《2株H5N6亚型禽流感病毒的序列分析和致病性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码：10564学号：2014307311分类号：S855.3密级：硕士学位论文2株H5N6亚型禽流感病毒的序列分析和致病性研究黎玉莲第一指导教师：任涛教授第二指导教师：学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医硕士领域：无答辩委员会主席：田允波教授中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要自2014年5月四川省第一次报道人感染H5N6亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)以来，云南和广东省相继报道H5N6高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza，HPAI）感染人的事件。由于广东省和四川省两省间隔距离较远，家禽和人感染H5N6的来源、致病性以及传播引起了公众的高度关注。在2014-2015年期间，本研究室在广东省内野鸟的流行病学监测过程中，从鹊鸲和毛腿沙鸡上分离到2株新型的H5N6病毒，分别命名为A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015和A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014。基因和进化树表明，2株AIV由多个不同来源的毒株的基因片段重组而成。HA基因属于H5N1亚型，进化分支属2.3.4.4，NA基因则与欧亚家禽源的H6N6亚型相同，位于ST192-like分支；ZH283与感染人的H5N6病毒(A/Guangdong/ZQ874/2015)高度同源，SW8与另外分离的感染人的H5N6病毒(A/Guangzhou/39715/2014)高度同源，表明感染人的H5N6可能来源于野鸟毒株的片段重组。对全基因序列测定后发现，2株毒株的HA的裂解位点均是-RRRKR↓G-，含有4个碱性氨基酸，裂解位点符合高致病性禽流感病毒典型分子特征，且ZH283的HA蛋白的I155T受体结合位点突变为T，分子特性表明ZH283对人源受体有一定的亲和关系。2个毒株的PB2蛋白在E627K和D701N这两个位点都没有突变，NP蛋白A184K突变，NS1蛋白的D92E也均发生了突变。为了研究这2株H5N6亚型AIV的生物学特性，本文对这2株毒住进行了SPF鸡、BABL/C小鼠、豚鼠、北京鸭和鹌鹑的致病性试验。SPF鸡的致病性试验结果显示，2株H5N6对SPF鸡高度致死并引起组织器官感染，在肺脏、气管和法氏囊等10个脏器中均能检测到较高的病毒滴度，ZH283组被检的10个脏器中的病毒滴度都达到7.83log10EID50/g以上，肺的滴度较高，达10.08log10EID50/g；在SW8组被检的10个脏器中，log10EID50/g值在5.58～7.58范围内，较高是法氏囊和胰腺，较低是心脏；感染组和同居组的SPF鸡均可经咽喉和泄殖腔排毒。BABL/C小鼠的致病性试验结果显示，2株毒株对小鼠都具有高致病性与高致死率，致死率均为100%；感染病毒后的小鼠体重均有下降，ZH283组下降率达到23%，SW8组下降率为12.7%；ZH283和SW8在小鼠体内复制的病毒滴度也较高，特别是肺脏，第5d分别高达10.00log10EID50/g和9.5log10EID50/g。豚鼠的致病性试验结果显示，2株病毒感染豚鼠后在鼻甲骨、气管和肺脏等8个组织脏器中均能检测到病毒的复制，log10EID50/g值在3.75～6.42范围内，其中鼻甲骨中复制能力较强，ZH283组和SW8组分别为6.42log10EID50/g和6.33log10EID50/g，肺脏次之，I ZH283组和SW8组分别为5.75log10EID50/g和6.25log10EID50/g。同时也能在豚鼠的鼻腔和泄殖腔中分离到病毒，同居组也均能在鼻腔和泄殖腔中分离到病毒。北京鸭的致病性试验结果显示，在气管、肺脏和肾等10个脏器中均能检测到病毒的复制，感染组和同居组的鸭均可经咽喉和泄殖腔向外排毒，检测出同居组的鹌鹑向外排毒的病毒滴度比感染组和同居组的鸭子高；另一方面2个同居组的鹌鹑出现了较高的死亡率，ZH283鹌鹑同居组的死亡率为2/3，SW8鹌鹑同居组的死亡率为1/3。鹌鹑的致病性试验结果显示，感染组的鹌鹑致死率为100%，ZH283与SW8同居组的鹌鹑死亡率分别为2/3和1/3，同居组的鸭子则有较高的存活率，ZH283组与SW8组分别为2/3和3/3；在感染组的鹌鹑的盲肠扁桃体、肺脏和肾等9个组织脏器均能检测到较高滴度病毒的复制，log10EID50/g值在7.25～9.5范围内；感染组和同居组均能在口腔和泄殖腔拭子中分离到病毒。综上所述，2株H5N6亚型AIV对SPF鸡、BABL/C小鼠、豚鼠、北京鸭和鹌鹑表现出不同的致病性，当中以对SPF鸡和BABL/C小鼠的致病性较强，鹌鹑和豚鼠次之，对北京鸭不表现致病性。2株H5N6亚型AIV能经感染的北京鸭传播到鹌鹑，也能从感染的鹌鹑传播到北京鸭。本文中重组的H5N6亚型AIV从广东省内的野鸟分离而得，提示野鸟能够感染、携带H5N6，并且随其迁徙将H5N6传播至其他地方，进而感染更多的野鸟和哺乳动物，对公共卫生安全构成了潜在的威胁，值得高度关注。关键词：高致病性禽流感；H5N6；基因序列；致病性；传播II BioligicalCharacterizationandPathogenicityof2StrainsofH5N6SubtypeAvianInfluenzavirusesLiYulian(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthchinaAgriculturalUniversityGuangzhou,510642,China)Abstract:HumaninfectionbyanovelH5N6avianinfluenzavirus(AIV)wasfirstreportedinSichuanprovince,China,inApril2014.ItrecurredinGuangdongprovince,inDecember2015.TherecurrenceofhumaninfectionswithH5N6viruseshasraisedconcernsovertheirsourceandevolution.AstheregionsofemergenceofH5N6infectionsinpoultrywereofgreatdistancefromeachother,andthehumaninfectionsshowedthissamepattern,weassessedtheroleofwildbirdsinthespreadofH5N6andthepathogenicityandtransmissionindifferentbirds.Forthis,weconductedepidemicsurveillanceofavianinfluenzaamongwildbirdsinGuangdongprovince,China,during2014-2015.TwoH5N6viruses，A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014andA/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015wereisolatedfromwildbirds.Geneticandphylogeneticanalysisofvirussequencesrevealedtheywereoriginatedfrommultiplereassortmentsof2.3.4.4H5N1andH6N6avianinfluenzavirusesbelongedtoST192-likeofEurasianlineage.ThevirusisolatedinFebruary2015(ZH283)washighlyidenticaltoahumanisolatedH5N6inDecember2015(A/Guangdong/ZQ874/2015),whiletheotherviruseisolatedin2014havehighidentitywithanotherhuman-isolatedH5N6(A/Guangzhou/39715/2014).Thus,wildbirdsmightbethesourceofhumanH5N6infections.TheymighttransmittheH5N6virustodomesticpoultry,whichtheninfecthumans.MolecularevolutionanalysisofwholegenomesequencefoundthattheaminoacidsequenceofHAgeneshadthecleavagesite-RRRKR↓G-,whichrepresentsthemolecularbasisofhighpathogenicavianinfluenzavirusstrain.ThepositionI155TofZH283viruswasmutated,indicatingthattherehaveaaffinityofavianinfluenzavirusesforhuman-typereceptors.ThePB2geneofthetwoviruseshadnomutationatpositionE627KorD701N.ThemutationofA184kintheNPproteinandthemutationofD92EintheNS1protein.ToinvestigatethepathogenicityoftheH5N6,pathogenictestwascarriedonSPFchickens,mice,guineapigs,ducksandquails.TheSW8andZH283virusesreplicatedsystemicallyinchickens,whichcouldbedetectedfromallthetestedorgans,includingthelung,kidney,spleen,cecaltonsils,bursaoffabricius,trachea,pancreas,liver,heartandIII brain.TheSW8andZH283virusesreplicatedhighlyinlung;themeantiterswere7.83log10EID50and10.08log10EID50,respectivelyThetwonovelvirusescouldalsoreplicateinbrain;themeantiterswerefrom6.33log10EID50to8.67log10EID50.SW8andZH283virusessheddingfromtheinoculatedchickensweredetectedinoropharyngealandcloacalswabs.Babl/cmicepathogenictest,allthemiceinoculatedwithSW8andZH283wereresultingin100%lethalityandmortality.MiceinfectedwithSW8virusecausedanaveragebodyweightlossof12.7%.WhileinfectionwithZH283virusexhibitedbodyweightlossof23%.TheSW8andZH283virusesreplicatedhighlyinlung;themeantiterswere8.75log10EID50and9.08log10EID50at3DPIand9.08log10EID50and10.00log10EID50at5DPI,respectively.Guineapigspathogenictest,theSW8andZH283virusesreplicatedsystemicallyinguineapigs,whichcouldbedetectedfromallthetestedtissues,suchasthenasalturbinate,tracheaandlung,themeantiterswerefrom3.75log10EID50to6.42log10EID50.TheSW8andZH283virusesreplicatedhighlyinnasalturbinate;themeantiterswere6.33log10EID50and6.42log10EID50,respectively.Thetwovirusescouldalsoreplicateinlung;themeantiterswere6.25log10EID50and5.75log10EID50.SW8andZH283virusessheddingweredetectedinnasalwashsamplesandcloacalswabs.Thepathogenicityofduckstest,theSW8andZH283virusesreplicatedsystemicallyinducks,whichcouldbedetectedfromallthetestedorgans.Thenativecontactquails,housedwiththeducksinoculatedwithSW8orZH283virus,resultingin1/3or2/3lethalityandmortality.Thenativecontactquailsvirussheddingcouldbetestedfrombothoropharyngealandcloacalswabsandthevirustiterswashigherthanthenativecontactduck.Thepathogenicityofquailtest,thequailsinoculatedwithSW8orZH283virus,resultingin100%lethalityandmortality.ThenativecontactquailsinoculatedwithSW8orZH283virus,resultingin1/3or2/3lethalityandmortality.ThenativecontactducksinoculatedwithSW8orZH283virushave3/3and2/3survival.TheSW8andZH283virusesreplicatedsystemicallyinquails,whichcouldbedetectedfromallthetestedorgans,whosevirustiterswasfrom7.25log10EID50to9.5log10EID50.Allthequailsandducksweredetectedinoropharyngealandcloacalswabs.Inconclusion,ourresultsindicatedthatH5N6fromdifferentbirdsshowdifferenthostrangesandtransmission,andpathogenicityofH5N6indifferentbirdsmaybeassociatedthereplicationabilityofvirus.H5N6couldinfectSPFchickens,mice,guineapigsandquails,notonlycauseddeathinchickensandmicebutwithhighvirusload.H5N6waslowpathogenictoducks.Itcouldtransmittothequailsandducks.TheseresultssuggestapossibleroleofwildbirdsinthespreadofH5N6anditspotentialthreatforworldwideIV circulationofH5N6alongwildbirdmigratoryflywaysandthusposingthreatstothepoultryindustryandpublichealth.Keywords:HPAI;H5N6;geneticsequences;pathogenicity;transmissionV 常用英文缩略表简写英文全称中文名AIVAvianinfluenzavirus禽流感病毒AIAvianinfluenza禽流感cDNAComplementary（与RNA）互补的DNAdDay天EID5050%Embryoinfectivedose鸡胚半数感染量Gln(Q)L-Glutamine谷氨酰胺Glu(E)L-Glutamicacid谷氨酸Gly(G)Glycine甘氨酸HHour小时HAHemagglueination血凝试验HIHemagglueinationinhibitiontest血凝抑制试验HPAIHighlypathogenicavianinfluenza高致病性禽流感Leu(L)L-Leucine亮氨酸LPAILowpathogenicavianinfluenza低致病性禽流感Lys(K)L-Lysine赖氨酸minMinute分钟mLMilliliter毫升NANeuraminidase神经氨酸酶NPNucleoprotein核蛋白NSNonstructuralprotein非结构蛋白ORFOpenreadingframe开放阅读框PAPolymeraseA聚合酶APB1PolymeraseB1聚合酶B1PB2PolymeraseB2聚合酶B2PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RNARibosomenucleotaseinhibitorRNA酶抑制剂VI RRIRnasinribonucleoproteininhibitorRNA酶抑制剂RTReversetranscription反转录r/minRoundperminute转速每分钟sSecond秒SPFSpecificpathogenfree无特定病原Thr(T)L-Threonine苏氨酸uLMicroliter微升Val(V)Valine缬氨酸VII 