《灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：密级：否＿爭十嫩孝ＨＵＡＺＨＯＮＧＡＧＲＩＶＥＲＳＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＴＹ硕士学位论文ＭＡＳＴＥＲ’ＳＤＥＧＲＥＥＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ灰葡萄孢菌株ＨＢｒ－４７０中ｓｔ真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究ＳＴＵＤＩＥＳＯＮＴＨＥＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳＦ－ＡＮＤＭＹＣＯＶＩＲＵＥＳＯＢＯＴＲＹＴＩＳＣＩＮＥＲＥＡＨＢｓｔｒ４７０贺国园研究生：ＣＡＮＤＩＤＡＴＥ：ＨＥＧＵＯＹＵＡＮ学号：２０１５３０１１１０１８２ＳＴＵＤＥＮＴＮＯ．：专业：植物病理学ＭＡＪＯＲ：ＰＬＡＮＴＰＡＴＨＯＬＯＧＹ导师：李国庆教授吴明德讲师ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲ：ＤＲＳ．ＬＩＧＵＯＱＩＮＧａｎｄＷＵＭＩＮＧＤＥ中国武汉ＷＵＨＡＮ，ＣＨＩＮＡ二○一八年六月ＪＵＮＥ２０１８， 分类号：密级：否华中农业大学硕士学位论文灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究StudiesontheBiologicalCharacteristicsandMycoviruesofBotrytiscinereaHBstr-470研究生:贺国园学号:2015301110182指导教师:李国庆教授吴明德讲师指导小组:黄俊斌教授付艳苹教授董五辈教授罗朝喜教授徐文兴教授专业：植物病理学研究方向：植物病害生物防治获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2018年6月华中农业大学植物科学技术学院二○一八年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书ｍ如需縣，體时间ｓ否独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定一＾与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。１研究生签名时间：年￥月ｆ曰Ｉ丨爾每学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印。、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文（即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文）在解密后适用于本授权书。学位论文作者签导师签名賓｜蜀签名曰期年＜月／＾签名曰期：年５月义曰注：直请将本表接装订在学位论文的扉页和目录之间 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究目录摘要....................................................................................................................................iAbstract...............................................................................................................................iii缩略词表（Abbreviation）................................................................................................v第一章文献综述...............................................................................................................11葡萄孢属真菌.................................................................................................................12灰葡萄孢群体多样性.....................................................................................................23植物灰霉病的危害与流行.............................................................................................24植物灰霉病的防治.........................................................................................................34.1综合防治...............................................................................................................44.2生物防治...............................................................................................................44.3化学防治...............................................................................................................55真菌病毒的研究进展.....................................................................................................65.1真菌病毒的分类...................................................................................................65.2真菌病毒的传播...................................................................................................65.3植物病原真菌的弱毒现象...................................................................................65.4葡萄孢属中真菌病毒研究...................................................................................76本课题的由来.................................................................................................................77本研究的目的和意义.....................................................................................................8第二章灰葡萄孢HBstr-470生物学特性研究................................................................91试验材料.........................................................................................................................91.1供试菌株和培养基...............................................................................................91.1.1供试菌株.....................................................................................................91.1.2供试培养基.................................................................................................91.2供试植物...............................................................................................................91.3其他试剂药品.......................................................................................................92试验方法.........................................................................................................................92.1菌落形态的观察和菌丝生长速率的测定...........................................................92.2分生孢子产量与大小的测定.............................................................................10I 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.3分生孢子萌发率和芽管长度的测定.................................................................102.4单菌落产孢动态观察.........................................................................................102.5分生孢子致病力的测定.....................................................................................102.6分生孢子竞争性致病力的测定.........................................................................112.7数据的统计方法.................................................................................................113结果与分析....................................................................................................................113.1灰葡萄孢菌株HBstr-470的培养特性和弱致病性..........................................113.2灰葡萄孢菌株HBstr-470的分生孢子产量和大小..........................................123.3灰葡萄孢菌株HBstr-470的分生孢子萌发能力..............................................133.4灰葡萄孢菌HBstr-470单孢菌落的产孢动态..................................................133.5灰葡萄孢菌株HBstr-470分生孢子的致病力及竞争力..................................144讨论...............................................................................................................................16第三章灰葡萄孢HBstr-470中真菌病毒的鉴定及生物学特性研究..........................171实验材料.......................................................................................................................171.1供试菌株和培养基.............................................................................................171.1.1供试菌株...................................................................................................171.1.2培养基.......................................................................................................171.2酶和试剂材料.....................................................................................................171.3供试植物.............................................................................................................181.4载体和引物.........................................................................................................192试验方法.......................................................................................................................192.1灰葡萄孢菌丝培养及收集.................................................................................192.2灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的提取与纯化................................................192.3大于3.0kb片段cDNA的克隆.........................................................................202.3.1病毒cDNA片段库的构建.......................................................................202.3.2大片段dsRNA中间部分序列的cDNA克隆.........................................212.3.3dsRNA末端cDNA序列的获取...............................................................212.4小于3.0kb片段cDNA的克隆.........................................................................222.5目标cDNA片段的T载体连接转化................................................................232.5.1cDNA的A-Tailing及与T载体的连接...................................................23II 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究2.5.2目标载体转化大肠杆菌感受态细胞.......................................................232.5.3重组质粒的检测.......................................................................................232.6Nortnern杂交.......................................................................................................242.6.1电泳、转膜及固定...................................................................................242.6.2GE探针的标记..........................................................................................242.6.3预杂交与杂交...........................................................................................252.6.4GE洗膜及CDP-star显色.........................................................................252.7灰葡萄孢HBstr-470中真菌病毒的垂直传播..................................................252.8平板对峙培养介导的病毒的水平传播.............................................................262.9原生质体融合介导的病毒的水平传播.............................................................262.10不同灰葡萄孢菌株遗传背景的RAPD分析....................................................273结果与分析...................................................................................................................273.1灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的检测及序列分析........................................273.1.1SsHV2/HBstr-470的全长cDNA序列分析.............................................293.1.2BcHV1/HBstr-470的全长cDNA序列分析.............................................303.1.3BcVV1/HBstr-470的全长cDNA序列分析.............................................303.1.4BcRV2/HBstr-470的全长cDNA序列分析.............................................313.1.5BcPV2/HBstr-470的全长cDNA序列分析.............................................323.2灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的垂直传播....................................................343.3灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的水平传播....................................................344讨论...............................................................................................................................39第四章灰葡萄孢HBstr-470分生孢子形成阶段相关基因分析..................................411试验材料.......................................................................................................................411.1供试菌株和培养基.............................................................................................411.1.1供试菌株...................................................................................................411.1.2供试培养基...............................................................................................411.2试剂材料.............................................................................................................412试验方法.......................................................................................................................412.1样品收集.............................................................................................................412.2总RNA的提取...................................................................................................41III 