部出现严重细菌感染；最后，胞外多糖可以保护细菌的表面结构使病原菌在植物体内发生作用[9]。1 暨南大学硕士学位论文青枯菌的酶解系统也是造成强烈致病性的致病因子之一。主要包括果胶降解酶、纤维素水解酶类和效应蛋白等[10]。这些酶类通过II、III、IV分泌系统分泌至胞外。复杂的酶类系统为青枯菌降解植物细胞壁使植物致死造成可能。1.1.3青枯菌的致病机理自然条件下，青枯菌附着在植物的根部表面并从根、茎伤口或者次生根伤口部位进入植株体内。随后浸染的菌体在酶解系统参与下穿过根冠与主根之间的鞘膜并引起相邻薄壁细胞细胞壁的膨胀。理论上植株初生细胞壁中的木质部、木质素、凯氏带以及内皮细胞这时会分泌一系列的生物抗性化合物组成第一道屏障阻止大多数菌体的穿透，但由于有未分化的内皮细胞或者部分内皮细胞的破坏，给植株造成“伤口”使得青枯菌得以进入植株[11]。在对抗青枯病的研究中，其抗性原因大多表现在很多品种主根出现的多筛孔板结构，多筛孔板的存在可以减缓菌体的繁殖、扩增及根部组织与病菌体之间的粘连现象。被病原菌侵害时，抗性品种细胞壁周围分泌浓密物质包围入侵的青枯菌，以此来阻止病菌的继续侵入并减缓菌体的繁殖与扩增；而在易感病品种中，青枯菌降解植株细胞壁，破坏原生质膜使病菌侵入并感染青枯病[12]。1.1.4青枯菌的鉴定青枯菌传统的鉴定方法主要是Kelmans[13]研究的用于分离青枯菌的四唑培养基方法。青枯菌与培养基上的2，3，5一氯化三苯基四氮唑相互作用，可使青枯菌在培养基上呈现流动、平滑、带白色晕图的红色菌落。其中红色的菌落表示致病力较弱，白色的菌落致病力较强。利用青枯菌的这一特性可鉴定是否为青枯菌。传统组织分离鉴定方法最大的缺点是灵敏度低，检验周期长，不能适应植物检疫和实验室快速坚定地需要。优点在于可以很直观的看出青枯菌致病力的强弱。此外，酶联免疫吸附法[14]，即利用多克隆抗体对青枯菌进行检验。分子生物学方法[15]，包括分子杂交，多聚酶PCR反应等，可为快速、精准鉴定青枯菌提供可能。1.1.5青枯菌的进化分类青枯病从发现至今已有130余年的历史，早在1864年，印度尼西亚就首先报道过青枯菌在烟草上所引起毁灭性损失。随后，美国、澳大利亚也分别报道了马铃薯青枯病和番茄青枯病的存在。直到1896年美国ErwinSmith将其病原物定名为青枯假单胞杆菌，这种称呼延续了近100年。随后Yabuuchi等根据DNA-DNA、DNA-RNA分子杂交，以同源性分析为基础将其纳入BurlehdderiaSolanacearum，之后通过对其表型特征，脂肪酸2 暨南大学硕士学位论文图谱，DNA--DNA同源性以及16sRNA序列等结果的分析，证明并成立了Ralstonia属，青枯病菌被正式收入该属中，称为Ralstoniasolanacearum[16]。该分类定义已被IJSB(国际细菌学杂志)认可[17-19]。青枯菌是一群非常复杂的菌群。主要有三种青枯菌分类系统：一是根据寄主范围分类将其划分为4个生理小种（Race）；二是根据青枯菌对3类己醇、3类多糖氧化利用情况差异以及青枯菌寄主不同分类，理论上将青枯菌划分为5个不同的生理小种或5个生化变种[20-21]。其中生理小种与生化变种之间无绝对界限。我国仅存在1号小种（生化变种3和4）、3号小种和5号小种[22]。三是在限制性片段长度的多态性以及16S核糖体RNA序列的基础上进行分类，将青枯菌分为2个主要组群：组群I为亚洲分支，包括生物型3、4、5；组群Ⅱ为美洲分支，包括生物型1、2。一般来说生化型I在美洲占优势，中国主要的类群包括生化型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V，而其中生化型Ⅲ占优势[23]。2005年，Fegan和Prior等[24]在前人研究青枯菌分类系统的基础上又提出了新的分类系统。其基本理论将分为4个分类水平青枯菌依次划分为：种(Species)、演化型(Phylotype)、序列变种(Sequevar)和克隆(Clone)，随后建立了相对应的鉴定方法。不同地理来源的青枯菌在寄主长期演化过程中出现不同状态，表现为演化型青枯菌明显的生理分化以及遗传多样性[25]。其中青枯菌的地理起源在青枯菌的演化分类过程中占有很重要的地位。根据这一理论将演化型分为四种类型，即演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。紧接在内切葡聚糖酶基因(egl)和青枯菌DNA修复蛋白基因(mutS)的基础上，使演化型又可划分为很多不同的序列变种，目前在国际上已对青枯菌已划分出53个序列变种[26-27]。关于现已发现的青枯菌的演化分类情况如表1-1所示。表1-1来自Genebank中青枯菌系统发育分析StrainOriginHostGeneBankOtherPhylotype/namesequevarM4中国桑树FJ561107.1…I/12M7中国桑树FJ561110.1…I/12Po14中国土豆FJ561162.1…I/13GMI1000圭亚那茄子EF192968.1JS771，I/12or18JT523留尼汪岛土豆AF295252.1RUN333I/13to18CFBP2968德罗普岛茄子EF371806.1RUN58I/13to183 暨南大学硕士学位论文PSS81台湾番茄FJ561066.1…I/14Tm2中国番茄FJ561134.1…I/14Zo4菲律宾姜FJ561156.1…I/14B1中国甘薯FJ561159.1…I/15E2中国茄子FJ561157…I/15PSS358台湾番茄FJ561065.1…I/15Tm82中国番茄FJ561094.1…I/16Po152墨西哥土豆FJ561148.1…I/18Tm3中国番茄FJ561135.1…I/18PSS219台湾番茄FJ561167.1…I/34E96中国茄子FJ561092.1…I/34EU2中国桉树FJ561152.1…I/44M3中国桑树FJ561106.1…I/44M2中国桑树FJ561067.1…I/48M6中国桑树FJ561109.1…I/48CFBP765日本番茄EF371810.1JS771I/UNLNPV19.66法国土豆GU295037.1…II/1LNPV23.54法国土豆GU295038.1…II/1Po2中国土豆FJ561158.1…II/1CFBP3858荷兰土豆AF295259.1JS907II/1Aoyu澳大利亚土豆FJ561083.1…II/1Po276澳大利亚土豆FJ561082.1…II/1CIP309哥伦比亚土豆EF647735.1UW80，II/2JT518留尼汪岛土豆AF295258.1RUN160II/1and2IPO1609荷兰土豆EF371814.1RUN1II/1and2CFBP1183哥斯达黎加蝎尾蕉EF371805.1JS793II/3CFBP6786西印度群岛番茄EF1823.1SPV98-II/4UW129秘鲁车前草EF371811.1…II/4UW160秘鲁车前草GU295051.1R282II/44 暨南大学硕士学位论文Po82墨西哥土豆FJ561070.1…II/4ANT307西印度群岛火鹤花DQ657648.1CFBP6784II/4CFBP2958西印度群岛番茄AF295266.1GT4II/5CFBP2972马提尼克岛番茄EF371809.1RUN27II/5CIP301秘鲁土豆GU295003.1R311II/5CFBP2957西印度群岛番茄EF3718071MT5II/5or36K60美国番茄DQ657614.1UW25II/7ICMP7963肯尼亚土豆AF295263.1RUN55II/7CFBP2047美国番茄AF295262.1…II/7A3909美国蝎尾蕉EF371812.1…II/6Z7中国姜FJ561142.1…II/16CIP312秘鲁茄子EF647740.1…IIUW477秘鲁土豆DQ657604.1RUN110II/UNCFBP734马达加斯加土豆AF295274.1JS767III/19CFBP3059布基纳法索茄子AF295270.1JCG.AU28III/23CMR15喀麦隆土豆FP885896.1…III/29JT528留尼汪岛土豆AF295273.1…III/19J25肯尼亚土豆AF295279.1…III/22R233unknown.UNDO011542.1…IVACH0732澳大利亚番茄EQ907150.1UW433IV/7MAFF301558日本土豆DQ657634.1RUN71IV/8or10R230印尼香蕉AF295280.1…IV/101.1.6青枯病的防治在我国青枯病的危害启于上世纪60年代，但由于数量少、危害面积小的原因在植物病害中并没有受到重视。直到上世纪70年代，随着青枯病影响范围的扩大，使青枯菌病害越来越多的影响我国多种经济作物。目前，青枯病呈现出由南向北，由东向西蔓延的趋势[28-29]。目前对青枯病的防御性研究并没有什么有效的措施，原因在于青枯菌菌种的复杂性、在土壤里旺盛的生命力以及青枯病的潜伏性使不能在第一时间得到判断。青枯病的防御主要包括农业防治、化学防治、生物防治、选育和栽培高抗品种几大类[29]。5 暨南大学硕士学位论文农业防治主要有嫁接、轮作等。化学防治包括在田间喷洒石灰和链霉素处理苗期[39]。青枯菌的生物防治主要包括接种拮抗菌和筛选抗青枯菌品种[31]。前人已从土壤中分离出了青枯菌的拮抗性抗菌即拮抗一号与拮抗二号[32]。这两种拮抗菌对青枯菌产生了明显的拮抗效应。抗病材料的筛选是抗青枯病最经济实惠便利的方法[33]，抗病主要来源于野生型植株。目前，广东省农科院蔬菜所已研究出很多抗青枯病茄子品种，已成为华南地区抗病品种的主力。1.2茄子抗青枯病机制研究进展茄子(SolanummelongenaL.)为茄科茄属，属草本至亚灌木之间，果实多为紫色，果实形状大小不一。茄子原产于亚洲热带地区，在我国各地均有种植，是夏季主要蔬菜之一。我国茄子的栽培面积及产量占世界第一位，占世界总面积的75%。随着全球变暖趋势以及栽培不当的影响，使茄子青枯病在我国呈现爆发式蔓延。茄子青枯病又称细菌性枯萎病，是一种很难防治的土传类细菌性疾病，主要是由假单胞杆菌属细菌（Ralstioniasolanacearun）感染造成的。是目前影响茄子生产的重要障碍[34]。对茄子有致病性的病原菌主要是青枯菌小种一号，根据小种寄主和地区的来源不同分为37个菌株，大多对茄子有较强的致病性[35]。1.2.1茄子抗青枯病资源的筛选鉴定目前对于茄子的抗病性研究主要基于种质资源筛选的基础上。茄子抗性育种方法主要包括：杂交育种、远缘杂交、组织培养、基因工程等[36]。印度是最早开始对茄子抗青枯菌品种进行筛选的国家，早在1976年就已经报道过“DingrasMμLtiplePurple”和“Sinampiro”两个抗病的品种[37]。随后Sitaramiah于1981年筛选出“PusaPurpleRound”、“VijaiHybrid”以及“BanarasGiantGreen”三个品种[38]。AVRDC（亚洲蔬菜研究与发展中心）的研究证明“Rampurlocadl”、“Mattugulla”、“Westcoatgreenround”以及“IHR124-2”均可作为抗病性来源[39]。来自印度尼西亚的Gelatik、Glatik和来自印度的ArkaNidhi、ArkaKeshav等都具有较低的病情指数，均低于10。在我国茄子的抗病性筛选工作起步较晚，直到1998年中国农科院费东昕，宋燕等才第一次对茄子资源材料进行筛选。之后我国在抗青枯病资源筛选中取得很大的进步。封林林[35]对8份亚蔬中心的材料开展抗病性鉴定，结果表明来自印尼的TS69、TS90、S56B与来自马来西亚的S47A、TS3有抗病性。刘富中等[40]以304份茄子为种质资源开展抗病性研究，结果表明野生型品种Solanumsisymbriifolium和S.torvum有较强的抗病性，可作6 暨南大学硕士学位论文为抗性来源。佘小漫[41]对广东省主要推广茄子品种开展研究，发现其对青枯病表现为抗性或中抗。乐素菊[42]对92份茄子研究表明，南方茄子比北方茄子的抗病性强。李涛等[43]以13份东南亚茄子资源和8份茄子自交系为材料开展抗青枯病资源筛选，结果表明耐热性好的茄子材料在抗青枯菌方面抗性较强，两者或许存在一定的一致性。欧阳娴等[44]将高抗青枯病的茄子与不抗青枯病的烟草嫁接开展栽培试验，结果表明嫁接后的烟草苗对青枯病抗性增强。李植良等[45]以早熟、抗病的太选，抗病、耐热的长石为父母本进行组合力测定，经05-09年间的品质鉴定得到中抗青枯病、高耐热、品质优的庆丰紫红茄。黎振兴等[46]以台浙线茄特长和蕉岭粗长–5为父母本育得杂交一代-农丰长茄显示出中抗青枯病、耐热性、耐寒性。1.2.2茄子的抗病遗传及分子标记分子生物学的快速发展，为茄子在分子水平上的抗性研究提供了可能。目前对茄子的抗性研究也取得了很大的进展。高玉梅等[47]以抗性茄子品种509与感性茄子品种533为亲本，对F2、F3代进行AFLP分子鉴定，得出茄子的抗性遗传是单基因的显性遗传，得出320bp的茄子特异性抗性基因片段，遗传距离为7.75cM。孙宝娟等[48]以茄子高感自交系5810，高抗自交系5556单一为亲本杂交所得F1代为研究材料，采用BSA结合AFLP技术研究茄子抗青枯病的抗性遗传，结果得出抗感单株相引相标记E13M1015，相斥相标记E16M5240，两者与抗性基因的遗传距离为10.14cM、7.56cM。