侵染烟草、萝卜的芜菁花叶病毒CP基因序列差异及烟蚜传毒能力研究

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^~单位代码■学号甚漆、專硕士学位论文侵染烟草、萝卜的芜菁花叶病毒基因序列差异及烟蚜传毒能力研究论文作者：李夏莲指导教师：刘映红研究员学科专业：生物安全研究方向：生物安全提交论文日期：年月日论文答辩日期：年月日学位授予单位：西南大学中国重庆年月 MasterDissertationStudyonthedifferencesofgenestructureofTuMVCPinfectedtotobaccoandradishandthevirusspreadingabilityofMyzuspersicaeMastercandidate:LiXialianSupervisor:Prof.LiuYing-hongMajor:BiosafetyField:BiosafetySouthwestUniversity,Chongqing,ChinaMay2012 独创性声明学位论文题目：侵染烟草、萝卜的芜菁花叶病毒基因序列差异及烟蚜传毒能力研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。签字曰期：年月曰学位论文作者学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院(筹)可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文：口不保密,口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：导师签名：签字曰期：年《月日签字日期：二年月曰 目录第一章文献综述的研究进展的生物学特性基因组结构和功能的基因研究进展的检测鉴定技术烟蚜的研究进展烟蚜的生物学、生态学特性对烟株的危害烟蚜传播非持久性病毒的蚜传机理弓第二章武隆地区烟草花叶病和介体蚜虫发生情况田间调查材料与方法试验材料试验地点试验设计试验方法数据处理结果与分析蚜虫田间种群数量消长动态有翅蚜发生与烟草花叶病的关系樣第三章烟草花叶病毒病样品的病原种类检测材料及方法供试材料试验方法结果与分析病原种类烟草流行分析第四章侵染烟草和萝卜的基因序列分析材料与方法试验材料试验方法结果分析结果产物的克隆及重组子鉴定序列测定与分析第五章烟蚜不同实验种群传播烟草的能力材料与方法试验材料 西南大学硕士学位论文雄试验方法结果与分析取食不同寄主的烟蚜传毐效率测定不同虫口密度下烟蚜传效率测定结论与讨论讀攻读硕士学位期间发表的文章 摘要侵染烟草、萝卜的芜菁花叶病毒基因序列差异及烟蚜传毒能力研究研究生：李夏莲指导教师：刘映红研究员摘要烟草是我国重要的经济作物。在烟草生产中烟草花叶病发生普遍,对烟叶产量和烤烟质量造成巨大损失,严重制约烟区烟叶生产。烟草花叶病可由烟草花叶病毒(马铃薯病毒(,、黄瓜花叶病毒(以及近年来新发现的芜菁花叶病毒(侵染引起。田间主要由烟蚜(进行非持久性传播。目前,在烟田发生已呈现出逐年扩散的趋势。田间症状表现更加复杂并已造成严重危害,已成为烟草作物上的一种新的病毒病害。主要侵染十字花科作物,田间侵染烟草的是否发生变异,介体蚜虫传毒能力有何变化,目前尚无研究和报道。本论文以侵染烟草的芜菁花叶病毒和介体烟蚜为对象,应用媒介昆虫学及分子生物学的相关技术手段,比较研究了重庆地区烟草花叶病病原种类、烟田有翅蚜发生动态与烟草花叶病发生的关系、影响蚜虫传毒能力的佼染烟草和萝卜的外壳蛋白基因序列差异,烟蚜不同实验种群传播烟草的能力,为蚜传非持久性病毒传毒机制研究以及烟草的综合治理提供依据。本论文主要研究结果如下：武隆烟区有翅蚜发生动态与烟草花叶病发生的关系通过对武隆烟区烟田黄板诱蚜及鉴定发现,诱集的有翅蚜主要有种,即烟蚜、萝卜蚜、大豆蚜,棉蚜。其中烟蚜数量最多,所占比例最大。但仅有烟蚜能够在烟株上定殖。田间烟草花叶病的发生与有翅蚜的迁入动态紧密相关。年武隆烟区烟草花叶病在月上旬始发,到月中下旬盛发,至月底月初烟草花叶病的发生趋于平稳。而有翅蚜迁入烟田的高峰期为月中旬,加上烟草花叶病的潜育期,结果表明烟草花叶病的发生和有翅蚜迁入数量的增加在时间上相吻合。烟草花叶病病原的检测鉴定从武隆烟区采集的多个烟草花叶病样品中随机选取个待测样品进行间接检测。结果表明,个检测样品均感染了、种病毒复 西南大学硕士学位论文合侵染,但各病毒含量有显著的差异。其中含最高,次之,最低。结果表明武隆烟区田间烟草花叶病病毒复合仗染现象严茧,、已成为武隆烟区的优势原。侵染烟草和萝卜基因的克隆及序列分析克隆了侵染烟草和萝卜上的的基因,其核苷酸序列长度分别是和分别编码个和个氨基酸。对二者核苷酸序列、氨基酸序列进行比较,发现在的核苷酸序列上有个位点发生变化,在氨基酸序列上有个位点发生突变,但是二者基因编码的氨基酸均含有蚜虫传播所必需的基序。相似性比较结果表明,本研究克隆的两个基因序列的核苷酸相似性为氨基酸相似性为。烟蚜传播的传毒效率硏究取食不同寄主的烟蚜传播的效率不同。在每健株接获毒无翅成蚜头的条件下,取食烟草的烟蚜传毒效率最高,发病率为,取食萝卜的次之,发病率为取食甘蓝的烟蚜最低,发病率为同时,取食烟草的烟蚜导致供试烟株发病时间最早,取食甘蓝的最晚,萝卜次之。不同虫口密度下烟蚜传毒效率差异显著。个处理按照供试烟株发病率高低顺序依次排列是：头头〉头头〉头,其中,虫口密度是,头时,烟蚜传毒效率最高,供试烟株发病率达到,发病时间出现最早；而虫口密度为头时,烟蚜传毒效率最低,供试烟株的发病率为发病时间也较晚。关键词：芜菁花叶病毒；烟蚜；传毒效率；外壳蛋白 AbstractStudyonthedifferencesofgenestructureofTuMVCPinfectedtotobaccoandradishandthevirusspreadingabilityofMyzuspersicaeMastercandidate:LiXialianSupervisor:Prof.LiuYing-hongAbstractTobaccoisanimportanteconomiccropinChongqing.ThewidespreadofTobaccomosaicdiseaseintobaccoproductionhasbroughtthehugeeconomiclossestothetobaccoqualityandyield,andthusseriouslyconstrainsthedevelopmentofthetobaccoindustryinChongqing.Tobaccomosaicvirusdiseasewascausedbytobaccomosaicvirus(TMV),cucumbermosaicvirus(CMV),andpotatovirusY(PVY)aloneormixed,whichwasnon-persistenttransmittedbyMyzuspersicae,^Sulzer)inthefield.Atpresent,TuMVhaveshownthespreadtrendsinfieldyearbyyear.Withthecomplexfieldsymptomsandseriousdamagetotobacco,TuMVhasbecomeanewvirusdiseaseontobaccocrops.TuMVmainlyinfectscruciferouscrops,whileuntilnowthereisnoresearchaboutwhethertheexistenceofTuMVmutationsintheinfectiontotobaccoandthechangesofaphidstransmissionability.Incurrentstudy,wcfocusedonTurnipmosaicvirusanditsvectorM,persicae,comparativelystudiedthethetobaccomosaicvirustypes:thewingedaphidsdynamicrelationshipwiththetobaccomosaicdisease,thevirustransmissionabilityofaphidstoinfecttobacco,TuMVcoatprotein(CP)genesequencedifferencesonradish,thetransmissionabilitiestospreadtobaccoTuMVondifferentexperimentalpopulationsinChongqingthoughtheknowledgeofMediaentomologyandtechniquesofmolecularbiology.Ourresultsprovideimportantinformationtothemechanismofnon-persistentvirusforaphidtransmission,andthecomprehensivemanagementoftobaccoTuMV.Inthisthesisthemainfindingsareasfollows:1TherelationbetweentheWulongwingedaphidsdynamicandtobaccomosaicvirusdiseaseAccordingtoyellowboardtrapresults,wefoundthatthetrapwingedaphidsweremainlyfourspecies,namely,thetobaccoaphid,turnipaphid,soybeanaphidandcottonaphidintheWulongtobaccofield,inaddition,wealsoidentifiedthatM.persicaewasthelargestproportionwinglessaphidintobaccoplants,whichsuggeststhatM.persicaecancolonizeonthetobacco.Ill 西南大学硕士学位论文 Abstracttransmissionabilitiesis:20=15>10〉】 第一章文献综述第一章文献综述的研究进展的生物学特性芜菁花叶病毒(隶属马铃薯病毒科(马铃薯病毒属是马铃薯病毒科中寄主范围最广,危害最大的病毒种。通过人工接种的方式,能够侵染多种双子叶植物和少数单子叶植物。在世界范围内广泛分布,也是侵染大田蔬菜的第二大病毒种类,仅次于。在欧美亚部分地区对芸薹属作物和蔬菜危害严重(。在中国,是侵染十字花科蔬菜的重要病毒病病原,能引起油菜花叶病、大白菜孤丁病、芝麻矮花病和萝卜花叶病等,感染后的植株表现花叶、明脉、皱缩、畸形、矮化等症状,给油菜和蔬菜产业带来巨大的损失。年青玲等首次报道芜菁花叶病毒(在田间侵染烟草,并且与、、复合侵染,其侵染烟草的症状和、、花叶症状难以区分。基因组结构和功能粒子线形,长宽约为螺距为具有螺旋对称结构。是由的核糖核苷酸(和的外壳蛋白(构成。是正单链长度约为个核苷酸,中间是个单开放式阅读框,两翼是非转译区。开放式阅读框通过自身编码的蛋白酶,形成了种蛋白。近年来,这些蛋白的结构与功能己逐渐成为研究的热点,特别是外壳蛋白。外壳蛋白包被病毒的核糖核苷酸(,不仅可作为病毒的结构蛋白,还参与病毒的移动和蚜虫传播病毒的过程。的端区域是最容易变异的个区域之一,可用来对的不同株系进行鉴定。外壳蛋白端第位点上的有个保守的氨基酸三联子基序),它在外壳蛋白端和单克隆抗体特异性结合过程中具有重要作用,研究发现通过血清学方法可以辨别。此外,在和的结合过程中也发挥作用,所以对蚜传至关重要(。的基因研究进展随着分子生物学技术的发展,尤其是克隆和测序技术的发展,在病毒外壳蛋白(方面的研究越来越多,也越来越深入。崔璋京等(用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定核算分子量为并用分析其核酸,确认芜菁花叶病毒核酸。等(确认为正意核酸链。之后何庆芳等(对芥菜接种待其发病后提取病毒,然后提取其核酸,对核酸进行合成与克隆。孔令洁 西南大学硕士学位论文等(首先对的基因进行了克隆,测定了其核苷酸序列,并构建了植物表达载体。序列分析结果表明：这一克隆包含碱基的插入片段,从只有一个连通的阅读框架,根据这个阅读框架,该克隆由个滅基的蛋白质编码区和个碱基的非编码区(组成,最后面是尾巴。确定了的末端在氨基酸序列的第位。插入片段的编码区包括完整的外壳蛋白基因(和部分复制酶(基因,外壳蛋白端没有起始密码。徐平等(从杭州郊区甘蓝型油菜上分离到的一株为材料,进行了基因的克隆和序列分析,基因序列与已经发表的两种序列都有较高的同源性,但也同时也存在一定差别。造成这种差别很可能是由于病毒的不同株系所致；叶荣等(通过单克隆抗体对不同分离物抗原结构的比较,为分离物之间的鉴别提供了重耍的抗原组成与结构信息。施曼玲等(对杭州和昆明两分离物的和基因进行了克隆及序列测定,构建和基因的系统进化树,从系统关系树来看,总体上变异不大,杭州和昆明两分离物分别采自杭州和云南昆明,两地地理距离较远,而其基因同源性均较高,反映了变异不大的趋势。刘金亮,于小庆等(对潍坊萝卜分离物的基因进行表达,与年表现相同症状的分离物基因核苷酸同源性为氨基酸同源性为说明病毒发生了较大的变异,并且变异的位点主要在的末端。的检测鉴定技术利用鉴别寄主鉴别寄主是某一寄主在接种某种病毒后在叶片等组织产生典型症状,然后通过寄主所表现出来相关症状进而初步确定病毒的种类。早期的病毒检测和鉴定,是以的鉴别寄主为主要依据,前仅作为病毒的一种辅助检测鉴定手段。利用方法近年来,病原检测与鉴定使用最为广泛的一种血清学技术是酶联免疫吸附测定。虽然反应的灵敏度比核酸杂交技术稍差,但是由于它具有快速简便的特点,因此常用于大规模田间样本的常规病毒检测。