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.3文库构建和Illumina测序..................................................................................412.4原始数据分析与参考序列比对.........................................................................422.5基因与转录本定量分析.....................................................................................422.6差异表达基因筛选.............................................................................................423结果与分析...................................................................................................................433.1RNA质量检测.....................................................................................................433.2测序质量评估.....................................................................................................433.3菌株HBstr-470产孢阶段转录组分析..............................................................453.3.1菌株HBstr-470产孢阶段差异表达基因分析........................................453.3.2菌株HBstr-470产孢阶段差异表达基因GO功能分析.........................463.3.3菌株HBstr-470产孢阶段差异表达基因KEGGpathway富集分析.....473.4菌株HBstr-470和B05.10的比较转录组分析.................................................483.4.1差异表达基因的筛选...............................................................................483.4.2差异表达基因的GO功能注释................................................................483.4.4差异表达基因的聚类分析.......................................................................484讨论...............................................................................................................................51第五章总结与展望.........................................................................................................53参考文献...........................................................................................................................55附录1PCR引物序列.......................................................................................................66附录2病毒名称和序列号..............................................................................................69附录3病毒全长cDNA序列克隆模式图......................................................................71致谢.................................................................................................................................73IV 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究摘要葡萄孢属真菌的寄主范围十分广泛，能侵染1400多种植物，引起重要的灰霉病，造成重大的经济损失。本文主要研究了灰葡萄孢HBstr-470的生物学特性，对其中的真菌病毒进行了分子鉴定，并研究了病毒的传播特性和对灰葡萄孢生物学特性所造成的影响。此外，本文通过RNA-seq初步筛选分析了菌株HBstr-470菌落分生孢子产生阶段的差异表达基因。菌株HBstr-470在PDA上生长速度缓慢，菌落形态表现异常，形成大量的气生菌丝并产生丰富的分生孢子。分生孢子正常萌发，且形成的菌落再次无性繁殖形成分生孢子的性状稳定，分生孢子的产生不受光照条件限制且早于强毒菌株B05.10。但分生孢子在本氏烟叶片上的致病力与竞争性致病力都弱于强毒菌株B05.10。菌株HBstr-470由5种真菌病毒复合侵染，分别为Sclerotiniasclerotiorumhypovirus2/HBstr-470（SsHV2/HBstr-470）、Botrytiscinereahypovirus1/HBstr-470（BcHV1/HBstr-470）、Botrytiscinereavictorivirus1/HBstr-470（BcVV1/HBstr-470）、BotrytiscinereaRNA2/HBstr-470（BcRV2/HBstr-470）和Botrytiscinereapartitivirus2/HBstr-470（BcPV2/HBstr-470）。其中，SsHV2/HBstr-470、BcHV1/HBstr-470属于Hypoviridae病毒科，BcVV1/HBstr-470属于Totiviridae病毒科中的Victorivirius；BcRV2/HBstr-470与RnQV1/W1075的同源关系较近，但并未发现编码CP的dsRNA片段，可能为Quadrivirade的一个新成员；BcPV2/HBstr-470在系统进化上与Partitiviridae病毒科中成员构成一大支，是Partitiviridae中的一个新成员。菌株HBstr-470中的真菌病毒能通过分生孢子稳定地垂直传播给后代。通过对水平传播后获得的衍生菌株中真菌病毒种类及相关生物学进行分析发现：SsHV2/HBstr-470、BcVV1/HBstr-470可能与分生孢子产量增加有关；BcHV1/HBstr-470与致病力衰退有关；BcRV2/HBstr-470与生长速率的降低、分生孢子产量的增加和致病力的衰退有关；BcPV2/HBstr-470与致病力衰退和分生孢子产量的增加有关。菌株HBstr-470分生孢子产生阶段（48~72h）中的368个DEGs富集在氧化还原、氧化还原酶活性、血红素结合和四吡咯结合进程，表明氧化还原相关基因参与菌株HBstr-470分生孢子产生过程；KEGG分析表明基因显著富集在核糖体和氨基糖与核糖代谢通路。此外，比较转录组分析发现：菌株HBstr-470特异性表达的DEGsi 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文中涉及病毒的传播、转录和质膜的融合，可能与菌株HBstr-470中真菌病毒通过分生孢子的形成垂直传播到后代有关。关键词：灰葡萄孢菌株HBstr-470；弱致病力；真菌病毒；差异表达基因ii 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究AbstractThehostrangeofBotrytisspp.iswide,whichincludesover1400plantspecies,causingdramaticeconomicloss.Inthisstudy,weinvestigatedthebiologicalcharacteristicsofB.cinereastrainHBstr-470,themolecularcharacteristicsofvirusesinstrainHBstr-470anddeterminedtheviraltransmissionabilityandtheeffectsofviralinfectiononthebiologyofB.cinerea.Moreover,wealsoscreenedandanalyzedthedifferentiallyexpressedgenesintheconidiationprogressofstrainHBstr-470throughRNA-seq.B.cinereastrainHBstr-470showedlowmycelialgrowthrateandabnormalcolonymorphology,andproducedlotsofaerialhyphaeandabundantconidiaonPDAplate.TheconidiaproductedbystrainHBstr-470germinatedregularlywiththegerminationrateofover90%.Theproductionofconidiaonsingle-conidiumcolonieswasmuchsoonerthanvirulentstrainB05.10andstable,andalsowasindependentoflight.However,thevirulenceofstrainHBstr-470onNicotianabenthamianawassignificantlyimpairedcomparedwithstrainB05.10.B.cinereastrainHBstr-470wasco-infectedbyfivemycoviruses,includingSclerotiniasclerotiorumhypovirus2/HBstr-470(SsHV2/HBstr-470),Botrytiscinereahypovirus1/HBstr-470(BcHV1/HBstr-470),Botrytiscinereavictorivirus1/HBstr-470(BcVV1/HBstr-470),BotrytiscinereaRNA2/HBstr-470(BcRV2/HBstr-470)andBotrytiscinereapartitivirus2/HBstr-470(BcPV2/HBstr-470).SsHV2/HBstr-470andBcHV1/HBstr-470wereclustedintothefamilyHypoviridae.BcVV1/HBstr-470wasmostcloselyrelatedtomembersofthegenusVictorivirusinthefamilyTotiviridae.BcRV2/HBstr-470,lackingthecorrespondingsegmentencodedCPinRnQV1/W1075,wasthemostcloselyrelatedtoRnQV1/W1075.ItwassupposedthatBcRV2/HBstr-470mightbeanovelmemberinQuadriviradae.BcPV2/HBstr-470wasclusteredintothefamilyofPartitiviridaewithothermembersinthefamily.Inaddition,mycovirusesfromstrainHBstr-470canbestablyverticaltransmissedtoconidia.Accordingtotheanalysisbetweenviralinfectionandthebiologicalcharacteristicsofderivativeisolatesobtainedthroughhorizontaltransmissionfordifferentdonorstrains,wefoundthatiii 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文SsHV2/HBstr-470andBcVV1/HBstr-470positivelyregulateconidiationofB.cinerea;BcHV1/HBstr-470wasprobablyrelatedtothehypovirulence;BcRV2/HBstr-470hadaninfluenceonlowmycelialgrowth,reducingvirulenceandhighsporulationrates;andBcPV2/HBstr-470wasassociatedwithreducedpathogenicityandincreasedproductionofconidia.Atotalof368differentiallyexpressedgenesintheconidiationprogressofstrainHBstr-470wereenrichedinoxidation-reductionprocess,oxidoreductaseactivityprocess,hemebindingprocessandtetrapyrrolebindingprocess,itwassusposedthatDEGsinoxidation-reductionprocesswereinvovedinconidiationprogress.DEGswereenrichedinribosomeandaminosugarandnucleotidesugarmetabolismspathwayintheKEGGpathwayanalysis.Moreover,thespecificDEGsofstrainHBstr-470areinvolvedintransmissionofmycoviruses,viraltranscriptionandplasmamembranefusion,whichisprobablyassociatedwiththeverticaltransmissionofthemycovirusesinstrainHBstr-470fromhyphaetoconidia.Keyword:BotrytiscinereastrainHBstr-470,hypovirulence,mycoviruses,differentiallyexpressedgeneiv 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究缩略词表（Abbreviation）缩写英文全名中文名称AmpAmplicillim氨苄青霉素bpBasepair碱基对cDNAComplementaryDNA互补脱氧核糖核酸CTABCetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三乙基溴化铵DaDalton道尔顿dATPDeoxyadenosineTriphosphate脱氧腺苷三磷酸ddH2ODoubledistilledwater双蒸水DEPC-H2ODiethylpyrocarbonatewater焦碳酸二乙酯处理水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyriboNucleosideTriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸dsRNAdouble-strandedRNA双链核糖核酸EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸hygHygromycin潮霉素LALuria-BertaniAgarLA培养基LBLuria-BertanimediumLB培养基ntnucleotide核苷酸NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation国家生物技术信息中心ORFOpenReadingFrame开放阅读框PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PDApotatodextroseagar马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDBpotatodextrosebroth马铃薯葡萄糖液体培养基qRT-PCRQuantitativerealtimePCR实时定量PCRr/minrotationperminute每分钟转速RNARibonucleicacid核糖核酸RT-PCRReversetranscriptionPCR反转录PCRSDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠WAWateragar水琼脂v 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究第一章文献综述1葡萄孢属真菌葡萄孢属（Botrytisspp.）是PierAntonioMicheli在1729年首次命名的，到2004年已经确定了28个种（BeeverandWeeds2004）。近些年来，许多新种相继被发现和鉴定，例如B.fabiopsis、B.sinoallii、B.caroliniana、B.sinoviticola、B.deweyae、B.pyriformis以及B.euroamericana。其中，B.fabiopsis与B.fabae的在PDA上的菌丝生长速度类似，菌落呈浅灰色，但B.fabiopsis产生的菌核量显著小于B.fabae，且B.fabiopsis的菌核呈同心环状排列，基于G3PDH、HSP60和RPB2构建系统发育树发现B.fabiopsis与B.galanthina亲缘关系最近，但与B.fabae和B.cinerea等其他葡萄孢属真菌亲缘关系较远，而基于编码坏死和乙烯诱导蛋白（NEPs）基因构建的系统发育树分析表明B.fabiopsis与B.galanthina不同（Zhangetal2010a）；B.sinoallii能引起洋葱、大蒜和韭菜的叶枯病，在PDA上培养形成大量的小菌核，系统进化分析B.sinoallii形成独立的一支，与B.squamosa同源性最高（Zhangetal2010b）；在黑莓上分离的病原菌B.caroliniana是从美国南卡罗来纳州西北部的黑莓田中的黑莓病果上分离获得的，20℃下，在PDA培养基上菌落呈白色至浅灰色，形成短簇绒状的气生菌丝和黑色菌核，产生的分生孢子小于B.fabiopsis和B.galanthina（Lietal2012）；B.sinoviticola是中国食用葡萄上B.cinerea的隐蔽种，但B.sinoviticola只能通过伤口侵染葡萄叶或果实，对环酰菌胺的敏感性显著高于B.cinerea（Zhouetal2014）；B.deweyae在系统分析上为葡萄孢属的一个新种，与B.elliptica亲缘关系最近，能造成萱草属植物春天叶片的急性病害“springsickness”，在麦芽浸粉琼脂培养基上菌落颜色由白色转变为淡棕色，菌核发育只有在培养成熟的时候才会出现（Grant-Downtonetal2014）；B.pyriformis在PDA上培养能形成浅灰色菌丝、褐色的分生孢子和黑色的菌核，分生孢子为梨形且表面覆盖大量的附属丝，基于G3PDH、HSP60和RPB2构建系统发育树，发现B.pyriformis独立于葡萄孢属的其他种，单独构成一个亚枝（Zhangetal2016）；B.euroamericana是在美国阿拉斯加州的牡丹和意大利特兰托地区的葡萄上都分离到在系统进化上与B.aclada亲缘关系较近的新物种，但在菌落形态、分生孢子形态及在不同寄主组织上的致病力等方面表现出明显差异（Garfinkeletal2017）。1 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2灰葡萄孢群体多样性在葡萄孢属的30多个种中，B.cinerea因其能很好地适应各种环境条件而具有复杂的群体，是迄今为止种群水平上多样性研究最多的物种（Walker2016）。B.cinerea的变异性主要表现为表型不稳定（Yourmanetal2000）、染色体倍数（Büttneretal1994）、形态学（Chardonnetetal2000）、致病性（VanderVlugt-Bergmans1996）和DNA多态性（Moyanoetal2003）。由于在自然群体中，一些物种存在特异性的等位基因或共享等位基因对比频率高，因此除系统发育基因外，群体遗传标记也能有效的确认和识别物种界限，并用于种内群体多样性的研究。群体遗传学的研究促进我们认识不同环境中的B.cinerea种群、确定群体结构形成的因素和了解其相互间的关系。野外种群通常有较高的基因和基因型多样性、强基因流及重组现象，而由于在温室存在优势种的筛选，单倍体的多样性可能很低（Walker2016）。B.cinerea的遗传变异研究的分子手段主要包含随机扩增多态性DNA（RAPD）（Kumarietal2014）、限制性片段长度多态性（RFLP）（Giraudetal.1997）、扩增片段长度多态性（AFLP）（Moyanoetal2003）、转座子（TEs）Boty和Flipper（Levisetal1997）、重复序列指纹法（MaandMichailides2005）和微卫星标记（Fournieretal2002）。