曹必好等[49]利用BAS技术对茄子抗青枯病基因连锁基因进行筛选，得到了一个762bp的分子标记，与抗青枯病基因的遗传距离为3.52cM。朱华武[50]以高感北京六叶茄064和高抗马来西亚S3为材料，发现了在S3中与抗病基因连锁的分子标记S264，检验其遗传距离为4.33cM。储玉龙等[51]以Blacknite和湖南小圆茄为材料杂交，对F2代进行抗性分析，发现在茄子11号染色体上存在一个被命名为为ebwr11.1的抗性QTL。对其材料进行ISSR标记，发现包含19个连锁群，其平均标记距离为5.5cM。Lebeau等以MM738（易感）和AG91-25杂交F6代为材料进行抗性分析，得到一个显性基因ERS1，在长度为884cM的长度中有119个连锁遗传。李海涛等[52]通过RAPD技术标记WCGR112-8，证明茄子抗性基因的存在。。1.2.3茄子抗青枯病基因生产实践证明了在抗青枯病的研究中，抗性育种是最有效的抗病方式。目前对茄子抗病基因的研究较少。少量对抗病基因的研究大多是茄子对青枯病的抗性研究。李海涛等[52]认为茄子的抗性遗传在于一对或两对基因控制；封林林认为茄子抗性遗传符合“加性-7 暨南大学硕士学位论文显性”的遗传模式，即由多个基因控制茄子的抗性；朱华武[50]认为茄子抗性基因由一对显性基因控制。肖熙鸥等[53]人以抗病自交系和感病自交系为材料接种青枯菌表明该EDS1、PAD4、NPR1、SGT1和WRYK70基因或许与茄子抗青枯病有关；接下来的研究表明RE-BW是青枯病抗性的重要基因，RE-BW与EDS1，PAD4，NPR1，SGT1，WRKY70和无毒性效应青枯菌PopP2的互作结果提供了茄子青枯病抗性机制的重要新线索[54]。以上研究表明茄子抗青枯病基因的复杂多样性。1.3AP2/ERF转录因子家族及其抗病机制研究进展1.3.1AP2/ERF转录因子家族概述AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsivefactor)蛋白是广泛分布于植物界的一类转录因子，其命名是由AP2/ERF结构域而得出，一般AP2/ERF结构域由60-70个氨基酸组成，是一个由众多AP2/ERF成员组成的转录因子超家族[55-58]。早在1994年，Jofuku等就首次从拟南芥中分离获得第一个AP2基因，并证明其蛋白中的结构域由两个重复的AP2/ERF结构组成[59]。紧接着，1995年，Takagi和Shinshi[60]发现从烟草分离出的保守ERF结构域的乙烯响应元件结构蛋白。1999年，拟南芥AP2/ERF结构域被Kagaya证明，其结构域包括1个AP2/ERF结构域和1个B3结构域的RAV1和RAV2基因[61]。随着AP2/ERF转录因子家族的不断扩大，对AP2/ERF的分类系统也提到了日程上来。国内外学者根据ERF转录因子结构域的数量及其相互间的序列相似性，将其分为AP2、RAV和ERF三个主要亚家族[62]。其中AP2蛋白在调节植物生长发育过程中起着非常重要的作用，含有2个AP2/ERF结构域[63-66]；RAV家族蛋白在乙烯[67]、油菜素内酯[68]、生物和非生物胁迫响应[69-70]过程中发挥重要作用，含有1个AP2/ERF结构域和1个B3结构域；ERF家族是ERF/AP2中数量最大的一个家族，包含1个AP2/ERF结构域，对其庞大家族细化为DREB/CBF和ERF两类小亚家族[71]是以AP2/ERF结构域的第14和19位氨基酸残基的差异为依据；DREB/CBF亚家族成员在识别冷诱导响应原件，干旱以及植物抵抗非生物胁迫过程中具有非常重要作用，其主要序列特征在于第14和19位分别是缬氨酸和谷氨酸[72-73]；ERF亚家族成员可以识别GCC盒，并且其成员被证明在植物抵抗生物胁迫过程中发挥重要作用，序列上的特征表现在第14和19为为丙氨酸和天冬氨酸[74]。近年来，在模式植物拟南芥[75]、棉花[76]、番茄[77]、胡萝卜[78]、百脉根[79]、桃[80]、玉米[81-82]、巨桉[83]、高粱[84]、甜瓜[85]、大白菜[86-87]、芜菁[88-89]、苹果[90]、梅花[91]、马铃8 暨南大学硕士学位论文薯[92]、杨树[93]、黄瓜[94]、柳树[95]、葡萄[96]、大豆[97]、水稻[98]等植株中均发现有AP2/ERF家族的存在。其中AP2/ERF家族在拟南芥及水稻中的研究最为广泛，已经有研究证明了AP2/ERF家族成员在拟南芥和水稻中的数量。即在拟南芥中145个成员，在水稻中含有157个成员。对拟南芥和水稻的深入研究表明，AP2/ERF转录因子影响到植物生长的各个方面，主要包括植物生长、花发育、果实发育、种子发育及损伤、病菌防御、高盐、干旱、高温和低温等环境胁迫响应等[99]，是植物生长发育的重要的影响因子之一。1.3.2ERF转录因子抗病基因功能研究在茄果类植物研究方面，AP2/ERF转录因子的研究已取得了很大的成就。2010年Sharma等运用EST数据库检索发现番茄含有85个ERF基因，并证明番茄中ERF基因参与果实发育和低温等氧化胁迫过程[100]，后续于2014年对于番茄和辣椒的基因完成了基因组测序，检测发现发现在番茄中含有168个AP2/ERF成员，辣椒中含有123个AP2/ERF成员；2015年，Charfeddine等人发现马铃薯中含有155个AP2/ERF基因，并以155个基因为基础利用半定量PCR技术分析了AP2/ERF基因对其组织表达以及胁迫诱导响应[101]。在茄果类AP2/ERF家族成员基因功能研究方面，已报道出了大量的研究结果。表1-2茄果类AP2/ERF家族成员基因功能表达植株基因来源基因名称功能文献出处烟草番茄JERF1耐盐抗旱[102-103]番茄番茄TERF1耐干旱，高盐[107-109]番茄烟草番茄TERF2/LeERF2抗冻[110-111]水稻番茄TSERF1耐高渗透，耐干旱[112-113]水稻水稻OsBIERF3耐高盐[114]辣椒辣椒CaPTI1降低植株的根系活力[115]烟草烟草Tsil1抗斑点病[117]烟草辣椒CaERFLP1抗斑点病[118]烟草烟草NtERF5抗烟草花叶病[120]水稻水稻OPBP1抗烟草疫病，纹枯病[124]烟草烟草OPBP1抗水稻稻瘟[125]9 暨南大学硕士学位论文拟南芥番茄Pti4抗白粉病[122-123]番茄番茄SlERF5抗青枯病[121]烟草大白菜BrERF11抗青枯病[119]番茄番茄AtCBF1间接抗青枯病[119]辣椒辣椒CaERF5间接抗青枯病[119]辣椒辣椒CaERF18抗根结线虫[115]辣椒辣椒CaPTI1抗疫病[126]番茄JERF1在烟草中过量表达可提高烟草的耐盐和抗低温能力[102-103]，番茄JERF3的过量表达可提高番茄对干旱、低温、高盐和渗透压的耐受能力[104-105]，番茄TERF1基因的过量表达可提高番茄对干旱和高盐环境的耐受能力[107-109]；番茄TERF2/LeERF2基因在番茄和烟草中的过表达可增强番茄、烟草的抗冻害的耐受力[110-111]；番茄TSRF1基因在水稻中过量表达可增强水稻其对高渗透压和干旱环境的耐受性[112-113]。水稻OsBIERF3可提高植物的耐高盐性[114]。辣椒CaPTI1基因在辣椒中的表达可降低植株的根系活力[115]。对于抗病性的研究也取得了一定的进展。国内外学者研究表明AP2/ERF家族在抗病性方面具有重要作用[116]，如：烟草Tsil1基因和辣椒CaERFLP1基因过量表达均可提高烟草对细菌性斑点病的抗病性[117-118]；Li等研究发现番茄AtCBF1基因的过度表达可影响RAV转录因子(Related-to-ABI3/VP1)、致病相关基因(PR)以及ERF家族基因持续表达，这种持续性的表达提高了对番茄青枯病的抗性，更深一步的研究表明SlERF5可能通过调节SlRAV基因的过表达来调控AtCBF1和PR基因。大白菜BrERF11和辣椒CaERF5的表达量，间接的影响植株对青枯病的抗性，深究其原因可能是由于该基因通过SA、JA、ET途径介导了抗病基因的表达[119]。烟草中NtERF5的过量表达提高了烟草对烟草花叶病毒的抗病性[120]，番茄SlERF3的过表达体系促进了PR基因如PR1、PR2和PR5的表达且对青枯病的抗性显著提高[121]；番茄Pti4基因在拟南芥中的过量表达可提高拟南芥对白粉病和细菌性斑点病的抗病性[122-123]；番茄OPBP1基因在水稻和烟草中的过表达增强了水稻、烟草在对烟草疫病、水稻稻瘟病和纹枯病的抗性[124-125]。辣椒基因CaERF18的过表达增强了辣椒对根结线虫的抗性[115]。辣椒中CaPTI1基因与辣椒的抗疫病有关[126]。1.4病毒诱导的基因沉默研究进展早在1990年，对基因沉默现象就有过报道。Napoli等在矮牵牛中超量表达查耳酮合成酶基因（Chalconesynthase,CHS），结果发现开紫花的花瓣颜色变白许多，将这种现10 暨南大学硕士学位论文象称为共抑制[127]。病毒诱导的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS）是指携带植物功能基因的cDNA病毒侵入植株后诱导植物发生的表型性变异[128]。目前主要用于植物基因的功能研究，属于转录后基因沉默现象。研究证明，植物的基因沉默是植物长期进化造成的保持自身遗传因子稳定的主要机制，属于植物原始免疫系统。VIGS系统首先在本式烟草[129]和番茄等茄科植物中应用。后续在拟南芥，大麦，玉米，大豆，马铃薯中也得到了验证。利用基因工程将植物需要沉默的内源基因片段插入病毒载体，进而构建重组新的病毒结构来对植物进行感染。通过检测植物表型或生理生化指标上的变化，可以初步推测目的基因的功能。并非所有的病毒都可以具有VIGS现象，有些病毒由于存在一些抑制蛋白类因子，对VIGS会产生削弱的作用。目前已报到的病毒载体有烟草花叶病毒[130]、马铃薯X组病毒[131]、麦条花叶病毒[132]、甘蓝卷叶病毒[133]、番茄花叶病毒[134]、黄瓜花叶病毒[135]。病毒诱导基因沉默技术相对于其他转基因技术具有高效、耐用且高通量特性。在功能基因组研究领域，VIGS技术已成为了首选技术。胡节立等[136]在番茄中沉默了多梳蛋白基因LeEMF2，表明LeEMF2对TYLCV有抗性作用。常璟等[137]对陆地棉中GhBOP1基因沉默，得出GhBOP1对离层的形成具调控作用。宋静等[138]对中间偃麦草TiAsp基因沉默，表明TiAsp基因在感染白粉病菌的过程中起重要作用。牟晶晶等[139]对小麦SSI2基因的沉默表明SSI2基因对白粉病有较高抗性。龚攀等[140]对甜菜P5cs基因的沉默表明P5cs与甜菜抗旱性相关。李芳军等[141]对棉花GhBAK1基因的沉默表明GhBAK1与棉花抗黄萎病相关。郭玉双等[143]对烟草Ntrt1基因的沉默表明Ntrt1在烟草生长发育中有重要作用。赵祯等[144]对茄子SmMsrA基因沉默表明SmMsrA基因与果实的发育有关。尹延旭等[145]对辣椒CaPIP1-1基因的沉默表明辣椒CaPIP1-1与植株发育有关。刘军等[146]对野生茄Ve基因沉默表明Ve基因可提高野生茄抗黄萎病。刘自梅等[147]对番茄LeUCP基因沉默表明番茄LeUCP基因可提高番茄的抗逆性。1.5本研究的目的及内容在植物育种以及种质资源筛选中，植物的抗性研究一直属于研究的热门话题。茄子(SolanummelongenaL.)是世界上重要的经济作物之一。茄科雷尔式菌(Ralstoniasolanacearum)可侵染茄子并引发青枯病，对其产量及品质造成严重危害。茄子抗青枯病的研究一直是茄子抗病研究的重点问题，但深究其解决方法，至今未有明显性成效。茄11 暨南大学硕士学位论文子ERF转录因子是一个庞大的基因家族，含有130个成员，ERF转录因子在植物的抗逆性以及抗病性过程中有非常重要的作用。目前，还未见茄子ERF转录因子的分离鉴定及参与抗青枯病研究的报道，对于ERF参与抗青枯病的机制更加呈现空白状态，有许多问题承待解决。因此，本研究从茄子ERF的分离鉴定开始，对茄子ERF转录因子家族进行分析，开展组织表达及其胁迫分析，以及抗感青枯病自交系的差异表达分析。利用VIGS技术对青枯菌感染的茄子植株进行分析，旨在探明ERF转录因子在茄子抗青枯病的分子机制。为利用分子生物学技术和基因工程手段改良茄子青枯病抗性奠定坚实的基础。本研究的主要内容：1.34株青枯菌菌株的分离及亲缘关系鉴定；2.茄子ERF转录因子的分离鉴定；3.茄子ERF转录因子组织表达和氧化胁迫分析；4.茄子抗病和感病自交系间ERF转录因子的表达差异分析；5.病毒诱导基因沉默体系的建立；6.构建茄子ERF-VIGS载体并对茄子ERF转录因子开展基因功能研究。12 暨南大学硕士学位论文2实验材料与方法2.1材料2.1.1实验品种茄子(SolanummelongenaL)品种：农丰长茄，茄子抗病品种06112和茄子感病品种05119，抗病感病茄子品种编号由广东省农业科学院蔬菜所李植良教授自编[43]。青枯菌来自田间病株分离。2.1.2菌株与载体1.菌株：大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株DH5α，农杆菌GV3103，青枯雷尔氏菌。