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学校代码：８７８０１？学号：２〇＿篇学号：２０１４０３８硕士学位论文槐耳清膏对膜性肾病大鼠肾组织Ｍ型ＰＬＡ２Ｒ和ＩｇＧ４表达的影响ＴＨＥＥＦＦＲＣＴＯＦＬＯＣＵＳＴＰＡＳＴＥＯＮＴＨＥＥＸＯＲＥＳＳＩＯＮＯＦＭＴＹＰＥＰＬＡ２ＲＡＮＤＩＧＧ４ＩＮＲＥＮＡＬＴＩＳＳＵＥＯＦＭＥＭＢＲＡＮＯＵＳＮＥＰＨＲＯＴＩＣＴＡＴＳ专业：中西医结合临床研究生：李则辉导师：李莲花教授二〇一七年五月 目录英文缩略词..................................................................................................................III中文摘要......................................................................................................................IVABSTRACT......................................................................................................................V前言...........................................................................................................................1文献综述.......................................................................................................................31现代医学对MN的认识....................................................................................32中医对MN的认识............................................................................................9材料与方法.................................................................................................................141.实验材料..........................................................................................................141.1实验动物...............................................................................................141.2实验用药...............................................................................................141.3实验试剂和实验仪器...........................................................................142实验方法..........................................................................................................152.1动物模型的制备...................................................................................152.2分组及给药...........................................................................................152.3观察内容...............................................................................................162.4肾组织病理切片制作...........................................................................163统计学处理......................................................................................................19实验结果.....................................................................................................................201大鼠造模后存活情况及一般状态..................................................................202MN大鼠肾组织病理改变...............................................................................203第1天、第4周、第8周24h尿蛋白定量比较情况..................................204血清学检查......................................................................................................214.1治疗前后血清白蛋白(ALB）水平的比较情况...................................214.2治疗前后血清胆固醇（CHOL）和甘油三酯（TG）的比较情况......224.3治疗前后血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）的比较情况...............225肾组织M型PLA2R和IgG4的表达情况.......................................................23讨论...........................................................................................................................231阳性对照药物的选择......................................................................................24I 2导师对MN的认识..........................................................................................242.1MN的病因病机....................................................................................242.2MN的治疗原则....................................................................................253槐耳及其复方制剂的功效..............................................................................254槐耳及其复方制剂MN机理的探讨..............................................................254.1对蛋白尿的影响...................................................................................254.2对血清生化指标的影响.......................................................................264.3减少免疫复合物沉积，减轻肾脏病理的损伤...................................264.4降低PLA2R和IgG4在肾脏中的表达，调节免疫炎症反应.............26结论.............................................................................................................................28参考文献.....................................................................................................................29致谢...........................................................................................................................33攻读研究生期间发表的学术论文.............................................................................34附录...........................................................................................................................35原创性声明.................................................................................................................40关于论文使用授权的说明.........................................................................................40II 