检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫研究.pdf

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第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第10期2012年1O月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1507～1513检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫研究颜小飞李运涛王蓉晖。林建涵温新华汪懋华安冬韩伟静俞育德YanbinLi。(中国农业大学教育部现代精细农业系统集成研究重点实验室，北京100083)(中国科学院半导体所集成光电子学国家重点实验室，北京100083)(DepartmentofBiologicalandAgriculturalEngineering，UniversityofArkansas，Fayetteville，AR72701，USA)摘要研制了一种可用于H5亚型禽流感病毒快速检测的阻抗型免疫传感器。通过蛋白A将H5N1表面抗原血凝素(HA)的单克隆抗体固定于金叉指阵列微电极表面，并与待测溶液中的目标抗原H5N1进行免疫反应。在『Fe(CN)3-溶液中进行电化学阻抗谱扫描，表征电极的表面修饰及抗原捕获过程。当H5N1病毒浓度在2t～2HAunif50L范围时，其浓度的对数值与叉指阵列微电极的电子传递阻抗的变化值呈线性关系，相关系数为0．9885；检出限为2。HAunit／50L，检测时间为1h。此传感器特异性好，灵敏度高，可以重复使用，在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。关键词阻抗型免疫传感器；禽流感病毒；电化学阻抗谱；叉指阵列微电极1引言禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)对家禽养殖业危害巨大，也给人类健康和生命安全造成严重威胁，是世界动物卫生组织规定的A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。根据外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原特性的不同，AIV可分为16种HA亚型(H1～H16)和9种NA亚型(N1～N9)，高致病性禽流感均由H5和H7亚型引起[1]。目前，既能感染禽类又能感染人类的AIV亚型为H5N1，H9N2，H7N7，H7N2和H7N3等，其中感染H5N1的患者病情严重，死亡率高。据世界卫生组织(wHO)报道，自2003年至今，H5N1感染人类的病例为606例，死亡357例，死亡率高达58．9％。为了保障国民的生命财产安全，建立快速、准确、特异的AIV检测技术已迫在眉睫，并成为目前研究的热点问题之一【4]。AIV检测的常用方法主要包括病毒分离鉴定、酶联免疫吸附(ELISA)[5】、聚合酶链式反应(PCR)溉、核酸序列扩增(NASBA)]、环介导等温扩增(LAMP)和生物传感器叫等方法。其中，病毒分离鉴定是诊断AIV的经典方法[1”，具有准确、敏感的优点，但操作繁杂、耗时较长，检测时间需要5～7d，无法满足快速检测的要求。ELISA，PCR，NASBA和LAMP等方法能够检测出各种样品中的AIV，但这些方法或特异性差，或敏感性低，或操作复杂，或需要昂贵的仪器设备及专业的技术人员，难以对AIV进行快速、准确的检测，不利于实际应用中对禽流感疫情的有效预警及防治。近年来，生物传感器在病原微生物快速检测中的应用受到各国学者的重视，出现了多种用于AIV检测的生物传感器，如电化学传感器、表面等离子体共振(SPR)传感器[161、石英晶体微天平(QCM)传感器[1、光学干涉生物传感器等，具有操作简便、灵敏、快速的优点，但普遍处于初步探索阶段，其检测的稳定性和可靠性尚需进一步改进。本研究以灭活的AIVH5N1为检测对象，通过蛋白A将单克隆抗体固定于金叉指阵列微电极表面，制备了一种阻抗型免疫传感器。以Fe(CN)作为氧化还原对，用电化学阻抗谱表征电极表面修饰及抗原捕获过程，并采用等效电路阐释其阻抗谱变化。实验结果表明，待测溶液中灭活的H5N1病毒浓度的对数值与叉指阵列微电极的电子传递阻抗的变化值呈线性关系。2012—02-14收稿；2012-03—27接受本文系国际科技交流与合作专项(No．2010DFA31000)资助E-mail：wangmh@can．