2.载体：购于Takara公司的载体pMD-18T载体。pTRV1和pTRV2载体由广东省农业科学院蔬菜研究所孙宝娟博士提供。2.1.3实验仪器仪器名称生产厂家仪器型号PCR仪GeneCompanyLimitedVerity/9700电子精密天平梅特勒-托利多仪器有限公司PB602-E普通冰箱HaierBCD-196TJ微波炉美的M1-231A生物安全柜HaierHR40-13B2智能型人工气候箱宁波江南/宁波莱福1000B3/PQX-330A-3H电热恒温水浴锅BluePardHWS-12高压蒸汽灭菌锅日本三洋（SANYO）MLS-3750漩涡混合器上海精科XW80-A微型高速离心机Kylin-BellLX-400冷冻离心机eppendof5417R水平电泳仪广州市深华生物技术有限公司PowerPacBasic琼脂糖水平电泳槽北京六一DYCZ-30C凝胶成像仪SYNGENEG:BOX紫外分析仪上海嘉鹏科技有限公司UV-3000型超低温冰箱ThermoThermo99113 暨南大学硕士学位论文电热恒温鼓风干燥箱上海实验仪器厂有限公司101A-3B超微量核酸蛋白测定仪ThermoND-200C自动蒸馏系统瑞典Kjellec2200pH电导率测定仪梅特勒-托利多仪器有限公司S40恒温培养震荡器天津市欧诺仪器仪表有限公司HNY-200D微量移液枪eppendofResearchplus脱色摇床常州丹瑞实验仪器有限公司TS-1垂直电泳仪北京六一仪器厂DYY-6C荧光定量仪Bio-RadCFXConnect2.1.4实验试剂1.工具酶：名称购买公司2×ExPfuPCRMixGenStarDSTM2000东盛生物DSTM500050bpLadderrTaqDNA聚合酶Takara生物试剂公司RNA抑制剂酶（RRI）T4DNA连接酶ReverseTranscriptaseM-MLVBamHIEcoRIRNaseARNaseFreeSYBRPremixExTaq（2×）2.激素试剂实验所用激素试剂氨苄青霉素(Ampcillin,Amp)、卡那霉素(Kanamycin,Kan)、庆大霉素(Gentamicin，Gen)、利福平(Rifampicin,Rif)、水杨酸(Salicylicacid,SA)、脱落酸(Abscisicacid,ABA)等购自于鼎国试剂公司。3.试验用试剂盒14 暨南大学硕士学位论文试剂盒名称试剂公司质粒提取试剂盒OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒OMEGARNA提取试剂盒北京全式金生物公司Real-TimePCR试剂盒Takara公司4.培养基、培养液配制(1)LB培养基（每1000mL,PH为7.0）名称用量处理用法胰蛋白酶10g121℃，20min,酵母提取物5g高温高压灭菌NaCl10g琼脂粉1.5g(2)NB培养液（每1000mL，PH为7.0）名称用量处理方法胰蛋白酶5g121℃，20min酵母提取物1g高温高压灭菌牛肉浸膏3g(3)TTC培养基（4%TTC，每1000mL，PH为7.0）名称用量处理方法胰蛋白胨10g121℃，20min,葡萄糖5g高温高压灭菌酪氨酸酸水解蛋白1g4%的TTC在高温灭菌后琼脂粉25-30g于超净台上添加(4)1/2MS培养基（每1000mL，PH为5.8-6.0）名称用量处理方法母液I(大量元素)25mL121℃，20min,母液II（微量元素）5mL高温高压灭菌母液III（铁盐）5mL母液IVA(肌醇)5mL15 暨南大学硕士学位论文母液IVB（有机）5mL蔗糖30g琼脂粉7g注：母液配方母液I成分用量(mg/L)NH4NO333000KNO338000CaCl2·2H2O8800MgSO4·7H2O7400KH2PO47400母液IIKI166H3BO31240MnSO4·4H2O4460ZnSO4·4H2O1720Na2MoO4·2H2O50CuSO4·5H2O5CoCl2·6H2O5母液IIIFeSO4·7H2O5560Na2-EDTA·2H2O7460母液IV肌醇20000烟酸100维生素B6100维生素B1100甘氨酸400(5)抗生素配制名称溶剂处理方式终浓度Kan无菌水抽滤灭菌50mg/mLRifDMSO自然灭菌50mg/mLAmp无菌水抽滤灭菌50mg/mLGen无菌水抽滤灭菌50mg/mL16 暨南大学硕士学位论文ABA少量无水乙醇抽滤灭菌1mg/mLSA少量无水乙醇抽滤灭菌1mg/mL(5)CTAB配制（2%）名称用量处理方法CTAB20g121℃，20min,NaCl81.82g高温高压灭菌PVP20gTris-HCl100mLEDTA40mL(6)Lysisbuffer名称用量处理方法Tri-HCl40mM无需灭菌，直接使用乙酸钠20mMEDTA1mMSDS1%蒸馏水1000mL(7)NaCl配制：29.2gNaCl溶于80mL水中，定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌。(8)8%变性胶丙烯酰胺工作液（每4L）名称用量丙烯酰胺304g尿素500gN-N亚甲基双丙烯酰胺16g10×TBE400mL(9)10×TBE配制（每1L）名称用量Tris-base108g硼酸55gEDTA-Na27.44g(10)6×loadingbuffer配制名称用量配制方法17 暨南大学硕士学位论文去离子甲酰胺490mL直接混合溶解使用EDTA10mL溴酚蓝0125g二甲基苯氰0125g(11)Na+/Mg2+试剂（每200mL）名称用量MgCl2•6H2O3.25gCaCl2•2H2O0.6g2.2实验方法2.2.1青枯菌的分离1.用双蒸水洗脱病害标本发病部位，制成青枯菌悬浮液并将悬浮液稀释涂于TTC培养基上培养1-2天；2.培养1-2天的青枯菌单菌落传代于新的TTC培养基上；3.选取培养基上单菌落于新的培养基上，本研究共分离出34个青枯菌菌株。4.对34种青枯菌利用NB培养基于5mL离心管中扩大化培养，220g/28℃/24h。2.2.2青枯菌DNA提取采用简易提取法提取青枯病菌菌株的基因组DNA，用于后续实验模板。具体步骤如下：1.取1.5mL过夜培养好的细菌细胞，13000rpm离心3min；弃置上清，加入200μLlysisbuffer，用吸管轻轻吹打混匀混匀；2.加入66μL5MNaCl用吸管混匀，13000g离心10min3.将上清移至新的离心管中，加入1μLRNaseA（10mg/mL），震荡混匀，37℃恒温30min；4.加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），上下颠倒约50次，13000rpm离心6min；5.转移上清液至另一个新的离心管中，若上清液仍然浑浊，重复步骤一次此步骤；6.加入1mL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-20摄氏度冻存30-60min，13000rpm离心12min；7.弃置无水乙醇，使离心管沉淀干燥；8.加入50μL1×TE并放于4℃保温过夜；9.DNA于-20℃保存。2.2.3青枯菌ISSR分子标记18 暨南大学硕士学位论文1.以青枯菌DNA为模板进行分子扩增，其扩增体系如下：试剂名称用量青枯菌DNA1μLPfumix7μL引物F0.5μL引物R0.5μLddH2O1μL扩增条件：温度时间循环数94℃3min194℃30s1Tm(58℃)30s3872℃30s72℃10min4℃+∞12.PCR扩增产物加4μLloadingbuffer,于聚丙烯酰氨凝胶电泳。3.对凝胶结果染色，观察其条带分布。2.3幼苗培养处理2.3.1茄子幼苗培养1.将农丰长茄种子在37℃水浴锅中侵泡蒸馏水中4-6h。2.弃置水分，在超净台上酒精洗涤1min，无菌水洗涤2-3次；摇床上10%的次氯酸钠洗涤15-20min，200g。3.弃置次氯酸钠，无菌水洗涤2-3次，吸水纸吸去水分，用镊子将种子放置1/2MS培养基上培养。4.1/2MS于28℃暗处培养直至露白，之后移入光下培养(白天16h28℃，晚上8h25℃)。5.在种子长出2片真叶时移入培养土里继续培养。2.3.2茄子幼苗胁迫处理选取处于同一生理期的茄子幼苗（同一批同一环境下的幼苗），幼苗的激素处理和胁迫处理在1/2MS培养基的基础上，即在不同的灭过菌的液体培养瓶中加入不同试剂。19 暨南大学硕士学位论文胁迫处理为非生物处理，包括42℃高温处理，4℃低温处理，NaCl处理（调整终浓度为200mM/L）；CdCl2(调节终浓度为100μM/L)。激素胁迫包括分别把ABA和SA两个终浓度调整为100μM/L，5mM/L。之后对处理过的胁迫，非胁迫处理植株分别进行0、1、2、8小时的取样，取样后即刻置于液氮中，-80℃保存。青枯菌处理：本文使用的青枯菌为作者自行分离的青枯菌种，取出后于TTC培养基上活化，之后挑取单菌落于NB培养基上扩大培养。用无菌水调节至青枯菌的OD值为0.3-0.4。对青枯菌处理进行0、12h、24h、36h取样。2.3.3VIGS表达处理1.于-80℃取出含有载体及辅助载体的农杆菌，室温解冻并在LB+Rif-Kan+Gen的固体培养基上划线涂板，28℃恒温箱倒置培养2-3d。2.挑单克隆于5mLLB+Rif+Kan+Gene的5mL管中于摇床上摇至菌体活化，28℃，220g培养24h。3.ERF-VIGS载体菌及TRV载体菌以1:1的比例混合，离心8000g，弃置上清，加入无菌水调节OD值为0.3-0.4.4.待叶片长出第三片叶子时，利用去除针头的1mL微量注射器将菌体从叶片背面渗透压进叶片。5.在处理后的24h内黑暗处理，温度为22℃。之后的处理白天12h,夜晚12h,温度均为22℃。6.光照培养箱中培养15-20天，观察叶片表型并取样。2.4载体构建2.4.1引物设计根据cDNA序列（例如VIGS引物需要特定的酶切位点）利用primer5进行引物设计。引物见附录I2.4.2茄子总RNA提取利用RNA提取试剂盒提取茄子RNA，方法如下：(1)取80~100mg液氮冻存的茄子样品迅速置于液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨直至样品成粉末状，期间不断补充液氮。(2)研磨充分后，迅速将粉末移至2mLRNase-free离心管中并加入1mLTPI。(3)用力震荡20~30秒后，12,000×g4℃离心5分钟。20 暨南大学硕士学位论文(4)小心吸取上清，将上清移至新的2mLRNase-free离心管中（大约600µL）。(5)向上清中加入等体积的TPII溶液，反复颠倒混匀数次，加入1/4上清体积的氯仿，再次颠倒混匀数次后，室温下孵育5分钟。(6)12,000×g4℃离心5分钟。此时溶液分三层，RNA分布于上清层中。(7)小心吸取上清（大约550µL）于新的1.5mLRNase-free离心管中，向上清中加入等体积4℃预冷的异丙醇。轻轻颠倒混匀，室温孵育10分钟。(8)12,000×g4℃离心10分钟，弃上清。(9)加入1mL4℃预冷的无水乙醇洗涤，剧烈涡旋洗涤沉淀。(10)12,000×g4℃离心5分钟，弃上清，在通风厨晾干沉淀（大约3分钟）。(11)加入50µLRNA溶解液溶解RNA沉淀，将样品保存于-80℃以备长期使用。(12)所得的RNA样品使用琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸蛋白测定仪进行完整性和浓度纯度的检测。2.4.3cDNA制备1.在RNasefree离心管中配制模板-引物混合液：名称用量Ologo(dt)(10μm)5μLTotalRNA1ugRNasefreeddH2OUpto10μL2.于PCR仪上70℃保温10min，迅速于冰上冷却5min，快速离心使变性溶液中RNA-引物沉淀管底；3.在离心后的离心管中加入反转录反应液名称用量模板-变性引物10μL5×M-MLVBuffer4μLdNTPMixture（2.5mMeach）4μLRNaseInhibitor（40U/μL）0.5μLRTaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μL）0.5μLRNasefreeddH2OUpto204.于PCR仪上42℃放置保温60min；5.70℃下15min，冰上冷却，得到的cDNA于-20℃保存。21 暨南大学硕士学位论文2.4.4目的片段获得PCR反应体系（50μL）名称用量2×HiFiTaqPCRStarMix25μLcDNA2μL上游引物1μL下游引物1μLddH2O21μLPCR反应程序：温度时间循环数94℃3min194℃30s1Tm(58℃)30s3872℃30s72℃10min4℃+∞12.4.5DNA胶回收目的片段的胶回收是通过胶回收试剂盒来回收的。具体步骤如下：1.在紫外光下对照Marker切下目的片段。2.柱平衡：向放入收集管中的吸附柱CB2中加入500µL平衡液BL，13,400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液并将吸附柱重新放回收集管中。3.向切下来的胶块中加入等体积的溶液PC（每0.1g凝胶则加入100µL溶液PC），50℃水浴10分钟，期间每2~3分钟温和地上下翻转离心管。