黄嘌呤氧化酶氧化应激与糖尿病心房重构

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分类号：R541.7学校代码：10062密级：学号：2013602362硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：黄嘌呤氧化酶氧化应激与糖尿病心房重构TITLEXanthineoxidaserelatedoxidativestressanddiabeticatrialremodeling一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：赵建平导师：刘彤副教授天津医科大学研究生院二〇一六年五月 分类号：R541.7学校代码：10062密级：学号：2013602362学位类别：科学学位√专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：黄嘌呤氧化酶氧化应激与糖尿病心房重构TITLEXanthineoxidaserelatedoxidativestressanddiabeticatrialremodeling一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：赵建平导师：刘彤副教授天津医科大学研究生院二〇一六年五月 I 中文摘要背景：糖尿病是严重危害人类健康的全身性代谢疾病，且是房颤的独立危险因素之一，但具体机制还不是十分清楚。许多研究表明糖尿病状态下的炎症和氧化应激的激活与房颤的发生密切相关。因此我们推断，糖尿病状态下的炎症和氧化应激可能是导致心房结构性重构和电重构进一步导致房颤的重要机制。目的：探讨糖尿病房颤发生的机制，以及抗氧化药物黄嘌呤氧化酶抑制剂（别嘌呤醇）在糖尿病房颤的发生发展中发挥的主要作用，我们的研究从整体到分子等多个层面分析糖尿病状态下氧化应激和炎症在房颤发生发展中发挥的作用，进一步探讨黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对糖尿病诱导的房颤的干预作用。方法：选择健康的成年日本大耳白兔30只，随机分为对照组(Control,C组)，糖尿病组(Diabetesmellitus,DM组)，糖尿病别嘌呤醇组(DM+allopurinol,ALL)，每组10只。配置浓度为150mg/kg四氧嘧啶，从家兔耳缘静脉以120mg/kg注射建立糖尿病模型，密切观测血糖，达标后定为ALL组，并给予别嘌呤醇（50mg/d）饲养8周。8周模型建立成功后进行以下实验：1.行心脏超声检查，测量室间隔厚度（IVS）、、左室后壁厚度（LVPW）、左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）、左房内径（LAD）、左室射血分数（LVEF）；检测血清中黄嘌呤氧化酶（XOD）活性、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、和髓过氧化物酶(MPO)水平。2.用Langendorff灌流装置建立离体心脏模型，用自制电极刺激并记录高位右房（HRA）、低位左房（LLA）及高位左房（HLA）三个部位的心房间传导时间(IACT)、心房各点有效不应期(AERP)和AERP的离散度(AERPD)；测量完毕后用Burst刺激诱发房颤，并记录每个部位发生房颤的次数及持续时间；采用苏木素-伊红（HE）染色及Masson染色观察心房肌细胞形态及左房纤维化水平，测定心房肌细胞横截面积3.取左心房肌组织行分子水平实验（WesternBlotting），比较三组MAPK途径中ERK、P38及JNK蛋白表达及磷酸化水平的影响，同时测定心房肌TGF-β表达变化。结果：与对照组相比，DM组MDA水平明显增高(P<0.05)，ALL组SOD水平明显增高(P<0.05)，XOD在两组中均增高(P<0.05)；DM组IACT显著延长(P<0.05)，DM组房颤诱发率增高(30.37%vs2.22%,P<0.05)；HE染色显示，糖II 尿病组细胞排列紊乱，心房肌细胞横截面积增大(18509.37±1917.60μm2vs11938.57±7554.66μm2,P＜0.05)，Masson染色显示DM组胶原容积分数明显增大(6.83±1.43%vs1.90±0.33%,P<0.05)；DM组NF-κB，TGF-β，P-P38，MMP2，MMP9表达显著增多(P<0.05)。与糖尿病组比较，MDA水平明显下降(P<0.05)；别嘌呤醇组全心重量/家兔体重所占百分比相对较低(P<0.05)，别嘌呤醇组房颤诱发率降低(30.37%vs8.15%,P<0.05)；ALL组心房肌细胞横截面积减小(18509.37±1917.60μm2vs15818.47±644.58μm2,P＞0.05)，胶原容积分数减小(6.83±1.43%vs4.86±1.18%,P<0.05)；ALL组NF-κB，TGF-β，P-P38，MMP2，MMP9表达明显减少(P<0.05)，P38在三组间比较随有差异但无统计学意义。结论：1）氧化应激及细胞内钙信号通路在糖尿病心房电重构、结构重构及房颤的发生发展中发挥重要作用；同时，糖尿病氧化应激状态下，ROS和炎症因子产生增多，进一步促进成肌纤维细胞增殖及心房肌纤维化。2）通过抗炎抗氧化作用的黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善糖尿病状态下的炎症反应，从而间接的减轻心房电重构和结构重构，减少房颤发生。关键词：糖尿病炎症氧化应激别嘌呤醇心房颤动III AbstractBackground:Diabetesmellitus（DM）isoneoftheindependentriskfactorsforatrialfibrillation(AF),andthepotentialmechanismsofdiabetesrelatedAFisnotclear.Previousstudieshaveindicatedthatinflammationandoxidativestressplayanimportantroleinthedevelopmentofdiabetesandatrialfibrillation.Itisspeculatedthatinflammationandoxidativestressmaybethepotentialmechanismofdiabetesrelatedatrialfibrillation.Objective:Toexplorethemechanismsofdiabetesrelatedatrialfibrillation,andantioxidantandanti-inflammatoryagentxanthineoxidaseinhibitor(allopurinol)ondiabeticatrialremodeling.Fromthedifferentlevelstoexplorethepotentialmechanismsdiabeticatrialstructuralremodelingandelectricalremodelingandevaluatetheprotectiveeffectsofallopurinol.Methods:Ourexperimentconsistsofthreeparts,eachpartoftheapplicationofhealthadultJapaneserabbits(n=30),randomlydividedtothreegroups:controlgroup(control,Cgroup),diabetesmellitusgroup(DMgroup),diabetesintheallopurinolgroup(ALLgroup)(n=10).Thediabeticmodelwasestablishedby120mg/kginjectionintheearmarginveinofrabbits.ALLgroupwastreatedwith50mg/d,andtheothergroupwasfedfor8weeks.8weekslater,weestablishedLangendorffperfusedrabbitheartmodel,measuringtheinteratrialconductiontime(IACT),theatrialeffectiverefractoryperiod(AERP),AERPdispersion(AERPD),theapplicationofBurststimulitoinduceatrialfibrillation.Serumsuperoxidedismutase(SOD),malondialdehyde(MDA)andmyeloperoxidase(MPO)levelsweremeasured.Pathologicalexaminationincludinghematoxylinandeosin(HE)stainingandMassonstainingtoobservetheatrialmyocardialcross-sectionalareaandatrialfibrosis.WesternBlottinganalysistostudythechangesofERK,P38,JNKandTGF-βproteinandphosphorylationexpressioninthethreegroups.Results:Comparedwithcontrolgroup,theMDAlevelindiabeteswassignificantlyincreased(P<0.05),SODlevelinallopurinolgroupwassignificantlyincreased(P<0.05);Theheartweight/bodyweightratioofrabbitsinDMandALLgroupweresignificantlyhigherindiabeticgroup(P<0.05),IACT(P<0.05)significantlyIV prolonged.AFinducibilityindiabeticgroupwasincreasedcomparedwithcontrols(2.22%vs30.37%,P<0.05);HEstainingshowedthatthediabeticgroupcelldisorder,atrialmyocytecross-sectionalareaincrease(11938.57±7554.66μm2vs18509.37±1917.60μm2,P＞0.05),Pathologicalexaminationshowedthatthecollagenvolumefractionwassignificantlyincreasedindiabeticgroup(1.90±0.33%vs6.83±1.43%,P<0.05);NF-κB,TGF-β,P-P38，MMP2，MMP9expressionincreasedsignificantlyinDMgroup(P<0.05).ComparedwithDMgroup,heartweight/rabbitweightinallopurinolgroupwasrelativelylow(P<0.05).andAFinducibilityinallopurinolgroupwassignificantlyreduced(30.37%vs8.15%,P<0.05);AtrialmyocardialcrosssectionalareawasreducedinallopurinolgroupcomparedwithDMgroup(18509.37±1917.60μm2vs15818.47±644.58μm2,P>0.05),collagenvolumefractiondecreasescomparedwithDMgroup(6.83±1.43%vs4.86±1.18%,P<0.05);NF-κB,TGF-β,P-P38，MMP2，MMP9expressioninALLgroupweresignificantlydecreased(P<0.05).Conclusion:1)Xanthineoxidaseactivationandoxidativestressplayimportantroleinatrialelectricalandstructuralremodeling,andAFpromotion;2)Throughanti-inflammatoryandanti-oxidativeeffects,xanthineoxidaseinhibitorallopurinolcouldalleviatediabetesrelatedinflammationandoxidativestress,attenuateatrialelectricalandstructuralremodelingandreducetheinducibilityofAF.Keywords：DiabetesmellitusinflammationoxidativestressallopurinolatrialfibrillationV 