目录1前言....................................................................................................................................11.1禽流感概述.....................................................................................................................11.2禽流感病毒病原学特点.................................................................................................11.3H5N6亚型禽流感...........................................................................................................21.3.1H5亚型AIV的流行状况与遗传变异........................................................................21.3.2H5N6亚型AIV及抗原变异.......................................................................................21.3.3H5N6亚型AIV的公共卫生学意义...........................................................................31.4本研究的目的与意义.....................................................................................................32材料....................................................................................................................................42.1病料和毒株背景.............................................................................................................42.2鸡胚、试验动物和菌种.................................................................................................42.3主要仪器设备.................................................................................................................42.4主要试剂和分子生物学材料.........................................................................................42.5分子生物学软件.............................................................................................................53方法....................................................................................................................................63.1H5N6病毒的分离...........................................................................................................63.2H5N6亚型AIVHA、NA基因的分子生物学鉴定......................................................63.2.1引物设计......................................................................................................................63.2.2H5N6亚型AIV的RNA提取.....................................................................................63.2.3H5N6亚型AIV的cDNA合成...................................................................................73.3H5N6亚型AIV的有限稀释法纯化..............................................................................83.4鸡胚半数感染量（EID50）的测定................................................................................83.5H5N6亚型AIV的全基因序列扩增..............................................................................83.5.1引物设计......................................................................................................................83.5.2H5N6亚型AIV的RNA提取.....................................................................................93.5.3H5N6亚型AIV的cDNA合成...................................................................................93.5.4H5N6亚型AIV全基因的PCR扩增.........................................................................93.5.5目的片段的检测........................................................................................................103.5.6PCR扩增结果的回收及纯化....................................................................................10VIII 3.5.7目的片段与PGEM-T载体的连接与转化...............................................................103.5.8筛选与鉴定阳性菌落................................................................................................113.5.9各目的片段序列的测定与拼接................................................................................113.62株H5N6亚型AIV对SPF鸡的致病性试验...........................................................123.6.12株H5N6亚型的AIV在SPF鸡体内复制情况....................................................123.6.22株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后排毒情况........................................................123.72株H5N6亚型AIV对BABL/C小鼠的致病性试验................................................133.7.12株H5N6亚型的AIV在小鼠体内复制情况.........................................................133.82株H5N6亚型AIV对豚鼠的致病性试验................................................................133.8.12株H5N6亚型的AIV在豚鼠体内复制情况.........................................................143.8.22株H5N6亚型AIV感染豚鼠后排毒情况.............................................................143.92株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性与跨种传播试验........................................143.9.12株H5N6亚型的AIV在北京鸭体内复制情况.....................................................143.9.22株H5N6亚型AIV感染北京鸭和鹌鹑后的排毒情况.........................................143.102株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性与跨种传播试验..........................................153.10.12株H5N6亚型的AIV在鹌鹑体内复制情况.......................................................153.10.22株H5N6亚型AIV感染北京鸭后排毒情况.......................................................154结果与分析......................................................................................................................154.1毒株的初步分离鉴定结果...........................................................................................154.2毒株的HA、NA基因的分子生物学鉴定结果.........................................................164.3H5N6亚型AIV纯化的结果........................................................................................164.4鸡胚半数感染量（EID50）测定结果..........................................................................164.5H5N6亚型AIV的全基因序列及分析结果................................................................164.5.1HA基因序列分析......................................................................................................164.5.2NA基因序列分析......................................................................................................174.5.3PB2基因序列分析.....................................................................................................184.5.4PB1基因序列分析.....................................................................................................224.5.5PA基因序列分析.......................................................................................................224.5.6NP基因序列分析.......................................................................................................284.5.7M基因序列分析........................................................................................................28IX 4.5.8NS基因序列分析.......................................................................................................294.62株H5N6亚型AIV对SPF鸡的致病性试验结果..................................................294.6.12株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后的存活情况....................................................294.6.22株H5N6亚型AIV在SPF鸡体内的复制情况....................................................294.6.3SPF鸡感染后口咽和泄殖腔的排毒情况.................................................................304.6.414d后存活的SPF鸡血清抗体测定结果................................................................304.72株H5N6亚型AIV对BABL/C小鼠的致病性试验结果........................................304.7.12株H5N6亚型AIV感染SPFBALB/C小鼠后的存活情况.................................304.7.22株H5N6亚型AIV感染SPFBALB/C小鼠后体重变化情况.............................314.7.32株H5N6亚型AIV在SPFBALB/C小鼠体内复制情况.....................................324.82株H5N6亚型AIV对豚鼠的致病性试验结果........................................................324.8.12株H5N6亚型AIV感染豚鼠后的存活情况.........................................................324.8.22株H5N6亚型AIV在豚鼠体内的复制情况.........................................................334.8.3豚鼠感染后鼻腔和泄殖腔的排毒情况....................................................................334.8.414d后存活的豚鼠血清抗体测定结果.....................................................................344.92株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性与跨种传播试验结果................................344.9.12株H5N6亚型AIV感染北京鸭后的存活情况.....................................................344.9.22株H5N6亚型AIV在北京鸭体内的复制情况.....................................................344.9.3北京鸭感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情况........................................354.9.414d后存活的北京鸭和鹌鹑的血清抗体测定结果.................................................354.102株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性与跨种传播试验结果..................................354.10.12株H5N6亚型AIV感染鹌鹑后的存活情况.......................................................354.10.22株H5N6亚型AIV在鹌鹑体内的复制情况.......................................................364.10.3鹌鹑感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情况..........................................364.10.414d后存活的鹌鹑和北京鸭的血清抗体测定结果...............................................375讨论..................................................................................................................................42全文总结..............................................................................................................................46致谢..............................................................................................................................47参考文献..............................................................................................................................48附录：攻读硕士学位期间的科研成果..............................................................................52X 1前言1.1禽流感概述禽流感（AvianInfluenza,AI）也称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟（殷震等，1998；甘孟侯，2004），是由A型流感病毒引起的禽类的一种急性、烈性和高度接触性传染病。根据禽流感的致病性强弱可分为高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza，HPAI）和低致病性禽流感（LowPathogenicAvianInfluenza，LPAI）和无致病性禽流感（Non-PathogenicAvianInfluenza，NPAI）3种（Swayneetal,2000）。HPAI是由H5亚型或H7亚型AIV引起的一种禽类烈性传染病，是我国的一类动物疫病，属于世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）法定报告的动物疫病（Henningsonetal,2015）。AIV流行范围广，传播快，危害大，不仅可以感染禽类，还可以感染猪、马和海洋哺乳动物等（Chenetal,2014），偶尔也可以感染人，是重要的人畜共患病（Lietal,2015）。1878年，禽流感首次在意大利暴发，当时称之为“鸡瘟”，随后AIV在世界各地陆续流行和暴发（Shortridge,1992），尤其是高致病性禽流感的暴发，给养殖业造成了严重的打击和危害。1.2禽流感病毒病原学特点AIV属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），A型流感病毒属，有囊膜的单股、负链和分节的RNA病毒。AIV通常具有多形性，典型的AIV为球形结构，直径约80-120nm，AIV粒子的基本结构由囊膜和核衣壳组成，蛋白纤突呈放射状排列在表层囊膜，一种是呈杆状的血凝素（HA），一种是蘑菇状的神经氨酸酶（NA），分别为三聚体和四聚体分子，是主要的抗原物质。AIV基因组全长约为13.6kb，由8个不连续的RNA片段组成，按长度大小顺序依次为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS，使其较具变异性和重组性（Stephensonetal,2003），可编码多种蛋白，其中包括HA蛋白、NP蛋白、PB1蛋白、PB2蛋白、PA蛋白、NA蛋白、M1蛋白和M2蛋白等8种结构蛋白和PA-X蛋白、PB1-F2蛋白、PB1-N40蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白5种非结构蛋白（Chenetal,2001；Wiseetal,2009）。AIV对热敏感，56℃30min即可灭活，-40℃可保存2个月以上，-70℃可保存数年，冻干后可长期保存（Zhouetal,2013）。1 1.3H5N6亚型禽流感1.3.1H5亚型AIV的流行状况与遗传变异1878年，高致病性禽流感（HPAI）首次在意大利暴发，导致鸡较高的死亡率，1959年在苏格兰首次分离出致病性禽流感病毒（Beckeretal,1967）。