现在常用的方法主要有三种：直接、间接和夹心。利用分子生物学技术分子生物学检测技术通过检测病毒的和来证实病毒的存在,在操作比较简便的基础上,更为重要的是灵敏度高,特异性强,检测速度更快。目前,核酸分子杂交技术、多聚酶链式反应技术(和电泳技术广泛应用于植物病毒的检测与鉴定。 第一章文献综述烟蚜的研究进展烟蚜的生物学、生态学特性分类地位和分布烟蚜拜又名桃蚜、桃翅蚜,属同翅目(蚜科(瘤蚜属。在温室中,烟蚜几乎可以危害任何温室植物,故又有温室蚜的俗名。烟蚜在朝鲜、日本、印度尼西亚、印度以及北美、欧洲、非洲等地均有发生,是世界上分布最广的蚜虫之一。我国主要分布在浙江、江苏、安徽、江西、湖南、四川、云南、福建、台湾、广西、山东、河北、内蒙、甘肃、新疆、黑龙江、辽宁等省区(陈其瑚,。寄主烟蚜寄主范围很广,它可以在多个科多种植物上取食。可传播种植物病毒占整个蚜虫传播的种植物病毒的杨效文,。国内寄主有种以上。主要危害油菜和十字花科蔬菜,桃、李等蔷薇科果树,烟草,马铃薯等茄科作物。在烟蚜的进化过程中,昆虫种群为适应寄主及环境变化的需要,常分化为不同的寄主转化型。在不同的季节内,烟蚜在各种寄主植物间存在着寄主转移,对不同寄主的嗜食程度不同,对各种寄主有取食选择性(苏建亚,。对环境温度的要求温度是昆虫种群生长发育和繁殖过程中的一个重要生态因子。昆虫在完成其生命活动的过程中需要一定热能,温度是热的度量方式,它作为一种变温动物代谢率是随着外界温度的升降而增高或降低。昆虫的体温基本上是随外界温度而起变化。外界温度的变化直接影响昆虫代谢率的高低,从而对昆虫的生长发育、生存繁殖及活动行为等产生十分重要的影响。有人认为在适宜的条件卜,烟蚜每天即可完成一个世代,亦有认为在条件卜烟蚜需用天完成世代发育,说法不一(林华峰等,。对烟株的危害烟蚜具有刺吸式口器,刺吸吸取烟叶的汁液,引起烟株营养不良,造成烟叶花叶、明脉、皱缩,后期出现畸形、矮化,严重影响着烟草产量和质量。烟牙对烟株的危害主要表现为：直接取食烟株,造成烟叶品质下降；诱发严重的烟煤病；传播多种植物病毒病。烟蚜传播非持久性病毒的蚜传机理烟蚜的传毒方式已知烟蚜传播的病毒中大部分都是以非持久性方式传播的。其特点是：烟蚜对非持久性传播的病毒获毒时间很短,通常只需要几秒钟。在这个过程中,蚜虫口针通常不穿透植 西南大学硕士学位论文株表皮细胞,若穿透表皮进入叶肉和维管组织时,则传播效率迅速降低(。蚜虫最初发现寄主的行为是靠短暂的刺探,尝试表皮细胞的汁液,这种情况非常容易获毒。由于在非寄主上的试探取食时间非常短暂,因此非持久性病毒的介体通常不在这种植物上定殖。对许多非持久性病毒而言,烟蚜在供试植物上词喂后很快就失去传染性,通常只有几分钟。无论这种病毒是否易感染这种病毒,失去传染性的速率是相同的(。决定烟持毒能力长短的主要因素与病毒在田间的传播有关。在许多试验中,试验条件和田间实际情形相差很大。等(模拟田间的条件,允许拴着的蚜虫在气流中飞行若干不同的时间。无论桃蚜和豆卫矛蚜的有翅蚜是飞行的还是在玻璃皿中禁食的,它们对和传染性的下降速率几乎相同。烟蚜传播病毒的种类研究表明,在中国大多数植物病毒都是通过蚜虫传播(罗华元等,。目前已知烟蚜能够传播余种植物病毒,且大部分是非持久性的,以下都是以非持久性方式传播的病毒属：苜蓿花叶病毒属(、黄瓜花叶病毒属(、花椰菜花叶病毒属(、柘橙病毒属(、蚕豆病毒属(和马铃薯病毒属。蚜传病毒中以半持久性方式传播的病毒比较少,研究的比较详尽的有烟草从顶病毒(段玉琪,、长线病毒属的和以持久性方式传播的病毒主要有黄症病毒科病毒(其中和的研究最详细)、—种黄症病毒和一种幽影病毒的复合体和矮縮病毒科病毒。烟蚜传播非持久性病毒的蚜传机理关于非持久性病毒的蚜虫传播机理的研究开始比较早,关于机理方面的相关假说也很多,主要有口针带毒假说和吸入吐出假说。近些年伴随分子生物学的飞速发展,对蚜虫传毒特性在分子机制方面的研究具有极大的推动作用。口针带毒假说年,口针带毒假说由率先提出,他认为病毒是由蚜虫口针传播的。在蚜虫取食病株的时候,将病毒粘在口针末端,当带毒的蚜虫取食健康植株时,病毒侵入健康植株以非持久性方式传播。此假说很好的解释了非持久性病毒传播的特点,即完成时间短,仅能在蚜虫体内短时间保存,可进行机械传毒。有很多研究结果都支持了口针带毒假说,年等在烟蚜口针下颚末端检测到了病毒粒子。年等通过扫描电镜及标记抗体技术,在烟蚜口针内发现了豌豆种传花叶病毒粒子及其。吸入吐出假说上世纪年代初,另一种假说被提出：吸入吐出假说(。该假说认为蚜虫通过口针先在有毒植株上取食并将病毒吸入到食道和前肠,经过一系列的增 第一章文献综述殖,然后再次回到唾液腺,当牙虫取食健康植株时通过回吐释放病毒。此后的很多研究也支持了这一假说,和在蚜虫的食道和前肠中均发现了病毒粒子。分子领域的相关研究进入上世纪年代,随着分子生物技术的发展,在对蚜虫传毒机制的认识方面有了一定的深度。蚜虫以非持续性方式传播马铃薯病毒属的病毒。近几年的研究发现,与介体传播相关的两个由病毒编码的蛋白分别是外壳蛋白(和辅助因子。早在年和就对烟草蚀纹病毒(、马铃薯病毒(的与的关系进行了研究。马铃薯病毒(的端暴露在表面的氨基酸三联子也称基序)是牙虫传毒所不可或缺的。通过对烟草脉斑驳病毒和西葫芦黄花叶病毒(的外壳蛋白(基因进行分析,对于氨基酸三联子在蚜传过程中的作用更为明确。在中,三个氨基酸缺失或替换其中的任何一个,都可能导致蚜传特性的下降甚至完全丧失。在氨基酸三联子中,氨基酸的位置不同也能影响蚜虫传毒的特性。当是碱性氨基酸时,蚜虫的传毒特性受到影响。第二位的一个小的非极性残基的残基变大或极性增强,对传毒也产生负面影响,再者变成其他任何氨基酸,均能导致蚜传特性的丧失。另外,基序下游的也能影响蚜传性。 1^-?大学硕十学位论文 引言引言重庆烟区作为我国烟叶重要产地之一,烟叶生产历史悠久,烟叶基地规模较大,烟叶年产量在全国烟产量中占有较大的比重,对重庆经济的发展起到了一定的推动作用。但近年来烟草花叶病发生普遍、危害严重,对烟叶产量和品质造成巨大的经济损失,严重制约着重庆烟叶产业的发展。烟草花叶病症状复杂、难于防治,在重庆烟区花叶病发生率可达左右,严重地区甚至达到以上,造成严重的经济损失。目前己经明确的烟草花叶病病原主要有烟草普通花叶病毒(、黄瓜花叶病毒(和马铃薯病毒(魏培文等,。在重庆烟区主要是以、和呈严重的复合性侵染,田间几乎找不到单一侵染的样品。年、年青玲等报道了在田间侵染烟草(青玲等,。目前,在烟田的发生已呈现出逐年扩散的趋势。田间症状表现更加复杂并已造成严重危害,成为烟草作物上的一种新的病毒病害。主要侵染十字花科蔬菜,蚜虫是其主要的传播介体。田间侵染烟草的是否发生变异,介体蜉虫传毒能力有怎样的变化,对烟草的危害以及传毒介体蚜虫在烟草上传播的机制等,目前尚无研究和报道。为了探索烟草与其重要的蚜传介体之间的关系,明确烟草的蚜传机制,以切断介体传播来有效控制的逐年扩散的趋势。