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ⅠAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅲ缩略语/符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅶ前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1研究现状、成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1研究目的、方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3一、实验动物模型建立及氧化应激⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51.1实验对象和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51.1.1实验动物分组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51.1.2动物模型建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51.1.3血液生化检查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51.1.4统计学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61.2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61.2.1四组血糖变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61.2.2炎症氧化应激指标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71.3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81.3.1四氧嘧啶诱导的兔糖尿病模型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81.3.2氧化应激与糖尿病房颤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91.4小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9二、别嘌呤醇对糖尿病模型心房重构及心房颤动诱发的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯112.1实验方法和材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112.1.1实验设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112.1.2实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112.1.3实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132.1.4统计学处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172.2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172.2.1血流动力学结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172.2.2心脏超声变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172.2.3电生理参数比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18VI 2.2.4组织学改变⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192.3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212.3.1高糖状态下炎症氧化应激与房颤之间的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212.3.2糖尿病引起的组织学改变⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222.3.3别嘌呤醇的干预作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232.4小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23三、别嘌呤醇对糖尿病兔心房重构的分子机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253.1对象和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253.1.1仪器设备试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253.1.2主要试剂配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253.1.3方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263.2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293.3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313.3.1TGFβ在糖尿病心房重构中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313.3.2P38及P-p38在糖尿病心肌重构中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313.3.3NF-κB信号通路在糖尿病心房重构中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323.3.4MMP2和MMP9在糖尿病心房重构中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333.3.5别嘌呤醇减少房颤发生的分子机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333.4小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36发表论文和参加科研情况说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45高尿酸血症与心血管疾病的相关研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45综述参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56VII 缩略语/符号说明英文缩写英文全称中文名称ROSReactiveoxygenspecies活性氧自由基AFAtrialFibrillation心房颤动ALLallopurinol别嘌呤醇MAPKMitogen-ActivatedProteinKinase丝裂原活化蛋白激酶NF-κBNuclearFactorΚb核转录因子-κBTGFβTransforminggrowthfactor-β转化生长因子-βAERPatrialrefractoryeffectiveperiod心房有效不应期AERPDAERPdispersion心房有效不应期离散度IACTinteratrialconductiontime房间传导时间MDAMalonaldehyde丙二醛SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶MPOMyeloperoxidase髓过氧化物酶CRPC-reactiveproteinC反应蛋白NADPHNicotinamideadeninedinucleotide烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸2'-phosphatereducedtetrasodiumsaltACEIangiotensinconvertingenzymeinhibitors血管紧张素转换酶抑制剂ARBsAngiotensinReceptorBlockers血管紧张素Ⅱ受体阻断剂XOxanthineoxidase黄嘌呤氧化酶VIII 前言研究现状、成果心房颤动（房颤）是目前临床最常见的心律失常疾病。随着房颤危险因素的不断增加，房颤发生率也逐年增多，房颤已经成为全社会关注的公共问题。房颤不仅可以诱发恶性心律失常，还可加重其他心脏疾病如充血性心力衰竭，甚至长期房颤形成的血栓脱落阻塞脑及其他器官，其不但会影响患者生活，严重者可增加心脏病患者死亡率[1-5]。房颤的病因多样，发病机制复杂，尽管治疗房颤的非药物研究如导管消融术，房室结消融术及起搏治疗等已经广泛被患者熟知甚至使用，但抗心律失常药物依然是目前治疗房颤的基础。房颤患者虽长期使用抗心律失常药物控制房颤的进展，但房颤仍会有恶化趋势，同时抗心律失常药物的副作用较大，所以我们急需新药物及其他方法来进一步预防和治疗房颤。糖尿病是严重危害人类健康的全身性代谢疾病，且是房颤的独立危险因素之一[6]。VALUE研究亚组分析显示在平均4.2年的随访期内，出现新发糖尿病的高血压患者较血糖无异常者更易发生房颤[7]。有研究表明，在糖尿病患者中空腹血糖水平越高诱发房颤的几率越大[8]。糖尿病在严格意义上来说也属于一种炎症反应[9]，1型糖尿病是通过自身的免疫性反应破坏胰岛B细胞，从而发生胰岛炎症。2型糖尿病状态下，胰岛素抵抗等全身因素激活了炎症反应，导致糖尿病进一步加重[10-11]。另外，有许多研究表明C-反应蛋白升高与糖尿病房颤发生发展和并发症发生呈正相关，是肥胖和胰岛素抵抗之外糖尿病诱发房颤的又一独立危险因素[12-13]。许多研究表明，房颤的发生与炎症的发生密切相关，糖尿病状态下的炎症激活可能与房颤发生有关[14-16]。众所周知糖尿病患者微血管损伤严重，高糖损伤的主要是毛细血管，其主要是因为炎症反应使毛细血管基底膜增厚；糖尿病病变也会造成心肌纤维化，而糖尿病状态下的炎症反应在心肌间质纤维化和血管周围纤维化的过程中起到关键作用。心肌纤维化使心肌顺应性降低，甚至形成心肌肥厚，影响心肌舒张功能；间质及血管周围的纤维化会导致心肌内小动脉血管舒张功能障碍，长期会使管腔腔变窄，进一步造成心肌供血不足。心肌供血不足的心脏病如冠状动脉粥样硬化型心脏病和急性心肌梗死等可以诱发房颤的发生，甚至可以加重房颤，是阵发性房颤转化为持续性1 房颤和永久性房颤。近年来的观点认为房颤的发生机制主要为心房电重构和结构性重构，此外，炎症和氧化应激在房颤发生和发展中起到关键作用[17-18].Bruins等最早发现炎症与房颤之间存在相关关系[19]，其研究表明在心脏炎症如心包炎和心肌炎等可以导致房颤的发生及反复发作，因此推测局灶性的炎症可能诱是发房颤发生的关键[20]。此外，一项研究证实中性粒细胞和单核粒细胞等炎症细胞存在于持续性房颤患者的心房组织中[21]。有研究证实在房颤患者血浆中hs-CRP水平明显高于窦性心律患者，另外持续性房颤患者血浆中hs-CRP水平显著高于阵发性房颤患者，这项研究表明炎症反应在房颤的发生及发展过程中发挥着重要作用，该研究还表明相反房颤也能进一步使炎症反应加重[22]，另有研究表明，基线hs-CRP水平的变化能够作为长期随访的指标预测房颤的发生和发展，持续性房颤组与阵发性房颤组相比血浆hs-CRP水平显著增高，因此我们推断炎症反应在房颤的发展过程中发挥着至关重要的作用[23]。心房纤维化与房颤的发生发展之间密切相关。其机制可能是心房局部的纤维化影响心脏电传导功能，其可能使传导速度减慢甚至完全阻滞，进而发生异位起搏，增加心律失常的发生率，而房颤的起搏位置较高，故房颤是心律失常疾病中发病率较高的疾病。许多研究都已经表明心血管疾病如高血压、冠心病及慢性心力衰竭等均有炎症和氧化应激反应的参与。氧化应激是指体内氧化系统和抗氧化系统失衡，氧化作用增强，产生大量氧化中间产物，其中活性氧自由基（ROS）具有损伤细胞，参与衰老和疾病发生的作用。