2型固有淋巴细胞（ILC2）参与Graves病发病及机制研究

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中图分类号：Ｒ５８１．１ＳＯＵＴＨＷＥＳＴＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文２型固有淋巴细胞（ＩＬＣ２）参与Ｇｒａｖｅｓ病发病及机制研究院（系）、所临床医学院研宄生姓名丁静雅学科、专业内科学导师姓名徐勇学位类型专业学位二〇一八年五月 西南医科大学毕业硕士研究生学位论文独创性声明及发表承诺书本人声明所呈交的学位论文（己整理成发表形式）枭我个人在西南医科大学导师指导下一，由导师及西南医科大学提供切科研条件的情况下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在即将平业离校之际，本人郑重承诺：该论文将以西南医科大学的名义发表（论文作者力研宂生及导师，作者所在单位为西南医科大学），并在发表后立即将发表论文原件）（期刊寄与导师１册。学位论文作者签名：：ＴＷ导师签名＊－年〇曰ｎ期口期：月：年月Ｐ口ｖＡ穸＞西南医科大学硕士学位论文版权使用授权书本人完全了解西南医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：西南医－版科大学打权保留并向有关部ｎ或机构送交本人学位论文的复印件和电丫，允＿许论文被齊阅和借阅，允许有关部门或机构以电子出版物形式出版发彳／，并对外进行令文内容服务。本人授权西南医科大学可以将本人学位论文的全邰或郃分内界编入打关数据库进行检索，进行数字化处理汇编、通过Ｈ络或其它途径进行交流传捕，可以公布学位论文的全部或部分，内容可以采用影印、缩印、扣描或？于，即西南医科其他殳制段保存和汇编学位论文天孥具有本人学位论文的数字化、总网络传播权和汇编权。同时授权将本学位论文收泶到《制品ｍｈ制权屮ｎ库》和《万方数据库》，并通过网络。学位论文全义数据向社会公众提供佶总服务保密□，在年解密后适用本授权书。本人提交的学位论文属不保密ｄ“（请在以上方框）内打＂导师签：学位论文作者签名３；夺丫：妇导师签章：Ｕ期月马３：年曰期月９Ｓ曰 西南医科大学硕士学位论文目录12型固有淋巴细胞（ILC2）参与Graves病发病及机制研究………………………………………………………………11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………41.3前言……………………………………………………………81.4材料与方法……………………………………………………131.5结果……………………………………………………………291.6讨论……………………………………………………………431.7结论……………………………………………………………601.8参考文献………………………………………………………611.9英汉缩略词对照表……………………………………………732致谢……………………………………………………………7532型固有淋巴细胞与免疫疾病的研究进展（综述）…………76 西南医科大学硕士学位论文2型固有淋巴细胞（ILC2）参与Graves病发病及机制研究摘要目的：Graves病(Gravesdisease，GD)是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病，其特点是在外周血中存在针对甲状腺的自身抗体,同时伴有自体活化的淋巴细胞对于甲状腺的浸润，以及伴有眼眶以及眶周组织的浸润。GD最主要的临床表现包括了甲状腺毒症的高代谢表现、甲状腺弥漫性肿大，血清TSH浓度降低，甲状腺激素（T3、T4）水平的升高等。GD的发病机制到目前并不是特别清楚，但研究表明GD是一种主要由体液免疫参与调节的自身免疫疾病。而2型固有淋巴细胞（ILC2）是由共同淋巴样祖细胞发育而的一种非B、非T细胞的新型淋巴细胞，与免疫关系密切。ILC2受细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的刺激后可分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和双向调节蛋白等细胞因子。ILC2主要介导Th2类免疫应答，并可以通过多种效应细胞因子调控不同信号通路，在多种免疫性疾病的发生中参与重要的作用，如哮喘、特异性皮炎、嗜酸性胃肠炎等免疫性疾病。而Graves病被认为是Th2免疫反应主导的免疫疾病并且在Graves病患者的甲状腺中浸润的淋巴细胞可以分泌IL-4，IL-5,IL-10,IL-13等细胞因子。本文旨在探讨ILC2是否参与Graves病的发病，于是对ILC2与Graves病之间的联系及其机制进行研究。方法：1.采集Graves病、Graves眼病患者以及健康志愿者外周血，对外周血进行单个核细胞分离，检测外周血单个核细胞中ILC2的比例，并检测外周血浆中IL-4、IL-5、IL-13水平；2.细胞培养分组：对甲状腺上皮细胞进‐1 ‐ 西南医科大学硕士学位论文行体外培养，并使用50ng/ml人重组白介素4（rhIL-4）和25ng/ml人重组白介素13（rhIL-13）对甲状腺细胞进行24h体外刺激，并收集细胞上清液，同时提取干预后的甲状腺细胞的RNA；3.检测方法：①观察各组对象外周血单个核细胞中ILC2的比例：用流式细胞检测对外周血单个核淋巴细胞中的ILC2比例进行检测；②观察ILC2分泌的2类细胞因子的水平:用ELISA（酶联免疫吸附测定）对血浆中的IL-4，IL-5，IL-13水平进行检测；③观察rhIL-4和rhIL-13干预后细胞上清液甲状腺激素水平：采用ELISA方法对细胞上清液中T3、T4水平进行检测；④观察rhIL-4和rhIL-13干预后甲状腺细胞中PKA、CREB、STAT6、BCl-2基因水平的表达：采用荧光实时定量多聚酶链式反应（qRT-PCR）对PKA、CREB、STAT6、BCl-2mRNA相对表达量进行检测。4.统计学分析：对数据进行正态性检验，正态分布的计量资料用均数±标准差（x¯±s）表示，非正态计量资料用中位数和上下四分位数M(P25，P75)表示，应用统计软件SPSS22.0进行数据分析，对数据进行方差齐性检验，方差齐性的两组计量资料进行独立样本T检验，多组计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法；方差不齐的多组计量资料则组间比较采用Kruskal-WallisH秩和检验，二分类变量采用卡方检验；单因素相关性分析采用Pearson相关系数表示变量与自变量的线性关系，P<0.05认为差异具有统计学意义。结果：①与正常对照组相比，GD和GO组患者外周血单个核细胞中ILC2比例显著升高（P<0.05），GO组外周血单个核细胞数较GD组有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）;②与正常‐2 ‐ 西南医科大学硕士学位论文对照组相比，GD和GO组患者外周浆中IL-4、IL-5、IL-13水平显著升高（P<0.05）；GO组外周血浆中较GD组外周血浆中IL-4、IL-5、IL-13有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；③外周血中ILC2比例与白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量不存在相关性，而ILC2与甲状腺激素以及甲状腺自身抗体存在相关性，相关性低；ILC2比例和血浆中IL-4、IL-5、IL-13呈正相关（P<0.05）。④与正常对照组相比，rhIL-4和rhIL-13干预后细胞上清液甲状腺激素（T3、T4）水平均显著升高（P<0.05）。⑤与正常对照组相比，rhIL-4和rhIL-13干预后甲状腺细胞中PKA、CREB、STAT6、BCl-2mRNA水平明显升高（P<0.05）。结论：1.Graves病时ILC2可能通过在外周血中比例的增加以及其分泌的2类细胞因子水平的升高，活化Th2免疫反应；2.ILC2分泌的2类细胞因子可能通过抑制甲状腺细胞凋亡、刺激甲状腺细胞激素分泌，导致Graves病的发生发展。关键词：2型固有淋巴细胞，Graves病，Graves眼病，Th2细胞因子，自身免疫。‐3 ‐ 西南医科大学硕士学位论文TheassociationbetweenType2innatelymphoidcellsandthepathogenesisofGravesDiseaseAbstract：Objective：GravesDiseaseisacommonorganspecificautoimmunedisease,it’scharacterizedbythepresenceofthyroidautoantibody,theinfiltrationofthethyroidglandbyautoactivatedlymphocytesand,occasionallywiththeinfiltrationoforbitalandretrobulbartissues.MostpatientsofGravesdiseasehavesomehypermetabolismsymptoms，thyroidenlargement,decreasedlevelsofTSHandelevatedlevelsofthyroxine(T4)andtriiodothyronine(T3).ThepathogenesisofGravesDiseaseremainsobscure,butalargenumberofstudiessuggestedthatGravesDiseasewasanautoimmuneresponsemediatedbyhumoralimmunity.Meanwhile，type2innatelymphoidcell(ILC2）isanewtypeoflymphocytethatisdevelopedbycommonlymphoidprogenitorcellsanditisanon-Bandnon-Tcell，whichiscapableofproducinglargeamountsofIL-5,IL-4,IL-9,IL-13andamphiregulinwhenstimulatedbyIL-25andIL-33.ILC2mainlyparticipatesinregulationoftheTh2immuneresponse,andmediatesmultiplesignalingpathwaysbyproducingvariouscytokines,itplaysanimportantroleinmanyimmunediseasessuchasasthma,atopicdermatitis,eosinophilicgastroenteritis.Someresearchessuggestedthat‐4 ‐ 西南医科大学硕士学位论文GravesDiseasewasanautoimmunitydiseasemediatedbyTh2immunityresponseanditwasfoundthattheinfiltratinglymphocyteinthyroidofGravesDiseasepatientscansecreteTh2cytokinessuchasIL-4，IL-5,IL-10,IL-13.So,whetheILC2involveinthedevelopmentofGravesdiseasebyregulatingTh2immuneresponseornot.ThisstudyaimstoexploretheassociationbetweenILC2andthepathogenesisofGravesDisease.Methods:1.CollectingtheperipheralbloodofpatientsofGravesDiseaseandGravesophthalmopathyandhealthyvolunteersandtheirinformationofage,gender,bloodroutineexamination,thyroidfunctiontests.Besides,isolatingofindividualmononuclearcellandcollectingtheperipheralbloodmononuclearcell（PBMC）andtheupperplasma.2.Cellscultureandexperimentalgroups:Humannormalthyroidfollicularepitheliumcellwereculturedinvitro,stimulatingnormalthyroidcellfor24hourwith50ng/mlrhIL-4or25ng/mlrhIL-13respectively.CollectingthesupernatantandextractingthetotalRNAfromthecellafterstimulation.3.Detections:①ObservethefrequencyofILC2inPBMCbyflowcytometryineachgroup；②ObservetheleveloftheIL-4,IL-5,IL-13inserum:ELISAdetectedthelevelofIL-4,IL-5,IL-13inplasma.③Observethelevelofthethyroidhormonesinsupernatant:ELISAdetectedthelevelofthyroxineandtriiodothyronineinthesupernatantafterrespectivelystimulationof50ng/mlrhIL-4and25ng/mlrhIL-13.