本论文以侵染烟草的芜菁花叶病毒和介体烟蚜为对象,应用媒介昆虫学及分子生物学的相关技术手段,比较研究了重庆地区烟草花叶病病原种类、烟田有翅蚜发生动态与烟草花叶病发生的关系、影响蚜虫传毒能力的侵染烟草和萝卜的外壳蛋白基因序列差异,烟蚜不同实验种群传播烟草的能力,为蚜传非持久性病毒的传毒机制研究以及烟草的综合治理提供依据。 西南大学硕士学位论文 第二章武隆地区烟草花叶病和介体蚜虫发生情况田间调？第二章武隆地区烟草花叶病和介体蚜虫发生情况田间调查烟草花叶病的发生流行介体力牙虫的关系极为密切。传播烟草病病的蛭虫介体有烟蚜、萝卜岈、棉蚜《其中烟蚜是主耍传播介体。己知烟；牙至少可以传播多种病毒,在烟草上,烟蚜是烟草蚀文病、烟草花叶病每(、烟草环斑病毒(的主耍传播者《唯一传播介体(张广学,。此外,在云南烟蚜可以传播烟草丛顶病李凡,周雪平。烟虫牙是一种世界性的烟草害虫,它在烟草的整个生长季中都可以造成危害,由丁降雨、温度、大敌及烟株生状况,在烟株的不同生里,烟蚜种群数也有一定的变化。一般初次迁入烟田烟草上的有翅蚜个体的传毒能力都比较高(马继盛,罗梅沽,；江国,,冈此,有翅蚜个体迁入烟田的时期,是其传的关键期。为此,本章探讨了武隆地区烟草花叶病发生与介体蚜虫迁入之间的关系,这对制定相应的防治有翅蚜的措施、减轻烟草花叶病对烟草的危害,提高烟草的产和品质具有重耍的意义。材料与方法试验材料衿：通黄板(规格：,由屮波纽康生物技术有限公司提供)、铁丝、竹杆等。试验地点试验在武隆烟区发生较严重的基地进行。烟株品种为云烟。试验区烟株品种、种植年限、长势、十壤特点及田间管理一致。试验设计试验设两个处理：靠近树木菜元的烟田、山坡烟田。小区面积,处理间随机区组排列,重复次。试验方法田间蚜虫种群数调方法调？采取点取样法,每点株,定点定株,共株。从烟苗移栽后长势良好开始调卉,毎隔天调？一次,共调？！次。详细记载每株有翅蚜和无翅蜉蚩,并带问室内鉴定种类。有翅蚜调？！在烟田中放置黄板,将黄板挂在小竹竿上,插入烟苗行中,黄板的下边烟苗顶端相距。在挂板后第天、第大、第大、第天、第大、第大、第天、 W南人？硕十位论文第大分别周每板两面上诱杀的翅牙数。田间烟草花叶病病情系统调？从烟苗移栽后：势良奵幵始定点调,调采取点取样法,每点株定点定株。调指标为病株率、病情指数、调汽分级(参照全国烟草佼染性病害统一病情分级标准),记录数据。发病率发病株数调？总株数)病情指数￡各级病株成叶数该病级值)调总株数或叶数最高级值)数据处理所有数据的分析与处理、绘图均在数据处理系统中进行。结果与分析蚜虫田间种群数量消长动态迁入烟田的蚜虫种类年在武隆烟区进行黄板诱蚜并鉴定,结果表明,诱集的有翅蚜土耍有种,即烟虫牙、萝卜蚜、人蛭和棉蚜,其中烟蚜数最多,所比例最人(图,并且仅烟蚜能够在烟株上定殖。！讓薩讓■■國、圍■■■國其他蚜虫！。％画論■■國豳豳￡震调烟蜉所有蚜虫种群数的百分比不同烟田的蚜虫发生通过调发现,有翅蚜的来源土耍有：从桃树上直接迁移过来：(从油菜(十 第二章武隆地区烟草花叶病和介体蚜虫发生情况田间调？字花科蔬菜)直接迁移过来；(从桃树和油菜上同时迁移过来；(从桃树迁移到油菜十字花科蔬菜)再转移过来；(从烟草到烟草迁移。闲此,本实验选取了周边环境不同的田块调杏其蚯虫发生发现在距离果元、村庄较近的田块有翅明显较高,而距离较远的田块蚜虫较少(图。所以应加强田间管理,将烟田选择在远离蚜源的地方。不■向■地块虫國□近树木、菜。「：调期(图年武隆烟区不同烟田蚜虫的比较虫牙虫田间种群消长动态随着烟株生进入旺长期,由于食料丰富,有翅蚜胎生人量的无翅蚜。通过对周边不同环境的烟田蚜虫数的系统调？可知表,表月中旬是蚜虫的高发期,月日左右是蚜峰日,随后蚜虫数逐渐减少。通过调得知,有翅蚜的迁入数与田间无翅蚜的发生密切相关。在有翅蛭发生高峰期,无翅牙人发生,闪此无翅蚜的人发生是有翅蚜迁入后人繁殖造成的。表年武隆烟区靠近树木、菜元的烟田岈虫数单位：头株)期(月有蚜株率有翅蚜密度无翅虫牙密度 ^[^1'南人硕十学位论文表年隆烟区山坡烟田虫牙虫数单位：头株)期(有蚜株率有翅蚜密度翅蚜密度有翅蚜』无翅讶种群数消长规律如图所示。从图中可以出：蚜虫介体种群在田间的消长规律单峰「―震。一化翅蚜密义議■養—翅蚜密―小个》今合、个、、〈；、图有翅蚜」无翅蚜种群数￥消规律有翅蚜发生与烟草花叶病的关系对两种烟田的烟草花叶病病情调齊如表、所示。由表中可以召出,烟草花叶病的发生在月中上旬开始,月中卜旬达到发生高峰期,而在其发生高峰期过后,人约在月底至月初,烟草花叶病的发波动不人,趋丁平稳。从可知月中旬为有翅蚜迁入烟田的高峰期,而烟草花叶病有一个濟育期,由此可以得山,从时间方面来烟草花叶的发生与有翅蚜数增加相当吻合。表年武隆烟区靠近树木、菜的烟田烟草花叶病发生情况期(发病率病指数 第二章隆地区烟草花叶病和介体蚜虫发生情况田间调表年武隆烟区山坡烟田烟草花叶病发生情况期(月)发病率病怡指数由图、可知,田间烟草花叶病的发生与有翅岈的迁入消长密切相关,烟草花叶病病情指数与有翅蚜密度￥正相关,二者的线性分析式为相关系数为。随着有翅蚜数的增加,烟草花叶病的病情也在加重,当有翅蚜发生达到顶峰时,烟草花叶病的发病率和病情指数也急剧上升,达」一个峰值,而后烟株病情变化趋丁平稳。加■■一③賺、————■■》：、、々；：、今、咖《调期图图、图冇翅蚜与烟草花叶病发生消长关系讨论烟草花叶病是被蚜以「持久性方式传播的,在然界可以传播烟草花叶病的介体有：烟蚜、萝卜牙、棉蚜其中烟蚜是田间烟草花叶病的主耍传播介体,并且只有烟蚜能够在烟草上定殖。虫牙虫介体田间种群数消,是烟田生态系统中使所有生态冈子综合作的结果。其中包括烟株、天敌和气候条件。一般,蚜虫在月底开始迁月中卜旬达到高峰；但是,年庆武隆气温偏高,干早,烟苗的移栽期往后延迟,土月初至中旬移栽烟苗,至月上中旬,烟株处旺朋,加之此时气温较高,温湿度适宜,上升快,从而形成蚜高峰。月末月上旬烟株打顶抹杈,蚜虫由丁食料短缺,并且此时正值重庆 Irtj南人硕十宁位论文高温,迅速卜降。烟株和气攸条件是对蚜影响较人的态。通过本实验调得知底《中旬有翅！牙的高发助,』一翅蚜蚣峰过后人左心,烟草花叶病迅速发展,到底盛发,？翅蚜的迁入消田间烟草花病的发密切相关。闪此,这段时期对蚜虫进点防治,减少蚜虫在烟株上的降落数￡者在这段时间内烟移裁应采取有效的栽培措施,例如调整烟新的描种期,使烟株的旺々蚜虫的盛发助错开,以减少蚜虫传的机会。烟草花叶病的流行接威胁烟草的品质和产值,严盃时可导致全田被毁,烟绝收,所以当前更应该从防虫防碗的角度出发,视烟草的蚜虫和花叶病病的防治：作不影响烟草产和品质的前提卜,烟草适时晚栽,可以减少翅蚜向烟田迁移,从而减轻病病的发生。 第三章烟草花叶病毒病样品的病原种类检测第三章烟草花叶病毒病样品的病原种类检测烟草花叶病的病原种类很多,在世界范围内已经鉴定出多种,病原种类主要包括烟草花叶病毒、马铃薯病毒、黄瓜花叶病毒(、烟草蚀纹病毒(、烟草曲叶病毒和烟草环斑病毒等多种病毒。我国大部分地区烟草病毒中主要以、、及所占比例大,在田间几种病毒复合侵染非常严重。