4.将步骤3所得的溶液转移到吸附柱CB2中，13,400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液并将吸附柱重新放回收集管中。5.向吸附柱CB2中加入600µL漂洗液PW，静置5分钟后，13,400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液并将吸附柱重新放回收集管中。6.重复步骤5。7.13,400×g离心2分钟，将吸附柱置于室温下放置5分钟彻底晾干。22 暨南大学硕士学位论文8.将吸附柱CB2放入一个新的离心管中，向吸附膜中央位置悬空滴加50µL洗脱缓冲液EB，室温下放置2分钟。9.13,400×g离心2分钟即可收集好DNA溶液。2.4.6目的片段连接目的片段连接体系如下：名称用量目的片段0.2pmolpMD-18TVector0.2pmolT4连接酶0.5μLT4Ligasebuffer1μLddH2O8.1μL2.4.7制备大肠杆菌感受态1.小摇DH5α：挑取DH5α单菌落，置于5mL新鲜的LB液体培养液中（无抗生素），37℃，220g于摇床上18h。2.将5mL种子液于分别加入4瓶新鲜的LB液体培养基中，每瓶培养基50mL，37℃，220g振荡培养至OD600为0.4（大约需2-3h）。3.立即将步骤2中的菌倒入预冷的50mL离心管中，置于冰上15min。4.于4℃冷冻离心机上离心8000g，10min。5.弃置上清液，加入15mL预冷的Mg2+/Ca2+溶液并轻轻吹打菌体，使其悬浮于溶液中，于冰盒上静置30min，之后4℃，8000g冷冻离心10min。6.弃置上清液，用1.6mL预冷的100mMCaCl2溶液轻轻吹打菌体，使其悬浮于溶液中，冰上静置20min。7.每个50mL离心管中加500μL80%甘油，吹打混匀，每50-100μL分装于1.5mL的离心管中。2.4.8连接T4载体的目的片段转化大肠杆菌利用pEASY®-T1CloningKit试剂盒将胶回收片段与T载体连接并转化大肠杆菌，其具体步骤如下：1、连接反应ComponentsVolume胶回收产物1µL23 暨南大学硕士学位论文pEASY®-T1CloningVector1µLsterilewater3µL轻轻混匀后，室温下反应5分钟。反应结束后，立刻将离心管置于冰上。2、转化1.把连接产物加到50µLDH5α感受态细胞中，用移液枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。2.42℃水浴热激30秒并立刻置于冰上2分钟。3.加入800µLLB液体培养基，200rpm，37℃孵育1小时。4.取8µL500mMIPTG和80µL10mg/mLX-gal混合并均匀涂于含有适量氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱中放置30分钟。5.将孵育好的菌液8000g离心，弃置800µL上清液，将剩余液体均匀地涂于平板上，37℃恒温培养箱中过夜培养。2.4.9阳性克隆鉴定1.混合好PCR反应体系（引物为扩增目的片段的引物）。2.挑取白色单克隆到混合好反应体系的离心管中。PCR反应条件如下：温度时间循环数94℃3min194℃30s1Tm(58℃)30s3872℃30s72℃10min4℃+∞13.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，确认阳性克隆后扩大培养。挑取阳性菌落于液体LB培养基中，200rpm，37℃培养18h。2.4.10阳性克隆的质粒提取利用天根快速质粒小提试剂盒进行阳性克隆菌液质粒提取。1.吸取4mL过夜培养的菌液，13,400×g离心1分钟，弃掉上清。2.向离心管中加入150µL溶液P1，使用涡旋振荡器使细胞沉淀悬浮。3.向离心管中加入150µL溶液P2，温和地上下颠倒10次作于使菌体充分裂解。4.向离心管中加入350µL溶液P5，马上快速上下颠倒混匀20次，此时出现絮状沉淀。24 暨南大学硕士学位论文13,400×g离心2分钟。5.将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3中，3,400×g离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。6.向吸附柱CP3中加入300µL漂洗液PWT，13,400×g离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。7.13,400×g离心1分钟，将吸附柱CP3置于一个新的离心管中。8.向吸附膜的中央部位滴加50µL洗脱缓冲液TB，13,400×g离心30秒收集质粒溶液。将质粒溶液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。2.4.11阳性转化子酶切鉴定体系阳性酶切转化子酶切鉴定体系如下：试剂用量处理方法质粒DNA4μL酶切时间根据酶切体系10×Buffer2μL不同而不同，一般为4-BamHI0.5μL6h.EcoRI0.5μLddH2O3μL2.4.12农杆菌感受态的制备1.小摇农杆菌：挑取农杆菌单菌落，置于5mL新鲜的NB液体培养基（无抗生素），28℃，220g于摇床上24h。2.将5mL种子液于分别加入4瓶新鲜的NB液体培养基中，每瓶培养基50mL，28℃，220g振荡培养至OD600=0.4（大约需2-3h）。3.立即将步骤2中的菌倒入预冷的50mL离心管中，置于冰上15min。4.于4℃冷冻离心机上离心8000g，10min。5.弃置上清液，加入15mL预冷的Mg2+/Ca2+溶液并轻轻吹打菌体，使其悬浮于溶液中，于冰盒上静置30min。4℃，8000g冷冻离心10min。6.弃置上清液，用1.6mL预冷的100mMCaCl2溶液轻轻吹打菌体，使其悬浮于溶液中，冰上静置20min。7.每个50mL离心管中加500μL80%甘油，吹打混匀，每50-100μL分装于1.5mL的离心管中。2.4.13重组子转化农杆菌25 暨南大学硕士学位论文1.将农杆菌感受态从-80℃取出并置于冰盒上解冻，加入10μL质粒后于冰上放置30min；液氮中冷激2min。37℃水浴5min。2.加入28℃LB培养基800μL，28℃，220g振荡培养4-6h。3.离心弃置上清，取100μL离心沉淀物涂布在含有Rif（50mg/mL）和Kan（75mg/mL）抗生素的LB平板上，28℃倒置培养24h得到单菌落。2.4.14转化农杆菌鉴定农杆菌的鉴定方法参考T4载体转化大肠杆菌鉴定方法。2.4.15菌株保存方法大肠杆菌保存方法：60%甘油和含有LB的菌液1:1混合，反复颠倒混匀，于液氮中瞬间冷却后置于-80℃保存。农杆菌保存方法：60%甘油和含有LB的菌液1:1混合，反复颠倒混匀，于液氮中瞬间冷却后置于-80℃保存。青枯菌保存方法：含有NB培养液8000g离心，弃置上清，加入等量的无菌水，室温放置保存。2.5Q-PCR检测茄子ERF表达2.5.1茄子ERF胁迫表达1.对处理过的茄子样品提取RNA并反转录。2.Q-PCR引物设计：主要使用primer5.0软件设计引物。引物见附录II，附录III。3.Q-PCR反应体系（于96孔板上进行）10μL体系试剂名称试剂用量SYBRPremixExTaq(2×)5μLQ-PCR-F0.4μLQ-PCR-R0.4μLcDNA100ngddH2OUpto10μL4.Q-PCR反应程序温度时间循环数95℃3s195℃5s3926 暨南大学硕士学位论文55℃2s72℃3s65℃5s195℃5s15.Q-PCR结果分析：本论文中选用SmCYP，SmEF1为稳定表达的内参，采用2-∆∆Ct方法计算基因表达相对量[148]。2.5.2茄子ERF转录因子组织表达1.茄子组织样品取自广东省农业科学院白云基地，对茄子根、茎、叶、花、果实进行取样，每个样品为三个重复。2.提取RNA，进行Q-PCR，具体步骤参考2.4.2、2.4.3和2.6。2.5.3抗病及感病品种中ERF转录因子的表达1.分别对抗病，感病两种型号的茄子进行青枯菌处理，并于0h、12h、24h、36h取样，样品为三个重复。2.提取样品RNA，反转录为cDNA，进行荧光定量具体步骤参考2.4.2、2.4.3和2.6。2.5.4含有ERF-VIGS载体的茄子接种青枯菌后的表达分析1.对含有ERF-VIGS载体的茄子幼苗取样，每个样品为三个重复。2.提取样品RNA，反转录为cDNA，进行荧光定量具体步骤参考2.4.2、2.4.3和2.6。27 暨南大学硕士学位论文3实验结果3.1基于ISSR分子标记的青枯菌遗传进化分析ISSR分子标记是近年来新发展的分子标记技术之一。以快速，高效著称，在近年来的分子标记范围内占重要地位。为研究田间分离的青枯菌菌株，本研究以34种青枯菌菌株DNA为模板，以14条SSR引物扩增并鉴定出34种青枯菌菌株。扩增引物见附录III。扩增结果如图3-1所示。图3-1青枯菌ISSR扩增注：A为青枯菌电泳图，B为青枯菌分离过程，其中红色部分为致病力弱的菌株，白色为致病力强的菌株；对青枯菌SSR扩增结果进行条带统计，有条带的记为1，无条带的记为0。ISSR条带基于UPGMA法聚类分析，聚类结果如下图3-2所示。对聚类结果进行分析，34种青枯菌的遗传相似度在0.56-0.78之间。34种青枯菌聚类分为5类：第一类包括2、14、22、34、4、17、15、29、7、8、38、39和40菌株，其中39号菌株和40号菌株极为相近，可归为同一种青枯菌；第二类有5种青枯菌，包括3、26、33、25、31号菌株；第三种包括5、24、32、18、42、35、37、36号菌株；第四种有10、30、11、13、21、20和19号菌株；最后一类有且仅有6号一种青枯菌，其遗传相似性离其他菌种较远。28 暨南大学硕士学位论文图3-214条引物青枯菌UPGMA聚类分析3.2茄子ERF转录因子生物信息学分析3.2.1茄子ERF转录因子生物信息学分析随着ERF基因家族的不断深入研究，拟南芥、番茄、水稻、大豆、杨树、甜瓜等AP2/ERF转录因子已被鉴定[149-151]，如表3-1所示。本研究参考番茄及拟南芥ERF转录因子家族成员并通过NCBI和SGN数据库检索对茄子ERF基因家族成员信息鉴定。SMART和Pfam的配合使用进一步分析出茄子ERF结构域信息：茄子AP2/ERF家族共有130个成员，对其家族成员分类可知AP2家族成员20个（含2个AP2/ERF结构域），RAV成员2个（含1个B3和1个AP2/ERF结构域），最丰富的基因家族是ERF家族，含有108个家族成员。在结构域划分基础上对AP2/ERF转录因子进行进一步细致化分析，并根据其在染色体上的位置对新检索的AP2/ERF转录因子进行编号排号，研究得出：茄子ERF转录因子的蛋白长度范围为128-827aa，CDS为387-2484bp，其分子量为15.11-58.9kDa。根据AP2/ERF结构域与氨基酸序列的不同，将茄子ERF家族分为两类：含有41个成员的DREB/CBF1以及含有67个家族成员的ERF。茄子ERF亚细胞定位分析表明大多转录因子分布于细胞核内、线粒体、线粒体基质也有分类。对AP2/ERF转录因子具体分析如表3-2所示。29 暨南大学硕士学位论文表3-1多种植物AP2/ERF转录因子数目组分茄子拟南芥番茄水稻大豆杨树AP2201816nd2626ERF10812293139120168RAV263nd25Other---nd-1Total130147112nd148200注：以上数据来自Rashid等2012；Nakano等2006；Zhuang等2008；张计育等2012；Ma等2014.