④ObservetherelativeexpressionofPKA、CREB、‐5 ‐ 西南医科大学硕士学位论文STAT6、BCl-2inthyroidcell:qRT-PCRdetectedtherelativeexpressionofPKA、CREB、STAT6、BCl-2inthyroidcellunderstimulationof50ng/mlrhIL-4and25ng/mlrhIL-13.4.StatisticalAnalysis:Testthenormalityofthedata,themeasureddataofnormaldistributionareindicatedasmean±standarddeviation(SD).ThemeasureddataofabnormaldistributionareindicatedasthemedianandtheupperandlowerquartileM(P25，P75).AlldataareanalyzedbySPSS20.0statisticalsoftware.Thedataistestedforhomogeneityofvariance,twogroupsmeasurementdataofhomogeneityofvarianceareanalyzedusingindependent-samplesTtest，Multigroupsmeasurementdataareanalyzedusingone-wayanalysisofvariance(ANOVA)，followedbytheLSDposthoctestformultiplecomparisons.Multigroupsmeasurementdataofheterogeneityofvarianceareanalyzedusingnon-parametrictest,followedbytheKruskal-Wallisposthoctestformultiplecomparisons.Binaryvariableareanalyzedusingchi-squaretest.Thesingle-factorcorrelationanalysisusedPearsoncorrelationcoefficienttorepresentthelinearrelationshipbetweenvariablesandindependentvariables.P<0.05wasconsideredsignificant.Results:①Comparedwithnormalcontrolgroup,thefrequencyofILC2inpatientsofGDandGOgroupwasenhancedobviously(P<0.05),andthefrequencyofILC2inpatientsofGOgroupwasabithigherthanGDgroup,buttherewasnosignificantlydifference(P>0.05).②Comparedwithnormalcontrolgroup,thelevelof‐6 ‐ 西南医科大学硕士学位论文IL-4,IL-5,IL-13inplasmainpatientsofGDandGOgroupwasenhancedobviously(P<0.05),andthelevelofIL-4,IL-5,IL-13inplasmainpatientsofGOgroupwasabithigherthanGDgroup,buttherewasnosignificantlydifference(P>0.05).③TherewasnocorrelationbetweenthefrequencyofILC2andwhitebloodcells,neutrophils,lymphocytes.TherewasacorrelationbetweenILC2andTSH,FT4,FT3,aTG,aTPO,butit’slowcorrelation.TherewasapositivecorrelationbetweenILC2andthelevelofIL-4,IL-5,IL-13inplasma.④Comparedwithnormalcontrolgroup,thelevelofthyroxineandtriiodothyronineinthesupernatantunderstimulationof50ng/mlrhIL-4andstimulationof25ng/mlrhIL-13wereenhancedobviously(P<0.05).⑤Comparedwithnormalcontrolgroup,therelativeexpressionofPKA、CREB、STAT6、BCl-2mRNAofcellunderstimulationof50ng/mlrhIL-4andstimulationof25ng/mlrhIL-13wasenhancedobviously(P<0.05).Conclusion:①TheelevatedfrequencyofILC2inPBMCandtheelevatedTh2cytokinesinplasmamayactivateTh2immunityresponseinpatientswithGravesdisease.②Th2cytokinessecretedfromILC2maydirectlystimulatethyroidhormonesecretionofthyroidcells,andinhibitthyroidcellsapoptosis,finallyleadtooccurrenceanddevelopmentofGravesDisease.Keywords:Type2innatelymphoidcells,GravesDisease,Gravesophthalmopathy,Th2cytokines,autoimmunity.‐7 ‐ 西南医科大学硕士学位论文前言Graves病(Gravesdisease，GD)是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病，其特点是在外周血中存在甲状腺自身抗体同时有自身反应性淋巴细胞对于甲状腺的浸润，并可能伴有眼眶以及眶周组织的浸润。Graves病最主要的临床表现包括了高代谢症状、甲状腺弥漫性肿大；血清促甲状腺激素（TSH）浓度降低，甲状腺激素（T3、T4）水平的升高。Graves病和其他自身免疫性疾病相似，有女性较男性发病更频繁，存在家族史等特点。Graves病是引起甲状腺功能亢进的最常见原因，每年的发病约率20-30/10万，约有3％的女性和0.5％[1]的男性在一生中会患此病，发病的高峰期在30岁至60岁之间。而Graves眼病（GravesOphthalmopathy，GO）是Graves病最常见的一种甲状腺腺外表现，其特点是由于眼外肌及眼眶结缔组织的炎性反应及纤维化，导致眼眶内容物体积增大，引起复视、眼球突出、眼睑[2]退缩、球结膜水肿、眶周疼痛、眼球运动障碍、视神经受压等症状。Graves眼病也是一种针对眼眶的器官特异性自身免疫性疾病，其发病Graves病相关，但不完全相同。Graves病发病机制并不完全明确，研究表明表观遗传、环境和免疫学因素均参与GD发病。表观遗传因素在基因和环境之间相互调节，基因可通过环境作用而出现甲基化、乙酰化、去乙酰化、微小[3]RNA的干扰等参与GD的发生。而环境因素主要是指食物中碘、维生[4]素D、硒元素、药物、感染、吸烟、压力、污染、辐射暴露等。大量研究表明免疫反应是GD发生、发展的核心因素。‐8 ‐ 西南医科大学硕士学位论文曾有研究认为Graves病是由体液免疫和细胞免疫共同参与疾病的发生，由于在Graves病患者血清中存在针对促甲状腺激素受体的自身抗体(TRAb)，其可以直接促进甲状腺滤泡细胞的功能以及增生，从而导致甲状腺肿大和甲状腺机能亢进，因此目前认为Graves病是[5]一种主要由体液免疫参与调节的自身免疫反应。TRAb可以模拟TSH生物效应，导致甲状腺细胞分泌激素，其经典途径如下：当TRAb与甲状腺细胞上的TSH受体结合以后，环磷酸腺苷（cAMP）生成增多，同时激活了蛋白激酶A（PKA），cAMP与PKA调节亚基结合以后促使环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）丝氨酸磷酸化，参与细胞核内靶基因的转录调控，最终分泌过多甲状腺激素；而由于甲状腺激素过多，负反馈抑制TSH的生成，但却无法抑制TRAb，形成恶性循环导致甲[6]状腺功能亢进的发生。有研究者发现Th1／Th2细胞比例失衡、异常的细胞因子分泌以及信号传递均会通过导致Graves病的发生发展[7]。由于Graves病患者的外周循环中存在拮抗TSHR的自身抗体（TRAb）可以直接导致甲状腺功能亢进，因此Th2免疫反应可能更能主导GD的发生。体液免疫和细胞免疫均参与在Graves眼病的发病，在GD患[8]者中高达25%的患者会发生眼病。Graves眼病的发生主要是由于眶后的炎症，而眼眶的纤维母细胞是炎症活化的；而纤维母细胞的活化很有可能是由于继发性自身抗体的激活，如TSHR抗体的激活和胰岛[9]素样生长因子（IGF-1）。这些纤维母细胞表达TSH受体，也产生细胞外基质成分以及前体炎症因子，眶外肌的炎症就会导致眼睛活动受限以及眼球的突出。‐9 ‐ 西南医科大学硕士学位论文2型固有淋巴细胞（Type2innatelymphoidcell，ILC2）是由共同淋巴样祖细胞发育而来的一种非B、非T细胞的新型淋巴细胞。-/-ILC2最早发现于2001年，Fort等人将Rag小鼠的脾脏细胞（缺乏成熟的T细胞、B细胞）或者去除T细胞、B细胞的野生型小鼠的脾脏细胞分离出来，通过IL-25诱导后发现它们能够产生IL-4、IL-5、[10]IL-13、免疫球蛋白(Ig)E、IgG1和IgA。在2010年多名学者对[11-13][14]小鼠和人类的这类细胞进行了更深的研究，最开始称这些细胞为2型固有辅助细胞、自然辅助细胞或nuocytes，现在统一命名为2型固有淋巴细胞。ILC2属于固有淋巴细胞家族（ILCs）中的一员，主要由骨髓中的共同淋巴祖细胞发育而来，不表达谱系发育分子Lineage（Lin-），也不表达抗原特异性受体（TCR或BCR），因此与自[14]然杀伤NK细胞和淋巴组织诱导（LTi）细胞一起被称为ILCs。人类的ILC2表面缺乏谱系发育分子Lineage的表达，包括sCD3,[15,CD19,CD94,CD1a,CD11c,CD123,BDCA2,CD14,FceR1,和CD3416]；ILC2细胞表达IL-7Rα(CD127)和人类ILC泛化分子CD161以及[14]唯一的CRTH2（表达在Th2细胞上的趋化因子受体同源分子）。人[17]类ILC2细胞上也表达CD25，其同样也表达在ILC3上。但ILC2不表达ILC-1和ILC3相关标记NKp44(NCR)。此外，与ILC2在小鼠上的表达相似，人ILC2对IL-25，IL-33和胸腺基质淋巴生成素（TSLP）[14,16,能产生相应的反应，这表明在ILC2上存在相应的细胞因子的受体18]ILC2受细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的刺激后可分泌细胞因‐10 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[11,12,子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和双向调节蛋白（简称双调蛋白）17]。ILC2在发育期间始终高表达转录因子GATA结合蛋白3（GATA3），GATA3可以调控IL-13及ST2的表达，因此ILC2s的成熟必需GATA3[16,19]来维持和发挥其正常功能。此外，RORα（维甲酸相关孤核受体α）也是ILC2特征性的转录因子，对维持ILC2在骨髓中分化和外[15]周组织免疫应答起到重要作用。ILC2主要介导Th2免疫应答，可以通过多种效应因子调控不同信号通路，并在抵御寄生虫感染、呼吸道疾病和组织修复中以及炎症的启动、调节和缓解中同样发挥着重要作用。此外，ILC2也在多种疾病的发生中参与重要的作用，如食物过敏，特异性皮炎，哮喘，慢性鼻窦炎，肠道炎症，自身免疫性疾病[20]以及肿瘤的发生发展等。既然Th2免疫反应参与Graves病的发生发展，而ILC2又恰好是Th2免疫反应重要调控中心，那么ILC2是否也会参与Graves病的发生，是否可以通过增加血液循环中的Th2细胞因子如IL-4，IL-5以及IL-13的水平改变机体的免疫状态，导致免疫耐受的降低或者免疫稳态的破坏，促进甲状腺自身抗体的合成和Graves病的发生。ILC2分泌的Th2细胞因子是否直接作用于甲状腺，影响甲状腺胞内甲状腺激素分泌信号通路如cAMP/PKA/CREB,此外是否还会与Graves病的甲状腺肿大有所联系。为了探索ILC2在Graves病及Graves眼病发病中的作用，我们首先通过收集Graves病患者、Graves眼病患者以及健康志愿者的外周血，观察ILC2在外周血单个核细胞中的比例，以及血浆中2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平的差异，并使用重组‐11 ‐ 西南医科大学硕士学位论文人IL-4（rhIL-4），IL-13（rhIL-13）对正常人甲状腺滤泡上皮细胞进行体外刺激，观察ILC2分泌的细胞因子对于甲状腺滤泡上皮细胞的影响，探索ILC2及其分泌的2类细胞因子对于Graves发病的作用，为Graves病的治疗提供新的策略。‐12 ‐ 西南医科大学硕士学位论文材料与方法1.实验对象1.1临床对象选取在2017年8月至2018年1月西南医科大学附属医院内分泌科就诊的30例Graves病患者，其中女性17例，男性13例，平均年龄45，30例Graves眼病患者，其中女性16例，男性14例，平均年龄41岁；所有Graves病患者均符合2008年中华医学会内分泌学分[21]会制定的《中国甲状腺疾病诊治指南》中Graves病的诊断标准；Graves眼病患者符合2006年欧洲Graves眼病专家共识(EUGOCO)的[22]诊断标准，而且没有接受过激素冲击治疗的患者。排除标准：怀孕；其他甲状腺疾病及自身免疫性疾病；肝肾疾病；合并过敏性疾病如支气管哮喘、特发性皮炎、慢性过敏性鼻炎等以及过敏史；恶性肿瘤及严重感染性疾病；使用免疫调节药物、免疫抑制剂及含硒制剂的患者。正常对照组为于西南医科大学附属医院健康体检中心的志愿者，其中女性15名，男性15名，平均年龄43岁，均无甲状腺疾病史，无家族史，无自身免疫性疾病史。以上所有研究对象在进行血液采集之前均得到患者知情与同意并签署知情同意书。所有参与本实验的患者与志愿者均签署知情同意书，其信息严格保密。本实验通过西南医科大学附属医院伦理委员会审核通过，并与中国临床试验中心进行注册，注册号为（ChiCTR-ROC-17014053）。‐13 ‐ 西南医科大学硕士学位论文1.2实验细胞：人正常甲状腺滤泡上皮细胞株（Nthy-ori3-1），购于上海中乔新舟公司。