《活体成像揭示小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号学号１Ｄ２０１３７７７１３．８７学校代码１＿密级Ｉ＿博士学位论文活体成像揭示小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移及神经病理理性疼痛中的作用病学位申人：乔＿ｊ学科专业：生医学工程指导教师：张智红教授答辩日期：２０１８年４月２６日 分类号学号D201377713学校代码10487密级博士学位论文活体成像揭示小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛中的作用学位申请人：乔莎学科专业：生物医学工程指导教师：张智红教授答辩日期：2018年4月26日 ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyinEngineeringIntravitalimagingrevealmicrogliafunctioninmelanomabrainmetastasisandneuropathicpainPh.D.Candidate1.1.1.1.1.：ShaQiaoMajor：BiomedicalEngineeringSupervisor：Prof.ZhihongZhangHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074，P.R.ChinaApr,2018 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研。宄成果尽我所知，除文中己经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。＇‘学位论文作者签名：曰期／：＞；年ｒ月＞曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保。留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。。保密□，在年解密后适用本授权书本论文属于不保密〇／“”（请在以上方框内打Ｖ）学位论文作者签名：／指导教师签名：丫丨曰期：年Ｔ月糾曰曰期：年办；曰！ 华中科技大学博士学位论文*摘要小神经胶质细胞作为中枢神经系统中的主要免疫细胞，具有分化状态与功能的高度可塑性。它们不仅在维持中枢神经系统稳态中的作用十分关键，而且参与多种神经相关疾病的发生和发展。有研究表明，小神经胶质细胞的形态和动态行为是其在不同生理与病理条件下分化状态的直观反映。使用活体显微成像技术，描绘小神经胶质细胞形态和动态行为的变化规律，将为直观地揭示其在不同疾病中的作用带来可能。目前，癌症威胁着人类的健康，而肿瘤转移是癌症极难根治的主要原因。由于脑结构及功能的复杂性，肿瘤脑转移具有治疗难度大、风险高、预后不良的特点。神经病理性疼痛是一种主要由神经系统损伤造成的慢性疼痛，在一些慢性疾病（如癌症中的骨缩、感染、自身免疫疾病、外伤、糖尿病等）的发展过程中也会伴随发生，极大地影响了病人的生活质量。然而，在这两种疾病的漫长发展过程中，小神经胶质细胞的分化状态是如何改变的，并且发挥怎样的功能，目前还并不清楚。本研究充分利用活体显微成像方法的优势，旨在对肿瘤脑转移及神经病理性疼痛这两种慢性疾病中小神经胶质细胞的形态和动态行为进行长时程监视，以期揭示其在这两种疾病发展中所发挥的作用。主要结果如下所示：(1)首先，我们通过双侧颅窗窗口实现了对小鼠黑色素瘤脑转移灶和正常脑组织的同时监视。经过长达3周的活体显微成像，我们观察到在黑色素瘤脑转移的发展过程中小神经胶质细胞的形态由静息状态下的典型分支状转变为活化的变形虫样。成像数据的定量分析结果显示相比正常脑组织，转移灶中的小神经胶质细胞的胞体直径增至其1.56倍，而细胞突起长度减少了1.68倍。这些细胞除了形态发生了变化外，细胞的数量及胞体的运动速度分别是对照组的1.57倍和2.36倍。此外我们综合小神经胶质细胞的胞体直径及细胞突起长度信息，提出了可更直观与全面反映小神经胶质细胞活化程度的参数“分支参数”。这些结果说明在肿瘤细胞接种后的第5天开始，大量的小神经胶质细胞已被活化，且随着肿瘤转移灶的发展至接种后第21天，它们始*基金资助：国家杰出青年科学基金（81625012）、国家自然科学基金重大研究计划（91442201）、国家自然科学基金创新研究群体（61421064）。I 华中科技大学博士学位论文终保持着这一活化状态，且活化程度达到最高。(2)通过剔除小神经胶质细胞，我们证实它们参与了黑色素瘤脑转移灶的形成。同时这些小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移的发展中显著上调了MMP3的表达。其中，高达94%的小神经胶质细胞表达了MMP3，且相对肿瘤细胞，小神经胶质细胞表达的MMP3是其114.2倍。小神经胶质细胞MMP3表达情况与血脑屏障完整性及小神经胶质细胞活化参数的相关性分析显示，这些MMP3一方面作为刺激分子促进了小神经胶质细胞的活化，另一方面也参与破坏血脑屏障完整性从而实现对黑色素瘤脑转移发展的促进作用。(3)通过坐骨神经CCI损伤，建立了不同程度疼痛的小鼠模型，在实现腰椎L5段的脊髓窗安装后，经过长达2周的脊髓成像，我们观察到小神经胶质细胞在神经病理性疼痛发展中的动态变化。通过比较不同程度疼痛小鼠及疼痛小鼠左右两侧脊髓段中的小神经胶质细胞，我们发现，中重度疼痛小鼠脊髓中，小神经胶质细胞在疼痛损伤后第2天已开始活化，它们的形态更倾向于变形虫样。而且至疼痛损伤后第14天，这些细胞仍然保持着活化的状态，同时，细胞突起的运动速度降低，单位体积细胞数量是对照组的1.75倍。这些结果说明，疼痛损伤后，小神经胶质细胞能快速被活化，且疼痛发展过程中小神经胶质细胞持续的活化状态提示其与神经病理性疼痛的发展持久且漫长的特点密切相关。(4)最后，为了探究后肢感觉皮层是如何参与神经病理性疼痛的调控，通过无标记、高分辨的光声显微成像系统，我们对正常小鼠和疼痛小鼠的后肢感觉皮层血氧饱和度进行了成像，结果显示疼痛小鼠皮层血管中含氧血红蛋白的比例更高。血氧饱和度更高的现象说明，在疼痛小鼠中，后肢感觉皮层中正在进行活跃的物质和能量交换，因此需要更多的氧分，并提示皮层中小神经胶质细胞也可能处于活化的状态，从而参与了神经病理性疼痛的调控。综上所述，本课题使用活体显微成像技术监测到，随着黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛的发展，小神经胶质细胞能够被快速地活化，且在形态、动态行为及分布上有了显著性的改变，并通过传统生物学手段及光声显微成像技术，进一步揭示了其在这两种疾病中的作用，为相关机理研究提供了新证据，并为这两种疾病的治疗提供了II 华中科技大学博士学位论文新思路。关键词：小神经胶质细胞；黑色素瘤脑转移；神经病理性疼痛；活体显微成像；颅窗；脊髓窗；基质金属蛋白酶3；III 华中科技大学博士学位论文ABSTRACTMicroglia/macrophages(M/Ms)arethemainimmunecellswiththepropertyofhighplasticityinactivationstateandfunctioninthecentralnervoussystem(CNS).TheynotonlyplayimportantrolesinsustainingthehomeostasisofCNS,butalsoparticipateintheoccrruenceanddevelopmentofmanyneurologicaldiseases.ManystudiesdemonstratethatthemorphologyandmotilityofM/Msisthedirectmanifestationoftheiractivationstateindifferentphysiologicalandpathologicalconditions.DepictingtheruleofalterationinmorphologyandmotilityofM/Msviaintravitalmicroscopicimagingtechnologywillmakeitpossibletouncovertheirfunctionindifferentdiseasesdirectely.Nowadays,cancerisahugethreattothehealthofhumanbeings.However,metastasisisthereasonthatmakescancerdifficultytoberadicalcure.Becauseofthecomplexinbrainstructureandfunction,metastasistobrainpossessthecharacteristicswithdifficultyincures,highriskandpoorprognosis.Neuropathicpainisachronicpaincausedbyinjuryofnervoussystemandhappensaccompanionedwithdiseasessuchasboneshrinkincancer,infection,autoimmunediseases,trauma,diabetes,whichaffectthelifequalityofpatientsverydeeply.However,howdoestheactivationstateofM/Mschangeandwhatistheirfunctionduringthechronicdevelopmentofthetwodiseaseshaven’tbeenelucidatedwelltodate.Takingadvantagesoflongitudinalinvivomicroscopicimagin,thisstudyfocusedonlongitudinalmonitoringthemorphologyandmotilitybehaviorsofM/Msduringthedevelopmentofbrainmetastasisandneuropathicpaintorevealthefunctiontheyplayedindiseases.Themainresultswereshownasbelow:(1)Inthefirstplace,werealizedthemonitoringofthemelanomabrainmetastasisandnormalbraintissuesinmiceatthesametimewithdual-lateralcranialwindows.Havingimagedthemiceforaslongas3weeks,weobservedthatthemorphologyofM/Mschangedfromtypicalramifiedshapetoactivatedamboiedshapeduringthedevelopmentofmelanomabrainmetastasis.Thequantitationofimagingdatashownthat,comparedwiththenormalbraintissues,theM/Msinthemeatstasischangedtheirsomadiameterwhicincreased1.56folds,decreased1.68foldsoftheirprocesses.ExceptthealterationinIV 华中科技大学博士学位论文morphology,thecellnumbersandsomavelocityofM/Mswere1.57foldsand2.36foldsofthatintheircontrolgroupsseparately.Additionally,wesumerizedtheinformationofsomadiameterandprocessesofM/Msandproposedaparameternamed‘branchingparameter’formanisfetiontheactivatedegreeofthemmoredirectlyandcomprehensively.TheseresultsindicatedthatplentyofM/Mshadbeenactivatedonday5aftermelanomacellinoculation,andtheykepttheactivationstateduringmelanomabrainmetastasisandachievedtothestrongestactivationstateonday21aftermelanomacellinoculation.(2)ThroughdepletionofM/Ms,wetestifiedthattheyparticipatedintheoccurrenceofmelanomabrainmetastasis.Meanwhile,theyupregulatedtheMMP3expressionduringthedevelopmentofmelanomabrainmetastasis.Upto94%M/MsexpressedMMP3,andtheexpressionofMMP3fromM/Mswas114.2foldsofthatinmelanomacells.ThecorrelationanalysisbetweentheMMP3expressedbyM/MsandthetightjunctionproteinexpressionortheactivateparameterofM/Msshowedthat,theautocrineMMP3promotetheiractivationasastimulationandmeanwhileparticipatedindisruptionofBBBtorealizethefacilitationofmelanomabrainmetastasis.(3)HavingestablishedthemicemodelwithdifferentpaingradewithCCIinjuryonsciaticnerveandimplantedthespinalcordwindowonlumbar5ofspinal,weobservedthedynamicchangeofM/Msduringthedevelopmentofneuropathicpainafter2weeksimaging.ComparingtheM/Msinmicewithdifferentpaingradeandbothlateralspinalcord,wefoundthat,theywereactivatedonday2afterCCIinjury,andtheirmorphologyturnedtobeamboidshape.Today14afterCCIinjury,theykepttheactivationstill,anddecreasedtheirvelocityinprocesses,andincreasedthevolumedensityto1.75foldsofthatincontrolgroups.Theseresultsindicatedthat,afterCCIinjury,M/Mswerequicklyactivated,andthelonglastingactivationstatemaycloselyrelatewiththepropertyofpersistenceandlastinginthedevelopmentofneuropathicpain.(4)Last,forstudyingthemodulationofS1HLcortexinneuropathicpain,wedetectedtheoxygensatuationinnormalandpainmicewithunlabled,highresolutionphotoacousticmicroscopicsystem.Theresultsshowedthattheproportionofoxyhemoglobinwashigherinpainmice.Thephenomenonofhigheroxygensatuationindicatedthatinpainmice,theactiveexchangeofmaterialandenergywastakingplace，inwhichmoreoxygenwereV 华中科技大学博士学位论文needed，andtheM/MsinSIHLcortexmaybeintheactivationstateaswelltoparticipateinthemodulationofneuropathicpain.Insummary,wemonitoredthattheM/Mswerequicklyactivatedandalteratedsignificantlyinthemorphology,motilitybehaviorsanddistribution,alongwiththedevelopmentofmelanomabrainmetastasisandneuropathicpain,withtheuseofintravitalmicroscopicimagingtechniques.Furthermore,weuncoveredtheirfunctioninbothofthediseaseswithtraditionalbiologicalmethodsandphotoacousticmicroscopicimagingtooffernewproofforerelatedmechanismresearchandnewinsightsforthetherapyofthediseases.Keywords:microglia/macrophages；melanomabrainmetastasis;neuropathicpain;intravitalmicroscopicimaging;cranialwindow;spinalcordchamber;matrixmetalloproteinase3;VI 华中科技大学博士学位论文缩略语（Abbreviations）ADAlzheimer’sdisease阿尔兹海默症ALSAmyotrophiclateralsclerosis肌萎缩脊髓侧索硬化症BBBBloodbrainbarrier血脑屏障BMBrainmetastasis脑转移BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白CCDChargecoupleddevice感光耦合元件CCIChronicconstrictioninjury慢性束缚性损伤CMCulturemedium培养基CMCCarboxylmethylcellulose羧甲基纤维素钠CNSCentralnervoussystem中枢神经系统DMDissociationmedium裂解培养基EAEexperimentalautoimmune脑脊髓炎encephalomyelitisECMExtracellularmatrix细胞外基质EGFPEnhancedgreenfluorescenceprotein增强型绿色荧光蛋白HBSSHank’sbalancedsaltsolution汉克平衡盐溶液HEHematoxylin-eosin苏木精伊红IVCIndividuallyventilatedcages独立送风笼具IVMIntravitalmicroscopy活体显微成像MBMMelanomabrainmetastasis黑色素瘤脑转移MMPMatrixmetalloproteinases基质金属蛋白酶NMNeutralizationmedium中和培养基NPNeuropathicpain神经病理性疼痛OCTOpticalcuttingtemperature冰冻切片包埋剂VII 华中科技大学博士学位论文PAMPhotoacousticmicroscopy光声显微成像PBSPhosphaticbuffersolution磷酸缓冲液PFAParaformaldehyde多聚甲醛RT-PCRReversetranscription-polymerase反转录聚合酶链式反应chainreactionSMSerumfreemedium无血清培养基S1HLsomatosensorycortexhindlimb后肢感觉皮层VIII 华中科技大学博士学位论文目录摘要................................................................................................................IAbstract..........................................................................................................IV缩略语（Abbreviations）...........................................................................VII1绪论1.1小神经胶质细胞....................................................................................(1)1.2肿瘤脑转移............................................................................................(5)1.3神经病理性疼痛..................................................................................(11)1.4活体显微光学成像技术在神经科学中的应用..................................(17)1.5选题背景及本文的主要研究内容......................................................(20)2小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移发展中的细胞动态变化2.1引言......................................................................................................(23)2.2实验材料和方法..................................................................................(24)2.3实验结果..............................................................................................(32)2.4讨论......................................................................................................(49)2.5本章小节..............................................................................................(50)3小神经胶质细胞表达的MMP3调节黑色素瘤脑转移发展3.1引言......................................................................................................(52)3.2实验材料和方法..................................................................................(53)3.3实验结果..............................................................................................(60)3.4讨论......................................................................................................(77)3.5本章小节..............................................................................................(78)IX 华中科技大学博士学位论文4小神经胶质细胞在神经病理性疼痛发展中的细胞动态变化4.1引言......................................................................................................(79)4.2实验材料和方法..................................................................................(79)4.3实验结果..............................................................................................(84)4.4讨论....................................................................................................(104)4.5本章小结............................................................................................