机体在危险因素的刺激下，活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等活性分子产生增多，自身抗氧化系统不能抵御过多的氧化中间产物，激活氧化应激反应，进一步导致核酸、蛋白质、脂类的直接氧化和损伤，细胞损伤，也可以加重心脏疾病如动脉粥样硬化、心肌肥厚等，还可以作为分子信号激活细胞内多种应激信号通路。ROS包括超氧阴离子（.O2-）/羟自由基（.OH）和过氧化氢（H2O2）等；RNS包括一氧化氮（.NO）、二氧化氮（.NO2）和过氧化亚硝酸盐（.ONOO-）等。机体有两大抗氧化系统，分别是酶抗氧化系统如超氧化物歧化酶（SOD）和非酶抗氧化系统如维生素C、E。ROS的一般有两个来源：大多数真核细胞中的线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，还有吞噬体和对D-氨基酸氧化也可以产生ROS，另外，黄嘌呤氧化酶在ROS的产生中发挥重要作用，黄嘌呤氧化酶可以生成O2–与一氧化氮（NO）结合生成ONOO-[24-28]。在体内嘌呤代谢过程中，终产物尿酸的生2 成需要黄嘌呤氧化酶激活的介导，因此，尿酸水平可以间接反映黄嘌呤氧化酶的活性，尿酸还可以破坏内皮细胞，促进血管紧张素II生成，导致高血压等其他心脏疾病，而且尿酸还可以生成氨碳酰基自由基和ONOO-，参与氧化应激反应的激活。我们先前的研究表明普罗布考可以通过抗炎抗氧化作用改善糖尿病者房颤的发生发展[29]。另外我们的前期研究还提示血浆尿酸水平越高高血压患者发生房颤的风险越大[30]。此外，炎症与氧化应激之间也会相互作用，细胞内氧化应激激活后过多的氧自由基造成的损伤可以促进多种炎症因子的合成，另外炎症反应又可以反过来激活氧化应激反应，其中核转录因子NF-κB在炎症反应与氧化应激激活的关联中发挥了关键作用[31]。但氧化应激及炎症与房颤之间相关性的具体机制至今尚不十分清楚。另外，有研究提示，炎症和氧化应激不仅可以诱导房颤的发生，而且还可以加快房颤的发展过程，是阵发房颤逐渐发展为持续性房颤，甚至永久性房颤，故我们推测在一定刺激下激活氧化应激和炎症反应可以诱导房颤的发生以及促进房颤的进展[32-33]。由此我们推断炎症和氧化应激可能是高糖刺激下诱导房颤发生发展的关键因素。近年有多项研究表明，影响炎症和氧化应激的因素如肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）中的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体阻断剂(ARBs)可能对房颤发生率的减少也有一定作用[34-36]。血清尿酸是人类嘌呤代谢的终产物，而黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇则是抑制尿酸生成的关键药物。许多研究表明尿酸已经成为心血管相关疾病如冠心病、慢性心力衰竭等的独立危险因素[37-40]。别嘌呤醇及其代谢产物氧嘌呤醇均有抑制黄嘌呤氧化酶活性（XO）的作用，阻止嘌呤代谢，抑制尿酸的生成。在心肌细胞缺血缺氧如发生急性冠脉综合征时，细胞破坏产生过多的核酸产物如黄嘌呤，在黄嘌呤氧化酶（XO）的作用下黄嘌呤转化为尿酸，在此过程中黄嘌呤氧化酶（XO）的激活可导致O2-产生过多，O2-与NO结合生成OONO-，同时尿酸可以再生成OONO-和氨碳酰基自由基，进一步使体内氧化应激反应被激活[41-43]。近来研究发现，黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇通过抗氧化作用影响房颤的发生及发展[44]。而黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对糖尿病心房电重构和结构重构的作用机制以及预防房颤的作用机制目前尚不清除。研究目的和方法探究糖尿病导致心房重构和心房颤动的机制以及抗氧化药物别嘌呤醇在糖3 尿病心房重构和房颤预防中的作用。我们的实验首先是建立糖尿病兔模型，给予糖尿病兔黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇建立别嘌呤醇组模型，再通过电生理、病理和分子生物学等方法，研究从整体到分子等多个层面分析糖尿病状态下氧化应激和炎症在房颤发生发展中发挥的作用，进一步探讨黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对糖尿病诱导的房颤的干预作用；抗氧化药物别嘌呤醇在改善糖尿病房颤中的作用机制，为房颤的预防和治疗提供新方向和途径。4 一、实验动物模型建立及氧化应激1.1研究对象和方法1.1．1实验动物分组选择健康的成年日本大耳白兔30只（中国军事医学科学院动物实验中心），体重1.8kg-2.2kg，雌雄不限，随机分为对照组(Control)，糖尿病组(Diabetesmellitus，DM)，别嘌呤醇组(DM+allopurinol,ALL)，每组10只。1.1.2动物模型建立[45]糖尿病动物模型建立是根据Baily等的改良方法，用去离子水溶解四氧嘧啶药粉（美国Sigma公司），浓度为150mg/ml，将配置好的溶液用医用无菌纱布过滤后倒入烧杯中，约30min后方可使用。为防止结晶析出对家兔造成不必要的损伤再次用滤网过滤后方可使用。注射前观察是否有沉淀及悬浮物，若有则需再一次过滤。后取健康新西兰大白兔置于处置台上，给予安抚后显露兔耳缘静脉，给予消毒后，经兔耳缘静脉注射四氧嘧啶溶液，造模浓度为150mg/kg,30s内注射完毕，充分压迫止血。给药完毕后给家兔提供充足的饲料及清水。注射四氧嘧啶后48h、第7天夜间不给予食物，于清晨用OptiumXceed血糖仪（Abbott公司，美国）测量实验动物的空腹血糖，糖尿病模型建立成功[46]的标准为家兔清晨空腹血糖两次均≧11mmol/L或单次≧14mmol/L。7日后家兔血糖水平没达到诊断标准则再一次给予浓度为150mg/kg的四氧嘧啶，若追加剂量后空腹血糖水平仍没达到诊断标准则退出实验组。糖尿病动物建模成功后10只定为糖尿病组（DM）饲养8W，10只定为别嘌呤醇组（ALL）并同时给予别嘌呤醇片（江苏方强制药厂有限责任公司）干预，浓度为50mg/kg/d，10只定为对照组（C）组不给予任何干预并与其他组动物相同条件下饲养8周。3组实验动物于入组前一天清晨、用药后第二天清晨及建模成功后每周清晨检测家兔血糖变化，直至第8周实验结束，每次监测血糖水平时均需实验动物禁食禁水12小时。1.1.3血液生化检查把饲养8周的家兔置于处置台，经耳缘静脉注射提前配置好的浓度30mg/kg戊巴比妥钠，待实验动物处于麻醉状态后立即开腹，分离腹主动脉，在两侧髂总动脉分叉处，用注射器取10mL静脉血，后放置入离心管中室温下静置15-205 分钟，放入离心机中以4000r/min离心10分钟，提取上层血清，后立即置于-70℃冰箱保存，通过比色法测定髓过氧化物酶（MPO）；羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)；TBA法测定丙二醛(MDA)；实验步骤大致如下：（1）从冰箱中取出试剂盒，放置于室温15-30min。整个实验过程要在20-25℃的室温下进行。（2）取出酶标板，在空白微孔中按标准品次序加入100μl标准品。（3）分别在空白微孔和空白对照中中加入100μl的样品和蒸馏水。（4）在酶标板的各孔中加入50μl的酶标记溶液，但空白对照组的蒸馏水中不加。（5）将酶标板用胶带封闭后，放置于孵育箱中以恒温（37℃）、恒湿的环境中孵育1小时后取出。（6）充分清洗酶标板5次，使各个孔有充足水压（浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释）。（7）用吸水纸将酶标板擦干。（8）于酶标板的每一个孔依次加入显色剂A液50μl和B液50μl。（9）后放置于室温下阴暗处10min。（10）随后于酶标板的每一个孔依次加入终止液50μl终止反应。（11）加入终止液30min内于酶标仪上在波长450nm下读取酶标板各孔的OD值，记录酶标板各孔的浓度值。1.1.4统计学分析我们实验过程中所涉及的计数资料均使用均数±标准差(xˉs)，计数资料的均数比较使用2检验统计，计量资料的均数使用方差分析统计，两组间的比较使用LSD法；所有数据使用SPSS21.0统计软件分析，当P<0.05时定义为有统计学差异。1.2结果1.2.1四组血糖变化三组动物实验前初始血糖无明显差异，DM组和ALL组再注射四氧嘧啶后直至1周血糖迅速升高，第2周至第8周血糖维持在较高水平均明显高于对照组，DM组和ALL组实验动物空腹血糖无显著差异。见表1.1、图1.1。6 表1.1三组不同时期血糖变化(xˉs)组别0W1W2W3W8W(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)C组5.28±0.575.11±0.505.09±0.545.09±0.555.48±0.43DM组6.63±1.3121.84±7.54*20.84±6.94*18.79±7.49*17.47±6.68*ALL组5.83±1.0618.05±8.53*17.38±7.50*15.67±7.26*13.53±6.59*注：*：与C组比较P<0.05#：与DM组比较P<0.05图1.1各组血糖随时间变化曲线1.2.2炎症氧化应激指标与对照组比较，糖尿病组SOD，MPO水平均增高，但都未达到统计学差异，而XOD，MDA显著升高(P<0.05)，存在统计学意义；别嘌呤醇组SOD水平明显增高(P<0.05)，XOD水平明显增高(P<0.05)，存在统计学差异，MPO和MDA无明显变化。与糖尿病组比较，ALL组SOD水平升高，MPO水平减低，但差异无统计学意义。XOD，MDA水平明显下降(P<0.05)，存在统计学意义。与对7 照组相比，糖尿病及别嘌呤醇组全心重量/体重明显增高(P<0.05)，存在统计学意义。与糖尿病组相比，别嘌呤醇组全心重量/体重有所下降(P<0.05)，存在统计学意义。见表1.2。表1.2三组肾功能、氧化应激指标和胰岛素情况(xˉs)组别C组DM组ALL组肾BUN（mmol/L）6.52±1.267.45±1.147.16±1.75功Cr（umol/L）96.10±12.53104.70±13.25109.03±11.27能UA（mg/dl)0.68±0.140.98±0.28*0.65±0.12#氧化XOD（U/l）13.40±2.4448.11±17.00*29.75±12.64*#应激SOD(U/ml)447.32±63.86471.30±66.88538.56±64.72*指标MPO(U/l)51.22±9.4060.18±8.5650.93±8.85MDA(nmol/ml)9.61±2.2214.24±2.69*10.51±1.95#胰岛素（uIU/mL）15.73±2.207.41±1.48*7.10±1.54*全心重量/体重（%）)0.22±0.010.31±0.05*0.25±0.04*#注：BUN：尿素氮；Cr：肌酐；UA：尿酸；XOD：黄嘌呤氧化酶活性；SOD：超氧化物歧化酶；MPO：髓过氧化物酶；MDA：丙二醛；*：与C组比较P<0.05；#：与DM组比较P<0.051.3讨论1.3.1四氧嘧啶诱导的兔糖尿病模型四氧嘧啶(alloxan)破坏胰岛β细胞是通过超氧自由基来完成，胰岛β细胞破坏以后先有大量残存的胰岛素流出，后胰岛β细胞合成胰岛素减少，直至出现胰岛素缺乏。根据四氧嘧啶破坏胰岛β细胞的机制血糖水平的改变表现为药物发挥作用后2小时血糖升高；2小时后因胰岛β细胞被破坏细胞里大量的胰岛素流出，血糖被降低，6小时后细胞里的胰岛素基本释放完全；12h后因胰岛β细胞被破坏没有胰岛素释放，出现胰岛素缺乏的高血糖反应。有研究用四氧嘧啶建立糖尿病模型，结果发现在6W前空腹血糖水平到达高峰，7W时处于稳定期，7W以后血糖水平逐渐下降[47]。另外有研究结果表明，若造模时四氧嘧啶的浓度较低，则会使胰岛β细胞破坏不完全，形成非胰岛素依赖型糖尿病。但四氧嘧啶对胰岛β细胞的毒性较大，故低浓度破坏不完全的细胞会逐渐被破坏，形成胰岛素依赖型糖尿病，也可以使胰岛β细胞的功能恢复正常[46]。使用四氧嘧啶剂量适中则造成的兔糖尿病模型血糖水平较平稳，可是空腹血糖在较高水平1年之久[48]。我们实验建立的糖尿病模型空腹血糖在2-7天达高峰，2周后呈下降趋势，但仍维持在较高水平直至实验结束，提示糖尿病模型建立成功。8 1.3.2氧化应激与糖尿病房颤近年来许多研究表明糖尿病是导致房颤的独立危险因素[49]。但糖尿病导致房颤发生的具体机制仍尚不清楚。有研究表明糖尿病可促进ROS产生，其可以参与细胞增殖分化凋亡等病理生理反应，ROS主要包括超氧自由基、过氧化氢多种氧化应激产物等，这可能是导致房颤发生的重要机制[50-54]。在嘌呤代谢中，次黄嘌呤通过黄嘌呤氧化酶（XO）作用转化为黄嘌呤，黄嘌呤再在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为尿酸。今年的研究表明黄嘌呤氧化酶（XO）的激活可导致O2-产生过多，O2-与NO结合生成OONO-，从而激发氧化应激反应，进一步导致心房结构性重构，促进房颤发生。有研究结果显示炎症和氧化应激可能是糖尿病与房颤的病理生理过程的关键环节。我们前期工作结果表明炎症和氧化应激在糖尿病诱导的心房肌重构中发挥重要作用，其甚至可以介导房颤的发生[9]。