1.3实验试剂与材料：试剂来源Ficoll人单个核细胞分离液天津灏洋生物制品科技有限公司EDTA-K23ml抗凝管广州普阳医疗科技股份有限公司人IL-4ELISA试剂盒杭州联科生物公司人IL-5ELISA试剂盒杭州联科生物公司人IL-13ELISA试剂盒杭州联科生物公司人T3试剂盒北京诚林人T4试剂盒北京诚林LineageCocktail4流式抗体试剂美国BD公司包PE鼠抗人CD127流式抗体美国BD公司AlexaFlour647鼠抗人CD294流美国BD公司式抗体TM5.5PerCP-Cy鼠抗人CD45流式美国BD公司抗体RPMI1640培养液美国GIBCO公司胎牛血清美国GIBCO公司谷氨酰胺美国GIBCO公司总RNA提取试剂盒中国北京天根生化‐14 ‐ 西南医科大学硕士学位论文逆转录试剂盒（5×PCRMix1ml）日本TOYOBO公司RNase-FreeddH2O日本TOYOBO公司2xQuantiNovaSYBRGreenPCR德国QIAGEN公司MasterMix试剂盒琼脂糖西班牙BIOWEST公司50×TAE上海生工生物工程股份有限公司GoldviewⅠ型核酸染料北京索莱宝科技有限公司rIL-4美国PeproTech公司rIL-13美国PeproTech公司1.4主要实验仪器仪器来源生物安全柜西班牙Telstar公司二氧化碳恒温培养箱美国Thermo公司-80℃超低温冰箱美国Thermo公司倒置相差显微镜德国Leica公司低温高速离心机美国Thermo公司Mini-6K微型离心机湖南湘仪实验室仪器有限公司水平摇床美国Thermo公司微量移液器德国Eppendorf公司流式细胞仪美国BD公司凝胶成像系统美国Bio-Rad公司‐15 ‐ 西南医科大学硕士学位论文梯度PCR仪美国Bio-Rad公司qRT-PCR仪德国耶拿公司全波长全自动酶标仪德国Omega公司2.实验方法2.1人外周血单个核细胞（PBMC）分离及血浆的制备(1)使用EDTA-K2抗凝管静脉采集GD、GO患者以及健康志愿者空腹外周血3ml，抽血后立即颠倒混匀。将收集到的血液分为两份，其中1.5ml进行密度梯度离心获得PBMC；另一份进行血浆制备。(2)在离心管中加入3ml人单个核细胞分离液，45°倾斜离心管，用吸管小心吸取血液样本加于分离液的液面上，使两者之间形成一个清晰的界面，500g离心20min，（3）离心后，此时离心管中共4层，其中第二层为环状乳白色单个核细胞层。（4）取另一只离心管，加入10ml生理盐水；吸取单个核细胞层，加入生理盐水中重悬；（5）250g离心10min后弃上清液；再加入5ml生理盐水重悬，250g离心5min后去上清液获得PBMC细胞沉淀。（6）另一份1.5ml血液用3000rpm离心5min后，用巴氏吸管吸取上层血浆于无菌EP管中，-80℃冰箱保存待测。2.2流式细胞检测得到分离好的人单个核细胞后加入人单个核细胞后进行细胞计数，6将细胞浓度调整为5×10个/ml后取200ul细胞悬液加入流式管中。‐16 ‐ 西南医科大学硕士学位论文首先向试管中加入200ul细胞悬液，不加入抗体，作为阴性对照；另外4支试管均加入200ul细胞悬液，并分别加入20ulFITC结合的LineageCocktail4抗体、10ulPE结合的CD127抗体单染、10ulAlexaTM5.5Flour647结合的CD294抗体单染，PerCP-Cy结合的CD45抗体单染，调节荧光通道补偿用，再取一只试管为加入200ul细胞悬液以及同型对照，其他试管作为样本管加入200ul细胞悬液以及4种流式抗体。在所有样本均加入流式抗体后吹打混匀并室温避光孵育30分钟以后上流式细胞仪进行检测。先用空白管、单染管、同型对照管调节荧光通道补偿，再上样本进行细胞检测。对流式检测数据分析时，以FSC为X轴，SSC为Y轴，做散点图，对单个核细胞圈门为P1；以FITC-LineageCocktail4为X轴，PerCP-Cy5.5CD45为Y轴获得Lin-CD45+细胞群，圈为P2；以PE-CD127为X轴，以Alexa647-CD294-+++为Y轴，获得散点图，得到LinCD45CD127CD294细胞。2.3ELISA检测血浆中IL-4，IL-5，IL-13水平。将冻存的血浆从-80℃冰箱中拿出后室温自然融化后，开始进行实验。IL-4，IL-5和IL-13的检测均采用以下方法：（1）标准品的稀释与加样：使用标准品稀释液对标准品进行倍比稀释，每浓度设2个孔。（2）加样：分别设空白孔、未知样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中加待测血浆50μl。（3）温育：用封板后置37℃孵育30分钟。（4）配液：用蒸馏水将30倍浓缩洗涤液稀释后备用。‐17 ‐ 西南医科大学硕士学位论文（5）洗涤：小心撕掉封板膜，吸走液体，每孔加250ul洗涤液，静置半分钟后弃去，如此重复5次。（6）加酶：除空白孔外每孔加入酶标试剂50μl。（7）温育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。（8）显色：洗涤后，每孔先加入显色剂A50μl和显色剂B50μl，37℃避光15分钟。（9）终止：每孔加终止液50μl，终止反应。（10）测定：以空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度（OD值）。（11）计算：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线并计算出直线回归方程式，将OD值带入方程计算出血浆中的IL-4，IL-5，IL-13浓度（图1-3）。y=0.007x+0.0772.5R²=0.9832值1.5OD‐41IL0.500100200300400IL‐4浓度图1.人IL-4标准曲线Figure1.IL-4standardcurveofhuman.‐18 ‐ 西南医科大学硕士学位论文y=0.0081x+0.142.5R²=0.995321.5值1‐5OD0.5IL00100200300IL‐5浓度图2.人IL-5标准曲线Figure2.IL-5standardcurveofhuman.1.41.2y=0.0046x+0.10661R²=0.9992值0.80.6‐13OD0.4IL0.200100200300IL‐13浓度图3.人IL-13标准曲线Figure3.人IL-13standardcurveofhuman.2.4人正常甲状腺滤泡上皮细胞的培养2.4.1溶液配置（1）10%胎牛血清RPMI1640培养基：RPMI1640培养基44.5ml+胎牛血清5ml+青-链霉素0.5ml定容至50ml；混匀后4℃冰箱保存。（2）冻存液按RPMI1640培养基：胎牛血清：DMSO=7：2：1配制，4℃预冷，现配现用。（3）IL-4工作液‐19 ‐ 西南医科大学硕士学位论文开盖前，高速离心20-30秒10000rpm；加入100uL去离子水，溶解为0.1mg/mL浓度；再使用RPMI1640进行稀释至1ug/mL进行分装、冻存。将1ug/mL的IL-4稀释为500ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,10ng/ml，5ng/ml工作液。（4）IL-13工作液开盖前，高速离心20-30秒10000rpm；加入100uL去离子水，溶解为0.1mg/mL浓度；再使用RPMI1640进行稀释至1ug/mL进行分装、冻存。将1ug/mL的IL-13稀释为500ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,10ng/ml，5ng/ml工作液。2.4.2细胞复苏、传代、冻存（1）细胞复苏：紫外线照射超净工作台:20min及通风5min后，将冻存的人正常甲状腺滤泡上皮细胞从-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴箱中至融化，将细胞悬液移至离心管，以1000rpm/min的转速离心5分钟，弃上清，向离心管中加入10%胎牛血清培养基5ml，吹打混匀后移入培养皿，置于37℃、5%CO2培养箱中。约6-8h更换培养基，避免DMSO对细胞造成伤害。（2）细胞传代：当人正常甲状腺滤泡上皮细胞生长至70%-80%左右时，弃原有培养基，用无菌生理盐水3ml漂洗3次，弃生理盐水。向培养皿中加入1ml0.25%胰酶消化液并轻微晃动，在显微镜下观察待细胞形态变为圆形后，立即加入8-10ml正常培养液终止消化并反复吹打贴壁细胞使其形成细胞悬液，分装至培养皿或是移入6孔板做好标记并置于37℃，5%CO2培养箱。‐20 ‐ 西南医科大学硕士学位论文（3）细胞冻存：待细胞生长密度达90%左右时将细胞同前消化，移入离心管中离心（1000rpm，5min），弃上清液，加入提前在4℃冰箱预冷的细胞冻存液（4-6ml），充分吹打混匀后分装入冻存管，置于4℃冰箱30min后移入-20℃冰箱30min，最后移入-80℃低温冰箱中保存。2.4.3MTT法检测细胞活性（1）细胞密度在长到约90%，胰酶消化细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。将细胞悬液制备好后，每孔加入100ul,这样细胞的密度为5000-10000/孔（边缘孔用生理盐水填充），同时设置调零孔，对照孔。（2）将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，待细胞贴壁后吸走上清液，加入100ul不同浓度梯度的IL-4和IL-13。（3）5%CO2，37℃孵育24，倒置显微镜下观察药物的作用效果（4）每孔加入0.5%10ulMTT溶液，继续培养4h后终止培养，直接在每孔加入100ul三联溶解液（SDS），放入培养箱中继续孵育4小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。（5）使用酶标仪所测得的吸光度值，按（实验组OD-空白组OD）/（溶剂对照组OD-空白组OD）的公式计算，得到的每组的最终计算值。2.4.4细胞实验分组：本实验将人正常甲状腺滤泡上皮细胞分为3组（1）正常对照组（NC组）‐21 ‐ 西南医科大学硕士学位论文（2）IL-4组：50ng/mlrhIL-4组干预24h（3）IL-13组：25ng/mlrhIL-13组干预24h2.4.5ELISA检测细胞上清液中T3，T4水平（1）细胞培养、种板及干预同前，将干预的各组细胞培养液吸入无菌离心管中，于离心机中离心，转速为2500rpm/min，离心20分钟。将离心后所得的细胞培养上清液分装于做好标记的无菌EP管中，存放于-20℃冰箱中将冻存的细胞上清液从-20℃冰箱中拿出后室温自然融化后，开始进行ELISA检测。（2）从4℃冰箱中取出试剂盒，放置30分钟后使用。（3）标准品的稀释与加样：用标准品稀释液对标准品进行倍比稀释。（4）加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加入被测上清液。（5）温育：封板后置37℃温育30分钟。（6）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。（7）洗涤：小心撕掉封板膜，弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次。（8）加酶：除空白孔外每孔加入酶标试剂50μl。（9）温育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。（10）显色：洗涤后，每孔加入显色剂A50μ和显色剂B50μl，37℃避光显色15分钟。（11）终止：每孔加终止液50ul。‐22 ‐ 西南医科大学硕士学位论文（12）测定：以空白空调零，450nm波长测量各孔的吸光度（OD值）。（13）计算：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线并计算出直线回归方程式，将OD值带入方程计算出血浆中的T3、T4浓度（图4，图5）。y=0.0226x+0.19172R²=0.98681.5值OD1T40.50050100T4浓度图4.人T4标准曲线Figure4.T4standardcurveofhumany=0.1394x+0.112.5R²=0.99852值1.5OD1T30.5001020T3浓度图5.人T3标准曲线Figure5.T3standardcurveofhuman2.5qPCR检测PKA、CREB、STAT6、Bcl-2表达2.5.1引物的设计和合成‐23 ‐ 西南医科大学硕士学位论文以基因GAPDH为内参对照基因方向和序列长度PKA174bp上游：5'-gCCTATggCgTCCTgTTg-3'下游：5'-CCgCTTggCTgggTgTTT-3'CREB143bp上游：5'-AgCCgAgAACCAgCAgAg-3'下游：5'-TTACggTgggAgCAgATg-3'STAT6214bp上游：5'-CCTCgTCACCAgTTgCTT-3'下游：5'-TCCAgTgCTTTCTgCTCC-3'BCL-2149bp上游：5'-TgTggCCTTCTTTgAgTTCg-3'下游：5'-CTACCCAgCCTCCgTTATCC-3'GAPDH106bp上游：5'-GGACTCCTCCACCTTTg-3'下游：5'-CACCACCCTgTTgCTgT-3'2.5.2总RNA的提取（1）将6孔板细胞取出，收集上清液，用4℃冰箱预冷的无菌PBS洗涤细胞3次并吸净PBS，每孔加入裂解液1ml，反复吹打至透明。（2）室温下静置5min，转入无酶EP管中，将200μl氯仿中加入管中，剧烈振荡15s，于室温静置3min。（3）4℃的低温离心10min（12000rpm/min）后分成三相：无色水相层，中间层，黄色有机层，从上层吸取约400μl溶液转移到无酶EP管中。（4）向EP管中加入200μl无水乙醇，混匀后转入吸附柱中，12000rpm/min，4℃离心1min，弃去废液。再向吸附柱中加入500μl去蛋白液RD，12000rpm/min，4℃离心1min，再次弃去废液。（5）向吸附柱中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12000‐24 ‐ 西南医科大学硕士学位论文rpm/min，4℃离心1min，弃去废液。重复两次。（6）将吸附柱放入收集管，12000rpm/min，4℃离心2min，晾干2min。（7）将吸附柱置于新的无酶EP管中，加入60μlRNase-freeddH2O，室温放置2min后4℃离心2min，12000rpm/min。各组取2μl测定RNA浓度及OD值，立即取部分产物进行逆转录，其余可保存于-80℃冰箱。2.5.3逆转录DNA（cDNA）合成(1)将上步取得的部分RNA产物放入事先设好为65℃水浴箱下变性5min后立即置于冰上，配置每管10μl反应液的反应体系：样品RNA0.5ug5×RTMasterMix2μlTotal:10μlNuclease-Freewater定容至10μl(2)将配制好的逆转录反应混合液放入PCR仪中进行逆转录反应：37℃15min50℃5min×1cycle98℃5min2.5.4荧光定量PCR扩增反应（1）自然融解2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix、cDNA、引物、以及RNase-Free水。