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文英文缩略词C-BSACationbovineserumalbumin阳离子化牛血清白蛋CNICalcineurininhibitor钙调磷酸酶抑制剂ESRDEndstagerenaldisease终末期肾脏病GBMGlomerularbasementmembrane肾小球基底膜GTWTripterygiumGlycosides雷公藤多苷IMNIdiopathicmembranousnephropathy特发性膜性肾病LEFLeflunomide来氟米特MBLMannanbindinglectinpathway甘露糖结合凝集素途径MMFMycophenolatemofetil吗替麦考酚酯MNMebranousnephropathy膜性肾病NEPNeutralendopeptidase中性肽链内切酶PLA2RPhospholipaseA2receptor磷脂酶A2受体ROSReiveoxygenspecies活性氧SMNSecondarymembranousnephropathy继发性膜性肾病THSD7AThrombospondintype-1domain-containing7AⅠ型血小板反应蛋白7ATNF-αTmornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αC-BSACationbovineserumalbumin阳离子化牛血清白蛋CNICalcineurininhibitor钙调磷酸酶抑制剂III 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文中文摘要目的：通过实验研究观察槐耳清膏对膜性肾病大鼠肾组织M型PLA2R和IgG4表达的影响，探索和研究槐耳治疗膜性肾病的疗效及可能的作用机制。方法：将50只雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、雷公藤多苷片组、槐耳清膏高剂量组、槐耳清膏低剂量组。按照Boeder方法，诱导膜性肾病大鼠模型。造膜成功后，治疗组给予槐耳清膏和雷公藤多苷片治疗8周。观测治疗前后24h尿蛋白定量、血清白蛋白（ALB）、胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）的变化情况；通过光镜、电镜观测膜性肾病大鼠肾组织的病理变化；通过免疫组化检测膜性肾病大鼠肾组织M型PLA2R和IgG4沉积的表达。结果：1、槐耳清膏能够降低CBS-A膜性肾病大鼠24h尿蛋白定量，提升血清白蛋白水平，降低血清尿素氮，与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。2、槐耳清膏可减少肾组织M型PLA2R和IgG4表达，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3、槐耳清膏能减少膜性肾病大鼠免疫复合物在肾小球基底膜的沉积，减轻肾脏病理改变。结论：1、槐耳清膏能够减少膜性肾病大鼠蛋白尿的排泄，提升血浆白蛋白，降低血清尿素氮。2、槐耳清膏能够减少膜性肾病大鼠肾小球基底膜免疫复合物的沉积，从而减轻膜性肾病的病理损害。3、槐耳清膏能够减少膜性肾病大鼠肾组织M型PLA2R和IgG4的表达，从而减少膜性肾病靶抗原的沉积。关键词：槐耳清膏；膜性肾病；M型PLA2R；IgG4IV 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文ABSTRACTObjective:theeffectofrenaltissueinratsofMtypePLA2RandIgG4observationofexperimentalPS-Tonexpressionofmembranousnephropathy,exploreandstudyeffectofHuaiertreatmentofmembranousnephropathyanditspossiblemechanism.Methods:50maleWistarratswererandomlydividedinto5groups,10ratsineachgroup,namelycontrolgroup,modelcontrolgroup,TripterygiumPS-Tgroup,highdosegroup,lowdosegroupofps-t.AccordingtotheBoedermethod,theratmodelofmembranousnephropathywasinduced.ThefilmmadeafterthesuccessofthetreatmentgroupwasgivenPS-TandTripterygiumtabletsfor8weeks.Wereobservedbeforeandaftertreatment,24hurinaryproteinserumalbumin(ALB),cholesterol(CHOL),triglyceride(TG),ureanitrogen(BUN),serumcreatinine(Scr)changes;thepathologicalchangesofrenaltissuesofratswithlightmicroscopeandelectronmicroscopeobservationofmembranousnephropathy;membranousnephropathyandrenalexpressiontheorganizationofratMtypePLA2RandIgG4depositionbyimmunohistochemistry.Results:1,PS-TcanreduceCBS-Amembranousnephropathy24hurinaryproteininrats,increasethelevelofserumalbumin,serumureanitrogen,therewasstatisticalsignificancecomparedwiththemodelcontrolgroup(P<0.01);PS-TlowdosegroupandTripterygiumgroup,wasstatisticallysignificant(P<0.05).2,PS-TcanreducetherenaltissueofMtypePLA2RandIgG4expression,comparedwiththemodelgroup,therewasstatisticalsignificance(P<0.05);PS-TlowdosegroupandTripterygiumgroup,nostatisticalsignificance(P>0.05).3,PS-Tcanreducethedepositionofmembranousnephropathyinratswithimmunecomplexesintheglomerularbasementmembrane,reducetherenalpathologicalchanges.Conclusion:1,PS-Tcanreducemembranousnephropathyratsurinaryproteinexcretion,enhanceplasmaalbumin,decreaseserumureanitrogen.2,PS-Tcanreducethedepositionofmembranousnephropathyratglomerularbasementmembraneimmunecomplexes,therebyreducingthepathologicaldamageofmembranousnephropathy.3,PS-TcanreducetheexpressionofmembranousV 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文nephropathyinrenaltissueofratswithMPLA2RandIgG4,thusreducingthedepositionofmembranousnephropathytargetantigen.Keywords:PS-T;membranousnephropathy;MPLA2R;IgG4VI 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文前言膜性肾病（mebranousnephropathy，MN）是原发性肾小球疾病的病理诊断名词，病理诊断特点是肾小球基底膜上皮下免疫复合物沉积，同时出现基底膜弥漫性增厚表现。MN的发病率约占原发性肾小球肾炎的9.54%，随着肾活检等医疗技术的发展与推广，MN的检出率呈逐年上升趋势，检出率从5.8%上升至13.6%[1]。约60～80%MN患者表现为肾病综合征，其余表现为无症状的蛋白尿[2]。MN的预后存在着较大的差异，约有20～30%可自发缓解，50%的患者表现为持续性的肾病综合征，表现为持续性的肾病综合征患者有30～40%约10～15年发[3]展为终末期肾脏病（Endstagerenaldisease，ESRD）。MN仍然是原发性肾小[4]球疾病中导致终末期肾脏病第二位或第三位的病因。