其主要是在黄嘌呤氧化酶的介导下产生，故其作为嘌呤代谢的终产物能够反映黄嘌呤氧化酶的活性。有研究表明，炎性物质如C反应蛋白和氧化应激介质如氧化低密度脂蛋白在血浆中含量增多可能与房颤的发生及复发存在密切联系[55-57]。血浆中C反应蛋白和氧化低密度脂蛋白的增多也可能增加其他心血管疾病的风险（如高血压和心力衰竭等）[58-60]。过多的ROS可诱发氧化应激激活，从而导致心肌细胞肥厚和纤维化。糖尿病兔全心重量/体重比值明显高于正常对照组，而别嘌呤醇组与对照组无明显差异，这可能是应为糖尿病引起炎症及氧化应激反应，进一步使心房肌肥大和纤维化，而糖尿病本身的高代谢状态使动物体重下降，应用别嘌呤醇后明显改善炎症及氧化应激。故本研究结果显示糖尿病组较对照组黄嘌呤氧化酶活性（XOD），全心重量/体重比值，氧化应激产物MDA和炎症指标MPO水平升高，而别嘌呤醇可以显著抑制黄嘌呤氧化酶活性（XOD），减轻炎症和氧化应激反应，缓解糖尿病兔心房纤维化及心肌肥大，因此我们推测推测氧化应激及炎症与糖尿病引起的房颤密切相关，同时黄嘌呤氧化酶抑制剂可以显著改善炎症和氧化应激反应，降低房颤的诱发率。1.4小结用四氧嘧啶建立的糖尿病模型的建立简便易行，血糖水平稳定升高。糖尿病组较对照组血浆中氧化应激产物MDA、炎症指标MPO水平升高，而给予抗氧化剂别嘌呤醇治疗后脂质过氧化物分解产物MDA显著降低，炎症指标MPO水平也下降，糖尿病兔全心重量/体重比值明显高于正常对照组，而别嘌呤醇组可以9 使以上指标恢复正常，推测黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇及其代谢产物可能是减少糖尿病病理状态下炎症和氧化应激激活，进一步改善心肌肥大和心肌纤维化程度，从而减少房颤的发生率。10 二、别嘌呤醇对糖尿病模型心房重构及心房颤动诱发的影响2.1实验方法和材料2.1.1实验设备多道电生理记录仪洪桐有限公司Langendorff灌流系统恒温水浴泵银河公司自制不锈钢电极四对自制混合气体：95%O2，5%CO2六方高科技气体公司PHS-3C酸度计武汉格莱莫检测设备有限公司超净工作台江苏苏净集团有限公司磁力恒温搅拌器上海曹行无线电元件厂低温高速离心机德国Eppendorf公司电转膜仪美国Bio-Rad公司烘烤箱上海天美科学仪器有限公司普通医用冰箱（4°C，-20°C）中国海尔电器集团有限公司石蜡包埋机德国Leica公司石蜡切片机德国Leica公司真空干燥箱ZK3SBS天津病理图像分析仪IPP系统美国手术器械和器皿等上海医疗器械有限公司微波炉广东格兰仕集团有限公司显微镜日本Olympus公司小型分析用离心机北京市六一仪器厂研钵天津优瑞尔生物技术有限公司PHS-3C型PH计上海仪电科学仪器股份有限公司E-Pure超纯水设备美国Barnstead公司E-pure超纯水系统美国Millipore公司JA1003A电子天平上海精天电子仪器有限公司2.1.2实验材料健康成年日本大白兔30只，体重1.8-2.2Kg，雌雄不限11 戊巴比妥钠北京通县育才精细化工厂氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒南京建成生物工程研究所丙二醛(MDA)检测试剂盒南京建成生物工程研究所过氧化物酶(MPO)测试剂盒南京建成生物工程研究所浓氨水天津优瑞尔生物技术有限公司浓盐酸天津优瑞尔生物技术有限公司脱脂奶粉OXIDO无水乙醇天津优瑞尔生物技术有限公司磷酸盐缓冲液粉末（PBS）北京中杉金桥生物技术公司TEMED美国Amresco公司TrizolRNA裂解液美国Invitrogen公司Tween-20北京索莱宝科技有限公司丙酮天津优瑞尔生物技术有限公司丙烯酰胺天津优瑞尔生物技术有限公司蛋白质分子北京鼎国昌盛生物技术有限公司二甲苯天津优瑞尔生物技术有限公司过硫酸铵北京鼎国昌盛生物技术有限公司甲叉双丙烯酰胺北京鼎国昌盛生物技术有限公司甲醛天津优瑞尔生物技术有限公司胶原酶北京鼎国昌盛生物技术有限公司磷酸盐缓冲液粉末（PBS）北京中杉金桥生物技术公司伊红北京中杉金桥生物技术公司医用X光胶片富士医疗器材（上海）有限公司异丙醇天津优瑞尔生物技术有限公司Glucose，Tris(三羟甲基氨基甲烷)，甘氨酸，SDS（十二烷基磺酸钠），NaHCO3，KCl5.0，MgCl2•6H2O，NaH2PO4•2H2O，NaCl，CaCl2。石蜡，Masson，苏木素，伊红，二甲苯，中性树胶。12 2.1.3实验方法2.1.3.1动物模型建立糖尿病动物模型建立是根据Baily的改良方法，用去离子水溶解四氧嘧啶药粉（美国Sigma公司），浓度为150mg/ml，经兔耳缘静脉注射四氧嘧啶溶液，造模浓度为150mg/kg,30s内注射完毕，充分压迫止血。给药完毕后给家兔提供充足的饲料及清水。注射四氧嘧啶后48h、第7天夜间不给予食物，于清晨用血糖仪测量家兔血糖，若两次空腹血糖≧11mmol/L或单次空腹血糖≧14mmol/L则糖尿病模型建立成功。7日后家兔血糖水平没达到诊断标准则再一次给予浓度为150mg/kg的四氧嘧啶，若追加剂量后空腹血糖水平仍没达到诊断标准则退出实验组。糖尿病动物建模成功后10只定为糖尿病组（DM），10只定为别嘌呤醇组（ALL）并同时给予别嘌呤醇片干预，浓度为50mg/kg/d，10只定为对照组（C）组不给予任何干预措施，均饲养8周。3组实验动物于入组前一天清晨、用药后第二天清晨及建模成功后每周清晨检测家兔血糖变化，直至第8周实验结束，每次监测血糖水平时均需实验动物禁食禁水12小时。2.1.3.2血流动力学检查动物于模型建立成功后8周进行血流动力学测定，应用3%的戊巴比妥钠30mg/Kg通过耳缘静脉麻醉，而后背位固定于操作台。于四肢皮下扎入简易心电图，去除家兔颈部正中的体毛，切开大约5厘米，分离肌肉及神经，找到右侧颈总动脉，用医用线结扎右侧颈总动脉上部，用血管夹夹闭近心端，剥离出右侧颈总动脉，于近血管夹处剪开1个小口，从小口处向近心段缓缓导入预先准备好的用500U/mL肝素盐水浸泡过的压力导管由主动脉渐渐伸至左心室，通过压力导管连接的多导生理记录仪记录压力曲线、体表心电图、主动脉内收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均压(MBP)，间断测量三次取均值。缓缓动送压力导管由主动脉直至左心室同时记录主动脉、左心室、通过主动脉瓣时的压力曲线和左心室舒张末压力（LVEDP），间断测量三次取均值。待测量完毕后压力导管由左心室逐渐撤出至主动脉再至体外，拔出导管的同时结扎颈动脉近心端。2.1.3.3心脏彩超检测家兔糖尿病模型建立成功后，配置3%戊巴比妥钠以10mg/Kg对实验动物进行轻度麻醉，刮去实验动物心脏部位及四肢的体毛，使其呈左侧卧位。应用GEVivid7型超声仪及频率为7.5MHz的新生儿探头进行心脏超声检测。留取标13 准5个心动周期左心室长轴及短轴观、心尖四腔、心尖两腔指标进行数据统计分析。于左心室长轴观测量室间隔厚度(IVS)，左心室舒张末内径(LVEDD)，左心室收缩末内径（LVESD)。Simpson法测量左心室射血分数(LVEF)。心尖四腔切面测量二尖瓣血流频谱舒张早期波峰值速度(E)，舒张晚期波峰值速度(A)，记录三次测量的均值。2.1.3.4电生理学检查用KCl5.0mmol/L，NaCl125mmol/L，Glucose10mmol/L，MgCl2•6H2O0.6mmol/L，NaHCO324mmol/L，NaH2PO4•2H2O1.2mmol/L，CaCl22.0mmol/L配置台式液，使PH维持在7.35-7.45。配好台式液后迅速放置于37℃的水浴箱中加温，同时给予95%O2和5%CO2的混合气防止升温后有Ca沉淀影响实验进程，大约30分钟后将灌流系统中充满预先准备好的37℃的台氏液，并以95cmH2O压力逆向灌流。配置3%戊巴比妥钠放入4°C冰箱备用，待实验准备完毕，用30mg/kg经耳缘静脉麻醉实验动物，待实验动物状态稳定后，经胸骨正中切口开胸，于主动脉根部以上1cm处水平剪断主动脉，迅速取出心脏，在4℃的冰水混合台氏液洗净残血，同时挤净心脏内的血液，立即把心脏主动脉连接至Langendorff灌流系统上，同时结扎主动脉与插管连接处，防止台式液由动脉流出，使冠状动脉灌流量维持在50~60ml/min，pH7.35±0.05，同时用95%O2和5%CO2混合气体继续向台氏液中充气。将自制电极连接多道电生理记录仪，在用自制的四对电极另一端分别固定在高位左房(highleftatrium,HLA)、低位左房(lowleftatrium,LLA)、右心室(rightventricle,RV)、高位右房(highrightatrium,HRA)，稳定30分钟后开始给予刺激，记录起搏阈值和窦性心动周长(sinuscyclelength,SCL)。然后以脉宽2ms，以起搏阈值2倍的起搏电压对右房进行递增刺激（S1S1刺激），以250ms和200ms为基础起搏周长进行电生理参数的测定，首先以起搏周长250ms测定HRA至HLA的传导时间，即心房间传导时间(interatrialconductiontime,IACT)。然后逐渐缩短基础起搏周长，每次步长为5ms，直至房室传导的文氏点被诱发出来，房室传导文氏周长（WenckbachcyclelengthofAVconduction,AVWCL）定义为能够引起文氏型房室传导的最长心房连续起搏周长。然后设定基础起搏周长为250ms和200ms，以相同的脉宽、起搏电压分别测量各点有效不应期(atrialeffectiverefractoryperiod,AERP)，我们使用心脏程序期前刺激法（S1S2刺激），在每8个S1后诱发刺激一次S2，S1S2间期从120ms开始以2ms递减，直至不14 出现心房夺获。AERP定义为不能夺获心房的最长S1S2偶联间期。按次序从高位右房（HRA）开始，依次到低位左房（LLA）、高位左房（HLA）分别测定不同部位的AERP和房颤的诱发，心房不同部位最长AERP与最短AERP的差值即AERP的离散度(atrialeffectiverefractoryperioddispersion,AERPD)。将所有位点的AERP监测完毕后给予起搏周长为50msBurst刺激诱发房颤，每个部位刺激诱发5次，刺激持续1秒钟，每隔30秒刺激一次。在S1S2或Burst刺激后电生理图中正常心电图后跟随着出现快速而不规则心房激动，同时出现不规则的心室激动且维持超过1秒者则定义为房颤诱发成功。房颤维持＞1min时立即给予Burst刺激终止房颤，这种＞1min的房颤即为持续性房颤，同时记录不同组各部位的诱发房颤成功的次数及每次房颤持续的时间。注意：每只动物进行电生理检查时，出现持续性房颤时给予Burst刺激（起搏周长为50ms）终止，每组电生理实验的持续时间最好不超过30min。2.1.3.5组织学HE染色及Massom染色2.1.3.5.1标本处理1把留取的左房组织浸泡于10%福尔马林中14天；2.14天后取出放置于乙醇中脱水，按次序放置于75%乙醇4h，80%乙醇4h，95%乙醇Ⅰ2h，95%乙醇Ⅱ2h，100%乙醇Ⅰ1h20min，100%乙醇Ⅱ1h40min；3.后依次放入乙醇(1:1)10min，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min；4.随后依次放入石蜡Ⅰ40min，石蜡Ⅱ90min；5.将包埋框倒满液体石蜡，后立即把组织放入石蜡里完全侵润，再室温下静置，直至石蜡与组织凝固；6.每个蜡块取20张切片，每张切片厚3-4µm，取较为完整的10张切片。将切片铺于30°C左右的恒温水浴箱，将石蜡切片完全展开后将其平铺在干净的载玻片上，待所有石蜡切片铺完后，将石蜡切片置于固定架上放入60℃的烤箱中烘干约6小时，待烤箱冷却后取出石蜡切片，用于HE和Masson染色；2.1.3.5.2苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining，HE染色）1.将切片放入到架子上，依次放入二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ5min；2.然后再用无水乙醇洗去二甲苯重复2次，每次1min；后转至与95%乙醇浸泡1min，再至90%乙醇浸泡1min，85%乙醇浸泡1min，取出用去离子水清洗2min；3.脱水完毕的组织切片放置于苏木精染液中浸泡3min；4.再次用去离子水清洗1min；15 5.1%盐酸酒精分化20s；6.再次用去离子水清洗1min；7.1%氨水反蓝30s；8.去离子水清洗1min；9.浸入伊红染液2min30s；10.去离子水清洗30s；11.依次放入85%乙醇20s，90%乙醇30s，95%乙醇Ⅰ1min，95%乙醇Ⅱ1min，100%乙醇Ⅰ2min，100%乙醇Ⅱ2min行脱水；12.然后依次放入二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ2min；二甲苯Ⅲ2min，封片。2.1.3.5.3Masson染色1.组织切片脱蜡至水，步骤同HE染色；2.试剂A染色5min-10min；3.试剂B分化1min、水洗；4试剂C返蓝30s、水洗；5.蒸馏水1min；5.试剂D染色5min；6.试剂E洗1min；7.试剂F洗1-2min；8.