表3-2茄子ERF转录因子理化性质分析及其亚细胞定位基因名称类别SGN编号染色体CDS长度/bp氨基酸个数等电点PI分子量/kDa亚细胞定位SmERF1A1Sme2.5_02826.1_g00003.1E016512165.2324.57细胞核SmERF2B2Sme2.5_12868.1_g00001.1E017742576.3228.95细胞核SmERF3B1Sme2.5_05038.1_g00002.1E019993325.2737.29细胞核SmERF4B3Sme2.5_03732.1_g00002.1E017682557.6328.25细胞核SmERF5B5Sme2.5_04437.1_g00004.1E018162405.2127.70细胞核SmERF6B3Sme2.5_04475.1_g00002.1E015041676.4218.51细胞核SmERF7B3Sme2.5_04475.1_g00003.1E016122037.8423.03细胞质SmERF8B3Sme2.5_09500.1_g00002.1E025101699.5119.00细胞核SmERF9B3Sme2.5_09500.1_g00003.1E027952645.1730.82细胞核SmERF10A5Sme2.5_00029.1_g00016.1E025041678.3218.42细胞质SmERF11B4Sme2.5_00010.1_g00006.1E026392128.7324.06细胞核SmERF12B1Sme2.5_00787.1_g00017.1E036362116.4321.98细胞核SmERF13B3Sme2.5_03951.1_g00001.1E036032008.8022.54细胞核SmERF14B3Sme2.5_05774.1_g00004.1E033871285.6914.60细胞核SmERF15B3Sme2.5_05774.1_g00005.1E034621537.7617.34细胞核SmERF16A1Sme2.5_04750.1_g00001.1E036362114.9023.66细胞核SmERF17A1Sme2.5_04750.1_g00002.1E035281759.4519.32叶绿体SmERF18A1Sme2.5_04750.1_g00004.1E036032005.7222.05细胞核SmERF19A1Sme2.5_16389.1_g00001.1E036032007.1136.75细胞核SmERF20B1Sme2.5_05640.1_g00001.1E039933307.1136.75叶绿体SmERF21B5Sme2.5_08423.1_g00001.1E031,2003994.5744.38细胞核SmERF22B1Sme2.5_00022.1_g00002.1E037592529.7828.20细胞核SmERF23B6Sme2.5_00022.1_g00009.1E034981655.8618.73细胞核SmERF24B3Sme2.5_00125.1_g00017.1E0323917965.6888.63细胞核SmERF25A4Sme2.5_00372.1_g00002.1E037412465.6426.88细胞质SmERF26B3Sme2.5_00837.1_g00012.1E037592526.4628.51细胞核SmERF27B5Sme2.5_05202.1_g00002.1E0312394125.3846.12细胞核SmERF28B6Sme2.5_07921.1_g00003.1E036092029.1722.55细胞核SmERF29B1Sme2.5_02649.1_g00005.1E046872289.2724.67细胞核SmERF30B1Sme2.5_03788.1_g00003.1E046632209.0224.25细胞核SmERF31A2Sme2.5_00003.1_g00046.1E0424278089.0687.37细胞核30 暨南大学硕士学位论文SmERF32A5Sme2.5_00038.1_g00024.1E045431808.6720.36细胞核SmERF33A6Sme2.5_00086.1_g00004.1E0410773585.3439.51细胞核SmERF34B4Sme2.5_05971.1_g00001.1/TEE0413744576.3849.73细胞核SmERF35B3Sme2.5_00211.1_g00009.1E056962315.7926.49细胞核SmERF36B3Sme2.5_00388.1_g00003.1E055581859.8721.37细胞核SmERF37B3Sme2.5_02014.1_g00005.1E057112369.1726.18细胞核SmERF38B3Sme2.5_02014.1_g00007.1E058492826.1831.93细胞核SmERF39B3Sme2.5_02014.1_g00008.1E056092029.1822.85细胞核SmERF40A4Sme2.5_03441.1_g00007.1E057622535.7328.77细胞核SmERF41A2Sme2.5_04615.1_g00005.1E0511553844.6142.54细胞核SmERF42A6Sme2.5_00374.1_g00013.1E059363116.9134.00细胞核SmERF43B4Sme2.5_00713.1_g00012.1E0511913968.8043.04细胞核SmERF44A1Sme2.5_09576.1_g00003.1E056032006.1222.83细胞核SmERF45B4Sme2.5_10605.1_g00001.1E0524848278.7693.43细胞核SmERF46A4Sme2.5_11126.1_g00001.1E056362115.1523.77细胞核SmERF47A2Sme2.5_02766.1_g00005.1E0610023334.8636.67细胞核SmERF48B5Sme2.5_03270.1_g00005.1E0611313764.8942.06细胞核SmERF49B6Sme2.5_03707.1_g00008.1E065971989.1122.09线粒体SmERF50A4Sme2.5_09825.1_g00001.1E065401794.8219.40细胞核SmERF51A4Sme2.5_03119.1_g00002.1E067172384.6926.51细胞核SmERF52B2Sme2.5_00377.1_g00002.1E0610353444.6837.98细胞核SmERF53B5Sme2.5_00001.1_g00045.1E067442475.0427.84细胞核SmERF54B4Sme2.5_00008.1_g00028.1E067772587.8729.39细胞核SmERF55B6Sme2.5_00018.1_g00009.1E067461818.8220.70细胞核SmERF56B4Sme2.5_01189.1_g00007.1E076692227.0124.86细胞核SmERF57B1Sme2.5_10386.1_g00004.1E077772586.2128.90细胞核SmERF58A4Sme2.5_02248.1_g00002.1E074951645.3318.21叶绿体SmERF59B1Sme2.5_00165.1_g00011.1E076872289.2524.46叶绿体SmERF60A6Sme2.5_04588.1_g00001.1E0712334105.0346.69细胞核SmERF61B1Sme2.5_06218.1_g00001.1E077232407.7126.15叶绿体SmERF62A6Sme2.5_00013.1_g00022.1E0710143375.8438.01细胞核SmERF63A1Sme2.5_00250.1_g00012.1E089723235.7836.08细胞核SmERF64A1Sme2.5_00250.1_g00013.1E087202394.8527.06叶绿体SmERF65A4Sme2.5_00250.1_g00015.1E086032005.0522.25细胞核SmERF66A4Sme2.5_03078.1_g00003.1E084321439.2516.38细胞核SmERF67A6Sme2.5_00009.1_g00006.1E086602199.2324.51细胞核SmERF68B5Sme2.5_00009.1_g00032.1E0810413465.0638.22细胞核SmERF69A4Sme2.5_00860.1_g00007.1E085911966.7421.60细胞核SmERF70B5Sme2.5_02928.1_g00003.1E0810203394.6237.87细胞核SmERF71A4Sme2.5_04219.1_g00003.1E085641874.6819.87叶绿体SmERF72B3Sme2.5_06205.1_g00001.1E087172385.0726.99细胞核SmERF73B3Sme2.5_10584.1_g00003.1E089783255.6336.64细胞核SmERF74B3Sme2.5_11018.1_g00001.1E086872285.6425.58细胞核SmERF75A4Sme2.5_15558.1_g00001.1E086242079.7223.28细胞核31 暨南大学硕士学位论文SmERF76A4Sme2.5_04736.1_g00007.1E096001994.9521.80细胞核SmERF77B1Sme2.5_00248.1_g00018.1E094681559.6816.99细胞核SmERF78B3Sme2.5_00595.1_g00009.1E097232405.5026.70细胞核SmERF79B3Sme2.5_00595.1_g00011.1E094141375.9415.32细胞核SmERF80B2Sme2.5_06157.1_g00002.1E098102696.4730.38细胞核SmERF81B3Sme2.5_08027.1_g00002.1E094591528.9617.34细胞核SmERF82B3Sme2.5_08722.1_g00002.1E095851945.6022.15细胞核SmERF83B3Sme2.5_20235.1_g00001.1E094171385.6415.56细胞核SmERF84B5Sme2.5_00817.1_g00006.1E109843274.7936.37细胞核SmERF85B1Sme2.5_00128.1_g00014.1/TEE105701898.3021.27高尔基体SmERF86B1Sme2.5_03682.1_g00007.1E109543177.1934.08细胞核SmERF87A2Sme2.5_05394.1_g00005.1E101,0713564.7041.17细胞骨架SmERF88A2Sme2.5_00072.1_g00009.1E108852946.4233.43细胞核SmERF89B6Sme2.5_01443.1_g00004.1E101,2694224.6547.64细胞核SmERF90A4Sme2.5_02955.1_g00003.1E105911965.4220.61细胞核SmERF91B6Sme2.5_13587.1_g00002.1E108192728.8030.69细胞核SmERF92A4Sme2.5_00540.1_g00005.1E116482155.5023.97叶绿体SmERF93B3Sme2.5_00798.1_g00006.1E116212064.9623.33细胞核SmERF94B3Sme2.5_00984.1_g00004.1E114741575.3818.00细胞核SmERF95B3Sme2.5_00984.1_g00005.1E115521839.4120.88线粒体SmERF96B2Sme2.5_01098.1_g00004.1E1111583854.7342.37细胞核SmERF97B4Sme2.5_02371.1_g00003.1E1111673887.1743.89细胞核SmERF98A6Sme2.5_02705.1_g00003.1E1111523835.6141.88细胞核SmERF99B1Sme2.5_00276.1_g00007.1E119213065.4034.74细胞核SmERF100B3Sme2.5_03151.1_g00003.1E117652545.6729.14细胞核SmERF101A4Sme2.5_01200.1_g00005.1E127442474.3127.60细胞核SmERF102A4Sme2.5_03330.1_g00005.1E129273084.9033.72细胞核SmERF103B6Sme2.5_03438.1_g00003.1E126272088.9623.76细胞质SmERF104A2Sme2.5_03585.1_g00005.1E124021339.7415.12细胞核SmERF105A5Sme2.5_06802.1_g00002.1E125131708.9718.63细胞核SmERF106A4Sme2.5_10325.1_g00001.1E125881955.0621.78细胞质SmERF107B2Sme2.5_01459.1_g00005.1E0311493824.9342.23细胞核SmERF108A2Sme2.5_02100.1_g00003.1E038372786.3130.55细胞核3.2.2SmERF亚家族基因蛋白质系统进化发生分析本研究对番茄、杨树、拟南芥、水稻、大豆等植物进行AP2/ERF家族成员分析，旨在研究茄子ERF转录因子中各家族成员的进化关系。庞大的AP2/ERF转录因子根据其结构域及氨基酸的差异分为四个亚族，分别是：AP2、ERF、RAV以及其他亚族。其中ERF亚族成员最多，是AP2/ERF中最丰富的亚族。本研究中，对番茄、拟南芥ERF家族进行进化分析，旨在对茄子ERF亚家族进行进化分析提供基础。如图3-3所示，ERF转录因子家族被明显分为DREB/CBF和ERF两大类。图示表明：相同亚族的ERF基因在进32 暨南大学硕士学位论文化树上的距离相近。与拟南芥ERF家族成员的进化距离相比，茄子、番茄中的ERF转录因子在进化树上的位置距离更近。在DREB/CBF亚族中，番茄和茄子基因在亲缘关系上较近的有SmERF31和SlERF8、SmERF47和SlERF10、SmERF66和SlERF17、SmERF51和SlERF15、SmERF58和SlERF18、SmERF41和SlERF11、SmERF40和SlERF22、SmERF67和SlERF47、SmERF92和SlERF14、SmERF90和SlERF26。