在重庆烟区主要是以、、等为主,呈严重的复合性侵染症状,难于防治。本研究于年月对武隆地区烟草花叶病样品重新进行病原检测,检测结果表明,的侵染已日渐严重,与、等病原呈严重的复合侵染。有上升为烟草主要病毒病害的趋势。材料及方法供试材料样品供鉴定的烟草病叶样品于年月釆自重庆市武隆烟区,共采集多个样品。病株花叶、矮縮、坏死、黄化,感染后的烟叶主要表现浓淡不均、褪绿变黄的花叶症状。、的检测试剂盒。试验方法间接法。具体方法参照试剂盒说明。结果与分析病原种类对武隆烟区采集的多个烟草样品随机选取个待测样品,进行间接法检测,结果如表所示。表烟草样品检测结果值】 西南大学硕士学位论文续表烟草样品检测结果值注：值：个样品次重复的平均值；阴性对照。由表得知,个检测样品都感染了、且这种病毒的复合侵染都是而样品中各病毒含量有显著的差异,其中的含量最高,次之,最低。烟草流行分析青玲等年首次报道了在田间侵染烟草,通过从武隆采集的个烟草样品进行检测,得到及等种病毒。个样品中四种病毒均呈现出不同程度的复合侵染,种病毒复合侵染率为。在复合侵染的样品中,各病毒浓度差异较大,其病原种类如表。表武隆烟区烟草的病毒种类样品注：年青玲检测结果从表可以看出,年含量最高,次之,的含量最低,为。年青玲等为了明确主要烟区烟草病毒病的主要病毒种类,采用抗原直接包被法对重庆、四川、云南、贵州、河南、陕西和甘肃,省市部分烟区采集的个烟草病毒病样品进行了检测。检测结果表明,除了在重庆样品中检测到,在云南、四川、贵州样品中也检测出,并且有的样品种病毐的复染。本研究于年月对武隆烟区烟草样品重新进行病原检测,得知,及复合侵染严重,在复合侵染的样品中,种病毒浓度差异显著,如图所示 第三章烟草花叶病毒病样品的病原种类检测「――：§—―图烟草样品中各病毒浓度从图可以看出,含量最高,次之,最低。和、和等病毒呈严重的复合侵染,从次要病毒上升为主要病毒,并且侵染已日趋严重。讨论在国内许多报道中得知烟草花叶病主要由、及复合侵染引起。主要侵染十字花科作物,是侵染蔬菜作物的第二人病毒,年青玲等首次报逝在田间侵染烟草,年本研究重新就武隆地区烟草病毒病的发生情况进行调查并进行病原检测,并将检测结果与年、年青玲等报道的进行比较发现,在烟田发生已呈现出逐年扩散的趋势。田间症状表现更加复杂并已造成严重危害,已成为烟草作物上的一种新的病毒病害。国内对在田间侵染烟草的情况发现的比较晚,但由于烟草上的病毒复合侵染的状况复杂,病毒之间可能协作或者桔抗,一些次要病毒种类可能上升为主耍病毒种类。本研究于年对重庆武隆烟区田间烟草花叶病病原进行重新检测,检测结果表明：在武隆烟区,已成为烟草的主要病毒种类,并且和、等病毒复合侵染十分严重。由以前的不能侵染烟草转变为主要病毒种类,其主要原因可能是由于主要靠烟蚜传播,而的流行与烟田附近十字花科蔬菜上有翅蚜的迁入密切相关。在自然界中可通过至少种蚜虫以非持久性方式进行传播,其中最主要的就是烟蚜、甘蓝呀和萝卜；牙等。经过对田间蚜虫种类数量与烟草花叶病毒病的系统调査发现,烟蚜是烟田蚜虫的主要种类,即烟蚜可能是的主要传播介体。但目前有关烟蚜传播特性方面的研究很少,对于烟田烟草花叶病的综合防治有效措施较少。因此,今后我们应该加大对烟蚜传播特性方面的研究,以期更好地防治烟草花叶病。 西南人学硕十学位论文 第四章侵染烟草和萝卜的基因序列分析第四章侵染烟草和萝卜的基因序列分析烟草花叶病在重庆的普遍发生,给烟草的生产带来严重损失。重庆烟草花叶病的病原主要是以等所占比例较大,但是最近研究检测发现,以前从未在烟草上发现过的危害日益加重,且有成为主要病毒的趋势。主要侵染十字花科蔬菜,以前,从未有报道侵染烟草。田间侵染烟草的是否发生变异,是否影响蚜虫传播机制？因此,本研究首先从寄主病原着手,进行了和蚜虫传毒有关的的基因的研究,对重庆武隆烟区釆集的烟草病株,以及重庆农科院蔬菜基地采集的十字花科蔬菜萝卜病株进行了检测,同时进行了烟草和萝卜病叶的基因克隆、序列分析,以期为以后更深入地研究烟草蚜虫传播机制提供理论支持。材料与方法试验材料供试病毒供试烟草花叶病毒毒株样品从重庆武隆烟区釆集,保存于一超低温冰箱备用。主要化学试剂天根生化科技北京有限公司氯仿重庆川东化工集团有限公司异丙醇(重庆川东化工集团有限公司无水乙醇重庆东化工集团有限公司焦碳酸二乙酯三羊甲基氨基甲烷重庆百萃生物有限公司重庆百萃生物有限公司冰乙酸重庆川东化工集团有限公司乙二胺四乙酸(上海生工生物工程有限公司上样缓冲液大连宝生物工程有限公司溴化乙锭(重庆百萃生物有限公司琼脂糖(大连宝生物工程有限公司大连宝生物工程有限公司大连宝生物工程有限公司 西南大学硕士学位论文大连宝生物工程有限公司大连宝生物工程有限公司缓冲液大连宝生物工程有限公司大连宝生物工程有限公司酶抑制剂大连宝生物工程有限公司聚合大连宝生物工程有限公司凝胶回收试剂盒上海华舜生物工程有限公司大连宝生物工程有限公司大连宝生物工程有限公司感受态细胞大连宝生物工程有限公司核糖核酸酶胰蛋白胨酵母提取物琼脂粉日本进口分装溴氯吲噪半乳糖苷美国进口分装异丙基硫代半乳糖苷氨青霉素(质粒提取试剂盒上海华舜生物工程有限公司氯化钠(重庆北碚化学试剂厂试验方法病叶总提取参照总试剂盒说明书,具体步骤如下：①提取样品液氮预冷的研钵中,充分研磨；②将研磨好的样品加入已经事先加入适量的离心管中室温静置③°离心上清液移至新的离心管中；④加入体积(的氯仿,振荡均匀；室温静置⑤,°离心上清液移至新的离心管中；⑥加入和上清液等体积的异丙醇,室温静置 第四章侵染烟草和萝卜的基因序列分析°离心⑦弃去上清液,向沉淀中加入的乙醇清洗沉淀；,°离心清洗沉淀的步骤⑦可重复一次)⑧弃上清液,干燥；⑨将沉淀溶解于适量的处理水中(,把溶解后的样品保存于超低温冰箱。质量检测琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶的制作：称取琼脂糖溶于电泳缓冲液中,微波炉加热,待琼脂糖充分溶解,然后静置冷却；取与上样缓冲液混勾后,加入到上样孔中,电压电泳。经显色,在凝胶成像系统上观察并拍照电泳结果。反转录聚合酶链式反应(参照丁铭等(设计的引物(表,由上海英俊生物技术有限公司合成。表引物序列及长度引物序列目的片断长度上游下游反转录合成参照反转录试剂盒说明,按照以下顺序加入反应所需试剂及样品：①②③④缓冲液⑤样品⑥瞬时离心°反转录反应°反转录酶的失活反应。片段的扩增扩增总体系设为,以不含模板的作为空白对照。反应体系如下： 西南大学硕士学位论文样品在灭菌管里将其混匀,放入仪(扩增,反应条件如下：预变性°变性°退火个循环延伸°继续延伸°保温。产物的琼脂糖凝胶电泳检测取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,用染色后,观察并拍照电泳的结果。产物的克隆和测序靶标的回收用上海华舜生物工程有限公司的凝胶回收试剂盒回收扩增靶带。具体步骤如下：称量离心管(害下含目的的琼脂糖块,使它尽可能小。放入离心管；再次称量,算出胶的重量不能大于,否则多次上样操作麻烦；按每琼脂糖加入液的比例加入液；置水浴使琼脂糖块完全溶化。