试剂E洗1min；9.直接放入试剂G染色1-2min；10.试剂E洗1min；11.最后无水乙醇脱水，中性树胶封面。2.1.3.5.4分析取HE染色切片，在400倍视野下选取细胞核圆且多的视野，从中选取较圆的细胞测量其横截面积，为防止误差，每张切片选取15个视野，每个视野选取15个较圆的细胞，分别测量每个视野中每个细胞的横截面积，最后算出均值。用Masson染色切片，在200倍视野下观测心房组织，并测量纤维化程度及横截面积，用于胶原容积分数的计算。每张Masson染色切片随机选取5个视野，以Tiff格式保存。使用ImageProPlus6.0打开图片，将图片由RGB模式(Red,Green,Blue)转化为HSI模式(Hue,Saturation,Intensity)，调节H、S、I值，去除无组织16 的空隙，即可进行计算胶原总面积及图像总面积。胶原容积分数(CollagenVolumeFraction，CVF)＝胶原总面积/图像总面积。2.1.4统计学处理我们实验过程中所涉及的计数资料均使用均数±标准差(xˉs)，计数资料的均数比较使用2检验统计，计量资料的均数使用方差分析统计，两组间的比较使用LSD法；所有数据使用SPSS21.0统计软件分析，当P<0.05时定义为有统计学差异。2.2结果2.2.1血流动力学结果与C组相比，DM组的SBP、DBP、MBP和LVEDP大体呈下降趋势，但不存在统计学意义；与糖尿病组相比，ALL组SBP、DBP、MBP和LVEDP均升高，但无统计学差异；对照组与别嘌呤醇组无明显变化，见表2.1。表2.1三组动物血流动力学参数比较(ˉxs)组别SBPDBPMBPLVEDP(mmHg)(mmHg)(mmHg)(mmHg)C组87.00±14.7369.79±15.9776.36±15.093.57±7.66DM组96.43±11.2765.86±31.7575.57±24.10-4.11±5.64ALL组110.71±29.0583.14±27.9391.57±2.103.57±13.36注：SBP：主动脉收缩压；DBP：动脉内舒张压；MBP：主动脉内平均压；LVEDP：左心室舒张末压。2.2.2心脏超声变化与对照组相比，糖尿病组IVS、LVPW明显增高，有统计学意义，别嘌呤醇组则无明显变化。左室舒张末内径和左室射血分数在三组间则无明显变化。见表2.2。17 表2.2三组心脏彩超比较(ˉxs)组别IVSLVEDDLVESDLVPWLADE/ALVEF(mm)(mm)(mm)(mm)(mm)(%)C组1.71±0.112.42±0.6.82±0.1.65±0.17.26±0.1.43±0.70.23±7.838452557311DM组2.04±0.213.96±1.8.25±1.2.08±0.38.64±0.1.96±0.74.37±11.3*45642*896864ALL组1.86±0.213.34±1.7.86±1.1.89±0.17.77±1.1.39±0.67.78±11.131129184984注：IVS：室间隔厚度LVEDD：左室舒张末内径LVESD：左室收缩末内径LVPW：左室后壁厚度LAD：左房内径LVEF：左室射血分数*：与对照组比较P<0.05；#：与DM组比较P<0.052.2.3电生理参数比较与对照组比较，糖尿病组心率无明显变化；IACT显著延长(P<0.05)；AVWCL明显减低，但未达统计学差异；而250ms和200ms起搏周长时HRA、HLA、LLA有效不应期及AERPD均明显增高。与糖尿病组相比，别嘌呤醇组心率无明显变化；AVWCL明显增加；而250ms和200ms起搏周长下HRA、HLA、LLA有效不应期，IACT及AERPD明显减低，但不存在统计学意义。与对照组相比，别嘌呤醇组IACT延长，其他电生理指标均无明显差异。糖尿病组与对照组相比房颤诱发率增高(2.22%vs30.37%,P<0.05)，别嘌呤醇组房颤诱发率较糖尿病组下降(30.37%vs8.15%,P<0.05)，别嘌呤醇组房颤诱发率与对照组无明显差异(8.15%vs2.22%,P>0.05)，表2.3，图2.1。18 表2.3三组电生理参数比较(xˉs)组别C组DM组ALL组心率（ms）340.78±31.69357.67±25.53344.75±65.75IACT（ms）21.89±3.8227.11±2.93*23.75±2.82AVWCL(ms)159.78±17.39137.89±19.08151.75±15.73AERPD(ms)20.89±4.5926.67±6.0022.25±6.63HRAERP(ms)85.11±12.3790.89±14.9481.25±7.17250HLAERP(ms)84.44±8.1192.89±18.3087.50±10.30msLLAERP(ms)87.33±9.8597.56±14.4189.00±10.20HRAERP(ms)86.00±7.2895.11±17.2186.25±6.54200HLAERP(ms)82.00±8.1993.56±12.9991.25±11.56msLLAERP(ms)89.78±7.7796.22±14.0990.00±12.28注：IACT：房间传导时间；AVWCL：房室传导的文氏周长；AERPD心房有效不应期离散度；HRAERP：高位右心房有效不应期；HLAERP：高位左心房有效不应期；LLAERP：低位左心房有效不应期；#：与对照组比较P<0.05；*：与糖尿病组比较P<0.05图2.1三组房颤诱发率2.2.4组织学改变与对照组相比，HE染色显示糖尿病组细胞排列较为紊乱，心房肌细胞横截面积增大(11938.57±7554.66μm2vs18509.37±1917.60μm2,P＞0.05)，马松染色显示糖尿病组胶原容积分数明显增大(1.90±0.33%vs6.83±1.43%,P<0.05)；与DM组比较，别嘌呤醇组心房肌细胞横截面积减小(18509.37±1917.60μm2vs19 15818.47±644.58μm2,P＞0.05)，胶原容积分数减小(6.83±1.43%vs4.86±1.18%,P<0.05)。与对照组相比，别嘌呤醇组细胞排列紊乱，心房肌细胞横截面积增大(11938.57±7554.66μm2vs15818.47±644.58μm2,P＞0.05)，马松染色显示糖尿病组胶原容积分数明显增大(1.90±0.33%vs4.86±1.18%,P<0.05)。见图2.2，2.3.A图2.2HE染色心房肌细胞横截面积比较注：400×；*：与C组比较P<0.05；#：与DM比较P<0.05A：C组；B：DM组；C：ALL组20 图2.3马松染色胶原容积分数比较注:400×；*：与C组比较P<0.05；#：与DM比较P<0.05A：C组；B：DM组；C：ALL组胶原为蓝染区域2.3讨论2.3.1高糖状态下炎症氧化应激与房颤之间的关系许多研究表明，高糖状态下炎症氧化应激更容易诱发房颤。一项临床研究发现，明确诊断为糖尿病的患者房颤发病率明显高于空腹血糖无异常者，而且空腹血糖水平控制越差发生房颤的危险性越高[61]。糖尿病状态下的炎症和氧化应激反应可以促进ROS产生，并且参与细胞增殖、分化、衰老和凋亡等过程。有研究表明，线粒体呼吸链中ROS生成过多是引起糖尿病并发症的基础。线粒体呼吸链中电子通过复合物向外转移质子，形成质子梯度，促使三磷酸腺苷合成酶向内流动。葡萄糖产生过多会有一部分转化为丙酮酸，丙酮酸可以参与三羧酸循环产生电子，而这些电子可以进入电子传递链。而糖尿病患者胰岛素缺21 乏或者胰岛素抵抗导致空腹血糖水平升高，过多的葡萄糖会通过以上机制生成更多的电子参与电子传递链，直至临界阈值。与此同时，电子链中产生的电子与分子氧结合生成ROS[62]。ROS可以与氧化还原反应等相互影响，而氧化还原反应也能产生分子氧，ROS过多时可以反过来刺激氧化还原反应产生够多的分子氧，进一步促进ROS的生成，同时增强高血糖的破坏作用。另一方面，炎症和氧化应激反应可以通过改变心肌结构及影响分子生物学水平来诱发和促进房颤的发生发展，本研究结果显示，与对照组相比，糖尿病组房颤诱发率增高，与糖尿病组相比，别嘌呤醇组房颤诱发率下降，别嘌呤醇组房颤发生与C组无明显差异，由此推断空腹血糖较高的状态下炎症和氧化应激反应的激活可能参与糖尿病房颤的发生发展，但具体机制我们仍需要进一步研究。2.3.2糖尿病引起的组织学改变众所周知糖尿病患者微血管损伤严重，高糖损伤的主要是毛细血管，其主要是因为炎症反应使毛细血管基底膜增厚；糖尿病病变也会造成心肌纤维化，而糖尿病状态下的炎症反应在心肌间质纤维化和血管周围纤维化的过程中起到关键作用。心肌纤维化使心肌顺应性降低，甚至形成心肌肥厚，影响心肌舒张功能；间质及血管周围的纤维化会导致心肌内小动脉血管舒张功能障碍，长期会使管腔腔变窄，进一步造成心肌供血不足。心肌供血不足的心脏病如冠状动脉粥样硬化型心脏病和急性心肌梗死等可以诱发房颤的发生，甚至可以加重房颤，是阵发性房颤转化为持续性房颤和永久性房颤。另外，因心房肌细胞细且长，当一些原因造成心肌细胞肥大时如肥厚性心肌病、高血压性心脏病等，细胞表面的钙信号传递到细胞中央时间延长，Ca2+信号的反应时间延长，可能会诱发房颤等心律失常的发生[63-65]。我们研究显示，糖尿病组现对其他两组心房肌细胞横截面积明显增加，这可能是糖尿病的炎症和氧化应激反应或者是纤维化导致心肌细胞肥大。而对照组与别嘌呤醇组无明显差异，这可能是黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇的抗炎抗氧化作用改善了心肌毛细血管基底膜的增厚及心肌的纤维化程度，进一步改善心肌肥厚和心肌供血，使钙信号传递到细胞中央时间相对缩短，从而改善了糖尿病诱发的房颤。我们的实验结果提示，糖尿病组IVS、LVPW明显增高，别嘌呤醇组则无明显变化。左室舒张末内径和左室射血分数在三组间则无明显差异。故我们推测糖尿病可以引起以心房肌纤维化为特征的心房结构重构，这可能是导致心房颤动的重要原因，而黄嘌呤氧化酶抑制22 剂别嘌呤醇能够通过控制炎症反应和氧化应激反应间接的控制心房纤维化，从而降低房颤的诱发率，减缓了房颤的发展进程。2.3.3别嘌呤醇的干预作用在嘌呤代谢中，次黄嘌呤通过黄嘌呤氧化酶（XO）作用转化为黄嘌呤，黄嘌呤再在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为尿酸。今年的研究表明黄嘌呤氧化酶（XO）的激活可导致O2-产生过多，O2-与NO结合生成OONO-，从而激发氧化应激反应，进一步导致心房结构性重构，促进房颤发生。别嘌呤醇及其代谢产物氧嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从而抑制分子氧作为电子受体将黄嘌呤转化为尿酸，同时抑制生成超氧化物阴离子，来阻止体内氧化应激激活[66]。我们先前的研究评价了高尿酸血症与高血压患者发生房颤的相关性，随访了451例高血压患者，其中11.1%的患者同时伴有房颤，同时高血压并发房颤的患者血清尿酸水平明显较未发生房颤者高，该研究结果提示血浆尿酸水平越高高血压患者发生房颤的几率就越高[67]。另外，有研究发现，心房结构纤维化和脂肪浸润程度越严重房颤发生发生的几率越高，甚至加重房颤的发展[68]。本研究结果提示黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇不但可以抑制尿酸的生成，抑制生成超氧化物阴离子来抑制体内氧化应激反应，还可以改善糖尿病患者心房纤维化、脂肪侵润及心肌肥大，同时还可以使房颤诱发率降低。我们的研究发现DM组血清中氧化应激产物MDA较对照组增高，心房肌细胞横截面积和纤维化程度明显增加；别嘌呤醇组较糖尿病组血浆MDA水平降低，心房肌细胞横截面积和纤维化程度显著下降；而对照组与别嘌呤醇组无显著差异，因此我们认为房颤主要是因为心房纤维化、脂肪侵润及心肌肥大等原因引起的，所以要降低房颤的诱发率关键要改善心房的纤维化程度，而别嘌呤醇的抗炎抗氧化作用可以改善高血糖诱导的心房电重构和结构重构，也是降低房颤诱发率的关键之一。甚至别嘌呤醇还可以避免阵发性房颤向持续性房颤和永久性房颤的转化。2.4小结糖尿病本身属于炎症反应，其又可以进一步引起炎症和氧化应激反应，而炎症和氧化应激作用会导致心房肌纤维化，甚至可以诱发房颤。黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇及其代谢产物氧嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从而抑制分子氧作为电子受体将黄嘌呤转化为尿酸，同时抑制生成超氧化物阴离子，来阻止体内氧化应激激活，即改善了糖尿病引起的炎症和氧化应激，进一步减轻心房肌纤维化程度，从降低糖尿病兔房颤的发生率。但炎症及氧化应激通过23 什么途径诱发房颤以及别嘌呤醇如何改善糖尿病状态下的炎症和氧化应激来降低房颤发生率的具体机制我们仍需要进一步研究。