茄子基因与拟南芥基因进化距离较近的有SmERF76和AtERF42、SmERF88和AtERF51、SmERF67和AtERF40、SmERF62和AtERF61、SmERF17和AtERF23。茄子ERF基因之间进化关系较近的有SmERF89和SmERF91、SmERF98，SmERF63和SmERF64、SmERF42和SmERF33、SmERF102和SmERF75。在ERF亚族中，茄子和番茄亲缘关系较近的有SmERF4和SlERF79、SmERF72和SlERF68、SmERF79和SlERF59、SmERF95和SlERF56、SmERF96和SlERF77、SmERF2和SlERF78、SmERF56和SlERF80、SmERF49和SlERF54、SmERF24和SlERF82、SmERF13和SlERF55、SmERF53和SlERF31、SmERF8和SlERF60、SmERF100和SlERF58、SmERF73和SlERF64。茄子和拟南芥之间进化距离相近的有SmERF37和AtERF116、SmERF53和AtERF4、SmERF61和AtERF83、SmERF69和AtERF92、SmERF103和AtERF5。茄子ERF基因之间进化历程相近的有SmERF6和SmERF7、SmERF43、SmERF45和SmERF34、SmERF23和SmERF55、SmERF26和SmERF39。番茄与茄子ERF转录因子中有25对基因在进化历程上进化关系较近，拟南芥与茄子有17对基因在进化历程上进化关系较近，说明基因与物种在进化历程中的进化关系较近。茄子ERF家族基因之间的聚类说明ERF同源性较高且存在片段串联复制现象。33 暨南大学硕士学位论文图3-3茄子、拟南芥和番茄中ERF基因亚家族蛋白质系统进化分析3.2.3茄子ERF蛋白基序分析为进一步加强对茄子ERF氨基酸保守序列的认识，本研究利用Meme4.6.1软件对茄子ERF的保守基序分析，如下表3-3所示。研究结果表明，茄子ERF转录因子家族中保守基序20个，且在同一亚族的蛋白质有相同或相似的基因。其中组成AP2/ERF的结构域由基序1、2、3、4，它们出现在所有茄子ERF蛋白质序列中。已有研究根据ERF蛋白结构域中14及19号氨基酸残基的差异，将ERF转录因子划分为DREB/CBF和ERF亚家族[159]。第14、19位残基为缬氨酸，谷氨酸时为DREB/CBF亚家族；14、19位残基为丙氨酸，天冬氨酸时为ERF亚家族。本研究以拟南芥细分标准为标准将茄子ERF亚家族进行细致分化，其中ERF又分为B1、B2、B3、B4、B5、B6六个小亚族，DREB/CBF细分为A1、A2、A4、A5、A6五个小亚族。其中，拟南芥A1小亚族的保守基序为CMIII-3，而在茄子中与该基序对应的为基序7，共有ERF中8个成员。如图3-5，表3-3所示：拟南34 暨南大学硕士学位论文芥中的A2、A4和A6分别对应茄子ERF中的基序13、5和17，其基序编码为CMIV1、CMIII-1、CMI-2。根据这一特征，将茄子中的3个成员归置A5亚族中，同样的根据拟南芥分类的特征将茄子ERF分为6类（图3-4）：B1(CMVIII-1对应茄子中16号基序)、B2(CMVII-1对应茄子中20号基序)、B3(CMIX-2、CMIX4和CMIX-1对应茄子中19号、11号和9号基序)、B4(CMX-1对应茄子中15号基序)、B5(CMVI-1对应茄子中10号基序)和B6(CMV-1对应茄子中14号基序)。ERF蛋白序在不同亚族数目不同，由图表可看出，A4和B3小亚族中成员含有蛋白序列最多。图3-4茄子ERF保守基序分析35 暨南大学硕士学位论文表3-3茄子蛋白ERF基序分析基序编号E-值次数Motif14.7e-1741111RVWLGTFDTAEEAARAYDEAAMotif28.8e-910111WGKWAAEIRDPMotif31.0e-601108KRHYRGVRQRPMotif42.0e-595102FKIRGSKARLNFPHLMotif54.5e-11324LPRPVTLSPRDIQAAAAKAAMotif68.7e-1009EDHEYIDEEALFDMPNLLVDMAEGMMVSPPRMNSPPSDDMotif76.8e-0703QYGYESGSSASADTGLGSFIPSAGGDINFSSDVGSNSFERSDFGWGEPCSRTPEISSVLSAAVESNEAQFVEDTNLQEKLKSCTNNPVANDGNTVNVLSEDLSAFEPQMNFFQLPYIEGNWDASLDSFLNTSATQNGENAMDLWSFDDVPSLMGGVFMotif81.1e-06413QVLEFEYLDDKLLEELLDCMotif95.6e-0448KSSEYNPTIPRTVRISVTDPDATDSSSDEMotif106.3e-0448NPKKPAGRKKFRETRMotif111.8e-0372EQNCKINNEMMNRSPSQSSTVESSSRDGLSPAVMVDSSSPLDLSIAAAGGFNHSTVGFKLQNNNPFRSSQISAGRFAGAAPAVNHMYYLEALARAGMINLEKKTVDFLGGGVQMotif123.7e-0326VVESLHEMKFHVEEGCSPIVSLKKRHSMRMotif137.8e-03112YQHHHQQQQQQMotif146.0e-02810PLPFDLNFPPPMDDMotif158.9e-0283ILHAKLRKCSKVPSPSLTCLRLDIENSHIGVWQKRAGPSSDSKWVMTVELQKKMotif162.1e-0255YKPLHSSVDAKLQAICDDLAQGKSIDTKKKMotif172.0e-0248MYTGYTQSRDMSAMVTALTHVVSGMotif183.2e-0246RKAPAKGSKKGCMKGKGGPENMotif197.7e-0166LPFNVNDSEEMLLFGVLANAMotif208.6e-0135MCGGAIISDLVPP36 暨南大学硕士学位论文图3-5ERF保守基序结构域分析注：拟南芥中相对应A2（保守基序CMIV1）、A4（CMIII-1）和A6（CMI-2）分别对应茄子的基序13、5和17，茄子中B1（CMVIII-1对应茄子基序16）、B2（CMVII-1对应茄子基序20）、B3（CMIX-2、CMIX4和CMIX-1对应茄子基序19、11和9）、B4（CMX-1对应茄子基序15）、B5（CMVI-1对应茄子基序10）和B6（CMV-1对应茄子基序14）37 暨南大学硕士学位论文3.3茄子ERF转录因子家族基因的表达分析3.3.1茄子ERF组织表达分析图3-6茄子ERF组织表达分析本研究中选取38个茄子ERF亚族成员，包括根、茎、叶、花、果等5个组织器官进行表达分析（图3-6）。研究结果显示：不同的ERF基因在茄子不同的组织发育阶段有着不同的表达。38 暨南大学硕士学位论文17个SmERF基因在根中表达量高，这些基因包括SmERF8、SmERF17、SmERF18、SmERF26、SmERF32、SmERF38、SmERF39、SmERF47、SmERF53、SmERF55、SmERF59、SmERF61、SmERF78、SmERF80、SmERF86、SmERF94、SmERF101。在茎中有14个基因表达量高，包括：SmERF16、SmERF19、SmERF21、SmERF26、SmERF30、SmERF36、SmERF39、SmERF47、SmERF56、SmERF59、SmERF80、SmERF86、SmERF94、SmERF101。在叶中13个基因高效表达：SmERF9、SmERF21、SmERF24、SmERF51、SmERF62、SmERF66、SmERF75、SmERF78、SmERF85、SmERF91、SmERF93、SmERF100、SmERF104。在花中表达量高的基因较多，有19个：SmERF9、SmERF21、SmERF24、SmERF27、SmERF30、SmERF32、SmERF51、SmERF55、SmERF56、SmERF57、SmERF61、SmERF62、SmERF66、SmERF75、SmERF85、SmERF91、SmERF93、SmERF97和SmERF104。果实中表达量高的基因较少有8个：SmERF2、SmERF5、SmERF8、SmERF16、SmERF17、SmERF18、SmERF56和SmERF80。这些基因的在不同器官中的大量表达可能对不同器官在生长发育过程中具有重要作用。3.3.2.茄子ERF转录因子在氧化胁迫处理条件下的分析表达本研究利用Q-PCR技术对茄子高温、低温、盐、镉胁迫处理的样品进行表达分析，旨在检测茄子ERF转录因子胁迫下的表达分析(图3-7)。研究结果表明：高温、低温的表达呈现出互补的趋势，即SmERF在高温时上调表达，在低温时大多呈现下调趋势；SmERF高温下调时，在低温时大多呈现上调趋势。此类SmERF数量有22个，如SmERF8、SmERF9、SmERF19、SmERF21、SmERF26、SmERF32、SmERF38、SmERF39、SmERF53、SmERF55、SmERF59、SmERF61、SmERF62、SmERF75、SmERF78、SmERF80、SmERF85、SmERF86、SmERF91、SmERF94、SmERF100、SmERF101等。在一定时间里也有一些基因在低温条件下出现持续上调或持续下调的基因如SmERF16、SmERF18、SmERF55、SmERF56、SmERF80、SmERF97、SmERF101、SmERF2。在高温条件下也会出现持续的上调或下调如SmERF16、SmERF18、SmERF26、SmERF30、SmERF56、SmERF75、SmERF100、SmERF101、SmERF2。39 暨南大学硕士学位论文图3-7SmERF氧化胁迫表达分析在一定范围内，盐处理及镉处理呈现相似的表达趋势。盐处理条件下持续上调的基因有SmERF8、SmERF9、SmERF26、SmERF27、SmERF59、SmERF66、SmERF75、SmERF80、SmERF86、SmERF100、SmERF101；持续下调基因包括SmERF2、SmERF39、SmERF53、SmERF57、SmERF61。镉处理条件下先上调后下调的基因有SmERF9、SmERF30、SmERF59、SmERF61、SmERF85、SmERF86、SmERF100；持续下调的基因包括SmERF2、SmERF39、SmERF55、SmERF57。3.3.3.SmERF转录因子在激素处理条件下的表达分析40 暨南大学硕士学位论文图3-8SmERF激素条件下的表达分析本文应用Q-PCR技术对激素胁迫处理下茄子ERF转录因子展开表达分析。研究表明：在一定的时间范围内，ABA、SA两种激素的表达呈现出高度的一致性（图3-8）。有些基因呈现出先上调后下调的趋势，如SmERF8、SmERF16、SmERF18、SmERF19、SmERF21、SmERF32、SmERF56、SmERF59、SmERF62、SmERF66、SmERF80、SmERF97；有些呈现先下调后上调的趋势如SmERF5、SmERF9、SmERF38、SmERF55、SmERF57、SmERF61、SmERF75、SmERF78、SmERF85。但也有少量的基因在一定时间内的变化完全相反如SmERF26、SmERF27、SmERF30、SmERF91、SmERF100具体表现为于ABA处理中先上调后下调，在SA处理中先下调后上调趋势。3.3.4.青枯菌处理条件下SmERF的表达分析41 暨南大学硕士学位论文为进一步探明ERF转录因子与茄子青枯病间的联系，本研究选用茄子抗病自交系06112和感病自交系05119进行接种青枯菌处理研究。本研究中所用青枯菌为混合青枯菌。如图3-9所示，在接种青枯菌24h的时间内，抗病品种与感病品种表现出明显差异性。抗病品种表现正常，感病品种出现严重萎蔫症状。图3-9青枯菌处理条件下抗病品种与感病品种的表型注：本研究中感染青枯菌采用伤根法，即用刀片刮伤植株根系并浇注青枯菌。处理用青枯菌浓度为108cfu/mL。为进一步探究青枯菌对抗感品种的具体表达量，在上述研究的基础上采用Q-PCR技术对抗感品种开展表达分析，如图3-10所示。本文分别对感病、抗病茄子中的50个SmERF基因进行青枯菌的表达分析。在一定的时间内、感病与抗病表达呈现出不同的表达量。研究结果表明：一定时间内，18个SmERF基因在抗病条件下比感病的表达性高，如SmERF8、SmERF9、SmERF15、SmERF16、SmERF27、SmERF38、SmERF42、SmERF43、SmERF44、SmERF47、SmERF52、SmERF55、SmERF56、SmERF58、SmERF77、SmERF79、SmERF85、SmERF104。其中SmERF5、SmERF9、SmERF46、SmERF48、SmERF52、SmERF57、SmERF77基因在抗感自交系中有明显的上调和下调趋势。