截至2015年7月17日，世界卫生组织（WHO）公开报导全球的16个国家，至少有844人感染禽流感病毒（H5N1），其中449人死亡，达到53.2%的病死率。H5亚型在全世界已成为严重的传染性疾病，包括1983年在美国发现的H5N2亚型禽流感病毒（Brughetal,1991），1983年在爱尔兰发现的H5N8（Chambersetal,1988），1994年在墨西哥发现的H5N2（Horimotoetal,1995），1997年在香港发现的H5N1病毒（Shortridge,1999），2003年至今，在欧亚大陆、非洲和北美发现的一系列H5亚型禽流感，已经导致家禽业巨大的经济损失和威胁着全球人类和动物健康，值得引起我们高度的关注。野生鸟类目前被认为是低致病性禽流感病毒（LPAI）的天然储宿主，并且是禽类的自然感染源，而且感染低致病性禽流感病毒会表现出亚临床症状或无临床症状。然而，在2005年4月，在中国西部的青海湖候鸟迁徙路线上，野生候鸟感染了H5N1高致病性禽流感病毒，导致了候鸟类出现了大批死亡，超过6000只候鸟死亡，这样高的致死率引起了高度的关注（Liuetal,2005），并且提出了关于H5高致病性禽流感病毒的来源和野生鸟类沿着迁徙路线对其进行长距离传播和扩散的问题。而与青海发现的H5N1病毒相似的H5N1亚型AIV迅速在整个非洲，欧洲和中东一带的候鸟迁徙路线传播，导致了数百人类感染此病毒病毒和数以千万的家禽死亡（Yingstetal,2006；Saadetal,2007），这表明在候鸟迁徙的过程中，野生的鸟类在禽流感病毒大规模的传播扩散中扮演着重要的角色（Olsenetal,2006）。1.3.2H5N6亚型AIV及抗原变异禽流感病毒种类繁多，遗传变异频繁，表面糖蛋白层面的变异包括了抗原漂移（antigenicdrift）和抗原转变（antigenicshift）2大类(谭伟等,2014)。AIV正是通过表面蛋白抗原的不断变异去适应宿主，从而更快地在宿主体内进行大量复制繁殖。而我国近年来出现的H5N6亚型HPAI被证实是通过抗原转变的变异方式，由H5N1亚型AIV与H6N6亚型AIV重组而来（Bietal.,2015)。H5N6亚型AIV曾以低致病形式在美国、德国和瑞典的禽类动物中存在，虽然H5亚型高致病性禽流感病毒的NA基因与其他亚型不断地发生重组演化，但没造成人类的感染致病，如今H5N6亚型AIV却对人的健康构成了严重威胁。根据在四川、2 江西等地的家禽、环境和鸟类中分离出的H5N6亚型AIV的研究发现，多数都是H5N1亚型AIV和H6N6亚型AIV重组而产生的一个新的亚型病毒（Bietal,2015），2014年以来暴发的高致病性H5N6亚型禽流感既给养殖业带来了巨大经济损失，也影响了人类的公共卫生和健康安全。1.3.3H5N6亚型AIV的公共卫生学意义2014年5月7日，中国四川省出现第一例人类感染H5N6病毒致死病例，是1位49岁的男性，并有接触过活禽。随后，在广东和云南省的3例人感染H5N6已由国家卫生和计划生育委员会（NHFPC）确认，这就对公众健康构成了巨大的安全隐患。2014年8月23日，在中国黑龙江省哈尔滨市共20550只鹅感染了HPAVH5N6病毒，其中17790只死亡，与其他禽流感感染症状一致，如H5N1、H5N2、H7N9和H10N8。基因遗传演化分析表明，它们都来自禽源毒株H5N6亚型高致病性禽流感病毒（Yangetal,2015；Panetal,2016）。虽然目前H5N6亚型禽流感病毒只在家禽中循环，但仍需要对病毒的遗传演化和传播进行有效的、长期的监控和研究，目的是获得流感病毒暴发前的警示和有效防止野生鸟类或候鸟跨省或跨洲迁徙时携带并传播病毒。之前有报道，在香港发现了由H7N9和H5N6病毒重组产生的H7N6亚型禽流感毒株（Lametal,2015），这给禽流感病毒研究和预防又带来了新的探索和挑战。1.4本研究的目的与意义自2014年4月13日起，新暴发的H5N6亚型禽流感病毒感染人类和家禽的病例不断被报道，对全球养禽产业造成了巨大的经济损失并对公众健康安全也构成了巨大的威胁。华南地区位于我国候鸟迁徙路线上，地理条件特殊，具有丰富水源和典型亚热带气候，为禽流感病毒提供了天然良好繁殖条件。加上当地大规模、高密度、多模式的禽类养殖模式，不利于禽流感的防控。由于当地居民长久生活习惯倾向于购买活禽的原因，增加了人与禽类直接接触机会，增加了人感染流感病毒的机率。了解该病毒的生物学特性就显得尤为的重要。本研究选取2014-2015年从广东野生鸟类样品中分离的2株H5N6亚型AIV代表毒株，分析其序列分子特性，并开展对SPF鸡、小鼠、豚鼠、北京鸭和鹌鹑的致病性研究，及时了解H5N6亚型AIV的分子特点、遗传变异和致病性，为该病的综合防控提供科学数据。3 2材料2.1病料和毒株背景本研究中2株H5N6亚型AIV为华南农业大学兽医学院传染病教研室分离保存，详细毒株背景信息见表2.1。表2.12株实验毒株背景信息毒株名称分离时间分离地区宿主来源简称A/Syrrhaptesparadoxus/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)2015珠海毛腿沙鸡ZH283A/Copsychussaularis/Guangdong/SW8/2014(H5N6)2014汕尾鹊鸲SW82.2鸡胚、试验动物和菌种9～11日龄SPF鸡胚和6周龄的SPF鸡由广东大华农动物保健品股份有限公司提供；SPF级BABL/C小鼠由北京维通利华生物有限公司提供。7日龄禽流感病毒抗体为阴性的非免疫北京鸭由广东某养殖场提供；2周龄禽流感病毒抗体为阴性的非免疫鹌鹑，5周龄禽流感病毒抗体为阴性的非免疫豚鼠，由广东某养殖场提供。2.3主要仪器设备96孔微量反应板，1mL、2.5mL和10mL规格的一次性注射器，0.22μm微孔滤膜（Millipore公司），TgradientPCR仪（德国WhatmanBiometra公司）；Milli-Q纯水仪（德国Millipore公司）；高压灭菌锅LaboAutoclave（日本Sanyo公司）；InGeniusBioImaging凝胶成像及分析系统（英国GYNDENE公司）；ZentrifugenRotofix32离心机（美国Hettich公司）；64型高速冷冻离心机（美国BeckmanAllegra公司）；DNA微型凝胶电泳系统（BIO-RAD，USA）；LRH-250Ⅱ型生化培养箱（广东省医疗机械厂）；ABI7500RealTimePCRsystem(美国AppliedBiosystems公司)；超低温冰箱、制冰机、微量移液器、超净工作台、恒温培养箱等。2.4主要试剂和分子生物学材料生理盐水：0.85%NaCl溶液，121℃高压30min，4℃保存。双抗：青链霉素先配成10000U/mL，过滤除菌，4℃保存。鸡外周血红细胞的制备：取采集健康非免疫成年公鸡血液（阿氏液抗凝）1～2mL，用灭菌PBS缓冲液洗涤2～3次，每次以1000r/min4℃离心10min；将压积红细胞用灭4 菌PBS缓冲液配成1%(V/V)悬液，立即使用或贮存于4℃冰箱，供血凝、血凝抑制试验使用。LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出液5g，Nacl10g，加800mL双蒸水充分溶解后调pH值至7.0，最后定容至1000mL，高压蒸汽灭菌后储存于4℃备用。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入细菌培养用琼脂糖至终浓度1.5%(W/V)，高压蒸汽灭菌后分装至高压灭菌处理的平皿中，冷却至室温后4℃储存备用。+氨苄液体培养基：LB肉汤于用前加入Amp至终浓度100mg/mL，4℃备用。LB选择性固体培养基：用微波炉融化LB固体培养基后，待温度降至50℃左右+后加入Amp至终浓度100mg/mL，摇匀后迅速分装到高压灭菌处理的平皿中，冷却至室温，4℃储存备用。缓冲液1×TSS：事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100mL去离子水后封装，不用灭菌。取干净的100mL量筒和100mL烧杯，用量筒量取100mL去离子水，加入至烧杯中，取1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10gPEG(MW=3350)，5mLDMSO，5mL的1M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。50×TAE电泳缓冲液：将Tris-Base121g，冰醋酸28.6mL，Na2EDTA·2H2O18.6g，最终用去离子水定容至500mL。使用时将50×TAE贮存液稀释为1×TAE即可。TrizolreagentRNA提取试剂盒、M-MLV、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、随机引物（Randomprimers，20pmol/µL）、RNA酶抑制剂（RibonucleaseInhibitor，RNasin）、DL2000DNAmarker以及pMD19-TVector均为TaKaRa公司产品；ReverTraAceQpcrRTMasterMixwithgDNARemover；SYBRqPCRMix均为TOYOBO公司产品；GelExtractionKit（2000）DNA凝胶回收试剂盒和TotalRNAKitI提取试剂盒为OMEGA公司产品；DMEM、血清为GIBCOBRL公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯产品。2.5分子生物学软件序列分析软件Lasergene7(version7.00，包括EditSeq，MegAlign，SeqBuilder等软件)为DNAstar公司产品；引物设计软件PrimerPremier（Version5.0）为PREMIERBiosoftInternational公司产品开发的分析软件。5 3方法3.1H5N6病毒的分离每个样品中加入5000IU的双抗作用半小时后，取0.2mL处理好的样品，尿囊腔接种3个9～11日龄SPF鸡胚，每隔12h照胚1次，37℃恒温孵育24～48h（弃去24h内的死胚），48h后4℃过夜无菌收取鸡胚尿囊液，测定HA及交叉血凝抑制实验，收集HA反应阳性、HI反应中与H5亚型标准血清成阳性，但与H1、H3、H6、H7、H9亚型及新城疫标准血清反应成阴性的鸡胚尿囊液，血清阴性样品继续盲传第二代，阳性样品-80℃冰箱保存备用。3.2H5N6亚型AIVHA、NA基因的分子生物学鉴定3.2.1引物设计通过GenBank中已录入的H5N6亚型AIV的HA、NA序列，运用DNAStarlesegene(version7.1)软件和Oligo6软件进行基因序列分析，设计针对于H5N6亚型AIV的HA、NA的鉴定引物H5-Low、H5-Up以及N6-Low、N6-Up和反转录引物（见表3.1）。表3.1H5N6亚型AIV的HA、NA基因鉴定引物序列及反转录引物序列名称上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）H5TGGCAGGGAATGGTAGATGTAGGGAACTCGCCACTGTTGN6AGCAAAAGCAGGGTGAAAATGAGTAGAAACAAGGGTGTTTT反转引物AGCGAAAGCAGG3.2.2H5N6亚型AIV的RNA提取Trizol法提取RNA：（1）吸取纯化好的500μL病毒尿囊液到无菌去RNA酶的1.5mL的离心管中，加750μL提前预冷的TrizolLSReagent，剧烈震荡，混匀，室温放置5min；（2）加氯仿300μL，混匀，4℃12000r/min，15min离心，将约600μL上层液吸至另一个无菌去RNA酶的1.5mL离心管中；（3）加600μL异丙醇，混匀，-20℃放置30min后，4℃12000r/min离心15min，弃去上清；（4）加入1mL提前预冷的75%乙醇，缓慢颠倒，混匀，4℃，12000r/min，离6 心10min，弃去上清；（5）风干后加入DEPC水10μL，-80℃保存或直接反转录。3.2.3H5N6亚型AIV的cDNA合成参照TAKARA公司反转录酶（M-MLV）说明书，将各试剂、模板依次加入0.5mL去RNA酶离心管中，37℃水浴1小时即得到cDNA，反转后cDNA放于-20℃冰箱保存或直接用于体外PCR微量扩增，反转录体系(60μL)如下：RNA30μLMLV1μL5×MLV-Buffer12μLdNTP12μL反转引物3μLRRI2μL总体积60μL在0.2mLPCR管中配置20μL体系的PCR混合液，同时设置阴性对照（将体系中cDNA用水代替；P1为H5/N6鉴定上游引物；P2为H5/N6鉴定下游引物）。反应体系如下：rTaqDNA聚合酶1μL10×rTaqbuffer2μLdNTP(2.5mmol/uL)2μLP10.5μLP20.5μLcDNA2μL无菌去离子水12μL总体积20μL20μL的PCR反应体系配好后放入PCR扩增仪中扩增，反应程序如下：95℃预变性5min；94℃变形30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；72℃终延伸7min，30个循环，4℃保存。7 PCR结束后将产物点样于浓度为1%的琼脂凝胶中进行电泳，100V恒压，25min，观察检测阳性的目的片段。3.3H5N6亚型AIV的有限稀释法纯化-7（1）将病毒原液按照10倍稀释法用无菌的DMEM细胞培养液稀释至10；-3-7（2）选取10~10稀释液分别接种于9~11日龄SPF鸡胚各3枚，放置37℃培养箱中培养，每12h照胚1次，弃去24h内死亡鸡胚，之后每12h照胚，死亡鸡胚放置4℃保存，收集鸡胚尿囊液并测定每个鸡胚的血凝价，保存稀释倍数最高且血凝价较高的鸡胚尿囊液并记为F1代病毒；-5-8-6-10（3）按照同样方法稀释第一代病毒10~10和10~10接胚、培养、收胚、HA测定同样方法保存F2代、F3代；（4）F3代病毒按照1000倍稀释接种于3枚SPF胚，37℃培养箱培养72h后收取尿囊液并测定血凝价HA，并用H1、H3、H5、H6、H7、H9标准血清和新城疫阳性血清做HI试验，确定是否为混合毒；（5）收集HA大于5的鸡胚尿囊液，并标记HA效价、日期和编号入库保存。3.4鸡胚半数感染量（EID50）的测定-5-10将纯化好的AIV按照10倍稀释法稀释10~10稀释度接胚，每个稀释度各接5枚9~11日龄非免疫胚，0.2mL/枚，37℃培养，弃去12h内死亡鸡胚，测定所有感染鸡胚的尿囊液血凝活性，来判断该鸡胚是否被感染。通过Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。距离比值=（高于50%感染数-50%）/（高于50%感染数-低于50%感染数）LogEID50=高于50%的稀释度的对数+距离比值×稀释因数3.5H5N6亚型AIV的全基因序列扩增3.5.1引物设计通过GenBank中已录入的H5N6亚型AIV的8个基因片段序列，运用DNAStarlesegene(version7.1)软件和Oligo6软件进行基因序列分析，设计针对于H5N6亚型AIV的8个全长扩增引物和PB1、PB2、PA中间引物（见表3.2）。8 表3.2H5N6亚型AIV全基因扩增引物引物上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）名称PB21AGCRAAAGCAGGTCAAWTATATTCAACTGCYTTTATCATGCAMTCYTCPB22GCAACRGCTATYYTRAGGAAAGCAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAPB11TATTAGCAAAAGCAGGCAGGTTGGTTCCTTGTGATGPB12CATACATCACAAGGAAACGAGTAGAAACAAGGCATTTPA1TATTAGCAAAAGCAGGTACTCTTTGCARTCCTCAAAGTPA2TAAGCAGGTGCTGGCAGAGAGTAGAAACAAGGTACTTHAAGCAAAAGCAGGGGTMYRATCTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACANPAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTNAAGCAAAAGCAGGAGTTYAAAATGAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTSAACMAGCAAAAGCAGGTAGATRTTKAAAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCNSATTAGCAAAAGCAGGGTGGAGTAGAAACAAGGGTGTT3.5.2H5N6亚型AIV的RNA提取同3方法中3.2.23.5.3H5N6亚型AIV的cDNA合成同3方法中3.2.33.5.4H5N6亚型AIV全基因的PCR扩增进行PCR扩增时使用50μL反应体系，同时要进行阴性对照，具体反应体系如下：10×buffer5μLE×TaqTMPolymerase1μLdNTP5μL上游引物1μL下游引物1μLcDNA3μL去离子水34μL总体积50μL将PCR扩增体系配好后放入PCR仪中进行扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min，9 94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，72℃终延伸10min；4℃保存。3.5.5目的片段的检测将PCR产物与3μLLoadingBuffer混匀进行电泳（1%浓度的琼脂凝胶），电泳同时在一个点样孔中加入5μLDNAMarker2000，100V电压电泳25min后，用凝胶成像仪观察，并切取正确的基因片段条带。3.5.6PCR扩增结果的回收及纯化利用OMEGA公司E.Z.N.A.TMGelExtractionKit胶回收试剂盒进行PCR产物回收，操作过程如下：（1）在装有目的片段的离心管中加入400μLBindingBuffer溶胶液，55~60℃水浴溶胶，每间隔2~3min震荡至全部溶解；（2）待全部溶解后转移至吸附，10000r/min，离心2min，弃去收集管中液体；（3）重复（2）步骤1次；（4）向吸附柱中加700μLWashBuffer，10000r/min，离心2min，弃收集管液体；（5）重复（4）步骤1次；（6）10000r/min，离心3min，空离1次，弃掉多余水分，将收集管弃掉换一个新的1.5mL离心管；（7）向滤膜中央加入30μL去离子水，室温静止5min后12000r/min，离心3min，弃掉吸附柱，1.5mL离心管中即为PCR扩增产物。3.5.7目的片段与PGEM-T载体的连接与转化参照PMD18-T载体说明书进行目的片段连接反应。反应体系如下：目的基因3μLpGEM-T1μLT4连接酶1μL2×Buffer5μL总体积10μL反应体系配好后放入16℃恒温连接仪中，连接5h，得到连接产物后用于转化。10 将上述连接产物加入到DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30min后42℃水浴热激90s，继续冰浴5min，结束后向离心管中加入500μL没有抗性的LB培养基，然后放37℃摇床中震荡45min，4000r/min离心5min，离心后弃掉200μL培养基，将离心管底的沉淀吹打混匀后，涂于具有Amp﹢抗性LB固体培养皿中，待菌液吸收后倒置与37℃恒温培养箱中，培养12~16h后挑取单菌落培养。3.5.8筛选与鉴定阳性菌落将每个1.5mL离心管中加入500μLAmp﹢抗性LB液体培养基，挑取大小适中的单菌落于1.5mL离心管中，200r/min37℃摇床震荡8~10h后进行菌液PCR鉴定。菌液PCR反应体系如下：2×rTaqPCRMix10μL上游引物0.5μL下游引物0.5μL菌液1μL去离子水8μL总体积20μL进行菌液PCR时要同时做阴阳性对照，PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环，72℃终延伸7min；4℃保存。将PCR产物进行琼脂凝胶电泳，电泳15min后，用凝胶成像仪观察结果，阴阳性对照成立时，阳性为转化的目的产物。3.5.9各目的片段序列的测定与拼接目的基因的序列测定由上海英淮捷基贸易有限公司完成，测序后对得到的基因序列进行拼接，拼接过程中使用美国DNAStar公司的DNAStarlesegene(version7.1)软件和GenBank数据库协同完成。3.5.10H5N6亚型AIV全基因序列分子特性分析和遗传演化分析通过从GenBank数据库中搜索H5N6亚型AIV全基因序列，应用MEGA5.05以及DNAStar软件绘制基因遗传进化树，进行全基因序列分子特性分析和遗传演化分析。11 3.62株H5N6亚型AIV对SPF鸡的致病性试验将6周龄的SPF鸡随机分为2组，采取脚标编号记录，每组9只，分别为ZH2836和SW8组，其中每组6只SPF鸡经滴鼻点眼的方法接种0.2mL含有10EID50的病毒尿囊液，另外3只作为同居组；同时另取6只接种同样剂量无菌PBSSPF鸡作为空白对照组（见表3.3）。