[5]在特发性MN的发病机制方面的研究，近十年来取得了巨大进展，Beck证实了M型PLA2R是大部分成人特发性MN的足细胞自身抗原，同时检测出特异性识别PLA2R的IgG4抗体亚型，两者结合后会激活补体反应，引起肾小球滤过膜的损伤。肾组织PLA2R是MN的特异性的的生物标记物，同时，血清抗PLA2R抗体是一个敏感的指标，大约70～80%的MN患者血清中检测到[6]PLA2R抗体阳性。PLA2R是MN的主要靶抗原，PLA2R抗体在MN的发病、诊断和鉴别诊断中具有重要意义。IgG4作为PLA2R的特异性抗体，是特发性[7]MN患者肾小球免疫复合物沉积的主要成分，与PLA2R具有同样重要的意义。在MN的治疗中，糖皮质激素联合免疫抑制剂虽然取得了较好的临床疗效，但长期应用副作用较大，停药后容易复发，给患者及家庭带来沉重的经济负担。近年来中医药在MN的治疗中发挥着重要的作用，因良好的治疗效果、较低的副作用、相对低廉的价格被大众所接受。因此寻找安全有效的MN靶向性治疗药物尤为重要。槐耳及其复方制剂槐杞黄颗粒在慢性肾脏病的临床治疗中得到广泛的应用，具有改善患者蛋白尿，调节免疫，减轻肾脏炎症反应，保护肾小球足细胞[8]细胞，改善肾脏纤维化等作用。槐耳是我国古代重要的药用真菌，具有治风、破血、益力的功效。槐耳清膏中的主要成分---多糖蛋白（PS-T）具有能促进巨噬细胞功能作用，能增强溶菌酶活性，激活中性粒细胞和巨噬细胞，并促进T细胞的分裂、增殖、成熟、活化，并调整Th/Ts比例，能内源性诱导产生IFN-α、[9]IFN-γ，刺激产生IL-2等淋巴因子，进而激活相关细胞，发挥免疫调节作用。1 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文本实验通过探讨槐耳清膏对MN大鼠肾组织M型PLA2R和IgG4表达的影响，证实槐耳清膏具减轻肾组织病理损害，减少肾小球上皮下免疫复合物的沉积，从而减少尿蛋白的排泄，为临床治疗MN提供理论依据。2 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文文献综述1现代医学对MN的认识MN是引起原发性肾小球疾病常见的病理类型。临床表现不一，即可表现为肾病综合征，又可表现为无症状蛋白尿。根据病因将MN分为特发性MN（Idiopathicmembranousnephropathy，IMN）和继发性MN（Secondarymembranousnephropathy，SMN）。SMN有明确的发病原因，继发于自身免疫系统疾病、感染性疾病、恶性肿瘤、药物及毒物和其他疾病；IMN又称为原发性MN，无法明确其病因及发病机制。1.1MN发病机制的研究进展IMN是一种器官特异性的自身性免疫性疾病，其发生是多种因素共同作用的结果，包括靶抗原、自身抗体、补体和基因易感性等。IMN的发病机制虽不能完全阐述清楚，但M型磷脂酶A2受体（PhospholipaseA2receptor，PLA2）的发现取得了突破性的进展[10]。1.1.1MN靶抗原—M型PLA2RPLA2R是一种跨膜糖蛋白，在人类肾脏、肺脏上皮细胞和胎盘中均有表达，在肾脏中主要定位于肾小球足细胞。PLA2R受体属于甘露糖受体家族。Beck第一次在IMN患者血清中检测到M型PLA2R抗体，同时发现发现M型PLA2R抗体浓度与尿蛋白水平呈显著相关性，认为IMN的重要靶抗原可能是M型PLA2R，血清中检测到的PLA2R抗体主要针对M型PLA2R，主要以IgG4形式存在。磷脂酶A2（PLA2）表达于所有有核细胞中，是一个脂溶性水解酶超家族，有三个亚型：分泌型、胞浆型和钙离子依赖型，随着研究的深入，更多磷脂酶A2亚型和磷脂酶A2受体被发现，观察到磷脂酶A2在抗感染、抗炎、肿瘤诊断等方面具有重要作用。PLA2R是PLA2的受体，是存在于正常足细胞表面的膜蛋白。M型PLA2R是IMN的特异性靶抗原，在MN患者血清中检测中有70～80%的患者抗PLA2R抗体阳性，在继发性MN及其他肾小球疾病中的几乎检测不到[11]。血清抗PLA2R抗体是诊断IMN和检测SMN活动的分子标志物。血清抗PLA2R抗体和肾组织PLA2R结合，结合后形成原位免疫复合物，免疫复合物激活补体凝集素途径，形成C5b-9膜攻击复合物，引起肾小球足细胞的损伤，引3 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文发蛋白尿的产生[12]。血清抗PLA2R抗体主要以IgG4形式存在。肾组织PLA2R和IgG4共同参与IMN的发病，血清抗PLA2R抗体滴度与疾病严重程度和预后有密切关系。一项研究发现，IMN患者血清抗PLA2R抗体水平与临床的一些指标相关，这些指标可以反映疾病的活动度，发现PLA2R抗体水平与蛋白尿、肌酐、血/[13]尿β2-MG和尿IgG排出呈正相关，与eGFR呈负相关。PLA2R抗体水平与患者的临床表现相关：在大量蛋白尿（＞3.5g/24h）的IMN患者中，在其早期阶段血清中可检测到高低度抗PLA2R抗体，当疾病进入缓解阶段时，抗PLA2R抗体水平降低，随着病情的复发，抗PLA2R抗体水平再次升高。这说明IMN[14]患者血液循环中抗PLA2R抗体水平与疾病的活动度密切相关。在一篇对PLA2Ｒ抗体诊断IMN的meta分析中，在1551例确诊IMN患者分析后得，PLA2R对于诊断IMN的敏感性可达69%，特异性可以达到99%，[15]PLA2R检测有望成为临床上鉴别IMN和SMN的有效手段。南京军区总院刘志红院士团队在572例肾活检证实为IMN的患者中，用ELISA的方法检测到抗PLA2R抗体，用免疫荧光方法检测PLA2R沉积。结果显示，血清抗PLA2R抗体阳性率为68.5%，其中98.7%的患者肾组织PLA2R沉积，在血清抗PLA2R抗体阴性患者肾组织PLA2R沉积率为70.6%，PLA2R沉积率明显高于PLA2R抗体检测率（P＜0.001）。同时并指肾组织PLA2R和血清抗PLA2R抗体是诊断IMN、检测疾病活动性、预后判断和治疗决策的重要标志物。血清抗PLA2R抗体阳性患者较血清抗PLA2R抗体阴性患者尿蛋白水平更高，肾小球滤过率水平更低。与血清PLA2R抗体阴性、肾组织PLA2R阳性患者相比，血清抗PLA2R抗体阳性、肾组织PLA2R阳性患者尿蛋白水平更高，这提示血清抗PLA2R抗体较肾组织PLA2R与疾病的活动性和肾功能水平降低更相关。在52例重复肾活检病例中，血清抗PLA2R抗体水平在未获得缓解的患者中持续较高，未获得缓解的患者较获得缓解的患者第一次肾活检时PLA2R抗体的比例更高。持续的PLA2R沉积与疾病的复发有关。1.1.2其他生物标志的应用除PLA2R之外，中性肽链内切酶（NEP）、醛糖还原酶（AR）、超氧化物歧化酶（SOD2）、α-烯醇化酶和Ⅰ型血小板反应蛋白7A域（THSD7A）也被证实与IMN有关。NEP虽然解释了新生儿MN的发病机制，但不能完全解释成[16]人MN的发病机制。虽然在MN患者血清中检测到抗AR和抗SOD2的IgG44 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文抗体，但SOD2只在IMN患者肾组织中表达，而AR在IIMN和SMN患者肾组[17]织中均有表达。研究证明α-烯醇化酶也是存在于足细胞中的自身抗原，在血清检测中抗α-烯醇化酶，其主要成分以IgG4为主，但其在血清中的检测率明显低于抗PLA2R抗体。THSD7A的发现被认为是继PLA2R之后的第二靶抗原。THSD7A与PLA2R具有相似的化学结合和特征，同样表达于肾小球足细胞，且抗THSD7A抗体也是IgG4亚型，对于PLA2R抗体阴性的患者，THSD7A是一[18]个补充。1.1.3IgG4在MN中的意义抗PLA2R抗体主要亚型是IgG4，抗THSD7A抗体主要亚型是IgG4，部分AR或SOD2抗原的MN患者中，致病抗原是IgG4。IgG4是IMN肾小球上皮下[19]免疫复合物中的主要成分。Troyanov对186例IMN患者进行血清学检测，发现绝大多数患者血清中存在一种或多种IMN相关靶抗原的自身抗体，无论哪种自身抗体占优势，其亚型均以IgG4为主。IgG抗体是反映人体免疫功能的一项重要指标，根据重链结构的不同IgG抗体可分为4个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，根据现在的研究，肾组织IgG亚型常用于临床上用来区分IMN和SMN。Doi[20]教授首先发现并提出IgG4亚型在MN患者肾小球毛细血管袢免疫复合物沉积中占主要地位，而在SMN或其他肾小球疾病中肾组织沉积物以IgG1和IgG3亚型沉积为主。一项日本的研究显示，在亚裔人群中，弥漫增殖性狼疮肾炎、狼疮肾炎Ⅴ型同IMN患者比较重，前两组患者肾小球中以IgG1、IgG2、IgG3沉积为主，IgG4表达较低甚至不表达，而在IMN患者肾小球中以IgG4表达为主，伴IgG1[21]的沉积。我国研究人员对中国人群IMN肾小球IgG亚型的沉积特点进行了大量的研[22]究。韩伟丽等人在120例确诊为MN的患者，分为IMN组和不典型MN（UAMN）组，经免疫组化方法测定，IMN组以IgG4沉积为主，而UAMN组存在IgG1、IgG2、IgG多种亚型的沉积；在价值评估中，IgG4以强度1为界值，[23]灵敏度为79.5%，特异度为64.9%。管音等人在探讨MN患者血清抗PLA2R抗体与肾小球IgG4相关性的研究中发现，血清抗PLA2R抗体诊断IMN灵敏度为69.5%，特异度为95.2%；肾小球IgG4亚型诊断IMN的灵敏度为89.9%，特异度为52%；两者共同阳性的灵敏度为59.3%，特异度为100%，说明血清抗PLA2R5 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文抗体与肾小球IgG4亚型的监测有助于MN的诊断与鉴别诊断。1.1.4补体系统致病机制补体系统在足细胞损伤和蛋白尿的形成具有重要作用。上皮下免疫复合物沉积启动补体激活导致C3活化，C5转换，形成C5b-9膜攻击复合物，引起足细胞内活性和蛋白酶体产生，内质网应激及细胞骨架的改变，这些反应诱导细胞凋亡，细胞-基底膜粘附降低，肾小球基底膜变性，裂孔蛋白错位，引起足细[24]胞损伤，导致蛋白尿形成。补体系统是最重要的调节者。