(105)5小鼠S1HL皮层中血红蛋白分布与神经病理性疼痛的关系5.1引言....................................................................................................(106)5.2实验材料和方法................................................................................(106)5.3实验结果............................................................................................(107)5.4讨论....................................................................................................(112)5.5本章小节............................................................................................(112)6总结与展望6.1主要研究结果....................................................................................(113)6.2主要创新点........................................................................................(114)6.3展望....................................................................................................(114)致谢.....................................................................................................(116)参考文献.....................................................................................................(118)附录攻读博士学位期间发表的主要论文.............................................(130)X 华中科技大学博士学位论文1绪论1.1小神经胶质细胞1.1.1小神经胶质细胞的起源1小神经胶质细胞从被发现到给出目前公认的定义，已有161年漫长历史。早在1856年，RudolfVirchow将胶质细胞定义为一种脑组织中不同于神经元细胞的一类细2胞群。二十世纪九十年代，小神经胶质细胞来源于胚胎yolksac细胞的概念首次被Cuadros等研究者提出。他们通过鸡胚胎及鹌鹑yolksac构建骨髓嵌合体证实，进入到脑组织的原始髓系细胞是独立于血液的。这一观点进一步被Alliot等证实，他们在3胚胎发育的第八天于卵黄囊及新生脑中先后发现小神经胶质细胞前体已经出现。1.1.2小神经胶质细胞的功能2作为CNS中的主要免疫细胞，小神经胶质细胞组成了所有胶质细胞的10~15%，3并具有免疫防御及CNS的稳态维持两大主要功能。（1）小神经胶质细胞在正常生理状态下的功能由于小神经胶质细胞在CNS中的个体发育更早，因此它们参与了CNS中其它类4,5型细胞的分化以及CNS结构的形成和功能的发挥，主要表现在以下几个方面：控制着神经元细胞的命运和数量，不仅参与了神经元程序性死亡的调控，同时能直接通6,7过其吞噬功能将死细胞及碎片清除；调控了非神经元细胞的发展，不仅能够调节8CNS中其他类型胶质细胞的生存、增殖及成熟，如少突状胶质细胞、星形胶质细胞91011，同时还能够调节神经系统的血管生成，如参与视网膜及后脑的血管分支形成；12调控着神经回路的成熟，比如破坏小神经胶质细胞补体依赖的吞噬功能会导致突触密度的持续性增加从而导致不适合的连接发生。（2）小神经胶质细胞在疾病状态下的功能与巨噬细胞类似，小神经胶质细胞具有强的可塑性，即随着周围微环境的变化而调整自己的活化状态，倾向促炎的M1型或抗炎的M2型分化，从而发挥对应的功能1 华中科技大学博士学位论文13-15。因此，小神经胶质细胞在中枢神经系统紊乱时所发生的功能也具有多样性。在神经退行性疾病，如阿尔兹海默症AD、帕金森、亨廷顿疾病、ALS等疾病中，16小神经胶质细胞通过表达病原体相关分子模式及模式识别受体、Toll样受体、CD36、17,18CD34、CD47等导致细胞死亡、相关神经炎症因子的释放并促进病理反应。另外，19在帕金森疾病中，多巴胺神经元释放的MMP3能够促进小神经胶质细胞的活化。在2021炎症性的疾病，如多发性硬化及中风中，当对小神经胶质细胞进行剔除或者失活时，EAE的症状得到延迟并缓解，在人体中，PET的结果展示了活化的胶质细胞的数量与临床残疾的表现是相关的。在脑肿瘤的发展中，胶质瘤细胞释放的趋化因子如MCP-1、CXCL12、GDNF和CSF-1能够募集大量的小神经胶质细胞/巨噬细胞浸润至22,23肿瘤区域并促进肿瘤的生长。除了以上几种疾病，小神经胶质细胞还在其他多种疾病中扮演着重要作用，如功24能发生紊乱时，会直接造成蕾特氏症;固有模式识别系统辅助它们快速地应答多种病2526原物，如细菌、抗原、寄生虫、病毒等；多种表型与老化有关；非正常的活化与2728增殖破坏了神经因子的释放从而导致精神疾病的发生；生活方式如压力过大、节2930食、酒精过量等都会造成小神经胶质细胞调控的神经炎症的发生。1.1.3小神经胶质细胞的活化与其功能密切相关二十世纪三十年代，Rio-Hortega等利用显微镜观察并手绘出各种不同生理状态下的小神经胶质细胞，通过总结发现，这些不同状态下的细胞形态不尽相同，如在健康成熟的脑组织中，小神经胶质细胞表现为分支样；而在病理环境下，它们转变为适应31迁移、增殖、吞噬等功能的变形虫样，如下图1-1所示。因此，直至今日，小神经胶质细胞形态与功能不可分割的关系这一观点仍然普遍存在并被人们接受。在过去长达几十年的时间里，人们通过传统的生物学手段，如免疫组化、免疫荧光、离体细胞培养等方法，结合小神经胶质细胞在不同状态下表现的不同形态特征，研究和探索小神经胶质细胞多样化的功能发现其在维持CNS稳态及疾病发展中发挥着重要的作用。2 华中科技大学博士学位论文图1-1Rio-Hortega发现的小神经胶质细胞。A，PiodelRio-Hortega（1882-1945）；B，Rio-Hortega绘制的分支装小神经胶质细胞；C，吞噬过程中小神经胶质细胞的形态变化（A，具有粗大的细胞延长突起；B，短小的细胞突起和膨大的胞体；C，肥大胞体及伪足；D和E，变形虫样及伪足状；31F，吞噬了白细胞；G，吞噬了红细胞；H，脂肪滴细胞，I，正在进行有丝分裂的细胞）。Figure1-1MicrogliadiscoveredbyPiodelRio-Hortega.A,PiodelRio-Hortega(1882-1945).B,RamifiedmicrogliadrawnbyPiodelRio-Hortega.C,Differentmorphologyofmicrogliaduringitsphagocyticactivity(A,cellwiththick,roughprolongations;B,cellswithshortprolongationsandenlargedcellbody;C,hypertrophiccellwithpseudopodia;DandE,amoeboidandpseudopodicforms;F,cellwithphagocytosedleukocyte;G,cellwithnumerousphagocytosederythrocytes;H,fat-granulecell;31I,cellinmitoticdivision).小神经胶质细胞活化状态与功能密切相关。基于早期人们对小神经胶质细胞功能的研究发现，小神经胶质细胞能在外界刺激下转变成具有某种特定功能的活化细胞，32它们的形态会发生显著性的改变。随着显微成像技术的发展，人们观察到活化的小33神经胶质细胞相比监视状态下的细胞，运动等动态行为也有显著性的差别。它们的这种形态和动态的变化，都能够作为评价小神经胶质细胞活化状态的标准。在200534年，AxelNimmerjahn等人在健康的小鼠脑组织中发现，小神经胶质细胞是高速动态的，如图1-2所示。它们通过其高度分支的细胞突起通过伸出和回缩持续扫描周围的微环境，从而实现对CNS的监视。这一重大发现改变了长久以来人们对小神经胶质3 华中科技大学博士学位论文细胞的了解，并让人们意识到其动态的重要性。在随后的研究中，不少研究者们也通35-38过活体显微成像的方法揭示了小神经胶质细胞在不同微环境中的作用，如通过对局部激光损伤的脑组织活体显微成像发现，小神经胶质细胞这种对损伤做出的快速聚集的动态反应是依赖于ATP的；通过对中风的小鼠脑组织进行成像发现，小神经胶质细胞能够选择性地清除功能紊乱的神经元网络从而实现对脑组织的保护；而在躯体感觉皮层的发育过程中，小神经胶质细胞能够诱导突触的形成；另外，通过对单个小神经胶质细胞长达15个月的成像发现，其在脑组织中的较长的生命周期与各种老龄化疾病的发生都有紧密联系。这些活体显微成像的结果揭示了小神经胶质细胞动态地应对着不同的脑组织微环境中的变化，从而实现正常监视或损伤修复和应急，调控早期发育或老龄化疾病发生发展等功能。因此，小神经胶质细胞的形态及动态的变化都能够反应其活化状态的改变。图1-2小神经胶质细胞在静息状态下是高速动态的。A，一小时时间成像前后单个小神经胶质细胞最大投影图像；B，二十分钟记录里小神经胶质细胞突起的伸出和回缩；C,小神经胶质细胞细34胞突起的长度改变以及伸出和回缩的运动速度分析；D，不同分支类型的细胞突起数目分布。Figure1-2Microglialcellsarehighlydynamicintherestingstateinvivo.A.Maximum-intensityprojectionsofanindividualmicroglialcellatthebeginning(left)and1hourafter(center)thestartofatranscranialtime-lapserecording.B.Extensions(green)andretractions(red)ofprocessesoverthetimecourseof20min.C,Lengthchangeandvelocityofmicroglialprocesses.D,Distributionofnumbersin34differentextensionsandretractions.4 华中科技大学博士学位论文1.2肿瘤脑转移癌症，目前仍然是威胁人类生存的主要原因。癌症病人中有10~20%会发生脑转39移，其中肿瘤脑转移病人是原发脑肿瘤病人的10倍。随着诊断技术的提高，系统性癌症治疗疗效的增强以及寿命的延长，癌症脑转移的病人也增多。癌症一旦转移至脑部，结果通常都是令人堪忧的，如果不进行治疗，病人的平均存活时间少于两个月40，即使通过激素治疗、化疗、放疗等治疗手段延长患者的寿命，平均存活寿命也只41有一年左右。肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌是最易转移至脑的几种癌症，它们42,43形成脑转移的比例分别为45%、15%、10%、及5%。1.2.1实验性肿瘤脑转移动物模型由于肿瘤脑转移的预后不良，且如上所述诊断率在逐渐升高，因此深入探讨肿瘤转移的形成过程及其中的相关机制是很有必要的。临床上，人们对脑转移的特点有一定的了解，但早期脑转移的检测和成像仍然很困难，因此为了深入地了解脑转移的发生发展过程，建立合适的动物模型很有必要。尽管目前出现的实验性脑转移模型不可避免地会错过转移的起始过程或不能完全模拟临床上脑转移的自然状态，但它们的确42为研究脑转移的过程提供了必要的工具。在过去的60几年里，研究者们运用各种4441临床前的脑肿瘤转移模型，对脑转移的形成过程有了一定的了解。图1-3及表1-1展示的分别是目前出现的几种常用肿瘤脑转移模型的建立方法及它们各自的优缺点。图1-3活体研究脑转移的方法。A，将肿瘤细胞注射至原位肿瘤发生的位点形成自发肿瘤脑转移的方法。左侧，皮下注射自发转移性黑色素瘤细胞；右侧，乳房脂肪垫注射自发转移性乳腺癌细胞。B，将肿瘤细胞直接接种至血液循环中建立脑转移的方法。左侧，尾静脉经体循环注射肿瘤细胞；右侧，心内注射经体循环分布肿瘤细胞。C，颈内动脉注射肿瘤细胞形成脑转移的方法。D，41立体定位颅内直接注射肿瘤细胞形成脑转移的方法。Figure1-3Methodsofstudyingbrainmetastasisinvivo.A.Spontaneousbrainmetastasisassaysinvolveinjectionofcancercellsintotheirassociatedsiteofprimarytumororigin.Left:intradermalinjectionfor5 华中科技大学博士学位论文studyofspontaneousmelanomametastasis.Right:mammaryfatpadinjectionforstudyofspontaneousbreastcancermetastasis.B.Experimentalbrainmetastasisassaysbydirectinoculationofcancercellsintothecirculation.Left:tailveininjectionofcancercellsintroducesthemintothegeneralcirculation.Right:intracardiacinjectionofcancercellsdistributesthemthroughoutthemousebody,butdispersalcanbeunpredictable.C.Experimentalbrainmetastasisbyintracarotidarterialinjectionofcancercells.41D.Direct,stereotacticintracerebralinjection.41表1-1活体脑转移建立方法的优缺点41Table1-1Advantagesanddisadvantagesofinvivobrainmetastasisassays活体脑转移方法优势劣势自发转移方法实现对转移过程中每一步骤的效率低且多样性高研究周期长注射方法相对其他方法更容易可能需要进行原位肿瘤的清除以保证存活脑转移发生前优先转移至其他器官心脏内注射或尾静脉注射肿瘤包括了转移过程的后半部分错过了转移的前期步骤细胞形成的实验性脑转移相比颈内动脉注射操作更简单脑转移发生前优先转移至肺连续的在体筛选脑转移细胞能多样性高够增加脑转移发生了可能性颈内动脉注射肿瘤细胞形成的包括了转移过程的后半部分错过了转移的前期步骤实验性脑转移形成稳定的、重复性特定的脑注射方法难且耗时转移注射后需要关注存活情况立体定位注射肿瘤细胞至脑内重复性、稳定性高的肿瘤脑肿错馆了转移的步骤但是展示了的实验性脑转移瘤转移脑转移的生长脑环境中的肿瘤生长模型优于大块肿瘤细胞注射不同于单个体外实验细胞或少数细胞的转移灶定居1.2.2肿瘤脑转移发生发展的主要机制（1）肿瘤脑转移的形成过程早在1889年，英国外科医生StephenPaget通过分析735例乳腺癌病人尸检报告发现肿瘤转移并不是一个随机事件，转移肿瘤的成功生长取决于肿瘤细胞（种子）能45够与转移位点（土壤）有很好的亲和性，即著名的“种子和土壤”理论。尽管在1928年，JamesEwing质疑了他这一理论，并且提出，转移的散播是由血管系统的解剖学46结构决定的观点，但在之后的120年里，大量临床观察报告及科学实验结果支撑了47这一理论。目前，被普遍接受的“种子和土壤”理论主要包括以下三个方面：首先，原发性肿瘤尤其是转移病灶具有生物异质性并且包含了多种具有多样化特性的细胞群；其次，转移的过程依赖于那些能够完成所有转移步骤的细胞；最后，转移的结果48,49依赖于转移细胞与微环境的相互作用。而脑转移的形成毫无疑问也是遵从于这一6 华中科技大学博士学位论文理论的，脑部独特微环境与转移的肿瘤细胞的相互作用决定了最终脑肿瘤病灶的生长。图1-4展示的是肿瘤脑转移形成的主要步骤。图1-4经血液形成脑转移的几个步骤。当肿瘤细胞由原位肿瘤经血液循环到达脑血管时，A，由于毛细血管尺寸的限制，肿瘤细胞会首先禁锢在此处，B，接着通过一系列基因如HBEGF,COX2,ST6GALNAC5的调控作用进行跨BBB并进入至脑实质。另外，整联蛋白的活化如αvβ3及β1控制了肿瘤细胞在血管中的禁锢和粘附。C，转移的肿瘤细胞（种子）会在转移过程中利用基质中的细胞（土壤）。跨出血管后，肿瘤细胞要么D，沿着原来有的血管进行生长（血管周生长）要么42E，募集新的血管（血管生成）获得充足的营养支撑它们的增殖。Figure1-4Stepsintheformationofhematogenousmetastasistothebrain.Oncetumorcellsshedfromprimarytumorsarriveinbrainvasculature,A,theyarrestinthecapillarybedprimarilyowingtosizerestriction,andB,subsequentlyextravasateacrosstheBBBandenterthebrainparenchyma.Threegenesmediatecancercelltrans-BBBmigration:HBEGF,COX2,andST6GALNAC5.Also,activationofintegrins,suchasαvβ3andβ1,issuggestedtocontroltumor-cellarrestandadhesiontothevasculature.C,Metastasizingtumorcells(seeds)maybringtheirownhostcells(soil)inmetastasis.Afterextravasation,tumorcellseitherD,growalongpre-existingbloodvessels(perivasculargrowth),orE,42recruitnewbloodvessels(angiogenesis)toobtainsufficientnutrientstosupporttheirproliferation.（2）影响肿瘤脑转移发生发展的主要因素50成功的脑转移形成是一个漫长而又低效率的过程，不同的肿瘤细胞在脑定居的51-53初期行为是不同的。肿瘤细胞成功定居脑中的第一个最重要的前提即肿瘤细胞需7 华中科技大学博士学位论文要跨过血脑屏障。血脑屏障是由内皮细胞、细胞之间的紧密连接、基膜及星形胶质细54胞尾足突起组成的一道限制性屏障，它们限制了溶质跨血脑屏障的运动。由于血管53分支处的血流横切力减少，肿瘤细胞在转移的初期多数会限制在此处。接着，肿瘤细胞就会粘附在内皮细胞上，并逐渐开始跨内皮细胞的迁移，此过程主要是是由多种55-5758,5960,61肿瘤细胞表面受体及内皮细胞粘附因子如整联蛋白、选择素及趋化因子的相互作用调节的。除此之外，一些其他因子，如前列腺素合成酶环氧化物酶2、肝素连接上皮生长因子以及α-2,6-唾液酸转移酶ST6GALNAC5作为调节因子参与了乳6263腺癌细胞的跨BBB迁移。细胞间的紧密连接主要由各种紧密连接蛋白组成，在肿瘤转移形成过程中，紧密连接蛋白如Claudin-1，ZO-1等的表达显著性减低，显示BBB64的破坏促进恶性肿瘤的侵袭和转移灶的形成。高表达的内皮素能够促进细胞MMP1及MMP19的表达，从而促进其侵袭能力。另外，肿瘤细胞表达的各种MMP如MMP1,65-672,3和9等，能够帮助破坏BBB从而更容易实现跨血脑屏障迁移。成功跨越血脑屏障后，肿瘤细胞进入到脑组织中。脑组织中的非细胞组分即为68ECM，其纤连蛋白及胶原蛋白很少，但是其他如固生蛋白、层黏连蛋白、硫酸乙酰6968,70-72肝素、软骨素及透明质酸的含量则比较多。在HER2-阳性的乳腺癌中，肝素酶转定位至核内与拓扑异构酶I共定位作用在HER2/上皮生长因子的活化来促进乳腺癌7173-75脑转移的形成。无论是实验性还是人体脑转移中，都发现了过量表达的MMPs。脑倾向乳腺癌转移细胞相对骨倾向及亲代乳腺癌细胞，MMP1和9的RNA水平表达6766更高。当使用MMP的抑制剂时，脑转移及侵袭性的细胞行为都得到了抑制。侵袭至脑组织的肿瘤细胞除了与ECM作用外，还与其中的胶质细胞进行相互作用，以实现成功的脑定居。通过表达肝素酶，星形胶质细胞发挥了促瘤效应并帮助脑7677侵袭。它们通过旁分泌信号分泌的细胞因子能够帮助肿瘤脑转移的生长。通过旁66分泌信号途径它们活化了MAPK并进而促进乳腺癌细胞的MMP2过表达。同时，星型胶质细胞也能分泌表达MMP-2和MMP9帮助肿瘤细胞的迁移和侵袭，从而促进78肿瘤脑转移的形成。另外，它们也调控了肿瘤转移的治疗抗性。CNS中还有一些神经营养因子如原型神经生长因子NGF的表达，它们通过抗凋亡、促分裂以及趋化性刺激和调节神经发生还能通过表达肝素酶或细胞骨架重排刺激和维持黑色素瘤细胞8 华中科技大学博士学位论文79的生长和迁移。血管生成是肿瘤的形成、生长及扩散转移中的必要步骤，且大多是由血管内皮生80长因子VEGF信号通路调控的。通过阻断VEGF，能够有效地抑制肿瘤脑转移的形81,82成及血管生成。然而不同类型的脑转移及原发肿瘤血管生成以及对血管生成药物的反应都不同。相比乳腺癌脑转移，黑色素瘤脑转移中血管的密度明显更少，即使它83们的新生血管的大小没有差别。正如前面所述，黑色素瘤细胞倾向于沿着脑血管生53长，而肺癌细胞则是通过诱导新生血管生成进行结节状增殖。而相比其他类型肺癌84脑转移，小细胞肺癌细胞脑转移更易形成肾小球状的血管。（3）黑色素瘤脑转移发生发展的机制研究尽管只有10%左右的黑色素瘤病人被诊断为脑转移，但因其恶性程度高，多达8560%的黑色素瘤病人会在疾病的发展过程中形成脑转移，而目前主要的治疗手段仍然是外科手术及放疗，尽管一些新的免疫检验点抑制剂及分子靶向药物的引进给疾病的预后提高提供了新机遇，但目前仍然存在许多问题。因此研究黑色素瘤脑转移MBM的形成过程和其中的机制能让人们对MBM的病理更加了解，从而为病人寻求合适的86治疗方法。黑色素瘤细胞通过与血管的共选择作用，在血管分支处进行休眠，因其具有亲神87经性，它们表达的神经营养因子受体p75(NTR)及TrkC能够通过诱导肝素酶和细胞79骨架重排刺激和维持自身的生长和迁移。研究者们发现临床三期黑色素瘤病人PTEN磷酸酶张力蛋白的表达会减少，使得PI3K-AKT信号通路的活化，造成MBM8889的风险升高，这一结果在动物模型中也得到了证实。另一个控制脑发展过程中的基因PLEKHA5，也促进了脑转移的发生，体外研究证实，此基因可能通过与PI3K-AKT90信号通路的交互作用促进肿瘤细胞的跨BBB迁移。脑脊液CSF中的一些因子也能91活化MBM中的PI3K-AKT信号通路。其他相关分子如血管内皮生长因子VEGF-A(165)，能够帮助黑色素瘤细胞通过对已有的血管进行改造和重建即共选择而81非血管新生的过程实现MBM形成；肝素酶，提高了黑色素瘤细胞向脑的侵袭能力；连接蛋白，能够调节脑转移的早起事件，比如肿瘤细胞的跨血管及血管供选择。另外，92除了PI3K-AKT信号通路，TAK-STAT信号也能促进MBM的形成。在人类MBM9 华中科技大学博士学位论文样本中检测到STAT3的活性明显升高，它的活化能够影响并调节bFGF、VEGF、MMP275等的表达，从而实现促转移作用。一些研究者发现，黑色素瘤脑转移细胞能够活化脑组织中的星形胶质细胞，并通过促炎因子IL-23的分泌促使黑色素瘤细胞分泌大量93的MMP2以实现MBM的转移形成。紧密连接蛋白Claudin-1的表达也会影响肿瘤94细胞与内皮细胞的相互作用，从而抑制MBM的发展。1.2.3小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移中的作用小神经胶质细胞是CNS中主要的免疫效应细胞，它们在众多疾病包括中风、炎1,95,96症、神经退行性疾病及癌症中都能被有效地活化。体外研究表明，原代培养的小97鼠小神经胶质细胞的条件培养基能够抑制肺癌细胞的增殖。活化的小神经胶质细胞98可以通过释放一氧化氮NO对肺癌细胞进行杀伤和裂解。但也有研究表明，小神经胶质细胞能够促进转移细胞在脑组织的定居。它们对侵袭入脑的乳腺癌细胞进行处99理，并为这些细胞在脑实质的定居铺路，并提出这种过程主要是Wnt信号依赖的。通过收集不同转移天数的肿瘤脑转移样本描述了，研究者们发现星形胶质细胞及小神100经胶质细胞与血管中被限制的乳腺癌细胞以及跨血管的肿瘤细胞的作用。尽管已有一些研究者报道了小神经胶质细胞在肿瘤脑转移中的作用，但对其在黑色素瘤脑转移中作用的了解目前还不是很完善。通过给MBM病人进行一轮pembrolizumab治疗后，研究者们发现CNS的损伤范围加大，并且在肿瘤细胞周围有101大量的活化星形胶质细胞及分散的炎症细胞和大量的小神经胶质细胞分布，但这些细胞到底发挥着什么样的作用还不清楚。CNS中的黑色素瘤相比外周的黑色素瘤，由于抗原特异性的CD8阳性T细胞的减少及毒性的降低，因此更加耐受。但，当对MBM小鼠使用定点放疗及免疫疗法结合时可发现这种耐受状态被逆转并且生存率增加。其中，多功能CD8阳性T细胞的增加、T效应细胞/T调节细胞比例的升高以及102小神经胶质细胞分泌的TGF-β减少是达到这种治疗效果的根本原因。黑色素瘤细胞进入CNS后，其转录水平在此环境的影响下也发生了些适应性的改变，这种改变103无疑对它们的脑定居做出了贡献。此过程中，微环境中的星形胶质细胞及小神经胶质细胞被活化，并作为活跃的各种因子供应体影响闯入的肿瘤细胞的信号通路、侵袭104及生存和生长特性等。