攻毒后连续观察14d记录SPF鸡的临床症状和死亡情况。在攻毒后的第3d，各组随机剖检攻毒组和空白对照组各3只，无菌采集其盲肠扁桃体、心、气管、肺、脑、肝、脾、肾、法氏囊和胰腺10个脏器，-80℃保存，用于病毒分离和相关检测。另外在攻毒后的第2、3、5、7、9d定时采集口咽和泄殖腔棉拭子置于含10000U双抗的PBS中，-80℃保存，用于病毒分离，14d后存活的SPF鸡采血检测其血清是否转阳性。表3.32株H5N6亚型AIV对SPF鸡的致病性试验分组毒株动物感染组（只）同居组（只）接种剂量6ZH283ZH283SPF鸡6310EID50/0.2mL6SW8SW8SPF鸡6310EID50/0.2mL对照组PBSSPF鸡6/0.2mL3.6.12株H5N6亚型的AIV在SPF鸡体内复制情况利用鸡胚分离法来测定病毒在SPF鸡体内的复制情况。将在无菌条件下获取的各组织样品称取1g，加入1mL的含5000U双抗的无菌PBS充分研磨至匀浆状，然后转移至离心管中，4℃12000r/min离心5min。用含有5000U双抗的PBS将各脏器匀浆上清连续10倍稀释，每个稀释度接种3枚9～11日龄非免疫鸡胚，每枚0.1mL。37℃培养48h后测定鸡胚尿囊液的血凝效价，从而测定病毒在其体内各脏器的复制情况，病毒的滴度的计算按照Reed-Muench法。3.6.22株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后排毒情况利用鸡胚分离法测定病毒感染SPF鸡后的排毒情况。将攻毒后第2、3、5、7、9d采集的口咽和泄殖腔拭子分别加入含10000U双抗的PBS后，充分震荡混匀后12000r/min4℃离心5min，取上清用含双抗的PBS按10倍梯度稀释。每个稀释度分别接种3枚9～11日龄非免疫鸡胚，每枚0.1mL。37℃培养48h后测定鸡胚尿囊液的血凝效价，按照Reed-Muench法计算其病毒滴度。12 3.72株H5N6亚型AIV对BABL/C小鼠的致病性试验将体重为12~14g重的SPF级BABL/C雌性小鼠随机分成3组，分别编号，其中1组作为阴性空白对照组，其他2组为实验组，每组11只小鼠。攻毒前对每组中需要称重的小鼠进行编号、记录，实验组中每只小鼠分别用干冰麻醉后以滴鼻方式接种26株不同的H5N6亚型AIV（ZH283和SW8），每只接种剂量为50μL（含10EID50病毒），对照组以同样方法麻醉后接种50μL等量的PBS。攻毒后的第3d和第5d每组剖杀3只小鼠，取其脑、肺、鼻甲骨、肾和脾5个组织脏器，用于测定不同病毒感染SPF小鼠后各个组织脏器中病毒复制能力及组织嗜性。之连续14d每天观察记录各组小鼠状态和死亡情况，每天对编号小鼠进行体重称量、记录，并在14d后对存活小鼠采血，分离血清来测定小鼠抗体转阳情况。3.7.12株H5N6亚型的AIV在小鼠体内复制情况利用鸡胚分离法来测定病毒在小鼠体内的复制情况，具体方法参照3.6.1。3.82株H5N6亚型AIV对豚鼠的致病性试验5周龄健康的非免疫豚鼠购买回来后，对其禽流感病毒和新城疫病毒抗体进行检测，结果表明其HI抗体都在3孔以下，暂养1周无异常后进行实验。将5周龄的豚鼠随机分为2组，采取脚标编号记录，每组9只，分别为ZH283和SW8组，其中每6组6只豚鼠经滴鼻点眼的方法接种0.2mL含有10EID50的病毒尿囊液，另外3只作为同居组；同时另取6只接种同样剂量无菌PBS豚鼠作为空白对照组（见表3.4）。攻毒后连续观察14d记录豚鼠的临床症状和死亡情况。在攻毒后的第3d，各组随机剖检攻毒组和空白对照组各3只，无菌采集其小肠、鼻甲骨、心、气管、肺脏、脑、肝脏和胰腺8个脏器，-80℃保存，用于病毒分离和相关检测。另外在攻毒后的第2、4、6、8、10d定时采集鼻腔和泄殖腔棉拭子置于含10000U双抗的PBS中，-80℃保存，用于病毒分离，14d后存活的豚鼠采血检测其血清是否转阳性。表3.42株H5N6亚型AIV对豚鼠的致病性与传播试验分组毒株动物感染组（只）同居组（只）接种剂量6ZH283ZH283豚鼠6310EID50/0.2mL6SW8SW8豚鼠6310EID50/0.2mL对照组PBS豚鼠6/0.2mL13 3.8.12株H5N6亚型的AIV在豚鼠体内复制情况利用鸡胚分离法来测定病毒在豚鼠体内的复制情况，具体方法参照3.6.1。3.8.22株H5N6亚型AIV感染豚鼠后排毒情况利用鸡胚分离法测定病毒感染豚鼠后的排毒情况，具体方法参照3.6.2。3.92株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性与跨种传播试验1周龄健康的非免疫北京鸭购买回来后，对其禽流感病毒和新城疫病毒抗体进行检测，结果表明其HI抗体都在3孔以下，暂养1周无异常后进行实验。将1周龄的北京鸭随机分为2组，采取脚标编号记录，每组9只，分别为ZH283和SW8组，其6中每组6只北京鸭经滴鼻点眼的方法接种0.2mL含有10EID50的病毒尿囊液，3只北京鸭作为同居组，另外放进3只鹌鹑作为同居组，用来研究H5N6亚型AIV是否可以跨种传播；同时另取6只接种同样剂量无菌PBS北京鸭作为空白对照组，具体见表3.5。攻毒后连续观察14d记录北京鸭和鹌鹑的临床症状和死亡情况。在攻毒后的第3d，各组随机剖检攻毒组和空白对照组各3只，无菌采集其盲肠扁桃体、法氏囊、心、脾脏、气管、肺脏、脑、肾脏、肝脏和胰腺10个脏器，-80℃保存，用于病毒分离和相关检测。另外在攻毒后的第2、4、6、8、10d定时采集咽喉和泄殖腔棉拭子置于含10000U双抗的PBS中，-80℃保存，用于病毒分离，14d后存活的动物采血检测其血清是否转阳性。表3.52株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性与跨种传播试验感染组同居组鹌鹑同居组分组毒株动物接种剂量（只）（只）（只）6ZH283ZH283北京鸭63310EID50/0.2mL6SW8SW8北京鸭63310EID50/0.2mL对照组PBS北京鸭6//0.2mL3.9.12株H5N6亚型的AIV在北京鸭体内复制情况利用鸡胚分离法来测定病毒在北京鸭体内的复制情况，具体方法参照3.6.1。3.9.22株H5N6亚型AIV感染北京鸭和鹌鹑后的排毒情况利用鸡胚分离法测定病毒感染北京鸭和鹌鹑后的排毒情况，具体方法参照3.6.2。14 3.102株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性与跨种传播试验2周龄健康的非免疫鹌鹑购买回来后，对其禽流感病毒和新城疫病毒抗体进行检测，结果表明其HI抗体都在3孔以下，暂养1周无异常后进行实验。将2周龄的鹌鹑随机分为2组，采取脚标编号记录，每组9只，分别为ZH283和SW8组，其中每6组6只鹌鹑经滴鼻点眼的方法接种0.2mL含有10EID50的病毒尿囊液，3只鹌鹑作为同居组，另外放进3只北京鸭作为同居组，用来研究H5N6亚型AIV是否能跨种传播；同时另取6只接种同样剂量无菌PBS鹌鹑作为空白对照组，具体见表3.6。攻毒后连续观察14d记录鹌鹑和北京鸭的临床症状和死亡情况。在攻毒后的第3d，各组随机剖检攻毒组和空白对照组各3只，无菌采集其盲肠扁桃体、心、脾脏、气管、肺脏、脑、肾脏、肝脏和胰腺9个脏器，-80℃保存，用于病毒分离和相关检测。另外在攻毒后的第2、4、6、8、10d定时采集咽喉和泄殖腔棉拭子置于含10000U双抗的PBS中，-80℃保存，用于病毒分离，14d后存活的动物采血检测其血清是否转阳。3.10.12株H5N6亚型的AIV在鹌鹑体内复制情况利用鸡胚分离法来测定病毒在鹌鹑体内的复制情况，具体方法参照3.6.1。3.10.22株H5N6亚型AIV感染北京鸭后排毒情况利用鸡胚分离法测定病毒感染鹌鹑和北京鸭后的排毒情况，具体方法参照3.6.2。表3.62株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性和跨种传播试验感染组同居组北京鸭同居组分组毒株动物接种剂量（只）（只）（只）6ZH283ZH283鹌鹑63310EID50/0.2mL6SW8SW8鹌鹑63310EID50/0.2mL对照组PBS鹌鹑6//0.2mL4结果与分析4.1毒株的初步分离鉴定结果样品用鸡胚接种，收取鸡胚尿囊液，经血清学方法鉴定，鸡胚尿囊液的HA结果为阳性，HI试验中能被H5标准阳性血清完全抑制，与H1、H3、H6、H7、H9以及新城疫标准血清反应则为阴性，初步鉴定为H5亚型禽流感病毒。15 4.2毒株的HA、NA基因的分子生物学鉴定结果用DNA测序方法鉴定毒株，HA、NA基因的检测结果分别为H5、N6。结果表明，通过血清学检测结果与用分子生物学检测的结果一致，被检测毒株为H5N6亚型AIV。4.3H5N6亚型AIV纯化的结果通过用有限稀释法去纯化H5N6亚型AIV后，再检测鉴定发现：纯化后毒株与H1、H3、H6、H7、H9及新城疫标准血清反应，HI结果全部为阴性，不存在交叉反应的阳性现象，只有H5亚型标准阳性血清可以抑制H5N6亚型禽流感毒株，实验结果证明，分离鉴定的2株H5N6亚型禽流感毒株已经完成纯化。4.4鸡胚半数感染量（EID50）测定结果用纯化后H5N6亚型禽流感毒株接种9~11日龄非免疫鸡胚，进行病毒扩繁,37℃孵化培养箱培养，收取鸡胚尿囊液后，采用HA方法测定，鸡胚是否存在病毒感染，记录各稀释度鸡胚感染数量，利用Reed-Muench法去计算病毒的EID50滴度。测得ZH283、SW82株研究毒株的EID50值结果（见表4.1）。表4.12株毒的鸡胚半数感染量（EID50）测定结果毒株分离时间分离地点宿主EID508.75ZH2832015珠海毛腿沙鸡10/mL8.5SW82014汕尾鹊鸲10/mL4.5H5N6亚型AIV的全基因序列及分析结果4.5.1HA基因序列分析对2株H5N6亚型禽流感病毒进行分子学性状检测、全长测定且与特征性流感病毒序列比对。2株毒株的HA基因全长为1776个核苷酸，其中包含一个1704个核苷酸的完整ORF，能编码568个氨基酸。遗传演化进化树分析表明（见图4.1），2株病毒的HA基因属于H5N1亚型，进化分支属2.3.4.4；SW8和参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)亲缘关系达到98.1%,ZH283和参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)亲缘关系较近，达到98.8%。2株毒株的裂解位点分析表明，SW8和ZH283在HA的裂解位点是-RRRKR↓G-，16 由多个连续的碱性氨基酸K/R组成，这裂解位点符合高致病禽流感病毒典型的分子特征。对2株病毒的潜在糖基化位点分析发现：2株H5N6亚型禽流感毒株在HA1分子里存在6个相同的潜在N端糖基化位点，分别是26（NXS）、27（NST）、39（NVT）、181（NNT）、209（NPT）和302（NSS），而HA2分子中的糖基化位点是499（NGT）和558（NGS）。另外，SW8在100位和170位存在2个潜在的N端糖基化位点分别是NPS和NDT。而ZH283在100位和170位是不存在糖基化位点的（见表4.2）。对2株病毒的HA的受体结合位点分析发现：HA1分子的受体结合位点226位和228位分别是Q和G(H3亚型）没有发生突变，仍然可认为是禽类的特异性受体结合位点，符合禽流感病毒的分子特征（Haetal,2001）。SW8的155位点没有发生突变仍为I，然而ZH283的155受体结合位点突变为T，这分子特性表明ZH283对人源受体有一定的亲和关系（Tamurietal,2009；Lietal,2014）。表4.22株H5N6亚型AIVHA蛋白潜在糖基化位点表毒株26位27位39位100位170位181位209位302位499位558位ZH283NXSNSTNVT--NNTNPTNSSNGTNGSSW8NXSNSTNVTNPSNDTNNTNTPNSSNGTNGS4.5.2NA基因序列分析2株H5N6亚型禽流感毒株NA基因完整的ORF框为1380个核苷酸。把NA基因进化树描绘成2个主要的分支EurasianLineage和North-AmericanLineage（见图4.2）。2株H5N6亚型AIV毒株的NA基因进化分析表明，SW8和ZH283都位于EurasianLineage分支的亚分支ST192-like，SW8和参考毒株A/Yunnan/0127/2015(H5N6)有99.1%的同源性，和A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)毒株有98.5%的同源性。ZH283则和参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)有99.1%的同源性，和A/Yunnan/0127/2015(H5N6)毒株则只有98.3%的同源性。对这2株病毒的NA基因的糖基化位点分析中发现有7个潜在的糖基化位点（见表4.3），分别是51（NET）、67(NFT)、70（NIT）、86(NLT)、146(NGT)、201(NAS)和402（NWS），均没有发生突变，这一分子特征与提高对鼠的致病毒力有密切关联。NA全长分析表明，NA蛋白的H274Y位点没有突变，这一分子特征表明这2个毒株17 可能对神经氨酸酶抑制药物敏感，如磷酸奥司他韦（Suzukietal,2003；Scholtisseketal,1998）表4.32株H5N6亚型AIVNA蛋白潜在糖基化位点表NA蛋白潜在的糖基化位点毒株51位67位70位86位146位201位402位ZH283NETNFTNITNLTNGTNASNWSSW8NETNFTNITNLTNGTNASNWS4.5.3PB2基因序列分析ZH283和SW8的PB2基因长度为2341bp，完整的开放阅读框由2280个核苷酸组成，可推导编码759个氨基酸。其5’非编码区有27个核苷酸，3’非编码则有34个核苷酸。遗传演化分析（见图4.3）可以得出，2株H5N6亚型禽流感病毒均在EurasianLineage分支，参考毒株A/Yunnan/0127/2015(H5N6)和A/Hongkong/156/1997(H5N1)也均在EurasianLineage分支上。ZH283的PB2基因和毒株A/Yunnan/0127/2015(H5N6)的PB2基因有86.0%的同源性，和人源毒株A/Hongkong/156/1997(H5N1)则有88.9%的同源性。氨基酸序列分析(见表4.4)表明这2株病毒的PB2基因在E627K或D701N这2个位点都没有突变，这些序列位点与A型流感病毒的跨物种传播和病毒复制有着密切的关联（Massinetal,2001；Lietal,2005），禽源病毒的627位为E而人源病毒的627位则为K，表明本研究的这2株H5N6亚型AIV符合禽源性流感病毒的分子特征。而在位点198和位点317分别是K和M，这一分子特征表明对鼠只有低致病性或没有致病性（Katzetal,2000）。在氨基酸的271、590和591位点均没有突变，分别为T、G和Q。表4.42株H5N6亚型AIVPB2基因位点分析表PB2基因位点毒株198271371590591627701ZH283KTMGQEDSW8KTMGQED18 19A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)31A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)33A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)54A/goose/Shantou/1763/2014(H5N6)34A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)12A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)A/chicken/Dongguan/3363/2013(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1395/2013(H5N6)2633A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)5498A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)99A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)A/Yunnan/0127/2015(H5N6)100A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)8199A/chicken/Yichang/lung/1/04(H5N1)Clade2.3.4.440A/muscovyduck/Vietnam/LBM631/2014(H5N1)98A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)A/duck/Shandong/Q1/2013(H5N8)Clade2.3.4A/duck/Jiangsu/m234/2012(H5N2)3999A/duck/Jiangsu/k1203/2010(H5N8)48A/breederduck/Korea/Gochang1/2014(H5N1)5399100A/duck/Zhejiang/6D18/2013(H5N8)A/goose/EasternChina/1112/2011(H5N2)10033A/Sichuan/26221/2014(H5N6)A/duck/Guangdong/wy19/2008(H5N5)Clade2.367A/quail/Jiangsu/k0104/2010(H5N5)99A/duck/EasternChina/108/2008(H5N1)39A/chicken/Malaysia/5223/2007(H5N1)A/Anhui/1/2005(H5N1)Clade2.3.4.19991A/duck/Hunan/1994/2007(H5N1)86A/peregrinefalcon/HongKong/810/2009(H5N1)Clade2.3.4.5A/duck/Hunan/29/2006(H5N1)6555A/chicken/Vietnam/NCVD/45/2007(H5N1)Clade2.3.4.3A/environment/Guizhou/2/2009(H5N1)100Clade2.3.4.295A/environment/Guizhou/4/2009(H5N1)A/chicken/Guiyang/3055/2005(H5N1Clade2.3.3100A/duck/Guiyang/3242/2005(H5N1)100A/duck/Hunan/127/2005(H5N1)Clade2.3.1A/duck/Hunan/139/2005(H5N1)A/Chicken/Shantou/810/05(H5N1)63A/magpierobin/HongKong/1097/2008(H5N1)8865A/magpierobin/HongKong/1897/2008(H5N1)9299A/Guangxi/1/2009(H5N1)A/greyheron/HongKong/3088/2007(H5N1)Clade2.3.2100A/chicken/Primorje/1/2008(H5N1)A/Hubei/1/2010(H5N1)90A/duck/Lao/471/2010(H5N1)100100A/tundraswan/Mongolia/1T/2010(H5N1)37A/goose/Hungary/3413/2007(H5N1)41A/Nigeria/6e/07(H5N1)A/Iraq/1/2006(H5N1)100Clade2.295A/Turkey/15/2006(H5N1)92A/chicken/Egypt/088S-NLQP/2008(H5N1)100A/chicken/Egypt/9403NAMRU3-CLEVB214/2007(H5N1)A/chicken/Korea/ES/03(H5N1)Clade2.56684A/chicken/Indonesia/7/2003(H5N1)A/chicken/Indonesia/11/2003(H5N1)100A/Indonesia/CDC594/2006(H5N1)98Clade2.150A/Indonesia/CDC595/2006(H5N1)68A/Indonesia/5/2005(H5N1)100A/Indonesia/7/2005(H5N1)A/Chicken/Yunnan/447/05(H5N1)Clade2.4100A/Chicken/Yunnan/493/05(H5N1)93100A/Cambodia/JP52a/2005(H5N1)Clade1A/Cambodia/R0405050/2007(H5N1)81A/chicken/Anhui/T5/2006(H5N1)Clade980A/chicken/Fujian/1042/2005(H5N1)99A/Ck/HK/61.9/02(H5N1)Clade8A/Ck/HK/YU22/2002(H5N1)96100A/duck/Guangxi/668/2004(H5N1)Clade550A/goose/Guangxi/914/2004(H5N1)42A/blackbird/Hunan/1/2004(H5N1)Clade6100A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)33A/HongKong/156/97(H5N1)Clade09162A/Chicken/HongKong/YU562/01(H5N1)A/Chicken/HongKong/FY77/01(H5N1)Clade399A/goose/Fujian/bb/2003(H5N1)71Clade4A/goose/Guiyang/337/2006(H5N1)A/Beijing/01/2003(H5N1)53A/chicken/Hebei/326/2005(H5N1)100A/Ck/Shanxi/2/2006(H5N1)100Clade7A/CK/SX/10/20069(H5N1)89A/CK/JS/18/2008(H5N1)79Clade7.2100A/CK/HB/A/8/2009(H5N1)0.005图4.1H5N6亚型AIVHA基因遗传进化树“●”表示禽源H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒株19 