42 暨南大学硕士学位论文图3-10青枯菌条件下SmERF表达分析3.4茄子病毒诱导基因沉默体系的建立本研究采用VIGS技术，对基因功能开展进一步研究。本研究中以八氢番茄红素脱氧酶基因即PDS作为构建沉默体系的报告基因。PDS基因是合成胡萝卜素过程的必须基因，可保护叶绿素减少光漂白。PDS作为VIGS体系的参照基因是由于PDS基因在表型上易于分辨。PDS载体的构建过程如图3-11所示。PDS载体与TRV1载体以1:1的比例混合、于叶面背部注射植株，15-20天后观察叶片表型。茄子叶片明显出现白色斑点，这说明含43 暨南大学硕士学位论文PDS载体的农杆菌感染植株，导致PDS基因沉默表达，使叶绿体光漂白现象产生（图3-12）。图3-11茄子PDS表达载体的构建注：本研究中载体构建流程：RNA提取、基因扩增、转化大肠杆菌DH5α、单菌落阳性克隆、双酶切回收、转化农杆菌、单菌落阳性克隆以及双酶切鉴定。图3-11显示RNA提取、基因扩增及双酶切鉴定过程。图3-12PDS基因在茄子中的沉默表达载体构建注：左图为对照组，右图为实验组。3.5基于VIGS的茄子ERF基因功能研究为更深层次的明确茄子ERF转录因子的功能，本研究在抗感自交系接种青枯菌处理的基础上挑选8个均在感病中上调、抗病中下调且在茄子各组织中的表达量较高的SmERF基因。如SmERF34、SmERF39、SmERF60、SmERF62、SmERF77、SmERF80、SmERF88和SmERF100共8个基因如图3-11所示构建ERF-VIGS载体。44 暨南大学硕士学位论文图3-128个SmERF表达载体的构建注：本图为扩增PCR和双酶切鉴定，Marker最亮条带为750bp首先利用构建好的VIGS体系将ERF-VIGS载体和PDS-VIGS载体同时导入茄子幼苗。当含有PDS载体的幼苗出现表型时，对ERF-VIGS载体苗取样并提取叶片RNA、反转录为cDNA。在此基础上利用RT-PCR（图3-13）对茄子ERF基因沉默表达进行验证。图3-138个SmERF基因的沉默性表达由图中可知，茄子植株接种沉默表达载体后，SmERF60、SmERF88与未接种植株相比呈现出表达下调趋势，这表明茄子ERF基因成功在茄子植株中沉默；而SmERF34、SmERF39、SmERF62、SmERF77、SmERF80、SmERF100的相对上调则表明ERF基因未在植株中沉默。45 暨南大学硕士学位论文图3-14ERF转录因子沉默植株接种青枯菌后表型注：左图为感病自交系，右图为抗病自交系对ERF转录因子沉默植株接种青枯菌表达如图3-14所示。感病自交系中，其他未沉默植株已经表现出绿色萎焉的情况下，沉默SmERF66的植株仍保持正常生长状态；抗病自交系中，其他沉默植株正常沉默SmERF88基因的植株出现绿色萎焉。这表明，茄子SmERF66,88基因与茄子的抗病性有关。46 暨南大学硕士学位论文4.讨论茄子原产于亚洲热带地区，是重要的经济作物之一，在我国各地区均有种植，其栽培面积及产量具世界首位。茄科雷尔式菌是造成茄子减产的重要原因之一。目前高抗品种的选育是抵抗青枯病的最有效方法。AP2/ERF蛋白是广泛分布于植物界的一类转录因子，与植物体的生长发育息息相关，在生物及非生物胁迫中发挥重要作用[67]。4.1青枯菌的分离鉴定传统青枯菌的鉴定方法主要是Kelmans[13]用于分离青枯菌的四唑培养基法。青枯菌在该培养基上呈现流动、平滑、带白色晕图的红色菌落。其中红色的菌落表示致病力较弱，白色的菌落致病力较强。传统组织分离方法缺点是灵敏度低，检验周期长。优点在于可以很直观的看出致病力的大小。近年来，分子生物学的发展为分子标记鉴定青枯菌提供可能。目前分子标记的主要方法包括：扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)、简单重复序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)、序列标志位点(SequenceTaggedSites，STS)、随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)等。佘小漫对以分子标记的方式对广东藿香青枯菌进行鉴定，表明广东藿香青枯病为茄科雷尔氏菌演化Ⅰ型。本研究中运用ISSR分子标记技术对34种青枯菌菌株分离鉴定。从40条ISSR引物中挑选出14条稳定表达且呈多样性条带引物。对14条引物扩增结果进行聚类分析，得出147个条带，这些结果表明不同青枯菌菌株之间具有很高的相似性。在遗传相似性系数为0.58的情况下，可将34种青枯菌分为5类，其中39和40可归为一类。这为以后进行的青枯菌的深入研究提供了基础。4.2茄子ERF转录因子家族生物信息学分析随着基因工程技术的蓬勃发展，茄果类植物中茄子、辣椒、番茄等基因组测序已完成[153]。目前，从基因的角度开展基因家族的生物信息学分析、进化历程研究、功能验证是当前研究的热点[154-157]。国内外学者已对拟南芥、番茄等模式植物中AP2/ERF家族开展了分类及功能研究。研究表明AP2/ERF转录因子参与植物生长发育、生物及非生物胁迫等[158]。已有研究表明：水稻中含有157个AP2/ERF成员、其中ERF家族139个[62]；拟南芥中含有147个AP2/ERF成员、其中ERF家族122个；大豆含148个AP2/ERF成员、其中ERF有120个[97]；番茄含AP2/ERF168个、辣椒有123个AP2/ERF转录因子[165]。马铃薯中AP2/ERF47 暨南大学硕士学位论文有155个[92]。本研究根据拟南芥、番茄AP2/ERF转录因子检索得出、茄子AP2/ERF家族含有130个成员，其中小亚族AP220个、RAV2个、ERF108个。与番茄、拟南芥的共同进化关系表明：茄子ERF与番茄在进化关系上较近，有25个基因与番茄相近；与较远的拟南芥只有17个基因相近。本研究中参考拟南芥122个ERF分化小亚族的特定保守序列[74]，MEME的在线分析得出茄子有20个保守基序。根据其结构域的不同，主要是第14,19位氨基酸残基的差异，将ERF划分为DREB/CBF和ERF亚家族；进而根据保守序列将其更加细化为A1、A2、A3、A4、A5、A6及B1、B3、B4、B5、B6；其中A3中有且仅有一个成员即AtERF52与SmERF108。结合前人研究番茄、水稻、拟南芥、大豆、烟草、苹果等证明：ERF家族具有高度的保守性[56]。大多数ERF成员经亚细胞预测定位于细胞核内、少数存在于线粒体中，这与前人研究的亚细胞定位结果基本一致。4.3茄子ERF转录因子家族组织表达分析本文通过对茄子根、茎、叶、花及成熟果实中的表达分析表明：SmERFs基因在各个组织中均有表达，在不同组织中基因表达有差异性。其中在花，茎及成熟果实中的相对表达量较高：SmERF2在成熟果实中的相对表达量是其他组织表达的5倍；SmERF19、SmERF38在茎中的表达量是其他组织表达量的3-4倍；SmERF55在花中的表达量远远高于根、茎、叶的表达。SmERF2在果实中有极高表达量，在叶和花中表达量极低。SmERF16，SmERF38在茎中有较高表达量，但在叶中表达量较低。SmERF62在花中的表达量较高，但在根、茎、成熟果实中的表达量极低。SmERF95在根、茎、叶、花、成熟果实中的相对表达量逐次递减。SmERF8和SmERF17在各个组织中的相对表达量都处于一种平衡状态。这些表达量的相对差异性的的不同可能与ERF参与植物开花、果实发育等方面相关[57]。4.4ERF转录因子参与非生物胁迫ERF转录因子（SmERFs）是一个庞大的基因家族，广泛存在于植物界中，在应对生物及非生物胁迫、调控相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性过程中发挥重要的作用。植物受到外界环境胁迫作用下，植物本身往往会诱导自身防御相关基因的表达来实现自身保护。冷胁迫条件下辣椒基因CaERFBP-C1、-C2、-C3强烈诱导表达应对低温胁迫防御[159]。在高温、低温条件下番茄SlERF5基因[210]与玉米ZmDREB1B基因[161]的过48 暨南大学硕士学位论文表达研究表明一个基因可同时应对高温、低温、高盐胁迫表达。本研究高温低温对茄子ERF进行氧化胁迫表明：大多数基因呈现出胁迫诱导现象。高温低温的响应表达出现互补效应，这与前人报道一致[55,57,58]。有22个SmERF基因均出现了互补效应，在低温时上调、高温时下调或在低温时下调、高温时上调。但也有一些基因表现出持续的上下调现象：8个SmERF基因在低温时呈现出持续的上下调现象，9个SmERF基因在高温时期呈现出持续的上下调现象。盐碱性环境易对植物造成伤害，植物在盐碱环境下的自身防御通过响应抗盐碱胁迫基因来应对表达。与野生型拟南芥相比，导入GmERF7基因的转基因拟南芥和烟草具有更强的抗盐能力[162]；含有GmERF3的转基因烟草明显提高了植株的抗盐性[163]。盐、镉的胁迫表明：植物在遭受盐碱胁迫时，ERF转录因子呈现上调趋势。表明茄子ERF基因与茄子的耐逆性有关。以上研究表明SmERF在茄子表达过程中呈现出一定的规律性及复杂性。植物激素属于小分子信号物质，在调控植物的生长发育过程中占重要地位。SA（水杨酸）是广泛存在于植物体的一种天然酚类物质，主要抑制植物体的乙烯合成并延迟果实的成熟。ABA（脱落酸）在植物体中可抑制植物生长，延长细胞生长。两种激素在植物生长发育过程中表现出相似性。辣椒CaJERF1基因在多种植物激素如ABA、SA等影响下参与多信号途径，应答逆性环境。烟草NtCDI1基因在SA，ABA胁迫下，基因表达量增加[164]。在本研究中，激素ABA和SA胁迫作用下，茄子ERF的胁迫表达表现出一致性；且在植物的应答反应中表现为应答上调。研究结果为以后进一步研究ERF转录因子的基因功能及机制提供了有力的理论依据。4.5ERF转录因子参与青枯病的分子机制青枯菌对茄子的危害巨大，感染青枯病之后的茄子植株在经济效益上造成巨大的经济损失。本研究对抗病、感病植株对比表达，青枯菌处理下的SmERF基因表达多样性。对不同的感病、抗病植株呈现不同表达量。本研究中有25对抗感植株呈现出这种结果，即SmERF基因在抗病自交系中上调在感病自交系中下调。分析其原因并推测SmERF基因在茄子抗青枯病的表达过程中占有一定的地位。根据这一结果本文构建了8个基于茄子ERF基因诱导沉默表达载体并致使基因在植株中出现沉默。由于沉默表达体系的不稳定表达，本文仅选取抗感自交系中SmERF60，SmERF88沉默表达的植株接种青枯菌处理。结果表明，SmERF60,SmERF88基因与茄子抗青枯病相关。本研究的研究结果为茄子抗病性研究提供数据支持。49 暨南大学硕士学位论文5结论与展望植物青枯病是植物中的严重病害，在分子水平上对ERF转录因子参与抗病功能的研究是重要的研究手段。本文通过对两者交叉处的结合，对ERF转录因子参与茄子抗青枯病的机制进行研究。目前初步探明了SmERF参与青枯病抗性的机制。但ERF家族成员中的抗性机制还有待进一步的研究。1..对青枯菌菌株进行ISSR分子标记及遗传多样性表明：34种青枯菌菌株可分为5类。2.首次发现茄子AP2/ERF家族含130个成员，分为3个亚家族和11个小亚族3.组织表达分析表明ERF存在组织表达差异。SmERF基因受高温、低温、盐、重金属镉、SA和ABA胁迫处理诱导表达。有24个基因参与抗青枯病作用。4.建立了VIGS沉默体系，沉默ERF基因后表达分析发现SmERF60,SmERF88参与茄子抗青枯病过程。