10 华中科技大学博士学位论文1.3神经病理性疼痛1.3.1神经病理性疼痛简介及实验性动物模型的建立在正常生理条件下疼痛是一种具有保护性及适应性的感受系统。当身体感受到损105伤信号如组织症或损伤时，疼痛感受会诱发一系列行为变化帮助损伤修复及复原。目前，疼痛可以分为两大类，即在正常健康状态下发生的一系列急性疼痛以及当疼痛信号发生紊乱时，如在组织损伤不存在时产生的病理性疼痛。神经病理性疼痛NP，是病理性疼痛的一种形式，它是由神经系统损伤造成的，表现为一种难以解释的广泛的106疼痛，如感觉失常、灼烧感、轻微触碰带来的疼感，最多能持续6个月。疼痛传递107的过程是基本一致的，图1-5展示的即为疼痛感受的传递过程。108早在1872年，神经病理性疼痛就被称为“神经损伤造成的最痛苦的折磨”。随着人们对NP的深入了解，到二十一世纪初期，人们认为它是多种神经损伤，包括一些如癌症过程中的骨缩、感染、自免疫疾病、外伤、糖尿病等造成的一种慢性疼痛状态，109是一种临床上观测到的一种症状。但目前，人们开始认为NP不仅仅只是疾病发生后110的某一个症状，而是一种由于神经系统功能紊乱所造成的后果。因此，揭示神经损伤造成的NP的机制，为更好地发展新治疗药物，帮助病人缓解疼痛造成的折磨是很有必要的。11 华中科技大学博士学位论文图1-5疼痛感受。体内正常的疼痛信号是由伤害感受器出发传递到脊髓背角。疼痛感，比如针头扎在脚底，投射到疼痛投射神经元上的初级传入末端将疼痛传递因子释放到脊髓背角LI,IV,V段。然而，当组织损伤及皮肤炎症发生时，外周神经末端周围的细胞释放的慢性炎症因子会造成感受器的敏化。背根神经节DRG的疼痛信号就会被传递到背部脊髓，脑干及脑中，于是就产生痛感。方框内展示的是脊髓背根及DRG的横截面。DRG中包含了假单极性感觉神经元，之所以这样被命名是因为它们伸出了一个含分叉的单根轴突，一个分叉是投射到外周，另一个投射到脊髓背根。DRG中的疼痛神经元的细胞胞体被分为大小两类。免疫组化研究表明慢速传导的C和Aδ纤维束111是小胞体，快速传导的Aβ纤维束是大细胞体。Figure1-5Nociception.Normalpainsignallinginthebodyistransmittedtothespinalcorddorsalhornthroughnociceptors.Nociceptivepain,suchasapinpricktothefoot,leadstothereleaseofpaintransmittersfromprimaryafferentterminalsthatprojectontopain-projectionneuronsprimarilytolaminaeI,IVandVinthespinalcorddorsalhorns.However,whentissueinjuryandskininflammationensue,chronicinflammatorysignalsarereleasedfromsurroundingcellsattheperipheralnerveterminalandleadtothesensitizationofthenociceptors.Nociceptivesignallingfromthedorsalrootganglia(DRG)isthenrelayedtothedorsalspinalcord,brainstemandbrain,wheretheexperienceofpainoccurs.TheinsetshowsacrosssectionofspinalcordincludingthespinalcorddorsalhornandtheDRG.TheDRGcontainpseudounipolarsensoryneurons-socalledbecausetheygiverisetoasingleaxonthatbifurcates,withonepartprojectingtotheperipheryandtheotherprojectingtothedorsalhornofthespinalcord.ThecellbodiesofnociceptiveneuronsintheDRGarebroadlyclassifiedintolargeandsmalltypes.ImmunohistochemicalstainingstudieshaveshownthatslowlyconductingCandAδfibres111havesmallcellbodies,whereasfaster-conductingAβfibrestendtohavelargercellbodies.目前，通过常用的减少如非类固醇类及麻醉剂等药物针对NP的治疗疗效很小或无，因此探究新型治疗药物的需求很高。由于仅仅通过临床研究容易造成对人体不可逆的损伤，因此，使用有效的简易的可重复性强的NP动物模型，研究其中的机制、拓12 华中科技大学博士学位论文112宽对它的了解、并且对药物治疗的评价等都很有帮助。下图1-6展示的是几个代表性的NP动物模型。图1-6代表性外周神经损伤模型。(1),L5和L6脊髓段结扎SNL；(2),坐骨神经4根肠线结扎而成的慢性收缩损伤CCI；(3),腓总神经结扎CPL；(4),坐骨神经横切轴索显微外科术SNT；(5),三分之一至一半的坐骨神经紧密结扎PSNL；(6),胫骨腓肠神经的横切TST；(7),腓骨胫骨神经横切113SNI。Figure1-6Representationofdifferentperipheralnerveinjurymodels.(1)spinalnerveligationSNLbytightlyligatingL5andL6spinalnerves;(2)chronicconstrictioninjuryCCIbyplacingfourlooseligaturesaroundthesciaticnerve;(3)ligationofcommonperonealnerveCPL;(4)axotomymodelbysciaticnervetransectionSNT;(5)partialsciaticnerveligationbytightligationofone-thirdtohalfofsciaticnervePSNL;(6)tibialandsuralnervetransectionmodelbytransectionoftibialandsuralnerve113TST;(7)sparednerveinjurymodelSNIbytransectionofperonealandtibialnerve.除了以上表示出来的几种典型模型，NP的动物模型远不止这些，比如还有一些通113过模拟其余疾病而诱导出的模型，总计有27种模型，到目前为止，可能会更多。尽管目前已出现了比较多的模型，但其中尚未发现最好的能够完全解决人体中的疼痛模型，在实际探究中，研究者需要根据自己的目的选择合适的进行。目前几种常见的NP114的模型主要包括：CCI慢性束缚性损伤模型，刺激并产生了临床外伤及肿瘤发展过115程中的慢性神经压迫症状；PSNL模型产生的既有触觉敏感又有热及机械疼痛感的116117疼痛；适用于选择性研究坐骨神经中损伤及未损伤神经纤维束的SNL模型。13 华中科技大学博士学位论文1.3.2神经病理性疼痛发生发展的主要机制在正常条件下，CNS中不同突触传播系统的抑制和促进维持着一个平衡，但当神经系统受到损伤，疼痛网络便会紊乱，处在一种兴奋和抑制不平衡的情况，沿着神经轴，自外周神经至大脑，任何一个环节都能导致神经系统的损伤，最终造成功能改变118。图1-7展示的是疼痛传递过程中的一些主要调节机制。图1-7疼痛传递及调节。疼痛传递：有害物刺激的检测是几个递增的疼痛信号通路的共同结果。LaminaI层及更深的背角里的神经元投射到中脑、髓质及脑桥包括导水管周围灰质（PAG）及臂旁核并进一步投射到杏仁核及下丘脑。这些信号通路在自主性行为、內源疼痛调节结构及效果的活化、恐惧及躲避反应中都有一定作用。背角及腹角深部的内侧投射脊髓丘脑神经元投射至丘脑内侧并在疼痛的动机影响方面扮演着重要作用。侧面投射脊髓丘脑神经元来自于LaminaI及V层，并将信息传递给丘脑侧边进而给躯体感觉皮层及脑岛。这些是疼痛的感觉分辨方面。疼痛调节：信号从边缘结构传递到脑中的PAG及下丘脑是通过脑干下兴奋及从脑到脊髓及三叉神经核的抑制输出的联系实现的。另外，从岛叶皮层到脑干的蓝斑到脊髓及三叉神经核的信号系统也调节了脊髓的活动。皮质、皮质下及脑干结构因此也能调节脊髓发生的疼痛活动。损伤后神经系统的可塑性：(1)化学介质的释放使感觉纤维敏感，神经瘤的形成引发了异位活动；(2)DRG中的钠离子通道的上调及基因表达的变化增加了感觉神经元的兴奋性；(3)背角的次级神经元被敏化。传入讯息的增加可能会导致抑制性中间神经元退化，小神经胶质细胞被活化并进一步促进敏化；(4)脑干核团出发而来的下行辅助和抑制信号调节了脊髓的传导；(5)下丘脑和边缘系统调节了自主118的行为、情绪、情感的改变；(6)脑不适应的可塑性会引起皮层疼痛感受的改变。Figure1-7PaintransmissionandPainmodulation.Paintransmission:Detectionofnoxiousstimuliistheresultofseveralascendingpainpathways.NeuronsoriginatinginthelaminaIanddeeperdorsalhornprojecttonucleiinmidbrain,medullaandponsincludingtheperiaqueductalgreymatter(PAG)andparabrachialnucleuswithfurtherprojectionstotheamygdalaandhypothalamus.Thesepathwaysaresuggestedtobeinvolvedinautonomicbehavior,activationofendogenouspainmodulatingstructuresandaffect,fearandavoidanceresponses.Mediallyprojectingspinothalamicneuronsoriginatinginthedeepdorsalhornandventralhornprojectstothemedialthalamusandarethoughttoplayaroleinthemotivational-affectiveaspectsofpain.LaterallyprojectingspinothalamicneuronsoriginatesinlaminaIandVandsenditsinformationtothelateralpartofthalamusandsubsequentlytosomatosensorycortexandinsula.Thesearethoughttosignalthesensory-discriminativeaspectsofpain.Painmodulation:14 华中科技大学博士学位论文PathwaysfromlimbicstructurestothemesencephalicPAGandhypothalamuscontrolviaalinkinthelowerbrainstemexcitatory(+)andinhibitory(-)outputfromthebraintothespinalcordandtrigeminalnucleus.Additionalsystemsfromtheinsularcortextothelocuscoeruleusinthebrainstemtothespinalcordalsomodulatespinalactivity.Cortical,subcorticalandbrainstemstructuresarethereforeabletomodulatespinalgeneratedpainactivity.Plasticityinthenervoussystemafterinjury:(1)Releaseofchemicalmediatorssensitizethesensoryfibersandneuromaformationcausesectopicactivity.(2)Upregulationofsodiumchannelsandchangesingeneexpressionindorsalrootgangliaincreasesexcitabilityofsensoryneurons.(3)Second-orderneuronsinthedorsalhornbecomesensitized.Inhibitoryinterneuronsmaydegenerate,maybeasaresultofincreasedafferentinput,andmicrogliabecomeactivated,whichfurthercontributetoenhancedsensitivity.(4)Descendingfacilitationandinhibitionfrombrainstemnucleimodulatestransmissioninthespinalcord.(5)Hypothalamusandlimbicsystemareinvolvedinalterationsinautonomicbehavior,mood,andemotions.(6)Maladaptive118plasticityinthebraincausesalteredcorticalprocessingofnociceptiveinputs.1.3.3小神经胶质细胞在神经病理性疼痛中的作用神经通路相关的机制在NP的调控中起到重要的作用，但它们周围的胶质细胞在其中的调节作用也不能忽视。目前，胶质细胞正因此也逐渐成为药物开发的新型靶标。它们通过释放一系列特有的神经信号分子对NP的进程进行调控。中枢敏化一旦开始，疼痛信号就不再是一种适应性保护的角色，在此过程中，胶质细胞会被活化，活化的胶质细胞能够表达各种功能性的神经递质受体，在突触传递的过程中接收并响应各种119120信号，既可通过促炎因子的释放如TNFα，IL-1β促进NP的进程，同时也能释放抗121炎因子如IL-10对病理性疼痛进行逆转，起到保护作用。最近有研究强调，一种特定表型的小神经胶质细胞，即表达P2X4受体的小神经胶质细胞在NP的进程中扮演着核心作用。P2X4受体的刺激引发一系列疼痛相关信号通路，并调节了脑源神经营养因子的释放。这些分子信号事件与人类NP的多种症状都相关，为特定的干预治疗缓解病人病痛提供帮助。这类小神经胶质细胞在外周神经损伤122后参与调节的一系列疼痛级联反应如下图1-8所示。15 华中科技大学博士学位论文图1-8外周神经损伤后P2X4R受体表达的小神经胶质细胞调控了一系列疼痛超敏反应。外周轴突或神经损伤后刺激脊髓小神经胶质细胞（紫色）改变为一种P2X4Rs高表达的细胞表型（左上）。虚线方框中的内容在下方展示。它们展示的是小神经胶质细胞在不同的病理条件下其中的一种活化状态，右上为几种可能发挥作用的状态。外周神经损伤通过从ECM，浸润的T细胞及孙山初级传入神经释放的多种因子调节P2X4R的表达。P2X4R主要定位在溶酶体中，之后迁移至细胞表面。ATP活化的P2X4R会导致钙离子内流，p38MAPK磷酸化及p38调节的小神经胶质细胞BDNF的合成和释放。BDNF与脊髓疼痛感受网络中的神经元TrkB受体集合，并反过来造成KCl共转子KCC2的下调，从而破坏神经元中氯化物的稳态破坏。最终，造成背角固有抑制系统的去抑制122作用。Figure1-8TheP2X4R+microglialphenotypemediatesacorepainhypersensitivitycascadefollowingperipheralnerveinjury.Peripheralaxotomyornervedamage(PNI)stimulateschangesinspinalmicroglia(purple)suchthattheyadoptaphenotypecharacterizedbyincreasedexpressionofP2X4Rs(topleft).Thedottedrectangleisexpandedinthebottompanel.Thisisoneofseveralreactivephenotypesthatmicrogliacanadoptunderpathologicalconditions(topright).PeripheralnerveinjurymodulatesP2X4Rexpressionbythereleaseofvariousfactorsfromtheextracellularmatrix,infiltratingTcellsandinjuredprimaryafferents(bottom).P2X4Rsarelocalizedpredominantlytolysosomesandaretraffickedtothecellsurface(orangearrow).P2X4RactivationbyATPleadstocalciuminflow,phosphorylation(P)ofp38MAPK,andp38-mediatedsynthesisandreleaseofBDNFfromthemicroglia.BDNFthenbindsneuronalTrkBreceptorsinthespinalnociceptivenetworkandinturncausesadownregulationofthepotassium–chloridecotransporterKCC2,disturbingthechloridehomeostasisof122theneuron.Theoutcomeisanetdisinhibitionoftheintrinsicinhibitorysysteminthedorsalhorn.16 华中科技大学博士学位论文1.4活体显微光学成像技术在神经科学中的应用1.4.1活体显微光学成像技术活体显微成像（IVM）技术是在显微水平对活着的动物进行成像。这种技术的优势是能够揭示细胞随着时间和空间变化的反应过程，同时能够实现在近似自然的环境123下对目标进行成像。目前，活体显微成像技术主要包括单光子/多光子激发活体显微成像，光片荧光显微成像、超分辨显微成像及相干光电子显微成像。随着各种荧光标记术的发展及各种功能成像技术的结合或辅助，活体显微成像为各种生物学问题的解决提供更多量化的、动态的信息和指导。其中，由于单光子/多光子激发活体显微成像具有高分辨率、快速、数据量小、易操作及多功能且已被商业化等特性，因此广泛地124被应用于肿瘤生物学、发展生物学、神经科学、干细胞生物学等研究领域。由于深部组织的光吸收很强，因此用于IVM的无损小鼠模型很少。完整的组织如125真皮或表皮层约100µm左右能被双光子激发显微镜探测到。然而大部分内部器官的信息都需要通过手术暴露的方法或者通过使用内窥镜才能被探测到。比如，使用单光子/多光子激发活体显微成像能够直接对暴露的舌头、肌肉、胃肠道等部位进行成像。126为了发展损伤性更少且能实现长时程的成像探测，科学家们发展了一系列成像窗口53127128129用于如脑、肺、乳房、腹腔脏器及皮肤组织的长时间成像。1.4.2活体显微光学成像技术在神经科学中的应用（1）CNS活体显微成像窗口的进展随着各种显微光学成像技术的发展，科学家们也将其运用到神经科学研究领域中，让人们能探索相对完整的CNS中的奥秘。合适的颅窗成像窗口为这些显微光学成130像技术的应用提供准备和前提，图1-9展示的是几种常见的颅窗开窗方式。17 华中科技大学博士学位论文图1-9活体显微成像观察脑组织的准备。(a)颅窗准备，由一块薄的盖玻片替代揭开的一小块颅骨组成；(b)磨薄的头骨准备，将头骨表面磨薄至能够穿过它进行成像为止；(c)打开的颅窗准备，一部分脑组织表面暴露一部分盖上盖玻片；(d)PoRTS窗口准备，颅骨磨薄、抛光后盖上盖玻片。130红色虚线间的区域为通过每种窗口能探测到的相对区域。Figure1-9Opticalpreparationsforintravitalmicroscopyofthebrain.Thecranialwindowpreparation(a)consistsintheremovalofapieceofskullandreplacingitwithathincoverglass.Thethinned-skullpreparation(b)requirestheremovalofthesuperficiallayersoftheskullboneuntilitsthinnessallowsfortheimagingofthebrainstructuresbeneathit.Theresearchermayoptforanopencranialwindow(c)whereareasofthebrainsurfaceareaccessiblewhileothersareunderthecoverglass.ForthePoRTSpreparation(d)thecranialboneisthinned,polished,andcoveredwithcoverglass.Therelativesizesofthebrainareasthatcanbeimagedusingeachpreparationaredepictedastheareasbetweenthered130dottedlines.除了上述展示的颅窗之外，脊髓窗的发展也为人们使用光学显微成像手段长时间监测CNS中另一主要区域脊髓中的细胞行为提供可能。图1-10展示的是安装在小鼠脊131髓上的一个窗口，使用这种方法，实现了对小鼠长达几个月不同时间点对目标脊髓段的观察。18 华中科技大学博士学位论文图1-10无需二次手术的用于长时间光学成像小鼠脊髓窗口。(a)成像窗口照片；(b)展示脊髓窗口安装在小鼠脊髓T11-T12段的方法图；(c)手术后144天，从脊髓窗拍到的视野；(d)安装有脊131髓窗的小鼠。Figure1-10Animagingchamberforlongitudinalopticalaccesstomousespinalcordwithouttheneedforrepeatedsurgeries.(a)Photographoftheimagingchamber.(b)SchemashowingtheimplantationoftheimagingchamberinmiceattheT11–T12vertebra,justbelowthedorsalfatpad(taupe).(c)Photographshowingthespinalcordimagedthroughtheimplantedchamber144dafterthesurgery.(d)131Photographofamousewithanimplantedchamber(samemouseasinc).（2）活体显微光学成像技术在神经科学中的应用长时间单光子/多光子激发活体显微成像的观察，为揭示经验依赖性可塑性中各种132细胞及元件在其中的作用提供帮助，结合各种疾病如AD、中风等，观察到神经元、胶质细胞、血管等在其中的变化，为对疾病的深入了解做贡献。通过多色标记的共定位现象，人们可以区分不同吞噬状态的细胞，并对相关数据进行量化。在AD的发展过程中，Aβ斑块的清除与否与疾病的严重程度相关，通过活体长时间的成像观察，以及多色标记的帮助，人们发现小神经胶质细胞在斑块清除中的作用。它们会在斑块周围形成一个屏障，并阻止神经毒性原细纤维Aβ42的积累，从而为AD的新型药物133开发以及临床成像提供新思路。另外，单光子/多光子激发活体显微成像结合其他功能成像如钙成像等为更好地监36测细胞的功能性活动提供可能性。将基因编码的钙探针在CD4阳性T细胞中的特异性表达，并结合荧光共振能量转移FRET技术，人们已经能够在CNS中观察在实验性脑脊髓炎EAE中至炎性的T细胞的活化。在疾病过程中，小部分T细胞会进入软脑膜空隙，19 华中科技大学博士学位论文大部分则进入至CNS实质中，在空隙中游走的过程中胞内钙浓度有了明显的升高。细胞的运动也有了一定的变化。结合活体显微成像的动态性结果及钙成像的钙信号的变134化结果，实现了在体对EAE过程中T细胞的活动变化的监测。其他光学显微成像技术如光声显微成像的应用为研究更深层的脑组织的生物学135问题提供了契机。目前，光声显微成像PAM技术能实现高分辨、快速地穿过活体小鼠颅骨进行无标记的血管成像。它们的侧向分辨率为3µm，能实现对毛细血管的血氧饱和度，对静息小鼠或者刺激后的小鼠脑的血管形态、血氧饱和度、血流及氧代谢进136行成像。除此之外，由于具有相比其他显微技术分辨率更高的优势，超分辨显微技137术STED也被应用于活体小鼠皮层中神经元的细微动态研究中。1.5选题背景及本文的主要研究内容1.5.1选题背景长久以来，CNS因其特有的BBB存在，被定义为一种免疫豁免区。目前，随着众多研究表明，外周免疫细胞能够通过如脑脊液CSF、脉络丛、脑膜、血管周空隙等54138,139部位浸润至CNS中；同时最近的研究证实了CNS中淋巴管的存在；除此之外，CNS中特有的固有免疫哨兵细胞，如脑膜巨噬细胞、血管周巨噬细胞、脉络丛巨噬细140胞及小神经胶质细胞等驻扎在各自的位点守护着CNS，等等这些免疫组分的被发现及证实，使得人们已经接受，CNS不再是免疫豁免区这一观点。作为CNS中主要的免疫细胞，小神经胶质细胞不仅时刻监视着其周围的微环境以维持其稳态，同时还参与了各种疾病的发生和发展。黑色素瘤是一种恶性程度极高的肿瘤，其较高的脑转移特性更加剧了黑色素瘤病人的痛苦。传统的生物学方法如免疫组化的研究结果证实，小神经胶质细胞参与了黑101色素瘤的发展，在黑色素瘤脑转移灶周围存在着大量活化的胶质细胞，但其作用目前还不太清楚。肿瘤、糖尿病、感染、外伤等都可能会造成一种神经病理性疼痛的症状，但是这种慢性疼痛状态比想象中更加复杂，它不仅仅是这些疾病的某一个症状，109,110同时还是一种由于神经系统功能紊乱造成的疾病。小神经胶质细胞在其中的保护或者伤害作用对于疾病的发展有着不可替代的作用。它们通过不同的分子信号途径20 华中科技大学博士学位论文122调节神经营养因子的释放，参与到疼痛级联反应中。