1.1.5基因致病机制随着基因组学的发展，越来越多的实验研究表明，MN的发生机制与遗传基因有关。PLA2R分布于足细胞表面，其多态性可能直接影响到基因的功能。[25]Stanescu通过对欧洲人IMN患者用全基因组联合方法，研究发现：位于2号染色体PLA2RSMPrs4664308和位于6号染色体HLA-DQA1SNPrs2187668是[26]欧洲白种人IMN的易感基因。我国学者张宏教授及其团队在对1112例IMN患者的基因多态性分析中发现，携带HLA-DQA1和PLA2R1风险等位基因的患者中，73%的患者可在循环中检测出抗PLA2R抗体，75%的患者肾小球表达PLA2R，提示这部分患者在致病性PLA2R抗体产生上存在明显易感风险。其他基因的SNPs，包括肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）等位基因G308A、TNFA2、NPHS1、PAI1、IL-6STAT4及TLR9均报道与MN有关。1.2MN的治疗进展由于IMN的病情迁延，预后主要存在肾功能逐渐恶化和自发缓解两种趋势，故在治疗方案的药物选择上一直存在争议。一些学者认为在一般情况较好的患者，由于免疫抑制剂的副作用，相较于未使用免疫抑制剂的患者，使用后并未获得有益的效果。根据2012年改善全球肾脏病预后组织临床实践指南中明确指出：不推荐IMN的初始治疗单一使用糖皮质激素。而激素联合免疫抑制治疗IMN有较好的应用价值。1..2.1非免疫抑制剂的治疗饮食食物上应坚持低盐饮食为主，低脂蛋白为优且每天的摄入应在0.6~0.8g/kg。少食用或尽量不食动物内脏及肥肉脂肪。限制钠盐及水分的摄入。可使用一些富含钙、镁、锌、铁等微量元素元素的水果、蔬菜等食品。目前认为年龄较轻、肾功能正常、尿蛋白定量＜3.5g/24h，血浆白蛋白水平6 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文正常或轻度下降的患者，药物首选血管紧张素转换酶抑制剂（Azngiotensinconvertingenzymeinhibitor，ACEI）或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（Angiotensinreceptorreceptorblocker，ARB）,在降压的同时降低蛋白尿，可作为降压的首选药物，患者血压应控制在125/75mmHg（1mmHg＝0.133kPa）以下，[27]必要时可联合应用其他种类降压药，调脂治疗可选用他汀类药物。此外，MN患者的血栓发生率较高，其中尤以肾静脉最常见，故治疗时可使用肝素、尿激酶等药物预防。1.2.2免疫抑制剂的治疗KDIGO指南建议表现为肾病综合征的MN患者经过6个月的降蛋白治疗，蛋白仍维持大于4g/d或维持在高于基线水平50%以上，且无下降趋势；或存在肾病综合征严重的并发症；或6~12个月血清肌酐升高≥30%者应用免疫抑制剂治疗。1.2.2.1糖皮质激素联合烷化剂KDIGO指南首先推荐糖皮质激素联合烷化剂治疗。此治疗方案源于意大利Ponticelli[28]的一项开放性RCT研究，又被称为“意大利方案”：第1、3、5个月初给予甲泼尼龙1.0g/d静脉点滴3天，接着口服0.5mg/（kg·d）；第2、4、6个月停用激素，给予苯丁酸氮芥0.15~0.20mg/（kg·d）或环磷酰胺2.0~2.5mg/（kg·d）口服30d（IB）。在甲泼尼龙联合环磷酰胺与甲泼尼龙联合苯丁酸氮芥的方案比较试验中，3[29]年内两组的完全或部分缓解率分别为93%及82%，肾功能对比无差异。但与环磷酰胺组相比，苯丁酸氮芥组发生严重不良事件中断治疗的患者比较多。大量研究证实糖皮质激素联合烷化剂，比单用烷化剂副作用明显降低，联用环磷酰胺的安全性优于苯丁酸氮芥。1.2.2.2糖皮质激素联合钙调磷酸酶抑制剂（calcineurininhibtor，CNI）KDIGO临床实践指南建议抵抗糖皮质激素和烷化剂治疗的MN患者可使用CNI治疗方案。其代表药物为环孢素A（CSA）和他克莫司（FK506）。环孢素A联合低剂量的泼尼松龙治疗半年与安慰剂联合低剂量泼尼松龙组比较缓解率分别为75%和22%，保持1年上者为39%和13%，未见CSA出现严[30]重的副作用。有使用CSA治疗高危的IMN患者1年，仍可使34%的患者缓解。FK506逐步广泛应用致肾脏领域，具有起效快，不良反应少，缓解率高等优势。单用FK506每次0.05mg/（kg·d），分两次口服，药物浓度3~8ng/ml，治疗127 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文个月，缓慢减药半年后停药，18个月的缓解率为94%。我国一项RCT研究发现激素联合FK506，药物浓度5~10ng/ml，治疗6个月后的缓解率93.9%。国内外多项随机对照研究证实，FK506与其他免疫抑制剂如环磷酰胺、霉酚酸酯相比，[31]可以更迅速的缓解患者24h蛋白尿，同时升高血浆白蛋白。1.2.2.3糖皮质激素联合吗替麦考酚酯（mycophenolatemofetil，MMF）KDIGO临床实践指南明确指出不建议单一使用MMF用于IMN患者的初始治疗。国外一项临床RCT研究结果提示MMF治疗并不能有效降低IMN患者的蛋白和提高缓解率，且有些患者出现明显的不良反应。MMF单独治疗IMN的疗效尚不确切。泼尼松联合MMF治疗6个月，总有效率为72.2%。Branten等发现MMF联合糖皮质激素治疗12个月，能有效缓解蛋白、改善肾功能，但其[32]疗效和耐受性并不优于环磷酰胺。1.2.2.4糖皮质激素联合来氟米特（leflunomide，LEF）近年来诸多临床观察证明，LEF联合糖皮质激素治疗激素依赖性和激素抵抗性肾病综合征，具有降低蛋白尿和提高血清白蛋白的作用，其疗效与CTX、MMF或FK506联合糖皮质激素的治疗效果相当，可有促进RPNS患者肾功能恢复的作用。一项研究通过对80例原发性肾病综合征经肾活检确诊为IMN的患者，随机分组，分别用LEF和CTX分别联合泼尼松治疗，治疗6个月后，CXT组[33]疗效指标略优于LEF，但差异无统计学意义。但LEF比CTX不良反应更小，耐受性较好，而LEF比CTX起效慢，治疗6个月的临床效果稍逊于CTX，但长期疗效仍需进一步观察治疗。1.2.2.5糖皮质激素联合雷公藤多苷（TripterygiumGlycosides，GTW）研究证实雷公藤甲素能够通过抑制细胞内P38信号通路活性，减少嘌呤霉素动物模型所导致的足细胞损伤。同时还可以拮抗膜复合物C5b-9所导致的足细胞损伤，提示雷公藤甲素能通过免疫抑制及其以为的途径保护足细胞。文献[34]报道GTW与FK506分别联合小剂量的泼尼松均有较高的缓解率。我国左科等人对100例IMN患者，随机分组，用GTW联合小剂量的泼尼松治疗IMN，用FK506联合小剂量的泼尼松做对照，治疗12个月的有效率分别为76.9%和79.9%，完全缓解率为10.6%和33.7%[35]。GTW联合ARB可明显减少非肾病综合征表现的IMN患者蛋白尿，不良反应少，值得临床推广应用。8 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文2中医对MN的认识2.1病名MN是现代医学的诊断名词，在中医诊断中无此病名。根据MN的临床表现可将其归属为“尿浊”、“水肿”“虚劳”等范畴。2.1.1尿浊尿浊是指因湿热下注、脾肾亏虚等引起的小便浑浊，白如泔浆的疾病。《素问·至真要大论》言：“少阳在泉，客胜则腰腹痛而恶寒，甚则下白溺白。”《医碥·淋》言：“膏淋，湿热伤气分，水液浑浊，如膏如涕如米泔。”此将膏淋意为尿浊。2.1.2水肿水肿病名首见于《黄帝内经》。《灵枢·水胀》中称为“水”，言之：“水始起也，目窠上微肿，如新卧起立状，其颈脉动，时咳，阴股间寒，足胫肿，腹乃大，其水已成矣，以手按其腹，随手喘起，如裹水之状，此其侯也。”《诸病源候论·水病诸侯》言：“水病无不由脾肾虚所为，脾肾虚则所为，脾肾虚则水妄行，盈溢皮肤而令身体肿满。”2.1.3虚劳虚劳是指临床以两脏或多脏虚损、气血阴阳中等多种功能虚损为主要表现的慢性虚弱性症候的总称。病名首见于《金匮要略·虚痹虚劳病脉证并治》。《医宗金鉴·虚劳总括》曰：“虚者，阴阳、气血、荣卫、精神、骨髓、津液不足是也；损者，外而皮、脉、肉、筋、骨，内而肺、也、脾、肝、肾消损是也；成劳者，谓虚损日久，留连不愈，而成五劳、走伤、六极也。”2.2病因病机中医学理论认为，MN的本质属本虚标实，正虚邪实，病位在肺、脾、肾三脏，肺脾肾三脏功能失调，尤以脾肾虚为主；标实多表现为“瘀血”“湿热”“风湿”“痰浊”等。2.2.1脏腑虚损致病《景岳全书·肿胀》言：“凡水肿等症，乃肺脾肾三脏相干之病。盖水为至阴，故其本在肾；水化于气，故其标在肺；水唯畏土，故其制在脾。今肺虚则气不化水，脾虚则土不制水而反克，肾虚则水无所主而妄行，故传之于脾而肌肉浮肿……”由此可看出，此病病位在肺脾肾三脏，由肺脾肾三脏功能失常，虚损9 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文导致。肺脾肾三脏虚损是基本病机。肺居上焦，主司一身之气，有宣发肃降的生理功能，肺为娇脏，益受外邪侵袭。风邪侵袭肺，肺失宣降，通调水道功能失司，而形成风水水肿。脾居中焦，主运化水湿。《素问·至真要大论》曰：“诸湿肿满，皆属于脾”。肾居下焦，主水，主气化。《医学心语》曰：“浊之因有二种，一由肾虚败精流注，一由湿热渗入膀胱”。脾肾两虚是病机关键，脾虚运化失调则精微不能向外向上疏布，水湿不得运行；肾司开阖，开阖功能有赖于肾阴阳互济平衡，肾阳虚开阖功能失司则小便不利。水液代谢障碍，势必耗伤肾气，精微遗泄日久，更耗肾之阴阳。肾虚温煦滋养失职，脾气匾乏，脾虚化生不足，无力充养先天，二者相互为患，导致水肿发生。脾土劣弱，温化失职，阳道乖戾，则肾精反受其克，精伤而开阖失司，精微随溲出，形成蛋白尿。2.2.2病理产物致病湿热、毒邪、瘀血等既是病理产物又是致病因素，胶结互病，致疾病缠绵难愈。脾肾虚损，水液不归正化而泛溢为肿、停聚为湿，湿阻气机，气机不利，积湿成浊、成痰，痰浊留滞，脉络壅塞，血运滞涩成瘀，日久则气滞、湿阻、血瘀、浊聚、痰结。徐灵胎云“有湿必有热，湿邪每易化热”，积滞化热，郁热内生，日久蕴热入血成毒。