24 三、别嘌呤醇对糖尿病兔心房重构的分子机制3.1对象和方法3.1.1仪器设备试剂分析天平稳压稳流电泳仪微型水平电泳槽电转膜仪微量移液器水平摇床丙烯酰胺北京鼎国昌盛生物技术有限公司Tween20北京索莱宝科技有限公司TEMEDAMRESCO,USAImmobilonTMWesternchmiluminescentMILLIPORE,USAHRPSubstrateNF-kappaBP65抗兔抗体武汉博士德生物工程有限公司RabbitpolyclonaltoERK2(44KDa)Abcom,USA(ab73272)磷酸化-丝裂原活化蛋白激p38抗兔抗体武汉博士德生物工程有限公司磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38抗兔抗体武汉博士德生物工程有限公司PageRulertTMPrestainedProteinLadderFermentas,USAPVDF膜(0.22,0.45)MILLIPORE,USA3.1.2主要试剂配置1.丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺，以温热的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml，放置于棕色瓶中用锡纸包裹，于4℃冰箱保存。2.用10%(w/v)10gSDS和100ml去离子水配制10%SDS十二烷基硫酸钠溶液，放于室温下。3.1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)分离胶缓冲液：用18.15gTris和48ml1mol/LHcL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后室温保存。4.用6.05gTris和48ml1mol/LHCL混合加入去离子水100ml，用弄HCl和KOH25 调pH至6.8，配置成0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8)浓缩胶缓冲液，用滤网过滤后放于室温下即可。5.称量30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS放入烧瓶中，向烧瓶中加入去离子水1000ml，混合均匀后即为0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液，放于室温下备用，使用前可稀释成1x的Tris-甘氨酸电极缓冲液。6.用天平称量2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS放入烧杯中，放入200ml甲醇，加入去离子水定容至1L，充分搅拌混合均匀后，即为1L的转移缓冲液。7.BSA封闭液5%(w/v)，5gBSA，100mlTBST8.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g，去离子水1.0ml9.RIPA裂解液：50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS10.水饱和正丁醇：去离子H2O:正丁醇=2:811.10×TBST：Tris-HCL(pH8.8)50ml,Nacl43.83g,Tween2050ml3.1.3方法3.1.3.1组织中总蛋白的提取定量及处理1.将预先准备好的0.1g左房组织块从-70°C的冰箱取出，置于研钵中，将研钵置于冰盒上，于研钵中倒入少量液氮，冷却组织，在研钵中缓慢研磨组织，防止溅出，反复倒入液氮冷却研磨，组织研磨为粉红色粉末状后静置。2.向研磨好的组织中加入1mlRIPA裂解液，同时仍不断加入液氮冷却。3.后于室温下静止15分钟，待组织变成粉红色液体时，将裂解液转移至1.5ml离心管中，放入离心机中，4℃恒温，以12000rpm离心，持续5min，取出离心管，取上清液移至0.5ml离心管中，放于-20℃的冰箱备用。4.用Bradford比色法测定蛋白质浓度5.于80ul裂解液中加入20ul5×蛋白上样缓冲液混合均匀。6.煮沸30分钟使蛋白变性，待冷却后放入-20℃冰箱待用。3.1.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳1.取两块预先准备好的干净玻璃板和0.75mm垫片固定在灌胶支架上，用于灌胶。2.配置SDS变性聚丙烯酰胺凝胶(下层分离胶)需要DDW、40%丙烯酰胺、1.5MTris-Cl(pH8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵和TEMED。26 具体浓度配比按照表3.1配制分离胶表3.1不同浓度SDS变性聚丙烯酰胺凝胶配置方法(下层分离胶)浓度10%(16-68KDa)6%(51-212KDa)15%(12-43KDa)DDW4.825mL5.8mL3.55mL40%丙烯酰胺2.475mL1.5mL3.75mL1.5MTris-Cl(pH8.8)2.5mL2.5mL2.5mL10%SDS100μL100μL100μL10%过硫酸铵100μL100μL100μLTEMED4μL8μL4μL带液体配置完毕后，迅速将下层胶沿玻璃板注入，留1/3的上层胶间隙，观测玻璃板底部是否有凝胶流出，若有则重复上述过程，而后在底层胶上加入正丁醇1mL压平底层胶上界，等待1小时，底层胶彻底凝固后倒去正丁醇，反复用去离子水清洗。在跑mtor及p-mtor蛋白等分子量较大的蛋白时，配置浓度为4%-6%的凝胶，保证出现大分子量蛋白的条带。按如下浓度配制SDS变性5%聚丙烯酰胺凝胶(上层积层胶)，表3.2表3.2SDS变性5%聚丙烯酰胺凝胶(上层积层胶)DDW2.225mL40%丙烯酰胺375μL1.0MTris-Cl(pH6.8)380μL10%SDS30μL10%过硫酸铵30μLTEMED3μL混合均匀后，迅速将分离胶沿玻璃板一边注入玻璃板间，不超过玻璃板的上缘,插入准备好的干净梳齿,静止30分钟，同时准备电泳槽，将1×SDS-PAGE缓冲液倒入电泳槽，将配置好的胶放置于电泳槽置于1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液中，缓缓取出梳齿，用1ml的针管取电泳缓冲液冲洗加样孔。3.每个加样空依次加入20ul蛋白样品，接通电泳开关，保持电压80V，密切观测，待样品进入分离胶后，电压调至110V。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，出现所需蛋白层后停止电泳。注意电泳要充分分离蛋白，防止分子量接近的蛋白融合在一起。3.1.3.3转膜准备2张海绵及六张3M滤纸及一张硝酸纤维素膜（NC膜）放置于预先准备好的WesternBlotting转移缓冲液中5min左右，分别把海绵、滤纸、凝胶、27 NC膜依次放置于夹子中间，放置每一层时需用玻璃棒赶走气泡，保证每层之间平整，否则所需蛋白可能不能转移到NC膜上。接通电源转膜2小时，恒流350mA，同时在转膜装置周围放置冰袋降温，避免高温对凝胶的损坏。若跑的蛋白分子量较大时，不仅要延长转膜时间，换要注意降温，过长时间的转膜会使NC膜及滤纸破坏，进一步使Westernblotting结果不清晰。PVDF膜侧与电源正极相连，在90V的电压下转膜1-2小时不等（按分子量大小衡量，分子量越大所需时间越长）。转膜完毕后，取出PVDF膜，放入预先配置好的1XTBST中清洗6次，置于摇床上加快清洗速度，每次10分钟。3.1.3.4封闭及一抗以PBSBuffer清洗NC膜3次后放入封闭液中（用PBST配置的5%的脱脂牛奶），放置在摇床上轻摇1-2小时，剪下所需蛋白区域，于PBSBuffer清洗NC膜4次，每次10分钟；后将NC膜放入一抗中（用封闭液稀释），封闭，37℃震荡1h，4℃孵育过夜3.1.3.5清洗加二抗从一抗中取出NC膜放置于1×TBST溶液中，放置在摇床上清洗4次，每次10分钟。后将NC膜放入对应的二抗中封闭，置于摇床上慢摇1小时左右。从二抗中取出NC膜放置于1×TBST溶液中，放置在摇床上清洗4次，每次10分钟。3.1.3.6显色取出NC膜，用PBSBuffer清洗4次，每次10min，清洗完毕后将NC膜放置在预先准备好的曝光盒的保鲜膜上，同时将A、B显影液1:1混合均匀，用滴管将混合液均匀滴在NC膜上，静置3-5分钟，用滤纸将多余的A、B混合液吸走，再用另一侧保鲜膜将NC膜封闭。在暗室中，放入胶片，曝光1~5min，显影液中显影，条形影出现后置于定影液中定影。重复多次挑选清晰底片。3.1.3.7分析我们使用Gene凝胶成像及分析系统进行胶片灰度分析，分析各组目地条带的亮度值。计算蛋白条带的亮度值，并和对应GAPDH(内参照)条带亮度值比较，取其比值来比较各组目的蛋白之间的差异进行统计分析。28 3.2结果与C组相比，DM病组NF-κB，TGF-β，P-P38，MMP2，MMP9表达明显增多(P<0.05)，与DM组相比，ALL组NF-κB，TGF-β，P-P38MMP2，MMP9表达明显减少(P<0.05)，P38在三组间比较随有差异但无统计学意义。ALL组NF-κB，TGF-β，P-P38，P38表达与C组差异无统计学意义，图3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6。图3.1三组TGF-β蛋白表达图3.2三组NF-κB蛋白表达*：与对照组比较P<0.05；#：与DM组比较P<0.0529 图3.3三组P-P38蛋白表达图3.4三组P38蛋白表达*：与对照组比较P<0.05；#：与DM组比较P<0.05图3.5三组MMP2蛋白表达图3.6三组MMP9蛋白表达*：与对照组比较P<0.05；#：与DM组比较P<0.0530 3.3讨论3.3.1TGFβ在糖尿病心房重构中的作用转化生长因子（TGFβ）可以有多种细胞产生，其不仅在细胞生长、分化及免疫功能上发挥重要作用，而且在炎症应激和组织修复中也发挥着不可取代的作用。有研究表明，TGFβ可以通过炎症作用使心肌纤维化程度加重甚至可以造成心肌肥厚[69-71]。一项研究结果显示，糖尿病病人在高血糖水平的刺激下，可以促使血管紧张素Ⅱ生成增多，血管紧张素Ⅱ的增多可以刺激肾素血管紧张素醛固酮系统中醛固酮分泌增加，血管紧张素Ⅱ和醛固酮同样可以引起高血压等心脏疾病，导致心房结构重构[72]。另一方面由于血管紧张素Ⅱ也可以刺激心肌细胞产生TGFβ，TGFβ可以通过炎症作用使心肌纤维化程度加重[73]。心肌纤维化与胶原合成增加有关，而TGFβ与胶原合成增加呈正相关，MMPs-TIMPs的平衡需要胶原作用，胶原合成增加后会影响MMPs-TIMPs，使胶原聚集、排列紊乱，从而导致心肌纤维化。而糖尿病状态下，心肌细胞中TGFβ表达的增加，炎症反应增强，进一步使成纤维细胞增多，胶原蛋白合成增多，MMPs-TIMPs失去平衡，心房纤维排列紊乱，进而使房颤发生率增加。本研究结果也显示糖尿病组TGFβ表达增高，进一步促使胶原合成增加，纤维化程度加重，这可能是糖尿病诱发房颤的机制之一。抗炎抗氧化剂别嘌呤醇虽不能直接作用于TGFβ，但其可以作用于炎症反应。我们的研究显示，糖尿病组TGFβ水平明显增高，别嘌呤醇组较糖尿病组则降低。因此我们可以推断糖尿病状态下炎症反应和氧化应激激活可以使心房结构纤维化程度加重，而抗氧化剂别嘌呤醇及其代谢产物可以通过改善炎症反应降低心脏纤维化程度，间接的减少房颤的发生率。3.3.2P38及P-p38在糖尿病心肌重构中的作用丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)有三个亚家族组成，分别是细胞外反应激酶(ExtracellularlyResponsiveKINases,ERKs)，c-Jun氨基末端激酶(JNKs)又称为应激活化蛋白激酶(SAPKs)，以及p38MAPKs[74]。有研究发现蛋白激酶信号通路在心肌细胞肥大的过程中起到至关重要的作用[75]。糖尿病患者微血管损伤严重，高糖损伤的主要是毛细血管，其主要是因为炎症反应使毛细血管基底膜增厚；而糖尿病状态下的炎症反应在心肌间质纤维化和血管周围纤维化的过程中起到关键作用。心肌纤维化使心肌顺应性降低，甚至形成心肌肥厚，影响心肌舒张31 功能；间质及血管周围的纤维化会导致心肌内小动脉血管舒张功能障碍，长期会使管腔腔变窄，进一步造成心肌供血不足。心肌供血不足的心脏病如冠状动脉粥样硬化型心脏病和急性心肌梗死等可以诱发房颤的发生，甚至可以加重房颤。最重要的是因为心房肌细胞细且长，当一些原因造成心肌细胞肥大时如肥厚性心肌病、高血压性心脏病等，细胞表面的钙信号传递到细胞中央时间延长，Ca2+信号的反应时间延长，可能会诱发房颤等心律失常的发生[65]。另一项关于糖尿病大鼠的研究发现大鼠心室肌中JNK，p38以及ERK表达明显较对照组增加[76]。蛋白激酶信号通路通过使心肌细胞肥大，从而使细胞表面的钙信号传递到细胞中央的时间延长，引起房颤等心率市场的发生。我们选择家族中的P38和P-p38进行观测，发现糖尿病组P-p38表达显著增高，而别嘌呤醇组较对照组变化不明显。进一步说明MAPK-ERK信号通路与糖尿病心房纤维化密切相关。P38在三组中的表达差异虽然无统计学意义，但也有明显变化。故我们推测糖尿病房颤的心房重构可能与糖尿病诱导下的P-p38、P38激活有关，抗氧化剂别嘌呤醇可能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶如P-p38、P38的激活来改善心肌重构，降低房颤发生率，但是这种推测的具体机制仍需要进一步探究。