目前，人们对小神经胶质细胞在神经病理性疼痛中的作用有一定的了解，但对其如何参与整个神经病理性疼痛的发展过程仍不太清楚。近几年，利用活体显微成像、稳定的荧光标记的转基因小鼠等这些技术，人们能够直观地观察到免疫细胞在不同微环境中的作用。经过几年的积淀，我们实验室在免疫光学成像领域已有所涉猎。通过长时程活体显微成像，骆美洁等人利用足垫成像发现单核巨噬细胞及中性粒细胞在迟发型超敏反应中能够快速的聚集，从而参与迟发型141超敏反应的调控；杨飞等人利用皮窗对小鼠黑色素瘤微环境中免疫细胞及肿瘤细胞的行为进行监测，发现了在免疫小鼠中免疫细胞能够特异性清除抗原表达的肿瘤细胞142；祁淑红等人发现，肿瘤微环境周围形成了由T调节细胞组成的免疫细胞耐受圈，143并进而通过成像实现对肿瘤治疗的指导。结合这些宝贵的经验，本论文旨在通过活体显微成像技术，利用稳定表达荧光蛋白的转基因小鼠对其漫长的疾病发展过程（如黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛）中小神经胶质细胞的行为进行长时程监测，从而揭示其发挥的功能及可能的疾病机理，为疾病的治疗和诊断提供新视野和思路。1.5.2本论文主要研究内容本文充分利用各种活体显微成像系统，对小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛中的作用进行系统性的研究。为此，首先，我们通过活体显微成像的方法对黑色素瘤脑转移发展过程中小神经胶质细胞的行为等进行长时程不同时间点监测，并对获得的成像数据进行提取和整合，从而揭示其变化，此为第二章内容。接着，为了进一步探究活体成像监测到的小神经胶质细胞动态信息是否具有一定的生物学意义，以及其中可能的机制，我们结合传统生物学手段进行了相关阐述，此为第三章。为了探究小神经胶质细胞是如何参与神经病理性疼痛的发展，我们充分利用长时程活体成像的优势，结合不同程度的疼痛小鼠模型，揭示了其在此过程中可能的作用，此为第四章内容。考虑到后肢感觉皮层参与了神经病理性疼痛中的调控，并结合无标记的光声显微成像的优势，我们对不同疼痛小鼠的后肢感觉皮层进行光声显微成像，以揭示皮层参与的疼痛调控在其中的作用，此为第五章。最后，对获得的结果进行总结及展望。本论文的研究内容和结构如图1-11所示。21 华中科技大学博士学位论文图1-11本论文的研究内容和结构Figure1-11ThecontentsandstructureofthePhDdissertation22 华中科技大学博士学位论文2小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移发展中的细胞动态变化2.1引言脑转移的形成是一个漫长且低效的过程，因此应用合适的实验性脑转移模型研究此过程是很有必要的。根据现有的实验性脑转移模型的方法及优缺点（如图1-3及表1361-1所示），我们选择立体定位注射及颈内动脉注射形成的脑转移模型分别用于活体显微成像及脑转移机理的相关研究中。由于我们的体系中使用了黑色素肿瘤细胞及荧光标记的黑色素瘤细胞，我们能够很好的对脑转移的成功与否进行鉴定：一方面，黑色素瘤能够被肉眼直观的判断出其在脑组织中的分布和数目，另一方面，荧光标记的黑色素瘤细胞能够通过显微及整体荧光成像的方式被检测到。作为CNS中主要的免疫哨兵细胞，小神经胶质细胞能够持续地使用其突起扫描34,35,144监视周围的微环境，同时能快速做出相应的反应。尽管目前已有一些报道涉及到小神经胶质细胞在肿瘤区域的活化现象，但其在黑色素瘤脑转移发展过程中的作用目前还尚不清楚。由于小神经胶质细胞无论在健康或者损伤条件下都是动态变化的，因此相比传统的生物学手段，活体显微成像方法的运用为研究小神经胶质细胞的功能提供更多直观的信息和帮助。为了更全面地观察在黑色素瘤脑转移的发生发展过程中小神经胶质细胞的活动，我们采用双侧颅窗的方式，即可同时对大脑皮层两侧颅窗中小神经胶质细胞的行为活动进行监视。皮层两侧颅窗中，一侧进行黑色素瘤细胞的接种，一侧作为对照，这种方式可以实现同时对肿瘤形成过程中转移灶周围的小神经胶质细胞及对侧正常脑组织中小神经细胞活动的监测，以更全面地揭示不同环境下的小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移发展过程中的作用。本章节，我们通过立体定位注射的方式建立黑色素瘤脑转移模型，并运用双侧颅窗的设计，分别对肿瘤接种侧及对侧颅窗窗口中的小神经胶质细胞进行长时程多时间点的活体显微成像，比较黑色素瘤脑转移发展过程中，小神经胶质细胞的行为变化，从而揭示其发挥的作用。23 华中科技大学博士学位论文2.2实验材料和方法2.2.1实验仪器电热恒温水浴锅上海福玛实验设备有限公司台式低速水平离心机长沙湘智离心机仪器有限公司VS-840K-U型净化工作台苏州安泰空气技术有限公司二氧化碳培养箱美国Thermo公司IX71倒置荧光显微镜日本奥林巴斯公司立体定位注射系统NARISHIGE科学仪器实验室XTL-240体视显微镜上海光密仪器动物体温维持仪瑞沃德生命科技有限公司整体荧光成像系统自制梅特勒PH计梅特勒-托利多国际有限公司AL204-IC精密电子天平美国梅特勒公司恒温磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司微型手持式颅钻瑞沃德生命科技有限公司桌面数显脑立体定位仪瑞沃德生命科技有限公司转盘共聚焦显微镜PerkinElmer公司Dell图像处工作站戴尔公司小动物麻醉机瑞沃德生命科技有限公司2.2.2实验材料黑色素瘤脑转移模型所用实验材料：C57BL/6小鼠，CX3CR1-GFP小鼠，黑色素瘤细胞B16F10，tfRFP荧光标记的黑色素瘤细胞B16-tfRFP，磷酸缓冲液PBS，台盼蓝，RPMI-1640培养基，胎牛血清FBS，双抗（青链霉素混合液100×），医用碘酒，医用酒精，冻存管，15mLcorning离心管，康宁细胞培养瓶，吉尔森移液枪，Eppendorf管，31gauge一次性胰岛素注射器，5-0号丝线，0号缝线，角针，微型止血夹，脱脂棉球，手术器械，打孔器。24 华中科技大学博士学位论文双侧颅窗所用实验材料：手术器械，医用碘酒，棉签，牙科树脂，止血海绵，生理盐水，地塞米松磷酸钠注射液，凡士林，刀片，利多卡因，记号笔，组织胶水，3mm盖玻片。活体显微成像实验材料：异氟烷，医用酒精，脱脂棉签，透明胶带，医用胶带。PBS缓冲液KH2PO40.27g，Na2HPO41.42g，NaCl8g，KCl0.2g，加入900mL去离子水，磁力搅拌至溶解后，使用PH调节器调节PH值至7.4，定容至1L即可；胰蛋白酶消化液取900mLPBS缓冲液，加入2.5g胰酶，磁力搅拌溶解后，使用PH调节器将PH值调节至7.4，定容至1L即可；RPMI-1640完全培养基RPMI-1640培养基中加入10%FBS及双抗。乌拉坦麻醉剂2%水合氯醛与10%乌拉坦混合过滤后待用。PFA溶液称取4g多聚甲醛加入100mLPBS缓冲液，60°C磁力搅拌机上加热搅拌至多聚甲醛全部溶解，冷却至室温后，调整PH值到7.4，此过程在通风厨中进行。地塞米松磷酸钠注射液将地塞米松磷酸钠注射液稀释成4mg/mL的浓度待用，按照~2µg/g剂量对小鼠进行肌肉注射，地塞米松能够减少手术过程中皮层的应激反应及脑水肿；利多卡因使用PBS稀释成1%利多卡因，使用棉签蘸取适量涂抹在头骨上，进行局部麻醉；Cortexbuffer25 华中科技大学博士学位论文NaCl125mMGlucose10mMHEPES10mMMgSO42mMCaCl22mM加入1L去离子水，磁力搅拌至溶解后，调节PH至7.4，过滤待用；葡萄糖溶液使用生理盐水配制5%葡萄糖溶液，分装待用。2.2.3实验方法(1)黑色素瘤细胞悬液制备a)冻存的黑色素瘤细胞放置在37°C水浴锅中复苏，复苏后，立即加入完全培养基将细胞悬液混匀，移至15mL无菌离心管中，低速离心机中1000转，5min中离心；b)离心后，使用完全培养基进行重悬，并转至康宁培养瓶中进行扩大培养；c)IX71显微镜下镜检观察细胞的生长状态，待细胞密度适中时，使用胰蛋白酶溶液将肿瘤细胞消化，镜检观察消化状态，细胞开始变圆后，加入完全培养基终止消化，混匀后进行离心；d)离心结束后，使用PBS磷酸缓冲液将细胞悬液清洗两次，清洗后，取适量细胞加入台盼蓝，在显微镜下使用白细胞计数板进行活细胞计数；63e)按照10cell/60µL将细胞重悬至PBS中，用于颈内动脉注射方式，按照10cell/0.3µL重悬细胞，用于立体定位注射方式。(2)颈内动脉注射黑色素瘤细胞形成脑转移a)使用乌拉坦麻醉剂将小鼠进行深度麻醉，麻醉后使用婴儿理发器小心将小鼠颈部毛发推掉；b)将小鼠仰卧放置在体视显微镜下方，使用自带的固定装置将小鼠上肢固定好，并在镜头下调整好高度以及亮度，准备手术，主要步骤参照之前文献所述，注射位点如图2-1所示：26 华中科技大学博士学位论文145图2-1颈内动脉注射肿瘤细胞145Figure2-1Intracarotidinjectionoftumorcellc)使用酒精棉球轻轻擦拭剃毛部位，借着使用碘酒进行擦拭，擦拭后后，使用已消毒后的眼科剪将小鼠靠近右侧的颈部开1cm左右小口，之后使用眼科镊对组织进行蹲钝性分离，暴露器官，分离胸锁乳突肌及肩胛舌骨肌，暴露颈动脉鞘，并将右侧颈总动脉及颈内动脉颈外动脉分支游离；d)使用微血管夹将颈总动脉近心端夹紧，接着，将微血管夹稍微抬起，从血管下方穿入两根5-0号丝线，叠放置在微血管夹后方近心端位置；e)移液枪将备好的细胞悬液混匀，使用31gauge胰岛素注射器吸取细胞悬液，排尽气泡待用；f)脱脂棉球沾上适量PBS将分离好的血管稍微湿润，调整好血管的位置准备进行注射；g)一手将微血管夹捏住，一手将针头从微血管夹上颈总动脉近心端插入，并将针尖深入至颈内动脉，针头插入后不要左右移动，稳定后，开始缓慢注射细27 华中科技大学博士学位论文胞悬液，细胞悬液注射完成后，保持针头的位置不动，停留1min左右；h)这时小心将针头抽出，并立即在注射点使用脱脂棉球盖住，防止流血；i)待到注射点不流血后，将备好的丝线拉上至注射点上方即远心端，打上结，接着，在微血管夹后方，即注射点近心端使用另一丝线打好结；j)使用PBS擦拭创口，并将肌肉皮肤等位置复原，使用0号缝线，将皮肤开口使用单纯连续缝合的方法缝合好；k)缝合结束后，使用医用碘酒擦拭皮肤，即可将小鼠放置在加热垫上，等待其苏醒，放置在IVC笼具中，待后续观察。(3)立体定位注射黑色素瘤细胞形成脑转移a)使用乌拉坦麻醉剂将小鼠深度麻醉，使用手持颅钻将小鼠颅骨打开一小孔（第三章会详细介绍颅骨开窗的步骤）；b)将小鼠放置在立体定位仪上，固定好后，将毛细玻璃电极安装至注射台上，剪断适量尖端，将细胞悬液混匀后吸取至一薄膜上，毛细电极小心将细胞吸取，避免抽吸到空气；c)细胞悬液准备好后，就开始调节注射位置，将细胞注射至皮层开颅窗中心部位深200µm处，注射时，需要控制好速度，在立体定位仪镜头下可见液面下移及注射点的情况，保证细胞下移的速度不能太快，且脑膜表面未见细胞漏出；d)细胞注射结束后，停留5min，以保证注入效率；e)注射完成后，将毛细电极抽出，之后封闭开口及皮肤即可。(4)小鼠心脏灌流a)准备好所需试剂，包括PBS,HBSS等磷酸缓冲液，4%PFA等固定液；b)打开灌流泵，将速度显示调整到18.5psi，吸入管放入PBS等磷酸缓冲液中，为避免管中残存的4%PFA，因此首先使用缓冲液将管道冲洗干净，冲洗后，即可停止等待灌注；c)使用乌拉坦等麻药对实验小鼠进行麻醉，小鼠深度麻醉后，将小鼠放置在固定台面上，四肢固定好，使用手术器械暴露小鼠胸腔，小心剪开肋骨，暴露28 华中科技大学博士学位论文心脏；d)使用止血钳夹住肋骨，顺势将止血钳固定好掀开的肋骨，小心剥离心脏上的纤维组织，一手使用镊子轻轻放置在心脏周围进行固定，一手将针头插入至小鼠左心室心尖部位，成功插入的针头中可见血液的回流；e)插入针头后，使用眼科镊等手术器械固定好针管，避免针头随着心脏泵动而抽出，固定好后，再使用眼科剪小心在右心房位置剪个小口，此时需避免人眼被小鼠血液溅到，生手需控制好距离或戴好护目镜；f)血液成功泵出后，大约5min即可看到小鼠的脏器转白，等到PBS灌注完成后，即可将吸入管放置入4%PFA中进行固定，灌注过程中可观察到小鼠身体肌肉抽搐、身体变硬以及尾巴上翘等正常现象，约3-5min后即可停止灌注，若不需要固定样本，则不需要灌注4%PFA，直接结束PBS灌注即可。(5)黑色素瘤脑转移鉴定a)根据黑色素瘤细胞的特点，分别给接种有无荧光黑色素瘤细胞的小鼠在接种后第15天左右，接种有荧光蛋白标记的黑色素瘤细胞的小鼠在接种后第21天左右，将小鼠深度麻醉；b)按照2.2.3.4的方法说明进行小鼠心脏灌流；c)灌流结束后，使用止血钳将头盖骨揭开，剥离完整脑组织；d)将剥离后的脑组织摆放在滤纸上，黑色的肿瘤块即为转移灶所在位置，对于tfRFP荧光标记的肿瘤脑转移样本，将其放置在自制的整体荧光成像系统中，使用561nm激发光激发，设置曝光时间5s就能检测到明显的荧光信号，该信号即为黑色素瘤脑转移灶的信号。(6)双侧颅窗制备方法a)深度麻醉小鼠，使用棉签蘸取适量凡士林，涂抹在小鼠眼睛上，以保证小鼠眼部湿润，地塞米松肌肉注射，搭好临时试验台，主要包括加热垫以及一些纱布海绵等将小鼠位置稍作固定，特别是头部的位置；b)使用弯剪减掉头顶部位的毛发使用碘伏及酒精清理剪发部位（酒精及碘伏使用过程中需注意，不要在暴露的伤口上使用），保持头顶干净，接着从两耳29 华中科技大学博士学位论文中点部位开剪至小鼠眼部，注意还未到眼睛部位，向各个方向剪开头皮，以暴露整个头骨及边界；c)使用局部麻醉剂（利多卡因）适量涂抹暴露的头骨，小心去掉骨膜，并将右侧颞肌与骨小心分离，这能够减少成像过程中的出血现象；d)使用尺子在目标部位（介于lambda和bregma中间的右半球部位）做标记，标出中点及直径2.7mm的圆形边界，对侧位置也做好标记；e)待记号及周围骨干燥后，头骨及伤口周围均涂抹上一层组织胶水，它能够止血并防止浆液血性渗出，且能够有助于牙科树脂的粘附；f)待组织胶水干燥后，在其上方涂上一薄层牙科树脂黏合剂，待干燥后进行下一步；在涂抹组织胶水及牙科树脂时要注意不要涂抹在目标部位；g)使用微型手持钻对准标记部位开始进行钻圈打洞，使用微型钻时，一定要注意不能让钻头工作时太猛导致穿过头骨，这样会对脑部实质组织会造成损伤，整个打洞的过程一定要注意施力均匀，即不要在一个点停留太久，需要不断的画圆，以减少电钻运动时产生的热量对硬脑膜的伤害，间隔时使用Cortexbuffer浸泡过的止血海绵湿润，给打钻位置降温；h)另外，由于是双侧颅窗模型，因此，在窗口打磨时可交替进行，间隙使用止血海绵进行擦拭；i)使用沾有无菌PBS的棉棒小心清洗磨碎的骨碎，保持工作部位的干净，同时也可估计打洞程度是否完全，当能够使用弯头尖镊子将这片骨片剥离下来时，小心在骨空隙中加入适量Cortexbuffer（可以使用注射器小心注入），由于溶液的张力存在，在慢慢揭开骨头时，能够缓解小鼠的疼痛并且加快揭开的步骤；j)揭开骨片后，使用沾有Cortexbuffer的止血海绵清洗几次暴露的脑实质，清洗干净后，清洗干净后即可加入一些Cortexbuffer，准备加上盖玻片；k)盖上盖玻片时，将打开的颅窗完全覆盖住，之后使用组织胶水将玻片与骨边缘的空隙粘合好，待胶水凝固后，使用牙科树脂涂抹在整个头骨上暴露的区域，待干燥后即可等待小鼠苏醒，观察窗口情况。30 华中科技大学博士学位论文(7)小鼠脑活体显微成像方法a)使用异氟烷将待成像的小鼠进行呼吸麻醉，并将麻醉后的小鼠固定在第三章所述的成像小盒子中即可开始成像；b)成像之前，需要对对应荧光分子的激光强度和曝光时间进行调节，这里，我们使用GFP及RFP两种激发光分别对小神经胶质细胞及黑色素瘤细胞进行成像；c)成像时，首先使用10×物镜找到目标区域，使用系统中带有的3D扫描功能获得不同区域内的Z轴信息即小神经胶质细胞的分布信息，注意层与层之间间隔设置为1µm左右；d)接着将镜头转为20×物镜，选择感兴趣的区域进行时间序列的扫描，获得小神经胶质细胞的运动信息，其中，间隔时间设置为5s，扫描时间为20至30min。根据预实验的结果，该时间段的运动记录足以实现对小神经胶质细胞运动行为的分析，另外，可根据实际情况获得2至3个不同区域的时间序列扫描；e)成像后，将获得的原始数据导出，使用FIJI及imaris对数据进行分析，分析方法如后续所述。(8)活体显微成像数据处理方法a)使用转盘共聚焦配套软件volocity，将待分析的数据导出为multipleTiff格式，接着使用FIJI将数据打开，并调节合适的显示强度，使用FIJI将导出的TIFF数据批量处理为stack文件；b)然后，将stack文件使用imaris打开，并根据图片的真实信息将格式录入，接着分别对3Dstack数据及时间序列进行处理；c)对于3Dstack数据的处理，我们首先随机选择5个立方块的区域，大小为250µm×250µm×50µm，使用imaris软件上spot的工具，对区域内的小神经胶质细胞数目进行统计，并再次检查所选细胞信息是否真实，接着，将数据录入至电子表格中，计算每个3Dstack中5个立方体中细胞数目的均值，最终使用此数据进行小神经胶质细胞volumedensity参数的比较；d)对于时间序列的数据，根据小神经胶质细胞的特点，分别对细胞胞体及胞体31 华中科技大学博士学位论文延伸而出的突起的运动进行分析。在细胞的胞体分析过程中，使用imaris中spot模块中，自动追踪的功能，获得小神经胶质细胞胞体的运动信息；而针对小神经胶质细胞的突起的运动分析时，根据突起的运动特点需要进行人工分析，即选择能被清晰识别的突起，使用手动追踪的方法，对其运动进行追踪，追踪过程中，需将画面放大以减少误差，完成后，需通过反复比对确认轨迹的正确可靠性；e)将追踪完成后的数据通过matlab上相应程序进行分析，获得所需要的参数信息，如运动速度、运动位移、限制系数、限制比例等；f)最后，使用软件GraphpadPrism对获得的数据进行统计分析即可。2.3实验结果2.3.1黑色素瘤脑转移模型的建立(1)颈内动脉注射黑色素瘤形成的脑转移首先，按照上述颈内动脉注射方式形成脑转移的实验方法和步骤，使用普通无荧光的黑色素瘤细胞进行接种。细胞注射后15天左右，使用PBS及PFA对小鼠进行灌流，分离小鼠脑组织，对黑色素瘤脑转移形成进行鉴定，主要结果如图2-2所示。由于本博士论文主要的研究目标是活体显微成像观察小神经胶质细胞在黑色素gfp+瘤脑转移及神经病理性疼痛中的作用，在活体研究时我们主要使用CX3CR1转基因小鼠。因此，首先需要比较黑色素瘤细胞在C57BL/6小鼠与转基因小鼠中形成的脑转移是否有差异。将等量的黑色素瘤细胞颈内动脉注射至三种小鼠（分别为正常小鼠、小神经胶质细胞EGFP标记的正常小鼠、小神经胶质细胞EGFP标记的且CX3CR1基因缺陷的小鼠）中，15天后，收集脑组织。从图2-2A结果可见，黑色素瘤细胞经过颈内动脉后能够成功形成肉眼可见的黑色素瘤脑转移灶，红色圆圈区域中即为黑色素瘤转移所在灶点。另外，从此结果可见，颈内动脉注射的方式，虽然能够成功形成转移灶，但由于其肿瘤转移灶的位置分布很难确定，可能分布在皮层、嗅球下方、矢状窦一侧等各种区域，因此不太适合从固定窗口活体显微成像对脑转移形成过程中事件的观察，这也是后续在成像时使用立体定位注射的方式进行活体成像的原因。32 华中科技大学博士学位论文图2-2黑色素瘤脑转移的建立。A，正常脑组织及黑色素瘤转移后的脑组织照片，其中红色花圈gfp+gfpgfp区域为黑色素瘤转移灶位置；B，黑色素瘤细胞在C57，CX3CR1，CX3CR1三种小鼠中形成的脑转移的数目及大小都无明显差异。所有数据来自三次独立实验，每组10只小鼠。全文中多组间比较使用one-wayANOVA或KruskalWallis检验，两组间使用未配对T检验。图中所有的误差线均表示“标准误”。NS表示P>0.05，无显著性差异。Figure2-2Establishmentofmelanomabrainmetastasis.A，Photographofnormalbrainandmelanomametastaticbrain.Regionsinredcirclesshowedthefociofmelanomabrainmetastasis.B,Nosignificantgfp+differencesinthenumbersandsizeofmelanomabrainmetastasisamongthemiceofC57,CX3CR1,gfpgfpCX3CR1.Datawerepooledfrom10miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.StatisticaldatawereperformedwithonewayANOVAorKruskalWallistestbetweengroups,andunpairedT-testbetweentwogroupsinthewholeassay.AlloftheerrorbarsrepresentStandardErroroftheMean(SEM).Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant.接着，我们对转移灶的数目及大小进行统计和测量。从图2-2B中可见，在这三种小鼠脑组织中，黑色素瘤脑转移灶的数目基本一致，都至少有1至2个转移灶，相互之间均无明显差异。另外，使用千分尺对形成的转移灶的尺寸进行测量，记录其长宽，统计得到每个转移灶的面积大小，进行统计分析，组与组之间的比较使用未配对的T检验分析。从图2-2B右侧柱状图结果可见，这三组小鼠中，黑色素瘤脑转移灶2的大小为6mm左右，在三组中也无明显差异。由于黑色素瘤细胞在C57小鼠及33 华中科技大学博士学位论文CX3CR1转基因小鼠中无明显差异，因此能使用CX3CR1转基因小鼠作为研究对象，观察基因正常的小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移灶形成中的作用。为了进一步确定荧光标记的黑色素瘤细胞也能形成黑色素瘤脑转移，我们将荧光标记的黑色素瘤细胞颈内动脉注射至CX3CR1转基因小鼠体内，21天后，按照上述方法，获得小鼠脑组织，并使用整体荧光成像系统对获得的鼠脑肿瘤转移灶的信号进行检测，得到如图2-3所示的结果。图2-3整体荧光成像系统获得的转移的脑组织的荧光成像结果。图中竖排分别代表的是白光图、荧光图及融合图，分别展示两种转基因小鼠脑组织黑色素瘤转移的结果。右侧为荧光信号的色棒。Figure2-3Fluorescentimagesofmetastaticbrainacquiredbywhole-bodyfluorescenceimagingsystem.Imagesrepresentedaswhitelightimage,fluorescentimageandmergeimageofmetastaticbrainfromCX3CR1transgenemice.Thecolorbarrepresentedfluorescenceintensity.从上图结果可见，无论在CX3CR1正常或缺陷的小鼠中，颈内动脉注射荧光标记的黑色素瘤细胞后，小鼠脑组织中都能够被检测到黑色素瘤脑转移。另外，需要指出的是，由于黑色素瘤细胞黑色程度越高，因其吸光特性，荧光信号反而会弱，因此不能从荧光强度反应黑色素瘤的大小。(2)立体定位注射黑色素瘤形成的脑转移为了活体实时动态地监测小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移中的作用，我们首先需要实现能够被长时间活体监测的黑色素瘤脑转移模型，这就需要肿瘤细胞能够在我们的监视下进行生长。又如图2-2A及2-3所示，颈内动脉注射后形成的黑色素瘤转34 华中科技大学博士学位论文移灶分布的位置不定，很难保证其生长可监测性，因此结合表1-1中所列出的四种主要的脑转移模型建立方法的优缺点，在此部分，我们使用立体定位注射肿瘤细胞至脑组织中形成脑转移的方式进行模型的建立。根据上述实验步骤和方法，将肿瘤细胞使用立体定位仪注射后，等待14天左右即可在窗口上形成肉眼可见的肿瘤组织形成。分别收集接种细胞后第1天、第5天、第7天、第14天、第21天的小鼠脑组织，使用整体荧光成像系统对脑组织中红色荧光蛋白的信号进行成像，得到如图2-4所示的结果。图2-4自制整体荧光成像系统获得的黑色素瘤细胞接种后不同天数的转移脑组织的荧光成像结果。上图分别展示接种后第1天、第5天、第7天、第14天、第21天黑色素瘤脑组织的白光图、荧光图及融合图。右侧为荧光信号的色棒。Figure2-4Fluorescentimagesofmetastaticbrainondifferentdaysaftermelanomacellinoculationacquiredbyhome-madeWBFIsystem.Imagesrepresentedaswhitelightimage,fluorescenceimageandmergeimageofmetastaticbrainonday1,day5,day7,day14,day21aftermelanomacellinoculation.Thecolorbarrepresentedthefluorescenceintensity.从图2-4中展示的黑色素瘤细胞接种后不同时间的脑组织整体荧光成像结果可见，在接种后一周，肿瘤细胞就已经形成能明显被检测到的细胞团，之后一周内黑色素瘤细胞会疯狂生长，到第14天及21天时已形成肉眼可见的肿瘤细胞团。这种由接种位点决定的固定位置形成的肿瘤转移灶为活体显微成像提供便利。有了这一基础，35 华中科技大学博士学位论文我们就能够实现从窗口实时动态地观察黑色素瘤形成过程中小神经胶质细胞的作用。2.3.2长时程活体显微成像双侧颅窗模型建立按照上述制备双侧颅窗的方法和步骤，我们获得了如图2-5所示的双侧颅窗模型。图2-5小鼠双侧颅窗模型。A，双侧颅窗示意图;B，小鼠双侧颅窗照片及放大图。Figure2-5Bilateralcranialwindowsofmice.A,Schemadiagramofbilateralcranialwindows.B,Photograghofmicewithbilateralcranialwindowsandmagnificationofthewindowsinthewhiteboxofmice.