每分钟颠倒混匀一次。如果琼脂糖重量小于,用双蒸水补充至,以确保体系总体积不至太小；加入液体积的异丙醇,混匀。温浴后,混匀；将溶化的琼脂糖液移入吸附柱,室温离心。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中,静置在吸附柱中加入液,静置后,室温离心。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中；室温,离心将吸附柱放入一个干净的离心管内,在吸附膜中央加入液,静置后,室温离心。将离心管中的回收所得贮存于°备用。 第四章侵染烟草和萝卜的基因序列分析靶片段与载体的体外连接用公司生产的克隆试剂盒,按照说明,在微凉离心管中制备以下连接反应液：靶片段和外源片段要在冰中解冻,°反应。质粒的转化从一冰箱中取出感受态细胞；冰中解冻,溶解后轻柔混匀,取出每管分装(注：解冻后不能再冷冻；分装后立即冰浴将连接液加入感受态细胞中,旋转几次,混匀内容物：冰上放置冰解中,勿动离心管；将离心管放入°水浴中,勿动离心管,使易于插入；快速将离心管转移到冰浴中,使细胞冷却加入液(无置于振荡器,摇,浑迚即可；在°下,离心去掉上层,剩下菌液,加入乂和丁；涂板含平板：,°培养挑单斑培养,提取质粒,鉴定。挑斑培养挑取可能是阳性克隆的白斑单菌落,于含的液中(°振荡培养过液最大转速。质粒提取将培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于°以最大转速离心,将剩余的培养物存°离心结束,尽可能吸干培养液。(培养液未吸干可能使质粒不能被限制酶切割或不能完全切割,这是因为培养液中的细胞壁成份抑制多种限制酶的活性。解决方法：用冰预冷的重悬细菌沉淀并离心) 西南大学硕士学位论文将细菌沉淀重悬于冰预冷的碱裂解液中,剧烈振荡；加新配制的碱裂解液于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管次,以混合内容物,切勿振荡,将离心管放置于冰上。(应确保离心管的整个内壁均与碱裂解液接触)加用冰预冷的碱裂解液,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液在黏稠的细菌裂解液中分散均匀,之后将管置于冰上用小离心机于°以最大转速离心将上清液转移到另一离心管中；加等体积的酚：氯仿,振荡混合有机相和水相,然后用小离心机于°以最大速度离心将上清液转移到另一离心管中；用倍体积的无水乙醇用于沉淀核酸,振荡混合,于室温放置用微量离心机于°以最大转速离心,收集沉淀的核酸；小心吸去上清液,将离心管倒置于纸巾上,以使所有液体流出棑干,用吸头除去管壁上的液滴；加乙醇于沉淀中,并将盖紧的试管颠倒数次,°以最大转速离心回收除去上清液和管壁上的酒精液滴,将开口的试管置于室温使酒精挥发,直至试管内没有可见的液体存在加灭菌水,,°消化存于°。转化菌液鉴定取液中培养的菌液各采用相同的扩增体系和条件进行扩增,鉴定外源基因转化情况。序列测定分析核苷酸序列由上海英俊生物技术有限公司测定。在网站(上进行和比较两种寄主作物上基因的相似性。结果分析结果总的提取结果分子生物学研究的必要前提是简单而又快速地从植物体中提取。本实验采用改 第四章佼染烟草和萝卜的基闪序列分析进的方法,反复试验,从病叶样品中获得了较高质的总。对提取的总进行琼脂糖凝胶屯泳检测如图、获得了相应的扩增条带,表明所提取的并没有降解。提取的烟草病叶总图提取的萝卜病叶总注：：阴件对照；和样品产物扩增结果以所提取的烟草、萝卜病叶总为模板,进行反转录合成的第一链,然后川得到的为模板进行扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳,分别得到人小约为和的特异性条带(图,图,与引物设计扩增片段人小基本一致。烟草病叶中的扩增产物阴件对照、；问物 两南人宁硕十宁位论文参■萝卜叶屮的扩增产物阴件照：品产物产物的克隆及重组子鉴定对产物分别进行割胶冋收,克隆到载体,川碱裂解法转化人肠杆菌,振荡培养,经斑筛选,鉴定,得到了预期片段人小的扩增条带,说明对应的单菌落都存在含有基的—组质粒。(图和。—■■■■函——,图菌液鉴定烟草)图菌液鉴定萝卜)阴性对照；品产物卜样品产物序列测定与分析阳性隆由上海英俊生物技术有限公测定,得到扩增的的条带的核酸序列,所测序列还未登陆。来烟草和萝卜病叶上的的基闪测序结果〈度分別是和,其所编码的氨基酸分別为个和个。将二者核酸序列、氨基酸序列分别进行比较(图,图在核酸序列上冇个位点发生变化,氨基酸序列上仃个位点存士：差异,但是—者基编码的氨酸均含有蚜虫传播所必需的基序。相似性比较结果表明,本研究克隆的两个基闪序列的核酸相似性为氨基酸相似 第四章染烟草和萝卜的基闪序列分析性为。, 两南人硕十：位论文烟草萝卜病叶上基闪的核酸序列比较汴：红色标为染烟卜的闪核酸序列卜个差异位点 第四章佼染烟草和萝卜的基闪序列分析爾欄爾曙醫卜■：图烟草与萝卜病叶上基闪的氨基酸序列比较注白色部分为侵染烟草、卜的闪的氨拔酸序列上个差异位点讨论芜菁花叶病毒为马铃薯病鸾属、—的成员,寄主范围很广,可佼染个科个属的种双于叶植物。成员少见的宽广寄土谱,那么由于寄主间的差异,基闪可能存在变异,本研究就证实了这一点。基闪序列分析发现,在不同寄主烟草和萝卜上,二者的核酸和氨基酸相似性分别为和。在基闪中,氨基酸二联子：是蚜虫传播必须的,然存在氨基酸二联亍：但是当是碱性氨基酸时,蚜虫的传毒特性受到影响,二《者小的非极性残基的残基变人、成极性增强,对传森产生负面影响,再者变成任何其他氨基酸,均能导致蚜传性丧火。另外,基序下游的也能影响！牙传性。佼染烟草和萝卜的的氨基酸序列均含有蚜虫传毒所必须的基序,但是以前未被蚜传播至烟草上,经过本研究分析可能原闪如下：在氨基酸二联于中,残基发生变化,！者其极性增强；对染烟草和萝卜的基闪的氨基酸序列比对发现,烟草上的卜游存在其中一个影响传毒的氨基酸,而原来萝卜上该位点是。 |jtng人宁硕「位论文 第五章烟蚜不同实验种群传播烟草的能力第五章烟蚜不同实验种群传播烟草的能力烟田中迁入的蚜虫主要是烟蚜、萝卜蚜、大豆蚜,棉蚜,除烟蚜外其他蚜虫基本上不能在烟叶上定殖。由于烟蚜长期取食不同植物就会引起种群分化,产生不同的生物型。国内多个学者确认了烟蚜存在传毒专化性的种下型,并开展了按虫牙虫介体划分病毒株系的研究(吴云峰等,；；马占鸿等,。胡稳奇(发现了不能通过蚜虫传播的株系。周雪平和濃祖芹(先后发现来源于豌豆的分离物不能通过烟蜉、豆蚜和豌豆蚜以非持久性方式传播。烟蚜是烟田花叶病的主要传播介体,而是烟草花叶病中的重要病毒,因此,研究烟蚜传播的传毒效率,对预防的流行,减轻给烟叶带来的损失有重要意义。本文研究了烟蚜在不同寄主种群和不同虫口密度下对烟草的传毒效率。材料与方法试验材料试验烟蚜年月在重庆市武隆烟区、重庆北賠甘蓝和萝卜上,把带有烟牙的各寄主叶片直接采摘带回实验室,然后将其移入带有防虫网的相应盆栽寄主上,进行人工饲养。