edu．cn 第lO期颜小飞等：检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫传感器研究1509闭环境下保存待用。2．3．4病毒捕获在表面固定有特异性抗体的叉指微电极表面滴加3O待测溶液，室温下孵育1h，使待测溶液中的目标病毒与电极表面的抗体进行免疫结合，然后用超纯水冲洗，并用氮气干燥。2．3．5电化学阻抗谱测量利用电化学阻抗谱对电极表面修饰的各个步骤及抗原捕获过程进行表征。电解质溶液为含有1mol／LKC1和10mmol／L[Fe(CN)63-(1：1，v／)的PBS(10mmol／L，pH7．4)缓冲液，测量频率范围为20Hz～1MHz，外加交流电压幅值为10mV。记录反应过程中的Nyquist阻抗谱(阻抗实部vs阻抗虚部)，用ZView软件建立等效电路模型并进行阻抗谱拟合。3结果与讨论3．1抗体质量分析金叉指阵列微电极表面固定的抗体与目标病毒之间具有的较好亲和力是保证免疫传感器检测性能^8的关键因素。本研究采用Dot-ELISA方法检测抗体与H5N1病毒之间的亲和力。由图2可见，病毒浓度较高时(2，2，2HAunit／50)，NC膜上呈现出较深的紫色斑点；随着病毒浓度降低，抗原一抗体结合后呈现的斑点颜色越来越浅。当病毒浓度降低至2。HAunit／50uL时，呈现出颜色极为微弱的斑点。因此，本研究所选用的抗体与H5N1病毒之间具有良好的亲和力，能够应用于免疫传感器的制备。3．2免疫传感器的电化学阻抗谱电化学阻抗谱Nyquist图能够有效地表征金叉指阵列微电极表面修饰和病毒捕获过程。图3b为金电极表面逐层修饰蛋白A、抗体、BSA及吸附浓度为2HAunit／50uLH5N1病毒的Nyquist图。以10mmol／L[Fe(CN)】3_作为氧化还原对，数据从左到右对应频率的下降。每个阻抗谱包含一个高频区的半圆和一条低频区的直线，分别代表电极界面的图2H5亚型禽流感病毒单克隆抗体与不同浓度电子传递过程和扩散过程。当蛋白A、抗体、BSA或H5N1病毒的Dot-ELISA反应结果H5N1病毒吸附到叉指微电极表面后，会抑制电极表Fig．2Dot-ELISAanalysisofafinityofH5monoclonal面氧化还原对的电子传递，导致界面阻抗增加，在antibodyreactingtoH5NIviruswithdiferentconcentra-Nyquist图上表现为阻抗谱半圆直径的增大。因此，tions图3b中阻抗曲线的半圆直径随修饰层的增加而不断增大。b．i盖心岛R吼z图3(a)电化学阻抗检测等效电路图；(b)裸电极I、蛋白A修饰Ⅱ、抗体固定Ⅲ、BSA封闭IV、H5N1病毒捕获V后的Nyquist图及阻抗谱数据拟合Fig．3(a)Equivalentcircuitofelectrochemicalimpedancespectroscopy；(b)Nyquistdiagramoftheimpedancespectroscopyofbareelectrode(I)，afterproteinAmodification㈤，afterantibodyimmobilization㈣，afterBSAblockingav)andafterH5N1virusbinding(v)采用图3a所示的Randles等效电路模型对电化学阻抗谱进行模拟和解析。图中，R。，R，C和Z分别代表电解液电阻、电子传递电阻、双电层电容和Warburg阻抗。如图3b所示，等效电路的拟合数据 分析化学第4O卷和阻抗测量数据具有良好的一致性，说明Randles等效电路模型应用于该免疫传感器电化学阻抗谱的解析是可行的。采用该等效电路分别对裸电极、蛋白A修饰、抗体固定、BSA封闭和H5N1病毒捕获后的电化学阻抗谱进行拟合，得到等效电路各元件在金电极表面不同吸附状态下的拟合值。由表1可见，随着电极表面的逐层修饰，R值基本不变；C。的变化率分别为6．2％，3．2％，1％和5．4％；Z的变化率分别为一4．1％，6．9％，3_3％和8．6％；R的变化最为显著，变化率分别为641．1％，87．8％，48．2％和15．8％。因此，可通过R检测电极表面固定和病毒吸附过程。表1金电极表面逐层修饰后等效电路各元件的拟合值Table1Simulatedvaluesofelementsinequivalentcircuitforthebareelectrode，afterproteinAmodification,afterantibodyimmobilization,afterBSAblockingandafterH5N1virusbinding金A电d极表面吸附状态RRCdlz极表面吸附状态RRCdlzsorptionstatesof(aXs)(QXet)(n)(／)Asorptionstatesof(1Q,s)(()()ngoldelectrode⋯⋯⋯⋯⋯goldelectrode、⋯、⋯⋯⋯⋯裸电极36228．