《金匮要略心典》言：“毒者，邪气蕴结不解之谓”。浊毒胶结，难解难分，瘀热久聚，脾肾功能受损，气不布津，血不养经，水、湿、浊、痰、瘀、毒停留于肾，肾失滋养，日久浊毒腐肉败血，甚则使正气难复，加重病情，久羁缠绵。2.2.3现代医家对MN的认识[36]吕宏生教授认为慢性肾病发病，先有禀赋不足，加之感受外邪、饮食劳倦、情志所伤等后天失养而发病。病机方面，多以脾肾亏虚为本，尤以阳虚为著，气滞、血瘀、水停、湿阻为标，诸邪或单现，每每兼见同病，内外合邪，发而为病，本虚标实。[37]陈以平教授认为MN的与脾肾不足密切相关，正气不足、肺脾肾三脏虚损是主因，饮食失调、劳倦内伤、肾精亏耗是诱因。MN发病早期以湿热内蕴为主要特点，发病后期以脾肾阳虚为主，在发病的过程中还可出现气虚、阴虚、血瘀之象，血瘀存在疾病发展的整个过程。[38]张佩青教授认为MN病机表现为本虚标实，本虚以脾肾两虚为主，标实10 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文则多表现为水湿、湿热、瘀血等病理实邪。脾肾虚损是MN的主要病理基础，水湿是MN的主要病理产物，湿热是MN病情加重的重要病理因素，血瘀贯穿MN的始终。[39]王暴魁教授提出风邪致病是MN不可忽视的病因病机。提出风邪伤肾，有外风和内风之分，外风伤肾是慢性肾病的急性发作阶段，不仅水肿显著，且常见上呼吸道感染；内风伤肾，慢性肾脏病一般都具有长期水肿不消或时隐时现，或蛋白尿、血尿久治不效或患者反复外感造成病情难以稳定，这些均与风邪“善行而数变”有关。[40]杨霓芝教授认为MN患者病性属本虚标实，以脾肾亏虚（气虚、阳虚）为本，水湿、湿热及瘀血为标，标实中尤以瘀血为著，气虚、瘀血为本病最常见及关键的病理产物及致病因素。因虚致瘀，因瘀致虚，病程缠绵难愈；因湿致瘀，水道不利，气滞血瘀。提出治疗本病时需“益气”和“活血”并举。2.3MN的分型论治[41]刘宏伟教授根据中医辨证，将MN分为4型：①脾肾阳虚、水湿泛滥型。②脾气虚弱、水湿逗留型。③肝肾阴虚、湿热留恋型。④气阴两虚、湿瘀阻络型。脾肾阳虚证方选真武汤合苓桂术甘汤或五苓散加减，治以通阳利水、温肾健脾。脾气虚弱证选参苓白术散加减，治以利水渗湿、健脾益气。肝肾阴虚证方选知柏地黄汤加减，治以清热利湿、滋补肝肾。气阴两虚证方选参芪地黄汤加减，治以益气养阴、活血清利。[42]陈以平教授根据MN之“虚、湿、瘀、热”四大病机，脾肾两虚是疾病根本基础，络脉瘀阻、湿热内蕴是疾病反复发作的基础。结合MN的西医发病机制，将肾脏微观病理与中医辨证论治相结合，将膜性肾脏病理诊断中的免疫复合物和肾小球基底膜的增厚等病理归于中医“瘀血”证；将肾组织中的补体、膜攻击复合物等归属中医之湿热或热毒之候，湿热胶着成瘀可贯穿疾病发展的始终。针对这一病机，陈教授提出健脾益气、清利湿热、活血化瘀之疗法。[43]陈志强教授针对MN肾阳不化，湿瘀阻络的基本病机，拟定了温阳化气，祛湿泄浊，化瘀通络这一基本原则。阳气不振者，常以黄芪、桂枝配伍以益气通阳，化气利水；阳气不足者，常以仙茅、仙灵脾、巴戟天等温阳之品助化气行水。根据三焦的生理特点，制定了三焦分治的祛湿泄浊用药方法：上焦如雾，宜宣宜散，故用芳香之品，散湿化浊，如藿香、佩兰、香薷等；中焦如沤，宜11 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文燥宜化，故用苦温（寒）制品，燥湿化浊，如陈皮、半夏、砂仁、白豆蔻、苍术等；下焦如渎，宜宣宜利，故用甘淡苦寒之品，利湿泄浊，常用淡渗利湿药，如茯苓、猪苓、泽泻、薏苡仁、车前子等，使湿浊从肾和膀胱去；常用苦寒泻浊药，如大黄、萆薢、土茯苓、白花蛇舌草等。同时可用祛风胜湿药，如羌活、独活、白芷、防己、秦艽等。活血化瘀药常用丹参、川芎、桃仁、红花等。通络药物有两种：一种是虫类搜剔之品：水蛭、地龙、全蝎、桑蚕等；另一种是藤类药物：青风藤、海风藤、鸡血藤、络石藤等。根据患者情况，临证治之。[44]杨霓芝教授将益气活血法贯入MN治疗的始终，多途径活血化瘀。拟定中药方剂：北黄芪20g，党参15g，白术15g，熟地黄15g，盐山茱萸10g，菟丝子20g，丹参15g，泽兰15g，当归15g，桃仁5g，红花5g，白芍15g，甘草3g。水肿甚者，加泽泻，茯苓皮，茯苓等用以利水消肿；肿甚而喘者，加葶苈子，茯苓皮，泽泻，桑白皮等；阳虚肢冷者，加淫羊藿，肉桂用以温阳利水；纳呆者加陈皮，砂仁用以健脾理气；湿热内蕴者，加蒲公英，生薏苡仁等用以清热利湿。血瘀者常用丹参、桃仁、红花、三七、川芎、益母草等用以活血化瘀。[45]周锦教授认为，不论特发性MN还是继发性MN，基本病机为气虚血瘀，癥积形成，均可用补阳还五汤加减治疗。特发性MN“湿”“瘀”夹杂，气虚明显，故在治疗中，一方面补气，一方面利湿活血消癥。周锦教授治疗MN的基本方组成：黄芪50g，当归10g，川芎10g，党参10g，防己12g，女贞子10g，旱莲草10g，金樱子10g，芡实10g，赤芍药10g，白术10g，茯苓10g，猪苓10g，佛手9g，泽兰15g，葫芦壳15g，赤小豆15g。[46]吕仁和教授将整体观与辨证论治相结合，灵活运用六对论治，临证时标本兼顾轻重缓急，分期治疗。分为本虚证和标实证。本虚证：1）脾气亏虚：治以益气健脾。2）脾肾两虚：治以健脾补肾。3）肝肾两亏：治以补益肝肾。4）气阴两虚：治以益气养阴。标实证：1）外感热毒：治以清热解毒、疏风解表。2）水湿不化：治以化湿利水消肿。3）湿热内蕴：治以清热化湿。4）血脉瘀阻：治以活血化瘀。5）气机阻滞：治以疏肝理脾解郁。2.4单味中药治疗MN的研究雷公藤：研究表明雷公藤对MN的治疗机制包括对机体有免疫抑制和对肾[47]小球足细胞的保护作用。雷公藤对机体免疫抑制体现在内酯醇能诱导活化状态的淋巴细胞凋亡，抑制致病性免疫反应的同时不产生严重感染并发症，抑制12 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文[48]NF-κB表达与激活，促进细胞凋亡，抑制免疫反应和各类炎症因子的表达。雷公藤对足细胞具有保护作用，能够有效遏制C5b-9激活的细胞内p38MAPK信号通路的活化，使p38MAPK的磷酸化水平显著降低，发挥直接保护足细胞[49]的作用。雷公藤还可通过稳定足细胞骨架减少蛋白年的产生。[50]苏木：胡克杰教授通过对MN大鼠实验研究表明：苏木对大鼠MN有一定的治疗作用。苏木在免疫的细胞和分子水平均有抑制作用，还有抗炎、改善微循环、抗氧化等作用。实验研究表明，苏木可减少MN蛋白尿，提高MN大鼠血浆白蛋白水平，改善肝脏的白蛋白合成和增加白蛋白的摄入。苏木能抑制MN大鼠的系膜细胞增生，减少免疫复合物的形成，延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的进程，提高肾小球率过滤，改善肾脏微循环，部分调节组织的修复和再生，从而修复部分受损肾脏。川芎嗪：川芎嗪是从中药川芎中提取分离的生物碱单体，具有扩张血管、抑[51]制血小板聚集，抑制细胞增生、抗纤维化、抗细胞凋亡等作用。谭宗凤在川芎嗪对MN大鼠防治作用的实验研究中表明，川芎嗪可减少肾小球上皮下免疫复合物的沉积、减轻足细胞损伤、抑制肾小球基底膜增厚及降低血肌酐、尿素氮水平而对肾功能起保护作用。川芎嗪可通过减少肾脏氧自由基的产生，抑制肾脏纤维细胞增殖，扩张外周血管，抗血小板聚集，改善肾脏微循环，增加肾小球率过滤等作用，从而改善和保护肾脏功能。鱼腥草：鱼腥草具有抗菌、利尿、镇咳等作用，同时对免疫功能也有调节作[52]用。钟瑜通过鱼腥草注射液对MN大鼠研究表明，鱼腥草注射液可降低MN大鼠TGF-β1蛋白表达水平，减少免疫复合物的沉积，减轻肾小球基底膜的损伤，从而减少蛋白尿的排出。重楼：重楼的主要有效成分是甾体皂苷，此外还含有氨基酸、甾酮、蜕皮素[53]等化合物，具有免疫调节作用。黄谷香教授通过实验证实，重楼可影响MN大鼠肾组织细胞外基质，抑制肾ColIV组织和FN沉积，调节肾组织NF-κB的活化，抑制炎症反应，减轻和清除肾小球免疫复合物的沉积，降低蛋白尿、高血脂，从而达到改善肾脏功能的目的。13 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文材料与方法1.实验材料1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠50只，体重180±10g，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。实验动物合格证号：SCXK（黑）2013-001。将50只大鼠置于安静的空调房间内喂养，实验室温度：18℃~25℃，相对湿度：40~60%，分别置于10只等大的代谢笼中。饮用自来水，给予普通的大鼠饲料喂养，饲料由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。1.2实验用药槐耳清膏：由启东盖天力药业有限公司提供雷公藤多苷片：购置浙江普洛康裕天然药物有限公司。规格：10mg/片，批准文号：国药准字：Z33020778。1.3实验试剂和实验仪器1.3.1实验试剂牛血清白蛋白（BSA）：Sigma生物制药公司弗氏不完全佐剂：Sigma生物制药公司无水乙二胺（EDA）：Sigma生物制药公司液体石蜡：天津市科密欧化学试剂有限公司羊毛脂：天津永大化学试剂有限公司兔抗多隆抗体：北京博奥森二抗PV6001、DAB染色剂：北京中杉金桥生物技术公司1.3.2实验仪器透析袋：美国Fisherscientific公司台式冷冻干燥机：上海楚柏实验设备有限公司电热恒温水浴箱：天津太斯特设备厂全自动生化分析仪：瑞士COBASMIRA台式离心机：荷兰威图公司高性能无菌试验台：哈尔滨东联显微镜：美国motiocam3000显微摄影成像系统切片机：德国菜卡2135型普通显微镜：湖北省黄石医疗器械公司14 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文电热恒温箱：上海一恒医疗器械公司医用微波炉：河南格尔微波科技有限公司电子天平：Mettler低温冰箱：SANYO2实验方法2.1动物模型的制备2.2.1阳离子化牛血清白蛋（C-BSA）的制备参照Border方法，用67ml的无水乙二胺（EDA）同500ml的双蒸水均匀混合，再加入350ml的6M盐酸，使溶液PH值4.75，并降温至25℃；将5g牛血清白蛋白溶于25ml双蒸水中，加入1.8g碳二亚胺盐酸（EDC）搅拌均匀，使其保持PH值4.75、温度25℃，静置2个小时；加入4M醋酸缓冲液30ml终止反应；将溶液置于4℃的双蒸水中透析72小时，于真空冷冻干燥机内干燥成粉末，即制成阳离子化牛血清白蛋白。