配置每管20μl反应液的反应体系：2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix10μl引物11.4ul‐25 ‐ 西南医科大学硕士学位论文引物21.4ul20μlcDNA样品≤100ng/次反应RNase-Free水定容至20μl（2）充分混匀,放入qPCR扩增仪中按下列条件进行cDNA扩增反应：PCR初始活化步骤95ºC2min两步循环变性95ºC5s退火/延伸步骤60ºC10s×35cycle激活熔解曲线图6.PKA熔解曲线Figure.6MeltingcurveofPKA图7.CCREB熔解曲线Figure.7MeltingcurveofCREB‐26 ‐ 西南医科大学硕士学位论文图8.STAT6熔解曲线Figure.8MeltingcurveofSTAT6.图9.BCl-2熔解曲线Figure.9MeltingcurveofBCL-2图10.GAPDH熔解曲线Figure.10MeltingcurveofGAPDH3.统计学分析对数据进行正态性检验，正态分布的计量资料用均数数±标准差（x¯±s）表示，非正态计量资料用中位数和上下四分位数M(P25，P75)表示，应用统计软件SPSS22.0进行数据分析，对数据进行方差齐性检‐27 ‐ 西南医科大学硕士学位论文验，方差齐性的两组计量资料进行独立样本T检验，多组计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法；方差不齐的多组计量资料则组间比较采用Kruskal-WallisH秩和检验，二分类变量采用卡方检验；单因素相关性分析采用Pearson相关系数表示变量与自变量的线性关系，P<0.05认为差异具有统计学意义。‐28 ‐ 西南医科大学硕士学位论文结果1.三组研究对象一般资料比较与正常对照组相比，GD组以及GO组患者在年龄、性别，以及白细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞数目上均无统计学差异（P＞0.05，表1）。表1.NC组、GD组、GO组的一般资料Table.1InformationofGroupofNC,GD,GO.组别年龄白细胞数淋巴细胞数性别99（岁）（×10/L）（×10/L）NC组(n=30)43.808±13.2795.709±1.4071.955±0.579男15女15GD组(n=30)45.000±11.4465.968±1.9991.967±0.641男13女17GO组(n=30)41.667±12.2856.124±2.2421.951±0.736男14女16F值0.5180.3230.0042值0.268P值0.5980.7250.9960.8752.三组研究对象甲状腺功能以及甲状腺自身抗体比较与正常对照组相比，GD组和GO组的TSH、FT3、FT4、aTPO，aTG均有统计学差异，而GD组与GO组的TSH、FT3、FT4、aTPO，aTG无明显统计学差异（P＞0.05，表2）。表2.NC组，GD组，GO组的甲状腺功能与甲状腺自身抗体Table.2ThyroidfunctionandthyroidautoantibodyofGroupofNC,GD,GO.组别NC组（n=30）GD组（n=30）GO组（n=30）H值P值aaTSH2.324(1.276,3.081)0.010(0.010,0.015)0.015(0.010,0.077)48.8120.000(mIU/L)aaFT32.230(1.878,2.628)9.180(5.950,17.855)8.960(6.323,17.875)36.7080.000(pg/ml)‐29 ‐ 西南医科大学硕士学位论文aaFT41.140(0.998,1.182)3.020(2.260,4.725)2.580(1.390,6.008)51.5020.000(ng/dl)aTPO0.500(0.500,0.525)305.470(11.660,848.12513.470(213.690,975.1335.4100.000aa(IU/ml)0)0)aaTG0.120(0.120,8.392)521.765(129.948,962.1513.870(60.4,1013.400)40.8210.000a(IU/ml)18)注：a:P<0.05vsNC组3.三组外周血ILC2含量流式检测结果与正常对照组（0.383±0.192‱）相比，GD组（1.176±0.417‱）和GO组（1.423±0.534‱）的ILC2明显升高，且差异异均有统计学差异（P＜0.05），而GD组与GGO组的ILC2无统计学差异（P>0.05，图11-14）图11.NC组ILC2流式结果Figure.11FrequencyofILC2inNCGroup.图12.NC组ILC2流式结果Figure.12FrequencyofILC2inGDGroup.‐30 ‐ 西南医科大学硕士学位论文图13.NC组ILC2流式结果Figure.13FrequencyofILC2inGOGroup.2.5）‱2**1.5中的比例（1PBMC0.5在ILC20NCGDGO注：*::P<0.05vsNC组,,图14.NC组、GD组、GO组ILC2流式结果统计Figure.14FrequencyofILC2inNC,GD,GOGroup.4.三组血浆中IL-4，IL-5，IL-13水平的ELISA结果与正常对照组相比，GD患者与GO患者血浆中IL-4，IL-5，IL-13水平均明显升高，差异有统计学差异（P<0.05）；但GD组与GO组患者血浆中IL-4，IL-5，IL-13无统计学差异差（P>0.05，表3，图15-17）。‐31 ‐ 西南医科大学硕士学位论文表3.NC组，GD组，GO组血浆IL-4，IL-5，IL-13水平Table.3.TheconcentrationofIL-4,IL-5,IL-13inplasmaofNC,GDD,GOGroup.组别NC组GD组GO组H值P值样本数303030aaIL-4(ng/L)24.810±8.57950.630±16.30055.019±12.15821.8790.000aaIL-5(ng/L)1.003±0.4971.864±0.5193.055±1.27922.8360.000aaIL-13(ng/L)1.070±0.3504.120±1.6605.152±2.09040.5530.000注：a:P<0.05vsNC组80）L70**ng/605040水平（‐4302010血浆中IL0NCGDGO注:*:P<0.05vsNC组,图15.NC组，GD组，GO组血浆IL-4水平Figure.15TheconcentrationofIL-4inplasmaofNC,GD,GOGroup.5*）L4ng/（3*水平‐521血浆中IL0NCGDGO注*:P<0.05vsNC组图16.NC组，GD组，GO组血浆IL-5水平Figure.16TheconcentrationofIL-5inplasmaofNC,GD,GOGroup.‐32 ‐ 西南医科大学硕士学位论文8*）7*6ng/L54水平（3‐13IL21血浆中0NCGDGO注*:P<0.05vsNC组图17.NC组，GD组，GO组血浆IL-13水平Figure.17TheconcentrationofIL-13inplasmaofNC,GD,GOGroup.5.相关性分析对外周血单个核细胞中ILC2与白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞以及甲功5项进行相关性分析，结果发现ILC2与白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞没有相关性（P>0.05）,但ILC2与TSH、FT3、FT4、aTPO、aTG存在相关性（P＜0.05），但相关性不显著。对外周血单个核细胞中ILC2和血浆中IL-4、IL-5、IL-13进行Pearson相关分析，结果发现ILC2的比例和与IL-4水平呈正相关2（Pearson相关系数=0.769，P=0.000，R=0.592，图18）；ILC2的比例和与IL-5水平呈正相关（Pearson相关系数=0.773，P=0.000，R2=0.597，图19）；ILC2的比例和与IL-13水平呈正相关（Pearson2相关系数=0.759，P=0.000，R=0.576，图20）；‐33 ‐ 西南医科大学硕士学位论文图18.ILC2与IL-4相关分析散点图Figure.18CorrelationanalysissscatterdiagrambetweenILC2andIL-4.图19.ILC2与IL-5相关分析散点图Figure.19CorrelationanalysisscatterdiagrambetweenILC2andIL-5‐34 ‐ 西南医科大学硕士学位论文图20.ILC2与IL-13相关分析散点图Figure.20CorrelationanalysisscatterdiagrambetweenILC2andIL-136.MTT检测细胞活性不同浓度rhIL-4干预甲状腺上皮细胞24h活性的检测，发现各浓度对细胞没有明显的毒性，差异有统计学意义（P＞0.05，表4，图21）。不同浓度rhIL-13干预甲状腺上皮细胞24h活性的检测，发现各浓度对细胞没有明显的毒性，差异无统计学意义（P＞0.05，表4，图22）。表4.不同浓度IL-4、IL-13对甲状腺上皮细胞干预24h对细胞活性的影响。Table.4MTTdetectedtheeffectsofdifferentconcentrationsofIL-4andIL-3oncytotoxicityofhumannormalthyroidcellat24h浓度样本IL-4IL-131ng/ml30.776±0.1190.917±0.0165ng/ml30.826±0.0590.939±0.06810ng/ml30.822±0.0430.935±0.05925ng/ml30.809±0.0310.9885±0.020a50ng/ml30.912±0.0430.9778±0.022a1000ng/ml30.864±0.0120.939±0.037‐35 ‐ 西南医科大学硕士学位论文200ng/ml30.919±0.0250.939±0.030F值2.6381.097P值0.0640.411注：a：P<0.05vs1ng/ml组‐1.00.9组OD0.8剂对照0.7（溶））/0.6OD组0.5空白组OD0.4‐空白1ng/ml5ng/ml10ng/ml25ng/ml50ng/ml100ng/ml200ng/ml（实验组OD不同浓度rhIL‐4对甲状腺上皮细胞毒性影响图21.不同浓度rhIL-4对甲状腺上皮细胞干预24h对细胞活性的影响Figure.21MTTdetectedtheeffectsofdifferentconcentrationsofrhIL-4oncytotoxicityofhumannormalthyroidcellat24h1.1组1.0剂对照0.9（溶））/0.8OD组0.7‐空白组OD‐空白OD0.60.5（实验组OD0.41ng/ml5ng/ml10ng/ml25ng/ml50ng/ml100ng/ml200ng/ml不同浓度rhIL‐13对甲状腺上皮细胞活性影响图22.不同浓度rhIL-13对甲状腺上皮细胞干预24h对细胞活性的影响Figure.22MTTdetectedtheeffectsofdifferentconcentrationssofrhIL-13oncytotoxicityofhumannormalthyroidcellat24h‐36 ‐ 西南医科大学硕士学位论文7.IL-4干预后甲状腺上皮细胞上清液T3、T4水平f与对照组细胞相比，在500ng/mlrhIL-4刺激甲状腺细胞24h后，上清液的T3水平和T4水平均明显升高，且有统计学差异（P<0.05，表5，图23、24）。表5.50ng/mlIL-4刺激24h后上清液激素水平Table.5TheconcentrationsofT3,T4oofsupernatantunder50ng/mlrhIL-4stimulationfor24h.组别NC组50ng/mlIL-4T值P值样本数33T3(pmol/L)0.083±0.0410.273±0.047-3.44700.026T4(pmol/L)8.440±2.25114.528±0.507-4.57000.0100.350.3水平T30.25液0.2上清0.150.1干预后0.05‐4IL0NCIL‐4注*:P<0.05vsNC组,图23.IL-4刺激24h后上清液T3水平Figure.23TheconcentrationsofT3ofsupernatantunder50ng/mlrhIL-4stimulationfor24h.‐37 ‐ 西南医科大学硕士学位论文16平14T41210864干预后上清液‐42IL0NCIL‐4注*:P<0.05vsNC组,图24.IL-4刺激24h后上清液T4水平Figure.24TheconcentrationsofT4ofsupernatantunder50ng/mlrhIL-4stimulationfor24h.8.IL-13干预后甲状腺上皮细胞胞上清液T3、T4水平与对照组细胞相比，在25ngg/mlrhIL-13刺激甲状腺细胞24h后，上清液的T3水平和T4水平均明显升高，且有统计学差异（P<0.05，表6，图25、26）。表6.25ng/mlIL-13刺激24h后上清液激素水平Table.6TheconcentrationsofT3,T4ofsupernatantunder25nng/mlrhIL-13stimulationfor24h组别NC组25ng/mlIL-13T值P值样本数55T3(pmol/L)0.083±0.0410.665±0.138-7.1180.026T4(pmol/L)8.440±2.25121.368±2.000-7.7710.010‐38 ‐ 西南医科大学硕士学位论文0.90.8水平T30.70.60.50.40.3干预后上清液0.2‐130.1IL0NCIL‐13注*:P<0.05vsNC组图25.rhIL-13刺激24h后上清液T3水平Figure.25TheconcentrationsofT3ofsupernatantunder25ng/mlrhIL-13stimulationfor24h25T420液15后上清预10干‐135IL0NCIL‐13注*:P<0.05vsNC组图26.IL-13刺激24h后上清液T4水平Figure.26TheconcentrationsofT4ofsupernatantunderrh25ng/mlIL-13stimulationfor24h9.IL-4刺激甲状腺上皮细胞PKA、CREB、STAT6、BCL-2的的mRNA表达与对照组细胞相比，rhIL-4刺激甲状腺细胞24h后PKA、CREB、STAT6、BCL-2的mRNA相对表达量较正常组明显升高，且差异有统计‐39 ‐ 西南医科大学硕士学位论文学意义（P<0.005，表6，图27、28）。