1671．2272．3BSA封闭36Bareelectrode．‘‘’BSAblocking．5579．’9743．‘1288．‘5P蛋白A修饰365208．4712．6261．1H5Nl吸附37．roteinAmodification‘‘‘’H5N1virusbinding．1671．‘8783．。2313．。2抗体固定364391AntibodyimmobilizationJU,．。4。735．’7279．’33．3禽流感H5Nl亚型病毒的检测将不同浓度灭活的禽流感H5N1亚型病毒滴加到固定抗体的金叉指阵列微电极表面进行检测，免疫反应lh后记录电化学阻抗谱Nyquist图。结果表明，随着病毒浓度增大，吸附到金电极表面的病毒数量增加，从而使Fe(cN)3-／4-氧化还原对在电极表面的电子传递阻力变大，导致R随之增加。如图4所示，当H5N1病毒浓度在2～2HAunit／50uL范围时，病毒浓度的对数值与电子传递电阻的变化值AR。(电极表面吸附病毒后的R。值一BSA封闭后的H5N1病毒浓度R值)呈线性关系，相关系数为0．9885。其中，△R值ConcentrationofH5N1virusflog2HA。)为相同条件下对H5N1病毒重复测量3次的平均值，图4H5N1病毒浓度对数值与电子传递电阻的变化其标准差如图4中误差棒所示。该免疫传感器的检值之间的线性关系测下限为2。HAunit／50uL，与Dot-ELISA方法的检Fig．4Linearrelationshipbetweenthelogarithmicvalue出限相当。表2总结了禽流感H5亚型病毒的其它ofconcentrationofavianinfluenzavirus(AIV)H5N1and检测方法。changeofelectrontransferresistance表2禽流感H5亚型病毒的其它检测方法Table2OtherAIVH5subtypedetectionmethods 一第10期颜小飞等：检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫传感器研究1511加∞舳∞加0加续表2(ContinuedTable2)3．4免疫传感器的特异性采用禽流感H1，H3，H9亚型病毒和新城疫(ND)病毒检测该传感器的特异性。免疫传感器制备完成后，分别将30uL浓度为2HAunit／50gL的H1，H3，H9，ND和H5N1病毒滴加到电极表面，室温孵育1h后记录其Nyquist图。结果表明，H1，H3，H9和ND病毒均不会引起明显的阻抗信号变化，如图5所示，4种非目标病毒引起的AR。值均在系统误差范围之内，该免疫传感器具有良好的特异性。3．5传感器的再生该免疫传感器能够重复使用，可通过NaOH溶液和HC1溶液洗去电极表面吸附的蛋白。将使用过的传感器依次置于lmol／LNaOH和1mol／LHC1溶液中浸泡5和2min后，用超纯水清洗干净，并用蘸有无水乙醇的擦镜纸轻轻擦拭电极表面。反复清洗3～5次后，测量电极的Nyquist图。若与电极使用前裸电极的Nyquist图相近，则该电极可继续用于下一次的测定；若差别较大，则继续清洗，直至两者相近。如图6所示，随着电极使用次数增加，清洗后的裸电极阻抗谱R值呈增大趋势。实验表明，电极经反复清洗后，若裸电极阻抗谱R值仍大于60Q，则表明又指微电极表面已损坏，不建议继续使用此电极进行病毒检测。采用上述方法再生，传感器一般可重复使用8次。病毒Virus图6叉指阵列微电极使用次数与裸电极阻抗谱R。值图5免疫传感器的特异性检测的关系Fig．5SpecificitytestsofimmunosensorFig．6Relationshipbetweenrecyclingtimesofinterdigita—tedarraymicroelectrodesandR。tvalueofbareelectrode4结论通过在叉指阵列微电极表面固定特异性抗体以捕获目标病毒，采用法拉第阻抗谱技术实现对禽流感H5亚型病毒的快速检测。等效电路分析表明，当H5N1病毒吸附到电极表面时，电子传递电阻R会发生显著变化。当H5N1病毒浓度在2～2HAunit／50gL范围时，病毒浓度的对数值与R的变化值呈线性关系。与传统方法相比，本方法操作简单、所需样品量少、检测时间短(1h)，且灵敏度高、特异性强、稳定性好。