于-20℃的冰箱内冷冻保存备用。2.2.2不完全弗氏佐剂（FIA）的制备将10g羊毛脂与20ml液体石蜡完全混合均匀，充分乳化，高压蒸汽消毒15min，4℃存放备用。2.2.3模型制备将50只大鼠适应性喂养一周，留取每只大鼠的尿液，每只大鼠的尿液用尿蛋白试纸测试为阴性，空白对照组随机选10只大鼠，用Border方法将剩余40只大鼠造模。预免疫：取阳离子化牛血清白蛋100mg，将其溶于生理盐水中，生理盐水用3.75ml，再加入26.25ml弗氏不完全佐剂，两者均匀混合，并将其超声乳化。再大鼠双侧腋下和腹股沟下皮下注射，每次注射0.4ml，不超过0.5ml，每日注射1次，注射7天。空白对照组按照上述比例，将弗氏不完全佐剂与等体积的生理盐水均匀混合后给每只大鼠皮下注射。正式免疫：造模的40只大鼠预免疫1周后，于大鼠尾静脉注射C-BSA，每次注射7mg，每2天注射一次，连续注射4周。空白对照组注射等剂量的生理盐水。4周后，留取大鼠的24小时尿量，测尿蛋白定量，证实造模成功。2.2分组及给药将50只大鼠，除空白对照组10只外，剩余40只大鼠编号并随机分为4组：模型对照组10只，雷公藤多苷片组10只，槐耳清膏高剂量组10只，槐耳清膏15 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文低剂量组10只。大鼠造模成功后，分别用槐耳清膏和雷公藤多苷片治疗。大鼠给药的剂量按人与大鼠间体表面积折算等效剂量折算。大鼠每周称重1次，根据体重变化调整药物剂量。给药剂量：临床等效量：槐耳清膏低剂量，给以1.08g/kg/d灌胃；槐耳清膏高剂量组给以4.32g/kg/d灌胃，槐耳清膏高剂量组是槐耳清膏低剂量组的4倍；雷公藤多苷片组给以8.1g/kg/d灌胃。空白对照组和模型组对照组从正式免疫结束的第一天起，给予等量的生理盐水灌胃。2.3观察内容2.3.1大鼠一般状态观察每天对大鼠的一般状态观察记录，包括大鼠的精神状态，皮毛色泽，进食情况，体重变化，尿量等。2.3.2实验标本的采集2.3.2.1尿液检测造模成功及给药后第1天，第4周，第8周，分别将大鼠置于代谢笼中，收集大鼠24h尿液，采样前禁食不禁水12h，各取1.5ml尿量作为标本，于EP管中固定，置于-80℃冰箱保存备用。2.3.2.2血清生化指标造模成功第一天于大鼠眼内眦取血2ml，并离心（3000r/min，15min），取上清液，置于-80℃冰箱保存备用。实验第8周末，先取得大鼠24h尿液，第二天禁食、断水12h，常规消毒。各组大鼠腹腔内注射麻醉剂（4g水合氯醛加40ml双蒸水，配成10%水合氯醛），按0.35ml/100g麻醉，待麻醉完全后，将大鼠置于实验台，剖开腹腔，于腹主动脉采血取样，取血约9ml，在室温下静置2h，于离心机中离心15min，收集血清。装于EP管内，置于-70℃的冰箱内保存备用。用于检测血清白蛋白(ALB）、胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）。2.4肾组织病理切片制作2.4.1取材及固定取血后，用75%酒精消毒，大鼠腹部备皮，沿大鼠腹中线由下而上分离，暴露腹腔，露出肾脏，取双侧肾脏组织，用双蒸水冲洗后，成冠状面切开肾组织。将一侧肾脏组织放入10%多聚甲醛溶液中保存固定，用于光镜和免疫组化（IgG4、M型PLA2R）的检测；将另一侧肾脏组织置于2.5%戊二醛溶液中固定，16 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文用于电镜检测。2.4.1肾组织切片及观察2.4.1.1免疫组化法测定测定肾组织M型PLA2R和IgG4的表达1）石蜡包埋：①将肾组织标本组织从10%多聚甲醛溶液中取出，放于蒸馏水中冲洗，按以下方法进行处理。②除去固定液：将带有多余固定液的肾组织用流水反复冲洗，冲洗时间为20-30分钟；③脱水：将祛除固定液的肾组织用自动脱水机脱水，然后放入70%酒精脱水1小时、80%酒精脱水1小时、90%酒精脱水1小时、100%脱水两次，每次1小时；④透明：将脱水过的肾组织放入二甲苯中浸泡15分钟，取出后，再放入二甲苯中浸泡10分钟；⑤浸蜡：将处理过变透明后的肾组织放入已溶化的石蜡（Ⅰ）、石蜡（Ⅱ）和石蜡（Ⅲ）中，放入恒温箱中1小时；⑥包埋：将浸过的组织按顺序包埋成块，以备切片。2）PV二步法免疫组化法两步法：①将包埋好的切片常规脱蜡到水。②脱蜡后的切片孵育10分钟，在3%H2O2中，再用PBS冲洗3分钟，反复冲洗3次。③微波修复：把切片放入枸缘酸钾缓冲液（PH6），再微波炉中烘烤2次，每次5min，每次间隔10min，自然冷却至室温。④再切片上滴加一抗，然后放于4℃冰箱中过夜，再用PBS冲洗3次，每次2分钟。⑤于切片是滴加二抗，在37度温度中孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟。⑥AB显色5-10分钟。用蒸馏水反复冲洗，直至冲洗干净。⑦用苏木素复染，时间为1min。⑧常规脱水，切片变透明，用中性树胶封片，于显微镜下观察。3）结果判断与分析：otic3000显微摄影系统于400倍下摄片，采用Image-proplus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，以积分光密度(IOD)代表17 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文基因和蛋白相对表达量，积分光密度（IOD）=阳性面积×平均光密度，每例随机分析3个不同高倍镜视野，取其均值代表该例的相对表达量。染色结果细胞核呈蓝色，阳性为黄色或黄棕色。肾组织IgG4和M型PLA2R的积分光密度以均数±标准差表示。2.4.1.2光镜标本的制备2.4.1.2.1组织处理：①将固定在10%多聚甲醛溶液中取出,放于蒸馏水中冲洗，修块,将修块的肾组织依次经70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精和无水乙醇逐级脱水，用二甲苯进行透明处理。②将处理好的肾组织放入石蜡中，在常温下浸蜡，将二甲苯置换出来。将处理过的肾组织放入包埋器中，在石蜡表面凝固后，将包埋器放入冷水浴中，冷却凝固石蜡，组织蜡块包埋后，备切片用。③切片厚度为3mm，放入包埋盒内，根据实验要求再固定。固定好的组织块，进行梯度酒精脱水，用二甲苯进行透明处理，用石蜡包埋。④石蜡的切片厚度为3μm，用60℃烤片机内烤片12小时，放于4℃冰箱备用。2.4.1.2.2染色方法：Masson（马松三色）染色方法：①把制定好的石蜡切片脱蜡，入水。②将切片放入铁苏木素混合液中浸泡5分钟，取出用流水稍冲洗。③用1%盐酸酒精对切片进行分化，然后用流水进行充分冲洗。④将切片放入丽春红溶液浸泡10分钟，取出用流水稍冲洗。⑤将切片放入磷钼酸中5分钟，不冲洗，然后再放入苯胺蓝中，复染5分钟，再放入1%冰醋酸中，1分钟。⑥将切片依次经70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精脱水，然后用二甲苯进行透明处理，最后用树脂把切片封片。六胺银染色方法：①把制定好的石蜡切片脱蜡，入水。②将切片放入高碘酸溶液中，氧化10分钟，然后用流水充分冲洗。③于水浴箱放置现配制的六胺银工作液，预热10分钟。18 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文④从水浴箱中取出六胺银工作液，将切片放入六胺银工作液，浸泡半小时以上，取出，然后用流水反复冲洗。⑤将冲洗过的切片放入硫代硫酸钠溶液中，放置5分钟，然后用流水反复冲洗。⑥将冲洗过的切片用伊红复染，时间为2分钟。⑦将切片依次经70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精脱水，然后用二甲苯进行透明处理，最后用树脂把切片封片。2.4.1.3电镜标本的制备①组织处理：将固定在2.5%戊二醛溶液中取出,用生理盐水冲洗3次，修块,再用1％锇酸固定1个小时，去除离子，再冲洗3次，每次冲洗8分钟。②脱水：在低温（4℃）条件下分别于50%、70%、90%酒精梯度脱水，每次脱水20分钟分钟，然后在常温下用100%酒精脱水3次，每次15分钟。③浸透和包埋：将组织放入包埋液中浸透，浸透过夜。包埋液在使用前，放于于80℃温箱中加湿3个小时，去除水分和挥发物。④切片：在80℃温箱中聚合40小时，然后用超薄切片机切片，片厚0.5μm。⑤染色：用醋酸铀饱和溶液染色20分钟，蒸馏水冲洗，再用醋酸铅染液加NaOH染色20分钟，在透射电镜下观察肾小球组织的情况，同时照相和记录。3统计学处理实验结果采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。所有计量资料进行正态性检验，实验结果以均数±标准差（±s）表示,组间比较采用独立样本t检验，多组组间比较采用单因素方差分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。19 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文实验结果1大鼠造模后存活情况及一般状态MN大鼠造模成功后，大鼠一般情况较差，表现为毛发脱落、暗淡，精神不振、饮食减少、部分大鼠出现腹水及阴囊水肿；而空白对照组大鼠毛发光亮、精神状态良好、饮食正常。MN大鼠在给药后，槐耳清膏组和雷公藤多苷片组大鼠饮食逐渐增加，精神状态转好，活力恢复，水肿症状有所缓解。在实验进行中2只大鼠死亡：空白对照组大鼠在饲养过程中因灌胃操作失误死亡1只，模型对照组大鼠因营养不良死亡1只。2MN大鼠肾组织病理改变2.1光学显微镜观察光镜下空白对照组大鼠肾组织肾小球结构无明显变化，肾小球基底膜无明显增厚。