此外，地理、寄主、耕作制度和杀菌剂等也是群体结构形成的相关因素（Walker2016）。除了遗传因素以外，真菌病毒的侵染也会导致葡萄孢菌表型的变异，进而导致种群多样性的发生，相关研究将在研究背景第5部分进行讨论。3植物灰霉病的危害与流行葡萄孢属真菌引起的灰霉病是全世界范围内最严重的病害之一（Deanetal2012），在温床、温室、仓库和田间等环境下时有发生，能造成侵染的植物组织腐烂，并在病部形成灰褐色的霉层，造成花腐、果腐、叶斑、茎腐和猝倒（Carisse2016）。现已发现葡萄孢属真菌能侵染维管植物多达596个属，共1400多个物种，是观赏植物、水果、蔬菜和豆科作物等上重要的植物病原菌，但是在野生植物上的报道有限。从地理学上来说，葡萄孢属真菌能侵染包括北半球的热带、亚热带和温带地区与整个南半球区域，甚至寄生在极端严寒气候下的寄主植物（Eladetal2016）。灰霉病能够导致严重的农作物损失，造成巨大的经济损失。已有报道表明灰霉病引起的果腐病曾在国际上造成的经济损失高达20亿美元（ElmerandMichailides2007）。在美国佛罗里达州杀真菌剂喷施的地块，灰霉病引起的草莓果腐的发病率约2 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究为0.5~13%，而在未喷药的地块中收获前的损失高达35%（Mertelyetal2000）。同时，灰霉病能引起间接损失，灰葡萄孢感染葡萄果实后会影响葡萄酒的风味、色泽和贮藏稳定性。葡萄孢属真菌的流行涉及一系列过程，初侵染源的发生和扩散造成初侵染后产生分生孢子并扩散，从而造成再侵染，最后形成休眠体，病害发生的每个阶段都受到环境条件（温度、雨水、湿度和风）、栽培技术（施肥和杀菌剂的使用）和寄主因素（耐受性和物候学）的影响（Carisse2016）。大多数葡萄孢属真菌在腐烂植物组织上形成菌核从而在土壤中越冬或适应不利的环境条件（Holtzetal2004）。在多年生的草莓植株上，B.cinerea则以菌核与叶子、叶柄、覆盖物及杂草上的菌丝越冬（BraunandSutton1987）。在适宜的条件下，菌核萌发形成的菌丝和分生孢子（HsiangandChastagner1992）或越冬的菌丝上产生的分生孢子成为主要的初侵染源（BraunandSutton1988）。侵染源的来源、数量和类型显著影响病害流行的开始和发病率，从而间接地造成产量损失。大多数种和菌株能在分支的分生孢子梗顶端产生大量的无性分生孢子，并且不同种的分生孢子大小有差异（BeeverandWeeds2004）。绝大多数葡萄孢属种类都能通过分生孢子随气流传播扩散并能够被监测（Carisseetal2015），此外，水滴飞溅（Blancoetal2006）、昆虫（FermaudandleMenn1992）、农业机械和园艺剪也是传播分生孢子的重要途径。大多数的葡萄孢属真菌能通过伤口侵染寄主植物，部分种的分生孢子能够直接侵入寄主组织或者通过自然孔口进入植物组织，就B.cinerea而言，花是其最重要的侵染器官。表面自由水的存在或者较高的相对湿度是分生孢子侵入和萌发的关键性因素，B.cinerea侵染最适温度为15-20℃，最佳湿度为相对湿度90%以上或有自由水存在并维持至少4小时。B.cinerea侵染后造成病害并在发病组织上形成分生孢子造成再侵染（Carisseetal2015）。4植物灰霉病的防治葡萄孢属真菌的寄主范围广（Eladetal2016），群体多样性丰富（Walker2016），缺乏有效的抗病品种，化学防治引起的环境污染和真菌抗药性促进了生物防治等环境友好型病害防控措施的开发（Nicotetal2016），但生物防治在应用中暴露出防效不一致和变异大的弊端，仅仅依靠生防制剂并不能满足控制病害的要求（Elad1990）。因此，采取以农业防治为基础，结合化学防治和生物防治的综合防治措施将是长期3 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文用于灰霉病防治的有效方法（Elad2016）。4.1综合防治在高湿的环境条件下，灰葡萄孢真菌的侵染更严重，利用农业技术降低湿度能够在一定程度上抑制灰霉病的发生。一、冠层管理。修剪枝叶，改善光照，加强空气流通，降低相对湿度（SavageandSall1982）。二、降低种植密度（Legardetal2000），合理灌溉，增加土壤覆盖层（Elad2000）。三、管理植物营养。科学施肥，增施钾肥（Yermiyahuetal2013）、钙肥（WojcikandLewandowski2003,Yermiyahuetal2006），减少氮肥的使用（HobbsandWaters1964,Hofflandetal1999）。综合防治措施BOTMAN不仅考虑化学和生物防治方法，并结合环境条件对灰霉病发生的可能影响，通过促进农业管理和生物防治而减少化学杀菌剂的使用，并达到防治温室蔬菜作物灰霉病的效果（ShtienbergandElad1997）。4.2生物防治开发生物防治方法控制葡萄孢属真菌引起的灰霉病一直是我们努力的目标，早在20世纪50年代就有报道应用微生物成功防治蔬菜作物病害的案例（Dubos1992）。由于化学防治的不利影响和急于减少农药使用的社会压力，寻求环境友好型的防治策略和替代方法在世界范围内获得广泛关注。在过去的十年里，防治灰霉病的生物农药发生了巨大变化，最显著的商品化制剂数量增多及其注册范围扩大。此外，市场上日益推广生物农药替代综合管理系统中的化学防治并作为抗药性治理的有效工具。当病害发生轻或在花期和收获前等不适宜农药使用的时期，可能推动生物农药的广泛使用（Nicotetal2016）。生物防治制剂和生物农药主要包括植物提取物、微生物、矿物油和有机酸等。®茶树提取物的商品化产品TimorexGold24EC对真菌具有广谱活性，包括蔬菜、草本植物、葡萄和果园上的B.cinerea。在加利福尼亚地区葡萄园中的田间试验中，该提取物对灰霉病发生率的抑制效果高达90%以上（Nguyenetal2013）；微生物活性物质主要来自于细菌（枯草芽孢杆菌）（Ongenaetal2010）、放线菌（链霉菌）（Lichatowich2007）、酵母（出芽短梗霉）（Schilder2013）和真菌（木霉）（Card2005）；®®矿物油商品化产品主要有JMSStylet-Oil和Trilogy90EC，主要活性成分分别为石蜡油和楝油（Nicotetal2016）。在大多数情况下，对Botrytisspp.的生物防治可以看作是许多生防制剂相互作用的结果，作用机制主要包括降低营养物质的浓度4 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究（Schilder2013）、改变植物表面性质（Meyeretal2001）、微生物化合物抑制作用（Ajouzetal2011）、重寄生（Chengetal2012）、干扰致病过程（Schoonbeeketal2007）、减少侵染源（Morandietal2000）和诱导抗性（MellerHareletal2014）。4.3化学防治化学防治主要使用合成的杀菌剂，是有效防治灰霉病的主要手段，在不同作物上杀菌剂的投入不同，主要依据其经济价值、对病原菌的敏感性和储藏时间而定（FillingerandWalker2016）。在农业中最早使用的杀菌剂是多位点毒剂，无机硫和酮盐早在20世纪九十年代被使用，灭菌丹、福美双、甲苯氟烷和百菌清在许多国家仍然被用来防治灰霉病（Russell2005）。但是，葡萄孢属真菌很快就对多位点杀菌剂产生了耐药性，比如解毒作用（Leroux2004）。单靶标位点的杀菌剂主要以不同的细胞功能为靶标，苯并咪唑类和N-苯基氨基甲酸酯通过微管结合，严重影响细胞减数分裂、有丝分裂和蛋白质分泌（DavidseandIshii1995），但由于大量的使用，包括葡萄孢属在内的许多真菌都产生了抗性（Leroux2004）；天然抗真菌化合物硝吡咯的结构类似物二甲酰亚胺类和苯基吡咯能够干扰真菌信号转导，但因应用广泛，二甲酰亚胺类很快丧失了防治灰霉病的效力（Leroux2004），因此允许有限的使用以限制抗性菌株的选择（Walkeretal2013）；嘧啶胺类（嘧菌胺、嘧霉胺和嘧菌环胺）可能抑制氨基酸的合成，特别是甲硫氨酸的生物合成（Fritzetal1997），但在引入使用几年后，出现了中抗或高抗菌株（Lerouxetal2002）；环酰菌胺和氨基吡唑啉酮抑制C4-去甲基化合物的3-酮还原酶，终止麦角甾醇的合成并导致有毒中间产物的积累（Debieuetal2001），尽管在环酰菌胺注册使用后，群体中出现了特异性抗性菌株，但防效丧失或降低的记录很少出现（Billardetal2012）；SDHIs（苯甲酰胺、呋喃甲酰胺、吡啶甲酰胺和噻唑甲酰胺）（LerouxandWalker2010,SierotzkiandScalliet2013），QoIs（嘧菌酯和唑菌胺酯）和氧化磷酸化解偶联剂的靶向是真菌呼吸和能量产生（FillingerandWalker2016），但这类杀菌剂具有很高的抗药性发展风险，因为其靶标为细胞色素b，而cytb突变体与抗性有关，能通过母性传播和菌丝融合传播（VillaniandCox2014）。通过限制杀真菌剂的使用来减少对环境的影响（Fenneretal2013）及农药残留（VergerandBoobis2013）已尤为重要。同时，获得性抗性的发生降低了田间防效（BrentandHollomon2007）。因此，为达到杀真菌剂、人类健康、环境保护和作物5 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文产量四者之间的平衡，要求合理用药，并结合预防管理和精准化施药方式。5真菌病毒的研究进展5.1真菌病毒的分类真菌病毒是一类能侵染丝状真菌、酵母和卵菌并在其中复制的病毒（GhabrialandSuzuki2009,Pearsonetal2009）。真菌病毒最早是于1948年在感染“LaFrance”的双胞蘑菇上的病原菌中分离发现的（Hollings1962）。近年来，在许多重要的植物病原真菌类群中都检测到真菌病毒的存在，如B.cinerea和大蒜盲种葡萄孢（B.porri）（Wuetal2007,2012）。目前已报道的真菌病毒基因组主要是dsRNA和+ssRNA。其中dsRNA病毒包括双分体病毒科（Partitiviridae）、四分体病毒科（Quadriviridae）和全病毒科（Totiviridae）等7个科；+ssRNA病毒含有5个科，如减毒病毒科（Hypoviridae）（GhabrialandSuzuki2009）。另外，近年来负单链RNA病毒（Kondoetal2013）、单链DNA病毒（Yuetal2010）也有研究报道。5.2真菌病毒的传播真菌病毒传播类型主要有垂直传播（Nuss2005）、水平传播（Nuss2005）、细胞外的传播（Yuetal2013）和种间传播（MilgroomandHillman2011）。垂直传播指真菌病毒通过无性（或有性）孢子的产生从亲代传播到后代（Nuss2005）。通常来说，真菌病毒的垂直传播是通过无性繁殖，而不是有性繁殖（Lecoqetal1979）。水平传播指真菌病毒通过菌丝接触或菌丝融合进行传播（Nuss2005）。例如在灰葡萄孢中，Botrytiscinereamitovirus1（BcMV1）可以从菌丝传播到分生孢子中，而且效率高达79.8%，并且BcMV1可以通过菌丝融合从弱毒菌株CanBc-1中水平传播到单分生孢子分离后代CanBc-1c-66中，但不能成功感染菌株CanBc-2（Wuetal2007）。真菌病毒的水平传播在一定程度上受到营养体不亲和性的限制，但也有研究表明，原生质体融合（Chenetal1994）和构建cDNA侵染性克隆（Vargaetal1998）技术可以突破营养体亲和群的限制，从而提高真菌病毒传播的可能及生防潜能。5.3植物病原真菌的弱毒现象在大多数情况下，真菌病毒的侵染不会影响寄主真菌的形态和生物学特性的改变。但是，少数真菌病毒的感染能使寄主真菌表型异常，包括菌丝生长速度的减慢、6 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究产孢量的降低、次级代谢产物（色素和毒素）产生的抑制和致病力的衰退等（Nuss2005）。因此，真菌病毒的研究为生物防治提供了新的思路。应用真菌病毒进行生物防治最典型的案例就是在欧洲利用RNA病毒Cryphonectriaparasiticahypovirus1控制板栗疫病的发生（Anagnostakis1982）。然而，由于北美板栗疫病菌营养亲和群（VCGs）的复杂性，CHV1并不能成功的控制北美板栗疫病的发生（MilgroomandCortesi2004）。此外，DNA病毒Sclerotiniasclerotiorumhypovirulence-associatedDNAvirus1纯化的病毒离体能在PDA平板上成功侵染S.sclerotiorum，并能抑制S.sclerotiorum在拟南芥和油菜叶片上造成的病斑扩展，SsHADV-1在田间条件下也能减小病害严重度并提高油菜产量（Yuetal2013）。5.4葡萄孢属中真菌病毒研究真菌病毒RNA侵染葡萄孢属真菌在1995年被首次报道，第一次在灰葡萄孢中观察到类似病毒粒体并检测到dsRNA（Howittetal1995）。随着测序技术的迅速发展，研究发现大量的真菌病毒能侵染葡萄孢属真菌，其中BotrytisvirusF（BVF，Howittetal2001）、BotrytisvirusX（BVX，Howittetal2006）、BcMV1（Wuetal2007,2010）、Botryotiniafuckelianatotivirus1（BfTV1，DeGuidoetal2007）、Botryotiniafuckelianapartitivirus1（BfPV1，DeGuidoetal2007）、BotrytiscinereaCCg378virus1（Bc378V1，Potgieteretal2013）、BotrytiscinereaRNAvirus1（BcRV1，Yuetal2015）和Botrytiscinereaendornavirus1（BcEV1，Haoetal2016）能侵染灰葡萄孢；BotrytiscinereaRNAvirus1（BpRV1）能侵染B.porri（Wuetal2012）。BcMV1和BpRV1能经垂直传播从菌丝中传播到分生孢子中，同时能通过菌丝融合水平传播到类似宿主真菌中（Wuetal2007,2012），该现象表明RNA真菌病毒可能具有防治B.cinerea和B.porri的生防潜能。6本课题的由来灰葡萄孢HBstr-470是本实验室于2013年在湖北襄阳地区草莓病害样品上分离纯化获得的。20℃下，菌株HBstr-470菌株在PDA培养基上菌落生长异常，菌丝生长速度缓慢，菌落上形成大量的气生菌丝和分生孢子。分生孢子能正常萌发且萌发率高达90%以上，但分生孢子在本氏烟叶片上的致病力显著低于强毒菌株B05.10（周梓良2015）。通过dsRNA的提取和凝胶电泳分析检测到菌株HBstr-470中含有5条dsRNA7 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文条带（A~E）。经cDNA序列克隆分析，获得dsRNA-A的部分序列，BLAST分析表明该序列与SsHV1的同源性较高；获得B~D3条dsRNA的全长cDNA序列，通过序列比对及进化树分析发现：该3条dsRNA片段可能同属一种病毒，且与RnQV1的亲缘关系较近；dsRNA-E的部分序列与双分体病毒科成员的同源性较高（周梓良2015）。7本研究的目的和意义灰葡萄孢寄主范围广泛，引起多种作物的灰霉病，造成巨大的经济损失。本文主要是基于前期对灰葡萄孢菌株HBstr-470生物学特性及其中真菌病毒的研究，进一步明确菌株HBstr-470中真菌病毒的分类属性和传播特性，并进一步探究真菌病毒与其生物学异常间的关系，为更好的应用真菌病毒于生物防治提供理论依据和实验材料。8 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究第二章灰葡萄孢HBstr-470生物学特性研究本实验室前期研究表明，灰葡萄孢菌株HBstr-470，在PDA上培养菌落形态异常，生长速度缓慢，形成大量分生孢子，且致病力发生了严重衰退（周梓良，2015）。由于该菌株具有十分强的产孢特性，因此本章节将对灰葡萄孢菌株HBstr-470从分生孢子萌发到菌落形成的过程及其他生物学特性进行详细研究。1试验材料1.1供试菌株和培养基1.1.1供试菌株灰葡萄孢HBstr-470，灰葡萄孢B05.10，菌株接种在PDA斜面于4℃下保存。1.1.2供试培养基PDA：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，具体制作方法参见植物病害研究法（方中达1998）。PDB：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。1.5%WA：琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。1.2供试植物本氏烟（Nicotianabenthamiana），光照培养室中（26℃，12h光周期）种植，用于致病力的测定。1.3其他试剂药品Tween80，乳酸2试验方法2.1菌落形态的观察和菌丝生长速率的测定供试菌株接种于PDA平板上，于20℃培养2~3d，进行活化。活化好的菌株在菌落边缘用灭菌的打孔器（直径5mm）打取菌丝块若干。打取获得的菌丝块将转接到的新的PDA平板中央（直径9mm，20mLPDA）进行生长速度的测定，每个菌株3皿，置于20℃下培养，每隔24h测量一次菌落直径，直至菌落长满整个培养皿，并观察菌落形态。菌丝生长速率（mm/d）=（48h菌落直径-24h菌落直径）/2。试验设3次生物学重复。9 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.2分生孢子产量与大小的测定将活化好的菌株接种于PDA平板上，分别于24h光照（LL）、12h光照/12h黑暗（LD）及24h黑暗（DD）三个不同光照条件下，20℃培养15d。培养好的灰葡萄孢菌落用适量灭菌蒸馏水（0.1%Tween80）刮洗下分生孢子，用三层无菌的擦镜纸过滤后再稀释到合适倍数，于血球计数板上进行计数，从而测定分生孢子浓度，并最终计算每皿分生孢子的产量。分生孢子的大小用目镜测微尺进行测量，每个菌株测量50个分生孢子。分生孢子产量（个/皿）=血球计数板所测分生孢子浓度（个/mL）×灭菌蒸馏水的量（mL）×稀释倍数。每个处理设3次重复，每个试验重复3次。2.3分生孢子萌发率和芽管长度的测定采用2.2中所述方法获得不同菌株的分生孢子悬液，将孢子悬浮液浓度稀释至61.0×10个孢子/mL，取200μL分生孢子悬浮液均匀涂布在1.5%WA平板上（10mLWA），放于超净工作台内吹干后置于20℃下黑暗培养。在接种后3h、6h、9h和12h取样显微镜下观察，记录各处理的分生孢子萌发数，计算分生孢子萌发率；接种后第12h测量每个处理萌发的分生孢子的芽管长度。每个处理计数100个分生孢子中的已萌发孢子数量，测量50个分生孢子萌发后的芽管长度。每个处理设3次重复，试验重复3次。2.4单菌落产孢动态观察用灭菌蒸馏水洗下于PDA平板上培养10d的分生孢子，三层的无菌擦镜纸过滤，将分生孢子悬浮液稀释至50个/mL。取100μL分生孢子悬浮液均匀涂布在PDA平板上，放于超净工作台内吹干。分别于LL、LD和DD三种光照条件下，20℃培养。接种后60h后每隔12h在体式显微镜下观察单分生孢子萌发后菌落形态，并记录产孢菌落数。2.5分生孢子致病力的测定本试验釆用活体本氏烟叶片法测定供试菌株分生孢子的致病力。用灭菌的1/2PDB培养基洗下于PDA平板上培养10d的分生孢子，三层的无菌擦镜纸过滤后，5将分生孢子悬浮液用1/2PDB稀释至1.0×10个/mL备用。选取生长健康、长势均匀的本氏烟植株，每株本氏烟上选取3片大小均一、叶龄相近的叶片，用镊子将无菌的直径为5mm的滤纸片放在叶片中央，每张滤纸片10 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究上均匀滴加20μL分生孢子悬浮液，将接种后的植株放置于20℃下保湿培养，接种第2d后每隔12h测量接种叶片上的病斑直径，观察叶片病斑扩展情况。每个处理接种3棵植株，试验重复3次。2.6分生孢子竞争性致病力的测定将菌株HBstr-470的分生孢子悬浮液和菌株B05.10的分生孢子悬浮液或1/25PDB按体积1:0、3:1、1:1、1:3或0:1等5种比例配制成不同的孢子液混合液（1.0×10个/mL）。分别吸取各分生孢子混合液20μL，接种在活体本氏烟叶片上，将接种后的植株放置于20℃下保湿培养，接种第2d后每隔12h测量接种叶片上的病斑直径。接种10d后，将各菌株发病的叶片剪下，无菌水洗下分生孢子。三层擦镜纸过滤后3将分生孢子浓度稀释至1×10个孢子/mL。取200μL孢子液涂布于含0.5%乳酸的PDA平板上，置于20℃下培养48h。用灭菌接种针将单个菌落转移至新鲜PDA平板上，每个处理挑取50个单菌落。在20℃下培养5d后，观察各菌落形态，计算菌株HBstr-470和菌株B05.10的分生孢子比例，以此判断不同菌株在病斑上产生分生孢子的能力。2.7数据的统计方法菌株的生长速度、病斑直径和分生孢子产量等用SAS软件进行统计分析（SASInstitute,Cary,NC,USA,Version8.0,1999）。其中分生孢子产量数据进行Log10转换后运用SAS进行分析。每个处理结果运用LSD法（P=0.05）进行多重比较。3结果与分析3.1灰葡萄孢菌株HBstr-470的培养特性和弱致病性在20℃下，灰葡萄孢菌株HBstr-470在PDA上生长缓慢，菌丝平均生长速度为1.8mm/d，显著低于强毒菌株B05.10（15.4mm/d）（P<0.001）（图2-1B），菌落边缘不整齐，产生大量的气生菌丝，培养15d后仍不能完全覆盖整个培养皿（9cm），菌落有黑色色素沉积且表面能形成大量的分生孢子，但没有黑色菌核的形成（图2-1A）。与之相比，菌株B05.10的菌落在PDA上均匀扩展，3d就可以长满培养皿，产生较少的气生菌丝和分生孢子，15d后菌落表面能形成成熟的黑色菌核（图2-1A）。菌丝块在离体本氏烟叶片的致病力测定表明，菌株B05.10在离体本氏烟叶片上接种11 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文72h后造成的病斑直径为26.4mm；而菌株HBstr-470对烟草不致病或造成很小的病斑，平均病斑直径（5.6mm）显著小于菌株B05.10（P<0.001）（图2-1C和D）。图2-1灰葡萄孢菌株B05.10和HBstr-470的菌落形态（A）、菌丝生长速率（B）和在离体本氏烟草叶片上接种72h的致病力（C和D）Fig.2-1Colonymorphology(A),mycelialradialgrowthrate(B)andinvitropathogenicityondetachedN.benthamianaleavesat72hpi(CandD)ofB.cinereaB05.10andHBstr-4703.2灰葡萄孢菌株HBstr-470的分生孢子产量和大小20℃下，菌株HBstr-470在PDA上于不同光照条件（LL、LD和DD）下培养15d后，菌落上都能形成大量的分生孢子。