图2-5A中展示的是双侧颅窗的示意图，竖直虚线为颅缝所在位置，上下环状虚线分别为脑组织bregma及lambda线所在位置，两侧实线圆圈为双侧颅窗在大脑皮层上的方位。另外，在后续的实验观察中，会在左侧进行肿瘤细胞的立体定位注射，然后再盖上盖玻片，以实现对黑色素瘤脑转移形成过成中的观察。图2-5B中为双侧颅窗完成后的小鼠实物照片，方框内放大图片如右侧所示。接着，为了实现长时程活体显微成像观察小神经胶质细胞在黑色素瘤转移过程中36 华中科技大学博士学位论文的作用，我们选择使用能够快速扫描的转盘共聚焦系统对小鼠双侧颅窗模型进行成像。图2-6小鼠脑活体显微成像。A,活体脑成像盒子的设计图；B，活体脑成像盒子及使用PE装盘共聚焦成像的小鼠照片。Figure2-6Intravitalmicroscopyimagingofmicebrain.A,Designsketchofintravitalbrainimagingbox.B,PhotographofintravitalbrainimagingboxandmicebeingintravitalimagedwithPEspinning-discconfocalmicroscopy.为此，需要设计一套能够适应该系统并满足长期显微活体成像的装置。通过测量转盘共聚焦工作台的空间大小，并考虑到操作过程的方便简单的要求，我们设计了如图2-6所示的小鼠双侧颅窗成像装置。这套装置具有操作简单、能实现小鼠呼吸麻醉37 华中科技大学博士学位论文等特点。由于使用的是亚克力有机玻璃材质，其透明的特性方便实验时对小鼠状态的观察，另外，相对金属材质，亚克力材质更能保持室内温度，小鼠的体温不会因为麻醉而骤降，保证其处在相对正常的生理状态。在设计上，我们将成像小盒分为Part1和Part2两部分,分别如图2-6A左右两侧所示。Part1部分为小盒的上部分，由顶面和左右两侧面共同组成一个矩形空槽状，顶部一角开一小孔，用于呼吸麻醉气体导管安装，左右两侧面底部设计为齿状，Part2部分作为底部插入至Part1部分中的卡槽中，更易组合和拆分。在Part2部分中，我们将自然侧仰卧的小鼠头部所在位置设计为镂空状，以实现对颅窗的观察，将固定好的小鼠插进去，使用封口膜封好空心侧，并将其拉松，创造一个可调节的密闭环境。小鼠双侧颅窗成像装置实物图如图2-6B所示。2.3.3活体显微成像观察黑色素瘤脑转移的形成过程为了最终实现观察小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移过程中的作用，需要进一步确定活体显微成像是否能够监测到整个黑色素瘤脑转移形成的过程。因此，我们使用立体定位注射的方式进行黑色素瘤细胞的接种，接种后，使用双侧颅窗模型对黑色素瘤脑转移发展过程中不同时间点进行成像，以期观察到黑色素瘤脑转移形成的过程。对已准备好双侧颅窗的小鼠接种RFP标记的黑色素瘤细胞，并通过转盘共聚焦成像系统，分别在接种后第1天、第7天、第14天及第21天进行成像，获得如图2-7A所示的结果。从结果可见，红色荧光蛋白标记的黑色素瘤细胞随着接种天数的延长形成的细胞团越来越大。通过长时程活体显微成像，我们观察到在接种后第1天，少许表达红色荧光蛋白的黑色素瘤细胞存在；接着在接种后第7天，已经能够观察到肿瘤细胞形成的细胞团，另外肿瘤细胞的形态也比较清楚；到接种后第14天时，我们已经能够观察到比较大的肿瘤转移灶及其中密集分布的清晰的血管轮廓；到接种后的第三周时，可见整个窗口已经被红色荧光蛋白标记的黑色素瘤细胞团占满。另外，绿色荧光蛋白标记的小神经胶质细胞的形态和密度也发生了明显的变化，这部分结果会在后面进行进一步分析。接着，我们将对应时间点的小鼠进行灌流，收集脑组织样本后经过固定、石蜡包埋、HE染色步骤获得了如图2-7B所示的结果，从图上可见，与活体显微成像观察到的现象类似，随着黑色素瘤细胞接种后时间的延长，黑色素瘤细胞形成的脑转移灶区域越来越广。除此之外，与图2-7A第14天观察到的肿瘤转移灶区38 华中科技大学博士学位论文域中的血管信号一致，从第14天和第21天的HE切片可见，肿瘤区域内也有大量的新生血管形成，这也从侧面说明，血管的新生与黑色素瘤脑转移的发展有一定的关系。图2-7黑色素瘤脑转移的发展。A，转盘共聚焦显微成像系统监测到的肿瘤细胞接种后不同时期的黑色素瘤脑转移的发展过程，红色为RFP标记的黑色素瘤细胞，绿色为CX3CR1转基因小鼠中EGFP标记的小神经胶质细胞，比例尺，40µm；B，对应时间点脑组织的HE切片，虚线标记部位为肿瘤组织，比例尺500µm。Figure2-7Developmentofmelanomabrainmetastasis.A,DevelopmentofmelanomabrainmetastasisindifferenttimepointaftertumorcellinoculationmonitoredbyPEspinning-discconfocal,red,RFPexpressedmelanomacell,GFP,EGFPexpressedM/MsinCX3CR1transgenemice.Scalebar,40µm.B,H&Esectionormetastaticbrainindistincttimepoint,theregionmarkedbydottetlinereferedtothemelanomafoci.Scalebar,500µm.2.3.4活体显微成像揭示小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移发展中的细胞动态变化为了进一步使用活体显微成像揭示小神经胶质细胞在黑色素瘤发生发展中的作用，我们分别在接种后第1天，第5天，第7天，第14天，第21天对CX3CR1杂合转基因小鼠进行活体显微成像，在如图2-7A所示的黑色素瘤脑转移发展的过程中，我们对特定环境中小神经胶质细胞的形态、分布及运动行为进行分析，同时与对侧中及PBS对照小鼠组中的小神经胶质细胞的这些特点进行比较，以期揭示其功能。(1)小神经胶质细胞在黑色素瘤发展中形态发生改变早在1932年，PiodelRio-Hortegat通过显微镜的观察以及自己的描绘，将小神经胶质细胞的各种形态分别展示出来，它们分别是，分支状以及各种吞噬活化的状态，包39 华中科技大学博士学位论文括细胞具有密集的粗糙的突起、增大的胞体与短小的突起、过度膨胀的胞体及伪足、31斑块状并有伪足等形态。到目前，这种典型的形态变化已经成为了一种判断小神经胶质细胞活化状态的金标准。小神经胶质细胞能够被快速的活化并发生形态变化，而通过活体显微成像的方式，不仅能捕捉到它的变化状态同时，还能通过长期的观察监测这种状态的持续时间和变化方式，为揭示其在疾病状态中的作用提供全面的信息。在黑色素瘤细胞接种后，分别对在接种后的第1天、第5天、第7天、第14天、第21天进行活体显微成像，我们通过活体显微成像长时程不同时间点不同区域观察到了小神经胶质细胞如图2-8所示的形态变化。图2-8A展示了小神经胶质细胞分别在监视状态及活化状态时会出现的典型形态特点，包括如图中箭头所示，监视状态下小的胞体及长的细胞突起；活化状态下膨大的胞体及缩短加粗的细胞突起等。通过比较PBS及黑色素瘤细胞接种后第1天及第21天小鼠脑注射同侧及对侧的小神经胶质细胞的形态可见，各组接种后第1天的细胞形态变化并不大，都具有典型的小胞体及长突起的典型形态，而在第21天，仅接种有黑色素瘤同侧组中，可见肿瘤区域内的小神经胶质细胞的形态已经发生了明显的改变，细胞展现为膨大的胞体及缩短的细胞突起，如图2-8B所示。为了更准确地描述在黑色素瘤脑转移发展的过程中小神经胶质细胞的形态变化，我们使用如图2-8C所示的方法，分别对细胞的胞体直径及细胞突起的平均长度进行测量，获得的主要量化结果如图2-9所示。40 华中科技大学博士学位论文图2-8黑色素瘤脑转移发展过程中小神经胶质细胞形态的改变。A，CX3CR1转基因小鼠中小神经胶质细胞分别在监视和活化状态中的典型形态，箭头为突起或者伪足，星型为胞体，多边形为吞噬球状结构，比例尺，10µm；B，黑色素瘤接种及PBS接种后对应时间点典型细胞形态图，ipsilateral，注射同侧，contralateral，注射对侧；C，不同形态的小神经胶质细胞胞体及突起测量方法图解。Figure2-8MorphologychangeofM/Msduringmelanomabrainmetastasisdevelopment.A,TypicalmorphologyofM/MsinsurveillanceandactivatedstateinCX3CR1transgenemice.Arrows,processesorpseudopodia,star,somata,polygon,phagocyticsphericalshapeengulfment.Scalebar,10µm.B,TypicalcellmorphologyofM/Msinday1andday21fromipsilateralofcontralateralsideaftermelanomaorPBSinoculation.C,SchemaofmeasurementinsomaandprocessesfromramifiedoramoedoidM/Ms.从图2-9A可见，接种黑色素瘤细胞的第1天至第5天，无论在同侧或对侧，小神经胶质细胞胞体直径都有显著性的增加，分别增加了1.66倍及1.38倍。接着，随着时间的延长至接种后的第21天，黑色素瘤细胞注射同侧的小神经胶质细胞始终保持着较大的胞体直径，且比对侧更高。然而，在注射对侧中，小神经胶质细胞的胞体直径从第5天以后开始慢慢的恢复，至第21天时，仅为注射同侧的70%。另外，图2-9B中的结果41 华中科技大学博士学位论文展示，在PBS注射组两侧中，小神经胶质细胞胞体直径也有一定程度的增加，但从第5天开始，均开始下降。至第21天时，如图2-9C，黑色素瘤注射同侧的小神经胶质细胞胞体直径比PBS注射侧的细胞大1.56倍。与上述细胞胞体直径的改变相反的是，从第1天至第21天，黑色素瘤细胞接种后同侧小神经胶质细胞的突起平均长度相比对侧下降了40%，如图2-9D所示。而在PBS注射组中，小神经胶质细胞细胞突起的平均长度在注射同侧及对侧没有明显的差异，如图2-9E所示。另外，到第21天时，PBS注射同侧的小神经胶质细胞细胞突起的平均长度比黑色素瘤注射同侧中的细胞长1.68倍，如图2-9F所示。图2-9小神经胶质细胞胞体直径及突起长度的定量分析。A，黑色素瘤细胞接种后同侧及对侧中小神经胶质细胞胞体直径随不同时间点的变化；B，PBS接种后同侧及对侧中小神经胶质细胞胞体直径随不同时间点的变化；C，PBS接种后与黑色素瘤接种后同侧小神经胶质细胞胞体直径随时间的变化；D，黑色素瘤细胞接种后同侧及对侧中小神经胶质细胞突起平均长度随不同时间点的变化；E，PBS接种后同侧及对侧中小神经胶质细胞突起平均长度随不同时间点的变化；F，PBS接种后与黑色素瘤接种后同侧小神经胶质细胞突起平均长度随时间的变化。数据展示位平均值±标准误。图中星标，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure2-9QuantitativeanalysisofM/Mssomadiameterandprocesseslength.A,Changeofmicroglialsomadiameterfromipsilateralorcontralateralsideofmelanomainoculationmice.B,ChangeofmicroglialsomadiameterfromipsilateralorcontralateralsideofPBSinoculationmice.C,ChangeofmicroglialsomadiameterfromipsilateralsideofmelanomaorPBSinoculationmice.D,Changeofmicroglialmeanprocesseslengthfromipsilateralorcontralateralsideofmelanomainoculationmice.E,ChangeofmicroglialmeanprocesseslengthfromipsilateralorcontralateralsideofPBSinoculationmice.F,ChangeofmicroglialmeanprocesseslengthfromipsilateralsideofmelanomaorPBSinoculationmice.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001.42 华中科技大学博士学位论文综上所述，这些结果说明小神经胶质细胞能够快速地监测脑组织微环境的变化，无论是PBS或者是肿瘤细胞，都能够在短时间内引起其形态的变化。但值得注意的是，当黑色素瘤细胞侵入后，随着时间的延长，仅注射同侧细胞形态的改变会继续保持，说明这种改变是区域限制的。这些结果暗示病灶周围的小神经胶质细胞能够快速地被活化，并长时间持续保持一种活化的状态，从而参与疾病的发生和发展。(2)小神经胶质细胞在黑色素瘤发展过程中运动状态发生改变由于小神经胶质细胞发挥功能的过程主要是通过细胞突起动态地监视周围微环境而实现的。而在上述结果中我们观察到在黑色素瘤脑转移的发展过程中，小神经胶质细胞的胞体和突起发生了显著性的形态改变，因此，我们接着对其运动状态进行监测，探究其是否也发生了相应的改变从而参与黑色素瘤的发展。我们使用活体显微成像时间序列成像模块，分别在以上对应时间点对小鼠双侧颅窗进行时间成像，并在成像结束后，按照2.2.3的方法步骤进行数据的处理，其中小神经胶质细胞突起的处理方法如图2-10所示。由于突起的形态不规则，其运动方式也不同于细胞的运动，因此其运动方式需要通过人工手动追踪实现。图2-10小神经胶质细胞突起运动的手动追踪。左右图分别截取总时长为30min的时间序列起始时间及终止时间点的示例图片，每一个标记（三角形、圆形、多边形、矩形）对应统一个突起在整个时间序列的运动，彩色线条为追踪出的运动轨迹。比例尺，20µm。Figure2-10MethodofmanualtrackingprocessesofM/Ms.Exampleimagesfromatime-lapserecordingshowingthemethodofprocessesmanualtracking.Left,initialimageattime00:00,right,terminalimageattime30:00.ColorfullinereferstoatrajectoryofoneprocessesofM/Ms,andthesamemarker(triangle,circle,polygon,rectangle)referstothesametrajectoryinbothpanel.Scalebar,20µm.相比小神经胶质细胞突起运动的不规则性，细胞胞体的运动分析则相对简单，通43 华中科技大学博士学位论文过imaris上spot自动追踪的模块，可以选择合适的细胞胞体，并在选择完成后，实现自动追踪。但由于自动追踪的前提是基于所选目标的荧光强度的分布，而目标荧光强度或多或少的受周围细胞或信号强度及成像质量的影响，因此会出现一些误差和错误追踪的情况。所以，在完成自动追踪后，需要对追踪结果进行仔细校正并与真实运动情况进行比较，必要时删除错误轨迹，以免给实验结果造成假阳性或阴性。图2-11小神经胶质细胞胞体及细胞突起轨迹追踪分布图。A，小神经胶质细胞胞体轨迹分布图；B，小神经胶质细胞细胞突起轨迹分布图。Figure2-11DistributionoftrajectoryfromM/Mssomaandprocesses.A,DistributionofM/Mssomatrajectory.B,DistributionofM/Msprocessestrajectory.按照2.2.3中(8)所述的实验方法对小神经胶质细胞的胞体及突起的运动进行轨迹追踪，轨迹追踪的结果如图2-11所示，进而获得的主要运动相关参数如图2-12所示。从上图可见，小神经胶质细胞胞体及突起的运动轨迹有很大差异。首先，对于小神经胶质细胞的胞体来说，黑色素瘤脑转移组中，小神经胶质细胞的胞体运动轨迹明显比PBS组中范围更广，距离更长，如图2-11A所示。相反地，在细胞突起的轨迹分布中可见，黑色素瘤脑转移组中，小神经胶质细胞细胞突起的轨迹范围和长度比对照组更小，如图2-11B所示。在健康的鼠脑中，小神经胶质细胞胞体运动范围很小，但突起的运动非常显著，而从此处我们所获得的相反的结果中也可暗示，黑色素瘤脑转移发生后，小神经胶质细胞的运动方式也发生了相应的改变。接着，我们通过比较其各种运动参数，进一步分析小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移发展过程中的运动变化。图2-12分别展示了黑色素瘤脑转移发生过程中小神经胶质细胞胞体及突起运动特性的变化，分别通过运动速度、运动限制比例及限制系数三个参数进行展示。其中，限制比例是指运动的位移与长度之间的比例，体现的是运动的范围；限制系数是指，细胞速度小于等于2µm/min的（定义为静止细胞）时长比例，44 华中科技大学博士学位论文表现的是细胞静止相对时间。图2-12黑色素瘤脑转移发生过程中小神经胶质细胞胞体及突起运动特性的变化。A,小神经胶质细胞胞体运动速度随时间的变化；B,小神经胶质细胞限制比例随时间的变化;C，小神经胶质细胞限制系数随时间的变化；D，小神经胶质细胞细胞突起运动速度随时间的变化。所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠。每一个点代表一个细胞胞体或者突起，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure2-12MotilitychangeofM/Mssomataandprocessesduringmelanomabrainmetastasisdevelopment.A,VelocitychangeofM/Mssomataovertime.B,ConfinementratiochangeofM/Msovertime.C,ArrestcoefficientchangeofM/Msovertime.D,VelocitychangeofM/Msprocessesovertime.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Everydotrepresentsonesomataorprocesses.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001).首先从小神经胶质细胞胞体的运动速度变化来看，如图2-12A所示，随着黑色素瘤细胞接种时间的延长，细胞胞体的运动速度逐步增加，在第5天时，就有明显的加快，之后持续增加，到肿瘤细胞接种后的第21天时，细胞胞体的运动速度已达到6.99µm/min。而在PBS注射组中。同侧的小神经胶质细胞胞体运动速度也有增高，但在第14天时开始下降，至接种后第21天时，黑色素瘤注射侧的小神经胞体运动速度是PBS注射侧的2.36倍。另外，无论是黑色素瘤注射组或PBS注射组，其对侧小神经胶质细胞胞体及突起的运动速度变化都不如注射同侧明显，如图2-13所示。接着，从限制比例图2-12B的结果看，黑色素瘤细胞注射侧的小神经胶质细胞限制比例在接种后整个45 华中科技大学博士学位论文黑色素瘤发展过程中都比PBS对照组大，说明小神经胶质细胞检测到黑色素瘤细胞的侵入，并开始做范围更广的限制性运动。接着，从小神经胶质细胞的限制系数的结果看，如图2-12C所示，无论是黑色素瘤细胞注射组或者PBS注射组中，小神经胶质细胞的限制系数在第1天后均开始显著性的下降，且在接种后第1天、第5天、第14天时，黑色素瘤注射组的小神经胶质细胞限制系数更大。从这些结果可见，尽管在黑色素瘤脑转移的发展过程中，小神经胶质细胞的运动范围更广，但其运动方式应该是不连续的，这种现象可能是由于这些细胞需要暂停运动并与黑色素瘤细胞或周围环境交换信息造成的。另外，从小神经胶质细胞细胞突起的运动速度可见，如图2-12D所示，在黑色素瘤细胞接种后，小神经胶质细胞突起的运动速度始终保持着较低的水平，而PBS组中细胞突起的运动明显更活泼，这个结果与上述突起形态变化及轨迹的分布结果一致。图2-13黑色素瘤脑转移发生过程中对侧窗口小神经胶质细胞胞体及突起运动速度的变化。每一个点代表一个细胞胞体或者突起，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，*表示P<0.05，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure2-13VelocitychangeofM/MssomataandprocessesofM/Msovertimeduringmelanomabrainmetastasis.Everydotrepresentsonesomataorprocesses.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001).综上所述，从上图中展示的小神经胶质细胞胞体及突起的运动参数结果分析得到，在黑色素瘤脑转移的发展过程中，小神经胶质细胞的胞体运动从正常的相对静止状态转变为一种快速的、受限的、不连续的运动模式；而其突起的运动速度和范围则显著降低，这些运动特性的改变暗示着小神经胶质细胞变得更加主动，并蕴藏着这些细胞正在不停的与周围环境交换信息相互影响的可能性。另外，小神经胶质细胞胞体46 华中科技大学博士学位论文及突起运动的相反改变也暗示着细胞本身所存在的一种稳定和平衡性，这也许也是保证其正常生存和发挥功能的一种本能表现。(3)小神经胶质细胞在黑色素瘤发展过程中分布发生改变由于在黑色素瘤细胞接种后并成功形成脑转移的过程中，小神经胶质细胞的形态、胞体及突起的运动特点都发生了一定的变化，另外，从图2-7A可见，小神经胶质细胞在黑色素瘤周围大量浸润，因此我们猜测小神经胶质细胞在单位体积的密度应该会发生改变，这可能是运动特性改变后造成的结果。为此，我们使用2.2.3中（7）的实验方法获得小鼠皮层3D图像，如图2-14所示，接着使用2.2.3中（8）的方法进行volumedensity单位体积细胞数量的提取和分析，得到下图2-15所示的统计结果。图2-14小神经胶质细胞在黑色素瘤发展不同时期的3D分布。A，黑色素瘤注射同侧及对侧中小神经胶质细胞的3D分布；B，PBS注射同侧及对侧中小神经胶质细胞的3D分布。绿色为CX3CR1信号，红色为黑色素瘤细胞信号。比例尺，50µm。Figure2-14Three-dimensionaldistributionofM/Msindifferentstageofmelanomabrainmetastasisdevelopment.A,ThreedimonsionsdistributionofM/Msinmelanomainoculationipsilateralandcontralateralside.B,ThreedimonsionsdistributionofM/MsinPBSinoculationipsilateralandcontralateralside.Green,CX3CR1-EGFPsignal;Red,B16-tfRFP.Scalebar,50µm.47 华中科技大学博士学位论文接种后不同时间点的小神经胶质细胞的3D分布如上图所示。在接种后第一天，无论是注射侧还是对侧，黑色素瘤及PBS注射组中小神经胶质细胞的分布都相对稀疏且比较均匀。随着时间的延长到第五天时，各组中的小神经胶质细胞的分布都有明显的改变，变得更为致密，这时，无论是黑色素瘤注射侧还是PBS侧都有这样的现象。到第七天时，黑色素瘤注射侧的细胞分布变得相当致密，细胞间的界限也很难分辨，并且在之后的两周内，该侧的细胞分布始终维持在这个水平。而在PBS注射侧，接种后的两周内都处在与第五天类似的水平，即并没有出现类似黑色素瘤注射侧这种程度的致密分布；另外，黑色素瘤或PBS注射对侧中，随着接种后时间的延长，细胞的分布有一定程度的增加，但都是一定程度的波动，在这两组中并无明显差别，且相对注射侧，黑色素瘤注射对侧的细胞分布相对稀疏，而PBS组中，注射侧与对侧中小神经胶质细胞的分布比较类似。在观察到这种差别现象后，我们对3D分布的数据按照方法步骤部分进行量化分析，计算出小神经胶质细胞在单位体积中的数目，即volumedensity如图2-15所示。图2-15黑色素瘤脑转移发展过程中小神经胶质细胞单位体积细胞数量的改变。A，黑色素瘤或PBS注射同侧小神经胶质细胞单位体积细胞数量随时间的变化；B，黑色素瘤或PBS注射对侧小神经胶质细胞单位体积细胞数量随时间的变化。所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠。数据展示为平均值±标准误。图中星标，*表示P<0.05，**表示P<0.01，****表示P<0.0001。Figure2-15VolumedensitychangeofM/Msduringmelanomabrainmetastasisdevelopment.A,VolumedensitychangeofM/MsinmelanomaorPBSinoculationipisilateralsideoverthetime.A,VolumedensitychangeofM/MsinmelanomaorPBSinoculationcontralateralsideoverthetime.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001在小神经胶质细胞的3D分布中，随机选择多个立方体区域，计数后得到上图量化结果。从图中的单位体积细胞数量随时间变化的趋势来看，与上述分析比较一致。黑33色素瘤注射侧中，小神经胶质细胞由最初的3.11×10cell/mm增长至第三周的48 华中科技大学博士学位论文339.28×10cell/mm。另外，从接种后的第7天至第21天，黑色素瘤注射同侧的小神经胶质细胞单位体积细胞数量比PBS注射侧的细胞分别高了约1.76倍和1.57倍。在对侧33中，到第21天时，黑色素瘤注射组中小神经胶质细胞的密度为6.32×10cell/mm而33PBS注射组中为4.64×10cell/mm，两组并无显著性差异。