3.3.3NF-κB信号通路在糖尿病心房重构中的作用NF-κB为一个转录因子蛋白家族，包括五个亚单位：c-Rel、RelA、RelB、NF-κB1和NF-κB2。这些蛋白质二聚化后形成有功能的NF-κB[77]。没有刺激时，存在于细胞中大部分的NF-κB二聚体与IkBα、IkBβ、IkBε三个抑制因子中的任意一个或多个结合而以无活性状态存在。各种信号如炎症因子、病毒、机械因素和氧化应激等可以通过间接抑制这三个因子来活化NF-κB，活化后的NF-κB进入细胞核与DNA结合，诱导靶基因转录[78]。免疫反应的的早期和炎症反应的各阶段都受NF-κB的调控。故在糖尿病状态下NF-κB通过调节炎症反应改善心肌纤维化程度。有研究表明，糖尿病患者和高脂血症患者更容易使心肌NF-κB的活化，其可能跟高血糖水平有关[79]。也有研究发现高血糖水平可以刺激全身血管活性肽和生长因素的释放，高血糖对细胞因子的作用促使NF-κB表达增多[80]。如上所述，糖尿病状态下ROS产生过多，另一个因素则为脂肪蓄积过多导致脂肪酸降解，降解的脂肪酸在体内过氧化，产生ROS，聚集在心肌细胞引起炎症反应[81]。高血糖、细胞因子还可介导ROS的激活NF-κB，NF-κB参与炎症反应的各个阶段，ROS也在炎症与氧化应激中发挥重要作用。我们的研究结果显示糖尿病兔心房肌NF-κB蛋白表达增多，别嘌呤醇组则较糖尿病组32 表达减少，可能是因为高血糖导致的炎症激活参与心房结构重构，抗炎抗氧化作用的别嘌呤醇可以间接地作用于NF-κB来改善心房重构，减少房颤发生。3.3.4MMP2和MMP9在糖尿病心房重构中的作用氧化应激状态下，各种炎症因子及ROS可以促进成纤维细胞增值，分泌基质金属蛋白酶（MMP），促使胶原合成增多，从而进一步导致心肌重构，增加房颤的诱发率。近年来已经有许多研究表明，心房纤维化与房颤的发生发展之间密切相关[82]。其机制可能是心房局部的纤维化影响心脏电传导功能，其可能使传导速度减慢甚至完全阻滞，进而发生异位起搏，增加心律失常的发生率，而房颤的起搏位置较高，故房颤是心律失常疾病中发病率较高的疾病。由于一些危险因素的作用使心肌细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)原先排列有序的结构被破坏，金属蛋白酶（MMP）分泌过多，促使胶原合成增多，胶原纤维进一步排列紊乱，这一系列的改变最终导致心房发生纤维化[83]。ECM代谢主要靠基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)和金属蛋白酶内源性组织抑制剂(tissueinhibitorsofmetalloproteinases,TIMPs)控制调节。许多外界因素会破坏MMP和TIMPs之间的平衡，影响ECM代谢[84]。MMP2和MMP9是MMPs家族的重要成员，一项研究已经表明，MMPs和TIMPs调节心肌细胞外基质代谢，而细胞外基质印一些因素紊乱后，则会造成胶原蛋白分泌增多，纤维排列紊乱，进一步导致心房结构重构加重，即房颤发生率增加，而MMP2和MMP9是MMPs家族的成员，可以控制ECM代谢，故MMP2和MMP9可以参与房颤的诱发[85-86]。我们的研究结果为MMP2和MMP9糖尿病组较对照组明显增加，而别嘌呤醇组与对照组的变化不大，说明糖尿病在氧化应激状态下，诱发各种炎症因子及ROS促使成纤维细胞增值，分泌基质金属蛋白酶（MMP），促使胶原合成增多，纤维化程度加重，进一步促使房颤发生。而别嘌呤醇具有抗炎抗氧化作用，可以抑制ROS产生，因此能够改善心房肌重构，减少房颤发生。3.3.5别嘌呤醇减少房颤发生的分子机制有研究结果显示炎症和氧化应激可能是糖尿病与房颤的病理生理过程的关键环节。我们前期工作结果表明炎症和氧化应激在糖尿病诱导的心房肌重构中发挥重要作用，其甚至可以介导房颤的发生[9]。其主要是在黄嘌呤氧化酶的介导下产生，故其作为嘌呤代谢的终产物能够反映黄嘌呤氧化酶的活性。近年的研究表明黄嘌呤氧化酶（XO）的激活可导致O2-产生过多，O2-与NO结合生成OONO-，从而激发氧化应激反应，进一步导致心房结构性重构，促进房颤发生。33 别嘌呤醇及其代谢产物氧嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从而抑制分子氧作为电子受体将黄嘌呤转化为尿酸，同时抑制生成超氧化物阴离子，来阻止体内氧化应激激活。越来越多的研究表明高尿酸血症是高血压、房颤及急性冠脉综合征等心脏疾病的独立危险因素[87-90]。尿酸含量增高不仅会造成内皮损伤，还可以使血管紧张素II生成增加。此外，免疫反应的的早期和炎症反应的各阶段都受NF-κB的调控。而NF-κB是炎症与氧化应激相互作用的重要介质。氧化应激激活可以使NF-κB生成增加，活化的NF-κB可以促进炎症因子的转录，使炎症因子生成增多[91]。别嘌呤醇作为黄嘌呤氧化酶抑制剂，可以抑制尿酸的生成，从而减少血管紧张素II生成，进一步影响核转录因子NF-κB在心肌重构中发挥的作用。另外抗氧化剂别嘌呤醇还可以抑制炎症和黄嘌呤氧化酶的作用，改善心肌纤维化及心肌细胞肥大，从而预防房颤发生。3.4小结心房纤维化与房颤的发生发展之间密切相关，其机制可能是心房局部的纤维化影响心脏电传导功能，其可能使传导速度减慢甚至完全阻滞，进而发生异位起搏，增加心律失常的发生率，而房颤的起搏位置较高，故房颤是心律失常疾病中发病率较高的疾病。糖尿病本身属于炎症反应，而炎症和氧化应激作用会导致心房肌纤维化，甚至可以诱发房颤。TGFβ、P38及P-p38、NF-κB、MMP2等在心房纤维化和心肌肥厚的过程中发挥了重要作用。黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇及其代谢产物氧嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从而抑制O2-产生过多，进一步使O2-与NO结合生成OONO-减少，同时抑制尿酸的生成，减少OONO-的生成，即减少了ROS的生成，改善了糖尿病引起的炎症和氧化应激，进一步减轻心房肌纤维化程度，从降低糖尿病兔房颤的发生率。但炎症及氧化应激如何诱发房颤以及别嘌呤醇如何改善糖尿病状态下的炎症和氧化应激来降低房颤发生率的具体机制我们仍需要进一步研究。34 结论氧化应激及细胞内钙信号通路在糖尿病心房电重构、结构重构及房颤的发生发展中发挥重要作用；同时，糖尿病氧化应激状态下，ROS和炎症因子产生增多，进一步促进成肌纤维细胞增殖及心房肌纤维化。通过抗炎抗氧化作用的黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善糖尿病状态下的炎症反应，从而间接的减轻心房电重构和结构重构，减少房颤发生。糖尿病病理状态下炎症和氧化应激激活导致心房结构重构，心房肌纤维化，并导致房间传导时间延长，心房颤动发生率增加。别嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧酶活性拮抗炎症和氧化应激，改善心房肌纤维化，预防房颤发生。本课题阐明氧化应激在糖尿病心房电重构和结构性重构及房颤发生的作用以及黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对心房结构重构和房颤的干预作用，国内外未见相关报道，研究结果将有助于深入阐明糖尿病导致房颤的具体机制，为房颤的防治提供新的思路和干预靶点。但本研究也存在一定的局限性，我们的实验选用的是健康成年大白兔，可能存在种属之间的区别。我们在实验过程中人为因素造成的实验结果的偏差，以及我们选用的实验动物是数量较少造成的结果偏差。我们主要探讨的是黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对糖尿病兔所诱导的房颤的作用，而忽略了别嘌呤醇的剂量对实验的影响以及实验条件的作用，未能明确炎症氧化应激导致心房纤维化的明确分子机制。35 参考文献[1]HuD,SunY.Epidemiology,riskfactorsforstroke,andmanagementofatrialfibrillationinChina[J].JAmCollCardiol,2008,52:865-868.[2]LipGY,TseHF,LaneDA.Atrialfibrillation[J].Lancet,2011Dec9,[Epubaheadofprint].[3]KorantzopoulosP,KolettisTM,GoudevenosJA,etal.Errorsandpitfallsinthenon-invasivemanagementofatrialfibrillation[J],IntJCardiol,2005,104:125–130.[4]KrijtheBP,KunstA,BenjaminEJ,etal.ProjectionsonthenumberofindividualswithatrialfibrillationintheEuropeanUnion,from2000to2060[J].EurHeartJ,2013,4:2746–2751.[5]HuD,SunY.Epidemiology,riskfactorsforstroke,andmanagementofatrialfibrillationinChina[J].JAmCollCardiol,2008,52:865-868.[6]MovahedMR,HashemzadehM,JamalMM.Diabetesmellitusisastrong,independentriskforatrialfibrillationandflutterinadditiontoothercardiovascu-lardisease[J].IntJCardiol,2005,105(3):315-318.[7]AksnesTA,SchmiederRE,KjeldsenSE,etal.Impactofnewonsetdiabetesmellitusondevelopmentofatrialfibrillationandheartfailureinhigh-riskhyper-tension(fromtheVALUEtrial)[J].AmJCardiol,2008,101:634–638.[8]UxleyRR,AlonsoA,LopezFL,etal.Type2diabetes,glucosehomeostasisandincidentatrialfibrillation:theAtherosclerosisRiskinCommunitiesstudy[J].Heart,2012,98(2):133-138.[9]PickupJC,CrookMA.IstypeIIdiabetesmellitusadiseaseoftheinnateimmunesystem[J].Diabetologia,1998,41(10):1241-1248.[10]GoldbergRB.Cytokineandcytokine-likeinflammationmarkers,endothelialdysfunction,andimbalancedcoagulationindevelopmentofdiabetesanditscomplications[J].JClinEndocrinolMetab,2009,94(9):3171-3182.[11]EhsesJA,Böni-SchnetzlerM,FaulenbachM,etal.Macrophages,cytokinesandbeta-celldeathinType2diabetes[J].BiochemSocTrans,2008,36(3):340-342.36 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综述高尿酸血症与心血管疾病的相关性研究心房颤动（房颤）是目前最常见的心律失常疾病。随着社会老龄化人口的增多，房颤已经成为全社会关注的公共问题。随着房颤危险因素的不断增加，房颤发生率也逐年增多。房颤不仅可以诱发恶性心律失常，还可加重其他心脏疾病如充血性心力衰竭，甚至长期房颤形成的血栓脱落阻塞脑及其他器官，其不但会影响患者生活，严重者可增加心脏病患者死亡率，目前已经成为严重危害人类的重大社会问题[1-3]。房颤多在器质性心脏病的基础上发生，但少数房颤却没有原因。然而，房颤的病因多样，发病机制复杂，尽管治疗房颤的非药物研究如导管消融术，房室结消融术及起搏治疗等已经广泛被患者熟知甚至使用，但抗心律失常药物依然是治疗房颤的基础。房颤患者虽长期使用抗心律失常药物控制房颤的进展，但房颤仍会有恶化趋势，同时抗心律失常药物的副作用较大，所以我们急需新药物及其他方法来进一步预防和治疗房颤。房颤的发生机制目前观点倾向于炎症和氧化应激引起心肌细胞外基质胶原分泌增加，纤维化加重，导致心房发生电重构和结构性重构，进一步促进房颤的诱发[4-5]。许多研究都已经表明心血管疾病如高血压、冠心病及慢性心力衰竭等均有炎症和氧化应激反应的参与。氧化应激是指体内氧化系统和抗氧化系统失衡，氧化作用增强，产生大量氧化中间产物，其中活性氧自由基（ROS）具有损伤细胞，参与衰老和疾病发生的作用。