无翅无毒成牙的建立参照马占鸿(。分别建立烟草,甘蓝和萝卜种寄主植物上烟蚜实验室种群。词养条件：温度士相对湿度±,光周期。供试毒源供试毒源雪菜分离物)为浙江大学农业与生物技术学院馈赠。供试植物供试植物分为接毒植物和毒源植物。接毒植物是叶龄期左右的健康烟草；毒源植物是釆用摩擦接种法将接种到龄期左右的健康烟草上,总共接种株,然后将其放在防虫网室内,大约天后即可作为毒源植物。方法消毒灭菌方法土壤,珍珠砂灭菌方法：采用高压蒸汽灭菌法,温度为,时间分别为和。种子消毒方法：或或的福尔马林溶液浸泡。花盆,瓷盘的消毒方法：溶液浸泡小时。手的消毒方法：用肥皂水彻底清洗消毒。 西南大学硕士学位论文烟蚜词毒传毒方法将无翅无毒成蚜放在小安培瓶内,饥饿小时,将其转移到烟草毒源植株上,接触角与身体是否平行来判断烟蚜是否取食,饲毒裘季燕,用端部蘸湿的毛笔笔尖轻轻触动烟蚜尾部,令其口针自动收回,将烟蛭轻轻用毛笔挑起,转移到健康烟株的第二个叶片(自上往下)上,传毒取食小时后用阿维菌素杀死烟蚜,将各处理烟株移入人工气候室(温度±湿度±,光周期,观察烟株发病率,并用间接法检测烟株带毒情况。发病率与带毒率的计算方法发病率发病株数总株数)带毒率带毒株数总株数)试验方法烟蚜取食三种不同寄主的传毒效率的测定试验共设种处理：烟蚜取食烟草、烟蚜取食甘蓝和烟蚜取食萝卜。每种处理接种株,每株接种头无翅无毒成蚜,以健康烟草作为对照。不同虫口密度下烟虫牙传毒效率测定试验共设个密度处理：头、头、头、头、头。每个处理接种株,对照为健康烟草。结果与分析取食不同寄主的烟蚜传毒效率测定烟株发病率的测定烟虫牙的寄主种类繁多,在不同寄主上其传播的能力不同(图。通过对烟株发病率的测定得知,当虫口密度为头时,烟草上的烟蚜传毒效率最高,健康烟株的发病率为,萝卜上次之,健康烟株发病率为,甘蓝上最低,健康烟株发病率仅为通过对发病时间的测定得知,在烟草上饲养的烟牙传毒后,健康烟株发病时间最早,萝卜上的次之,甘蓝上的最晚。这就表明了取食烟草后的烟蚜在烟草上传播的效率最高。 第五章烟蚜不同实验种群传描烟草的能力。萝卜；时问图取食不同寄主烟蚜的传毒效率供试烟株的带毒率供试烟株检测结果如表、、。由表可知,在烟草,萝卜和甘蓝二种不同寄主上饲养的烟蚜获毒传毒后,健康烟株的带毒率差异显：。烟草上烟蚜传毒效率最高,在株供试烟株中,有株带毒,烟株带率为,株带毒却隐症；其次是萝卜上烟蚜,有株带毒,烟株带毒率为,其中株带毒却隐症；甘蓝上烟蚜的传毒效率最低,供试烟株带毒率是其中株带却隐症。 两南人学硕十位论文供试烟株检测结果烟蚜来烟草)值序号品阴件对照今力照品阴件对照带宇 第五章烟蚜不同实验种群传播烟草的能力表供试烟株检测结果(烟蚜来自萝卜)值序号样品阴性对照、对照样品阴性对照】带率 内南人硕,位论文表供试烟株检测结果烟蚜来甘蓝)值忭品阴性对照对照样品阴性对照带；宇不同虫口密度下烟蚜传毒效率测定烟株的发病率烟蚜以持久性方式传播,其虫口密度影响着传效率,虫口密度不同,烟蚜的传毒效率也有显《：的差异(图。个处理卜供试烟株发病率由高到低依次为：头头〉头头头,其中虫口密度为、头时,供试烟株均发病,发病率为发病时间也最早出现,说明烟蚜传毒效率最高；而虫口密度为头时,供试烟株的发病率为,发病时间也出现的最晚,说明烟牙传每效率最低。 ^第五章烟牙不同实验种群传描烟草的能力■國：：：：：：：头烟蚜吋天)不同虫口密度十烟蚜传效率供试烟株的带率由表、、、、可知,烟蚜在不同的虫口密度下,烟蚜传毒效率有差异,供试烟株带毒率也不同。在个处理下供试烟株带毒率由人到小依次为：头头〉头〉头〉头,其中,虫口密度是头时,烟蚜传毒效率最低,烟株带毒率是无隐症现象出现；虫口密度为头,头时,烟蚜的传毒效率最高,株供试烟株均带带毒率为。由此得出：在一定的虫口密度范围内,烟蚜的传效率随着虫口密度的增加而提高,而超出这范围,传效率受虫口密度的影响不人。 Irt^南人学硕十位论文衣供式烟株检测结果(头烟蚜)值阴性对照对照阴件对照带率°。 第五章烟蚜不同实验种群传播烟草的能力表供试烟株检测结果(头烟蚜)值阴性对照空白对照样品阴性对照带毒率 西南大学硕士学位论文表供试烟株检测结果头烟蚜)值序号阴性对照空白对照样品阴性对照带毒率 第五章烟岈不同实验种群传播烟草的能力表供试烟株检测结果(头烟蚜)值序号阴性对照空白对照样品阴性对照带毒率 西南大学硕士学位论文表供试烟株检测结果头烟蚜)值月性对照空白对照样品阴性对照带毒率。讨论本研究结果表明不同寄主上烟蚜的传毒能力不同。在烟草、萝卜和甘蓝三种寄主上,烟草上饲养的烟蚜传毒能力最强,烟蚜传毒后,供试烟株的发病率和带毒率分别为和甘蓝上烟蚜传毒能力最弱,烟牙传毒后,供试烟株的发病率和带毒率分别为和。不同寄主上烟蚜传毒能力不同可能与烟蚜的寄主适应性相关。由于烟蚜在一种寄主植物上的长期取食,很容易导致其颜色、体型、生理生化、生长发育和繁殖等方面发生一定的变化。本研究中由于接毒植物和毒源植物是烟草,在萝卜和甘蓝上的烟錄到了烟草上要有一定的寄主适应性,本实验的研究结果表明取食不同寄主的烟蚜传播的效率差异显著。此外,虫口密度不同,烟虫牙的传毒能力也有差异。烟蚜在一定的虫口密度范围内,其传毒能力随着虫口密度的增加而上升,但是超出这个范围,虫口密度对烟蚜的传毒能力影响不大。烟蚜虫态、虫口密度、温度等都能影响着烟蚜传毒效率的大小。其中,虫口密度 第五章烟蚜不同实验种群传播烟草的能力对传毒能力的影响最为明显。赵荣乐,郑光宇等(发现烟牙能够传毒的最小虫口密度是头,多头烟蚜的传毒效率比单头的高；在一定蚜量范围内,传毒能力随着蚜虫数量的增加而上升；当蚜虫为头,头,头时,烟蚜的传毒效率分别是；当蚜虫达到头以上时,烟蚜的传毒效率可达此试验结果和本研究得到的结果基本一致。本研究对预防烟草上的流行有重要意义,为烟区作物布局提供了理论依据,由于烟蚜喜欢寄宿在萝卜等十字花科蔬菜上,所以应加强田间管理,在烟田周围不适宜种植萝卜等十字花科蔬菜。目前对于不同寄主植物上蚜传特性的研究很少,烟草花叶病的防治难度依然很大,因此,应该加强这些方面的研究,以便能够更好的为烟草花叶病的综合防治提供理论依据。 两南大学硕十学位论文 结论与讨论结论与讨论主要结论本文针对田间烟草发生严重的情况,在田间调查的基础上,对烟草的岈虫机制有了初步的研究,以期为更深入的研究蚜传机理提供依据。本研究得到了以下主要结论：明确了武隆烟区的主要传毒介体以及有翅蚜发生动态与病毒病发生的关系年在武隆烟区发生较严重的基地设置试验点,通过对有翅蚜调査鉴定可知,主要为烟蚜、萝卜力牙、大豆蚜和棉牙,其中烟蚜所占比例最大。田间烟草花叶病毒病的发生与有翅蚜的迁入消长紧密相关,在有翅蚜发生达到高峰期时,烟草花叶病毒病的发病率和病情指数也急剧上升。通过调查得知,烟草花叶病有一个发生高峰期,在月中上旬始发,在月底盛发,往后花叶病的发生波动不大,趋于平稳。而月底至月中旬为有翅蚜迁入烟田的高峰期,加上烟草花叶病有一个潜育期,这样在时间上有翅蚜数量的增加和烟草花叶病的发生吻合。