光照条件为LL和LD时，菌株HBstr-47088的分生孢子产量分别为4.0×10个孢子/皿和3.2×10个孢子/皿，显著高于菌株B05.10在同等培养条件下的分生孢子产量（P<0.05）。光照条件为DD时，菌株HBstr-4708的菌落仍能产生大量分生孢子（2.5×10个孢子/皿），但菌株B05.10的菌落在黑暗条件下几乎不能形成分生孢子。在光照条件为LL和LD时，菌株HBstr-470的分生孢子的大小均略小于菌株B05.10（表2-1）。表2-1不同光照条件下菌株B05.10和HBstr-470的分生孢子的产量和大小Table2-1YieldandsizeofconidiaproducedbystrainsB05.10andHBstr-470underdifferentlightconditionLLLDDDB05.10HBstr-470B05.10HBstr-470B05.10HBstr-4701分生个/皿（log10）7.9c8.6a7.8c8.5ab0d8.4b孢子大小（μm）11.3×8.6a9.7×7.3c10.9×8.7a9.7×7.5bcNS10.3×7.7b1数字后面标有相同字母的表示差异不显著（P>0.05），多重比较采用LSD法。NS=无分生孢子产生12 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究3.3灰葡萄孢菌株HBstr-470的分生孢子萌发能力菌株HBstr-470的分生孢子在20℃下，于PDA上的萌发能力的测定表明，菌株HBstr-470在不同光照条件下产生的分生孢子均能萌发，在不同时间段的萌发率与菌株B05.10相近，并在培养12h后，萌发率都达到90%以上；在12h后，菌株HBstr-470萌发芽管的平均长度约为110μm，与菌株B05.10无显著差异（P>0.05）（表2-2）。表2-2不同灰葡萄孢菌株在不同光照条件下产生的分生孢子的萌发率和芽管长度Table2-2ThegerminationrateandgermtubelengthofconidiaproducedbydifferentB.cinereastrainsunderdifferentlightcondition分生孢子萌发率(%)芽管长度菌株处理3h6h9h12h(μm,12hpi)1HBstr-470LL58.56a83.00a91.22a93.78a112.9aLD48.00a76.56a91.44a95.89a102.0aDD58.22a73.89a92.22a95.78a110.0aB05.10LD56.22a81.56a91.78a95.56a118.3a1数字后面标有相同字母的表示差异不显著（P>0.05），多重比较采用LSD法。3.4灰葡萄孢菌HBstr-470单孢菌落的产孢动态将菌株HBstr-470和B05.10的分生孢子稀释后涂布于PDA平板上，放于不同光照条件（LL、LD和DD）下培养。接种72h后，三个光照处理条件下的菌株HBstr-470的分生孢子萌发形成的菌落上已经开始有分生孢子的形成，DD、LD和LL光照条件下的单孢菌落产孢率分别为54.8%、83.6%和31.0%；接种84h后，DD和LD培养条件下，菌株HBstr-470形成的菌落100%都能产生分生孢子；LL条件下，菌株HBstr-470的部分菌落形成分生孢子的时间稍有延缓，培养84h时单孢菌落产孢率为62.0%，但在96h时菌落上已全部能观察到分生孢子的形成。然而，菌株B05.10的单孢菌落上分生孢子的形成均晚于菌株HBstr-470，培养96h后，都未能在菌落上观察到分生孢子的产生（图2-2，表2-3）。表2-3不同光照条件下菌株B05.10和HBstr-470的分生孢子萌发形成菌落的产孢动态Table2-3ConidiationofstrainsB05.10andHBstr-470underdifferentlightcondition产孢菌落数/观察总菌落数DDLDLL72h84h72h84h72h84h96hHBstr-47017/3130/3046/5555/5513/4226/4242/42B05.100/150/140/320/320/370/370/3713 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图2-2不同光照条件下菌株B05.10和HBstr-470的分生孢子萌发形成菌落的产孢动态Fig.2-2ConidiationofstrainsB05.10andHBstr-470underdifferentlightcondition3.5灰葡萄孢菌株HBstr-470分生孢子的致病力及竞争力收集菌株HBstr-470和B05.10接种于PDA上培养10d后的分生孢子，用1/2PDB配置成分生孢子悬浮液，接种于活体本氏烟叶片上，20℃下保湿培养。接种第2d后，菌株HBstr-470和菌株B05.10的分生孢子均能在叶片上造成病斑，并随着接种时间的延长，病斑逐渐扩展，但菌株HBstr-470分生孢子造成的病斑大小始终显著低于菌株B05.10（P<0.05）（图2-3）。将菌株HBstr-470和菌株B05.10的分生孢子按不同比例（1:0、3:1、1:1、1:3和0:1）混合后接种于活体本氏烟叶片，20℃下保湿培养。随着接种混合孢子液中菌株HBstr-470分生孢子比例的升高，所形成的叶片病斑直径相应减小（图2-4）。在接种14 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究10d后检测不同混合比例接种后病斑上形成的分生孢子中菌株HBstr-470和菌株B05.10的相对比例，结果发现：在病斑上形成的分生孢子中，菌株HBstr-470和菌株B05.10各自形成的分生孢子比例始终小于接种混合液中的分生孢子比例（表2-4）。因此，菌株HBstr-470的竞争能力可能较菌株B05.10弱。图2-3菌株B05.10和HBstr-470的分生孢子在活体烟草叶片上接种96h后的病斑情况（A）和病斑直径的扩展变化（B）Fig.2-3Pathogenicityassayat96hpi(A)anddevelopmentoflesiondiameter(B)onN.benthamianaleavesoftheconidiaproducedbystrainsB05.10andHBstr-470图2-4不同比例菌株B05.10和HBstr-470的分生孢子混合接种在烟草叶片上接种96h后的病斑情况（A）和病斑直径的扩展变化（B）Fig.2-4Pathogenicityassayat96hpi(A)anddevelopmentoflesiondiameter(B)onN.benthamianaleavescausedbythemixtureofconidiaproducedbystrainsB05.10andHBstr-47015 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文表2-4不同混合接种处理下菌株B05.10与HBstr-470分生孢子重新分离的比例Table2-4Thepercentageofre-isolationofconidiaofstrainsB05.10andHBstr-470indifferentmixed-inoculationtreatments病斑直径（mm）分生孢子后代比例（菌株数量/个）处理（分生孢子比例）（20℃，4d）B05.10HBstr-4701B05.10(100%)33.9a100%（50）0%（0）B05.10(75%)+1/2PDB(25%)32.1ab100%（50）0%（0）B05.10(75%)+HBstr-470(25%)27.8c92%（46）8%（4）B05.10(50%)+1/2PDB(50%)29.0bc100%（50）0%（0）B05.10(50%)+HBstr-470(50%)22.3d72%（36）28%（14）B05.10(25%)+1/2PDB(75%)28.4bc100%（50）0%（0）B05.10(25%)+HBstr-470(75%)19.3de54%（27）46%（23）HBstr-470(100%)17.4e0%（0）100%（50）1数字后面标有相同字母的表示差异不显著（P>0.05），多重比较采用LSD法。4讨论本章节明确了灰葡萄孢菌株HBstr-470的培养特性与侵染特性。20℃下，菌株HBstr-470在PDA培养基上生长速度与致病力显著低于强毒菌株B05.10（图2-1）。菌落上能形成大量的分生孢子，且分生孢子能正常萌发，萌发率与萌发形成的芽管长度与强毒菌株B05.10无明显差异（表2-1和2-2）。大多数灰葡萄孢菌株在光照条件下形成分生孢子，而在黑暗培养下形成菌核（EptonandRichmond1980），但是也有研究表明，部分菌株并不遵循该光照节律，仅产生分生孢子或者菌核（Canessaetal2013）。VELVET复合体是子囊菌中光照信号调节发育和次级代谢的一个关键因子（BayramandBraus2012），在灰葡萄孢中，敲除VELVET复合体中的任何一个成员（BcVEL1、BcVEL2或BcLAE1）都能抑制菌株菌核的形成，使致病力减弱，而分生孢子的产量增加，菌株出现一直产孢的表型（Schumacheretal2012；Schumacheretal2015；Yangetal2013）。菌株HBstr-470菌落上分生孢子的形成稳定，且并不依赖于光照条件（图2-2和2-3），但是否与其光感应受体基因的表达水平有关还待进一步的研究。菌株HBstr-470的分生孢子能在本氏烟叶片上造成病斑，但是致病力和竞争性致病力都显著低于强毒菌株B05.10（图2-3、图2-4和表2-4）。因此，这可能是菌株HBstr-470虽然能产生大量的分生孢子，但不会在自然界中占绝对优势的原因之一，从而达到物种的生态平衡。16 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究第三章灰葡萄孢HBstr-470中真菌病毒的鉴定及生物学特性研究在本实验室的前期研究中，在灰葡萄孢菌株HBstr-470的菌丝中检测到了多条dsRNA条带。其中部分dsRNA片段进行的序列测定结果表明，这些dsRNA为真菌病毒的基因组。为了进一步明确菌株HBstr-470中所含真菌病毒的种类及不同病毒对灰葡萄孢的影响，本章将对菌株HBstr-470中的所有真菌病毒进行基因组序列的测定和分析，并揭示不同病毒对灰葡萄孢生物学特性的影响。1实验材料1.1供试菌株和培养基1.1.1供试菌株hyg灰葡萄孢菌株HBstr-470、B05.10、HeBtom-25、HNstr-2、B05.10（插入了抗hyg潮霉素基因的菌株B05.10）；菌株T36为菌株HBstr-470和B05.10原生质体融合衍生菌株；菌株T1、T2、T8、T11、T15和T17为菌株HBstr-470和HeBtom-25水平传染后获得的衍生菌株；T22和T24为菌株HBstr-470和HNstr-2水平传染后获得的衍生菌株。1.1.2培养基PDA，制作方法参见本文的第二章。PDB，制作方法参见本文的第二章。LB：胰化蛋白胨（Bacto-tryptone）10g、酵母提取物（Bacto-yeastextract）5g，氯化钠（NaCl）10g，用蒸馏水溶解后调节pH为7.0，定容至1000mL，121℃灭菌20min。LA：将上述每200mLLB培养基中加入2.6g琼脂粉，121℃灭菌20min。TB3培养基：蔗糖（Surose）25g、酵母提取物（YeastExtract）0.5g、酶水解酪蛋白（CaseinEnzymalicHydrolysate）0.2g，琼脂粉（Agarose）0.8g，蒸馏水定容至100mL，121℃灭菌20min。1.2酶和试剂材料TaqDNA聚合酶、T4RNA连接酶、RNase抑制剂、RNasefreeDNaseI、随机17 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文TM引物（pd(N)9）、PrimeScriptⅡReverseTranscriptase为TaKaRa公司产品（TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd,Dalian,China）；KOD-plus-DNA聚合酶（TOYOBO.,Ltd,Osaka,Japan）、CF-11纤维素粉（SIGMA-ALDRICH,Inc.,Louis,MOUSA）、DNA凝胶回收试剂盒（AxygenScientific,Inc.UnionCity,USA）、PCR产物纯化试剂盒（AxygenScientific,Inc.UnionCity,USA）、尼龙膜zeta-probemembrane（Bedford,MA,®USA）、杂交试剂盒（GEHeaithcareCompanies）、TRIzolreagent(InvitrogenCorp,Carlsbad,USA)、D-sorbitol、氨苄青霉素、潮霉素B、Tween80、Tris饱和酚、水饱和酚、氯仿、异戊醇；2×GPS：甘氨酸15g，Na2HPO414.2g，NaCl35.1g，DEPC-H2O溶解后用NaOH调节pH为9，并定容至1000mL。10%十二烷基磺酸钠（SDS）：将10gSDS溶于ddH2O后定容至100mL。10×STE：0.5mol/LTris，1mol/LNaCl，10mmol/LEDTA，调节pH为7.0。dsRNA提取洗脱缓冲液：10×STE10mL，无水乙醇16mL，DEPC-H2O74mL。电泳缓冲液（0.5×TBE）：Tris54g，硼酸27.5g，EDTA8.7g，加ddH2O定容到1L（5×TBE），使用时用ddH2O稀释为0.5×TBE。STC：43.72gD-sorbitol，0.24gTrizmabase，0.22gCaCl2，ddH2O溶解后用HCl将pH调至7.5并定容到200mL。40%PEG：称取40gPEG3350，用STC溶解并定容至100mL。5×KCM：KCl0.5mol/L，CaCl20.15mol/L，MgCl20.25mol/L。高温灭菌后分装于1.5mL离心管中于-20℃冰箱中保存。SOC：Bacto-tryptone20g，Bacto-yeast5g，NaCl0.5g，0.25mol/LKCl10mL，用NaOH调节pH值至7.0，加水定容至1L，121℃灭菌20min，使用前加入过滤灭菌的5mL2mol/LMgCl2和20mL1mol/L葡萄糖。CTAB缓冲液：2%CTAB，2%PVP，0.1MTris-HCl（pH8.0），0.025MEDTA，2.0MNaCl，加入ddH2O至1000mL。0.1mol/L的磷酸钠缓冲液（pH7.0）：将57.7mL1mol/LNa2HPO4溶液和42.3mL1mol/LNaH2PO4溶液混合后，再加入ddH2O至1000mL即可。1.3供试植物本氏烟（N.benthamiana），光照培养室中（26℃，12h光周期）种植，用于致病18 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究力的测定。1.4载体和引物载体为pMD18-T，具有Amp的抗性。所用的引物见附表1。2试验方法2.1灰葡萄孢菌丝培养及收集将活化好的菌丝块接种到铺有一层玻璃纸的PDA平板上，置于20℃下培养2-5d，收集菌丝于-80℃下保存备用。2.2灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的提取与纯化参考Harmma等（Harmmaretal1989）的方法提取dsRNA。具体方法为：将培养好的菌丝放入液氮中碾磨成粉末后装入2mL离心管中，每0.2g样品中依次加入800μL2×GPS、400μLTris饱和酚、400μL氯仿-异戊醇（24:1）、92μL10％十二烷基磺酸钠（SDS），室温下剧烈震荡10min，12000r/min离心10min。取上清液至新的2mL离心管中，加入无水乙醇并使终浓度为15%~16%，上下颠倒混匀后再加入0.1gCF-11，震荡混匀，冰浴20min，4℃下12000r/min离心5min。弃上清，加入1mL洗脱缓冲液，剧烈震荡使纤维素粉混匀，室温下静置2min后于4℃下12000r/min离心1min，重复洗脱5次。加入333μL1×STE，混匀震荡10min后4℃下12000r/min离心1min，重复3次，将上清转移至新的离心管中。加入2倍体积的无水乙醇（或等体积的异丙醇），上下颠倒混匀后置于-20℃下沉淀2h以上，4℃下12000r/min离心20min，弃上清，用1mL75％乙醇洗涤沉淀，4℃下12000r/min离心3min后倒去上清液。风干后用25μLDEPC-H2O溶解沉淀，置于-80℃保存备用。将提取的dsRNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离。电泳后，将目标条带分别切割下来，使用的DNA回收试剂盒（Axygen）进行回收，具体方法参考说明书：（1）dsRNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目标dsRNA片段的琼脂糖凝胶，放入一支无菌1.5mL离心管中，捣碎，计算凝胶重量，并以该重量作为一个凝胶体积。（2）加入3倍体积的BufferDE-A，置于75℃水浴6~8min，其间每隔两分钟上下颠倒混匀。（3）待凝胶完全溶化后，加入0.5倍BufferDE-A体积的BufferDE-B（如果回收的片段小于400bp，则再加入一个凝胶体积的异丙醇混合均匀）。19 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文（4）将上述混合溶液转移至DNA制备管（置于2mL离心管）中，12000×g离心1min，舍弃2mL离心管中的废液。（5）将制备管置回2mL离心管，加入500μL溶液BufferW1，12000×g离心30s，舍弃2mL离心管中的废液。（6）将制备管置回2mL离心管，加700μLBufferW2，12000×g离心30s，舍弃2mL离心管中的废液，并重复该步骤一次。（7）将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min。（8）将DNA制备管置于一新的1.5mL离心管中，加25μL65℃预热的DEPC-H2O洗脱，于室温静置2min。在12000×g离心1min，收集管中液体即为收回的dsRNA片段，置于-80℃保存备用。2.3大于3.0kb片段cDNA的克隆2.3.1病毒cDNA片段库的构建取10μL回收好的dsRNA，加入1μL随机引物pd(N)9（0.1nmol）、1μL10mMdNTP、1μLDMSO混合均匀，于98℃加热变性5min后立即置于冰上冷却2min。在变性液中依次加入4μL5×反应缓冲液、1μLRNase抑制剂（40U/μL）、1μLTMPrimeScriptⅡReverseTranscriptase（200U/μL），加DEPC-H2O使总体积为20μL。混匀后于PCR仪中30℃反应10min，42℃反应90min，16℃反应4min，合成cDNA。为了减少PCR扩增过程中造成的序列差错，以下PCR过程均采用高保真DNA聚合酶（KOD-plus-DNA聚合酶）进行PCR反应，取上述cDNA反应液1μL，然后依次加入5μL10×PCRBuffer缓冲液、1.4μLMgSO4（25mM）、1.5μLpd(N)9（0.1nmol）、5μLdNTP（2mM）、1μLKOD-Plus聚合酶（1U/μL）、31.1μLddH2O，总体积为50μL，混匀后于PCR仪中进行PCR仪扩增。PCR循环条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，30℃退火2min，68℃延伸4min，共30个循环，最后68℃延伸10min，16℃冷却4min。PCR反应完成后，向PCR产物中加入两倍体积的无水乙醇，混合均匀后-20℃沉淀30min，12000×g离心10min，去上清后风干，沉淀溶于30μLddH2O，1%凝胶电泳切胶后用DNA凝胶试剂盒回收，用于下一步连接转化。20 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究2.3.2大片段dsRNA中间部分序列的cDNA克隆大片段dsRNA中间部分cDNA的序列是运用特异性引物进行反转录（RT-）PCR克隆获得的。具体方法如下：取8μL经DNaseI处理过的dsRNA，加入1μLDMSO和一对特异性引物（2μmol/L，各1μL）混匀后于98℃变性5-8min，迅速冰水浴3~5min。再依次加入4μL5×反应缓冲液、1μLdNTP（10mmol/L）、0.5μLRNaseTM抑制剂（40U/μL）、0.5μLPrimeScriptⅡReverseTranscriptase（200U/μL）以及6μLDEPC-H2O，混合均匀后置于42℃条件下反应1.5h。反应体系如下：取上述反应液1μL，然后依次加入5μL10×PCRBuffer缓冲液、2μLMgSO4（25mM）、2μL特异性引物（20μmol/L，各1μL）、5μLdNTP（2mM）、1μLKOD-Plus聚合酶（1U/μL）、34μLddH2O，总体积为50μL，混匀后于PCR仪中进行PCR仪扩增。PCR循环条件为：94℃预变性2min，然后94℃变性20s，55℃退火30s，68℃延伸3min，共30个循环，最后68℃延伸10min，16℃冷却4min。PCR反应完成后，使用1%的琼脂糖进行凝胶电泳检测RT-PCR扩增结果。2.3.3dsRNA末端cDNA序列的获取dsRNA末端序列的克隆是通过在dsRNA的3’末端加上一段已知序列的寡核苷酸片段（110A）来实现。使用与该序列互补的引物（RC110A），以及另一段根据已知序列设计出的引物，通过进行RT-PCR获取dsRNA末端序列的cDNA。在对dsRNA进行DNaseI处理并使用凝胶回收纯化后，进行接头的连接反应，具体的反应体系如下：13μLdsRNA，4μLRNALigasebuffer，1μLRNALigase，1μLRNase抑制剂（40U/μL），1μL接头110A（100μM），20μL40%PEG6000，混匀后于16℃水浴16-18h。连接反应完成后用PCR回收试剂盒（Axygen）进行dsRNA的回收纯化，并溶解于10μL的DEPC-H2O中，用于反转录试验。具体方法参考说明书：（1）在PCR反应液中加3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A不足100μL，加至100μL）；混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管中，12000×g离心1min，舍弃2mL离心管中的废液。（2）将制备管置回2mL离心管，加700μLBufferW2，12000×g离心1min，舍弃2mL离心管中的废液。（3）将制备管置回2mL离心管，加400μLBufferW2，12000×g离心1min，舍弃21 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2mL离心管中的废液。