机体在危险因素的刺激下，活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等活性分子产生增多，自身抗氧化系统不能抵御过多的氧化中间产物，激活氧化应激反应，进一步导致核酸、蛋白质、脂类的直接氧化和损伤，细胞损伤，也可以加重心脏疾病如动脉粥样硬化、心肌肥厚等，还可以作为分子信号激活细胞内多种应激信号通路。ROS的一般有两个来源：大多数真核细胞中的线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，还有吞噬体和对D-氨基酸氧化也可以产生ROS，另外，黄嘌呤氧化酶在ROS的产生中发挥重要作用。在体内嘌呤代谢过程中，终产物尿酸的生成需要黄嘌呤氧化酶激活的介导，因此，尿酸水平可以间接反映黄嘌呤氧化酶的活性，尿酸还可以破坏内皮细胞，促进血管紧张素II生成，导致高血压等其他心脏疾病。有研究结果显示黄嘌呤氧化酶（XO）激活可以促使ROS的生成，介导45 体内氧化应激反应，促进心肌纤维化，从而导致心房肌结构重构，进一步诱导房颤的发生。本文主要探究高尿酸血症及黄嘌呤氧化酶对房颤的发生发展的影响作一综述。一、高尿酸血症、黄嘌呤氧化酶在心血管疾病中的作用尿酸与心血管疾病之间的相关性一直是争论很多年的话题。许多研究表明高尿酸血症已经成为心血管相关疾病如冠状动脉性心脏病心房颤动、高血压、糖尿病和充血性心力衰竭等的独立危险因素[6-8]。高尿酸血症时，尿酸盐沉积、破坏胰岛β细胞及损伤肾小球动脉可以导致代谢综合症、冠心病及肾脏疾病。此外，高尿酸血症常与高血糖等同时存在，而这些代谢紊乱又可以反向调节ROS的生成。嘌呤代谢主要是次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为黄嘌呤，黄嘌呤再在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为尿酸，因此尿酸可以反映黄嘌呤氧化酶的活性[9]。血清尿酸是人类嘌呤代谢的终产物，可以通过肾功能检测到，而心血管系统内主要是内皮细胞产生尿酸。在一定的刺激条件下，细胞内过多的尿酸会激活NADPH氧化酶产生ROS，促进氧化应激反应的发生，尿酸也能激活RASS系统增强氧化应激反应。尿酸不但参与自身免疫反应，而且也参与炎症的发生以及氧化应激反应的激活[10-14]。黄嘌呤氧化酶（XO）产生O2-与NO结合生成OONO-，心肌细胞在缺血损伤时，黄嘌呤会产生过多，黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为尿酸，尿酸可以进一步分解为氨碳酰基自由基和OONO-，激活氧化应激反应[9]。超氧化物阴离子在铁和超氧化物歧化酶的介导下生成过氧化氢。活性氧不但会引起细胞的损坏，甚至会造成细胞的凋亡，进一步引起机体的炎症反应，激活氧化应激反应，从而导致心肌结构重构和电重构，诱导房颤的发生发展。二、炎症和氧化应激在心房纤颤的作用许多研究表明，高尿酸血症与炎症氧化应激反应存在紧密的关系，其可以反应体内氧化应激的程度及观测的指标[9,15-16]。近年来，已经有许多研究证明炎症和氧化应激参与心血管疾病如急性冠脉综合征的发生发展。而氧化应激的激活是指抗氧化系统不能清除过多的分子氧，炎症细胞分泌增多，氧自由基（ROS）46 生成增加，刺激细胞增殖分化和凋亡，进一步引起疾病。体内活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）在应激情况下生成增加，机体自身不能清除这些过多的氧化产物，过多的ROS和RNS损伤细胞、影响蛋白质的表达，引起机体疾病的发生，甚至可以加重心脏疾病如动脉粥样硬化、心肌肥厚等，还可以作为分子信号激活细胞内多种应激信号通路。ROS包括超氧阴离子（.O2-）和过氧化氢（H2O2）等；RNS包括一氧化氮（.NO）和过氧化亚硝酸盐（.ONOO-）等。机体有两大抗氧化系统，分别是酶抗氧化系统如超氧化物歧化酶（SOD）和非酶抗氧化系统如维生素C、E。ROS的一般有两个来源：大多数真核细胞中的线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，还有吞噬体和对D-氨基酸氧化也可以产生ROS。我们先前的研究发现炎症氧化应激反应可以促使心房肌纤维化程度加重，从而导致房颤的发生。一项动物实验探究了心房快速起搏模型，并进一步探究了左心房超氧阴离子的产生及变化情况[17]，其结果为快速起搏组左心房超氧阴离子含量明显高于窦性心律组，NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶的水平也明显升高，相反NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶被抑制后超氧阴离子含量也随之降低。这表明NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶在炎症氧化应激反应中起着关键作用。随后，又有研究发现房颤患者血浆中活性氧代谢物明显升高，活性氧是氧化应激反应的重要物质[18]。另一临床研究发现，心脏外科术后许多患者会发生心房纤颤，测定其右心房NADPH氧化酶活性发现明显高于术后无房颤发生者[19]。尿酸主要是在黄嘌呤氧化酶的介导下产生，故其作为嘌呤代谢的终产物能够反映黄嘌呤氧化酶的活性。越来越多的研究表明高尿酸血症是高血压、房颤及急性冠脉综合征等心脏疾病的独立危险因素。尿酸含量增高不仅会造成内皮损伤，还可以使血管紧张素II生成增加。我们的前期研究发现高血压患者血浆尿酸水平越高发生房颤发生房颤的几率越大[20]。此外，自生免疫反应和炎症反应的均受NF-κB的调控。而NF-κB是炎症与氧化应激相互作用的重要介质。氧化应激激活可以使NF-κB生成增加，活化的NF-κB可以促进炎症因子的转录，使炎症因子生成增多。炎症氧化应激诱发房颤的具体机制依然不清楚，我47 们推测氧化应激状态下，NF-κB诱导产生过多的ROS，使成肌纤维细胞生成过多，胶原合成增加，心肌纤维化程度加重，同时房颤诱发率增加。三、高尿酸血症、黄嘌呤氧化酶在心房纤颤的作用我们的前期研究发现高血压患者发生房颤者血清尿酸水平明显升高，同时也证明了高尿酸血症与高血压患者房颤的发生密切相关，故可以明确高血压患者中同时伴有高尿酸血症在更容易发生房颤[20]。多项临床研究结果显示高尿酸血症可以诱发房颤，甚至介导房颤的复发。一项临床研究发现，与对照组相比阵发性房颤组和永久性房颤组患者血浆尿酸水平明显升高，该实验说明血尿酸水平与房颤发生呈正相关，同时提示高尿酸血症是永久性房颤的独立危险因子[21]。一项临床研究发现40岁以上的入选人群血清尿酸水平越高房颤的发生率也也会随之增高[22]。随后多项研究证实高尿酸血症与心房颤动呈正相关。一项研究发现在女性中，血浆尿酸水平越高其发生房颤的可能性越大，在男性中这种相关性则不明显，该研究说明不同性别血浆尿酸水平诱发房颤的发生率存在明显的差异，这种相关性在女性中更加明显[23]。一项研究入选15382例未发生过房颤的人群，随访后发现高尿酸血症者发生房颤的概率越大，其中女性现对于男性更加明显，因此推测高尿酸血症可能是房颤发生的独立危险因素[24]。随访房颤患者射频消融术后发生房颤的情况发现血浆尿酸水平越高发颤复发率越大，可作为房颤复发的预测因素[25-26]。血清尿酸水平≥8mg/dl作为预测房颤发生的指标，尿酸水平越高发生房颤的发生率越大，同时尿酸还可以生成分子氧，促进氧化应激反应和炎症反应，进一步导致心房电重构，诱发房颤的发生[27]。当血清尿酸水平>9mg/dl时，尿酸转运蛋白水平显著升高，该研究表明尿酸转运蛋白1可能介导尿酸诱发房颤。Chao等6年的随访发现高尿酸血症较对照组房颤发生率明显增加，血清尿酸水平与左房直径呈相关性，该研究推测高尿酸血症与房颤发生独立相关[28]。与此同时，另一些研究发现高尿酸血症在2型糖尿病患者房颤的发生中起到关键作用[29]。48 有研究表明高尿酸血症与房颤发生密切相关，同时其也是脑卒中发生的危险因素，尤其在无症状脑梗塞患者中更为明显[30-31]。另一项临床研究随访未使用任何抗凝药物的房颤患者发生缺血性脑卒中的概率，为期3年，结果约15%房颤患者发生了缺血性事件，给予CHA2DS2-VASc评分后，发现CHA2DS2-VASc评分较低的房颤患者血浆尿酸水平越高发生缺血性脑卒中的概率越大，而大于4分的房颤患者血浆尿酸水平对缺血性脑卒中的影响反而较小，该研究表明高尿酸血症与CHA2DS2-VASc评分较低房颤患者发生缺血性脑卒中的概率呈正相关[32]。此外，有研究表明高尿酸血症与阻塞性睡眠呼吸暂停综合症（obstructivesleepapnea，OSA）患者房颤的发生呈正相关，并推测OSA患者房颤的发生率可以以尿酸水平作为指标[33]。一项动物实验探究了心房快速起搏模型，并进一步研究了左心房超氧化物的发生及变化情况[17]，其结果为起搏模型组左心房超氧阴离子含量明显高于窦性心律组，NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶的水平也明显升升高，相反NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶被抑制后超氧阴离子含量也随之降低。另一临床研究发现，心脏外科术后许多患者会发生心房纤颤，测定其右心房NADPH氧化酶活性发现明显高于术后无房颤发生者，但给与黄嘌呤氧化酶抑制剂后右心房超氧化物含量无明显变化。上述两个实验结果之所以不同我们考虑为两者研究部位存在差异。先前两项动物实验发现猪的房颤模型左有心房NO的含量有着显著差异，左心房NO含量较窦性心律者明显下降，而右心房与对照组间差异较小，因此我们推断可能因为左心房存在更多对黄嘌呤氧化酶更敏感的物质，从而使氧化应激反应更明显[34]。四、心房颤动的抗炎治疗尽管治疗房颤的非药物研究如导管消融术，房室结消融术及起搏治疗等已经广泛被患者熟知甚至使用，但抗心律失常药物依然是治疗房颤的基础。房颤患者虽长期使用抗心律失常药物控制房颤进展，但房颤仍会有恶化趋势，同时抗心律失常药物的副作用较大，所以我们急需新药物及其他方法来预防和治疗房颤。炎症和氧化应激在房颤的发生发展中发挥了关键作用,但具体机制仍不清楚[35]。房颤患者与无心律失常疾病的患者相比，C-反应蛋白等炎性指标增高，49 房颤时间越长炎性指标越高；另外发现炎性指标较高的患者射频消融后房颤的复发率越高。有研究表明,他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂及血管紧张素受体拮抗剂、糖皮质激素及多不饱和脂肪酸等抗炎药物对房颤发生发展有一定的作用[36-37]。一项动物实验结果显示心包炎狗模型服用阿托伐他汀可以明显降低房颤的发生率，甚至可以缩短房颤的持续时间、改善心肌纤维化程度以及改善心包炎症等作用[38]。一项荟萃分析结果显示使用ACEIs和ARBs治疗心力衰竭和高血压左室肥厚患者的同时，ACEIs和ARBs还可以降低房颤的发生率，甚至可以减缓房颤的进展[39]。另外一项动物实验证明ACEIs或ARBs可以改善心房结构重构和电重构，从而预防房颤的发生[40]。一项临床试验选取104例射频消融术后服用普罗帕酮的患者，随访2年，随机分为两组，一组给予甲强龙，另一组给予安慰剂，观察房颤的复发情况，安慰剂组房颤的复发率及炎症指标CRP水平明显高于甲强龙组，故推测糖皮质激素类药物可以预防射频消融术后房颤的复发，同时也可以通过改善炎症反应，进而改善心房结构重构，延缓房颤的发生发展[41]。虽然抗心律失常药物及非药物研究已经取得了很大的进展，但是房颤的发生及复发率并没有减少，房颤患者的数量反而是增加的。因此我们需要更有效的方法来预防和治疗房颤。而这些具有潜在抗炎作用的药物在预防和治疗房颤的发生发展中可能起到关键作用，因此我们需要对这些抗炎药物进一步研究。五、总结与展望以上研究表明血浆高尿酸水平可能是房颤发生和发展的重要指标，炎症和氧化应激可能参与高尿酸血症诱发的房颤，但具体机制尚不明确。高尿酸血症可以作为房颤发生发展的重要预测因素，降低尿酸水平的黄嘌呤氧化酶抑制剂和具有潜在抗炎作用的药物可能成为预防和治疗心房颤动重要组成部分[42-43]。综述参考文献[1]KrijtheBP,KunstA,BenjaminEJ,etal.Projectionsonthenumberofindividuals-withatrialfibrillationintheEuropeanUnion,from2000to2060[J].Eur.HeartJ,2013,4:2746–2751.[2]LipGY,TseHF,LaneDA.Atrialfibrillation[J].Lancet,2012,379:648–661.[3]HuD,SunY.Epidemiology,riskfactorsforstroke,andmanagementofatrialfibri50 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个人简历姓名：性别：女赵建平出生年月：1989年4月籍贯：河北邯郸主要学习和工作经历：（从本科开始）2008年9月-2013年6月承德医学院中医系，获中西医学士学位2013年9月-2016年5月天津医科大学研究生院，在读56