从此结果可见，黑色素瘤及PBS注射后，细胞的密度都有一定程度的升高，但是在肿瘤发展的过程中，小神经胶质细胞的密度在一周内会持续升高，且在之后的两周内保持着这种升高的水平，而在PBS组中，到第七天时，不再继续升高，而只是维持着一个相对稳定的水平。2.4讨论目前，有多种肿瘤脑转移的动物模型制备方法，且各有优缺点，此部分内容在第一章有详尽的叙述。因此，针对本课题的研究方法及目的，我们分别选择颈内动脉注射及立体定位注射肿瘤细胞的方式获得肿瘤脑转移模型。由于本课题主要通过活体显微成像方式对脑转移过程中小神经胶质细胞的行为进行监测，因此我们选用了RFP-B16黑色素瘤细胞（内源表达红色荧光蛋白）及CX3CR1-GFP转基因小鼠（所有小神经胶质细胞组成型表达EGFP）。为此，我们首先证实了黑色素瘤细胞在野生型小鼠及CX3CR1-GFP转基因小鼠中形成脑转移灶的数目及大小没有统计学差异。同时显微光学成像的结果显示，使用立体定位注射将RFP-B16接种入脑组织后，其荧光信号范围逐渐扩大，强度逐渐增强，可以很好地反应黑色素瘤脑转移的发展过程。我们设计并采用双侧开颅的方式进行窗口的安装，避免了二次手术可能造成的不可逆损伤，并保证了同一区域的稳定性，因此实现了持续时间可长达1个月的活体显微成像。通过对转移灶及对侧正常脑组织的显微成像，我们获得了更多的有效信息，不仅能够观察转移灶周围的小神经胶质细胞的作用和反应，同时能揭示不同区域不同微环境时，小神经胶质细胞的活动。除此之外，我们为适应转盘共聚焦系统所设计的小鼠颅窗成像盒子，采用亚克力材质，轻巧简易，并能满足活体成像的基本条件，为小鼠长期活体显微成像提供了舒适的环境。而且，这种小盒的构造决定了其能够广泛地应用于各种品牌的倒置显微镜系统。通过长达3周的活体显微成像，我们观察到小神经胶质细胞在不同微环境下表现49 华中科技大学博士学位论文出的不同反应，主要包括形态、运动以及分布等的改变。首先，无论接种黑色素瘤或者PBS，由于两者均是外界入侵的物质，注射同侧的小神经胶质细胞均能够在接种后第5天作出快速的反应。但随着时间的延长，至接种后的第21天，黑色素瘤注射组的小神经胶质细胞始终保持着高强度的活化状态；而在PBS对照组中，小神经胶质细胞则在快速反应后会慢慢地恢复至最初的水平。相比正常脑组织，转移灶中的小神经胶质细胞的胞体直径增至其1.56倍，而细胞突起长度减少了1.68倍。同时，细胞的数量及胞体的运动速度分别是对照组的1.57倍和2.36倍。这一现象说明小神经胶质细胞能够根据微环境的改变从而做出不同的应对。紧接着，通过比较注射同侧以及对侧脑组织中小神经胶质细胞的行为变化，我们观察到注射侧的小神经胶质细胞比远端即对侧的细胞反应更快且大，这说明小神经胶质细胞发挥功能时具有位置限制性，即远端的细胞可能受到的刺激影响更小，病灶局部的小神经胶质细胞是主要的参与者。这些成像监测到的小神经胶质细胞形态由典型分支状转变为变形虫样、细胞胞体运动速度显著增高以及分布明显增多的现象说明随着黑色素瘤脑转移的发展，它们正常的监视状态已被改变并活化成与转移发展相关的某种状态的细胞，但其具体的作用还不清楚，为此，我们进一步对其中的问题进行探讨，详述见第三章。2.5本章小节在本章中，我们对黑色素瘤脑转移模型的建立做了一个相对完整的描述，从手术的进行到最终效果的评判都有所展示。从实验结果可见，我们成功地使用两种注射方法建立了黑色素瘤脑转移模型，并确保了荧光标记的黑色素瘤细胞的脑转移形成，同时使用整体荧光成像对其进行了检测。另外，我们详尽地阐述了小鼠双侧颅窗及成像装置的制作方法及其中的要点，并展示了窗口和成像装置的设计图及实物图。本章充分利用长时程活体显微成像的优势，观察了在黑色素瘤脑转移发展过程中小神经胶质细胞所发生的行为变化。通过对细胞的形态、运动及分布等动态信息的比较和整合，我们总结发现，小神经胶质细胞在检测到异物的入侵后均能做出快速地响应，并被活化。随着时间的延长，它们能够识别入侵物，并做出不同的反应对策，如在PBS入侵后，它们逐渐恢复至正常状态，但在黑色素瘤细胞入侵后，它们会保持着50 华中科技大学博士学位论文最初的活化状态直至黑色素瘤转移灶完全形成。另外，不同区域的小神经胶质细胞对刺激的反应有所不同，即，在异物入侵后，入侵位点周围的小神经胶质细胞反应最为强烈，而远端的细胞反应会相对较弱。随着转移灶的发展，转移灶周围的细胞活化状态不断增强而远端的细胞的活化状态则逐渐减弱。这些结果说明，作为中枢神经系统的哨兵细胞，小神经胶质细胞能够快速识别周围微环境，并被活化从而参与黑色素瘤脑转移的发展。51 华中科技大学博士学位论文3小神经胶质细胞表达的MMP3调节黑色素瘤脑转移发展3.1引言根据肿瘤转移的“种子和土壤”学说，成功的脑转移形成不仅与肿瘤细胞本身有45,48,49关，同时与转移灶周围的微环境密切相关。尽管在小鼠及人体脑转移灶周围都检101测到大量小神经胶质细胞的分布，但其作为脑组织微环境中的重要一员，在肿瘤入侵至脑组织后，会如何反应并参与肿瘤脑转移的形成，目前尚不清楚。通过上一章的长时程活体显微成像，我们观察到小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移的发展过程中会被大量的活化，且在整个过程中持续保持着这种变化。为此，根据出现的小神经胶质细胞形态转变、运动速度和范围增加、细胞分布改变等现象，我们猜测在黑色素瘤脑转移发展过程中脑组织的结构遭到了破坏，从而为细胞的迁移和运动提供可能，另外，在此过程中细胞被活化，活化的小神经胶质细胞帮助了黑色素瘤脑转移的发展。146基质金属蛋白酶MMPs在促进转移灶的发生和发展中扮演着多重作用，一方面能够促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，一方面能够破坏基质的组分，为肿瘤细胞的成功定居开疆拓土。在肿瘤脑转移的发展过程中，肿瘤细胞能够表达分泌多种MMPs参与65-67BBB的破坏，从而促进其转移灶的形成。但小神经胶质细胞作为MMP的来源，其分泌的MMP是如何参与肿瘤转移灶的形成还不清楚。另外，在其他神经退行性疾19,147病的研究中，人们发现MMP3能够促进小神经胶质细胞的活化。因此，我们猜测，小神经胶质细胞通过分泌MMP3参与BBB的破坏，并进而促进自身的活化，从而促进黑色素瘤脑转移的发展。本章，我们通过一系列传统的生物学方法并结合活体显微成像的数据分析，探究小神经胶质细胞是否能通过表达MMP3参与黑色素瘤脑转移发展的调控。52 华中科技大学博士学位论文3.2实验材料和方法3.2.1实验仪器正置切片扫描显微镜尼康公司CM1950冰冻切片机徕卡公司LSM710共聚焦显微成像系统CarlZeiss公司DL-5M低速冷冻离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司日立离心机日本日立公司PCR仪美国Bio-Rad公司电泳仪美国Bio-Rad公司CCDAndor科技公司GuavaeasyCyte8HT流式分析仪德国默克·密理博公司分光光度计Eppendorf公司自动涡旋振荡混合器英国STUART其他仪器参见2.2.13.2.2实验材料冰冻切片样本制备实验材料：PBS，4%PFA，30%蔗糖溶液，滤纸，OCT胶，刀片，勾线笔，防脱玻片，铅笔，眼科镊。免疫荧光标记实验材料：PBS，BSA，免疫组化笔，暗盒，抗体，切片盒，DAPI，50%甘油，盖玻片，滤纸，指甲油。小神经胶质细胞分离实验材料：HBSS溶液，PBS，DMEM/F12，中性蛋白酶II，DNA酶I，木瓜蛋白酶，400目滤网，percoll溶液，10×PBS，100mmPetridish，0.01%胰蛋白酶，FBS，Fcblock，APC标记小鼠CD45抗体，PE/Cy7标记小鼠CD11b抗体。TM半定量反转录PCRRNA检测实验材料：RNaseZAP，TRIzol®Reagent，RNA-freeTM枪头，RNA-freeEP管，氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNase-free水，PrimeScriptRTMasterMix(PerfectRealTime)，DM2000plusmarker，琼脂糖。1%BSA溶液53 华中科技大学博士学位论文称取0.1gBSA粉末，溶于10毫升PBS中，混匀后，冰上待用；葡萄糖溶液（100×）称取4.5g葡萄糖粉末，溶于10mLPBS中，过滤后待用；无血清培养基SM49mLDMEM/F12中分别加入100×双抗500µL及上述葡萄糖溶液500µL；（此步骤在超净工作台中无菌进行）中和培养基NM44mLDMEM/F12中分别加入100×双抗500µL、上述葡萄糖溶液500µL及FBS5mL；（此步骤在超净工作台中无菌进行）培养基CM44.5mLDMEM/F12中分别加入100×双抗500µL及FBS5mL；（此步骤在超净工作台中无菌进行）中性蛋白酶II首先配制HEPES缓冲盐水（50mMHEPES/KOHpH7.4,150mMNaCl）(10mg/mL)，将中性蛋白酶II溶于缓冲液中，配制成终浓度为2.4U/mL的酶溶液，使用CM溶液定容，过滤好后待用；木瓜蛋白酶溶液配制活力单位为280U的木瓜蛋白酶溶液，使用DMEM/F12进行溶解，过滤后待用；DNA酶I溶液配制终浓度为20U/mL的酶溶液分装待用；裂解培养基DM各取14mL中性蛋白酶II溶液及木瓜蛋白酶溶液混匀，分装待用，使用之前，加入DNA酶I混匀即可使用。半定量RNA反转录PCR所用序列：β-actin：正向引物序列5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’,反向引物序列5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’,产物大小为245bp。54 华中科技大学博士学位论文MMP3：正向引物序列5’-TTGATGGGCCTGGAACAGTC-3’反向引物序列5’-AGTCCTGAGAGATTTGCGCC-3’，产物大小443bp。MMP9:正向引物序列5’-GGTCTTCCCCAAAGACCTGAAA-3’反向引物序列5’-GGGCACCATTTGAGTTTCCA-3’,产物大小为599bp。在体MMP3抑制所用材料：MMP抑制剂PD166793，0.5%CMC。在体小神经胶质细胞剔除所用材料：CSF-1R抑制剂PLX3397，AIN-76A食物。3.2.3实验方法(1)冰冻切片制备脑组织样本a)深度麻醉小鼠后，按照2.2.3方法进行小鼠心脏灌流步骤；b)灌流后，将小鼠的脑组织完整的剥离下来，并放置在4%PFA中固定过夜，至第二天时，更换30%蔗糖溶液进行脱水处理；c)两至三天后，鼠脑已完成脱水，准备进行冰冻切片样本的制备；d)在开始切片之前，首先需将冰冻切片机机箱及刀头的温度均调节至-20°C备用，另外，还需将刀片、勾线笔等需要在机箱内使用的物品放置在机箱内降温待用；e)使用OCT胶制作放置脑样本的底座，即，滴加适量OCT胶，铺满底座，放置在机箱内，等到其快要凝固时，使用定型锤将底座压平待用；f)将浸泡在蔗糖溶液中的脑组织样本取出，放置在滤纸上吸干其上的溶液，使用刀片将脑组织切割成需要获得切片的样子，注意保持地面持平，切割好后，将样本转移至底座上，并在脑组织上滴加OCT胶，立即放入机箱中等待其凝固；g)样品凝固后，将待切片的样本底座放置在底座卡槽内，固定好，调节样品与刀片的位置，即可开始切片；h)切片时，在还没有到达目标区域时，可将切片厚度设置为50µm，当到达目标区域时，调整切片厚度至10µm，接着，在获得一系列平整和完整的切片时，使用勾线笔小心将切片位置调整为拱起的易服帖的形状，即可开始贴片，贴片时，需要将防脱玻片拿入机箱停留2-3秒，然后快速的将铺展好的切片贴55 华中科技大学博士学位论文片即可，如此反复获得冰冻切片样本；i)切好的冰冻切片样本放置在-20°C储存待用。(2)免疫荧光标记a)将-20°C保存的冰冻切片放置在室温恢复至少30min，恢复后，使用新鲜配制的PBS将切片在水平摇床上以50rpm震荡5min，此步骤重复3次，将样品上的OCT胶清洗干净；b)清洗完成后，使用滤纸将切片上过量的PBS吸干净，然后使用免疫组化笔在脑片的周围画上一圈，用于防止溶液的流动；c)将提前配置好的1%BSA溶液滴加至脑片上，室温下在加水的暗盒中孵育1小时，进行封闭步骤；d)封闭过程中，可根据抗体说明书推荐剂量进行抗体稀释液的配制，封闭完成后，甩干切片上的溶液，滴加相应的抗体稀释液，放置在暗盒中4°C过夜孵育；e)孵育完成后，将切片转移至切片盒中，PBS震荡漂洗3次，若需要标记二抗，在漂洗结束后，滤纸吸干多余溶液后，在对应样本上滴加二抗稀释液，暗盒中继续室温孵育1小时，若不需要标记二抗，这时需要将切片转移至通风厨下，进行DAPI的染色，滴加好DAPI后，室温孵育10min左右，再使用PBS清洗3次即可，二抗孵育完成后，同样进行DAPI的标记及后续清洗操作；f)清洗结束后，将切片上多余液体吸干，在一侧滴加一滴50%甘油溶液，然后进行封片步骤，封片时注意动作缓慢避免产生气泡；g)封片完成后，小心吸走溢出的溶液，使用指甲油在盖玻片边缘进行涂抹，将盖玻片与切片封紧，接着待指甲油晾干后，将切片转移至4°C中储存即可，注意免疫荧光完成后的切片尽快进行成像，以免荧光猝灭影响实验结果。(3)小神经胶质细胞分离及鉴定a)使用预冷的无菌HBSS进行小鼠心脏灌流，灌流结束后，将小鼠转移至无菌超净台取出小鼠脑组织；b)将新鲜分离的脑组织放至在盛有2mL无血清的培养基SM（serumfree56 华中科技大学博士学位论文medium）中，小心将组织切碎，确保培养基的量比较适合（操作台上提前准备好装有冰块的饭盒，六孔板提前放在冰上待用）；c)将切好的脑组织转移至盛有3mL裂解培养基DM（dissociationmedium）的15毫升离心管中，在细胞培养箱中孵育20min，每5min上下颠倒混匀细胞悬液；d)裂解完成后，加入5mL中和培养基NM（neutrolizationmedium）至以上悬液中，终止酶的作用，顺势重悬细胞，缓慢将细胞吹散，静止1分钟，将上清转移至新的离心管中；e)使用1mL枪头，加入3mLDMEM/F12重悬细胞直到大的组织块被吹散，静置1min直到细胞团沉下，将上层（含有裂解的细胞）转移至新的离心管中，冰上保存；f)继续加入2mLDMEM/F12使用1mL枪头上下混匀细胞悬液至大的细胞块被吹散，静置1-2min，收集上层细胞悬液转移至之前的细胞收集管中，冰上保存；g)继续加入2mLDMEM/F12使用200µL枪头上下混匀细胞悬液至细胞悬液能轻松地被吹吸，静置1-2min，收集上层细胞悬液转移至之前的细胞收集管中，冰上保存；h)将消毒后的400目尼龙筛网（约40µm）预先使用DMEM/F12浸润并晾干，准备好另一干净的离心管，将冰上放置的细胞悬液混匀后，使用此筛网过滤细胞悬液；i)过滤后的细胞悬液1000g4°C离心5min，离心完成后，小心去除上清；j)使用6mL30%percoll溶液重悬细胞，500g4°C离心20min；k)离心完成后，可看到明显的分层，小心去除上层髓磷脂，底层为细胞团；l)使用6mL红细胞裂解液，重悬底层细胞，重悬的细胞再次使用400目的尼龙筛网过滤，过滤后1000g4°C离心5min；m)再使用2mLDMEM/F12重悬细胞，1000g4°C离心5min，清洗两次；n)使用CM培养基重悬细胞，接种至六孔板中，37°C二氧化碳培养箱中孵育57 华中科技大学博士学位论文30min；o)孵育后，去掉上层未贴壁细胞，使用DMEM/F12对贴壁细胞漂洗，漂洗三次后，使用1%胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，清洗后即可用于后续实验；p)将收集到的细胞使用2%FBS的PBS重悬，加入Fc封闭液冰上孵育10min，孵育后加入抗体CD45及CD11b冰上继续孵育30min，孵育完成后，加入适量PBS清洗2次即可使用流式细胞仪进行细胞纯度的检测，除此之外，细胞还可使用IX71显微镜进行拍照，并使用倒置共聚焦进行形态的鉴定。(4)小神经胶质细胞相关因子RNA水平半定量PCR检测TMa)使用医用酒精对通风厨实验台面进行擦拭，并使用RNaseZAP将RNA酶清除；®b)将上述收集到的贴壁细胞完成3次漂洗后，转移至通风橱中，根据TRIzolReagent说明书的方法进行小神经胶质下拨的RNA提取；c)将孔板中残存的培养基丢弃，使用RNA-free枪头吸取1mLtrizol溶液反复吹打细胞层，至溶液变粘稠，将溶液转移至RNA-free的EP管中室温下孵育5min，以保证核蛋白复合物被完全裂解；d)向管中加入200µL氯仿溶液，盖紧盖子，用力手动上下混匀15s，室温下孵育2-3min；e)将样品12000g4°C离心15min，离心后，EP管中会出现三层，分别为底层红色苯酚-氯仿相，中间层及上层无色透明水相，RNA主要分布在上层水相中，且其体积大约为总体积的一半；f)小心将EP管倾斜45°，将上层水相转移至一新的EP管中，注意避免吸取到中间层及底层有机相，其中主要含有DNA和蛋白质；g)往管中加入500µL100%异丙醇，混匀后，室温孵育10min；h)接着12000g4°C离心10min，注意在离心之前，RNA是肉眼不可见的，并且会呈现出一种胶状；i)离心完成后，弃上清，加入1mL75%乙醇，RNA能在乙醇中-20°C保存至少一年，4°C保存一周，将样品使用自动涡旋震荡混合器简单的震荡，然后58 华中科技大学博士学位论文7500g4°C离心5min，离心完成后，弃上清，RNA即在管中，将EP管在空气中晾干，约5-10min即可，不可太干，否则会损失RNA的可溶性；j)使用RNA-free水将RNA团重悬，55-60°C下孵育10-15min即可使用或在-80°C冰箱保存；k)接着吸取适量，稀释10-100倍后使用分光光度计对RNA的浓度进行测量，准备进行反转录；TMl)反转录时，按照PrimeScriptRTMasterMix(PerfectRealTime)说明书操作进行，如表4-1所示配制好相关反应体系，接着按照37°C15min，85°C5s，4°C进行反转录反应，反应后即可取适量加入设计好的相关因子如MMP3，β-actin等进行PCR，检测这些因子在小神经胶质细胞的RNA水平上的表达，PCR结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳对条带进行检测，使用整体荧光成像系统对胶块进行拍照，再通过FIJI中gel的模块计算相关条带的强度，获得相关分子RNA水平上的相对表达，以实现半定量检测。表3-1反转录反应体系Table3-1Reversetranscriptionreaction试剂使用量终浓度5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2µL1×TotalRNA*RNaseFreedH2Oupto10µL*：Thescaleofthereverse-transcriptionreactioncanbeincreasedasnecessary.Reversetranscriptionofasmuchas500ngoftotalRNAispossiblewith10µLofreactionsolution.(5)在体MMP3抑制a)首先，配制好0.5%CMC溶液过滤后待用，将MMP3抑制剂PD166793溶解于该溶液中，溶解时需要使用涡旋振荡仪混合均匀，吸取适量至EP管中待用；b)对已颈内动脉接种有黑色素瘤细胞的小鼠在接种后第一天开始进行给药操作，小鼠分成两组，一组为PD166793给药组，另一组为CMC对照给药组，药物通过腹腔注射给药；c)按照上述方法，直至接种后15天左右收集小鼠脑组织鉴定黑色素瘤脑转移情59 华中科技大学博士学位论文况为止，对小鼠连续每天给药，尽量保证每天给药时间一致即可。另外，由于腹腔注射同一位置可能会造成注射点损伤，因此可改变腹腔注射点，减少对同一位置的损伤。(6)在体小神经胶质细胞剔除148a)参照文献剔除小神经胶质细胞的方法，制作含有CSF-1R抑制剂PLX3397290mg/kg的饲料AIN-76A，饲料制作灭菌等过程由公司完成；b)将小鼠分成两组，一组喂食含有PLX3397的饲料，一组喂食不含有抑制剂的饲料作为control组，分别在喂食一周后，每组随机选取3只小鼠，进行冰冻切片后镜检小神经胶质细胞的分布；c)接着在持续喂食3周后，另每组再取3只小鼠用于剔除效果验证；剩余小鼠进行黑色素瘤细胞接种，并持续喂食至收集脑组织为止即可。3.3实验结果3.3.1小神经胶质细胞MMP3的表达(1)小神经胶质细胞中MMP表达检测根据活体显微成像的主要结果所揭示的小神经胶质细胞的运动行为等发生改变的现象，我们猜测在黑色素瘤脑转移发展过程中，转移灶周围微环境中的细胞外基质应该发生了改变，从而给细胞的运动带来便利。MMP的表达能够将脑组织微环境中的基质等降解，因此我们猜测，在黑色素瘤脑转移的发展过程中，小神经胶质细胞的MMP表达水平可能有变化，从而造成小神经胶质细胞各种运动行为变化的现象。为了更精准的对小神经胶质细胞进行分析和研究，我们通过不断尝试和摸索，从成年小鼠脑组织中分离出了纯度高达90%以上的小神经胶质细胞，具体操作步骤和要点见3.2.3中（3）部分所阐述。我们使用流式细胞术将从小鼠脑组织中获得的小神经胶质细胞的表型和纯度进行了分析，另外，使用倒置荧光显微镜对收集到的细胞进行了成像，并将细胞接种至共聚焦小皿中，使用高倍镜对细胞的形态和荧光信号进行了进一步的确定，结果如图3-1所示。60 华中科技大学博士学位论文图3-1分离的小神经胶质细胞的鉴定。A，流式细胞术分析分离的细胞中CX3CR1绿色阳性细胞所占比例；B，小神经胶质细胞的表型分析；C，倒置荧光显微镜观察到的小神经胶质细胞，4倍物镜，比例尺，20µm；D，倒置共聚焦显微镜观察到的小神经胶质细胞，63倍油镜，比例尺，10µm。Figure3-1IdentificationofisolatedM/Ms.A,HistogramofCX3CR1-EGFPpositivecelldistributioninisolatedcellwithflowcytometry.B,AnalysisofM/Msphenotype.C,M/Mscapturedbyinvertedfluorescencemicroscopywith4×object.Scalebar,20µm.D,M/Mscapturedbyinvertedconfocalmicroscopywith63×oil-inmersedobject.Scalebar,10µm.由于小鼠鼠脑中，小神经胶质细胞是主要高表达CX3CR1的细胞群，因此，在CX3CR1-EGFP中，我们能够通过EGFP信号来初步确定细是否是小神经胶质细胞。将获得的细胞群使用流式细胞术检测发现，EGFP表达的细胞占90%以上，如图3-1A所示，因此可以初步判定我们体外分离的小神经胶质细胞的纯度比较高。除此之外，我们同时使用了目前普遍被认可的鉴定小神经胶质细胞的两个标记物CD45及CD11b,进一步确定了这群EGFP高表达的细胞的确是CD45中表达及CD11b高表达，因此可61 华中科技大学博士学位论文以确定我们从小鼠脑中分离出的小神经胶质细胞的纯度是有保证的。将分离获得的细胞使用倒置荧光显微镜进行观察，也能看到细胞与绿色荧光蛋白能够很好的重合，证实了A图中的结果。由于低倍镜无法观察到细胞的形态，因此，我们结合倒置共聚焦显微镜，使用63倍油镜对细胞进行更细致的观察。从图3-1D图中可看到，贴壁的小神经胶质细胞具有明显的细胞突起，有些细胞的突起比较短，但胞体大，有些细胞突起长胞体小，这种情况是由于细胞并非在一个层面进行分布造成的。综上所述，我们成功从小鼠脑中分离出小神经胶质细胞。接着，我们按照此方法分别收集不同处理组脑组织中的细胞，并获得其RNA使用半定量分析方法对小神经胶质细胞中MMPs的RNA水平进行检测，如图3-2所示。图3-2黑色素瘤转移脑组织中小神经胶质细胞RNA水平MMPs表达。A,黑色素瘤细胞及黑色素瘤脑转移灶中小神经胶质细胞MMPs的表达；B，A图量化分析；C，C57BL/6及转基因小鼠中小神经胶质细胞MMP3的表达；D，C图量化分析。N=3每组，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure3-2MMP3expressioninRNAandproteinlevelofM/Msinmelanomametastaticbrain.A,MMPsmRNAexpressionofmelanomacellorM/Msisolatedfrommelanomametastaticbrain.B,QuantitativeanalysisofA.C,MMP3mRNAexpressionofM/MsisolatedfromC57BL/6orCX3CR1transegenemice.D,QuantitativeanalysisofC.N=3pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001).首先，我们分别比较了黑色素瘤细胞及小神经胶质细胞（由黑色素瘤转移灶脑组织分离得来）MMP3及MMP9的表达。如图3-2A及B的结果可见，分离得到的小神经胶质细胞同时显著性地高表达MMP3及MMP9，但黑色素瘤细胞很少表达MMP3，但也显著性高表达MMP9。另外，小神经胶质细胞表达的MMP3是黑色素瘤细胞的114.2倍，而MMP9仅为10.9倍，且小神经胶质细胞表达的MMP3是MMP9的1.57倍。再次，在神经退行性经的研究中，MMP3的表达能够促进小神经胶质细胞的活化62 华中科技大学博士学位论文19，结合以上的结果，我们猜测小神经胶质细胞所表达的MMP3在黑色素瘤发展的过程中扮演着双重作用，一方面可能参与小神经胶质细胞的活化，一方面破坏BBB。因此，我们检测了正常鼠脑组织及转移脑组织来源的小神经胶质细胞的MMP3的表达，并比较了不同来源小鼠的情况。通过图3-2C及D的结果可见，有黑色素瘤转移脑组织中获得的小神经胶质细胞MMP3的表达量显著性高于正常脑组织，且无论是在C57BL/6还是转基因小鼠中，都有这样的现象，分别是对照的40.4倍及20.6倍。由此可见，小神经胶质细胞表达的MMP3与黑色素瘤脑转移的形成有明显关系。