99A/duck/Jiangxi/10160/2014(H5N6)A/blackchicken/Jiangxi/10129/2014(H5N6)78A/duck/Jiangxi/13469/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)100A/environment/Zhenjiang/C13/2013(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXJ24/2014(H5N6)64A/duck/Sichuan/NCJPL7/2014(H5N6)A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)97A/Sichuan/26221/2014(H5N6)5765A/environment/Sichuan/NCLL1/2014(H5N6)56A/chicken/Hunan/S4495/2010(H6N6)81A/duck/Fujian/7794/2007(H6N6)96A/duck/Fujian/5239/2007(H6N6)A/duck/Fujian/10706/2006(H6N6)93A/duck/Fujian/2818/2007(H6N6)76A/duck/Fujian/3756/2007(H6N6)72A/duck/Fujian/2087/2007(H6N6)A/goose/Shantou/18647/2005(H6N6)A/mallard/Shantou/972/2005(H6N6)100A/wildduck/Shantou/192/2004(H6N6)77A/duck/Shantou/6233/2004(H6N6)ST192-likeA/duck/Shantou/1984/2007(H6N6)A/duck/Guangdong/S4251/2010(H6N6)EurasianLineage88A/duck/Guangdong/S1419/2011(H6N6)A/swine/Guangdong/K6/2010(H6N6)96A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)5955A/silkiechicken/Dongguan/2809/2013(H5N6)69A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)A/duck/Dongguan/2685/2013(H5N6)58A/duck/Dongguan/3069/2013(H5N6)100A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)10060A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)A/duck/Vietnam/LBM758/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/2269/2013(H5N6)92A/chicken/Jiangxi/12272/2014(H10N6)77A/chicken/Jiangxi/12782/2014(H10N6)66A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)72A/chicken/LaosLPQ001/2014(H5N6)A/goose/Shantou/1763/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/552/2013(H5N6)A/Yunnan/0127/2015(H5N6)A/duck/Shantou/4893/2001(H6N6)A/duck/Yunnan/87/2007(H7N6)100A/duck/Hunan/S11893/2012(H4N6)ST4893-like59A/mallard/Iceland/1007/2011(H3N6)99A/American/blackduck/NewBrunswick/00464/2010(H4N6)99A/American/blackduck/NewBrunswick/00618/2010(H3N6)A/mallardduck/Minnesota/Sg/00116/2007(H3N6)100A/bluewingedteal/ALB/266/1982(H6N6)North-AmericanLineageA/mallard/California/1418/2013(H5N6)75A/mallard/Minnesota/182751/1998(H6N6)49A/mallard/Ohio/664/2002(H6N6)0.05图4.2H5N6亚型AIVNA基因遗传进化树“●”表示禽源H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒株20 A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)A/chicken/Dongguan/4259/2013(H5N6)61A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/2269/2013(H5N6)A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)70A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1395/2013(H5N6)52A/chicken/Dongguan/3363/2013(H5N6)A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)58A/silkiechicken/Dongguan/2809/2013(H5N6)100A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)5899A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)100A/duck/Vietnam/LBM632/2014(H5N1)100A/muscovyduck/Vietnam/LBM631/2014(H5N1)A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)82A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)96A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)100A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)10093A/Sichuan/26221/2014(H5N6)51A/Hubei/1/2010(H5N1)A/Guangxi/1/2009(H5N1)100A/environment/Guizhou/2/2009(H5N1)A/Hunan/2/2009(H5N1)10091A/DK/FJ/897/2005(H5N1)A/CK/FJ/1042/2005(H5N1)100A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)100A/BHG/QH/5/2005(H5N1)99A/DK/Fujian/11094/2005(H5N1)96A/CK/Hunan/999/2005(H5N1)99A/CK/GD/191/2004(H5N1)A/DK/Guiyang/3242/2005(H5N1)40100A/GS/GY3422/2005(H5N1)EurasianLineage70A/Blackbird/hunan/1/2004(H5N1)51A/CK/GD/174/2004(H5N1)68A/CK/Korea/ES/2003(H5N1)A/CK/SX/2/06(H5N1)70A/BJ/01/03(H5N1)47A/IDN/CDC887/2006(H5N1)100A/IDN/CDC940/2006(H5N1)A/CK/IDN/PA/2003(H5N1)100A/DK/IDNS/MS/04(H5N1)63A/IDN/546H/2006(H5N1)97100A/IDN/CDC595/2006(H5N1)A/CK/VN/C58/2004(H5N1)84100A/VN/1194/2004(H5N1)A/DK/GX/50/2001(H5N1)100A/ck/HK/YU22/2002(H5N1)A/DK/GD/22/2002(H5N1)99A/SCK/HK/SF189/01(H5N1)79A/CK/HK/YU562/01/PB2(H5N1)A/duck/Eastern/China/108/2008(H5N1)100A/GS/GD/96(H5N1)100A/DK/GX/13/2004(H5N1)99A/CK/GX/12/2004(H5N1)100A/CK/GY/441/06(H5N1)96ADK/GX/1793/04(H5N1)95100A/GS/GX/2383/04(H5N1)A/DK/Hunan/1265/2005(H5N1)100A/DK/YN/4400/2005(H5N1)45A/munia/HK/2454/2006(H5N1)53A/China/GD01/2006(H5N1)A/treesparrow/henan/4/2004(H5N1)A/Yunnan/0127/2015(H5N6)A/HK/156/97(H5N1)9591A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)100A/mallard/California/1418/2013(H5N6)100A/mallard/California/1500P/2013(H5N6)A/environment/Maryland/1149/2006(H5N1)100A/mallard/Wisconsin/34/1975(H5N6)North-AmericanLineageA/duck/Minnesota/1525/1981(H5N1)86A/mallard/California/2531P/2011(H5N1)6796A/mallard/Manitoba/458/2005(H5N1)0.05图4.3H5N6亚型AIVPB2基因遗传进化树“●”表示禽源H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒株21 4.5.4PB1基因序列分析选取的2株H5N6亚型禽流感病毒的PB1基因均包含2341个核苷酸，其中包含长度为2274个核苷酸的完整ORF框，可推导编码757个氨基酸，其5’非编码区有24个核苷酸，3’非编码区则有43个核苷酸。遗传进化树（见图4.4）分析发现：2株H5N6亚型AIV的PB1基因，均位于EurasianLineage分支。参考毒株A/Yunnan/0127/2015(H5N6)、A/Hongkong/156/1997(H5N1)和A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)均在EurasianLineage分支上，但又分别位于不同的亚分支上。基因位点分析发现2株H5N6亚型AIV的13位都突变成P，677位和678位没有发生突变，仍为T和S。4.5.5PA基因序列分析选取的2株H5N6亚型禽流感病毒的PA基因均包含2233个核苷酸，其中包含长度为2151个核苷酸的完整ORF框，可推导编码716个氨基酸，其5’非编码区有24个核苷酸，3’非编码区则有58个核苷酸。遗传进化树（见图4.5）分析发现：2株H5N6亚型AIV的PA基因，均位于EurasianLineage分支上。参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)也在EurasianLineage分支上，而参考毒株A/Yunnan/0127/2015(H5N6)则位于North-AmericanLineage）分支上。选取的毒株ZH283和参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)在同一个亚分支上。基因位点分析发现2株H5N6亚型AIV的N615K都突变成K。638位没有发生突变，这是与病毒在细胞中生长有关的位点，仍为R。而与病毒复制相关的位点539仍为K，没有突变。另外，与聚合酶活性相关的510位，与致病性相关的224位和383位，都没有发生突变（见表4.5）。表4.52株H5N6亚型AIVPA基因位点分析表PA基因位点毒株224383510539615638ZH283SDHKKRSW8SDHKKR22 A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)48A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)98A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1395/2013(H5N6)9871A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)84A/silkiechicken/Dongguan/2809/2013(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXN11/2014(H5N1)100A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)98A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)94A/Sichuan/26221/2014(H5N6)100A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)10010054A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)22A/Hubei/1/2010(H5N1)A/Guangxi/1/2009(H5N1)A/China/GD01/2006(H5N1)67A/environment/Guizhou/2/2009(H5N1)45A/Hunan/2/2009(H5N1)69A/DK/Fujian/11094/2005(H5N1)A/CK/Hunan/999/2005(H5N1)A/munia/HK/2454/2006(H5N1)53100A/IDN/CDC887/2006(H5N1)A/IDN/CDC940/2006(H5N1)A/CK/IDN/PA/2003(H5N1)90A/DK/IDNS/MS/04(H5N1)A/IDN/546H/2006(H5N1)100A/IDN/CDC595/2006(H5N1)EurasianLineage100A/DK/Guiyang/3242/2005(H5N1)100A/GS/GY3422/2005(H5N1)A/DK/Hunan/1265/2005(H5N1)83A/DK/YN/4400/2005(H5N1)85A/BHG/QH/5/2005(H5N1)100A/turkey/Turkey/1/2005(H5N6)48A/CK/FJ/1042/2005(H5N1)97A/DK/FJ/897/2005(H5N1)100A/DK/GX/1793/04(H5N1)79A/GS/GX/2383/04(H5N1)70A/ck/HK/YU22/2002(H5N1)A/DK/GX/50/2001(H5N1)A/BJ/01/03(H5N1)37A/Blackbird/hunan/1/2004(H5N1)2146A/CK/GD/174/2004(H5N1)A/CK/Korea/ES/2003(H5N1)100A/CK/VN/C58/2004(H5N1)A/VN/1194/2004(H5N6)A/CK/GY/441/06(H5N1)49A/CK/GD/191/2004(H5N1)8599A/CK/GX/12/2004(H5N1)99A/DK/GX/13/2004(H5N1)A/DK/GD/22/2002(H5N1)100A/CK/HK/YU562/01(H5N1)9499A/SCK/HK/SF189/01(H5N1)78A/CK/SX/2/06(H5N1)A/duck/EasternChina/108/2008(H5N1)98A/GS/GD/96(H5N1)89A/HK/156/97(H5N1)A/Yunnan/0127/2015(H5N6)A/treesparrow/henan/4/2004(H5N1)85A/duck/Minnesota/1525/1981(H5N1)72A/environment/Maryland/1149/2006(H5N1)A/mallard/Wisconsin/34/1975(H5N6)100A/mallard/Manitoba/458/2005(H5N1)North-AmericanLineage99A/Americangreen-wingedteal/Washington/195750/2014(H5N1)84A/mallard/California/2531P/2011(H5N1)100A/mallard/California/1418/2013(H5N6)100A/mallard/California/1500P/2013(H5N6)0.02图4.4H5N6亚型AIVPB1基因遗传进化树“●”表示禽源H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒株23 