50 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暨南大学硕士学位论文附录Ⅰ引物名称引物序列片段大小SmPDS-FGAATTCGTAGTGCATCTATGGGTCAT450SmPDS-RGGATCCATGTTCCTTCCACTGCAACCSmERF34-V-FGAATTCTGTTCCACTTCAACAGAGACC426SmERF34-V-RGGATCCAGCAAAGTCACCTCGAAGSmERF39-V-FGAATTCAAGCGATACAGAGGAGTGA417SmERF39-V-RGGATCCTGACAAAGGTGGCACTTCASmERF60-V-FGAATTCAAGAAAAGTCGGGTCTGGT465SmERF60-V-RGGATCCCACACTAGAAACAACTCCGGSmERF62-V-FGAATTCAGGGTTTGGTTGGGTACTTTT401SmERF62-V-RGGATCCACCGTCATCAACAACAGAAGSmERF77-V-FGAATTCACCTTAGCACCATCAAAACA444SmERF77-V-RGGATCCTTTCAGCTCCAACCAAATCCSmERF80-V-FGAATTCGTTAGTTCCCAATCCGAGGTT450SmERF80-V-RGGATCCTTGCTCCAAATAATCAGCCCSmERF88-V-FGAATTCCCCAAAGCCAAGACAAATT456SmERF88-V-RGGATCCGACATGGTCGGTTAACTCACSmERF100-V-FGAATTCAGCAGTAACAGTATCAACAGT408SmERF100-V-RGGATCCAGGATATGTGTAAGTGGGTGC附录Ⅱ氧化胁迫、组织胁迫Q-PCR引物引物名称引物序列片段大小SmERF1-Q-FCCTTAACTTCCCCGACTCCG113SmERF1-Q-RGGCGGGGAGGACACAATTAASmERF2-Q-FGGCAGGAGTGTGAAGGTTGA145SmERF2-Q-RAATGTACCCAGCCAGACACGSmERF5-Q-FTTCGTGGTGTTAGGCAGAGG108SmERF5-Q-RCAGCTTCTTCCGCAGTCTCASmERF8-Q-FCGTCCGTCACAGTCCATAGG111SmERF8-Q-RCTAGCCATACTCTCGCACCGSmERF9-Q-FTAGAGGGGTAAGGAGGAGGC81SmERF9-Q-RAGCCAAACCCTAGCTCCTTTSmERF16-Q-FCAGGGGAGTCAGGAAGAGGA126SmERF16-Q-RTGCCACGTCATGAGCTCTAGSmERF17-Q-FACAGGGGAGTCAGGAAGAGA11464 暨南大学硕士学位论文SmERF17-Q-RCTCTAGCCGCCATTTCTGCTSmERF18-Q-FTACCTTCTTCGTGGATGCGG84SmERF18-Q-RGGTGGAGGTAGCATGAGTCCSmERF19-Q-FAATTTGGCTCGGCACATTCC137SmERF19-Q-RCAGTGGATGCAGGTCTAGGCSmERF21-Q-FGTCCCGTAACCTCGCTTCTC135SmERF21-Q-RTGGTCGCACTCCATGGATTCSmERF22-Q-FGAGGTGGTCAGCGGAGATTC131SmERF22-Q-RTTCGTGCCTTTGACCCTCTCSmERF24-Q-FGGGTCTGGGAAGGGTAGGAT79SmERF24-Q-RCTTGCACCAGTACCAGCAGASmERF26-Q-FTATGACAGGGCGGCGTTTAA122SmERF26-Q-RACCCTTTTGCTGCCTGATGASmERF27-Q-FTGATAGGGGAAGACAGGGCA126SmERF27-Q-RCGTTGGTTTGGCTTCGGTTTSmERF31-Q-FGCTCGTACTCTTCGTGGACC124SmERF31-Q-RGTGCGTACAATCTCGGGTCASmERF33-Q-FGGGGTAAATGGGTGGCTGAA82SmERF33-Q-RGCAGCAACAGGGGAAGAGTASmERF39-Q-FCAGCAGAGATTCGTGACCCA97SmERF39-Q-RTGCTGCTCTGTCATAAGCCASmERF40-Q-FCAGAGGGGTGAGGAAAAGGC132SmERF40-Q-RCGCGGCACAATCATAAGCTCSmERF41-Q-FCGTCCAGCTTCCACTTCTCA86SmERF41-Q-RTCGATCTTCCTCCTCCTCGGSmERF48-Q-FCACCGTTGCTTCCAGTTTCG94SmERF48-Q-RTGAACTCAACCGCGTACCAASmERF49-Q-FTGAAGGGTAAGGAAGCGGTG111SmERF49-Q-RGCGCTGGGTCTCTGATTTCASmERF52-Q-FCGGTTGAGGAAGTGGGGAAA85SmERF52-Q-RGCAGAATCGTAGGAGCCCAASmERF54-Q-FGATGATTTCGCGCCGTTTGA133SmERF54-Q-RCGTCAAAGTCAAACTCGCCGSmERF56-Q-FCGACATTGGGGATCTTGGGTT135SmERF56-Q-RTCTTGGTCCACACATGAGCCSmERF57-Q-FAGCAGAACCAGAGCCTTGTC9065 暨南大学硕士学位论文SmERF57-Q-RTCTTCAGCAACAGTAGCAGCTSmERF58-Q-FGAATCGTCTAGTGGGCCTCG126SmERF58-Q-RATCATCCACCACAGACGACGSmERF60-Q-FGGTACTTTCGACACAGCGGA101SmERF60-Q-RCTCCGACGGAAAGGGGAAATSmERF62-Q-FCCGTGGAGTCCGAAAGAGAC111SmERF62-Q-RACGAGCAGCATCTTCAGCAGSmERF63-Q-FGCCAGTGAAGTAGCTGTCGT133SmERF63-Q-RGTTGGAGCCTCAGTGATGTGASmERF66-Q-FTGCCTATGATGTTGCTGCCTT94SmERF66-Q-RGGGAGGGAGCTTTGGATAGGSmERF67-Q-FTACGTCAACCCAAAAGCCGT147SmERF67-Q-RCGGGGAATCAGTGGTGGATCSmERF68-Q-FACTTCGAAAACTGCCCCTTT101SmERF68-Q-RCCCCAATGCCTCTGTCTCACSmERF77-Q-FTGGGATTTGGTTGGAGCTGA104SmERF77-Q-RTTCGAGTACAGTTCCGTGGCSmERF80-Q-FCCAACGCAGCTCAAGAAACA98SmERF80-Q-RCCCGATTTCTCCGACAACCTSmERF82-Q-FCCAAGCACAAACGAGCACAA131SmERF82-Q-RGTCACGAATTTCAGCTGCCCSmERF87-Q-FGCTGCAAGGTCCTTTCATGG148SmERF87-Q-RGACGCACCCCACTAGATGATSmERF88-Q-FATGGTGGCGGTTATGGGTTT116SmERF88-Q-RCGGCGGGTGAACAATGTTTTSmERF93-Q-FTGTAAGGCAAAGGTCGTCGG139SmERF93-Q-RCACGAAGGAGACAAGCAGCTSmERF94-Q-FCCCTCTGCTGCTCCAAATCT133SmERF94-Q-RTGATCATTTCCAGCGCCTTGSmERF95-Q-FGGGAAATACGCGGCAGAAAT133SmERF95-Q-RCCGCCATTGTCCCATGCAASmERF96-Q-FTCTCGGTGGATAAAGTGCGC84SmERF96-Q-RCTGCAACAGGAGACAACAACASmERF99-Q-FAGGGGACATCATTCGAGGGA106SmERF99-Q-RGCTGCACCCCTGGATCATTSmERF101-Q-FCCACCACCAGCAACAACAAC13466 暨南大学硕士学位论文SmERF101-Q-RCCACCACTACTATCGCCACCSmERF103-Q-FTGGAGTTCGAGTTTGGTTAGGA98SmERF103-Q-RGAAGTGCCAATGGACCTCTCASmERF104-Q-FGGTTTCCGTTTCCGTTTCCG85SmERF104-Q-RACGACTCTCCCCGGTACATASmERF107-Q-FAGAAATCTCCTGCCGATGGG103SmERF107-Q-RGCCCCAGGTCTTTTGCCTAA附录Ⅲ青枯菌Q-PCR补充引物引物名称引物序列片段大小SmERF1-Q-FCCTTAACTTCCCCGACTCCG113SmERF1-Q-RGGCGGGGAGGACACAATTAASmERF5-Q-FTTCGTGGTGTTAGGCAGAGG108SmERF5-Q-RCAGCTTCTTCCGCAGTCTCASmERF21-Q-FGTCCCGTAACCTCGCTTCTC135SmERF21-Q-RTGGTCGCACTCCATGGATTCSmERF24-Q-FGGGTCTGGGAAGGGTAGGAT79SmERF24-Q-RCTTGCACCAGTACCAGCAGASmERF27-Q-FTGATAGGGGAAGACAGGGCA126SmERF27-Q-RCGTTGGTTTGGCTTCGGTTTSmERF41-Q-FCGTCCAGCTTCCACTTCTCA86SmERF41-Q-RTCGATCTTCCTCCTCCTCGGSmERF49-Q-FTGAAGGGTAAGGAAGCGGTG111SmERF49-Q-RGCGCTGGGTCTCTGATTTCASmERF66-Q-FTGCCTATGATGTTGCTGCCTT94SmERF66-Q-RGGGAGGGAGCTTTGGATAGGSmERF68-Q-FACTTCGAAAACTGCCCCTTT101SmERF68-Q-RCCCCAATGCCTCTGTCTCACSmERF77-Q-FTGGGATTTGGTTGGAGCTGA104SmERF77-Q-RTTCGAGTACAGTTCCGTGGCSmERF80-Q-FCCAACGCAGCTCAAGAAACA98SmERF80-Q-RCCCGATTTCTCCGACAACCTSmERF87-Q-FGCTGCAAGGTCCTTTCATGG148SmERF87-Q-RGACGCACCCCACTAGATGATSmERF94-Q-FCCCTCTGCTGCTCCAAATCT133SmERF94-Q-RTGATCATTTCCAGCGCCTTG67 暨南大学硕士学位论文SmERF95-Q-FGGGAAATACGCGGCAGAAAT133SmERF95-Q-RCCGCCATTGTCCCATGCAASmERF101-Q-FCCACCACCAGCAACAACAAC134SmERF101-Q-RCCACCACTACTATCGCCACCSmERF103-Q-FTGGAGTTCGAGTTTGGTTAGGA98SmERF103-Q-RGAAGTGCCAATGGACCTCTCA附录ⅣSSR引物序列引物编号引物序列807AGAGAGAGAGAGAGAGT808AGAGAGAGAGAGAGAGC809AGAGAGAGAGAGAGAGG810GAGAGAGAGAGAGAGAT811GAGAGAGAGAGAGAGAC812GAGAGAGAGAGAGAGAA825ACACACACACACACACT826ACACACACACACACACC873GACAGACAGACAGACA876GATAGATAGACAGACA879CTTCACTTCACTTCA892TAGATCTGATATCTGAATTCCC895AGAGTTGGTAGCTCTTGATC900ACTTCCCCACAGGTTAACACA68 暨南大学硕士学位论文在读期间的学术成果及课题基金资助已发表的学术论文[1]邵欣欣,李涛,李植良,宇丽,黎振兴,徐小万.茄子AP2/ERF转录因子的鉴定及胁迫条件下的表达分析[J].植物生理学报,2015,11:1901-1918.[2]TaoLi,Xin-xinShao,Zhi-liangLi,Xiao-wanXu,YingLi,Zhen-xingLi.Genome-wideIdentification,PhylogeneticandExpressionAnalysisofABC1KGeneFamilyinTomato(SolanumlycopersicumL.)[J]InternationalJournalBioautomotin.2015,19(3):287-302.[3]HuX,ZhangJ,ShaoX,ErmeiLuo,LiYu.DAPTinhibitsthechondrogenesisofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells[J].OpenLifeSciences,2015,10(1).论文课题基金资助本论文课题研究由国家自然科学基金（31301776）、广东省对外科技合作项目（2013B050800012）、广东省省级科技计划项目（2014A020208041；2014A020208044；2012A020100006）、广东省科技计划项目（2015B020202004）、广州市科技和信息化局项目（2014J4100094）和广东省农科院院长基金项目（201303）69 暨南大学硕士学位论文致谢历经3年的时间论文终于接近尾声了，顿时百感交加，三年的研究生生涯也即将敲响尾声，在此论文完成之际，感谢所有一路支持我，关心我的所有人。感谢宇丽教授三年来对我的关心和爱护，使我不仅在科研上而且在为人处事上都学到了宝贵的人生财富。是老师的言传身教及谆谆教诲让我受益颇多，在这次说声感谢。三年的学习生涯中，特别感谢广东省农业科学院蔬菜研究所的李涛博士，从开始的实验选题都最后的论文撰写都有您的参与；感谢在三年研究生期间对我的敦敦教诲，感谢您的科研热情和工作态度让我受益匪浅。感谢广东省农业科学院蔬菜研究所、广东省蔬菜新技术重点实验室的所有老师，谢谢你们给我提供了这么一个优越的平台让我全心全意的进行科研工作。感谢我张家文师兄，胡笑柯师姐在我迷茫时对我的各种开导帮助；感谢713实验室对我的照顾和关怀；感谢农科院蔬菜所的各位同门对我的实验帮助。最要感谢的是我的爸爸妈妈和妹妹，感谢你们一直给与我的爱和鼓励。本实验在广东省农业科学院蔬菜所完成，该所茄果室和广东省蔬菜新技术重点实验室为本研究提供了良好的试验条件和经费支持。在此一并致谢。70
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