（4）将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min。（5）将DNA制备管置于一新的1.5mL离心管中，加25μL65℃预热的ddH2O洗脱，于室温静置2min。再12000×g离心1min，收集管中液体即为清洁后的dsRNA片段。1μLDMSO和1μL接头互补引物RC110A（2μM）与回收纯化的dsRNA混匀后于98℃变性5-8min，迅速冰水浴3~5min。再依次加入5μL5×反应缓冲液、1μLdNTP（10mM）、1μLRNase抑制剂、1μLRC110A（2μmol/L）、1μL反转录酶及6μLDEPC-H2O，混合均匀后置于42℃条件下反应1.5h。将反应后的溶液按照如下体系配制PCR体系用于PCR扩增：1μLcDNA、5μL10×PCRBuffer缓冲液、2μLMgSO4（25mM）、1μL末端特异性引物（20μmol/L）、1μL接头互补引物RC110A（20μmol/L），5μLdNTP（2mM）、1μLKOD-Plus聚合酶（1U/μL），加34μLddH2O使总体积为50μL。PCR循环条件为：94℃预变性2min，然后94℃变性20s，55℃退火30s，68℃延伸3min，共30个循环，最后68℃延伸10min，16℃冷却4min。PCR反应完成后，使用1%的琼脂糖进行凝胶电泳检测RT-PCR扩增结果。2.4小于3.0kb片段cDNA的克隆序列的克隆是通过在dsRNA的3’末端加上一段已知序列的寡核苷酸片段（BPA）来实现，使用与该序列互补的引物（RCBPA），通过进行RT-PCR获取dsRNA末端序列的cDNA。向用凝胶回收纯化后dsRNA（13μL）中加入4μLRNALigasebuffer，1μLRNALigase，1μLRNase抑制剂（40U/μL），1μL接头BPA（100μM），20μL40%PEG6000，混匀后于16℃水浴16-18h。连接反应完成后用PCR回收试剂盒进行dsRNA的回收纯化，并溶解于10μL的DEPC-H2O中，用于反转录试验。加入1μLDMSO和1μL接头互补引物RCBPA（2μM）与回收纯化的dsRNA混匀后于98℃变性5-8min，迅速冰水浴3~5min。再依次加入5μL5×反应缓冲液、1μLdNTP（10mmol/L）、1μLTMRNase抑制剂、1μLPrimeScriptⅡReverseTranscriptase（200U/μL）及6μLDEPC-H2O，混合均匀后置于42℃条件下反应1.5h。将反应后的溶液按照如下体系配制PCR体系用于PCR扩增：1μLcDNA、5μL10×PCRBuffer缓冲液、2μLMgSO4（25mM）、1μL接头互补引物RC110A（2022 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究μmol/L）、5μLdNTP（2mM）、1μLKOD-Plus聚合酶（1U/μL），加35μLddH2O使总体积为50μL。PCR循环条件为：94℃预变性2min，然后94℃变性20s，55℃退火30s，68℃延伸3min，共30个循环，最后68℃延伸10min，16℃冷却4min。PCR反应完成后，使用1%的琼脂糖进行凝胶电泳检测RT-PCR扩增结果。2.5目标cDNA片段的T载体连接转化2.5.1cDNA的A-Tailing及与T载体的连接用随机引物合成的cDNA片段，以及使用高保真KOD-plus-DNA聚合酶进行PCR扩增获得的cDNA片段，需要在其产物3’末端加腺嘌呤（A）以便与T载体进行连接，进而进行大肠杆菌的转化和插入序列的测定。首先用PCR纯化试剂盒对PCR所获得的cDNA片段进行纯化，取10μL用上述方法清洁后的cDNA，加入5μL10×PCRBuffer，0.5μLTaqDNA聚合酶（5U/μL），1μLdATP（10mM），1μLdNTP（2.5mM），最后加入ddH2O至总体积为50.0μL。将体系混合均匀后置于72℃条件下反应15min，反应结束后使用PCR纯化试剂盒进行回收纯化。取4.5μLcDNA，加入0.5μLpMD18-T和5μLSolutionI，混合均匀后置于16℃低温水浴锅内反应16~18h。2.5.2目标载体转化大肠杆菌感受态细胞向与pMD18-T载体连接后的产物中加入10μL5×KCM和30μLddH2O，混匀后加到50μL大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上静置20min，再于37℃热激5min，最后加入900μL37℃预热的SOC培养基，混合均匀后置于37℃恒温摇床中150r/min培养lh。将培养好的菌液均匀涂布于LA平板上（Amp，50μg/mL），在超净工作台中吹干后，将平板置于37℃培养箱中黑暗培养至单菌落出现（12~16h）。2.5.3重组质粒的检测重组质粒的鉴定采用PCR的方法进行。随机挑取抗性平板中的大肠杆菌单菌落于1mL的LB培养基（Amp，50μg/mL）中，37℃下振荡培养（150r/min）8~10h后，取摇培好的菌液进行PCR检测，反应体系为：1μL菌液、5μL10×PCRBuffer、0.5μLTaqDNA聚合酶（5U/μL）、0.5μL引物M13F（-47）（20μM）、0.5μL引物M13R（-48）（20μM）和1μLdNTP（2.5mM），最后加ddH2O至总体积为20μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸23 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3min，共30个循环，最后72℃延伸10min，16℃冷却4min。PCR反应完成后，使用1%的琼脂糖进行凝胶电泳检测RT-PCR扩增结果。选取PCR检测结果符合预期的单克隆大肠杆菌菌液送公司（北京奥科鼎盛生物科技有限公司）测序。2.6Nortnern杂交2.6.1电泳、转膜及固定将提取的灰葡萄孢HBstr-470的dsRNA在1%的琼脂糖凝胶中于4℃条件下低电压电泳8-12h（1V/cm）。电泳结束后，参考吴明德（2012）的转膜方法，具体如下：用手术刀片将凝胶切割到合适大小后置于0.1mol/LNaOH溶液中浸泡10min，然后转于0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）中浸泡20min，再用20×SSC浸泡处理15min；转膜时，取用一个比凝胶面积大的有机玻璃平台，将其放入盛有20×SSC玻璃缸中，在平台上铺一张浸湿滤纸并使其两端浸入SSC中，同时用玻璃棒赶掉滤纸与平台间的气泡；将凝胶放于平台上滤纸中央使反面朝上，用Parafilm膜围绕四周以防止液体自液池TM+直接流至凝胶上方的纸巾层中；剪裁下大小与凝胶接近的Immobilon-Ny尼龙膜（Zeta-ProbeBlottingMembranes,BIO-RAD），用ddH2O湿润后再用20×SSC浸泡5min；处理好的尼龙膜轻放在凝胶上面，使它们边缘基本对齐，再在尼龙膜上放置两张与凝胶同样大小的用20×SSC湿润的滤纸，注意滤纸、凝胶和尼龙膜之间不能留有气泡；将一叠整齐的纸巾(略小于滤纸)放置在滤纸的上方，并在纸巾上放一块平板，然后用质量约200g的重物压实，静置16h以上使dsRNA充分转移到尼龙膜上，其间勤换纸巾。转膜结束后，用10×SSC清洗尼龙膜以除去滤膜上的琼脂糖碎片，室温凉干后将其放在两张滤纸中间，于紫外交联仪中进行交联。交联后用于杂交或夹在两张滤纸中置于4℃条件下保存。2.6.2GE探针的标记探针标记根据试剂盒（GEHeathcare）中探针标记的方法进行，具体步骤为：（1）使用特异性引物对运用反转录PCR分别获得相应的探针模板，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后，将DNA浓度稀释为10ng/μL（核酸中盐的含量必须低于50mM）。（2）取7μLDNA和3μLDNAMarker于PCR管中混匀，用离心机离心后，95℃变性5min，将变性的DNA迅速放在冰上5min，离心。24 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究（3）取20μLCross-linker，加入80μL水配成工作液，可于2~8℃放一周。（4）首先加入10μL的reactionbuffer，轻轻混匀（冰上操作），再加入2μL的labellingreagent轻轻混匀，最后加入10μL的cross-linkerworkingsolution，混匀后离心，37℃下反应30min。（5）将标记好的探针用于预杂交和杂交。若不立即使用，可在冰上放置2h或长期储存于50%甘油中。2.6.3预杂交与杂交2根据杂交膜的面积，按0.125mL/cm计算杂交液体积，另加入0.5M/L的NaCl，4%的blockingreagent，55℃旋转混匀1-2h。将膜放入杂交管，避免膜和管壁间产生气泡并使其正面朝向杂交管的内部，放于杂交炉中于55℃，60r/min预杂交15min。将标记好的探针按终浓度5-10ng/mL的浓度加入杂交管底，55℃杂交12h左右。2.6.4GE洗膜及CDP-star显色2根据膜的大小按2-5mL/cm计算Primarywashbuffer体积，将膜小心转入55℃预热的Primarywashbuffer中，于55℃下定时洗打10min，再重复一次；接着用过量的Secondarywashbuffer室温洗5min，再重复一次后将膜取出，放在保鲜膜上，2向膜上均匀滴加30-40mL/cm的CDP-star，再用保鲜膜盖住，显色2-5min，放入仪器曝光。2.7灰葡萄孢HBstr-470中真菌病毒的垂直传播真菌病毒的垂直传播是指病毒通过宿主真菌产生的有性或无性孢子传播到下一代（Nuss2005）。本试验通过研究菌株HBstr-470分生孢子中携带病毒的情况来验证菌株HBstr-470中真菌病毒的垂直传播特性。将菌株HBstr-470接种在PDA平板上培养5~6d至大量分生孢子形成。将载玻片浸泡在75%的医用酒精中消毒30min后置于超净工作台中风干，用灭菌的棉签粘取适量HBstr-470分生孢子涂在载玻片上并置于显微镜载物台上，使涂有孢子的一面朝下。随后用拉制好的玻璃毛细管针头置于显微镜下粘取载玻片上的单分生孢子并转移至水琼脂块上，将琼脂块转接到PDA平板上，20℃下培养并观察菌落形态及用RT-PCR检测单分生孢子后代中病毒存在情况。25 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.8平板对峙培养介导的病毒的水平传播水平传播是指真菌病毒通过菌丝融合或者菌丝接触从宿主菌株传播到受体真菌菌株中（Nuss2005）。平板两两配对的培养试验采用弱毒菌株HBstr-470为供体菌株，强毒菌株HeBtom-25和HNstr-2为受体菌株。将供试菌株活化后，用灭菌的打孔器（直径5mm）在供试菌株菌落边缘打取菌丝块。将供体菌株HBstr-470的菌丝块接种于PDA平板上，使菌丝块距离培养皿边缘约1cm，至于20℃下培养1d后将受体菌株HeBtom-25（或HNstr-2）的菌丝块接种于该平板上，菌丝块距培养皿边缘约1cm，且两菌丝块之间相距约1.5cm。置于20℃下培养4~5d后，观察配对培养的形态，并在强毒菌株菌落远离HBstr-470接种点的区域挑取菌丝块转接于PDA平板上，20℃培养。菌株配对培养所挑取的衍生菌株进一步进行致病力、生长速度的测定及dsRNA的检测。2.9原生质体融合介导的病毒的水平传播2.9.1菌丝的培养hyg在铺有玻璃纸的PDA平板上接种灰葡萄孢B05.10的菌丝块和灰葡萄孢HBstr-470的孢子悬浮液，于20℃培养48h后收集菌丝。用榨汁机磨碎菌丝并加入100mLPDB混匀，转移至三角瓶（250mL）中，于20℃，150r/min摇培8~10h。2.9.2酶液的配置将1gLysingenzymes和0.1g蜗牛酶（snailase）溶解于1MD-sorbital中，于4℃，12000r/min下离心20min，再依次用孔径为0.45μm和0.22μm的细菌过滤器过滤后定容至100mL。2.9.3原生质体的制备将摇培好的菌丝于室温下4000r/min离心10min后弃上清，接着用2倍体积的1MD-sorbital溶液悬浮沉淀，4000r/min离心10min，弃上清。将菌丝和酶液按照1:3的比例混合，震荡使完全混匀后于30℃，80r/min下摇培1.5h后镜检，每隔1h镜检一次原生质体的释放情况。若有大量原生质体释放，则用3层擦镜纸过滤，收集的滤液于4℃，2000r/min离心10min。用1MD-sorbital悬浮沉淀，4℃下，2000r/min离心10min，弃上清并重复一次。最后用适量体积STC悬浮沉淀，加入终浓26 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究度10%DMSO并小心混匀后置于-80℃保存备用。2.9.4原生质体间的融合hyg取菌株HBstr-470的原生质体200μL和菌株B05.10的原生质体20μL，轻轻混匀后加入40μL40%PEG3350溶液并再轻轻混匀，30℃水浴10min。将混合液与100mLTB3培养基混匀，倒平板（每皿20mL），置于20℃下培养直至有菌丝萌发。随后在TB3平板上倒一层含50μg/mL潮霉素的PDA，于20℃培养3d后挑取菌丝于PDA（潮霉素，50μg/mL）上筛选。所挑取的衍生菌株进一步对其进行致病力、生长速度的测定及dsRNA的检测。2.10不同灰葡萄孢菌株遗传背景的RAPD分析为了确定水平传播试验获得的菌株来源于相应的受体菌株，而非其它菌株污染，该试验利用随机扩增多态性DNA（RAPD）比较亲本菌株和衍生菌株的遗传背景。采用CTAB法（Mölleretal1992）提取供试菌株菌丝中的DNA，以菌株的总DNA（50-100ng/μL）为模板，使用10碱基引物OPW-04（附表1）进行PCR扩增。反应体系为：1μLDNA（50ng）、1μL引物OPW-04（20μM）、0.25μLTaqDNApolymerase、2.5μL10×PCRbuffer和1μLdNTP（s2.5mM），加ddH2O定容至25μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，然后94℃变性30s，30℃退火30s，72℃延伸2min，共40个循环，最后72℃延伸10min，16℃冷却4min。反应结束后，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶成像检测产物条带的多态性，区分不同菌株的遗传背景。3结果与分析3.1灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的检测及序列分析通过对菌株HBstr-470菌丝中dsRNA的提取及1%凝胶电泳分析发现，菌株HBstr-470中含有8条dsRNA条带dsRNA1~8，大小约为2.0~15.0kb（图3-1A）。对dsRNA片段的cDNA序列进行克隆测序后（附图1~5），分别获得8条全长cDNA序列。GenBank登录号分别为MH347276、MH347277、MH347278、MH347279、MH347280、MH347281、MH347282、和MH347283。基于测得的每条cDNA全长序列设计特异性DNA探针P（1~8）进行Northern杂交，每条特异性探针仅可以和相对应的dsRNA进行杂交，有明显的杂交信号，验27 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文证了病毒基因组序列的准确性（图3-1B和C）。图3-1灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA检测（A）、Northern杂交验证（B）和基因组模式图（C）Fig.3-1DetectionofdsRNAelements(A),Northernhybridizationsandschematicdiagramsshowingthegeneticorganization(C)inB.cinereastrainHBstr-47028 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究图3-2菌株HBstr-470中真菌病毒与其他病毒RdRp的系统进化分析病毒的缩写见附表2Fig.3-2PhylogeneticanalysisofRdRpformycovirusesinstrainHBstr-470andotherviruesSeevirusabbreviationinTableS23.1.1SsHV2/HBstr-470的全长cDNA序列分析SsHV2/HBstr-470基因组全长15222nt（除polyA），编码一个ORF，始于核苷酸470位至14893位，编码1个含4807个氨基酸的多聚蛋白，分子量约为542kDa。含有3个保守结构域，包含Prot（木瓜类似蛋白酶）、RdRp（依赖于RNA的RNA复制酶）和Helicase（解旋酶）（图3-1C）。图3-3SsHV2/HBstr-470和相关病毒的RdRp的保守结构域的氨基酸序列多重比较分析“*”表示完全一样的氨基酸，“.”表示化学上相似的氨基酸。病毒的缩写见附表2.Fig.3-3MultiplealignmentsoftheaminoacidsequencesoftheconservedmotifsintheRdRpinSsHV2/HBstr-470andrelatedvirus“*”representtheidenticalaminoacids,“.”Representthechemically-similaraminiacids.SeevirusabbreviationsinTableS2.29 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文SsHV2/HBstr-470核苷酸序列与SsHV2/SX247（Huetal2014）的序列一致性较高，同源性为98.11%，全长氨基酸序列同源性高达98.04%。此外，RdRp序列含有与其他减毒病毒相似的保守结构域（图3-3），基于RdRp构建系统发育树，SsHV2/HBstr-470与SsHV2/SX247聚为一支，同属于Hypoviridae中的Alpahypovirus，与SsHV2/SX247为同种病毒（图3-2A）。3.1.2BcHV1/HBstr-470的全长cDNA序列分析BcHV1/HBstr-470全长10217nt（除polyA），编码一个ORF，始于核苷酸396位至9293位，编码1个含2965个氨基酸的多聚蛋白，分子量约为336kDa。含有4个保守域，包含Prot、RdRp、Helicase和UGT（葡糖基转移酶）（图3-1C）。BcHV1/HBstr-470核苷酸序列与BcHV1/HBtom-372（Haoetal2018）的序列一致性较高，同源性为97.81%，全长氨基酸序列同源性高达98.55%。此外，RdRp序列含有与其他减毒病毒都具有的8个保守结构域，即MotifⅠ到MotifⅧ（图3-4）。基于RdRp构建系统发育树，BcHV1/HBstr-470与BcHV1/HBtom-372构成一支，属于Hypoviridae病毒科中的Betahypovirus，与BcHV1/HBtom-372为同种病毒（图3-2A）。图3-4BcHV1/HBstr-470和相关病毒的RdRp的保守结构域的氨基酸序列多重比较分析“Ⅰ”到“Ⅷ”分别表示MotifⅠ到MotifⅧ。“*”表示完全一样的氨基酸，“.”表示化学上相似的氨基酸。病毒的缩写见附表2.Fig.3-4MultiplealignmentsoftheaminoacidsequencesoftheconservedmotifsintheRdRpinBcHV1/HBstr-470andrelatedvirus“Ⅰ”to“Ⅷ”representMotifⅠtoMotifⅧ.“*”representtheidenticalaminoacids,“.”Representthechemically-similaraminiacids.SeevirusabbreviationsinTableS2.3.1.3BcVV1/HBstr-470的全长cDNA序列分析BcVV1/HBstr-470基因组全长为5228bp，编码两个ORF（ORF1和ORF2），其中靠近5’端的ORF1编码一个含807个氨基酸的衣壳蛋白（CP），分子量约为85kDa，核苷酸位置为192-2615nt，靠近3’端的ORF2编码一个含838个氨基酸的RdRp，分子量约为92kDa，核苷酸位置为2612-5128nt（图3-1C）。ORF1的终止密码子与ORF2的起始密码子在2612-2615nt位有个四核苷酸（AUGA）的重叠。BcVV1/HBstr-470核苷酸序列与Botryotiniafuckelianatotivirus1的序列一致性较高，同源性为77.10%，RdRp全长氨基酸序列同源性高达86.52%，CP全长氨基酸序列30 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究同源性高达95.56%。RdRp序列含有与其他属于Totiviridae病毒都具有的8个保守结构域，即MotifⅠ到MotifⅧ（图3-5）。基于RdRp的第一到第八个Motif构建系统发育树，结果表明：BcVV1/HBstr-470与BfTV1聚为一支，为同种病毒，同属于Totiviridae病毒科中的Victorivirius。图3-5BcVV1/HBstr-470和相关病毒RdRp的保守结构域的氨基酸序列多重比较分析“Ⅰ”到“Ⅷ”分别表示MotifⅠ到MotifⅧ。“*”表示完全一样的氨基酸，“.”表示化学上相似的氨基酸。病毒的缩写见附表2.Fig.3-5MultiplealignmentsoftheaminoacidsequencesoftheconservedmotifsintheRdRpinBcVV1/HBstr-470andrelatedvirus“Ⅰ”to“Ⅷ”representMotifⅠtoMotifⅧ.“*”representtheidenticalaminoacids,“.”Representthechemically-similaraminiacids.SeevirusabbreviationsinTableS2.3.1.4BcRV2/HBstr-470的全长cDNA序列分析BcRV2/HBstr-470含有三条dsRNA（S1、S2和S3），全长分别为4996bp、4263bp和3931bp，S1和S2都含有一个大的ORF，分别编码一个假定蛋白和RdRp，S3含有两个ORF，目前没有比对出与之同源的病毒序列（图3-1C）。S1、S2和S3的5’末端和3’末端具有一定的保守性，5’末端的30-nt的核苷酸同源性为76.67%，3’末端的约90-nt的核苷酸同源性为71.01%（图3-6）。其中，S1与Grapevineassociatedtotivirus-1（AlRwahnihetal2011）的全长核苷酸序列同源性高达89.30%，S2编码的氨基酸与Rosellinianecatrixquadrivirus1/W1075-P3（Linetal2012）的氨基酸同源性为30.78%，与Amasyacherrydisease-associatedmycovirusLdsRNA3和LdsRNA4（Kozlakidisetal2006）编码的氨基酸的同源性分别为46.70%和49.11%（表3-1）。