模型对照组大鼠的肾组织肾小球有不同程度的萎缩，肾小球基底膜弥漫性增厚，上皮下嗜复红蛋白沉积，有节段性钉突形成，肾小管萎缩，肾小管内可见大量的红细胞堆积。治疗组的大鼠经过治疗后，以槐耳清膏低剂量组改善较为明显，其次是雷公藤多苷片组，两组相比较，槐耳清膏低剂量组大鼠肾组织肾小球基底膜轻度增厚，上皮下嗜复红蛋白沉积较少，肾小管轻度萎缩。槐耳清膏高剂量组与雷公藤多苷片组相比较，肾小球基底膜增厚较突出，嗜复红蛋白沉积较较多，肾小管萎缩较明显。2.2透射电镜观察电镜下模型对照组大鼠肾组织肾小球基底膜显著增厚，大量电子致密物沉积于肾小球基底膜，上皮细胞足突大量融合，有微丝聚集，微绒毛化明显。与模型对照组相比，空白对照组大鼠肾脏组织结构完整，未见明显异常。三组治疗组与模型对照组相比，有明显的改善，以槐耳清膏低剂量组改善较为明显，雷公藤多苷片组次之，最后是槐耳清膏高剂量组。槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，肾小球基底膜轻度增厚，较少的电子致密物沉积，少量足突融合。槐耳清膏高剂量组与雷公藤多苷片组比较，肾小球基底膜增厚程度大，较多的电子致密物沉积，有团块形成，部分足突融合，上皮细胞的完整性遭到破坏。20 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文3第1天、第4周、第8周24h尿蛋白定量比较情况表1各组大鼠24h尿蛋白（mg/24h）的对比（±s）组别N第1天第4周第8周空白组911.34±2.0813.26±3.0813.73±3.34模型组10301.91±23.06#356.33±23.94359.22±24.95雷公藤9306.57±23.60#●223.62±24.52*210.12±25.83*▼高剂量10306.42±24.46#●224.04±24.96*▲218.09±23.26*▲▼低剂量10303.49±23.04#●202.07±22.08*★193.04±23.14*★▼注：与空白对照组比较：#P＜0.01；与模型对照组比较：●P＞0.05与治疗前比较：▼P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.01★▲与雷公藤多苷片组比较：P＜0.05；与雷公藤多苷片比较：P＞0.05表1所示：除空白组外，各组造模后均出现明显蛋白尿，各模型组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗4周、8周后，各治疗组治疗前与治疗后比较，差异有统计学意义(P＜0.01）；各治疗组与模型组比较，24h尿蛋白定量均有不同程度的下降，差异有统计学意义(P＜0.01）；槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。4血清学检查4.1治疗前后血清白蛋白(ALB）水平的比较情况表2大鼠血清ALB（g/L）水平的对比（±s）组别N治疗前治疗后空白组937.05±1.5737.54±1.83模型组1029.27±1.9323.85±2.58雷公藤929.17±1.2533.34±1.96*▲高剂量1029.79±1.5433.12±2.52*▲◆低剂量1029.07±1.1235.73±2.04*▲★注：与治疗前比较：*P＜0.05；与模型对照组比较：▲P＜0.01◆★与雷公藤多苷片组比较：P＞0.05；与雷公藤多苷片比较：P＜0.05表2所示：经药物治疗后，各治疗组大鼠ALB水平与模型对照组比较明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01）；各治疗组治疗后与治疗前比较，差异有统计学意义(P＜0.05），槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），槐耳清膏高剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异无统计21 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文学意义（P＞0.05）。说明经药物治疗后MN大鼠ALB水平不同程度的上升，以槐耳清膏低剂量组改善效果佳。4.2治疗前后血清胆固醇（CHOL）和甘油三酯（TG）的比较情况表3大鼠血清CHOL（mmol/L）和TG（mmol/L）水平的对比（±s）CHOLTG组别N治疗前治疗后治疗前治疗后空白组94.03±0.404.33±0.330.89±0.410.85±0.37模型组107.04±1.507.52±1.364.84±0.884.96±0.97*●*●雷公藤97.08±1.436.81±1.274.99±0.854.83±0.71*●#*●#高剂量107.00±1.167.06±1.364.83±0.734.77±0.83*●#*●#低剂量106.97±1.346.88±1.094.76±0.844.72±1.00注：与治疗前比较：*P＞0.05；与模型对照组比较：●P＞0.05与雷公藤多苷片组比较：#P＞0.05表3所示：各组大鼠血清胆固醇及甘油三酯情况，治疗后与治疗前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗组与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；槐耳清膏高、低剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4.3治疗前后血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）的比较情况表4大鼠血清BUN（mmol/L）和Scr（μmol/L）水平的对比（±s）BUNScr组别N治疗前治疗后治疗前治疗后空白组93.26±1.163.53±0.3356.65±3.6157.28±4.28模型组107.21±0.237.96±0.4785.59±2.2685.73±2.92雷公藤97.05±0.256.03±0.36*73.15±5.5473.78±4.01#高剂量107.16±0.306.34±0.29*▲78.26±23.779.90±2.44#▼低剂量107.08±0.355.94±0.36*♦74.66±8.1671.68±5.35#▼注：与治疗前比较：*P＜0.05；#P＞0.05▲♦▼与雷公藤多苷片组比较：P＞0.05，P＜0.05；P＞0.05表4所示：各治疗组治疗后与治疗前比较，BUN水平下降，差异有统计学22 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文意义(P＜0.05）；槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，BUN水平下降更明显，差异有统计学意义(P＜0.05）；各治疗组治疗后与治疗前比较，Scr无明显改善，差异无统计学意义（P＞0.05），槐耳清膏高、低剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。5肾组织M型PLA2R和IgG4的表达情况表5肾组织M型PLA2R(IOD)和IgG4(IOD)表达水平的对比（±s）组别NM型PLA2RIgG4空白组91517.32±191.829010.51±1192.37模型组1065092.51±8330.7272634.73±32871.69雷公藤938574.60±4215.91*40782.35±3960.32*高剂量1043474.61±6364.46*▲41810.12±2501.22*▲低剂量1037525.43±3591.17*▲34795.19±4179.57*▲注：与模型组比较：*P＜0.05与雷公藤多苷片组比较：▲P＞0.05表5所示：经药物治疗后，各治疗组大鼠M型PLA2R和IgG4表达水平与模型对照组比较明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05）；槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），槐耳清膏高剂量组与雷公藤多苷片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。23 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文讨论MN是现代医学病理形态学诊断名词，病理表现为光镜下可见肾小球基底膜增厚及钉突形成；免疫荧光主要表现为IgG和补体C3的沉积；电镜主要表现为上皮下电子致密物沉积。1阳性对照药物的选择雷公藤多苷片是现代临床上用于治疗肾小球类疾病常用的药物之一，雷公藤多苷片的主要活性成分是雷公藤甲素，从中药雷公藤中提出。雷公藤治疗MN的治疗机制是对机体的免疫抑制作用和对足细胞保护作用，从而抑制肾小球上皮侧免疫复合物沉积和基底膜反应性增殖，抑制肾脏免疫损伤，稳定足细胞的细胞骨架，修复裂孔蛋白，减少蛋白尿的产生。在一项前瞻性对照临床观察表明，雷公藤等有效减少MN患者蛋白尿，单用雷公藤治疗3个月的总有效率为51.2%，部分患者减量后复发，但1年有效率仍在43.9%[54]。雷公藤具有多靶点作用，相较于其他免疫抑制剂有药效学的优势；用药安全性相对较高，与环孢素和FK506相比，肾毒性更小，并且不需要定期检测血药浓度，与霉酚酸酯相比，发生重症感染几率小，且价格优势明显[55]。由此选择雷公藤多苷片作为阳性对照药物。2导师对MN的认识2.1MN的病因病机导师认为，MN的病因是由禀赋不足，年老体虚，劳累过度，饮食失调或外邪侵袭导致。MN属本虚标实，正虚邪实。本虚以脾肾两虚为主，标实则表现为水湿、湿热、瘀血等，外感风邪是加重疾病的主要诱因，风邪伤肾，直中肾脏，内外合邪，或夹杂他邪，使MN缠绵难愈。脾肾虚损是MN主要的病理基础，脾主升清，脾虚则升清不利，精微下注，肾主封藏，肾虚则封藏失司，肾气不固，精微下泄，随尿而出，故成蛋白尿；脾属中焦，主运化水湿，水无所致而泛溢，肾属下焦，主水液，肾虚失其温化开合则水无所主而妄行，则发为水肿。