图27.50ng/mlrhIL-4干预24h后PKA、CREB、STAT6、BCL-2的扩增曲线Figure.27TheamplificationcurvesofPKA、CREB、STAT6、BCL-2under50ng/mlIL-4sttimulationfor24h表7.50ng/mlrhIL-4刺激24h后PKA、CREB、STAT6、BCL-2的mmRNA相对表达量Table.7RelativeexpressionofPKA、CREB、STAT6、BCL-2mRNAunder50ng/mlrhIL-4stimulationfor24h组别NC组50ng/mlIL-4T值P值样本55PKA1.075±0.6772.792±0.772-2.8960.044CREB1.217±0.9714.395±0.995-3.9610.017STAT61.000±0.4242.316±0.647-2.9450.042BCL-21.181±0.8453.778±1.260-2.9660.041‐40 ‐ 西南医科大学硕士学位论文NC6IL454321干预后个基因相对表达‐40ILPKACREBSTAT6BCL‐2注*:P<0.05vsNC组图28.50ng/mlrhIL-4刺激24h后PKA、CREB、STAT6、BCL-2的mRNA相对表达图Figure.28RelativeexpressionofPKA、CREB、STAT6、BCL-2mRNAunder50ng/mlrhIL-4stimulationfor24h10.IL-13刺激甲状腺上皮细胞24h后PKA、CREB、STATT6、BCL-2的mRNA表达与对照组细胞相比，IL-4刺激甲状腺细胞24h后PKA、CREB、STAT6、BCL-2的mRNA相对表达量较正常组明显升高，且差异有统计学意义（P<0.05，表7，图29、30）。图29.25ng/mlrhIL-13干预24hh后PKA、CREB、STAT6、BCL-22的扩增曲线Figure.29TheamplificationcurvesofPKA、CREB、STAT6、BCL-2under25ng/mlrhIL-13stimulationfor24h‐41 ‐ 西南医科大学硕士学位论文表8.25ng/mlrhIL-13刺激24h后PKA、CREB、STAT6、BCL-2的mRNA相对表达量Table.7RelativeexpressionofPKA、CREB、STAT6、BCL-2mRNAunder50ng/mlrhIL-13stimulationfor24h组别NC组25ng/mlIL-13T值P值样本n=5n=5PKA1.011±0.1901.581±0.278-2.9300.043CREB1.000±0.0221.608±0.297-3.5330.024STAT61.012±0.1961.745±0.378-2.9830.041BCL-21.012±0.2001.854±0.226-4.8330.0082.5NCIL1321.510.5‐13干预后各基因相对表达IL0PKACRREBSTAT6BCL‐2注*:P<0.05vsNC组图30.25ng/mlrhIL-13刺激24h后PKA、CREB、STAT6、BCL-2的mRNA相对表达Figure.30RelativeexpressionofPKA、CREB、STAT6、BCL-2mRNAunder25ng/mlrhIL-13stimulationfor24h‐42 ‐ 西南医科大学硕士学位论文讨论Graves病是一种器官特异性的自身免疫性疾病，主要的临床特点是甲状腺弥漫性肿大，甲状腺毒症的发生，以及眼眶周围组织的浸润[23]。到目前为止GD的发病机制并不完全清楚，但大量研究表明其与[24]环境因素、遗传基因、免疫因素等均对于GD的发病有所影响。ILCs是近年来发现的新型造血细胞和固有免疫调节的家族，虽然这些细胞在形态上和B细胞和T细胞是相似的，但它们既不是T细胞，也不是B细胞；而其中的ILC2受细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的刺激后[11,12,17]可分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和双调蛋白。ILC2主要介导Th2免疫应答，可以通过多种效应因子调控不同信号通路，并在抵御寄生虫感染、呼吸道疾病和组织修复中以及炎症的启动、调节和缓解中同样发挥着重要作用发挥重要作用。此外，ILC2也在多种疾病的发生中参与重要的作用，如食物过敏，特异性皮炎，哮喘，慢性鼻窦炎，肠道炎症，自身免疫性疾病以及肿瘤的发生发展等。而Graves病与Th2类免疫关系密切，本文就Graves和ILC2之间的联系进行讨论。1.Graves病、Graves眼病与Th2免疫反应Graves病是常见的内分泌疾病，也是最常见的器官特异性自身免疫疾病。虽然到目前为止，Graves病的发病机制并不完全清楚，但是许多研究表明机体免疫状态的异常是导致疾病发生的核心因素。曾有研究提出Th1和Th2细胞平衡的改变可能在GD的发生机制种扮演重要角色。Th1细胞主要产生Th1细胞因子IL-2、TNF-β和IFN-γ，‐43 ‐ 西南医科大学硕士学位论文并介导细胞免疫、细胞毒性T细胞（CTL）、巨噬细胞活化以及迟发性超敏反应（DTH），可以清除胞内寄生菌的感染。Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等Th2细胞因子，并参与体液免疫的调节；Th2细胞分泌的IL-4能促进B细胞的增殖和诱导抗体的产生以及Th2细胞的分化；主要与变态反应性疾病有关，如过敏性[25]皮炎、过敏性哮喘等。然而，在Graves病到底是细胞免疫或者体液免疫引起的自身免疫现象还是共同作用的结果还有争议。桥本氏甲状腺炎被普遍认为是Th1免疫反应参与发病，Th1淋巴细胞激发严重的淋巴细胞炎症浸润甲状腺导致激发甲状腺炎和甲状[26]腺破坏。Graves病常被认为是Th2免疫反应主导的疾病并且有研究发现在Graves病患者的甲状腺中浸润的淋巴细胞可以分泌IL-4，IL-5,IL-10,IL-13等Th2细胞因子，同时Th2免疫反应可以持续增加针对TSHR的自身抗体(TRAb)刺激甲状腺滤泡细胞的生长和功能,[27]这样的结果也支持Graves病与抗体调节的免疫反应关系更密切。但有趣的是，人TSH受体刺激抗体（TSAb）主要是IgG1—人类Th1[28]反应的一种免疫球蛋白亚型。因此Graves病与Th1和Th2免疫反[29]应之间的关系还存在一定的争议。Ueda等人研究发现GD患者外周血中产生IL-4的淋巴细胞的数目明显增多，而产生IFN-γ的淋巴细胞数目降低，同时在使用促甲状腺激素受体合成肽对外周血淋巴细胞进行体外刺激后发现IL-4的产生明显增加，这样的结果说明在Graves病患者体内受TSH-R诱导后[30]Th2类细胞群数目明显升高，而在这些患者中体液免疫占主导地位。‐44 ‐ 西南医科大学硕士学位论文另有研究者对GD患者血清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-15和IL-18等细胞因子表达进行检测，发现与对照组比较，Th2细胞分泌的IL-4、IL-5的水平升高，同样也认为Th2对GD的发病起至关[29][31]重要的作用。Dogan等人通过Graves病动物模型（EAGD）对于Graves病的免疫紊乱进行了探讨，发现IL-4基因敲除以后小鼠能够抵制EAGD的发展，而IFN-γ敲除后的小鼠在存在大量IL-4的情况下既不会增加疾病的严重程度也不会缩短临床发病的时间；这样的结果表明IL-4对于EAGD的发展是有促进的作用的，虽然IL-4水平的减少并不能完全影响疾病的发展，但在IL-4敲除的小鼠中，IL-4的缺乏却能阻断Graves病的发展，这表明对Il-4的持续抑制可能成为一种更完整和持续的治疗方法；同时也表明Graves病与Th2免疫反应更密切。而本次研究同样发现在GD患者血浆中Th2类细胞因子IL-4，IL-5，IL-13水平较健康志愿者明显升高，这再次证明Th2免疫反应参与了Graves病的发生并可能在调节Graves病的发展中有重要作用。Graves眼病的发生被认为与炎症过程联系紧密，而细胞因子在Graves眼病的发生过程中有重要的作用。研究者们认为淋巴细胞和肥大细胞会迁移到眶周组织，这些细胞产生的因子有助于组织的反应和重构。但是到底哪种表型的T淋巴细胞在活化Graves眼病发展的过程中起主要作用却还是存在争议。有研究对Graves眼病患者眼部[32]结缔组织和眼外肌中均发现了Th1细胞和Th2细胞的累积，同时在[33][34]受累的眶周组织中也有大量的Th1和Th2细胞。王丽等人的研究发现在静止期的Graves眼病患者血浆中的IL-4水平较正常组有所‐45 ‐ 西南医科大学硕士学位论文升高，但当Graves眼病从静止期向活动期发展的过程中其IL-4水平会有所降低。与IFN-γ相似，Th2细胞因子IL-4会刺激眶后组织纤维母细胞的增生，但与IFN-γ不同的是，IL-4还可以促进IV类胶原[35]而不是透明质酸的合成。另有Wakelkamp等人选取疾病处于活动期及静止期的Graves眼病患者进行研究发现，体外培养其眼眶成纤维细胞，发现Graves眼病患者眼眶成纤维细胞在活动期以分泌Thl型细胞因子为主，而Th2类细胞因子与疾病进程无直接相关性。在本次研究中发现Graves眼病患者外周血中Th2类细胞因子IL-4，IL-5，IL-13水平较健康志愿者明显升高，循环中Th2类细胞因子水平升高表明Th2类免疫可能也参与了Graves眼病的发生，但结合以上研究似乎GO发生与Th1型免疫关系或更为密切。2.ILC2与Graves病以及Graves眼病ILCs（Innatelymphoidcells）是近年来发现的新型造血细胞和固有免疫调节的家族，在所有ILCs的发育过程中Id2（DNA抑制子2）是细胞分化所必须的，这也表明所有固有淋巴细胞均来源于共同的祖[36,37]细胞。ILC2是ILC家族中分泌Th2细胞因子的细胞，在ILC2的发育中IL-7是必须的。ILC2在人类机体中被第一次发现是在胎儿的肠道组织中，接着也在血液、肺脏，特别是慢性鼻窦炎患者的鼻息肉中被发[38,39]现。所有ILC2受到IL-25，IL-33以及胸腺基质淋巴细胞素(TSLP）刺激以后均能产生Th2细胞因子，主要包括IL-4,IL-5，IL-13还有[38]双调蛋白，这些反应可能涉及哮喘、过敏和宿主对抗线虫的机制‐46 ‐ 西南医科大学硕士学位论文ILC2是目前在过敏反应、自身免疫、代谢综合征中研究许多的新型淋巴细胞，但是关于Graves病以及Graves眼病与ILC2的研究却十分有限。于是本次研究对Graves病以及Graves眼病患者外周血单个核细胞中ILC2的比例进行检测，结果发现Graves患者以及Graves眼病外周血中的ILC2与健康对照组患者外周血中ILC2相比是显著升高的，虽然Graves眼病患者外周血中的ILC2较Graves病组有所升高，但两者差异没有统计学意义。其实这样的结果与我国学者纪晓昀[40]的研究结果相似，其研究同样发现Graves病患者外周血中ILC2比例较对照组是明显升高的，此外还对外周血中ILC2细胞的相关细胞因子进行了检测，人外周血单个核细胞中的T1/ST2（IL-33受体)、IL-17RB（IL-25受体）以及ILC2细胞表面标记ICOS（共刺激分子）、CD45以及IL-5和IL-13的mRNA表达水平明显高于健康对照组，而转录因子RORα的mRNA水平有明显上升的趋势；除此之外，IFN-γ和T-bet(Th1细胞因子的转录因子)也被观察到较健康对照组显著[41]降低。张淡宜等人用qPCR法检测桥本氏甲状腺炎（HT）患者外周血ILC2特征性细胞因子和转录因子的表达水平，发现HT患者外周血单个核细胞中ILC2特征性转录因子RORα和IL-13的mRNA明显增加，且与血清aTG及aTPO自身抗体水平的显著升高呈现明显正相关，这也说明ILC2与桥本甲状腺炎的发生也存在一定的联系。可见ILC2与甲状腺疾病如Graves病和桥本甲状腺炎之间可能存在某些联系，但在本次研究中对ILC2与甲状腺自身抗体aTG和aTPO进行相关分析后，并没有发现显著的相关性。到目前为止ILC2如何影响Graves病‐47 ‐ 西南医科大学硕士学位论文的发病目前还不是特别明确，而ILC2的升高至少提示Graves病患者免疫状态的异常，尤其是Th2免疫反应的活化，可能刺激B细胞的活化并导致自身抗体的产生，另外还会辅助体液免疫应答而促进TRAb的产生，从而加速Graves病的发生。而到目前为止还没有发现有关于ILC2与Graves眼病之间的研究，但通过我们研究发现Graves眼病患者ILC2也较正常组明显升高；与Graves病组相比，Graves眼病组ILC2水平没有显著升高，这提示ILC2可能参与了Graves病发病，并且参与Graves眼病的调节，这样的结果也提示Graves病与Graves眼病的发生存在一定关联，但Graves眼病的发病机制更为复杂，还需要更加深入的研究进行探讨。3.ILC2分泌的2类细胞因子和Graves病本次研究为了探究ILC2对Graves病的发生发展的影响，Graves病与Graves眼病患者以及健康志愿者的外周血血浆中的IL-4，IL-5，IL-13水平进行了ELISA检测，结果表明与健康对照组相比，Graves病组、Graves眼病组患者血浆IL-4明显升高，但Graves眼病组与Graves病组无明显差别；同样血浆中IL-5和IL-13的水平也有同样的趋势。同时对患者ILC2与血浆中的IL-4，IL-5和IL-13进行相关分析，结果发现外周血中ILC2与血浆中IL-4、IL-5和IL-13显著相关，所以可以推测IL-4、IL-5、IL-13的升高可能与ILC2比例的增加相关，因此在Graves病与Graves眼病中这些因子异常的升高以及其发挥其生物效应与ILC2的增加有关。IL-4是由ILC2分泌的重要细胞因子。本次研究发现与健康对照‐48 ‐ 西南医科大学硕士学位论文组相比，Graves病组、Graves眼病组患者血浆IL-4明显升高，但Graves病组和Graves眼病组之间无统计学差异。其实对于Graves病与Graves眼病患者血浆中细胞因子的研究并不少，Al-Humaidi等[42]人对28名Graves病患者和30名正常人的血清中的IL-4进行了ELISA检测发现Graves病患者的IL-4水平明显高于正常人，当然也发现IFN-γ、IL-6、TNF-α的水平也较正常人升高，这也表明了Th1淋巴细胞和Th2淋巴细胞均活化，同时参与了Graves病的发生，这[43]与特定的THSR抗体产生以及细胞免疫调节组织破坏有关。