当实验中选用其它抗体，本方法可实现对其它病原微生物的检测研究。 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第10期颜小飞等：检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫传感器研究1513AnImpedanceImmunosensorforDetectionofH5SubtypeAvianInfluenzaVirusYANXiaOFei，LIYun-Tao，WANGRong—Hui0，IINJian-Han。，WENXin—Hua，WANGMao—Hua～，ANDong，HANWei—Jing，YUYu—De，LIYan—Bin。(KeyLaboratoryonModernPrecisionAgricultureSystemIntegrationResearch，MinistryofEducation，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100083，China)。(StateKeyLaboratoryofIntegratedOptoelectronics，InstituteofSemiconductor，ChineseAcademyofSciences，Beijing100083，China)。(DepartmentofBiologicalandAgriculturalEngineering，UniversityofArkansas，Fayetteville，AR72701，USA)AbstractAnimpedanceimmunosensorwasdevelopedfortherapiddetectionofH5subtypeavianinfluenzavirus(AIV)．MonoclonalantibodiesagainstAIVH5N1surfaceantigenhemagglutinin(HA)wereimmobilizedonthesurfaceofgoldinterdigitatedarraymicroelectrodesthroughproteinAforcapturingAIVH5N1insamplesolutions．Electrochemicalimpedancespectroscopyinthepresenceof[Fe(CN)6]一asaredoxprobewasusedtodescribethesurfacemodificationofmicroelectrodesandthebindingofviruses．AlinearrelationshipbetweenthelogarithmicvalueofconcentrationofAIVH5N1andthechangeofelectrontransferresistancewasfoundintheconcentrationrangeof2一2HAunitper50uL，anditscorrelationcoefficientwas0．9885．Thedetectionlimitwas2。HAunitper50gL，andthedetectiontimewas1h．Thisimmunosensorcouldbeusedrepeatedlywithgoodspecificityandhighsensitivity，anditispromisingforrapiddetectionofpathogenicmicroorganisms．KeywordsImpedanceimmunosensor；Avianinfluenzavirus；Electrochemicalimpedancespectroscopy；InterdigitatedarraymicrOeIectrOdes(Received14February2012；accepted27March2012)+-量+-量+-+-量+-量+-+-圣《天然有机化合物核磁共振碳谱集》(上、下册)(ISBN978—7—122—12695-5)本书是全面收集了生物碱类、萜类、皂、苷类、黄酮类、醌类、苯丙素类、甾体类、芳香族类、脂肪族类，木脂素、香豆素、氨基酸和糖类、海洋天然产物、抗生素等2万余种天然有机化合物的核磁共振碳谱数据，每一种化合物都给出了相应的名称、分子式、结构式、测试溶剂和碳的化学位移数据以及参考文献。书后还附有化合物中英文名称索引以及分子式索引等，详实的数据资料，对确定天然有机化合物的结构有很大帮助。该书由杨峻山主编，化学工业出版社出版，定价488．00元