(2)黑色素瘤发展过程中脑组织小神经胶质细胞MMP3的表达改变为了验证小神经胶质细胞MMP3的表达情况是否伴随着黑色素瘤脑转移灶的发展，我们分别收集了肿瘤接种后day1，day5，day7，day14，day21的肿瘤组织，使用免疫荧光标记对小神经胶质细胞表达的MMP3标记进行检测，得到如图3-3所示的结果。从图3-3A中免疫荧光切片结果可见，随着黑色素瘤接种后时间的延长，MMP3表达的小神经胶质细胞有了明显的增多，如图中白色箭头所示。通过图3-3B中的量化比较可见，至黑色素瘤细胞接种后的第21天，MMP3表达的小神经胶质细胞比例相比第一天增加了3.22倍，从最初29.9%增长至94.2%。接着，我们对肿瘤组织微环境中MMP3的表达情况进行了展示，如图3-4所示。63 华中科技大学博士学位论文图3-3小神经胶质细胞MMP3免疫荧光检测。A，脑片MMP3典型免疫荧光标记结果，比例尺，20µm；B，不同时间点MMP3阳性小神经胶质细胞比例的统计分析。3只小鼠每组，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure3-3ImmunofluorescenceanalysisofMMP3expressiononM/Ms.A,TypicalimmunoinfluorescenceofMMP3expressioninbrainslice.Scalebar,20µm.B,QuantitativeanalysisforproportionofMMP3positiveM/Msindifferenttimepoints.N=3pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001).在肿瘤组织中，由于小神经胶质细胞的分布并不均匀，因此我们将其定义为图3-4A中黄色虚线区分的两种区域，即肿瘤组织中小神经胶质细胞富集区域及稀缺区域。在图3-3中，我们能够看到，随着黑色素瘤脑转移的发展，表达MMP3的小神经胶质细胞的比例逐渐增加，正因为此，我们猜测，在肿瘤组织中，MMP3的表达应该也是依赖于小神经胶质细胞的分布。通过比较肿瘤组织中小神经胶质细胞富集及稀缺区域，我们观察到，肿瘤组织中，小神经胶质细胞所在区域周围的确分布着大量的MMP3，如图3-4B所示。64 华中科技大学博士学位论文图3-4MMP3在黑色素瘤脑转移组织中不同区域的表达情况。A，黑色素瘤脑转移组织中的小神经胶质细胞富集区域及小神经胶质细胞稀疏区域，黄色虚线为区域区分界限，方框区域为B图中放大区域展示。比例尺，20µm。Figure3-4MMP3expressionindifferentregionsofmelanomabrainmetastasis.A,M/Msrichandpoorregioninmelanomametastaticbrain.Yellowdotlinerepresentstheboundaryoftheseregions.TheregionintheboxweremagnificatedinB.Scalebar,20µm.以上结果再一次证实了小神经胶质细胞周围以及与其共定位的MMP3的高表达，与黑色素瘤脑转移的发展有某种联系。因此，为了确定小神经胶质细胞MMP3的表达与其本身的活化有一定的关系，我们使用皮尔森相关性分析的方法，分别对MMP3表达的小神经胶质细胞随肿瘤发展的变换与活体显微成像观察到的其形态变化、运动速度及单位体积细胞数量等进行相关性分析，以期更好地为这些改变做出合理的解释。65 华中科技大学博士学位论文3.3.2小神经胶质细胞表达的MMP3影响其活化状态通过长时程活体显微成像我们观察到在黑色素瘤脑转移灶的发展过程中小神经胶质细胞的形态发生了显著性的改变。如图2-8及2-9所示，我们总结出，其形态会33趋向于增大胞体减小突起的方式改变。另外，根据文献中所提到的，当小神经胶质细胞突起的长度小于2倍的胞体直径时，即定义此时的小神经胶质细胞为活化状态。因此，为了更直观和全面地展示小神经胶质细胞的活化程度，我们将细胞形态发生的这两种变化定义为“分支参数”：小神经胶质细胞平均胞体直径与其平均突起长度的比值。根据成像监测到的小神经胶质细胞形态的变化以及此参数，我们定义静息的小神经胶质细胞分支参数的值倾向于0.5，而活化的细胞大于0.5，且分支参数越大，说明小神经胶质细胞的活化程度越强。据此获得图3-5A所示的结果，图中可见黑色素瘤脑转移灶形成的过程中小神经胶质细胞分支参数越来越高，即小神经胶质细胞的活化程度更高，到肿瘤接种后第21天，活化状态最强。为了探究小神经胶质细胞活化程度增高的现象是否与表达的MMP3细胞比例增高的现象一致，我们进行了皮尔森相关性分析，得到图3-5B及C所示的结果。从上图结果可见，黑色素瘤脑转移组中小神经胶质细胞分支参数的升高现象与其MMP3表达细胞比例增高的现象具有很好的相关性，其中皮尔森相关系数为0.9941，P值为0.0005，而在PBS对照组中，这种相关性则不复存在。这些结果说明，小神经胶质细胞表达的MMP3与其活化程度的改变密切相关。图3-5MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与细胞分支参数的相互关系。A，小神经胶质细胞分支参数的变化；B，黑色素瘤细胞接种后MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与其分支参数的相互关系；C，PBS接种后MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与其分支参数的相互关系。Figure3-5CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/Msandtheirbranchingparameter.A,ThechangeinbranchingparameterofM/Msinindicatedgroup.B,Correlationbetweenthechangeof66 华中科技大学博士学位论文MMP3expressingM/Msandtheirbranchingparameteraftermelamomacellinoculation.B,CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/MsandtheirbrainchingparameterafterPBSinoculation.接着，我们进一步将小神经胶质细胞MMP3表达比例的改变与其运动速度的改变进行相关性分析，得到图3-6所示的结果。从图3-6A所示的黑色素瘤细胞接种组中MMP3表达的小神经胶质细胞比例变化与胞体的运动速度相关性结果可见，两者有很高的相关性，皮尔森相关系数为0.8856，P值为0.0457。同样的，在PBS对照组中，不存在与之一致的相关性。图3-6MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与胞体速度的相互关系。A，黑色素瘤细胞接种后MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与其胞体速度的相互关系；C，PBS接种后MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与其胞体速度的相互关系。Figure3-6CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/Msandtheirsomavelocity.A,CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/Msandtheirsomavelocityaftermelamomacellinoculation.B,CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/MsandtheirsomavelocityafterPBSinoculation.最后，我们对在黑色素瘤脑转移发展过程中出现的细胞单位体积细胞数量增加的现象也与其MMP3比例变化进行相关性分析，得到图3-7所示的结果。从图3-7A所示的黑色素瘤细胞接种后MMP3表达的小神经胶质细胞比例变化与单位体积细胞数量相关性结果可见，该两者之间也存在密切的相关系，皮尔森相关系数为0.915，P值为0.0294，类似的，在PBS对照组中，这种相关性也不存在。这组相关性结果说明，活体显微成像获得的结果中所描述的小神经胶质细胞在黑色素瘤发展过程中所出现的细胞形态改变、胞体速度增加、单位体积细胞数量增加等活化的现象与其表达的MMP3有密切的关系，即小神经胶质细胞能够通过表达MMP3影响其活化状态。67 华中科技大学博士学位论文图3-7MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与细胞单位体积细胞数量的相互关系。A，黑色素瘤细胞接种后MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与其单位体积细胞数量的相互关系；C，PBS接种后MMP3表达的小神经胶质细胞比例的变化与其单位体积细胞数量的相互关系。Figure3-7CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/Msandtheirvolumedensity.A,CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/Msandtheirvolumedensityaftermelamomacellinoculation.B,CorrelationbetweenthechangeofMMP3expressingM/MsandtheirvolumedensityafterPBSinoculation.3.3.3小神经胶质细胞表达的MMP3影响紧密连接蛋白ZO-1的表达为了进一步探讨在黑色素瘤脑转移的发展过程中小神经胶质细胞不断升高的MMP3能够破坏脑组织中紧密的微环境，并为黑色素瘤脑转移的发展提供帮助，我们检测了脑组织中紧密连接蛋白的表达。血脑屏障的完整性主要是基于血管内皮细胞间94紧密连接的存在，紧密连接中含有各种紧密连接蛋白，如ZO-1,Claudin等，因此我们对肿瘤转移灶发展的不同时期的脑组织中紧密连接蛋白ZO-1的表达进行了检测。通过对各组脑切片进行免疫荧光染色标记后，获得如图3-8所示的结果。68 华中科技大学博士学位论文图3-8黑色素瘤脑转移发展的过程中紧密连接蛋白ZO-1的表达情况。A，黑色素瘤发展的不同时间点的ZO-1免疫荧光标记，比例尺,20µm；B，黑色素瘤发展的不同时间点ZO-1表达的细胞比例的统计分析；C，MMP3表达的小神经胶质细胞比例变化与ZO-1阳性细胞比例的相关性分析。每组3只小鼠，数据展示为平均值±标准误。**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure3-8ZO-1expressinginthedevelopmentofmelanomabrainmetastasis.A,ImmunofluorescenceofZO-1indifferenttimepointsduringthedevelopmentofmelanomabrainmetastasis,scalebar,20µm;B,StatisticsofZO-1expressingcellindifferenttimepointsduringthedevelopmentofmelanomabrainmetastasis;C,CorrelationanalysisinproportionofMMP3expressingM/MsbetweentZO-1expressingDAPI+cell.N=3pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001.从上图3-8A和B可见，随着黑色素瘤脑转移的发展，检测到的脑组织中ZO-1表达细胞比例显著性的减少。通过图3-8B的量化分析可见，随着黑色素瘤的发展，ZO-1阳性细胞比例由接种后第一天的63.92%降至第21天的31.21%。而在PBS对照组中，紧密连接蛋白ZO-1阳性细胞比例基本没有改变。如图3-8B及图3-9所示。69 华中科技大学博士学位论文图3-9PBS注射组接种后小鼠脑组织中ZO-1在不同时间点的表达情况，比例尺，20µm。Figure3-9ZO-1expressionindistinctivetimepointsafterPBSinjectiongroup.Scalebar,20µm.另外，为了进一步分析黑色素瘤转移脑组织中ZO-1表达的细胞比例减少是否与小神经胶质细胞的MMP3的表达有关系，我们对这它们进行了皮尔森相关性分析，得到图3-8C所示的结果。结果显示，皮尔森相关系数为0.8471，P值为0.0266，证实ZO-1表达的细胞比例变化与MMP3表达的小神经胶质细胞的比例变化有很高的相关性，并说明小神经胶质细胞表达的MMP3影响脑组织中的紧密连接蛋白表达降低，从而改变脑组织微环境以促进转移的黑色素瘤细胞侵袭。3.3.4MMP3剔除后影响黑色素瘤脑转移的发展基于以上猜测和实验结果，我们认为小神经胶质细胞表达的MMP3在黑色素瘤的发展过程中起着重要的作用，不仅影响了小神经胶质细胞的活化，同时影响了脑组织的微环境，因此我们使用MMP抑制剂通过腹腔给药的方式实现在体MMP3的抑制，并进一步检测其是否对黑色素瘤脑转移灶的发展起促进作用。将已完成颈内动脉接种后的小鼠，分为两组，每天分别在小鼠腹腔进行抑制剂PD166793或溶剂对照CMC的给药操作，至小鼠接种后的第15天左右，获得小鼠脑组织，并进行一系列的检测，主要结果如下图所示。70 华中科技大学博士学位论文图3-10免疫荧光标记检测小神经胶质细胞MMP3的抑制效果。A，不同组中代表性MMP3免疫荧光标记结果，比例尺,20µm。B，A图的量化分析。每组5只小鼠，数据展示为平均值±标准误。****表示P<0.0001。Figure3-10InhibitionofMMP3expressiononM/Msbyimmunofuorescence.A,TypicalimmunofluorescenceofMMP3expressionindifferentgroups.Scalebar,20µm.B,QuantitativeanalysisoftheresultsinA.N=5pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.****P<0.0001.图3-10展示的是，分别对小鼠进行CMC或PD166793腹腔给药后的脑组织MMP3的免疫标记结果，以此可见抑制剂对MMP3的抑制作用。图3-10A展示的为代表性MMP3免疫荧光结果，图3-10B为免疫荧光的量化分析结果。从上图中可见，使用PD166793抑制剂后，小神经胶质细胞中表达MMP3的细胞比例的得到了明显的抑制，相对对照组，实验组中表达MMP3的小神经胶质细胞降低了72%。图3-11MMP3抑制后ZO-1的表达。A，不同组中代表性ZO-1免疫荧光标记结果，scalebar,20µm。B，A图的量化分析。每组5只小鼠，数据展示为平均值±标准误。****表示P<0.0001。Figure3-11ZO-1expressionafterMMP3inhibition.A,TypicalimmunofluorescenceofZO-1expressionindifferentgroups.Scalebar,20µm.B,QuantitativeanalysisoftheresultsinA.N=5pergroup.Statisticaldatapresentedwithmean±SEM.****P<0.0001.根据3-8C中的相关性结果可见，小神经胶质细胞MMP3的表达与脑组织中ZO-1的表达有一定的相关性，因此继续对MMP3抑制后的脑组织进行免疫荧光ZO-1标记。图3-11分别展示的是不同处理组中代表性ZO-1的免疫荧光结果及其量化分析结果。从图中可见，在PD166793作用后的MMP3抑制小组中，可以看到显著性ZO-1表达71 华中科技大学博士学位论文的恢复。虽然并未恢复至图3-8所示的结果，但已恢复至其80%的ZO-1的表达。接着，我们对这两种处理下黑色素瘤脑转移的形成情况进行分析，如图3-12所示。图3-12MMP3抑制后黑色素瘤脑转移的形成情况。A，不同处理组的代表性脑组织照片；B，形成的黑色素瘤脑转移灶数量的统计分析；C，形成的黑色素瘤脑转移灶直径的统计分析。每组5只小鼠，数据展示为平均值±标准误。*表示P<0.05。Figure3-12OccurrenceofmelanomabrainmetastasisafterMMP3inhibition.A,Typicalphotographofmicebrainfromdifferentgroups.B,Quantitativeanalysisfornumberofmelanomabrainmetastasisindifferentgroups.C,Quantitativeanalysisfordiameterofmelanomabrainmetastasisindifferentgroups.N=5pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.*P<0.05.使用PFA灌流小鼠后，获得脑组织，记录脑组织中肉眼可见的黑色素瘤脑转移灶数目，并使用千分尺对转移灶的直径进行测量得到上图展示的结果。从图片及结果可见，PD166793给药抑制MMP3后，小鼠的黑色素瘤脑转移灶形成的数目和大小均降低了46.2%及66.7%。综上所述可见，PD166793能够实现部分的MMP3的抑制，且MMP3的抑制发生后，脑组织中ZO-1的表达也明显得到恢复，并且显著性减小了黑色素瘤脑转移的形成数目及形成的转移灶的大小。这些结果进一步验证了小神经胶质细胞通过自身所分泌的MMP3影响了紧密连接蛋白ZO-1的表达从而促进黑色素瘤脑转移的发生。3.3.5小神经胶质细胞剔除后影响黑色素瘤脑转移的发生根据上述结果，我们猜测，小神经胶质细胞通过自表达的MMP3影响其形态、运动特性及分布，进而改变其活化状态，同时对BBB的紧密连接蛋白进行破坏，持续活化的小神经胶质细胞促进了黑色素瘤脑著转移灶的发展。为了验证活化的小神经胶质细胞参与了黑色素瘤脑转移的发展，我们首先检测了其活化状态，并使用CSF1R抑制剂对脑组织中小神经胶质细胞进行剔除，从而验证小神经胶质细胞是否直接参与72 华中科技大学博士学位论文了黑色素瘤脑转移的形成。图3-13黑色素瘤发展的不同时期小神经胶质细胞F4/80的表达情况。A，不同时间点代表性小神经胶质细胞F4/80的免疫荧光结果。比例尺，20µm。Figure3-13F4/80expressionofM/Msduringthedifferenttimepointofthedevelopmentofmelanomabrainmetastasis.A,TypicalimmunofluorescenceofF4/80onM/Msindifferenttimepointsduringthedevelopmentofmelanomabrainmetastasis.Scalebar,20µm.F4/80为M2型巨噬细胞的活化标记，M2型的巨噬细胞具有促进肿瘤生长的能力。由于在上述猜想中，我们认为小神经胶质细胞参与了黑色素瘤脑转移灶的发展，即促肿瘤的作用，为此，我们对脑组织中小神经胶质细胞F4/80的表达进行了检测。通过图3-13所示的免疫荧光结果可见，随着黑色素瘤脑转移的发展，F4/80标记的细胞数目明显增多，且与绿色的小神经胶质细胞具有很好的共定位。根据成像结果可见，这些高表达F4/80的小神经胶质细胞通常分布在肿瘤组织内或周围，通过进一步分析肿73 华中科技大学博士学位论文瘤区域与非肿瘤区域中的小神经胶质细胞F4/80的表达情况，证实了此情况。肿瘤区域内的小神经胶质细胞高表达F4/80，而正常组织中小神经胶质细胞上很难检测到其表达。因此猜测，局部小神经胶质细胞通过活化成更具M2型的促肿瘤发展的状态来帮助肿瘤细胞的生长和壮大，如图3-14A及B所示。图3-14不同区域的小神经胶质细胞F4/80的表达情况。A，不同区域的F4/80分布大图。黄色虚线为肿瘤区域边界，方框分别为非肿瘤区域及肿瘤区域。B，A图中方框区域放大图，比例尺，20µm。Figure3-14F4/80expressiononM/Msindifferentregionofbrain.A,LargescaledistributionofF4/80expressiononM/Msindifferentregions.Yellowdottedline,tumorboundry,regionsintheboxrepresentednon-tumorregionandtumorregionrespectively.B,magnificationofregionsinboxesinA,scalebar,20µm.为了更加直接地验证小神经胶质细胞在黑色素瘤发展中的作用，根据参考文献中74 华中科技大学博士学位论文148的报道，我们使用CSF-1R抑制剂PLX3397喂食的方法实现小神经胶质细胞的剔除，特异性地剔除细胞后，再进行黑色素瘤的接种，并在接种后的15天左右收集脑组织，检测黑色素瘤的发生情况。图3-15PLX喂食一周后的小神经胶质细胞剔除效果。A,不同组中代表性免疫荧光标记结果，比例尺,60µm。B，A图中绿色荧光蛋白标记细胞所占比例的量化分析。每组3只小鼠，数据展示为平均值±标准误。****表示P<0.0001。Figure3-15DepletionofM/MsafteroneweekPLXchow.A,Typicalimmunofluorescenceresultsfrom+differentgroups.Scalebar,60µm.B,QuantitativeanalysisofGFPcellinA.N=3pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.****P<0.0001.分别使用含有PLX3397的AIN-76A饲料（图中所示PLXchow）及单独的AIN-76A饲料（图中所示Vehiclechow）对小鼠进行喂食，喂食一周后，收集小鼠的脑组织，使用DAPI标记细胞核后进行成像，获得图3-15A代表性结果。从免疫荧光结果可见，相对对照组，PLX组的GFP表达的细胞有了一定程度的减少，但是仍然可见。通过3-15B的统计学分析得到，相比对照组，PLX组中有31%的小神经胶质细胞被剔除。根据文献中报道，如果停止药物喂食，剔除的小神经胶质细胞会慢慢地恢复至正常水平，因此，为了实现更大程度的小神经胶质细胞的剔除，需要继续进行喂食以达到目的。另外，需要强调的是，根据文献中说明，长达两个月的喂食也并未对小鼠的学习、记忆、运动功能或行为等造成危害。理论上喂食三周后能获得很明显的剔除效果，因此选择在三周喂食结束后进行黑色素瘤细胞的接种，整个黑色素瘤发展的过程中持续喂食，至此，整个喂食时长约为五周左右。75 华中科技大学博士学位论文图3-16PLX喂食三周后的小神经胶质细胞剔除效果。A,不同组中代表性免疫荧光标记结果，比例尺,60µm。B，A图中绿色荧光蛋白标记细胞所占比例的量化分析。每组3只小鼠，数据展示为平均值±标准误。****表示P<0.0001。Figure3-16DepletionofM/MsafterthreeweekPLXchow.A,Typicalimmunofluorescenceresults+fromdifferentgroups.Scalebar,60µm.B,QuantitativeanalysisofGFPcellinA.N=3pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.****P<0.0001.继续喂食三周后，小神经胶质细胞的剔除效果如图3-16所示。从A图免疫荧光切片的结果能看到，相比对照组，PLX组绿色标记的细胞数目明显减少。通过定量分析得到，PLX喂食三周后，80%的小神经胶质细胞被剔除。相对一周喂食的效果，喂食三周已实现大部分的小神经胶质细胞剔除。图3-17小神经胶质细胞剔除后黑色素瘤脑转移的形成情况。A，不同处理组的代表性脑组织照片；B，形成的黑色素瘤脑转移灶数量的统计分析；C，形成的黑色素瘤脑转移灶大小的统计分析。Vehicle组7只小鼠，PLX组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。*表示P<0.05，**表示P<0.01。Figure3-17OccurrenceofmelanomabrainmetastasisafterM/Msdepletion.A,Typicalphotographofmicebrainfromdifferentgroups.B,Quantitativeanalysisfornumberofmelanomabrainmetastasisindifferentgroups.C,Quantitativeanalysisfordiameterofmelanomabrainmetastasisindifferentgroups.N=6pergroup.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.*P<0.05,**P<0.01.实现大部分小神经胶质细胞的剔除后，颈内动脉注射黑色素瘤细胞至小鼠体内，黑色素瘤脑转移形成的15天中，小鼠继续进行PLX饲料的喂食。接种后15天左右，收集小鼠脑组织，对形成的黑色素瘤脑转移灶进行分析，如图3-17所示。分别记录每76 华中科技大学博士学位论文组小鼠中肉眼可见的黑色素瘤脑转移灶的数目，同时使用千分尺对其大小进行测量。将获得的结果进行统计学分析。从结果中可见，小神经胶质细胞剔除后，黑色素瘤脑转移灶的数目和大小都有了显著性的降低，由原来的平均每只鼠2个转移灶下降为不22到1个转移灶，同时转移灶大小也从6.07mm下降为1.34mm。因此，小神经胶质细胞直接参与了黑色素瘤脑转移的形成。3.4讨论活体显微成像结果显示在黑色素瘤脑转移的发展过程中，转移灶周围的小神经胶质细胞被大量活化，我们推测其参与了脑转移的形成。