SongR.H等人也对难治性Graves病和恢复期Graves病患者进行血浆中以及外周血中单个核细胞进行培养并取上清液进行IL-4、IL-6、IL-10的ELISA检测发现难治性Graves病患者的IL-4水平也较恢复期Graves病的水平明显升高，同时对外周血中单个核细胞中IL-4、IL-6、IL-10的mRNA水平检测，也得到同样的结果，这也表明在服用抗甲状腺药物的治疗期间，IL-4、IL-6、IL-10的持续过度表达可以使疾病持续活跃，也可能通过放大其他的炎性细胞因子的功能，诱导自身免疫反[44]应或增加对药物的抗性。以上研究结果与本次研究的结果一致的，均发现GD患者外周血中IL-4水平较正常人有所升高。IL-5也是ILC2分泌的Th2类细胞因子。IL-5能参与嗜酸性粒细[45][46]胞的发展、活化、生存，IL-5也在糖代谢，浆细胞生存，伤口[47][48]愈合，寄生虫感染方面有调节作用。本次研究发现与健康对照组相比，Graves病组、Graves眼病组患者血浆IL-5明显升高，但Graves病组和Graves眼病组间无统计学差异。我国研究者申勇对于初诊‐49 ‐ 西南医科大学硕士学位论文Graves病患者以及治愈的患者血清中IL-5进行ELISA检测，初诊组患者血清IL-5显著高于正常水平，然而治愈组患者血清中降至正常水平，IL-5作为Th2类细胞因子，这一变化提示在Graves病的免疫[49][50]应答从Th1免疫反应转为Th2免疫反应。早在1998年就有学者对Graves病患者外周血血清中检测发现其IL-5水平较正常组有所升高，但其升高与血清中FT4水平无明显相关性，但这也暗示大家Th2类免疫反正在Graves病的发病机制中可能存在重要作用。Pedro等[51]人对治疗前后的GD患者与正常对照组的血清中IL-5，IL-1β，IL-6进行了检测，发现未经治疗的GD患者有明显升高的IL-5、IL-1β，IL-6水平，而经过MMI的治疗以后IL-5、IL-1β，IL-6水平显著降低至对照组相似的水平。未经治疗的GD患者血浆中IL-5明显升高而但甲状腺功能恢复正常时IL-5水平却又有所降低，这表明在GD的发[51]生过程中存在细胞因子平衡的改变。Gopalakrishnan等人研究发现GD患者中血清中IL-5水平较正常组明显升高，但同样没有发现IL-5水平与T4、TSH存在明显相关；IL-5的血浆水平提示在GD的免[52]疫过程中Th2反应占主要地位。IL-13同样是ILC2分泌的重要细胞因子之一。IL-13是一种非常[53]多效性的细胞因子，对于不同的靶细胞可能有促炎或者抗炎效应。IL-13能促进杯状细胞增生和分泌粘液同时促进内皮细胞产生嗜酸细[54]胞活化趋化因子。同时IL-13也会抑制单核细胞产生细胞因子，通过减少一氧化氮产生和增加精氨酸酶活性促进巨噬细胞向2型表型[55]转化。本次研究发现与健康对照组相比，Graves病组、Graves眼‐50 ‐ 西南医科大学硕士学位论文病组患者血浆IL-13明显升高，但Graves病组和Graves眼病组间无统计学差异。IL-13是参与IgE合成的主要细胞因子，也参与Th2买[56][57]免疫调节的免疫疾病相关。有研究者对于60名Graves病患者的血清IL-13进行检测，结果也发现Graves病组患者IL-13水平较正常组血清IL-13水平明显升高，而且随着患者基本的严重程度不断升[58]高。Takashi等人发现在193名GD患者中，有35.5%的患者血清IgE水平明显升高，而在他们中同时还有升高的T4、T3、抗微粒体抗体与正常IgE水平的患者相比；在IgE升高的患者中有64.7%的患者血清中IL-13水平明显升高，而Th1免疫代表细胞因子IFN-γ却没有被发检测到。IL-13的升高不仅会导致IgM，IgA，IgG的产生，而且在早期没有IL-4或者IL-4水平很低的情况下由T细胞产生能产生IgE的主要的细胞因子，这研究暗示在Graves病发生过程中Th2细胞活化并分泌IL-13，刺激B细胞合成更多的TSAb,TSBAb和IgE导致Graves病。在过去的研究中均认为是Th2细胞因子均来自与Th2细胞，但本次研究发现IL-4、IL-5、IL-13的水平与外周血PBMC中的ILC2比例呈正相关，这提示我们血浆中Th2细胞因子有部分不仅是Th2细胞产生还可能来源于ILC2，所以ILC2可以通过分泌Th2类[40]因子发挥免疫调节作用。我国学者纪晓均对Graves病患者外周血中的PBMC中IL-4、IL-5、IL-13的mRNA水平使用qRT-PCR进行检测，结果发现与健康组相比，Graves病患者IL-4、IL-5、IL-13的mRNA水平是明显升高的，这些结果与本次实验结果是相似的。目前关于参与Graves眼病的发病过程中的淋巴细胞的特点还存‐51 ‐ 西南医科大学硕士学位论文在许多争议。有研究分析了Graves眼病的眶周细胞浸润的情况，这[32]些结果都表明Th1和Th2细胞均积累在结缔组织和眼外肌中，同时[33]在累及的眶周组织中也有大量的Th1和Th2细胞如在眶周脂肪和肌肉中均发现TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10mRNA的存在。本次研究发现GO组血浆中IL-4、IL-5、IL-13水平明显升高，但与GD组无显著差异；Graves眼病是发生在眼球器官特异性的自身免疫疾病，其发病机制与Graves病不完全相同，此次研究仅对循环中的2类细胞因子进行了检测，没有对眼部局部的2类细胞因子进行检测，因此外周血细胞因子水平并不能代表Graves眼病患者眶周局部的免疫反应，还需要更多深入的研究对Graves眼病的发病机制进行探究。4.ILC2与甲状腺细胞激素分泌的机制探讨虽然经过本次研究的观察到Graves病以及Graves眼病患者外周血中ILC2细胞比例较正常志愿者明显升高，同时Graves病及Graves眼病患者外周血血浆中ILC2分泌的Th2类细胞因子IL-4，IL-5，IL-13的含量也明显升高，这样的结果让我们推测ILC2有可能通过及其分泌的Th2类细胞因子参与Graves病的发生发展；但是除了ILC2的增多以及其分泌的细胞因子升高可以调节机体Th2类免疫反应，ILC2在细胞水平如何影响Graves病的发展。于是本次研究进行了进一步的细胞实验来着重探究ILC2分泌的Th2类细胞因子对甲状腺本身的影响。而在ILC2分泌的Th2类细胞因子中与Graves病关系更加密切的是IL-4和IL-13，所以使用人重组IL-4（rhIL-4）和人重组IL-13（rhIL-13）对甲状腺细胞进行体外刺激。‐52 ‐ 西南医科大学硕士学位论文本次研究结果表明50ng/mrhIL-4和25ng/mlrhIL-13对人正常甲状腺细胞株进行24h的刺激以后，通过对细胞上清液的检测发现，在IL-4和IL-13的刺激以后，与对照组相比，其细胞上清液的T3和[6]T4水平明显增加。有研究对Graves病发生以后甲状腺激素过度分泌的机制进行研究发现在疾病发生后机体产生了TSH受体抗体（TRAb），其中一部分的TRAb可以模拟TSH，与甲状腺细胞表面促甲状腺激素受体(TSHR)结合刺激以后，使G蛋白构象改变暴露使三聚体Gs蛋白α亚基与腺苷酸环化酶的结合位点；但α亚基与腺苷酸环化酶（AC）结合使之活化将ATP转化为cAMP并激活PKA，cAMP与PKA调节亚基结合促使环磷酸腺苷反应元件集合蛋白（CREB）丝氨酸磷酸化，参与细胞核内靶基因转录的调控，促进甲状腺激素的生存和分泌。其产生过多的甲状腺激素，在生理条件下负反馈调节促甲状腺激素的产生，高水平的甲状腺激素抑制垂体释放促甲状腺素，但不抑制TRAb的产生，从而导致血液循环中激素水平过高，从而出现机体高代谢的症状。其实有许多研究发现了这些细胞因子与甲状腺疾病之间存在的联[60]系。ZhuW等人曾观察到在中国和日本人群中染色体的Chr.5q31-33区域包含了多种免疫反应相关的细胞因子的基因包括IL-4，都与自[61]身免疫甲状腺紊乱有关。而且Khalilzadeh等人观察到GD与和细[62]胞因子IL-4基因多态性存在一定联系。ArturBossowski等人的研究也发现IL-4在GD中可以阻止粘附因子的表达防止甲状腺细胞的损伤，这有可能保护这些细胞免受免疫损害或减少细胞凋亡。Stassi‐53 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[63]G等人也表示在甲状腺中浸润的Th2细胞和GD患者的甲状腺细胞产生的IL-4和IL-10可以诱导抗凋亡分子表达的同时导致甲状腺细胞对CD95调节的凋亡的耐受。本研究通过使用荧光定量实时PCR对rhIL-4以及rhIL-13刺激以后的甲状腺细胞内PKA和CREBmRNA水平进行检测。结果发现在50ng/ml的rhIL-4干预24h以后的甲状腺细胞内PKAmRNA的相对表达较对照组细胞相比是显著升高的，同时rhIL-4干预后的细胞内CREB的mRNA的相对表达水平也是较对照组明显升高。早在1990年[64]Finney等人就发现IL-4可以调节细胞内钙离子以及cAMP的升高，同时也可以增加PKC的活性。另外最近也有学者在对IL-4是与视网膜细胞增生的研究中发现，用PKA的抑制剂H-89处理视网膜细胞以后可以阻断IL-4的抗增殖效应，而用不同浓度的IL-4刺激新鲜的视网膜组织10分钟，以后也发现细胞内明显增加的cAMP，因此研究者[65]推测IL-4诱导PKA的活化从而降低视网膜细胞的增生。这表明IL-4可能会参与调控cAMP/PKA信号通路，而这与本次研究发现PKA的转录水平的增加是基本一致的，而且本次研究还发现CREB的mRNA水平也较正常组明显升高，因此推测IL-4激活cAMP/PKA信号通路后导致CREBmRNA水平的增加继而可能参与CREB蛋白水平的丝氨酸磷酸化，参与甲状腺细胞转录水平的调控所以IL-4对甲状腺细胞进行体外刺激以后发现，可能激活甲状腺细胞胞内cAMP/PKA/CREB通路调控甲状腺，导致甲状腺激素（T3，T4）基础分泌的增加。[66]虽然IL-13与甲状腺细胞之间的研究并不多，但Chang等人‐54 ‐ 西南医科大学硕士学位论文通过对小鼠巨噬细胞中精氨酸酶的研究发现，精氨酸酶I是IL-13是唯一诱导的同工酶，由于IL-13和cAMP类似物对精氨酸酶的上调可以被PKA特异性抑制剂阻断；这说明IL-13活化cAMP/PKA是主要的信号通路诱导精氨酸酶和继而增加精氨酸酶的活性。此外腺苷酸环化酶（AC）被认为可以活化酪氨酸激酶依赖的通路，也有可能说明IL-13通过cAMP/PKA调节的活化CREB导致精氨酸转录。这样的研究结果表明IL-13的确能活化cAMP/PKA/CREB信号通路，而本次研究也发现在IL-13对甲状腺细胞进行体外刺激后PKA以及CREB的mRNA水平有所升高，同时也发现在IL-13体外刺激以后甲状腺细胞的基础分泌激素水平也有所升高；并且由于IL-13和IL-4有25%同源的氨基酸序[67]列，IL-4和IL-13也有许多相似的结构特征，所以IL-13也与IL-4有时会有参与一些共同的通路，于是作者推测在甲状腺细胞中IL-13也可能激活cAMP/PKA/CREB，从而参与调节甲状腺细胞的激素分泌，从而导致甲状腺激素分泌的增加。5.ILC2与抗凋亡Graves病除了有由于血液中甲状腺激素过多导致的高代谢症状以外，部分患者还存在甲状腺的肿大；而在前述的研究中我们发现了在Graves病患者的外周血中ILC2的明显升高以及血浆中IL-4，IL-5，IL-13水平，这些异常的水平是否也与甲状腺的肿大有关系。本次研究还对STAT6以及BCL-2基因水平进行检测，结果发现在rhIL-4和rhIL-13的干预下，STAT6的mRNA表达水平较对照组也有所升高。信号转导和转录活化因子6（STAT6）是具有信号和转录功能的双重功‐55 ‐ 西南医科大学硕士学位论文能的分子，其能在IL-4和IL-13刺激以后活化，通过JAK1和JAK3，IL-4受体α和STAT6的丝氨酸磷酸化的相互作用从而活化信号通路[68]。活化的STAT6与不同基因的启动子结合调节靶细胞的分化和生长，[69]以及诱导细胞抗凋亡。功能活跃的IL-4/STAT6信号在多种细胞中[70]都有重要作用，包括免疫细胞和癌细胞等等。STAT6活性的改变会影响细胞的功能，从而参与癌症和自身免疫疾病的发病机制，但是这[71]也取决于疾病的状态所以也可能带来益处或者害处。Qing.T等人对于肝癌细胞的研究发现STAT6基因沉默以后会抑制癌细胞的增殖而且诱导细胞的凋亡，而当STAT6过表达时会促进细胞的增殖。IL-13和IL-4可以共享一个同源受体IL-4Ra，他们可以共同活化STAT6，这也对小鼠脾细胞抗原刺激后IL-4的释放很重要，这在免疫[72]系统中也有主导作用。也有研究发现当IL-4/STAT6信号通路被抑制后可明显缓解哮喘，同时IL-4信号刺激STAT6活化促进IgE的转[73][67]化以及诱导免疫球蛋白族胚系转录。Hershey等人的报告也提到IL-4和IL-13通过其同源受体IL-4Ra活化STAT6，并在哮喘动物模型中调节调节气道粘液的产生。这些研究结果与本次实验结果发现rhIL-4和rhIL-13干预后STAT6基因水平的升高是基本一致的，rhIL-4和rhIL-13干预甲状腺细胞后就能上调STAT6mRNA的相对表达，从而有可能激活化STAT6发挥生物效应。此外，对于STAT6敲除的小鼠模型的研究已经揭示了IL-13的信号通路通过JAK-信号传导[74]和活化转录，特别是STAT6，发挥其生物效应。而且Andrews等人[75]提出在IL-4或者IL-13存在的时候，STAT6活化会一直维持。有‐56 ‐ 西南医科大学硕士学位论文研究表明STAT6会影响IL-4/IL-13/通路的活化，也可能会通过活化[76][77]Th2特定基因调节Th2型免疫。而且Shikarawa等人也发现在敲除IL-4、IL-13或STAT6基因的小鼠体内缺乏IgE的合成以及Th2免疫反应，同时也指出STAT6/IL-4/IL-13单个核基因突变以后可能对过敏性疾病的发展至关重要。这些研究结果均表明rhIL-13和rhIL-4可以通过STAT6信号通路参与Th2免疫的调节，IL-4和IL-13水平的升高可能影响Graves病的发生发展。那么本次研究对甲状腺细胞进行用IL-4和IL-13进行干预后也发现STAT6的表达有所增加，和这些研究结果基本一致的，所以作者推测在外周血中ILC2和IL-4与IL-13水平的升高的刺激甲状腺细胞激活STAT6从而改变细胞内的一些生物效应。然而在很多研究中都对STAT6进行了基因敲除，结果发现当STAT6基因敲除后会诱导细胞的凋亡，所以作者猜测当STAT6被激活或者表达明显增加时，是否会引起抗凋亡的增加。