BcRV2/HBstr-470的RdRp序列与ACD-L3、ACD-L4和RnQV1/W1075都含有相同的8个保守结构域，即MotifⅠ到MotifⅧ（图3-7）。基于RdRp构建系统发育树，BcRV2/HBstr-470与暂未分类的ACD和RnQV1/W1075的构成一大支，可能为Quadrivirade的一个新成员（图3-2B）。31 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图3-6BcRV2/HBstr-470中3条dsRNA（S1、S2和S3）的5’（A）和3’（B）末端序列的联配黑色部分表示相同碱基，“-”表示缺失碱基。Fig.3-6Alignmentofthe5’-terminal(A)and3’-terminal(B)sequencesofthecodingstrandsofS1,S2andS3ofBcRV2/HBstr-470Blackshadingisusedtohighlightidenticalnucleotides.The“-”symbolrepresentsamissingnucleotide.图3-7BcRV2/HBstr-470和相关病毒RdRp的保守结构域的氨基酸序列多重比较分析“Ⅰ”到“Ⅷ”分别表示MotifⅠ到MotifⅧ。“*”表示完全一样的氨基酸，“.”表示化学上相似的氨基酸。病毒的缩写见附表2.Fig.3-7MultiplealignmentsoftheaminoacidsequencesoftheconservedmotifsintheRdRpinBcRV2/HBstr-470andrelatedvirus“Ⅰ”to“Ⅷ”representMotifⅠtoMotifⅧ.“*”representtheidenticalaminoacids,“.”Representthechemically-similaraminiacids.SeevirusabbreviationsinTableS2.3.1.5BcPV2/HBstr-470的全长cDNA序列分析BcPV2/HBstr-470含有两条dsRNA片段，各编码一个ORF，其中较大的片段（1909bp）编码RdRp，较小的片段（1883bp）编码CP（图3-1C）。两条dsRNA的5’末端和3’末端具有较高的同源性，5’末端的86-nt核苷酸同源性为90.80%，3’末端的83-nt核苷酸同源性为60.00%（图3-8），且3’末端都具有类似于poly(A)尾的间断A的富集区域，与Partitiviridae病毒科中其他成员类似。图3-8BcPV2/HBstr-470中两条dsRNA的5’（A）和3’（B）末端序列的联配黑色部分表示相同碱基，“-”表示缺失碱基。Fig.3-8Alignmentofthe5’-terminal(A)and3’-terminal(B)sequencesofthetwocodingstrandsofBcPV2/HBstr-470Blackshadingisusedtohighlightidenticalnucleotides.The“-”symbolrepresentsamissingnucleotide.BcPV2/HBstr-470与SLPV2亲缘关系最近，编码RdRp的核苷酸和RdRp氨基酸全长序列比对同源性分别为56.83%和56.57%，编码CP的核苷酸和CP氨基酸全长序列比对同源性分别为43.48%和31.42%。此外，RdRp序列含有与其他属于32 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究Partitiviridae病毒都具有的6个保守结构域，即MotifⅢ到MotifⅧ（图3-9）。基于RdRp的第一到第六个Motif构建系统发育树，发现BcPV2/HBstr-470与SLPV2聚为一支，属于Partitiviridae病毒科中的Alpartitivirus，为Partitiviridae中的一个新成员（图3-2C）。图3-9BcPV2/HBstr-470和相关病毒RdRp的保守结构域的氨基酸序列多重比较分析“Ⅲ”到“Ⅷ”分别表示MotifⅢ到MotifⅧ。“*”表示完全一样的氨基酸，“.”表示化学上相似的氨基酸。病毒的缩写见附表2.Fig.3-9MultiplealignmentsoftheaminoacidsequencesoftheconservedmotifsintheRdRpinBcPV2/HBstr-470andrelatedvirus“Ⅲ”to“Ⅷ”representMotifⅢtoMotifⅧ.“*”representtheidenticalaminoacids,“.”Representthechemically-similaraminiacids.SeevirusabbreviationsinTableS2.表3-1菌株HBstr-470中真菌病毒与相关病毒的同源性比较Table3-1PercentidentitybetweenmycovirusinstrainHBstr-470andothervirusesdeterminedbysequencealignmentsntidentity(%)aaidentity(%)VirusinstrainHBstr-470ObjectivesFullsequenceFullsequenceRdRpCPSsHV2/HBstr-470SsHV2/SX24798.1198.04--BcHV1/HBstr-470BcHV1/HBtom-37297.8198.55--BcVV1/HBstr-470BfTV177.10-86.5295.56BcRV2/HBstr-470-P1RnQV1/W1075-P136.0311.21--ACD-L139.3322.8--ACD-L240.8421.11--BcRV2/HBstr-470-P2RnQV1/W1075-P343.5930.78--ACD-L352.2846.7--ACD-L453.2349.11--BcRV2/HBstr-470-P3RnQV1/W1075-P134.42---RnQV1/W1075-P234.38---RnQV1/W1075-P436.45---ACD-L134.25---ACD-L234.87---BcPV2/HBstr-470-P1SLPV256.8356.57--BcPV2/HBstr-470-P2SLPV243.4831.42--Bc378V138.0613.37--“-”表示未进行同源性比对33 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3.2灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的垂直传播通过对菌株HBstr-470的分生孢子进行单孢分离，共挑取了150个单分生孢子，这150个单孢后代菌株均表现出与亲本菌株HBstr-470一致的表型，包括较慢的生长速度，边缘的不整齐，以及产生大量的分生孢子。随机选取其中14个单孢菌株提取菌丝中dsRNA，并利用特异性引物对上述5种病毒进行RT-PCR检测。结果发现：所检测的14个单孢菌丝中都含有亲本菌株HBstr-470中的5种病毒（图3-10），表明菌株HBstr-470中的dsRNA病毒能通过产生分生孢子进行稳定的垂直传播。图3-10RT-PCR检测灰葡萄孢HBstr-470的14个单分生孢子后代Fig.3-10RT-PCRdeterminationoffourteenconidiaofB.cinereastrainHBstr-4703.3灰葡萄孢HBstr-470中dsRNA的水平传播以菌株HBstr-470为供体，分别以菌株HeBtom-25和HNstr-2为受体在PDA培养基上进行配对培养（图3-13、3-14），对HBstr-470/HeBtom-25和HBstr-470/HNstr-2两个配对培养组合所获的衍生菌株进行RT-PCR检测（图3-11），并从中选取共8个菌株进行生物学特性研究。其中，6个衍生菌株来自菌株HeBtom-25，命名为T1、T2、T8、T11、T15和T17；另2个菌株来自菌株HNstr-2，命名为T22和T24。RADP分析表明，衍生菌株T1、T2、T8、T11、T15和T17与受体菌株HeBtom-25的RAPD带型相同，因此可认为它们具有同样的遗传背景；衍生菌株T22和T24与受体菌株HNstr-2的RAPD带型相同，所以T22和T24与受体菌株HNstr-2具有同样的遗传背景；同时，8个衍生菌株和2个受体菌株的RAPD带型与供体菌株不一致（图3-12），表明该8个衍生菌株都来自于相应的受体菌株，而非其它菌株的污染。34 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究图3-11RT-PCR检测供体菌株、受体菌株及衍生菌株Fig.3-11RT-PCRdeterminationofdonor,recipientandderivativestrains图3-12OPW-04引物对不同灰葡萄孢菌株的RAPD带型分析Fig.3-12RAPDprofilingfordifferentisolatesofB.cinereausingrandomprimerOPW-04菌株HBstr-470和HeBtom-25配对培养后，菌株HeBtom-25的菌丝生长受到抑制（图3-13A）。20℃下，在PDA培养基上，6个衍生菌株的菌丝生长速度明显下降，为6.7~12.2mm/d，显著低于受体菌株HeBtom-25（15.6mm/d）（图3-13C）。致病力测定结果表明，衍生菌株菌丝在本氏烟叶片上接种72h后的平均病斑直径为0.5-18.9mm，显著小于菌株HeBtom-25（26.5mm）（P<0.05）（图3-13B和E）；除仅感染BcHV1/HBstr-470的菌株T8外，其余5个衍生菌株菌落上均能产生大量的分生孢子，分生孢子产量显著升高（P<0.05）（图3-13A和D）。35 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图3-13灰葡萄孢菌株HBstr-470中dsRNA的水平传染及传染后菌株HeBtom-25衍生菌株的生物学特性菌株HBstr-470和HeBtom-25的单独培养和配对培养（PDA、20℃、6d）及菌株HBstr-470、HeBtom-25和HBstr-470/HeBtom-25配对培养产生的HeBtom-25的6个衍生菌株的菌落形态（PDA、20℃、15d），白色“*”表示在此处挑取菌丝块形成HeBtom-25衍生菌株（A）；菌株HBstr-470、HeBtom-25和HeBtom-25的6个衍生菌株对离体本氏烟叶片的致病力（20℃，72h）（B和E）、生长速度（C）及分生孢子产量（D）；“﹢”、“﹣”和“﹢/﹣”分别表示病毒存在、不存在和不稳定存在。Fig.3-13HorizontaltransmissionofdsRNAsinB.cinereastrainHBstr-470andthebiologicalcharacteristicsofsixderivativeisolatesTwosingleculturesofstrainHBstr-470andHeBtom-25,respectively,andapaircultureofHBstr-470/HeBtom-25onPDA(20℃,6d),andPDAcultures(20℃,15d)ofstrainsHBstr-470,HeBtom-25andsixderivativeisolatesgeneratedfromstrainHeBtom-25inthepairculturesofHBstr-470/HeBtom-25,thewhite“*”indicatestheareawhereamycelialagarplugwastakenforgenerationofaderivativeisolateofHeBtom-25(A);pathogenicityondetachedN.benthamianaleaves(BandE),growthrate(C)andyieldofconidia(D)ofstrainsHBstr-470,HeBtom-25andsixderivativeisolatesofHeBtom-25,thesymbols“﹢”,“﹣”and“﹢/﹣”indicatethepresence,absenceandinstableofmycovirus,respectively.20℃下，在PDA培养基上，衍生菌株T22和T24的菌丝生长速度（图3-14C）和接种72h的病斑直径（图3-14B和E）分别约为15.5mm/d和23.5mm，与受体菌株HNstr-2无显著差异（P>0.05）；但2个衍生菌株菌丝都有黑色色素的沉积，且菌落上均能产生大量的分生孢子，分生孢子产量显著升高（P<0.05）（图3-14A和D）。hyg以菌株HBstr-470和B05.10为分别为供体和受体，通过原生质体融合进行dsRNA的水平传播，获得衍生菌株T36。20℃下，在PDA培养基上，衍生菌株T3636 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究hyg的菌丝生长速度为15.6mm/d，与受体菌株B05.10无显著差异（P>0.05）（图3-15C），但菌落上形成大量的气生菌丝，并产生大量的分生孢子，分生孢子产量显著升高（P<0.05）（图3-15A和D）；菌株T36的致病力显著下降，在本氏烟叶片上接hyg种72h造成的平均病斑直径为14.9mm，显著低于受体菌株B05.10（26.4mm）（P<0.05）（图3-15B和E）。图3-14灰葡萄孢菌株HNstr-2感染菌株HBstr-470中真菌病毒后衍生菌株的生物学特性菌株HBstr-470、HNstr-2和HBstr-470/HNstr-2配对培养产生的HNstr-2的2个衍生菌株的菌落形态（PDA、20℃、15d）、对离体本氏烟叶片的致病力（20℃，72h）（B和E）、生长速度（C）及分生孢子产量（D）；“﹢”、“﹣”和“﹢/﹣”分别表示病毒存在、不存在和不稳定存在。Fig.3-14BiologicalcharacteristicsofderivativeisolatesofstrainHNstr-2infectedbydsRNAsfromB.cinereastrainHBstr-470PDAcultures(20℃,15d)(A),pathogenicityondetachedN.benthamianaleaves(BandE),growthrate(C)andyieldofconidia(D)ofstrainsHBstr-470,HNstr-2andtwoderivativeisolatesofHNstr-2inthepairculturesofHBstr-470/HNstr-2,thesymbols“﹢”,“﹣”and“﹢/﹣”indicatethepresence,absenceandinstableofmycovirus,respectively37 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文hyg图3-15灰葡萄孢菌株B05.10感染菌株HBstr-470中真菌病毒后衍生菌株的生物学特性hyghyghyg菌株HBstr-470、B05.10和HBstr-470/B05.10原生质体融合产生的B05.10的衍生菌株的菌落形态（PDA、20℃、15d）、对本氏烟叶片的致病力（20℃，72h）（B和E）、生长速度（C）及分生孢子产量（D）；“﹢”、“﹣”和“﹢/﹣”分别表示病毒存在、不存在和不稳定存在。hygFig.3-15BiologicalcharacteristicsofderivativeisolatesofB05.10infectedbydsRNAsfromB.cinereastrainHBstr-470PDAcultures(20℃,15d)(A),pathogenicityondetachedN.benthamianaleaves(BandE),growthrate(C)andyieldofconidia(D)ofstrainsHBstr-470,B05.10hygandtwoderivativehygisolatesofB05.10,thesymbols“﹢”,“﹣”and“﹢/﹣”indicatethepresence,absenceandinstableofmycovirus,respectively.图3-16BcHV1感染HBtom-459后衍生菌株的生物学特性比较菌株HBtom-459、T8/HBtom-459配对培养产生的HBtom-459的衍生菌株Z5（BcHV1/HBstr-470）和Z33（BcHV1/HBtom-372）的菌落形态（PDA、20℃、15d）、对离体本氏烟叶片的致病力（20℃，72h）（B和D）、生长速度（C）及BcHV1的RT-PCR检测（E）Fig.3-16BiologicalcharacteristicsofderivativeisolatesofHBtom-459infectedbyBcHV1PDAcultures(20℃,15d)(A),pathogenicityondetachedN.benthamianaleaves(BandD),growthrate(C)anddetectionBcHV1byRT-PCR(E)ofstrainsHBtom-459,derivativeisolateofHNstr-2inthepairculturesofT8/HBtom-459(Z5)andZ33(BcHV1/HBtom-372).38 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究4讨论灰葡萄孢菌株HBstr-470由5种真菌病毒复合侵染，分别为SsHV2/HBstr-470、BcHV1/HBstr-470、BcVV1/HBstr-470、BcRV2/HBstr-470和BcPV2/HBstr-470。除polyA外，SsHV2/HBstr-470和BcHV1/HBstr-470的cDNA序列全长分别为15222nt和10217nt，分别与SsHV2/SX247（Huetal2014）和BcHV1/HBtom-372（Haoetal2018）的核苷酸序列高达98.11%和97.81%，同属于Hypoviridae。BcVV1/HBstr-470基因组全长为5228bp，与BfTV1的核苷酸序列同源性为77.10%。基于RdRp的系统进化分析表明，BcVV1/HBstr-470属于Totiviridae中的Victorivirius。此外，BcVV1/HBstr-470的基因组编码的两个重叠的ORF（CP和RdRp）之间通过四核苷酸（AUGA）序列连接，采用终止与重新启动机制实现蛋白的表达，这与Victorivirius属的病毒RdRp和CP的表达策略是一致的（Ghabrial2008）。BcRV2/HBstr-470由全长分别为4996bp、4263bp和3931bp的三条dsRNA组成，与RnQV1/1075对应的三条序列的核苷酸序列同源性分别为36.03%、43.59%和36.45%，没有发现与RnQV1/W1075（Linetal2012）中编码CP蛋白同源的dsRNA片段。尽管采用了宏转录组深度测序技术，仍没有发现编码CP蛋白的dsRNA片段，我们猜测BcRV2/HBstr-470可能为Quadrivirade的一个新成员，但并不编码CP蛋白，而是依赖于菌株HBstr-470中其它病毒的序列码CP。BcPV2/HBstr-470含有两条dsRNA片段，分别编码RdRp和CP，分别与SLPV2的核苷酸同源性为56.83%和43.48%，RdRp序列含有与其他双分病毒都具有的6个保守结构域（Ⅲ~Ⅷ），在系统进化上属于Partitiviridae中的Alpartitiviridae，为Partitiviridae中的一个新成员。菌株HBstr-470中的真菌病毒能通过分生孢子稳定地垂直传播给后代菌株（图3-10）。菌株HBstr-470中的真菌病毒也能够通过水平配对培养的菌丝接触和原生质体融合，水平传播到其他灰葡萄孢菌株中（图3-13、3-14、3-15）。通过比较感染不同病毒的衍生菌株的生物学特性，结果发现：SsHV2/HBstr-470、BcVV1/HBstr-470可能可以导致感染病毒后分生孢子产量的增加；BcHV1/HBstr-470则可能与感染病毒后菌株致病力的衰退有关；BcRV2/HBstr-470则可能与生长速率的降低、分生孢子产量的增加和致病力的衰退有关；最后，BcPV2/HBstr-470可能与致病力衰退和分生孢子产量的增加有关。39 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文尽管BcHV1/HBstr-470和BcHV1/HBtom-372的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性高达98%，但是单独感染BcHV1/HBstr-470的菌株T8（HeBtom-25）的菌落形态异常，不形成菌核，生长速度和致病力显著下降，而单独感染BcHV1/HBtom-372的菌株Z33的致病力衰退，但菌落形态和生长速度与亲本菌株HBtom-459无显著差异（Haoetal2018）。将菌株T8与HBtom-459平板配对培养，获得BcHV1/HBstr-470感染菌株Z5（图3-16E），通过生物学测定发现：菌株Z5（BcHV1/HBstr-470）和Z33（BcHV1/HBtom-372）的菌落形态和生长速度亲本菌株HBtom-459无明显差异，而致病力显著降低（P<0.05）（图3-16）。由此推测，BcHV1感染对菌株T8和Z33的影响不同是由于菌株遗传背景不一致。一种病毒的感染可能引起部分菌株的衰退，但同时对某些菌株不产生影响，进而能在自然界中存活和传播。此外，利用真菌病毒弱毒现象进行生物防治时，由于该真菌病毒可能对某些菌株的致病力无影响，可能存在抗病毒风险。40 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究第四章灰葡萄孢HBstr-470分生孢子形成阶段相关基因分析RNA-seq能从RNA水平上研究真菌的生长发育，检测基因的表达水平，并对DEGs进行筛选与功能分析。感染病毒的灰葡萄孢菌株HBstr-470表现出了与不带毒灰葡萄孢菌株明显不同的生物学特性，包括产生大量的分生孢子、生长速度及致病力的下降等。通过RNA-seq对菌株HBstr-470产孢阶段的转录本进行测序及对差异表达基因进行归类和分析可望获取参与菌株HBstr-470分生孢子大量产生的相关基因，及解析该菌产孢早于菌株B05.10且不受光照条件限制的可能机制。1试验材料1.1供试菌株和培养基1.1.1供试菌株灰葡萄孢HBstr-470，灰葡萄孢B05.101.1.2供试培养基PDA，制作方法参见本文的第二章1.2试剂材料RNA提取试剂盒E.Z.N.A.TMFungalRNAKit、巯基乙醇、氯仿、无水乙醇2试验方法2.1样品收集6将菌株HBstr-470和B05.10的分生孢子（10个/mL）涂布在铺有玻璃纸的的PDA平板上，20℃黑暗培养，分别在培养48h、72h收集菌丝，-80℃保存备用。