风邪是MN的加重因素，风为阳邪，善行而数变，风邪侵袭，直中肾脏，肾开阖和封藏功能失司，精微外泄；风邪首先犯肺，肺为水上之源，肺失宣降，不能通调水道，致风遏水阻，风水相搏，泛滥肌肤，发为水肿。水湿是主要的病理产物，脾肾功能失司，受外湿与内湿的共同影响，损伤阴阳，留滞体内，病程缠绵难愈。湿热是MN的重要病理因24 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文素，水湿之邪在体内停留日久，从阳化热，转为湿热，湿热日久暗耗气阴，致正气虚，加重脾肾亏虚，病情反复，致蛋白尿顽固不愈，同时湿热还可引动外邪，内外交感，引动宿疾，病情反复不愈。瘀血贯穿疾病的始终，MN病程日久，久病入络，久病多瘀，瘀血阻于肾络，血不利则病水，瘀血与水湿互结，气化不利，封藏功能失司，精微外泄，日久则气血阴阳失衡，元气衰微，湿毒内蕴，循环往复，导致虚劳等症。2.2MN的治疗原则MN的治疗原则当以益气扶正以固本，祛风、除湿、通络以除邪。脾为后天之本，肾为先天之本，脾主运化，肾主一身水液，脾肾虚损，水液无以运化，聚而成饮，脾失统摄，肾失开阖，精微不固，蛋白流失，治疗当益气扶正，健脾固肾治本。水湿、湿热、瘀血是病变过程中的病理产物，风邪是MN加重的主要诱因，水湿、湿热、瘀血、风邪互为因果，相互转化，致使病情缠绵难愈，“邪之所凑，其气必虚”，在扶正的同时，兼以祛风、除湿、通络，方可邪祛正安，正气得复，脾肾功能得以恢复。《本草纲目》中记载：槐菌，辛、苦、平、无毒，治风、破血、益力。槐耳益气扶正，祛风除湿，活血通络，标本兼治，扶正祛邪，使脾肾之功能得以恢复；风、湿、瘀、毒之邪得以消退，从而达到治疗MN的作用。3槐耳及复方制剂的功效槐耳是生长在老龄中国槐树上的高等真菌子实体，其学名为Tranetesrobiniophilamurr，中药全名是槐栓菌。槐耳是我国古代重要的药用真菌。《新修本草》中记载：槐耳，此槐树上菌也。经药理研究表明，槐耳清膏的活性有机成分是多糖蛋白（PS-T）；其含有6种单糖，含有18种氨基酸。在免疫试验中，槐耳能促进巨噬细胞的吞噬功能，对特异性免疫与非特异性免疫有良好反应，增加溶菌酶的活性，提高特异性抗体产生，说明槐耳可促进抗体免疫功能。槐耳及其复方制剂槐杞黄颗粒在治疗慢性肾脏中有良好的疗效，具有抗感染、抗过敏、改善肾脏微循环、增强机体免疫力和促进肾脏组织修复等作用。由于槐耳具有调节人体免疫的功能，故将槐耳应用于肾脏病的治疗。4槐耳清膏治疗MN机理的探讨4.1对蛋白尿的影响蛋白尿是MN常见的临床表现，是肾小球滤过屏障病变的结果。蛋白尿是25 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文评估肾脏疾病的重要指标，大量蛋白尿及其持续时间是影响MN预后的最重要因素，蛋白尿是评估肾脏功能减退的重要危险因素。槐耳清膏能够减少MN的蛋白尿排泄，有效控制蛋白尿是能够减慢MN进展至ESRD。实验结果表明，造模后CBS-A大鼠出现大量的蛋白尿，治疗4周、8周后，各治疗尿蛋白均明显减少；以槐耳清膏低剂量组及雷公藤多苷片组改善明显；槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，槐耳清膏低剂量明显减少，说明槐耳清膏低剂量组较雷公藤多苷片组更能减少蛋白尿。4.2对血清生化指标的影响低白蛋白血症是MN的一个临床表现，MN患者长期大量蛋白尿，肝脏代偿性合成蛋白的能力下降，血浆胶体渗透压降低，从而引发水肿。MN患者血管壁对白蛋白通透性增加，导致血液中白蛋白含量降低，出现蛋白质营养不良的状态。槐耳清膏能够提升血浆白蛋白水平，改善MN患者的营养状态。实验结果表明，治疗4周、8周后，各治疗组治疗后与治疗前比较，MN大鼠血清白蛋白水平不同程度的上升(P＜0.05）；各治疗组治疗后与模型对照组比较，血清白蛋白水平不同程度上升(P＜0.05）；槐耳清膏低剂量组与雷公藤多苷片组比较，槐耳清膏低剂量组较雷公藤多苷片组可明显提升。实验结果表明，治疗4周、8周后，各治疗组治疗后与治疗前比较，MN大鼠血清尿素氮降低(P＜0.05）；各治疗组治疗后，以槐耳清膏低剂量组血清尿素氮改善明显(P＜0.05）。4.3减少免疫复合物沉积，减轻肾脏病理的损伤MN大鼠肾组织病理结果显示：治疗4周、8周后，出空白对照组外，各组大鼠肾组织肾小球基底膜均有不同程度的改变。模型对照组光镜下肾小球明显肿胀，肾小球基底膜增厚明显，肾小管损伤较重，嗜复红蛋白沉积；电镜下大量电子致密物沉积，肾小球基底膜弥漫性增厚，钉突形成。各治疗组与模型对照组相比，光镜下肾小球肿胀程度减轻，肾小球基底膜增厚减轻，嗜复红蛋白沉积减少；电镜下肾小球上皮下电子致密物减少，肾小球基底膜增厚程度减轻，足突部分融合。以槐耳清膏低剂量组改变较为明显。4.4降低PLA2R和IgG4在肾脏中的表达，调节免疫炎症反应MN是一种器官自身性免疫性疾病，肾组织M型PLA2R是MN主要靶抗原，与PLA2R抗体结合形成原位免疫复合物，激活补体，形成膜攻击复合物，26 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文引起足细胞损伤，导致蛋白尿。PLA2R抗体以IgG4亚型为主。PLA2R的发现在IMN研究中具有重要作用，其抗原和自身抗体在IMN的诊断、病情监测和预后判断中发挥着重要价值。实验结果显示：治疗4周、8周后，各治疗组治疗大鼠肾组织中M型PLA2R与IgG4表达水平均有不同程度的降低，治疗组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；槐耳清膏组和雷公藤多苷片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明槐耳清膏在降低肾组织M型PLA2R与IgG4表达中与雷公藤多苷片的作用相当。实验证实槐耳清膏能够降低肾组织M型PLA2R与IgG4表达，降低免疫复合物在肾小球中沉积。27 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文结论1、槐耳清膏能够减少MN大鼠蛋白尿的排泄，提升血浆白蛋白，降低血清尿素氮。2、槐耳清膏能够减少MN大鼠肾小球基底膜免疫复合物的沉积，从而减轻MN的病理损害。3、槐耳清膏能够减少MN大鼠肾组织M型PLA2R和IgG4的表达，从而减少MN靶抗原的沉积。28 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黑龙江省中医药科学院硕士学位论文致谢在即将毕业之际，回首3年的研究生学习和生活期间，似乎有太多的感激。有尊敬的师长、可爱的同学、朋友对我帮助，是我人生经历中重要的一段历程，在这里请接受我真挚的谢意！首先我要感谢导师李莲花教授。感谢导师在我研究生期间对我生活、学习和工作上的关心与帮助。导师渊博的知识，严谨的工作作风及治学精神，精湛的临床技术，高尚的医德品质为我树立了榜样，使我终身受益。本课题从论文题目的选择，到实验设计以及实施完成，都得到了老师的细心教导、鼓励和支持。在此，向我最敬爱的导师致以感谢与敬意！感谢肾二科全体医师和护士。感谢张佩青教授能给我机会让我出诊学习，让我对肾脏治疗有更深刻的体会；感谢王冬老师在我学习肾脏病过程中的教导；感谢刘娜老师在肾脏病理方面的指导；感谢肾二科其他老师对我的帮助。感谢高鸿艳护士长和护士们，谢谢你们对我工作的配合以以及生活上的照料。肾二科就像一个大家庭，让我感到温馨、快乐，谢谢你们！感谢研究生科付老师和班老师，谢谢你们在学习和生活中的帮助！感谢研究生陈新昌、封晓琴在动物实验中的帮助；感谢我的同届同学、朋友对我的关心、照料。最后，还有未提及的关心、帮助过我的朋友们，谢谢大家！33 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文攻读研究生期间发表的学术论文张佩青教授治疗痛风性肾病的经验浅谈[J].黑龙江中医药,2016,(04):25-26.作者位次：第一位34 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文附录附图1光镜六胺银（PASM）染色的图片空白对照组400×模型对照组400×雷公藤多苷片组400×槐耳清膏高剂量组400×槐耳清膏低剂量组400×35 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文附图2光镜马松三色（Masson）染色的图片空白对照组400×模型对照组200×雷公藤多苷片组200×槐耳清膏高剂量组200×槐耳清膏低剂量组200×36 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文附图5透射电镜的图片空白对照组10000×模型对照组10000×雷公藤多苷片组10000×槐耳清膏高剂量组10000×槐耳清膏低剂量组10000×37 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文附图4肾组织M型PLA2R免疫组化的图片空白对照组400×模型对照组400×雷公藤多苷片组400×槐耳清膏高剂量组400×槐耳清膏低剂量组400×38 黑龙江省中医药科学院硕士学位论文附图5肾组织IgG4免疫组化的图片空白对照组400×模型对照组400×雷公藤多苷片组400×槐耳清膏高剂量组400×槐耳清膏低剂量组组400×39 黒龙江省中医药科学院硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，。独立进行研宄工作所取得的成果除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄。做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：才叫導日期：乂々年７月Ｐ日关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意学校及国家有关机构有权公布论文的全部或部分内容，并采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本论文内容以任何形式公开发表或成果转让时须经导师同意。论文作者签名ｒ指导教师签名：祕（７曰期：年］月／曰曰期：？年７月Ｋ曰４０