确定了烟草花叶病病原种类对从武隆采集的多个烟草样品中随机抽取的个样品进行了检测,结果检测到、及等四种病毒,在个检测样品中,四种病毒呈现不同程度的复合侵染,但是四种病毒含量差异显著,其中最高,次之,最低。对侵染烟草和萝卜的基因进行了克隆测序及序列分析对侵染烟草和萝卜病叶上的的基因进行测序,核苷酸长度分别是和其所编码的氨基酸分别为个和个。将二者核苷酸序列、氨基酸序列分别进行比较(图,图在核苷酸序列上有个位点发生变化,在氨基酸序列上有个位点发生突变,但是二者基因编码的氨基酸均含有蚜虫传播所必需的基序。相似性比较结果表明,本研究克隆的两个基因序列的核苷酸相似性为氨基酸相似性为。研究了烟蚜传播的传毒能力在不同寄主上的烟蚜传播的能力不同。在烟株发病率方面,每株接种头,烟草、萝卜和甘蓝三种寄主上的烟蚜饲毒传毒后,供试烟株的发病率分别为、和,表明取食烟草的烟蚜传播的能力最强；另外,在发病时间方面,烟草、萝卜和甘蓝三种寄主上的烟蚜词毒传毒后,供试烟株发病时间不同,取食烟草的烟蚜传毒 西南大学硕士学位论文后,供试烟株发病时间最早,而取食甘蓝的最晚,萝卜次之。这就表明了取食烟草后的烟蚜在烟草上传播的效率最高。烟蚜传播是非持久性方式传播,传毒效率受虫口密度的影响,对取食相同寄主不同虫口密度进行测定,结果表明：不同虫口密度下烟蚜传毒效率差异显著,个处理按照供试烟株发病率高低顺序依次排列是：头头头〉头〉头。当虫口密度是头时,供试烟株发病率达到发病时间出现最早,说明烟蚜传毒效率最高；而当虫口密度为头时,供试烟株的发病率为发病时间也出现的较晚,说明烟蚜传毒效率最低,。讨论属于马铃薯病毒科马铃薯病毒属。其危害及其严重,是马铃薯病毒科中危害范围最广、程度最深的病毒。是仅次于侵染大田蔬菜的第二大病毒,以前从未在烟草上发现过,如今能够侵染烟草,并且在烟草上迅速流行。主要被蚜虫以非持久性方式传播。通过田间调査得知,传播的主要介体是烟蚜。另外,本文针对的主要传播介体一烟蚜,取食不同寄主和不同虫口密度下的传毒能力做了研究,结果表明,烟蚜取食不同寄主和其在不同虫口密度下时,传播的能力也不同,烟蚜传播能力的大小直接影响着病毒病在田间的流行程度。切断介体传播是控制的有效途径。因而,明确介体传播的机制具有重要的理论和实践意义。本研究从病原本身出发,对影响蚜传特性的基因进行了序列测定和分析,对蚜虫能够传播在烟草上的可能原因分析如下：在氨基酸三联子中,残基发生变化,或者其极性增强；经过对侵染烟草和萝卜的基因的氨基酸序列比对发现,在氨基酸的个突变点中,烟草上的下游存在其中一个影响传毒的氨基酸而原来萝卜上该位点是,为蚜传机理的深入研究做了铺垫。目前,国内外在侵染其他寄主植物蚜传机制方面的研究开展的比较多,已进入了分子水平阶段。但是关于侵染烟草蚜传特性方面的研究不多,是何原因导致烟蚜能够传播至烟草,本研究从病原本身出发分析了可能存在的原因,但是还有待进一步明确。烟区烟草花叶病的综合防治难度依然很大。因此,我们应该加大蚜传特性方面的研究,为有效防治烟草花叶病提供理论依据。 参考文献参考文献,,,何庆芳,米景九芜普花叶病毒核酸的合成与克隆遗传学报,,：徐平,许建平芜普花叶病毒杭州分离株外壳蛋白基因的序列分析浙江农业大学,报,叶荣,于善谦,韦石泉用单克隆抗体作芜普花叶病毒不同分离物外壳蛋白抗原结构的比较研究病毒学报,施曼玲,周雪平芜菁花叶病毒两分离物的基因及基因的比较浙江大学学报,刘金亮,于晓庆等潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及基因的表达园艺学报,吴雅琴果树病毒检测方法研究进展河北果树, 西南大学硕士学位论文马筠植物病毒鉴定检测方法的研究进展世界农业,(胡吉成,朱桂香,谢淑仪白菜孤丁病毒的抗血清特性及其应用的研究植物保护学报,朱培坤,陆妙康,王鸣歧等芜蓄花叶病毒在上海市郊县蔬菜等作物上分布范围的血清学测定植物病理学报,李丽丽,黄早花,王圣玉华东地区油菜病毒病的毒原种类血清学诊断中国油料,李彦勇应用间接酶联免疫吸附技术对芜着花叶病毒血清学关系的研究植物病理学报,蔡岳松,李新予,余家兰等四川搾菜病毒病的毒原种群及其分布西南农业学报,赵荣乐,郑光宇在新疆发生的芜著花叶病毒的鉴定北京师范大学学报(自然科学版,杨书军,余子林侵染芝麻的芜菁花叶病毒黄斑黄化株系的初步鉴定中国油料,邓晓东,费小雯芜普花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析热带作物学报,施曼玲浙江榨菜病毒病病原鉴定微生物学通报裘维蕃植物病毒学北京：科学出版社,罗华元,濮祖芹蚜虫与蔬菜病毒流行的关系及阻断蚜虫传毒的途径云南农业大学学报,段玉琪,秦西云,莫笑晗等烟草丛顶病(传毒特性及寄主范围研究中国烟草科学, 参考文献,,,,,,张广学烟蚜研究新进展河南农业大学学报,李凡,周雪平,蔡红等云南烟草丛枝症病害的初步研究植物病理学报李显荣,张广学,朱弘复等烟蚜踏,的研究植物保护学报,,赵万源云南省烟蚜的研究植物保护学报,, 西南大学硕士学位论文宫亚军,石宝才,路红等温度对种蚜虫生发育及繁殖的影响华北农学报,马继盛,罗梅浩,郭线茹等中国烟草虫北京：科学出版社江宁国预防油菜病毒病关键在于阻截蚜虫现代农业科技,,■,,,,,, 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攻读硕士学位期间发表的文章攻读硕士学位期间发表的文章李夏莲,刘映红,洪枫重庆武隆地区烟草花叶病病原种类鉴定及烟草流行分析植保科技创新与病虫防控专业化中国楨物保护学会年学术年会李夏莲,刘映红佼染烟草、萝卜的基因序列分析待发表 南人学硕士位论文 致谢致谢本论文是在导师刘映红研究院的精心指导下完成的,从论文选题、试验设计、试验实施和论文撰写无不凝结着刘老师的大量心血和汗水。他渊博的学识、严谨治学的态度、把握学科前沿的敏锐洞察力、诲人不倦的师长风范以及对科学事业的执着追求给我留下了深刻的印象,并成为我终身学习的楷模。恩师的宽广、坦荡、豁达视学生如子女的高尚风格和人格魅力令我敬佩,将影响我一生。本实验主要在西南大学植物保护学院,重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室完成。试验过程中得到了学院各位老师的支持和帮助,感谢赵志模教授、王进军教授、陈力教授、陈国康副教授、吴仕源高级实验师等多位老师的指导和帮助,保证了我实验工作的顺利进行,再次表示衷心的感谢。此外还要感谢师兄师姐师弟师妹在我的学习中提供宝贵经验及建议,生活中给予我无私的关心和照顾,他们是：张彬、万宣武、翟雨林、胡黎华、唐平、张艳冬、洪枫、于文惠、周红艳、田卉、肖海斌。感谢同窗好友于云奇、阮涛、吴精晶、杨云飞、李竹、雍小菊、张国娜、柏自勤在我实验和生活方面给予的建议和帮助。最后,特别感谢我的父母,没有他们的支持和鼓励,就没有我的今天；感谢那些在我生命出现的朋友们,没有他们无怨无悔的奉献和帮助,我的生活不会如此顺利、多彩多姿。李夏莲年月