每次取样时间点设3次生物学重复。2.2总RNA的提取依据试剂盒E.Z.N.A.TMFungalRNAKit的实验步骤提取真菌菌丝TotalRNA。2.3文库构建和Illumina测序RNA样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA。随后加入fragmentationbuffer将41 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymeraseI合成二链cDNA，随后利用AMPureXPbeads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。文库构建完成后，使用Agilent2100Bioanalyzer和TMQ-PCR方法对质量。库检合格后，用IlluminaHiSeq2000测序仪测序。2.4原始数据分析与参考序列比对将高通量测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别（BaseCalling）分析转化为原始测序序列（RawReads），结果以FASTQ文件格式存储，其中包含reads序列信息以及其对应的测序质量信息。测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对rawreads进行过滤，得到cleanreads，后续分析都基于cleanreads。选取HISAT软件将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。2.5基因与转录本定量分析在RNA-seq分析中，我们通过定位到基因组区域或基因外显子区的reads的计数来估计基因的表达水平。Reads计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度和测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性，表达定量的结果以FPKM为单位，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因差异表达。2.6差异表达基因筛选2本研究中采用基于负二项分布（Kij~NB(μij,σij)）的分析方法，对两个样品间的差异表达基因（padj<0.05）进行了筛选。将基因表达水平分析中得到的readcount数据进行标准化，根据模型计算假设检验概率（pvalue），后进行多重假设检验校正，得到错误发现率（FDR）。42 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究3结果与分析3.1RNA质量检测提取的12个菌丝样品的总RNA的28S和18SrRNA条带清晰（图4-1）RNA较为完整。NanoDrop和Agilent2100检测样品RNA的纯度（OD260/280）与完整性（RIN值）均符合RNA-seq建库测序要求。图4-1样品总RNA电泳检测图谱Fig.4-1TotalRNAelectrophoresispatternofsclerotialsamples3.2测序质量评估11个样品的cleanbases在5G以上，Q20的比例高达96%，测序质量较好，可用于后续的基因表达分析（表4-1）。参考菌株B05.10菌丝RNA样品中72h取样点中的一个生物学重复（B-72-1）未达到预期数据量，由于另两个生物学重复效果好，具有代表性，因此后续分析将舍去样品RNAB72-1的数据。此外，样品cleanreads比对到灰葡萄孢参考基因组的比例达77%以上，多位点比对reads数低于0.8%（表4-3）。统计分析全部基因的表达丰度，结果发现：0~1、3~15和15~60之间的Unigene相当，分别占总数的20%以上（表4-2）。43 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文表4-1测序产量统计表Table4-1TotaloutputstatisticsofRNA-SeqsequencingSamplesRawCleanCleanErrorrateQ20Q30GCcontentnamereadsreadsbases(%)(%)(%)(%)B-48-143668044410153566.15G0.0297.0792.7646.80B-48-250553204479915867.2G0.0197.5593.8947.41B-48-342360684395323665.93G0.0197.4693.7146.91B-72-248097996455159406.83G0.0296.9192.4246.86B-72-344654890422381806.34G0.0296.6691.8646.78S-48-156852720521525067.82G0.0197.3493.2147.05S-48-253188452507502447.61G0.0197.3993.5846.68S-48-343706720415029286.23G0.0197.4693.8044.28S-72-152541306479812107.2G0.0297.1292.8445.85S-72-246285046432685586.49G0.0197.6194.0645.15S-72-347419828447150686.71G0.0296.9992.6245.57注：Samplesname，菌株(B05.10/B,HBstr-470/S)-取样时间(48h,72h)-生物学重复(1,2,3)表4-2不同FPKM范围分布的基因数量统计Table4-3ThestatisticsofgenenumberofdifferentFPKMrangedistributionFPKMSamplesnameIntervalB-48-1B-48-2B-48-3B-72-2B-72-3S-48-1S-48-2S-48-3S-72-1S-72-2S-72-30~13447391433793004301938933462324131502885275927.04%30.71%26.51%23.57%23.68%30.54%27.16%25.43%24.71%22.63%21.64%1~31622158914691432142613431532138415021413132012.72%12.47%11.52%11.23%11.19%10.54%12.02%10.86%11.78%11.08%10.36%3~153399320532923332339727953244307033623333294926.67%25.14%25.83%26.14%26.65%21.93%25.45%24.08%26.37%26.15%23.13%15~602613240428103200311430662742320528873156374520.50%18.86%22.04%25.10%24.43%24.05%21.51%25.14%22.65%24.76%29.38%>601666163517971779179116501767184718461960197413.07%12.83%14.10%13.96%14.05%12.94%13.86%14.49%14.48%15.38%15.49%注：Samplesname，菌株(B05.10/B,HBstr-470/S)-取样时间(48h,72h)-生物学重复(1,2,3)44 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究表4-3测序数据统计比对Table4-2ComparisonandstatisticsofthesequencingdataSamplesTotalTotalMultipleUniquelyNon-spliceSplicenamereadsmappedmappedmappedreadsreadsB-48-1410153563858376923061238353157266356231171753494.07%0.56%93.51%64.94%28.57%B-48-2479915864547644429153945184905296596481552525794.76%0.61%94.15%61.8%32.35%B-48-3395323663741348619789337215593260836671113192694.64%0.5%94.14%65.98%28.16%B-72-2455159404301457135036242664209309360631172814694.5%0.77%93.73%67.97%25.77%B-72-3422381803965810028508639373014286572751071573993.89%0.67%93.22%67.85%25.37%S-48-1521525064557577116626245409509325201351288937487.39%0.32%87.07%62.36%24.71%S-48-2507502444320035417621043024144298149991320914585.12%0.35%84.78%58.75%26.03%S-48-34150292832109402828083202659426414680561191477.37%0.2%77.17%63.65%13.52%S-72-1479812103977886514455039634315292065501042776582.91%0.3%82.6%60.87%21.73%S-72-24326855835150383832963506708727778323728876481.24%0.19%81.05%64.2%16.85%S-72-34471506835068854838503498500428270673671433178.43%0.19%78.24%63.22%15.02%注：Samplesname，菌株(B05.10/B,HBstr-470/S)-取样时间(48h,72h)-生物学重复(1,2,3)3.3菌株HBstr-470产孢阶段转录组分析3.3.1菌株HBstr-470产孢阶段差异表达基因分析对菌株HBstr-470和B05.10的单分生孢子萌发形成菌落的动态观察结果表明：20℃黑暗条件下，菌株HBstr-470的分生孢子在PDA培养基上培养48h时，萌发形成的菌落上无分生孢子的产生，在培养72h后菌落上开始形成分生孢子；而菌株B05.10的分生孢子在培养72h后菌落上仍无分生孢子的产生。因此，我们将48h（S-48）至72h（S-72）这一阶段视为菌株HBstr-470菌落有无分生孢子形成的阶段，同时以菌株B05.10（B-48和B-72）为对照，进行筛选菌株HBstr-470在不依赖于光照条件并极早产生孢子这一阶段的差异表达基因。45 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文菌落形成分生孢子前后，菌株HBstr-470中DEGs数目为368个（图4-1），其中上调表达的基因259个，下调表达的基因109个。图4-1菌株HBstr-470菌落产孢阶段的差异表达基因火山图Fig.4-1VolcanoplotofDEGsintheprogressofconidiationofstrainHBstr-4703.3.2菌株HBstr-470产孢阶段差异表达基因GO功能分析368个有GO功能注释的255个DEGs的GO功能注释结果如图4-2所示，图中仅显示了富集最显著的30种功能分类，主要功能分类为生物学过程和分子功能两大功能分类，分别包括14和16个功能分类，将Corrected_pValue<0.05的功能视为显著富集项。在生物学过程功能分类中，注释为单细胞过程（single-organismprocess）的差异基因数目最多，所占的比例为52.5%，DEGs富集在氧化还原过程（oxidation-reductionprocess）；在分子功能分类中，参与催化活性（catalyticactivity）过程的差异基因数占比例最高，为60%，DEGs富集在氧化还原酶活性、血红素结合、四吡咯结合过程，由此推测：氧化还原相关基因参与菌株HBstr-470分生孢子产生过程。46 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究图4-2菌株HBstr-470产孢阶段DEGs的GO功能分类Fig.4-2GOfunctionalclassificationmapoftheDEGsatconidiationprogressinstrainHBstr-4703.3.3菌株HBstr-470产孢阶段差异表达基因KEGGpathway富集分析在菌株HBstr-470菌落分生孢子形成阶段共有2个pathway显著富集（CorrectedP-value<0.05），包括Ribosome（核糖体）和Aminosugarandnucleotidesugarmetabolism（氨基糖与核糖代谢），主要功能为蛋白质的合成和氨基酸的代谢。共有12个基因差异表达，其中参与Ribosome代谢途径的7个差异基因都下调表达，而氨基糖与核苷酸糖代谢途径中的5个差异基因都上调表达（表4-4）。图4-4菌株HBstr-470和B05.10菌落48h与72h的差异表达基因韦恩图Fig.4-4TheVenndiagramofDEGsinstrainsHBstr-470andB05.10at48hpiand72hpi47 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文表4-4菌株HBstr-470菌落分生孢子产生阶段的差异基因KEGGpathway富集分析Table4-4KEGGpathwayofDEGsattheprogressofconidiationinstrainHBstr-470DEGsCorrectedPathwayUniGenesAnnotationnumberP-valueBcin03g03620hypotheticalproteinBcin01g06650hypotheticalproteinRibosomeBcin01g09620hypotheticalproteinorganism-specific70.014796Bcin05g06070Bcrpl38biosystemBcin13g03600hypotheticalproteinBcin14g04100hypotheticalproteinBcin11g05920hypotheticalproteinBcin01g09990hypotheticalproteinAminosugarandBcin16g01590hypotheticalproteinnucleotidesugar50.014796Bcin07g04810hypotheticalproteinmetabolismBcin01g09980hypotheticalproteinBcin02g00420hypotheticalprotein3.4菌株HBstr-470和B05.10的比较转录组分析3.4.1差异表达基因的筛选菌株HBstr-470分生孢子形成阶段DEGs数目为368个，特异性表达的差异基因有242个，B-72vsB-48的DEGs有1047个，二者共有差异基因为126个（图4-4）。3.4.2差异表达基因的GO功能注释242个有GO功能注释的164个DEGs的GO功能注释结果如图4-5所示，图中仅显示了富集最显著的30种功能分类，主要功能分类为生物学过程、细胞组成和分子功能两大功能分类。在生物学过程功能分类中，注释为代谢过程（metabolicprocess）的差异基因数目最多，所占的比例为67.1%；在细胞组成功能分类中，主要为细胞壁过程（cellwall），差异基因数目为3个；在分子功能分类中，参与催化活性（catalyticactivity）过程的差异基因数占比例最高，为63.4%。3.4.4差异表达基因的聚类分析聚类分析菌株HBstr-470分生孢子产生阶段特异性表达的242个差异基因，结果表明：依据表达模式，242个DEGs可以分为4组（A~D）。ClusterA共包括114个DEGs，主要参与代谢过程（metabolicprocess）和氧化还原（oxidation-reduction48 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究process）等生物学过程及催化活性（catalyticactivity）等酶催化功能，在菌株B05.10中表达水平较低，且在48~72h间波动幅度小，而在菌株HBstr-470的产孢阶段（72h）中表达水平相对较高，且上调表达明显，表明这些基因可能参与菌株HBstr-470的分生孢子产生过程。ClusterB共包括30个DEGs，主要涉及病毒的传播和细胞膜的融合等生物学过程及催化和结合等分子功能，在菌株HBstr-470和B05.10中的表达模式相似，都有一定的上调表达，但在菌株HBstr-470上调表达波动幅度相对较大。ClusterC共包括51个DEGs，主要参与生物学过程和氧化还原，在菌株HBstr-470中表达水平比B05.10低，在两菌株中都呈下调表达。ClusterD共包括47个DEGs，主要涉及氨基酸的代谢和蛋白质的合成，在两菌株中都呈下调表达，但在菌株HBstr-470中的波动幅度比B05.10大，培养48h，多数DEGs在菌株HBstr-470中表达水平比B05.10高，而在72h则与之相反。图4-5菌株HBstr-470产孢阶段特异性差异表达基因的GO功能分类Fig.4-5GOfunctionalclassificationmapofthespecificDEGsatconidiationprogressinstrainHBstr-47049 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图4-6菌株HBstr-470产孢阶段特异性差异表达基因的表达模式聚类Fig.4-6TheexpressionpatternofthespecificDEGsatconidiationprogressinstrainHBstr-47050 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究表4-5产孢相关基因的转录组表达模式分析Table4-4TheexpressionpatternofconidiationrelatedgenesintranscriptomeOrthologsinFPKMGeneIDA.nidulansB-48B-72S-48S-72Bcin05g06770FadA59.6169.2880.3895.43Bcin06g01280FluG1.815.964.0013.10Bcin06g05800FlbC73.50218.36110.15162.00Bcin10g04400FlbD36.4846.8871.6472.17Bcin05g04650abaA1.261.600.951.19Bcin14g00990wetA0.020.060.370.74Bcin04g00280StuA74.7499.5998.87119.10Bcin12g00460MedA11.5137.4835.6738.94Bcin15g03390VeA11.6820.5031.0742.89Bcin01g02730VelB7.6214.5014.0722.05Bcin07g05880VelC9.6610.4221.4939.04Bcin03g06410VosA0.480.930.471.04Bcin04g05000PpeA63.21155.3336.1076.19Bcin02g03060PpeA-like33.1863.57191.33170.69Bcin08g05570-1.546.491.404.57注：“-”表示未发现同源基因4讨论采用RNA-seq技术进行深度测序后，我们对DEGs进行了筛选。菌株HBstr-470产孢阶段（48~72h）中共有368个DEGs，下调表达基因数目大于上调表达基因。参与单细胞过程和催化活性的DEGs数目最多，而DEGs富集在氧化还原过程、氧化还原酶活性、血红素结合和四吡咯结合，表明氧化还原相关基因可能参与菌株HBstr-470的分生孢子产生过程。KEGGpathway富集分析表明：核糖体和氨基糖与核糖代谢这两个通路显著富集，其中参与Ribosome代谢途径的7个差异基因都下调表达，而氨基糖与核苷酸糖代谢途径中的5个差异基因都上调表达。菌株HBstr-470产孢阶段特异性表达的DEGs共164个，分为4组不同的表达模式。其中，ClusterA中DEGs主要参与代谢过程、氧化还原和酶催化功能，在菌株HBstr-470中表达水平相对较高且上调表达明显，表明氧化还原相关基因可能参与菌株HBstr-470的分生孢子产生过程；ClusterB中DEGs主要涉及病毒的传播和细胞膜的融合，可能与菌株HBstr-470中真菌病毒通过分生孢子的形成垂直传播到后代有关。51 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文在Aspergillusflavus中，敲除fluG能够延缓并减少分生孢子的产生（Changetal2012）；fluG在A.nidulans休眠的分生孢子中不转录，在早期营养生长阶段显著下调表达，在分生孢子诱导前后的表达无显著差异（BreakspearandMomany2007），但与分生孢子的激活有关（Adamsetal1992）。fluG的同源基因Bcin06g01280在菌株B05.10和HBstr-470的菌丝形成早期时表达量略低，且菌株HBstr-470中Bcin06g01280的表达量始终略高于B05.10，这可能与菌株HBstr-470分生孢子形成早且产量大于B05.10有关。FluG能消除SfgA的抑制效果，激活下游fluffy基因（flbA-E）（Seoetal2006），fluffy基因在营养菌丝体中表达，响应细胞内的刺激从而诱导brlA的协调激活（Etxebesteetal2010），在B.cinerea中并没有与brlA同源的基因，可能存在与该基因功能相同的基因；同时，flbA的激活干扰FadA的菌丝增殖信号，B.cinerea中fadA的同源基因Bcin05g06770在菌株B05.10和HBstr-470中表达水平相当，与该阶段菌丝增殖一致。abaA编码的转录因子（TF）在分生孢子形成中期阶段被brlA激活（Adamsetal1998），参与A.nidulans分生孢子形成中期阶段瓶梗的功能分化，缺失会造成分生孢子梗畸形从而导致不能形成分生孢子（Sewalletal1990）；wetA在分生孢子形成的后期阶段受abaA的激活，与分生孢子细胞壁的合成相关，功能缺失引起分生孢子在成熟阶段自溶的现象（MarshallandTimbeilake1991）；abaA在分生孢子形成早期和中期阶段转录积累，而在后期阶段减少，wetA受abaA的负反馈调节，mRNA水平在后期达到最大值（TimberlakeandClutterbuck1994），Bcin05g04650和Bcin14g00990在菌株B05.10和HBstr-470培养48~72h阶段的表达量较低。