于是本次研究对rhIL-4和rhIL-13干预以后的甲状腺细胞中抗凋亡基因Bcl-2进行了检测，结果发现Bcl-2在rhIL-4和rhIL-13的刺激下均较正常组其mRNA表达水平明显增加。Bcl-2基因是目前发现的抗凋亡作用最强的基因之一1，Bcl-2作为抑制细胞凋亡的基因，其实现凋亡调控的主要途径[78]是通过对线粒体凋亡通路的影响，导致细胞的死亡。我国学者张明生通过阻断人结肠癌细胞中STAT6信号通路以后发现Bcl-2mRNA基因表达较对照组明显降低，而促凋亡基因Bax的mRNA的表达明显升高，这提示STAT6信号通路可能通过Bcl-2和Bax表达来影响肿瘤细‐57 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[79]胞的凋亡。另有研究学者发现用重组小鼠的IL-13处理肠道缺血再灌注的小鼠模型以后发现与对照组相比增加的STAT6以及Bcl-2的表达，表明IL-13通过调节STAT6信号通路对于肠道缺血再灌注的损伤[80]有保护作用。也有研究者直接对Graves病患者中的Bcl-2水平用ELISA法进行检测发现在之在未治疗的Graves病患者血清中Bcl-2水平较对照组明显升高，但治疗以后患者血清中Bcl-2水平较治疗前[81]有所降低，与对照组相比没有明显差异。Graves病中的抗凋亡因子BCl-2的过度表达，会引起甲状腺以及浸润的淋巴细胞的凋亡清除[82]减少，从而参与GD的发病过程。既然甲状腺细胞的凋亡减少，有可能导致对甲状腺细胞的清除减弱，从而使甲状腺激素分泌的增多。这正好与本次研究结果一致，说明在ILC2细胞分泌的2类因子IL-4和IL-13的影响下，可能通过上调STAT6的基因水平，导致STAT6的活化，以及上调Bcl-2基因水平，有可能导致甲状腺细胞的凋亡减少，细胞清除的减少，激素水平的增加甚至导致甲状腺细胞数量的增加引起肿大。综上所述，ILC2是近年来研究较多的新型淋巴细胞，其参与多种疾病的发生发展，但关于ILC2与Graves病之间的研究却十分有限。通过对ILC2的生物学特点进行研究后，发现ILC2会参与Th2类免疫反应，因此ILC2可能通过对Th2类反应的调节参与Graves病的发生；于是本次研究对ILC2参与Graves病发病及机制进行了研究。但本次研究也存在一些不足之处，如没有对Graves眼病患者眶周组织中的ILC2数量以及ILC2分泌的2类细胞因子进行检测；没有对ILC2分‐58 ‐ 西南医科大学硕士学位论文泌的其他因子如IL-9、双调蛋白进行检测；没有对外周血或者眶周组织中的ILC2分离后进行体外培养研究。在未来的研究中还可以对Graves病患者治疗前后进行ILC2数量对比研究，以及对合并不同并发症的Graves病患者的ILC2数量进行亚组研究或许可以得到更多更有意义的研究结果，为Graves病的治疗提供新思路。‐59 ‐ 西南医科大学硕士学位论文结论本研究通过对Graves病患者、Graves眼病患者、健康志愿者外周血单个核细胞中2型固有淋巴细胞数量进行流式检测，以及血浆中2型固有淋巴细胞分泌的2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-13进行ELISA检测，探究ILC2与Graves的联系。并对人正常甲状腺上皮细胞株进行体外培养，并予以IL-4和IL-13的进行体外刺激，对其细胞上清液中甲状腺激素水平进行ELISA检测，并使用qRT-PCR对PKA、CREB、STAT6、BCl-2的基因水平进行检测，得出以下结论：1.Graves病、Graves眼病患者外周血单个核细胞中2型固有淋巴细胞数量及分泌的2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-13较健康志愿者明显升高，而但在Graves病与Graves眼病之间没有明显差异；提示ILC2可能参与了Graves病的发生。2.ILC2可能通过其分泌的2类细胞因子（IL-4、IL-13）直接刺激甲状腺上皮细胞分泌甲状腺激素，抑制甲状腺细胞凋亡导致Graves病的发生发展。‐60 ‐ 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西南医科大学硕士学位论文英文缩略词对照表英文缩写英文名称中文名称GDGravesDiseaseGraves病GOGravesOphthalmopathyGraves眼病TSHThyroidStimulatingHormone促甲状腺激素ILInterleukin白介素TRAbThyrotrophinReceptorAntibody促甲状腺激素受体抗体TSLPThymicstromallymphopoietin胸腺基质淋巴生成素RORαRetinoidacidreceptorrelatedorphan维甲酸相关孤核受receptorα体LinLineage谱系发育分子PBMCPeripheralBloodMononuclearCells人外周血单个核细胞TNF-βTumornecrosisfactor-β肿瘤坏死因子βIFN-γInterferon-γ干扰素-γcAMPCyclicAdenosineMonophosphate环磷酸腺苷PKAProteinKinaseA蛋白激酶ASTAT6SignalTransducerAndActivatorOf信号转导和转录激Transcription活因子6CREBcAMP-responseelementbinding环磷腺苷效应元件‐73 ‐ 西南医科大学硕士学位论文protein结合蛋白ILCsInnateLymphoidCells固有淋巴细胞ILC2Type2InnateLymphoidCell2型固有淋巴细胞FT3Freetriiodothyronine游离三碘甲状腺原氨酸FT4Freethyroxine血清游离甲状腺素aTPOThyroidperoxidaseantibody甲状腺过氧化物酶抗体aTGThyroglobulinantibodies甲状腺球蛋白抗体‐74 ‐ 西南医科大学硕士学位论文致谢时光荏苒，我短暂的研究生生涯已至谢幕时刻，回首近年经历，百感交集，酸甜苦辣结于心中，当然更富含收获及成长，让心中充满着感激。在此处首先感激我的导师徐勇教授对我学习及生活中无微不至的照顾及关心，以及三年来在临床和科研方面对我的细心的栽培和不倦的指导，恩师不懈的科研追求、严谨的学术态度、崇高的敬业精神将是我永远学习的榜样！感谢西南医科大学附属医院内分泌与代谢科全体医护人员在临床学习中给予我的悉心指导，让我掌握了临床相关知识与技能，获得了实践锻炼的机会！感谢西南医科大学附属医院医学中心实验室和内分泌PI实验室为我们提供了良好的科研条件和设备，特别感谢龙洋等老师在整个实验期间给予我的指导和帮助！感谢我的师姐师妹，特别是高陈林师姐在科研和临床方面给予的无私指导；感谢我的论文合作者及师妹们在实验期间给予的热忱帮助！感谢一直在背后默默关心支持我的家人和朋友，因为他们的温暖和鼓励才能让我在遇到困难时迎难而上，冲破难关！最后，衷心的感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们!‐75 ‐ 西南医科大学硕士学位论文2型固有淋巴细胞与免疫疾病的研究进展综述2型固有淋巴细胞（Type2Innatelymphoidcell，ILC2）是近年来发现的一种新型固有淋巴细胞群体，是由共同淋巴样祖细胞发育而来的新型的非B细胞、非T细胞，是与适应性免疫细胞平行的一类免疫细胞，广泛分布在血液、肠道、气管、肺脏、脾脏、肝脏、皮肤等部位。ILC2在转录因子DNA抑制子2（Id2）、维甲酸相关孤核受体α（RORα）和GATA结合蛋白3(GATA3)的调控下发育成熟，经上皮细胞源性细胞因子白介素-25（IL-25）或白介素-33（IL-33）刺激后可产生白介素-4（IL-4）,白介素-5（IL-5），白介素-9（IL-9）白介素-13（IL-13）等2型辅助性T(Th2)细胞因子。ILC2主要介导Ⅱ型免疫应答，并在抵御寄生虫感染、呼吸道疾病和组织修复中以及炎症的启动、调节和缓解中同样发挥着重要作用发挥重要作用。此外，ILC2也在多种免疫性疾病的发生中参与重要的作用，如食物过敏，特异性皮炎，哮喘，慢性鼻窦炎，肠道炎症以及自身免疫性疾病等。本文旨在就ILC2的生物特性以及ILC2与免疫疾病之间的联系做一综述。1.ILC2的生物特性：-/-ILC2最初发现于2001年，Fort等人将Ｒag小鼠的脾脏细胞（缺乏成熟的T、B细胞）或者去除T、B细胞的野生型小鼠的脾脏细胞分离出来，经IL-25诱导后发现这些细胞能够产生IL-5、IL-13、免疫[1][2-4]球蛋白IgE、IgG1和IgA。在2010年多名学者发现对于在小鼠‐76 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[5]和人类的这类细胞进行了更深的研究，最开始称这些细胞为自然辅助细胞、2型固有辅助细胞或nuocytes，现在统一命名为2型固有淋巴细胞。ILC2属于固有淋巴细胞家族（ILCs）中的一员，主要由骨髓中的共同淋巴祖细胞发育而来，不表达谱系发育分子Lineage（Lin-），也不表达抗原特异性受体（TCR或BCR），因此与自然杀伤NK细胞和淋巴组织诱导（LTi）细胞一起被称为ILCs。人类的ILC2表面缺乏谱系发育分子Lin的表达，包括sCD3,[6,CD19,CD94,CD1a,CD11c,CD123,BDCA2,CD14,FceR1,和CD347]；像人类的ILC3一样，ILC2细胞也表达IL-7Rα(CD127)，人类ILC泛化分子CD161以及特定的前列腺素D2受体（CRTH2，表达在Th2[5]细胞上的趋化因子受体同源分子）。人类ILC2细胞上也表达CD25，[8]但其同样也表达在ILC3上。ILC2不表达ILC-1和ILC3相关标记NKp44(NCR)。此外，与ILC2在小鼠上的表达相似，人ILC2对IL-25，IL-33和胸腺基质淋巴生成素（TSLP）能产生相应的反应，这表明在[5,7,9]ILC2上存在相应的细胞因子的受体ILC2受细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的刺激后可分泌细胞因[2,3,子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和双向调节蛋白（简称双调蛋白）8]，ILC2在发育期间始终高表达转录因子GATA结合蛋白3（GATA3），GATA3控制IL-13及ST2(IL-33的特应性受体)的表达，因此成熟[7,10]ILC2s必需GATA3来维持和发挥其正常功能；有研究者曾敲除小[11]鼠GATA3基因后发现ILC2s的分化和维持收到严重的影响。此外，RORα也是ILC2特征性的转录因子，对维持ILC2在骨髓中分化和‐77 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[6]外周组织免疫应答起到重要作用。值得注意的是，ILC2在胎儿中0.2％在肺部、2％在肠道，成人组织中不足0.1％、外周血中0.01％-0.03％，由此可见ILC2在人体中的数量稀少，而且在胎儿体内较成[5]人体内更为丰富。2.ILC2与其分泌的细胞因子ILC2的功能特征是能在不同的环境刺激中能产生不同的2类细胞因子。因此，我们认为ILC2主要通过在不同的组织器官中产生各类细胞因子从而发挥其生物学效应。而ILC2产生的最主要的细胞因子是IL-5和IL-13，而更特殊的条件下ILC2还可以产生IL-4、IL-9以及双调蛋白。ILC2分泌多种不同生物效应的细胞因子从而使ILC2在体内具有更复杂更多效的生物功能。2.1IL-13IL-13是ILC2分泌的重要细胞因子之一。通过对IL-13报告基[12]因小鼠的研究，发现ILC2是体内IL-13主要来源。IL-13是一种[13]作用丰富的细胞因子，对于不同的靶细胞可能有促炎或者抗炎效应；IL-13能通过于与其受体IL-13Rα1结合传递信号，而IL-13Rα1常表达与许多基质细胞比如纤维母细胞、内皮细胞、上皮细胞等，以[14]及效应T细胞和肥大细胞。此外，IL-13能与另一个受体IL-13R[15]α2结合，而其被认为是在大多数细胞的一种诱骗受体。IL-13能促进杯状细胞增生和分泌粘液同时促进内皮细胞产生[16]嗜酸细胞活化趋化因子。同时IL-13能抑制单核细胞的细胞因子产生，通过减少一氧化氮产生和增加精氨酸酶活性促进巨噬细胞向“2‐78 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[17]型”表型转化。IL-13对于损伤反应是引起纤维母细胞促进胶原沉[18]积。此外，IL-13还可能会抑制T细胞和ILC3产生IL-17来抵消[19]IL-17的促炎症效应。ILC2s也被发现与一些IL-13依赖的现象有[4]关，包括粘液的产生和寄生虫驱逐，嗜酸性细胞活化趋化因子和嗜[20][21]酸性粒细胞的招募，气道高反应性以及肺纤维化。2.2IL-5IL-5也是ILC2分泌的2类细胞因子之一。IL-5能参与嗜酸性[22][23]粒细胞的发展、活化、生存，IL-5也在糖代谢，浆细胞生存，[24][25]伤口愈合，寄生虫感染方面有调节作用。产生天然抗体的B1B细胞的发展也离不开IL-5,而ILC2也同时对于维持内皮细胞的稳态有重要作用。而通过对IL-5基因敲除小鼠研究发现证明ILC2确实有在[20]体内分泌IL-5的能力。2.3IL-4IL-4同样也是由ILC2分泌的重要细胞因子。ILC2中高表达的[26]GATA3能促进IL-4基因位点的活化。ILC2被发现在体外能产生[27]IL-4，特别是对于叠氮溴化丙锭（PMA）以及钙离子通道载体离子[28]霉素的刺激后都可以分泌IL-4。相反，ILC2在体内产生IL-4的证据较少，在稳定状态或者寄生虫感染的时候均没有发现ILC2能产生[12]IL-4。这些结果表明在ILC2对于分泌IL-4的调节和对于产生IL-5和IL-13的调节是不同的，而虽然ILC2能在体外产生IL-4，但是ILC2在体内产生IL-4的能力是有限的。‐79 ‐ 西南医科大学硕士学位论文2.4双调蛋白和IL-6ILC2也被发现能通过ILL-33的上调活化可以产生表皮生长因子[28]双调蛋白。双调蛋白可以促进表皮细胞增殖，也参与抵御线虫和伤口愈合有关。当受到流行病毒感染时，肺部ILC2产生的双调蛋白被[8]发现会增加气道表皮修复，这与ILC2细胞在维持屏障功能方面的[28]作用一致。还有研究表明活化的ILC2细胞IL-6，也是一种多效应细胞，在不同环境中可产生促炎和抗炎的效应。但ILC2产生的IL-6目前的功能性结果还不是特别明确。图31.ILC2分泌的细胞因子及其功能Figure.31ThefuncctionofcytokinesfromILC23.ILC2与免疫性疾病3.1ILC2与哮喘哮喘是会导致呼吸急促、喘息以及产生过多的粘液和气道重塑的一种慢性的炎症性紊乱导致的免疫疾病。