100A/duck/Laos/XBY004/2014(H5N6)A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)62A/chicken/Shenzhen/2464/2013(H5N6)A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)52A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)84A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)100A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)A/chicken/Dongguan/3363/2013(H5N6)A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)99A/chicken/Shenzhen/1395/2013(H5N6))99A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)A/muscovyduck/Vietnam/LBM631/2014(H5N6)95100A/duck/Vietnam/LBM639/2014(H5N1)99A/duck/Vietnam/LBM633/2014(H5N1)100A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)A/duck/Nanchang/9789/2013(H5N1)A/environment/Zhenjiang/C13/2013(H5N6)10054A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)100A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)A/Sichuan/26221/2014(H5N6)5399A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)A/Guangxi/1/2009(H5N1)99A/Hubei/1/2010(H5N1)100A/environment/Guizhou/2/2009(H5N1)A/Hunan/2/2009(H5N1)A/duck/EasternChina/108/2008(H5N1)98A/China/GD01/2006(H5N1)A/DK/Fujian/11094/2005(H5N1)A/CK/GD/174/2004(H5N1)A/CK/SX/2/06(H5N1)63A/Black-bird/hunan/1/2004(H5N1)100EurasianLineage100A/BJ/01/03(H5N1)6349A/CK/Korea/ES/2003(H5N1)100A/GS/GD/96(H5N1)A/SCK/HK/SF189/01(H5N1)92A/CK/HK/YU562/01(H5N1)A/DK/GD/22/2002(H5N1)78100A/DK/GX/1793/04(H5N1)68A/GS/GX/2383/04(H5N1)A/CK/GY/441/06(H5N1)10080A/ck/HK/YU22/2002(H5N1)A/DK/GX/50/2001(H5N1)A/CK/VN/C58/2004(H5N1)99A/VN/1194/2004(H5N1)100A/DK/Guiyang/3242/2005(H5N1)6962A/GS/GY3422/2005(H5N1)99A/DK/Hunan/1265/2005(H5N1)A/DK/YN/4400/2005(H5N1)99A/CK/Hunan/999/2005(H5N1)A/munia/HK/2454/2006(H5N1)A/CK/IDN/2003(H5N1)71A/DK/IDNS/MS/04(H5N1)88A/IDN/CDC887/2006(H5N1)100A/IDN/CDC940/2006(H5N1)58A/IDN/546H/2006(H5N1)100A/IDN/CDC595/2006(H5N1)97A/CK/GX/12/2004(H5N1)100A/DK/GX/13/2004(H5N1)A/CK/GD/191/2004(H5N1)99A/BHG/QH/5/2005(H5N1)69A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)99A/CK/FJ/1042/2005(H5N1)97A/DK/FJ/897/2005(H5N1)A/Yunnan/0127/2015(H5N6)100A/environment/Maryland/1149/2006(H5N1)A/mallard/Manitoba/458/2005(H5N1)North-AmericanLineage100A/mallard/California/2531P/2011(H5N1)A/mallard/California/1418/2013(H5N6)99100A/mallard/California/1500P/2013(H5N6)0.02图4.5H5N6亚型AIVPA基因遗传进化树“●”表示禽源H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒24 A/chicken/Shenzhen/1395/2013(H5N6)72A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)A/chicken/Dongguan/3363/2013(H5N6)45A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)98A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)99A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)99A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)A/duck/Vietnam/LBM632/2014(H5N1)9936A/duck/Vietnam/LBM638/2014(H5N1)99A/muscovyduck/Vietnam/LBM635/2014(H5N1)A/duck/Nanchang/9789/2013(H5N1)A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)99A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)99A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)99A/Sichuan/26221/2014(H5N6)98A/hillmyna/Heilongjiang/0704/2012(H5N1)A/wildduck/Fujian/1/2011(H5N1)799899A/wildduck/Fujian/2/2011(H5N1)76A/Guangxi/1/2009(H5N1)A/Hubei/1/2010(H5N1)70A/environment/Guizhou/2/2009(H5N1)A/DK/Hunan/1265/2005(H5N1)A/DK/YN/4400/2005(H5N1)2799A/China/GD01/2006(H5N1)A/munia/HK/2454/2006(H5N6)A/CK/Hunan/999/2005(H5N1)99A/Hunan/2/2009(H5N1)92A/DK/Fujian/11094/2005(H5N1)22A/CK/GD/191/2004(H5N1)A/CK/GX/12/2004(H5N1)70EurasianLineage99A/DK/GX/13/2004(H5N1)99A/IDN/CDC887/2006(H5N1)A/IDN/CDC940/2006(H5N1)91A/CK/IDN/PA/2003(H5N1)53A/DK/IDNS/MS/04(H5N1)A/IDN/546H/2006(H5N1)1499A/IDN/CDC595/2006(H5N1)99A/CK/VN/C58/2004(H5N1)A/VN/1194/2004(H5N1)A/CK/HK/YU22/2002(H5N1)1299A/CK/FJ/1042/2005(H5N1)A/DK/FJ/897/2005(H5N1)2024A/CK/GY/441/06(H5N1)45A/DK/GX/50/2001(H5N1)A/DK/Guiyang/3242/2005(H5N1)99A/GS/GY3422/2005(H5N1)46A/BJ/01/03(H5N1)52A/Black-bird/hunan/1/2004(H5N1)99A/BHG/QH/5/2005(H5N1)63A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)99A/CK/GD/174/2004(H5N1)53A/CK/Korea/ES/2003(H5N1)A/CK/SX/2/06(H5N1)77A/Yunnan/0127/2015(H5N6)A/HK/156/97(H5N1)99A/DK/GX/1793/04(H5N1)A/GS/GX/2383/04(H5N1)4676A/GS/GD/96(H5N1)A/DK/GD/22/2002(H5N1)99A/CK/HK/YU562/01(H5N1)9972A/SCK/HK/SF189/01(H5N1)A/Americangreen-wingedteal/Washington/195750/2014(H5N1)99A/duck/EasternChina/108/2008(H5N1)A/treesparrow/Henan/4/2004(H5N1)A/mallard/Wisconsin/34/1975(H5N6)65A/duck/Minnesota/1525/1981(H5N1)99A/mallard/Manitoba/458/2005(H5N1)North-AmericanLineage92A/mallard/California/1500P/2013(H5N6)A/mallard/California/1418/2013(H5N6)7699A/mallard/California/2531P/2011(H5N1)0.02图4.6H5N6亚型AIVNP基因遗传进化树“●”表示禽H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒株25 72A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)56A/chicken/Dongguan/3363/2013(H5N6)A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)72A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)A/duck/Jiangxi/JXA131996/2013(H5N2)58A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)A/goose/Shantou/1763/2014(H5N6)89A/muscovyduck/Vietnam/LBM634/2014(H5N1)77A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)62A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)97A/duck/Nanchang/9789/2013(H5N1)A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)A/environment/Zhenjiang/C13/2013(H5N6)89A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)7694A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)63A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)86A/Sichuan/26221/2014(H5N6)99A/wildduck/Fujian/1/2011(H5N1)A/hillmyna/Heilongjiang/0704/2012(H5N1)5399A/Japanesewhiteeye/Taoyuan/Q454/2012(H5N1)A/Hubei/1/2010(H5N1)A/duck/Hunan/3/2007(H5N1)40A/environment/Guizhou/2/2009(H5N1)4889A/chicken/VietNam/TMU008/2008(H5N1)A/chicken/Hunan/999/2005(H5N1)95A/Americangreen-wingedteal/Washington/195750/2014(H5N1)28A/duck/EasternChina/108/2008(H5N1)A/China/GD01/2006(H5N1)72A/duck/Fujian/11094/2005(H5N1)A/Ck/HK/YU22/2002(H5N1)A/munia/HongKong/2454/2006(H5N1)EurasianLineageA/duck/Guangxi/50/2001(H5N1)A/chicken/Guangdong/191/04(H5N1)285A/chicken/Guangxi/12/2004(H5N1)A/duck/Guangxi/13/2004(H5N1)A/BJ/01/03(H5N1)71A/chicken/Korea/ES/03(H5N1)97A/chicken/Vietnam/C58/04(H5N1)A/VietNam/1194/2004(H5N1)99A/Indonesia/546H/2006(H5N1)53A/Indonesia/CDC595/2006(H5N1)7A/Indonesia/CDC887/2006(H5N1)6399A/Indonesia/CDC940/2006(H5N1)10A/Ck/Indonesia/PA/2003(H5N1)A/Dk/Indonesia/MS/2004(H5N1)99A/duck/Guangxi/1793/2004(H5N1A/goose/Guangxi/2383/2004(H5N1)99A/duck/Guiyang/3242/2005(H5N1)74A/goose/Guiyang/3422/2005(H5N1)24A/duck/Hunan/1265/2005(H5N1)77A/duck/Yunnan/4400/2005(H5N1)A/chicken/Guiyang/441/2006(H5N1)A/BHG/QH/5/2005(H5N1)2319A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)99A/chicken/Fujian/1042/2005(H5N1)95A/duck/Fujian/897/2005(H5N1)A/blackbird/Hunan/1/2004(H5N1)98A/chicken/Guangdong/174/04(H5N1)A/Chicken/HongKong/YU562/01(H5N1)239961A/duck/Guangdong/22/2002(H5N1)A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)57A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)84A/SilkyChicken/HongKong/SF189/01(H5N1)A/Treesparrow/Henan/4/2004(H5N1)99A/HongKong/156/97(H5N1)A/Yunnan/0127/2015(H5N6)92A/environment/Maryland/1149/2006(H5N1)A/mallard/Manitoba/458/2005(H5N1)84A/duck/Minnesota/1525/1981(H5N1)North-AmericanLineage99A/mallard/Wisconsin/34/1975(H5N6)49A/mallard/California/2531P/2011(H5N1)A/mallard/California/1418/2013(H5N6)9498A/mallard/California/1500P/2013(H5N6)0.01图4.7H5N6亚型AIVM基因遗传进化树“●”表示禽源H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒株26 82A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1395/2013(H5N6)A/chicken/Dongguan/3363/2013(H5N6)5488A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)37A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)85A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)A/Pallas'sSandgrouse/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)A/CommonMoorhen/Guangdong/GZ174/2014(H5N6)A/OrientalMagpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)95A/duck/Vietnam/LBM633/2014(H5N1)9773A/duck/Vietnam/LBM633/2014(H5N1)95A/duck/Nanchang/9789/2013(H5N1)A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)53A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)86A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)9964A/Sichuan/26221/2014(H5N6)A/wildduck/Fujian/1/2011(H5N1)77A/hillmyna/Heilongjiang/0704/2012(H5N18199A/Japanesewhite-eye/Taoyuan/Q454/2012(H5N1)A/Guangxi/1/2009(H5N1)62A/Hubei/1/2010(H5N1)59A/Hunan/2/2009(H5N1)A/environment/Guizhou/2/2009(H5N1)83A/munia/HongKong/2454/2006(H5N1)A/chicken/Hunan/999/2005(H5N1)A/China/GD01/2006(H5N1)8942A/duck/EasternChina/108/2008(H5N1)45A/duck/Fujian/11094/2005(H5N1)A/duck/Guangxi/13/2004(H5N1)A/chicken/Guangdong/191/04(H5N1)94A/chicken/Guangxi/12/2004(H5N1)A/Dk/Indonesia/MS/2004(H5N1)EurasianLineageA/Ck/Indonesia/PA/2003(H5N1)27A/Indonesia/546H/2006(H5N1)9993A/Indonesia/CDC595/2006(H5N1)A/Indonesia/CDC887/2006(H5N1)96A/Indonesia/CDC940/2006(H5N1)95A/chicken/Vietnam/C58/04(H5N1)A/VietNam/1194/2004(H5N1))93A/blackbird/Hunan/1/2004(H5N1)86A/Beijing/01/2003(H5N1)71A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)A/chicken/Guangdong/174/04(H5N1)38A/chicken/Korea/ES/03(H5N1)A/Ck/HK/YU22/2002(H5N1)A/duck/Guangxi/50/2001(H5N1)28A/chicken/Guiyang/441/2006(H5N1)63A/Bar-headedGoose/Qinghai/5/05(H5N1)9123A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)99A/chicken/Fujian/1042/2005(H5N1)90A/duck/Fujian/897/2005(H5N1)A/duck/Guangdong/22/2002(H5N1)A/Chicken/HongKong/YU562/01(H5N1)95A/SilkyChicken/HongKong/SF189/01(H5N1)9351A/duck/Hunan/1265/2005(H5N1)A/duck/Yunnan/4400/2005(H5N1)99A/duck/Guiyang/3242/2005(H5N1)99A/goose/Guiyang/3422/2005(H5N1)51A/duck/Guangxi/1793/2004(H5N1)99A/goose/Guangxi/2383/2004(H5N1)A/mallard/California/2531P/2011(H5N6)93A/HongKong/156/97(H5N1)A/Yunnan/0127/2015(H5N6)56A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)A/mallard/California/1418/2013(H5N6)9999A/mallard/California/1500P/2013(H5N6)98A/duck/Minnesota/1525/1981(H5N1)A/mallard/Wisconsin/34/1975(H5N6)99A/Americangreen-wingedteal/Washington/195750/2014(H5N1)North-AmericanLineageA/environment/Maryland/1149/2006(H5N1)6499A/mallard/Manitoba/458/2005(H5N1)0.1图4.8H5N6亚型AIVNS基因遗传进化树“●”表示禽源H5N6毒株，“▲”表示人源H5N6毒株，红色表示本试验毒株27 4.5.6NP基因序列分析选取的2株H5N6亚型禽流感病毒的NP基因均包含1565个核苷酸，其中包含长度为1497个核苷酸的完整ORF，可推导编码498个氨基酸，其5’非编码区有45个核苷酸，3’非编码区则有23个核苷酸。