VosA（NiandYu2007）与其他velvet家族蛋白中的VeA、VelB和LaeA形成复合体（Changetal2012），调控真菌的发育和次级代谢（BayramOetal2008）。VosA作为wetA的激活因子和brlA的抑制因子，构成一个负反馈调节。VosA蛋白在梗基的细胞质、瓶梗、新形成的分生孢子和成熟孢子细胞核中表达水平高，而在分生孢子萌发和营养生长阶段时，vosAmRNA和蛋白表达水平较低（Changetal2012），Bcin03g06410在两菌株培养48~72h阶段表达量都处于较低水平。stuA和medA为发育修饰基因，影响细胞分化和分生孢子梗的空间结构，stuA无效突变体缺少正常的梗基和瓶梗，在分生孢子梗囊泡上形成畸形分生孢子，medA缺失则引起重复的梗基和次级的分生孢子梗结构（Milleretal1991）。StuA通过直接或间接地作用影响AbaA的空间定位，来抑制abaA表达（Milleretal1992），Bcin04g00280和Bcin12g00460在两菌株中一直处于较高的表达水平（表4-5）。52 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究第五章总结与展望本研究主要明确了灰葡萄孢HBstr-470的产孢、侵染等生物学特性及该菌株中真菌病毒的分子特性、系统进化关系及真菌病毒的水平和垂直传播特性，探究了菌株HBstr-470中真菌病毒与生物学特性的关系。此外，通过RNA-seq初步筛选分析了菌株HBstr-470菌落分生孢子产生阶段的DEGs。菌株HBstr-470在PDA上生长速度缓慢，菌落形态表现异常，形成大量的气生菌丝并有大量的分生孢子产生。分生孢子正常萌发，且形成的菌落再次无性繁殖形成分生孢子的性状稳定、不受光照条件限制且早于强毒菌株B05.10。但分生孢子在本氏烟叶片上的致病力与竞争性致病力都弱于强毒菌株B05.10。菌株HBstr-470由5种真菌病毒复合侵染，分别为SsHV2/HBstr-470、BcHV1/HBstr-470、BcVV1/HBstr-470、BcRV2/HBstr-470和BcPV2/HBstr-470。SsHV2/HBstr-470、BcHV1/HBstr-470属于Hypoviridae病毒科，BcVV1/HBstr-470属于Totiviridae病毒科中的Victorivirius，菌株HBstr-470是SsHV2、BcHV1和BcVV1侵染的灰葡萄孢菌株中的一个新寄主；BcRV2/HBstr-470与RnQV1/W1075的同源关系较近，但并未发现编码CP的dsRNA片段，可能为Quadrivirade的一个新成员；BcPV2/HBstr-470在系统进化上与Partitiviridae病毒科中成员构成一大支，是Partitiviridae中的一个新成员。我们猜测BcRV2/HBstr-470的CP是依赖于BcVV1/HBstr-470和BcPV2/HBstr-470而编码的，但是还需进一步对病毒粒子进行观察，并分析对CP蛋白和各病毒RNA关系间的。菌株HBstr-470中的真菌病毒能通过分生孢子稳定地垂直传播给后代。通过对水平传播后获得的衍生菌株中真菌病毒种类及相关生物学进行分析发现：SsHV2/HBstr-470、BcVV1/HBstr-470影响分生孢子产量的增加；BcHV1/HBstr-470与致病力衰退有关；BcRV2/HBstr-470生长速率的降低、分生孢子产量的增加和致病力的衰退有关；BcPV2/HBstr-470与致病力衰退和分生孢子产量的增加有关。单一感染BcHV1/HBstr-470的菌株T8的生长速度和致病力都显著降低，而菌株Z5（BcHV1/HBstr-470）和Z33（BcHV1/HBtom-372）的生长速度和菌落形态正常，致病力衰退（Haoetal2018），说明同一病毒对不同的遗传背景的菌株造成的影响可能不完全相同。虽然病毒的侵染可以导致灰葡萄孢菌株HBstr-470致病力的衰退，但53 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文是该菌株的分生孢子产量大大增加，因此可能在一定程度上补尝致病力衰退所降低的生态适应性，从而一定程度地增强带毒灰葡萄孢菌株在自然界的生态适应性。菌株HBstr-470分生孢子产生阶段（48~72h）中的368个DEGs富集在氧化还原过程、氧化还原酶活性、血红素结合和四吡咯结合，推测氧化还原相关基因可能参与分生孢子产生过程。此外，比较转录组分析发现：菌株HBstr-470特异性表达的DEGs中涉及病毒的传播和细胞膜的融合，可能与菌株HBstr-470中真菌病毒通过分生孢子的形成垂直传播到后代有关。但是，由于未能获得与菌株HBstr-470的脱毒菌株，用于转录组测序的样品菌株HBstr-470和B05.10的遗传背景不同，转录组数据的分析可能存在一定的误差，RNA-seq测序的数据准确性还需qPCR的进一步验证。此外，需要进一步分析菌株HBstr-470分生孢子产生阶段的特异性基因表达，在相同遗传背景下的灰葡萄孢菌株中验证病毒感染对基因表达的影响，从而推测出参与灰葡萄孢分生孢子形成的关键基因。54 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华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文附录1PCR引物序列附表1本研究所使用PCR引物序列TableS1ThePCRprimersequencesusedinthisstudy12名称序列（5’→3’）位置极性SsHV2/HBstr-470的cDNA克隆V1g1-FCTTGCCCACCTGTTCTCC2967-2984﹢V1g1-RTATACGTCCATGCCTCTTA5907-5925﹣V1g2-FACGATTACTGACATTAACTTCC6989-7010﹢V1g2-RCTTCCAGAGCCTTCCCT8631-8647﹣V1g3-FGCCCACAGGAGGACAAC8934-8950﹢V1g3-RGTAAGCAGCCGGAGGAG11676-11692﹣V1g4-FTAGTAGACCATCTGCGAGTT6117-6136﹢V1g4-RGACATCTGCTGCCTTGAC6863-6880﹣V1g5-FTCTACGATGACATTCTTGC11520-11538﹢V1g5-RCTTTTGGAGTTTGACGAT14174-14191﹣V1T5-RGCATTCCCGAGGATTCATT2413-2431﹣V1T3-F1AGGGGTACGATGTGGAAGA11976-11994﹢V1T3-F2GAACACGCAACGAATAACAGGG13987-14008﹢BcHV1/HBstr-470的cDNA克隆V2g1-FAGGATGTATTCTAAATGGCTGAC2745-2767﹢V2g1-RGCATTATTGGGTTTGACGA3799-3817﹣V2g2-FTAAGCTCGTTGGAAGATGT4105-4123﹢V2g2-RAGGGAACCCAGCAGAATAA5987-6005﹣V2g3-FCCAACGGGGTAGGAAAGAA7419-7437﹢V2g3-RCCATAGGCAACGCAACTGT9323-9341﹣V2g4-FAACTGTCCTGAATCGTATG559-577﹢V2g4-RATCGACTTCTCGGTCTTAT2412-2430﹣V2g5-FAGGACCACTGAAGAACAAT1836-1854﹢V2g5-RCAAAATCTGAAGGCATAAC2328-2346﹣V2g6-FCCCTCACTCAGACTTACCC3619-3637﹢V2g6-RCGAAATAGAAAACTGCGAC4360-4378﹣V2g7-FCGAGAAAGTTACCGATAGA5819-5837﹢V2g7-RAGACAGCATAATACAAGGAGT7696-7716﹣V2T5-RAAAGGCTTGTTTCCTGCCTGGG1677-1697﹣V2T3-FCCTGGAGGCTACGAAGAT8970-8987﹢BcVV1/HBstr-470的cDNA克隆V3g-FCCATTCACCGATTACTTGT1896-1914﹢V3g-RGCGTTGTGCTTCTTCTTAG3021-3039﹣V3T5-RCAACATCAGGGGTGCCGTA2196-2214﹣V3T3-FACGGACAAGGGACTTAGAG2990-3008﹢BcRV2/HBstr-470的cDNA克隆V4T5-RATCCCTAGTCAACAACATCCTCA1973-1995﹣V4T3-FTACCCGAAACTAACATCACTC2326-2346﹢66 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究续表12名称序列（5’→3’）位置极性V5T5-RTTGTGCTTAGCCCTCTTTCTT1465-1485﹣V5T3-FTGCCAGATTACTGCCCGATAG2683-2703﹢V6T5-RTCGATGTTCGTGAAATGCC2428-2446﹣V6T3-FTAAGGGAGTGAGCCAAGTC3197-3215﹢BcPV2/HBstr-470的cDNA克隆V8T3-FTACACCTATGCCCTCAAGCG1103-1122﹢Northern杂交验证P1-FTCAGGAATAAAGGCACCGCT1794-1814﹢P1-RCGTCGTAAGGGGAGTTCGTCT2497-2517﹣P2-FACGGAGACAAGTATCACG1798-1815﹢P2-RCACATTTAGGCATAGCAAC2535-2553﹣P3-FACACTCGTGCCCTTTCTA1432-1449﹢P3-RTAACGACGCAGTCTTGGA2053-2070﹣P4-FCCCAACTTACTAGCTCTGA239-257﹢P4-RTCCCATTATTGACTTCCA883-900﹣P5-FACTGCCCGATAGGTAAGG2692-2760﹢P5-RCTGCGTAAGCGACAAAGT3373-3390﹣P6-FACAGAACTAAGGCTGACCG2067-2085﹢P6-RACTTGATAACATCCAAAACA2920-2939﹣P7-FGATCAATCGACGTACTAAAC134-153﹢P7-RGTCGGTCAATCTGCTCTT1063-1080﹣P8-FCGGAATACGAGATTAAGAC267-285﹢P8-RTTAGGGACTGGGAGACA826-842﹣用于RT-PCR检测V1-FTCAGGAATAAAGGCACCGCT873-892﹢V1-RCGTCGTAAGGGGAGTTCGTC1795-1814﹣V2-FCATACGGCTTCCCTCCTGAC417-436﹢V2-RTAGGTTGCCCTATTGCACGG1031-1050﹣V3-FTGGGCGTATCACCACAAAGG374-393﹢V3-RATGTTCGAGCCCAAAACCCT981-1000﹣V4-FATTTGGTGGAGACGGGAGTG701-720﹢V4-RTTATGCCTGCTGTCGCTCTT1653-1672﹣V5-FAGCGACGGCTAAATTGGCTA920-939﹢V5-RCCCCGTCATTGGTTGCTCTA1642-1661﹣V6-FTGGAGCCAGATAGCATGAGC967-986﹢V6-RTCCTGGTGGCAGTTGTTCTC1759-1778﹣V7-FGAAGCACCGTACACCGAAAG474-493﹢V7-RTCGGGTTGCGATTCCAGATG1453-1472﹣V8-FCCGTTCCTTTTACACGCCAG469-488﹢V8-RCTCCAGGTGCTAGTGTTGCT967-986﹣67 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文续表12名称序列（5’→3’）位置极性末端序列克隆110AGGGGGACACGCCGATAAGATAdsRNA的3’末端﹢/﹣RC110ATATCTTATCGGCGTGTCCCCC与接头110A互补﹣/﹢BPATTCAAATCCTACTGGCGCCGTG-(NH2)dsRNA的3’末端﹢/﹣RCBPACACGGCGCCAGTAGGATTTGAA与接头BPA互补﹣/﹢用于检测在载体pMD18-T中cDNA的插入情况M13F(-47)CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACpMD18-T载体M13R(-48)AGCGGATAACAATTTCACACAGGApMD18-T载体RAPD引物OPW-04CAGAAGCGGA1引物在两条dsRNA的cDNA序列上的位置，部分引物位置见附图1~5中。2极性表明引物所在为dsRNA的正链（﹢）或负链（﹣）。68 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究附录2病毒名称和序列号附表2系统进化树分析中所用到的病毒TableS2VirusandfungalhostsusedinphylogeneticanalysisVirusAcronymAccessionno.Sclerotiniasclerotiorumhypovirus2/SX247SsHV2/SX247KJ561218.1Fusariumpoaehypovirus1FpHV1LC150612.1Fusariumgraminearumhypovirus2FgHV2KP208178.1Macrophominaphaseolinahypovirus1MpHV1KP900893.1Fusariumgraminearumhypovirus1FgHV1KC330231.1Cryphonectriahypovirus2CHV2L29010.1Cryphonectriahypovirus1CHV1M57938.1Botrytiscinereahypovirus1/HBtom-372BcHV1/HBtom-372MG554632Cryphonectriahypovirus3CHV3AF188515.1Valsaceratospermahypovirus1VcHV1AB690372.1Phomopsislongicollahypovirus1PlHV1KF537784.1Sclerotiniasclerotiorumhypovirus1SsHV1JF781304.1Cryphonectriahypovirus4CHV4AY307099.1PlumpoxvirusPPVD13751.1Aspergillusfoetidusslowvirus1AfSV1HE588147.1Beauveriabassianavictorivirus1BbV1HE572591.1Botryotiniafuckelianatotivirus1BfTV1AM491608.1ConiothyriumminitansRNAvirusCmRVAF527633.1GiardialambliavirusGLVL13218.1Helicobasidiummompatotivirus1-17HmV1-17AB085814.1Helminthosporiumvictoriaevirus190SHvV190SU41345.2LeishmaniaRNAvirus1-1LRV1-1M92355.1LeishmaniaRNAvirus2-1LRV2-1U32108.1PenicilliumchrysogenumvirusPcVAF296440.1Magnaportheoryzaevirus1MoV1AB176964.1Rosellinianecatrixvictorivirus1RnVV1AB742454.1SaccharomycescerevisiaevirusL-AScV-L-AJ04692.1SaccharomycescerevisiaevirusL-BC(La)ScV-L-BCU01060.1Sclerotinianivalisvictorivirus1SnVV1KT365894.169 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文续表VirusAcronymAccessionno.SphaeropsissapineaRNAvirus1SnVV1AF038665.1SphaeropsissapineaRNAvirus2SnVV2AF039080.1Tolypocladiumcylindrosporumvirus1TcV1FR750562.1Trichomonasvaginalisvirus1TVV1HQ607516.1Trichomonasvaginalisvirus2TVV2AF127178.1Amasyacherrydisease-associatedmycovirusL3ACD-L3AM085134.1Amasyacherrydisease-associatedmycovirusL4ACD-L4AM085135.1Rosellinianecatrixquadrivirus1/W1075RnQV1/W1075AB620063.1Beetcrypticvirus1BcV1GQ867221.1Beetcrypticvirus2BcV2HM560703.1Cryptosporidiumparvumvirus1CSpv1U95995.1GrapevinepartitivirusGPVJX658569.1HelicobasidiummompadsRNAmycovirusHmVAB025903.1Heterobasidionpartitivirus1HetPV1HQ541323.1Peppercrypticvirus1PepCV1JN117276.1Rhizoctoniasolanipartitivirus1RsPV1KU299048.1CarrotcrypticvirusCcVACL93278.1Rosellinianecatrixpartitivirus2RnPV2AB569997.1SclerotiniasclerotiorumpartitivirusSSsPV-SGQ280377.1Soybeanleaf-associatedpartitivirus2SLPV2KT598244.1ViciacrypticvirusVcVAY751737.1Whiteclovercrypticvirus1WCCV1AY705784.1CherrychloroticrustyspotassociatedpartitivirusCCRSPVAJ781401.1Heterobasidionpartitivirus2HetPV2KF551883.1AtkinsonellahypoxylonvirusAhVL39125.1PenicilliumstoloniferumvirusSPsV-SAY156521.2Fusariumsolanivirus1FsV1D55668.1HumanpicobirnavirushPBVAB186898.170 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究附录3病毒全长cDNA序列克隆模式图附图1SsHV2/HBStr-470全长cDNA序列克隆模式图。引物和接头序列见附表1。Fig.S1SchematicrepresentationofthestrategyusedforfullcDNAcloningofSsHV2/HBStr-470.Thesequencesofprimersandthe3’-adaptorarelistedinTableS1.附图2BcHV1/HBStr-470全长cDNA序列克隆模式图。引物和接头序列见附表1。Fig.S2SchematicrepresentationofthestrategyusedforfullcDNAcloningofBcHV1/HBStr-470.Thesequencesofprimersandthe3’-adaptorarelistedinTableS1.附图3BcVV1/HBStr-470全长cDNA序列克隆模式图。引物和接头序列见附表1。Fig.S3SchematicrepresentationofthestrategyusedforfullcDNAcloningofBcVV1/HBStr-470.Thesequencesofprimersandthe3’-adaptorarelistedinTableS1.71 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文附图4BcRV2/HBStr-470全长cDNA序列克隆模式图。引物和接头序列见附表1。Fig.S4SchematicrepresentationofthestrategyusedforfullcDNAcloningofBcRV2/HBStr-470.Thesequencesofprimersandthe3’-adaptorarelistedinTableS1.附图5BcPV2/HBStr-470全长cDNA序列克隆模式图。引物和接头序列见附表1。Fig.S5SchematicrepresentationofthestrategyusedforfullcDNAcloningofBcPV2/HBStr-470.Thesequencesofprimersandthe3’-adaptorarelistedinTableS1.72 灰葡萄孢菌株HBstr-470中真菌病毒的种类鉴定及生物学特性研究致谢光阴荏苒，毕业在即。回首七年大学生活，苦辣酸甜，满怀感激。在论文完稿之际，谨以此章感谢一路陪伴和帮助我的人。首先感谢我的导师李国庆教授，本文的完成离不开李老师的教诲与帮助。对论文的选题、试验设计、试验过程和论文撰写与修改，李老师都给予我悉心的指导，让我受益匪浅。李老师以其严谨的科学态度、精益求精的工作作风和平易近人的生活态度深深感染着我，让我不仅懂得了如何做科研，同时也明白了许多待人接物和为人处世的道理。衷心感谢吴明德老师对我试验的倾力指导和生活中的帮助，三年来对论文的设计、试验操作和论文的修改，吴老师始终都耐心的指导和支持，保证了课题的顺利进行。感谢实验室杨龙老师和张静老师在课题进行过程中的阶段汇报时提出的宝贵建议。感谢植物病理学教研室黄俊斌教授、姜道宏教授、董五辈教授、王国平教授、肖炎农教授、付艳苹教授、谢甲涛教授、郭晓黎教授、徐文兴教授、郑露副教授、王利平副教授等老师对知识的授予及论文选题和试验进展中的建议和指正。感谢所有论文评阅老师和答辩委员老师对论文提出的宝贵修改意见。感谢实验室吕昂、高天一、尤佳琪、郝芳敏、周映君、杨丹、艾爽、汤洁静、徐玉平、郝艳飞、丁亭、杨欢、刘晨、余涵、魏玲、余秋玉、秦晶、方迪、Shakeel和shakil等所有师兄师姐对我试验的指导，感谢周梓良师兄提供试验材料。感谢王梅菊、张蕊、王永春和熊蛟龙同学们在试验和生活中的帮助。感谢王宝、邓越、罗韬、程均钰、王雅、杜然、梁纳、孙力、周康、李俊、李俊成和柯润楠等师弟师妹的帮助。感谢我的父母和哥哥陪伴、理解、鼓励和支持，感谢肖兰兰、梁玉芳、郭霜、丁思敏、王文君和刘克敏等朋友多年来对我学习和生活上给予的鼓励和帮助。感谢所有关心我、帮助我的亲人朋友们，愿一切顺利，幸福安康。本研究由国家公益性行业（农业）科研专项“保护地果蔬灰霉病绿色防控技术研究与示范”（项目编号：201303025）资助。贺国园2018年6月于华中农业大学73
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