其特点是气道高反应性、可‐80 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[29]逆的气流受限和气道炎症。在呼吸道ILC2的研究中，ILC2与哮喘的发病机制研究最为广泛。在哮喘的病理过程中，Th2细胞应答增强并促进嗜酸粒细胞向气道浸润是产生哮喘气道炎症的关键因素。Allakhverdi等人在2009年的研究中发现在哮喘患者的呼吸道分泌物中发现了一种CD4+的非T非B细胞，而这类细胞在受到吸入[30]过敏刺激后可产生IL-5和IL-13。Barlow等人对比IL-13-/-小鼠和野生型小鼠，用IL-25或IL-33滴鼻后,IL-13-/-小鼠肺灌洗液中、肺部嗜酸粒细胞和2类细胞因子表达均减少；而将ILC2导入IL-13-/-[31]小鼠后，IL-25或IL-33诱导的气道高反应被重建。另有研究也发现在哮喘小鼠肺组织中，ILC2s细胞数目和糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关受体（GITR）表达均升高，且GITRL、叉头状转录因子3（Foxp3）、RORα、可诱导共刺激分子(ICOS)、ST2以及IL-5和IL-13的mRNA表达水平均明显上调。Bartemes等人在2014年的研究发现在哮喘患者的外周血单个核细胞中ILC2的比例明显高于正常人以及过敏性鼻炎的患者，同时用IL-33和IL-25分别和IL-2刺激外周血单个核细胞，与正常人和过敏性鼻炎患者的相比，哮喘患者的细胞能产生显著增多的IL-5和IL-13。这表明哮喘患者血液中ILC2s的[32]反应是增强的。ILC2与哮喘相关的细胞之间也存在联系。ILC2产生的2类细胞因子可诱导肥大细胞脱颗粒释放前列腺素D2，由于ILC2表面又存在前列腺素D2的特异性受体（CRTH2），如此又可以反作用于ILC2促使[33]其增殖活化。嗜酸粒细胞在炎症的发生、发展中具有十分重要的作‐81 ‐ 西南医科大学硕士学位论文用，有研究表明嗜酸粒细胞性哮喘患者外周血中ILC2数量较非嗜酸粒细胞哮喘患者明显增多，并且与痰液里嗜酸粒细胞数目有关，但多[34]元分析中发现ILC2才是反映嗜酸粒细胞性哮喘最重要的因素。这些研究均表明ILC2在哮喘的发病过程中具有重大的意义。此外，真菌抗原也可表达蛋白酶活性损害气道上皮细胞，气道上皮细胞随之释放IL-25及IL-33。Bartemes等人研究表示吸入真菌过敏原链格孢菌能够诱导IL-33的产生，肺组织中ILC2随之增多，并开始分泌IL-5与IL-13，导致嗜酸性粒细胞增多及炎症反应，这种现[35]象在ST2缺陷小鼠中并未发生，表明ST2/IL-33途径及ILC2是参与真菌抗原诱导的气道炎症反应所必需的。ILC2开创了哮喘发病机制的一个新领域。目前大量研究均研究提示了ILC2参与哮喘气道炎症调控，很有可能成为哮喘治疗的新靶点。3.2ILC2和特异性皮炎特异性皮炎是一种湿疹样并伴有瘙痒的种慢性或者长期复发的皮肤疾病，困扰了2-20%的普通人群；而且一旦患上这种疾病会严重影响患者的生活质量。其发病与I型过敏反应有关，包括食物过敏，[36]哮喘和过敏鼻炎。ILC2除了能促进气道炎症的发生发展，许多研究也发现ILC2s也会促进皮肤过敏性炎症。当皮肤屏障功能受损后会产生细胞因子IL-33和IL-25，并激活ILC2分泌大量IL-5和IL-13以及双调蛋白[37]。在特异性皮炎患者的皮损处发现了升高的IL-25，IL-33和TSLP，[38-40]它们均能促进ILC2反应;而且Kim和Roediger等人也在老鼠和‐82 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[12,41]人类特异性皮炎的皮损处均发现了丰富的ILC2。虽然IL-33是活化肺部、外周血、鼻息肉中ILC2s的主要细胞因子，但是研究表明在小鼠特异性皮炎模型的皮肤上的ILC2并不完全依赖IL-33活化，也可以由TSLP激活。Kim发现ILC2细胞表面存在TSLP的受体，当TSLP与受体结合后可促进ILC2分泌细胞因子IL-13等，这一途径对[41]于维持小鼠的特异性炎的炎症具有重要的影响。此外，皮肤相关的ILC2是可以在体内直接诱导皮肤发生特异性[41]皮炎样的病理改变以及Th2细胞反应。还有学者发现，ILC2s确实存在于小鼠皮肤上，并在角蛋白14启动子的转基因小鼠中过表达[42]IL-33也可以导致ILC2s的增殖以及诱导特异性皮炎样炎症的发生。Roediger等人用显微镜直接观察到皮肤上的ILC2s，ILC2主要位于[12]皮肤的真皮层中,而且ILC2会与皮肤上定植的肥大细胞相互作用。这些研究表明皮肤上的ILC2s促进2类细胞因子相关的皮肤炎症的发生，同时与皮肤上其他固有免疫和适应性免疫相互作用并影响他们功能。3.3ILC2与系统性硬化在2015年Thomas等人的研究发现ILC2与系统性硬化症的纤维[43]化的发生存在一定的联系。系统性硬化症（SSc)是一种慢性的自身免疫性疾病，主要临床特点为皮肤纤维化，以及内脏器官纤维化例如肺脏、肝脏。随着疾病发展，病人可出现胃肠、血管和心肺并发症，[44]后者是最常见的死亡原因SSc患者体内常会表达多种自身抗体，如Scl-70抗体、抗RNA多聚酶Ⅲ抗体（ARA-Ⅲ）、抗心磷脂抗体（ACA）‐83 ‐ 西南医科大学硕士学位论文[45]和抗U1核糖核蛋白抗体。[43]Thomas等人在对SSc患者皮肤取活检后进行免疫荧光发现SSc病人的皮肤真皮层中的ILC2细胞明显高于正常对照组，且是正常对照组细胞数目的3.38倍；将患者分为局限性SSc和弥漫性SSc，发现弥漫性SSc真皮层中ILC2比局限性SSc中ILC2的数量明显增加。同时根据改良Rodan皮肤评分（mRSS评分）发现超过10分的患者真皮层中ILC2数量比低于10分的的患者也是明显升高，而且将mRSS评分与ILC2数量进行相关性分析发现两者存在相关性。此外，对于外周血中的ILC2细胞进行流式细胞分析发现SSc患者的ILC2细胞也比正常组中明显增加。而且ILC2细胞数目与患者皮肤纤维化以及肺纤维化的程度也是紧密相关的。[46]其实，在2013年McHedlidze等人通过使用四氯化碳造的小鼠模型观察到，IL-33通过活肝脏的ILC2，产生IL-13并与IL-4的II类受体结合激活STAT6并激活肝星型细胞从而导致肝脏的纤维化。[47]Hams等人研究发现通过注射曼氏裂体吸虫虫卵入小鼠体内来抑制ILC2的发展，从而抑制了胶原沉积。所以，ILC2可能与纤维化的发生有一定的联系；这也支持了Thomas等人对于SSc的研究，以及ILC2与SSc患者发生皮肤以及内脏纤维化密切相关的研究结果。同时也提示ILC2有可能作为SSc的一个促纤维化的生物标记，以及潜在的抗纤维化的治疗靶点。3.4ILC2与多发性硬化多发性硬化是一种会导致中枢神经系统白质脱髓鞘病变的自身‐84 ‐ 西南医科大学硕士学位论文免疫疾病，常见病变部位位于脑或脊髓,临床表现存在空间和时间多发性,以髓鞘脱失、神经胶质增生、不同程度轴索病变和进行性神经功能障碍为主要特点,常累及脑室周围白质、视神经、脊髓、脑干和[48]小脑,尤以侧脑室体部和脊髓前角多见。多发性硬化的发病机制到目前为止仍是不太清楚，但自体活化的T细胞在轴突周围的髓鞘的破[49]坏中有重要的作用。在以前的研究中发现多发性硬化主要导致女性的发病，而这种两性有别的特点可以在多发性硬化，实验性自身免疫[50]性脑脊髓炎的SJL小鼠模型中被模拟。在Abigail的研究中，发现通过c-Kit的信号通路对于雌雄SJL鼠有不同的EAE易感性。而以前的研究发现Kit基因突变(W/Wv)的雌鼠不如野生型小鼠对EAE易感，然而W/Wv雄鼠却表现出疾病的恶化，这是一种不依赖肥大细胞表现型，也是与Th2主导T细胞反应向Th17主导T细胞反应的一致。在+以前的过敏性气道小鼠模型中，c-KitILC2可以通过产生IL-13来诱[51][50]导Th2免疫反应。Abigail的研究同时发现了在W/Wv小鼠中+c-KitILC2的缺失消除了自体活化T细胞反应的的衰减，从而增加疾病的易感性。此外，在WT雄鼠的中枢系统中发现疾病诱导的ILC2s的累积有所减少，而且ILC2s也在对EAE易感的野生型雌鼠中有明显降低，这表明c-Kit信号通路和未定义的雄性特定因素都需要ILC2功能的参与。这样的结果也说明Th2免疫促进的ILC2的缺失会减弱至脑炎的T细胞反应，从而增加发生疾病易感性。-/-另外也有研究发现ILC2缺失的小鼠（ST2）表现出由T细胞分泌的IL-17和G-CSF，与WT小鼠相比也对于EAE的易感性更强。‐85 ‐ 西南医科大学硕士学位论文-/-将WT小鼠体内致脑炎的T细胞转移至ST2小鼠体内后并不会缓解WT小鼠样EAE的易感性，这说明ST2的保护效应是T细胞外部的。而且用可以促进ILC2增殖的IL-33可以诱导Th2主导的免疫反应并[52]改善EAE。所以，以上的研究均表明c-Kit对于EAE的易感性十分重要，也表明c-Kit+ILC2参与多发性硬化的可能性较大。但到底ILC2是否以及如何参与多发性硬化的发生还是有待进一步的探究。3.5ILC2与过敏性肠道炎症原发性嗜酸性粒细胞性肠道紊乱（EGIDs）包括嗜酸细胞性食管炎（EoE），嗜酸性粒细胞性胃炎，嗜酸性粒细胞性胃肠炎，嗜酸性结肠炎都是在胃肠道中没有明确的嗜酸性粒细胞过多的情况如寄生虫感染和药物反正时嗜酸性粒细胞增多的的紊乱。虽然在EGID是患者的血清中发现了食物特异的IgE抗体，但并没有在EGID的患者中观察到食物过敏的典型症状如过敏反应。因此EGID被认为是不依赖于[53]IgE而依赖于被抗原活化IL-5+IL-13+Th2细胞。然而最近的研究表明ILC2s参与EGIDs的发病。EoE是一种慢性的以嗜酸性粒细胞浸润、食管重构、使皮下纤维化、平滑肌蠕动障碍，抗原调节疾病。虽然2类细胞因子如IL-3和[54]IL-5都被发现参与EoE的发病，但这些细胞因子的来源并没有被很好的阐明。来自全基因关联分析（GWASs）的结果表明TSLP基因与EoE有关。确实，TSLP的表达在EoE活动期病人的食管活检标本中较[55]对照组明显升高。此外IL-33和IL-25的表达有所增高，同时患者食管中ILC2的数量也与非活动期和对照组的ILC2数量明显增加，更‐86 ‐ 西南医科大学硕士学位论文重要的是在EoE活动期病人的食管活检标本中ILC2的数量与嗜酸性[56]粒细胞的数量存在相关性。这些结果都表明ILC2在TSLP,IL-33,和IL-25的诱导下产生的2类细胞因子在EOE的发病过程中有重要的作用。但是否还有其他的ILCs参与其他类型的EGIDs还不是很明确，但已经有研究发现在嗜酸性粒细胞胃肠炎患者的乙状结肠活检标本[57]中TSLP和IL-33的表达也表明ILC2可能也参与了EGID是的发生发展。3.6ILC2与自身免疫甲状腺疾病ILC2细胞最主要的生物特点就是在一定条件下能产生2类细胞因子，而且ILC2与Th2细胞也有相似的生物学效应；那么ILC2也会参与Th2免疫调节。近年来许多研究表明，自身免疫性甲状腺疾病的发生与在Th1和Th2失衡有关，ILC2也有可能通过Th2类因子的分泌影响自身免疫疾病的发生。Graves病（GravesDisease，GD）是器官特异性自身免疫性甲状腺疾病，其发病与促甲状腺素受体(TSH-R)抗体的产生密切相关。TSH-R抗体属于IgG亚类，Th2型细胞因子可促进IgG1亚类的产生，故GD发病可能以Th2型细胞因子为主，其免疫应答以体液免疫为主。我国研究者纪晓昀对于Graves病患者外周血中的ILC2细胞和相关细胞因子进行了检测，发现在Graves病患者外周血单个核细胞中ILC2的比例明显高于健康对照组，而且PBMC中的T1/ST2（IL-33受体)、IL-17RB（IL-25受体）以及ILC2细胞表面标记ICOS（共刺激分子）、CD45以及IL-5和IL-13的mRNA表达水平明显高于健康对照组，而‐87 ‐ 西南医科大学硕士学位论文转录因子RORα的mRNA水平也有上升的趋势。而且Graves病患者血浆中的IL-5以及IL-13的水平也明显高于健康对照组。除此之外，IFN-γ和T-bet(Th1细胞因子的转录因子)也被观察到明显降低。这些结果表明在GD患者中存在极化的2型固有淋巴细胞，他们与下[58]调的Th1或相对优势的Th2细胞分化有关。另一种常见的甲状腺自身免疫疾病就是桥本氏甲状腺炎，在桥本氏甲状腺炎的发生过程中常伴有大量甲状腺自身抗体的产生如aTG[59]和aTPO抗体，而Th2细胞是辅助B细胞产生抗体的重要细胞，ILC2[60]功能与维持Th2细胞的活化状态密切相关，于是张淡宜等人使用荧光实时定量PCR的方法检测了桥本氏甲状腺炎患者外周血中ILC2特征性细胞因子和转录因子的表达水平，发现ILC2的特征性转录因子RORα和IL-13的mRNA明显增加，而且于血清中aTG和aTPO自身抗体水平的升高程序明显正相关；这些结果均表明本研究初步表明，ILC2的活性与桥本氏甲状腺炎患者自身抗体的产生有着密切的关系，[11]其作用可能是通过维持Th2极化状态促进自身抗体的产生。图32.与ILC2相关的免疫疾病Figure.32TheantoimmunediseasesassociatedwithILC2‐88 ‐ 西南医科大学硕士学位论文4.总结及展望综上所述，2型固有淋巴细胞（LC2）是近年来发现一种新型固有淋巴细胞群体，是由共同淋巴样祖细胞发育而来的新型的非B细胞、非T细胞家族，与适应性免疫细胞平行的一类免疫细胞。ILC2在转录因子Id2、RORα和Gata3的调控下发育成熟，经上皮细胞源性细胞因子IL-25或IL-33刺激后可产生IL-4,IL-5,IL-9,IL-13等2型辅助性T(Th2)细胞因子。ILC2主要介导Ⅱ型免疫应答，并在抵御寄生虫感染、呼吸道疾病和组织修复中以及炎症的启动、调节和缓解中同样发挥着重要作用发挥了重要作用。ILC2s可能还有多种功能在多种屏障表面包括上下呼吸道、皮肤、肠道。除此外，ILC2s已经在多种组织包括大脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、脂肪组织中被发现。本文总结了ILC2的基本的生物特征以及其分泌的Th2细胞因子的效应特征，以及ILC2参与免疫性疾病免疫的调节。有研究明确指出ILC2与哮喘以及特异性皮炎的发生发展有密切联系，同时ILC2也参与多发性硬化，系统性硬化以及过敏性肠炎的免疫调节。但对于ILC2与自身免疫性甲状腺疾病的研究较少，对ILC2如何参与自身免疫甲状腺疾病的调控或者对于ILC2与自身免疫甲状腺疾病的发生机制的联系并不是很清楚，还需要进行更深入的研究。未来研究还需要进一步探究ILC2s在各器官系统中的发挥的免疫作用，为日后免疫疾病的预测与治疗提供新的思路。‐89 ‐ 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