遗传进化树（见图4.6）分析发现：2株H5N6亚型AIV的NP基因，均位于EurasianLineage分支。参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)和A/Yunnan/0127/2015(H5N6)均在EurasianLineage分支，ZH283和参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)在同一个亚分支上。选SW8和参考毒株A/Yunnan/0127/2015(H5N6)则在不同的亚分支上。毒株位点分析表明：NP基因位点A184K突变可能与影响禽流感病毒的繁殖和致病力方面有着密切关系（Wasilenkoetal,2008）。基因位点N319K和L479F突变可能对小鼠的致病力增强有密切关联。本研究中两个毒株的184位点为K，319位点则没有发生突变仍为N。4.5.7M基因序列分析选取的2株H5N6亚型禽流感病毒的M基因全长为1027个核苷酸，完整的开放阅读框由2个部分组成，一个是包含长度为759个核苷酸的完整ORF的M1蛋白，由26～784位，可推导编码252个氨基酸，是一个连的基因片段。M2蛋白包含294个核苷酸，由两个不连续的片段组成：26～51位和740～1007位，可推导编码97个氨基酸。遗传进化树（见图4.7）分析发现：2株H5N6亚型AIV的NP基因，均位于EurasianLineage分支上。参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)也在EurasianLineage分支上，而参考毒株A/Yunnan/0127/2015(H5N6)则位于North-AmericanLineage）分支上。选取的毒株ZH283、SW8和参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)分布在不同的亚分支上。对M基因位点分析（见表4.6）表明：M1蛋白在N30D和T215A位点都发生突变，这两个位点突变与小鼠致病性强弱相关，K174R位点突变，这与禽流感病毒宿主特征相关。在M2蛋白的S31N位点没有发现突变，这表明2株毒株对金刚烷胺抑制剂和金刚乙胺抗病毒类药物没有产生耐药性突变。28 表4.6M基因位点分析表M1M2毒株3017421526273031ZH283DRALVASSW8DRALVAS4.5.8NS基因序列分析选取的2株H5N6亚型禽流感病毒的NS基因全长为890个核苷酸，完整的开放阅读框由2个部分组成。NS1是一个连续的片段有678个核苷酸，从27～704位点，可推导编码225个氨基酸。NS2是两个不连续的片段，共含有366个氨基酸，ORF2包含27～56位和514～849位这两段核苷酸，NS2可推导编码121个氨基酸。遗传进化树（见图4.8）分析发现：2株H5N6亚型AIV的NS基因，均位于EurasianLineage分支。参考毒株A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)和A/Yunnan/0127/2015(H5N6)也在EurasianLineage分支上，但分布在不同的亚分支上。NS的氨基酸位点分析研究表明：NS1蛋白的D92E位点突变会造成流感病毒对人的致病性增强，也会对细胞因子如IFN的抗病毒耐药性产生影响（Qietal,2009）。在分析研究中发现这2株病毒的NS1蛋白的92位点均发生了突变。4.62株H5N6亚型AIV对SPF鸡的致病性试验结果4.6.12株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后的存活情况6ZH283和SW8毒株以200μL10EID50剂量通过滴鼻点眼途径感染SPF鸡。连续观察14d记录各组SPF鸡出现的临床症状和死亡情况（见图4.9）。SW8感染SPF鸡5d后全部死亡，同居组SPF鸡无死亡但表现出精神沉郁、食欲减退、消瘦等临床症状。ZH283感染SPF鸡后，感染组与同居组在5d后全部死亡。对照组无死亡。4.6.22株H5N6亚型AIV在SPF鸡体内的复制情况在攻毒后的第3d剖杀感染组和对照组各3只，ZH283和SW8感染组被检的10个脏器（心、气管、肺脏、脑、肝脏、胰腺、肾、脾、盲肠扁桃体和法氏囊）均能检测到病毒的复制。ZH283在SPF鸡体内复制能力比SW8在SPF鸡体内复制能力强，在ZH283组被检的10个脏器中的病毒滴度都达到7.83log10EID50/g以上，肺最高达到10.08log10EID50/g；在SW8组被检的10个脏器中，log10EID50/g值在5.58～7.58范围内，较高是法氏囊和胰腺，较低是心脏。对照组均未检测出病毒的复制(见表4.7)。29 图4.9SPF鸡感染ZH283和SW8后的存活率4.6.3SPF鸡感染后口咽和泄殖腔的排毒情况ZH283和SW8感染SPF鸡后的第2、3、5、7、9d分别采集2个毒株的感染组、同居组以及对照组SPF鸡的口咽拭子和泄殖腔拭子，处理过后接种9～11日龄的非免鸡胚，用此来评估各组SPF鸡的排毒情况（见表4.8）。ZH283感染组和同居组均能在口咽拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，感染组排毒量高达5.25log10EID50/0.1mL，同居组泄殖腔拭子排毒量高达5.00log10EID50/0.1mL，但5d后全部死亡，所以5d后没有检测数据。SW8感染组在第5d时也全部死亡，均能在口咽拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，但同居组的在3d后就不能检测出排毒。对照组均未能检测到排毒情况。总体而言，ZH283感染SPF鸡后排毒量比SW8的高。4.6.414d后存活的SPF鸡血清抗体测定结果攻毒14d后ZH283感染组和同居组全部死亡；SW8感染组全部死亡，同居组无死亡；对照组无死亡存活3只。对存活SPF鸡采血取血清，进行HI抗体转阳情况测定，存活的SW8同居组血清均转阳，对照组血清均为阴性。4.72株H5N6亚型AIV对BABL/C小鼠的致病性试验结果4.7.12株H5N6亚型AIV感染SPFBALB/C小鼠后的存活情况6ZH283和SW8毒株以50μL10EID50剂量通过滴鼻点眼途径感染小鼠。连续观察14d记录各组小鼠出现的临床症状和死亡情况（见图4.10）。期间观察到小鼠出现身体消瘦、精神不振、失明等症状。ZH283组在攻毒第5d小鼠全部死亡；SW8组在第30 4d开始出现死亡，到第6d全部死亡，死亡率达100%；对照组无死亡。1009080ZH28370SW86050对照组4030Percentsurvival2010001234567891011121314DaysPostInoculation图4.10小鼠感染ZH283和SW8后的存活率4.7.22株H5N6亚型AIV感染SPFBALB/C小鼠后体重变化情况连续14d记录各组小鼠体重变化的情况（见图4.11）。小鼠感染SW8后，在第6d体重下降12.7%；小鼠感染ZH283后，第5d体重下降23%；对照组则在第14d后体重增加21.9%。130ZH283120SW8110对照组1009080Bodyweight(%)706001234567891011121314DaysPostInoculation图4.11小鼠感染ZH283和SW8后的存活率31 4.7.32株H5N6亚型AIV在SPFBALB/C小鼠体内复制情况攻毒后第3d和第5d各组各杀3只小鼠，取其脑、鼻甲骨、脾、肾和肺5个组织器官测定病毒复制滴度。从图4.12可以看出，2株病毒均在小鼠的肺脏中有较高的病毒滴度，都达到8.75log10EID50/g以上，ZH283组小鼠在第5d的肺脏病毒滴度为10.00log10EID50/g。另外，在脑、鼻甲骨、脾和肾中也能检测到病毒的复制，整体来说，攻毒后第5d病毒滴度比第3d的高。123DPI5DPI/0.1g)1050EID8SW8106ZH283420Virustiters(log脑鼻脾肾肺脑鼻脾肾肺鼻鼻鼻鼻图4.12小鼠感染ZH283和SW8后的存活率4.82株H5N6亚型AIV对豚鼠的致病性试验结果4.8.12株H5N6亚型AIV感染豚鼠后的存活情况6ZH283和SW8毒株以200μL10EID50剂量通过滴鼻点眼途径感染豚鼠。连续观察14d记录各组豚鼠出现的临床症状和死亡情况（见图4.13）。SW8感染豚鼠后前5d无明显临床特征，5d后表现出精神沉郁、食欲减退和消瘦等轻微临床症状，感染组3d后杀3只测定病毒体内复制情况，第6d死亡1只，第13d死亡1只，死亡率达2/3。同居组在第7、8、14d各死1只，死亡率高达3/3。ZH283感染豚鼠后前期临床症状不明显，后期出现精神沉郁、食欲减退、消瘦等轻微临床症状，第7d开始出现死亡，死亡率为1/3；同居组无死亡。对照组无死亡。32 4.8.22株H5N6亚型AIV在豚鼠体内的复制情况在攻毒后的第3d剖杀感染组和对照组各3只，ZH283和SW8感染组被检的8个脏器（小肠、鼻甲骨、心、气管、肺脏、脑、肝脏和胰腺）均能检测到病毒的复制。ZH283和SW8在豚鼠体内复制能力较强，在被检的8个脏器中的病毒滴度都达到3.75log10EID50/g以上，且均在鼻甲骨中复制能力最强，肺脏次之。对照组均未检测出病毒的复制(见表4.9)。图4.13豚鼠感染ZH283和SW8后的存活率4.8.3豚鼠感染后鼻腔和泄殖腔的排毒情况ZH283和SW8感染豚鼠后的第2、4、6、8、10d分别采集2个毒株的感染组、同居组以及对照组豚鼠的鼻腔拭子和泄殖腔拭子，处理过后接种9～11日龄的非免鸡胚，用此来评估各组豚鼠的排毒情况（见表4.10）。ZH283感染组和同居组在第2d时均在鼻腔拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，鼻腔拭子是排毒量高达5.46log10EID50/0.1mL，泄殖腔拭子排毒量为1.54log10EID50/0.1mL；同居组鼻腔拭子为1.58log10EID50/0.1mL，泄殖腔为1.58log10EID50/0.1mL。SW8感染组在第2d时也均能在鼻腔拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，但同居组的泄殖腔拭子未能检测出排毒。豚鼠主要排毒途径是鼻腔，排毒周期也较长，而泄殖腔排毒量低，排毒周期也较短。对照组豚鼠中未能检测到排毒情况。总体而言，ZH283感染豚鼠后排毒量比SW8的高；ZH283和SW8毒株在豚鼠试验中同居组排毒水平低，且排33 毒周期短。4.8.414d后存活的豚鼠血清抗体测定结果攻毒14d后ZH283感染组存活2只，同居组无死亡存活3只；SW8感染组存活1只，同居组全部死亡；对照组无死亡存活3只。对存活豚鼠采血取血清，进行HI抗体转阳情况测定，存活的SW8感染组、ZH283感染组和同居组血清均转阳，对照组血清均为阴性。4.92株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性与跨种传播试验结果4.9.12株H5N6亚型AIV感染北京鸭后的存活情况6ZH283和SW8毒株以200μL10EID50剂量通过滴鼻点眼途径感染北京鸭。连续观察14d记录各组鸭和鹌鹑出现的临床症状和死亡情况（见图4.14）。SW8感染鸭后无临床症状，感染组在攻毒后1d死亡1只，3d后杀3只测定病毒体内复制情况，之后就无死亡；鸭子同居组也无临床症状，亦无死亡出现；鹌鹑同居组有精神沉郁、食欲减退、消瘦等轻微临床症状出现，第8d死亡1只，死亡率达1/3。ZH283感染北京鸭后亦不致病，感染组和鸭子同居组均无死亡；鹌鹑同居组死亡率高达2/3。对照组无死亡。图4.14北京鸭感染ZH283和SW8后的存活率4.9.22株H5N6亚型AIV在北京鸭体内的复制情况在攻毒后的第3d剖杀感染组和对照组各3只，取脏器研磨稀释处理后接种非免34 鸡胚，ZH283和SW8感染组被检的10个脏器（盲肠扁桃体、法氏囊、心、脾脏、气管、肺脏、脑、肾脏、肝脏和胰腺）均能检测到病毒的复制。ZH283和SW8在北京鸭体内均能成功复制，在被检的10个脏器中都有较高的病毒滴度，特别是肺脏和肾脏。ZH283感染组的肺脏病毒滴度为6.5log10EID50/g，SW8感染组为5.63log10EID50/g。对照组均未检测出病毒的复制（见表4.11）。4.9.3北京鸭感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情况ZH283和SW8感染北京鸭后的第2、4、6、8、10d分别采集2个毒株的感染组、北京鸭同居组、鹌鹑同居组以及对照组鸭子的口咽拭子和泄殖腔拭子，处理过后接种9～11日龄的非免鸡胚，用此来评估各组的排鸭子和鹌鹑的排毒情况（见表4.12）。ZH283感染组和鸭子、鹌鹑同居组均能在口咽拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，从整体来看，口咽拭子排毒量要比泄殖腔拭子排毒量高，ZH283鹌鹑同居组无论是口咽拭子或泄殖腔拭子都要比北京鸭感染组或同居组高，在第2d时鹌鹑同居组口咽拭子排毒量为4.25log10EID50/0.1mL，而鸭子感染组口咽腔拭子排毒量为2.67log10EID50/0.1mL；在第6d之后，无论是感染组或同居组，排毒量都降低或没有检测到排毒。SW8感染组和鸭子、鹌鹑同居组感染病毒后排毒情况与ZH283组排毒情况比较相似，均能在口咽拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，鹌鹑同居组排毒量比鸭子感染组和同居组都要高。这表明ZH283和SW8可水平传播，也可以跨物种传播，且流感病毒对鹌鹑的致病性比北京鸭要强。对照组鸭子中未能检测到排毒情况。4.9.414d后存活的北京鸭和鹌鹑的血清抗体测定结果攻毒14d后，ZH283感染组和鸭子同居组均无死亡，鹌鹑同居组只存活1只；SW8感染组死亡1只，鹌鹑同居组死亡1只，鸭子同居组无死亡；对照组无死亡存活3只。对存活的北京鸭和鹌鹑采血取血清，进行HI抗体转阳情况测定，存活的SW8感染组和鹌鹑同居组均血清转阳，鸭子同居组转阳率为2/3。ZH283感染组和鹌鹑同居组血清也均转阳，鸭子同居组血清阳性率为2/3。对照组血清均为阴性。4.102株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性与跨种传播试验结果4.10.12株H5N6亚型AIV感染鹌鹑后的存活情况6ZH283和SW8毒株以200μL10EID50剂量通过滴鼻点眼途径感染鹌鹑。连续观察14d记录各组鹌鹑和鸭出现的临床症状和死亡情况（见图4.15）。ZH283、SW835 感染鹌鹑后临床症状比较明显，有精神沉郁、食欲减退和消瘦等明显临床症状出现，但鸭子同居组均无临床症状出现。ZH283和SW8感染组在攻毒4d后时全部死亡，死亡率达3/3。ZH283鹌鹑同居组死亡率也高达2/3，鸭子同居组死亡率为1/3。SW8鹌鹑同居组在第7d死亡1只，死亡率为1/3，鸭子同居组无死亡出现。对照组无死亡。4.10.22株H5N6亚型AIV在鹌鹑体内的复制情况在攻毒后的第3d剖杀感染组和对照组各3只，取脏器研磨稀释处理后接种非免鸡胚，ZH283和SW8感染组被检的9个脏器（盲肠扁桃体、心、脾脏、气管、肺脏、脑、肾脏、肝脏和胰腺）均能检测到病毒的复制。ZH283和SW8在鹌鹑体内均能成功复制，在被检的9个脏器中病毒滴度都较高，log10EID50/0.1mL值在7.25～9.5范围内，ZH283和SW8各脏器的病毒含量都差别不大。对照组均未检测出病毒的复制（见表4.13）。图4.15鹌鹑感染ZH283和SW8后的存活率4.10.3鹌鹑感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情况如表4.8中所示，ZH283和SW8感染鹌鹑后的第2、4、6、8、10d分别采集2个毒株的感染组、鹌鹑同居组、北京鸭同居组以及对照组鹌鹑的口咽拭子和泄殖腔拭子，处理过后接种9～11日龄的非免鸡胚，用此来评估各组的排鹌鹑和鸭的排毒情况（见表4.14）。ZH283感染组和鹌鹑、鸭子同居组均能在口咽拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，36 感染组排毒量最高，口咽拭子在第4d达到最高6.5log10EID50/0.1mL，第4d后感染组全部死亡，就无检测数据。ZH283鹌鹑同居组无论是口咽拭子或泄殖腔拭子都要比北京鸭感染组或同居组高，在第2d时鹌鹑同居组口咽拭子排毒量高达4.5log10EID50/0.1mL，而鸭子同居组口咽腔拭子排毒量为2.75log10EID50/0.1mL。与北京鸭感染病毒试验相比较，同居组的鸭子口咽和泄殖腔排毒情况相近，同居组鹌鹑排毒量也较为相似。SW8感染组和鹌鹑、鸭子同居组感染病毒后排毒情况与ZH283组排毒情况比较相似，均能在口咽拭子和泄殖腔拭子中检测出排毒，鹌鹑同居组排毒量比鸭子感染组和同居组都要高。感染组在第2d和第4d的排毒量都很高，第4d后全部死亡无检测数据。与北京鸭感染病毒试验相比较，同居组的鸭子口咽和泄殖腔排毒情况相近，同居组鹌鹑排毒量也较为相似。综合北京鸭感染病毒和鹌鹑感染病毒这两个试验来说，鹌鹑对流感病毒的易感性很强，体内复制病毒含量也很高，北京鸭也能在体内复制病毒，但没有鹌鹑高。并且，鹌鹑和北京鸭感染流感病毒后均能水平传播，也可以跨物种传播。对照组鹌鹑中未能检测到排毒情况。4.10.414d后存活的鹌鹑和北京鸭的血清抗体测定结果攻毒14d后，ZH283感染组全部死亡，ZH283鸭子同居组存活2只，鹌鹑同居组只存活1只；SW8感染组全部死亡，鹌鹑同居组死亡2只，鸭子同居组无死亡，存活3只；对照组无死亡存活3只。对存活的北京鸭和鹌鹑采血取血清，进行HI抗体转阳情况测定，存活的鹌鹑同居组均血清转阳，存活的ZH283鸭子同居组转阳率为2/2，存活的SW8鸭子同居组血清阳性率为3/3。对照组血清均为阴性。37 表4.72株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后第3d在其体内的复制情况a感染后第3d各病毒在不同脏器中的复制情况(log10EID50/g)±SD毒株心肝脏脾脏肺脏肾脏脑气管法氏囊胰脏盲肠扁桃体ZH2838.17±0.148.08±0.298.83±0.5210.08±0.299.08±0.298.67±0.147.83±0.529.08±0.148.50±0.668.92±0.29SW85.58±0.296.58±0.527.33±0.387.83±0.147.08±0.296.33±0.637.17±0.147.58±0.297.58±0.767.00±0.25对照组NDNDNDNDNDNDNDNDNDND表4.82株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后的排毒情况a感染天数(log10EID50/0.1mL)±SD2Day3Day5Day7Day9Day毒株口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子ZH283感染组5.08±0.29(6/6)4.40±0.84(6/6)5.25(1/1)4.00(1/1)------ZH283同居组3.92±0.29(3/3)2.25±0.43(3/3)4.25(1/1)5.00(1/1)3.25(1/1)3.75(1/1)----SW8感染组2.92±0.29(6/6)2.02±0.46(6/6)4.33±0.56(3/3)4.29±0.29(3/3)------SW8同居组2.00±0.66(2/3)1.58±014(3/3)2.33±0.14(3/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)对照组ND(0/6)ND(0/6)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)38 表4.92株H5N6亚型AIV感染豚鼠后第3d在其体内的复制情况a感染后第3d各病毒在不同脏器中的复制情况(log10EID50/g)±SD毒株鼻甲骨气管肺心脑小肠肝脏胰腺ZH2836.42±0.143.755.753.754.5±0.354.75±1.413.755.50SW86.33±0.143.756.253.754.67±0.385.503.504.75±1.41对照组NDNDNDNDNDNDNDND表4.102株H5N6亚型AIV感染豚鼠后的排毒情况a感染天数(log10EID50/0.1mL)±SD2Day4Day6Day8Day10Day毒株鼻腔拭子泄殖腔拭子鼻腔拭子泄殖腔拭子鼻腔拭子泄殖腔拭子鼻腔拭子泄殖腔拭子鼻腔拭子泄殖腔拭子ZH283感染组5.46±0.10(6/6)1.54±0.10(1/6)5.42±0.14(3/3)1.58±0.14(1/3)4.75±0.14(3/3)ND(0/3)1.88±0.53(1/2)ND(0/2)ND(0/2)ND(0/2)ZH283同居组1.58±0.14(1/3)1.58±0.14(1/3)1.58.±0.14(1/3)ND(0/3)1.58±0.14(1/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)SW8感染组4.50(6/6)1.63±0.21(2/6)4.50(3/3)ND(0/3)2.17±0.76(2/3)1.58±0.14(1/3)1.88±0.18(2/2)ND(0/2)1.63±0.17(1/2)ND(0/2)SW8同居组2.25±0.35(3/3)ND(0/3)ND(0/3)1.56±0.13(1/3)ND(0/3)1.75±0.50(1/3)ND(0/2)ND(0/2)ND(0/1)ND(0/1)对照组ND(0/6)ND(0/6)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)39 表4.112株H5N6亚型AIV感染北京鸭后第3天在其体内的复制情a感染后第3d各病毒在不同脏器中的复制情况(log10EID50/g)±SD毒株心肝脏脾脏肺脏肾脏脑气管法氏囊胰脏盲肠扁桃体ZH2834.88±0.884.63±0.884.88±0.536.506.00±0.714.13±0.885.00±0.715.38±1.594.38±0.184.88±0.88SW84.13±0.533.75±1.414.38±0.535.63±1.244.88±1.244.88±0.884.13±0.883.88±0.184.63±1.244.38±0.88对照组NDNDNDNDNDNDNDNDNDND表4.122株H5N6亚型AIV感染北京鸭后的排毒情况a感染天数(log10EID50/0.1mL)±SD2Day4Day6Day8Day10Day毒株口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子ZH283感染组2.67±0.97(6/6)2.15±0.44(6/6)1.83±0.38(2/3)2.25±0.86(3/3)1.58±0.14(1/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ZH283同居组2.75±0.25(3/3)2.16±0.38(3/3)1.67±0.14(2/3)1.92±0.52(2/3)1.58±0.14(1/3)ND(0/3)1.58±0.14(1/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ZH283鹌鹑同居组4.25(2/2)1.88±0.53(1/2)3.13±1.94(2/2)2.00±0.7(1/2)ND(0/1)ND(0/1)ND(0/1)ND(0/1)ND(0/1)ND(0/1)SW8感染组2.25±0.25(5/5)2.15±0.80(4/5)1.88±0.53(1/2)1.63±0.17(1/2)2.00±0.70(1/2)1.63±0.17(1/2)1.75(2/2)ND(0/2)ND(0/2)ND(0/2)SW8同居组2.58±0.87(3/3)1.75±0.25(2/3)2.00±0.43(3/3)1.58±0.14(1/3)2.00±0.25(3/3)1.67±0.28(1/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)SW8鹌鹑同居组4.00±0.50(3/3)1.58±0.14(1/3)2.08±0.29(2/3)1.83±0.58(1/3)1.67±0.14(2/3)ND(0/3)ND(0/2)ND(0/2)ND(0/2)ND(0/2)对照组ND(0/6)ND(0/6)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)40 表4.132株H5N6亚型AIV感染鹌鹑后第3天在其体内的复制情况a感染后第3天各病毒在不同脏器中的复制情况(log10EID50/g)±SD毒株肺脏肝脏心气管脾脏脑胰腺肾脏盲肠扁桃体ZH2839.507.507.25±0.437.42±0.148.507.38±0.187.38±0.189.42±0.148.33±0.14SW89.507.42±0.147.507.42±0.148.507.507.509.508.42±0.14对照组NDNDNDNDNDNDNDNDND表4.142株H5N6亚型AIV感染鹌鹑后的排毒情况a感染天数(log10EID50/0.1mL)±SD毒株2Day4Day6Day8Day10Day口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子口咽拭子泄殖腔拭子ZH283感染组5.50±0.65(6/6)3.38±1.61(5/6)6.50(2/2)4.75±0.70(2/2)------ZH283同居组4.50±1.41(3/3)3.41±1.59(3/3)2.63±0.18(2/2)2.50(2/2)3.13±1.94(2/2)2.63±1.59(1/2)1.75(1/1)ND(0/1)ND(0/1)ND(0/1)ZH283鸭同居组2.75±0.70(2/2)2.00±0.35(2/2)1.75(2/2)1.75(2/2)1.63±0.18(1/2)ND(0/2)ND(0/2)1.63±0.18(1/2)ND(0/2)ND(0/2)SW8感染组6.40±0.14(5/5)4.45±1.48(5/5)6.25(1/1)3.75(1/1)------SW8同居组4.67±0.72(3/3)2.50(3/3)3.13±1.42(3/3)2.50(3/3)2.00±1.00(1/3)1.56±0.13(1/3)1.58±0.14(1/2)ND(0/2)ND(0/2)ND(0/2)SW8鸭同居组2.25±0.66(2/3)1.67±0.14(2/3)1.92±0.38(2/3)1.67±0.14(2/3)ND(0/3)ND(0/3)1.58±0.14(1/3)1.58±0.14(1/3)ND(0/3)1.67±0.29(1/3)对照组ND(0/6)ND(0/6)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)ND(0/3)注：为了统计需要，表4.7-4.12中如果原液接种三个鸡胚中未能检测到结果，那么结果计为1.5（Sunetal,2011）；ND表示未能检测到病毒；“-”表示实验动物全部死亡。41 5讨论多种H5新型重组高致病性禽流感病毒汇编成2.3.4.4分支，自2014年以来呈快速型和全球型传播，多种亚型(H5N1、H5N2、H5N5、H5N6和H5N8)在国内的鸡、猫、猪和人中被检测出来，导致全球养禽业经济损失严重并对公共健康安全造成了严重的威胁（Yuetal,2015；Jhungetal,2015；Panetal,2016；Yangetal,2015）。在中国华南地区禽流感病毒的流行状况研究中，本实验室在野鸟和野鸟候区分离检测到59株H5N1亚型AIV,1株H1亚型AIV,3株H7亚型AIV,7株H9亚型AIV和14株H6亚型AIV。这些发现表明了在野鸟中流感病毒不同亚型的相互共存，特别在野鸟栖息地。本研究中的2株新型重组H5N6病毒SW8和ZH283分别从国际二级保护动物鹊鸲和毛腿沙鸡中分离得到，基因型和致病性特征明显。先前已有报道国内有禽类感染H5N6亚型AIV，自从2013年12月在中国浙江活禽交易市场分离到1株H5N6新型禽流感病毒以来，该病毒就受到了中国政府高度关注，特别是在2014-2015年，中国的四川、广东和云南省被报道有4个人感染H5N6亚型AIV。另外，2014年3月有报道H5N6亚型AIV在老挝暴发，导致了5142只家禽感染和457只家禽死亡。本研究中的2株重组H5N6病毒，HA基因来源于2.3.4.4H5N1病毒分支，NA基因来源于H6N6亚型AIV，属于家禽欧亚系ST192-like分支，H5N6亚型AIV重组病毒的内部基因还是来源于2.3.4.4分支H5N1亚型AIV的主干基因。进化分析表明SW8的所有基因片段非常接近禽源的H5N6和H5N1亚型禽流感病毒，ZH283非常接近于人源H5N6和H5N1亚型禽流感病毒。这些表明感染的野鸟可能是人源的H5N6亚型禽流感病毒的源头，这些亚型早已在中国野鸟上检测到。AIV的致病性强弱是由各个基因片段的共同作用决定的结果，但HA基因对AIV的致病性强弱起到了重要的作用（Steinhauer,1999），HA蛋白经裂解酶的作用裂解为HA1和HA2，HA通过细胞表面特异性受体结合位点和细胞表面受体结合（Weisetal,1988），通过吞噬的作用进入胞浆后和囊膜融合，释放RNP（Gartenetal,1999）。AIV会通过识别禽源或人源的唾液酸受体（α2,3半乳糖唾液酸受体或α2,6半乳糖唾液酸受体）去侵染宿主组织器官。若禽源受体结合位点处的氨基酸发生了突变，就可能会造成AIV从禽类传播到人类的跨种间屏障传播（Mainesetal,2011）。HA基因发挥重要性作用主要是通过HA蛋白的裂解位点发生突变的影响、HA蛋白的潜在糖基化位点发生突变的影响和通过某些氨基酸点发生突变的影响等方式去改变AIV对宿主的结合与病毒复制能力。本研究中2株H5N6亚型AIV的HA基因裂解位点为-RRRKR42 ↓G-，附近有多个碱性氨基酸，符合高致病性禽流感病毒的分子特征，使得HA蛋白更易于被多种蛋白酶裂解，进而更能增强AIV在各器官的复制能力，具有更强的致病能力。HA蛋白潜在的糖基化位点分析表明，2株H5N6亚型AIV发现7个潜在糖基化位点，糖基化位点会影响HA蛋白的裂解和AIV与宿主的结合能力，进而影响到H5N6亚型AIV对宿主的致病性强弱（Gartenetal,1999）。NA蛋白与HA蛋白形成某种相对平衡，共同调节AIV在宿主体内的复制能力（Matrosovichetal,1999），NA蛋白潜在的糖基化位点也会对酶的活性和宿主的致病力产生影响。有文章报道NA蛋白头部的糖基化位点对增强病毒致病力有促进作用（Hulseetal,2004；Castruccietal,1993）。本研究中2株毒株的NA蛋白均存在多个糖基化位点。NA蛋白中存在的对神经氨酸酶抑制作用的靶细胞，相关位点发生突变会引起相应的抑制剂药物的耐药性（Yenetal,2007；Aokietal,2007）。本研究中的2株的病毒275H、293R、295N等耐药位点均没有发生突变。PB2蛋白对聚合酶复合体有着重要的作用，聚合酶复合体对病毒复制以及对宿主产生致病性的过程中起着重要的作用，因而PB2在对不同宿主产生致病性的过程中发挥着重要作用（Lietal,2012；Hattaetal,2001），PB2蛋白627位与701位发生突变能增强病毒对宿主的选择能力和致病力，627位中的谷氨酸（E）对禽类具有感染性能力，突变成赖氨酸（K）则对哺乳动物具有感染性能力，从而使AIV能跨物种传播感染（Yaoetal,2001；Subbaraoetal,1993），701位是天冬氨酸（D），对禽类形成强致病力，突变成天冬酰胺（N）则会对哺乳动物有强致病力（Lietal,2005）；271位苏氨酸（T）发生突变，能使627E的毒力增强（Hattaetal,2001），所以有必要对其进行致病性研究。本研究中2株病毒PB2蛋白的627位点没发生突变仍为E；能够增强其毒力的271位和701位也没有发生突变。PB1蛋白是聚合酶复合体里的重要成员，在病毒的转录与复制过程中起着重要作用。PB1蛋白中某些位点发生突变也能使病毒在宿主的复制能力和致病能力产生影响，L13P与S678N发生突变就使哺乳动物的致病能力增强（Hulse-Postetal,2007）。本研究中2株H5N6亚型AIV的13位点均突变为P，678位则没有发生突变，仍为S。PA蛋白通过和PB1蛋白协调作用和位点突变去达到更强的致病力，从而能让AIV更有效地在宿主体内复制（Hulse-Postetal,2007）；PA蛋白也是聚合酶复合体的重要一员，PA中501位点、539位点和638位点发生突变能减弱病毒在宿主细胞中的复制与增殖能力，而615位点的突变能使病毒的致病性增强（Salomonetal,2006）。本研43 究中501位点、539位点和638位均没有突变，615位点则全突变为K，具有更强致病力。NP蛋白为AIV重要的结构核蛋白，在AIV侵染宿主的过程中起着重要的作用（Neumannetal,1997）。NP蛋白的319位和479位氨基酸发生突变会增加AIV对哺乳动物的致病力。本研究中2株H5N6亚型AIV的319位点均为N，而479位却均突变为F。M1蛋白在病毒合成和释放的过程中与M2蛋白通过调节对离子选择对病毒的复制起着重要作用（Fanetal,2009）；M蛋白是AIV的基质蛋白，M1蛋白具有特异性，M2蛋白为跨膜蛋白，是金刚烷胺作用的靶细胞（Matrosovichetal,1999）。M蛋白相关位点的突变也能改变病毒毒力。本研究中M1蛋白的30位点与215位点氨基酸均突变成能增强毒力的氨基酸D与A（Fanetal,2009）。而抑制金刚烷胺的多个耐药位点则没有发生突变，表明毒株没有产生耐药性。NS1蛋白是通过抑制机体的免疫力从而加强AIV对机体的破坏程度（Seoetal,2002）。NS蛋白在病毒的复制过程中发起着重要作用，主要负责调控病毒的复制周期（Seoetal,2002）。NS1蛋白中42、92、103、106和149位的氨基酸突变均会对AIV毒力产生影响（Donelanetal,2003；Seoetal,2004）。本研究中2株H5N6亚型AIV的42、92、103、106和149位点均发生突变。H5N6亚型AIV自2013年起已经在中国浙江、四川和黑龙江省地区暴发并引起公众的关注。野鸟被认为是禽流感在人和动物之间循环传播的主要自然宿主，野鸟经常感染目前我们已知的各种亚型禽流感病毒（Websteretal,1992；Fouchieretal,2005）。野鸟和家禽感染的禽流感病毒分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。大多数动物感染低致病性禽流感病毒只引起轻微的症状或无表现症状，但低致病性禽流感病毒偶尔传播给家禽或哺乳动物后会演化成高致病性禽流感病毒（Tanetal,2014）。之前的研究报道称从不同鸟类中分离的H5N1高致病性禽流感病毒会因宿主不同，而导致致病性和传播途经不同，因而我们设计了H5N6亚型AIV在SPF鸡、BABL/C小鼠、豚鼠、北京鸭和鹌鹑中的致病性试验，以及在北京鸭和鹌鹑之间的跨种间的传播试验。本研究表明H5N6亚型AIV对SPF鸡、BABL/C小鼠、豚鼠和鹌鹑具有高致病性，可引起多种组织器官的感染，特别在SPF鸡、BABL/C小鼠和鹌鹑中高效水平传播，能导致高死亡率。而H5N6亚型AIV对北京鸭体内也能复制，但不致病，能水平传播。另外，H5N6亚型AIV能在北京鸭和鹌鹑之间传播。44 与病原、活禽接触是人感染H5N6的最直接途经（Suetal,2015），而广东省位于中国华南地区，属于亚热带气候，被喻为流感中心地带，这里是许多野鸟、候鸟迁徙的途经的地区，也是哺乳动物、家禽和人密集的地区，还有大量小型家禽养殖场，还有一些大型活禽市场，这些增加了动物和人类接触病原的机会。H5N6亚型AIV会经野鸟、活禽的分泌物和排泄物通过水源或其他方式向其他鸟类、家禽、哺乳动物甚至人类传播，这种跨种间的传播方式会导致新型禽流感病毒的出现（Suetal,2015）。综上所述，由于AIV变异、重组的方式多样，多种因素都会影响到AIV的复制与增值，以及基因突变和重组等方式都会严重影响到AIV的致病性，从而使AIV发生快速的遗传演化，因此对AIV的基因组进行分子生物学特性分析有助于进一步为流感的预防提供理论依据。另一方面，2株H5N6亚型AIV对SPF鸡、BABL/C小鼠和豚鼠的致病性研究中表现出较强的致病性和组织脏器嗜性；在北京鸭和鹌鹑的致病性与交叉传播试验研究中，鹌鹑表现出高致病性与高水平传播能力，经北京鸭传播也能表现出明显的临床特征；而H5N6亚型AIV感染北京鸭后不致病，传播能力也比鹌鹑低。这些结果表明野鸟在沿着迁徙路线对传播H5N6病毒扮演的角色，可能对家禽和公众健康造成潜在的危险。45 全文总结1.本研究首次从广东省野鸟体内分离到2株H5N6病毒，基因进化结果表明，2株H5N6亚型AIVHA基因属于H5N1亚型，进化分支属2.3.4.4，NA基因来源于H6N6，内部基因属于H6N6亚型欧亚分支。2.SPF鸡的致病性试验表明，2株H5N6亚型AIV对SPF鸡具有高致病性，致死率为100%，能够在SPF鸡体内脏器中复制，并且能在SPF鸡之间通过接触水平传播。3.BABL/C小鼠的致病性试验表明，2株H5N6亚型AIV对BABL/C小鼠具有高致病性，死亡率为100%，能够在BABL/C小鼠体内脏器中复制。4.豚鼠的致病性试验表明，2株H5N6亚型AIV对豚鼠具有致病性，ZH283组和SW8组死亡率分别为33.3%和66.7%，能够在豚鼠体内脏器中复制，并且能在豚鼠之间通过接触水平传播。5.2株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性试验表明，2株H5N6亚型AIV对北京鸭表现为低致病性，能够在北京鸭体内脏器中复制，并且能在北京鸭之间通过接触水平传播和通过接触水平传播至鹌鹑并能使鹌鹑发病。6.2株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性试验表明，2株H5N6亚型AIV对鹌鹑表现为高致病性，死亡率都为100%，能够在鹌鹑体内脏器中复制，并且能在鹌鹑之间通过接触水平传播；同时也能跨种传播到北京鸭，然而北京鸭感染却不致病。46 致谢本论文是在导师任涛教授的悉心指导和关怀下完成的。2年来导师严谨的治学态度、豁达宽广的胸怀让我终生难忘。在学习上导师礼贤下士，谦逊好学、精益求精的态度更让我受益非浅；在生活上导师对学生的平易近人，和蔼可亲的关心和帮助，无不让我铭记在心。在此，向导师表示最衷心的感谢和崇高的敬意！感谢廖明教授、张桂红教授、罗开健副教授、曹伟胜副教授、樊惠英教授、亓文宝教授、焦培荣副研究员、张建民副教授、徐成刚高级实验师及贾伟新高级实验师在实验中的细心指导和热情帮助，在此，对他们表示最真诚的感谢！在实验过程中还要感谢博士生研究生孙敏华、康银峰、李亚玲、谢鹏和向斌，硕士研究生高佩、冯敏莎、谭阳通、李艳玲、赵夏琼、朱雯娴、丁诗月、梁健鹏、戴旭、于得水、韩璐杰、高潇祎以及其他未能一一列出姓名的师弟师妹们，感谢他们长久以来对我的支持和帮助，感谢禽病研究室的技术员谢淑敏、郭彩银、林丽芳、林秋燕等提供的支持和帮助。本实验是在华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、农业部兽用疫苗创制重点实验室、广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室和广东普通高校人兽共患预防与控制重点实验室完成，感谢两年来的帮助和支持。最后我要特别感谢我的家人，感谢他们多年来对我的关心、理解、支持和帮助，他们的支持、鼓励是我最大的动力！在此向他们表示我最衷心的祝福和感谢！本文得到广东省科技计划项目（公益研究与能力建设专项）：H7N9亚型禽流感病原学研究(项目编号：2013B020224002)的资助，特此表示感谢！47 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附录：攻读硕士学位期间的科研成果1.任涛,高佩,黎玉莲.一种串联鸭α、γ干扰素基因及其制备方法和应用.申请号或专利号:201610133500.12.高佩,黎玉莲,李亚玲,向斌,任涛*.鸭干扰素的研究进展与应用[J].养禽与禽病防治,2016(2):6-8.3.YinfengKang,BinXiang,RunyuYuan,XiaqiongZhao,MinshaFeng,PeiGao,YanlingLi,YulianLi,ZhangyongNingandTaoRen*.PhylogeneticandPathotypicCharacterizationofNewcastleDiseaseVirusesCirculatinginSouthChinaandTransmissioninDifferentBirds.FrontiersinMicrobiology.2016,Vol.7:119.4.YinfengKang，MinshaFeng，XiaqiongZhao，BinXiang，PeiGao，YulianLi，YanlingLi，XuDai，andTaoRen.Newcastlediseasevirusinfectioninchickenembryonicfibroblastsbutnotduckembryonicfibroblastsisassociatedwithelevatedhostinnateimmuneresponse.VirologyJournal.2016,13:41.52
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