据此，我们通过传统生物学方法，结合活体显微成像监测到的结果，分别通过免疫荧光、半定量RT-PCR、免疫组化、特异性剔除等方法对小神经胶质细胞在其中所扮演的角色进行进一步的研究。结果表明，在黑色素瘤脑转移的发展过程中，小神经胶质细胞能够表达大量的MMP3，这些MMP3具有双重作用，不仅能同时影响其活化状态同时影响了脑组织中紧密连接蛋白ZO-1的表达。尽管脑组织中的其他细胞，如星型胶质细胞等也能够表达MMP，但我们通过原代细胞分离的方法，从脑组织中分离纯化出了90%以上的小神经胶质细胞，并检测到这些小胶质细胞MMP3的表达水平是肿瘤细胞的114.2倍。通过皮尔森相关性分析，我们得到小神经胶质细胞表达的MMP3与其活化状态有密切关系，具体表现为，与细胞的形态变化、胞体速度的增加及单位体积细胞数量的增加成线性关系。在使用MMP抑制剂PD166793后，我们观察到脑组织中表达MMP3的小神经胶质细胞比例减少，同时，脑组织中ZO-1的表达量也有所恢复，另外，黑色素瘤脑转移灶的数目和大小也明显的减少。通过活化标志物F4/80，我们也证实了黑色素瘤脑转移灶周围的小神经胶质细胞的活化状态发生了改变。为了更直接地揭示小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移中的作用，我们使用含CSF-1R抑制剂PLX3397的饲料对其进行特异性的剔除。结果显示，超过80%的小神经胶质细胞被剔除后，黑色素瘤转移灶的数目和大小都明显减少。由此可见，小神经胶质细胞直接参与了黑色素瘤脑转移灶的形成。这些结果证实了小神经胶质细胞通过表达MMP3一方面影响其自身活化状态，另一方面影响血脑屏障的完整性，从而直接参与黑色素瘤脑转移的发展。77 华中科技大学博士学位论文3.5本章小节为了研究小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移发展过程中出现的各种动态变化的原因以及生物学意义，本章充分利用传统生物学方法，证实小神经胶质细胞表达的MMP3在影响其活化状态的同时破坏血脑屏障的完整性从而促进黑色素瘤脑转移的形成。实验结果表明，小神经胶质细胞在黑色素瘤细胞入侵后能够被快速并持续地活化，至接种后第21天，活化程度最高。同时，高达94%小神经胶质细胞表达了MMP3。从皮尔森相关性分析得知，MMP3的表达与小神经胶质细胞的形态，运动和分布变化成线性关系；另外，MMP3的累积又影响了脑组织中ZO-1的表达，破坏了血脑屏障，从而促进黑色素瘤脑转移灶的形成。而MMP3的抑制、以及特异性剔除小神经胶质细胞后黑色素瘤脑转移灶的发生情况等实验结果，进一步证实了小神经胶质细胞作为脑组织中的主要免疫细胞，在黑色素瘤细胞入侵后，可能表现为一种促使肿瘤发生的状态，参与其转移灶的形成。78 华中科技大学博士学位论文4小神经胶质细胞在神经病理性疼痛发展中的细胞动态变化4.1引言神经病理性疼痛是一个长期且慢性发展的过程，小神经胶质细胞参与并调控了其中的级联反应，其活化状态、分泌的细胞因子等与疼痛的发展息息相关。为了探究小神经胶质细胞是如何参与这个长期发展的过程，且是如何影响疼痛的，本章旨在通过活体长时程显微成像的方法监测小神经胶质细胞的动态活动，从而揭示其作用。首先，我们通过坐骨神经慢性束缚型损伤建立稳定性、重复性高的CCI模型，用于神经病理性疼痛的模拟。在手术的过程中，对坐骨神经结扎的铬制肠线线圈的数目越多，造成的小鼠疼痛程度就会越高。基于这一点，CCI损伤后小鼠的疼痛程度会通过VonFreyTest的测试方法进行疼痛感觉测试。接着，为了实现对神经病理性疼痛小鼠脊髓中小神经胶质细胞的监测，我们需要制作长时程脊髓窗成像模型。目前，脊髓活体成像的窗口有很多，但是这些窗口的安装多发生在胸椎段，而胸椎段因有肋骨的支撑，脊髓窗的安装也更容易实现并长期保持。CCI损伤后的神经病理性疼痛小鼠由于损伤部位在坐骨神经，因此需要在对应脊髓段即腰椎段L4-L6进行成像观察。由于缺少肋骨的支撑、且弯曲度很高，腰椎段上脊髓窗的安装并不容易，另外因其更靠近尾椎，尾部及后肢的运动很容易带动腰椎段运动，因此也给腰椎部脊髓窗的安装和维持带来难点。本章节，我们根据实验目的和需求，结合活体显微成像技术与稳定的脊髓窗模型，长时程不同时间点监测在不同疼痛程度的小鼠、疼痛刺激同侧及对侧脊髓中，小神经胶质细胞所发生的变化，从而揭示其在神经病理性疼痛发展过程中的作用。4.2实验材料和方法4.2.1实验仪器兰格恒流泵兰格恒流泵有限公司79 华中科技大学博士学位论文VonFrey针刺痛觉测试套件瑞沃德生命科技有限公司动物测试笼瑞沃德生命科技有限公司脊髓手术台自组装（零件来自索雷博）LSM780双飞秒激光器多光子显微镜CarlZeiss公司Dell工作站戴尔公司小动物麻醉机瑞沃德生命科技有限公司其余实验仪器参照2.2.1。4.2.2实验材料神经病理性疼痛模型所用材料：医用碘酒，手术器械，自制玻璃弯勾，铬制肠线，生理盐水，100mmPetridish，5-0号丝线，角针，脱脂棉签。脊髓窗所用实验材料：手术器械，医用碘酒，棉签，牙科树脂，止血海绵，生理盐水，地塞米松磷酸钠注射液，葡萄糖溶液，显微弹簧剪，脊髓窗，硅胶粘合剂，5mm盖玻片。4.2.3实验方法(1)CCI损伤构成的神经病理性疼痛a)手术之前，提前至少30min将铬制肠线剪短成4cm左右的线段，并浸泡在生理盐水中待用；b)乌拉坦深度麻醉小鼠，将小鼠斜侧放置在手术台面上，使用解剖刀刀片小心将左侧大腿部分的毛发去掉；c)使用医用酒精或碘酒擦拭，眼科剪小心从大腿中部股骨外缘凹陷处切开皮肤，钝性分离皮肤与肌肉间的粘膜，接着继续钝性分离肌肉，暴露坐骨神经主干；d)使用自制玻璃弯勾，游离坐骨神经，并使用泡软后的铬制肠线在分离的坐骨神经干中部打结，匀速拉紧肠线，避免形成过大的压迫，接着在神经上间隔1mm处上打下第二个结，线圈的松紧程度与第一个结一致，以此类推，分别在坐骨神经上结下0个、1个、2个、3个、4个结，假手术组为0个结，但在皮肤与肌肉间隙中包埋4个2mm左右的线段，其余组别中，分别在其80 华中科技大学博士学位论文中埋下3个、2个、1个、0个结，这五组分别记为N0S1、N1S3、N2S2、N3S1、N4S0，其中N为nerve，S为skin，下图中红色表示结扎线圈位置和方法：图4-1CCI损伤模式图Figure4-1Schemadiagramofchronicconstrictioninjurye)完成铬制肠线的结扎后，将坐骨神经再放回原处，轻轻拉动对应一侧的后足，以帮助神经归位；f)接着，盖上皮肤，使用5-0号丝线将皮肤进行单纯连续缝合，注意不要将埋在皮肤下的肠线带出，缝合完毕后，使用医用碘酒对创口处进行消毒处理，小鼠放置在加热垫上，待苏醒后放回IVC笼具中，等待后续观察。(2)神经病理性疼痛测试方法a)在进行正式的疼痛测试之前，需要提前两天进行准备，将小鼠放置在动物测试笼中，让它们对此环境进行一个适应，以保证之后的正式测试时环境造成的小鼠行为的变化降到最小，适应时间为20min，且尽量保证时间点与后面疼痛测试的时间点一致；b)第三天时，在小鼠适应了一段时间后，开始进行疼痛测试，测试时按照以下表格进行，测试之前，用扔硬币的方式选择左或者右侧开始，依次按照表格中从轻到重的纤维丝进行足垫部位刺激（2.44,0.04g;2.83,0.07g;3.22,0.16g;3.61,0.4g;3.84,0.6g;4.08,1.0g）刺激时，保持与足垫刺激部位垂直，记录同一纤维丝的10次刺激后，足垫疼痛反馈的次数，另外，注意在更换下一个量级的纤维丝之前停留1min；81 华中科技大学博士学位论文表4-1VonFrey痛觉测试表Table4-1tableofVonFreytactiletestingPainlevelN0S4N1S3N2S2N3S1N4S0HairRightLeftRightLeftRightLeftRightLeftRightLeftweight2.44（1）2.83（2）3.22（3）3.61（4）3.84（5）4.08（6）c)按照此表格完成测试后，记录好时间点pre，接着可在当天或者第二天进行CCI损伤手术，具体步骤参见2.2.3.5部分内容，手术当天记为day0，之后按照上述步骤，分别在day2，day5，day7，day14，day21这几个时间点进行痛觉测试，并完成记录；149d)按照时间点完成测试后，将数据汇总，并参照文献进行结果分析。(3)脊髓窗制备方法a)深度麻醉小鼠，使用理发器将小鼠腰部的毛发剃除，使用医用碘酒和酒精将皮肤消毒处理，吸取适量葡糖糖溶液及地塞米松溶液在开窗附近皮下注射；b)使用手术刀在对应腰椎段开一小口，接着使用手术器械对开口进行钝性扩大，并分离皮肤与肌肉之间的粘膜，找准将要开窗的L5段位置，使用手术器械将L4-L6段的肌肉分离，分离的过程中不能使用利器戳脊髓椎板，由于椎板周围的血管比较丰富，因此在游离此段脊椎的过程中可能会有血液流出，可以实时的用棉签将已经松散的肌肉擦拭下来；c)另外，由于腰椎部没有其他骨组织对其支撑，肌肉层腹面即为腹腔内各种脏器，因此在剥离肌肉时需要避免过度去除，以保证腹腔器官的正常运作，同时，应注意避免解离过多将背根神经节破坏；d)当目标脊髓段已完成游离过程，即可使用定制的脊髓固定台将脊髓两侧固定82 华中科技大学博士学位论文好，固定时，需首先调整度，固定好一侧固定棒的位置，然后，使用镊子小心将脊髓段卡在这侧的固定棒上，同时将另一侧的固定棒夹紧，固定好脊髓段，固定完成后，将固定好的脊髓段垂直升高一部分，保证固定装置对小鼠腹腔未形成压迫，且可以检测脊髓段是否完成固定；e)固定好脊髓段后，就可以准备进行椎板揭开术，在解剖镜头下，使用棉签将固定好的脊髓段从一个方向擦拭干净，待相对干燥时，使用显微弹簧剪小心将在椎板紧密分布的肌肉水平方向拉下，由于脊髓的椎板之间是有一定的空隙，这些空隙缺少椎板的保护因此在去除这些细小肌肉时需要注意不要破坏脊髓以免造成大出血；f)镜检下确认肌肉已玻璃干净时，使用棉签将椎板表面擦拭干净，等待其表面干燥1min左右，这时，椎板由于干燥后变硬，因此在椎板揭时更容易；g)使用显微弹簧剪，尖端朝向外侧，从L5-L6椎板间隙中斜插进椎板下方，避免伸进去过多以免伤害脊髓，快速的将L5段椎板一侧剪端，接着迅速抽出显微弹簧剪，斜插进另一侧，保证尖端持续朝外，快速将这一侧椎板剪断，然后，使用镊子将椎板突夹住，小心揭开剪下的椎板，并使用弹簧剪分离椎板与肌肉之间的粘膜，此过程会伴随大量出血，但椎板揭开后，及时使用生理盐水浸泡过的止血海绵止血后，血液便会止住；h)待血液止住后，使用生理盐水漂洗暴露出的脊髓，并在解剖镜下查看上方的粘膜是否完全揭走，若还有残留则需要使用显微弹簧剪或者注射器针头将其掀开去除，注意不要破坏脊髓，此过程也需小心，触碰压力稍微过大就会造成出血，此时也需要使用止血海绵止血；i)当椎板揭开后的脊髓已经清洗干净，且粘膜都被清除后，即可准备进行窗口安装，安装之前，需要使用TEETS牙科树脂涂抹薄薄的一层在脊髓周围的肌肉和椎板上，以增强后续窗口及kwik-sil粘合剂的附着；j)接着，将脊髓窗窗口部分放置在脊髓固定棒上，调整位置，保证L5段在窗口中显现，此时使用螺丝将此部分与固定棒固定，固定时先将4个螺丝一一放置在对应孔位，并一一稍微拧紧，宁静过程中同样要保证窗口位置，最后将83 华中科技大学博士学位论文所有螺丝固定紧即可；k)将四周皮肤与脊髓窗使用乐泰胶水粘合，不可留下缝隙，粘合后，使用生理盐水再次漂洗窗口中的脊髓，清洗干净后，使用棉签吸干溶液，在窗口中滴加kwik-sil胶水，避免产生气泡，然后盖上5mm盖玻片待干燥即可。(4)脊髓活体显微成像a)使用异氟烷将待成像的小鼠呼吸麻醉，小鼠麻醉完成后，安装至自制的成像台上，固定好即可；b)接着，按照蔡司双飞秒激光器多光子显微镜LSM780使用步骤进行规范操作，设置好成像参数后，即可进行图像的扫描；c)成像时，首先进行大视野Z轴信息的提取，即，收集整个L5段的深度信息，约3mm×1.5mm×200µm左右；接着根据大视野的结果，识别出脊髓段中间背侧静脉的区域后，分别在血管两侧随机选择一个区域，进行时长20min时间序列成像，观察小神经胶质细胞的行为变化。d)将获得的大视野深度扫描结果及时间成像的结果导出，使用FIJI及imaris对数据进行分析。具体数据处理方法参照2.2.3部分。e)另外，由于是长时程不同时间点的成像，根据实验设计，需要在CCI损伤前pre时间点，day2，day3，day4，day5，day6，day7，day8，day9，day10，day14这几个时间点进行成像。4.3实验结果4.3.1神经病理性疼痛模型的建立(1)神经病理性疼痛的检测根据上述实验方法，找到图4-1所示的坐骨神经段，使用铬制肠线结扎后，建立CCI损伤后的小鼠模型。根据结扎线圈的数目多少，可以制作出不同程度疼痛的小鼠模型。因此，我们制作出了下列不同疼痛程度的小鼠，分别为N0S4，N1S3，N2S2，N3S1，N4S0。其中，N代表坐骨神经，N后的数字为铬制肠线线圈的数目；S为皮肤，后面的数字为线段的个数。为了保证线圈数目一致，在神经上每减少一个线圈，对应84 华中科技大学博士学位论文的需在皮肤下埋上一个线段，据此，N0S4为假手术对照组。手术后的小鼠，可从后肢运动状态初步判断手术效果，若出现后肢拖行无力情况，则说明铬制肠线结扎程度过猛，若后肢支撑正常，但能观察到结扎侧足垫有明显疼痛感，则说明肠线结扎适合。接着，按照表4-1的设计，在手术前后对应时间点完成表格，获得对小鼠疼痛行为的测量结果。将小鼠放置在图4-2B和C的测试笼及测试架中，使用VonFrey针刺痛觉测试套件进行疼痛行为的测试。在进行观察和测量时，尽量保证环境和时间的一致性，另外需要保证室内的清洁度以及安静。整个过程需严格遵照实验方法中的各步骤。图4-2小鼠CCI损伤及测试。A，CCI损伤位点：小鼠坐骨神经段；B，动物测试笼；C，动物测试包。Figure4-2CCIinjuryofmiceandVon-Freytesting.A,SciaticnerveofmiceforCCIinjury.B,Cageformicetesting.C,Von-Freytestingbag.(2)神经病理性疼痛的分析将获得到的小鼠疼痛测试反应的结果，使用文献中的方法获得对CCI损伤后小鼠的疼痛分析，如图4-3所示：85 华中科技大学博士学位论文图4-3小鼠CCI损伤后第14天疼痛反应测定结果。A，图中展示的是后肢足垫部位对不同压力大小纤维丝刺激后的收缩反应的比例。其中contra为坐骨神经损伤对侧，ipsi为坐骨神经损伤同侧。B，展示了纤维丝标记从2.44至3.84的统计数据结果。P值小于0.05时为显著性统计差异。每组5只小鼠。Figure4-3Von-FreytestingofCCIinjurymiceatday14post-surgery.A,Meanpercentageresponseofmicefootpadtodifferenthairweightfilamentstimulation.ContraisthecontralaterallateralofCCIinjuryofsciaticnerve;ipsiistheipsilaterallateralofCCIinjuryofsciaticnerve.B,Statisticalvaluesinhairsmarked2.44-3.84.Ap-valueof<0.05,wasdeterminedstatisticallysignificant.n=5pertreatmentgroup.将损伤前后的小鼠，按照4.2.3中（2）的具体方法，使用不同压力大小的纤维丝对小鼠后肢足垫进行刺激，并记录每十次足垫回缩的反应，从而得到对应的反应比例。如图4-3所示，随着纤维丝重量的增加，小鼠后肢足垫的反应会更明显，这种情况，即使在对照N0S4组都有所展示。但由于进行了CCI损伤，因此，疼痛小鼠会对更轻86 华中科技大学博士学位论文的压力纤维丝刺激更敏感。如图4-3A下侧图展示的小鼠刺激同侧中，相对上侧对照组图中，疼痛小鼠组N2S2，N3S1及N4S0对轻度0.04g，0.07g，0.16g，0.4g更明显的疼痛刺激反应。结合4-3B中展示的数据结果可见，相比正常小鼠及轻度疼痛小鼠，中重度疼痛小鼠对0.04g压力刺激反应更明显。而随着纤维丝压力增加，不同疼痛程度小鼠对疼痛刺激的反应差距变小。这些结果说明，我们通过结扎不同数目的铬制肠线线圈，成功建立起对微弱刺激敏感的不同程度疼痛的小鼠神经病理性疼痛模型。4.3.2长时程活体显微成像脊髓窗模型的建立为了长期观察小神经胶质细胞在神经病理性疼痛发生发展过程中的作用，我们需要建立小鼠脊髓窗模型用于长时程活体显微成像。正如引言所述，为了实现此目标，我们需要对CCI所造成的神经损伤中相关脊髓段L4-L6进行椎板揭开术，并在其上安装可以实现长时程活体显微成像的脊髓窗。由于此段区别于文献中的胸椎段，因此我们在参考文献中的设计方法之外，还需要将其进行改造。首先我们将稳定脊髓的固定棒的长宽高分别设计为10mm、4mm及1.5mm，相对文献报道的9.144mm,2.032mm及1.524mm的设计更长更宽更窄，如图4-4APart2所示。由于腰椎段缺少肋骨的支撑，加长的固定棒能够保证更多的脊髓区域被固定住；同时更宽的横截面不仅有助于螺纹的分布同时也能为腰椎提供支撑并减少窗口对身体的压迫；由于腰椎距离腹腔各脏器尤其是肾的距离很近，因此更窄的固定棒设计也能减少对腹腔各脏器的压迫，以减少窗口对小鼠各项正常生理功能的破坏。另外，为了将窗口适应蔡司双飞秒激光器多光子显微镜，我们需要将配套脊髓窗Part1部分两端进行相应微调，以免其高度挡住镜头，另外，将螺孔的位置加宽至1.15mm，这样极大地方便了脊髓窗的固定，同时给手术的操作带来更大的便利，从而获得更稳固的脊髓窗模型。将Part1放置在固定棒上，使用四个螺丝将其与Part2上的螺孔对应拧紧即可将脊髓窗安装至小鼠脊髓上，如图4-4C所示，展示的是一只安装有脊髓窗的小鼠照片。为了更好地进行椎板揭开术及脊髓窗的安装手术，我们制作了图4-4B所示的手术台，利用此手术台，可以将需要手术的脊椎部位放在最高点，以便操作。另外，脊髓固定棒通过乐泰胶粘附在黄色定制杆上，以实现固定脊椎的步骤，在手术结束后，将定制杆小心旋转即可卸下。87 华中科技大学博士学位论文图4-4小鼠脊髓窗模型。A,可安装的脊髓窗设计图纸；B，用于椎板揭开术及脊髓窗安装的手术台；C安装有脊髓窗的小鼠照片。Figure4-4Implantedspinalcordchamberofmice.A，Designsketchofimplantedspinalcordchamber.B,Operationtableforlamilectomyandspinalcordchamberimplanting.C,Photographofmicewearingspinalcordchamber.小鼠椎板揭开术及脊髓窗手术过程中会有出血的现象，且由于在椎板揭开术过程中，会近距离接触到脊髓，因此，在手术后需要观察小鼠的活动能力，以确定手术过程中没有破坏脊髓组织。约一周后，观察到小鼠运动状态不受影响并能正常活动，才表示椎板揭开术及脊髓窗安装的成功。此时，可开始进行活体显微成像。为了实现长时程不同时间点对同一区域的脊髓活体成像，我们需要将小鼠脊髓窗固定，于是设计了如图4-5B所示的脊髓窗成像用装置。在脊髓窗的设计上，除了上述提到的一些特点外，图4-4A中展示的，脊髓窗Part1部分侧面中间有一小孔，此孔为螺纹孔，有了这样的设计，我们就可以使用图4-5B中固定杆前方的螺丝拧紧脊髓窗上的这两个螺纹孔中，以达到将脊髓窗紧紧固定住的目的。另外，固定杆的固定座高度可调，能够保证在针对不同大小的小鼠的脊髓窗固定时对腹腔压迫为0，更自然的对小鼠脊髓88 华中科技大学博士学位论文进行成像。活体小鼠脊髓成像的实物图如图4-5A所示，脊髓窗口的放大实物照片如图4-5C所示，圆圈内所见白色组织即为L5段脊髓，中间红色血管为背侧静脉所在区域。在成像过程中，可通过此血管位置区分脊髓左右两侧方位，便于后续成像分析。图4-5小鼠活体显微脊髓成像。A,蔡司780双光子显微镜下正在成像的小鼠照片；B，A中白色方框内所用的成像台放大实物图；C，脊髓窗及通过窗口展示的L5段脊髓照片。Figure4-5IntravitalmicroscopyimagingofmicespinalcordA，PhotographofamicebeingimagedwithZeiss780twophotonmicroscopy.B，MagnificationofintravitalimagingtableinthewhiteboxinA.C,PhotographofimplantedspinalcordchamberandthespinalcordinL5throughthechamber.4.3.3活体显微成像揭示小神经胶质细胞在神经病理性疼痛发展中的细胞动态变化小神经胶质细胞在神经病理性疼痛中的行为变化包括形态、分布及运动等，通过长时程脊髓活体显微成像，在损伤前后不同时间点，我们对不同疼痛程度的小鼠脊髓内小神经胶质细胞的行为进行了监测。另外，由于实际成像天数为从第二天到第十天的连续每天成像，从成像的结果看，相邻天数的小神经胶质细胞的行为变化差别并不大，因此在处理数据时，分别将第二天至第四天的合计为day2，第五天至第七天合计为day5，第八天至第十天合计为day8，其余时间点保持一致。据此，获得的主要结果如下所示。(1)疼痛小鼠中小神经胶质细胞的单位体积细胞数量随着CCI损伤后时间的延长而增加89 华中科技大学博士学位论文首先，我们通过大视野深度成像的结果可见不同组中小神经胶质细胞的分布变化趋势，通过量化处理得到参数volumedensity（参照2.2.3），如图4-6至图4-11所示。图4-6小神经胶质细胞在N0S4神经病理性疼痛发展不同时间点的3D分布。A，不同时间点的脊髓L5段大视野图像，比例尺,100µm，黄色虚线为血管，血管两侧对应区域左侧为疼痛对侧，右侧为疼痛同侧；B，疼痛发展前后的小神经胶质细胞典型形态，比例尺，10µm；C，小神经胶质细胞单位体积细胞数量变化的量化分析，所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。NS表示P>0.05。Figure4-6Three-dimensionaldistributionofM/MsindifferenttimeofneuropathicpaindevelopmentinN0S4group.A,LargescaleimageofL5spinalcordindifferenttimepoint,scalebar,100µm,yellowdottetlinerepresenteddorsalvessel,regionintheleftofvesselreferredtocontralateralsidewhileipsilateralsideofCCIinjuryintheright.B,TypicalmorphologyofM/MsbeforeandafterCCIinjury,scalebar,10µm.C,QuantitativeanalysisforvolumedensityofM/Mschange.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant.90 华中科技大学博士学位论文图4-7展示的为疼痛程度为N1S3的小鼠小神经胶质细胞分布的变化结果。图4-7小神经胶质细胞在N1S3神经病理性疼痛发展不同时间点的3D分布。A，不同时间点的脊髓L5段大视野图像，比例尺，100µm，黄色虚线为血管，血管两侧对应区域左侧为疼痛对侧，右侧为疼痛同侧；B，疼痛发展前后的小神经胶质细胞典型形态，比例尺，10µm；C，小神经胶质细胞单位体积细胞数量变化的量化分析，所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。NS表示P>0.05。Figure4-7Three-dimensionaldistributionofM/MsindifferenttimeofneuropathicpaindevelopmentinN1S3group.A,LargescaleimageofL5spinalcordindifferenttimepoint,scalebar,100µm,yellowdottetlinerepresenteddorsalvessel,regionintheleftofvesselreferredtocontralateralsidewhileipsilateralsideofCCIinjuryintheright.B,TypicalmorphologyofM/MsbeforeandafterCCIinjury,scalebar,10µm.C,QuantitativeanalysisforvolumedensityofM/Mschange.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant.91 华中科技大学博士学位论文图4-6展示的为疼痛程度为N0S4的小鼠小神经胶质细胞分布的变化结果。N0S4小鼠中坐骨神经结扎数为0，即此组作为神经病理性疼痛中的对照组。从图4-6A中的大视野图像及图4-6C图中的定量分析结果可见，此组中的小神经胶质细胞的分布在CCI损伤前后各个时间点中并无显著性差别，且在手术同侧及对侧中也没观察到差异，33小神经胶质细胞的单位体积细胞数量约为1.6×10cell/mm。另外，从图4-6B图可见，在N0S4小鼠脊髓内，小神经胶质细胞能够观察到明显分支的细胞突起及小胞体结构，这种典型的分支装展示小神经胶质细胞此时处于正常的监视状态。N1S3小鼠中坐骨神经结扎数为1，即此组为坐骨神经轻微损伤小组。由于此小组的疼痛程度比较轻微，在图4-7A中的大视野图像中并没有观察到明显的小神经胶质细胞分布的变化；另外图4-7C图中的定量分析也展示统计学上并为检测到显著性差33异，均值波动范围不超过0.1×10cell/mm；从图4-7B图可见，在N1S3小鼠脊髓内，小神经胶质细胞的典型形态开始变得模糊，细胞突起末端出现明显的膨大现象。这些现象说明，在轻微疼痛小鼠脊髓内，随着疼痛的发展，小神经胶质细胞的状态正在发生缓慢的变化，虽然统计结果显示整个过程中小神经胶质细胞分布的变化并不大，但是预示着其状态与疼痛的严重程度有一定的相关性。接着，我们分析了疼痛程度为N2S2小组的小神经胶质细胞的分布情况，如图4-8所示。N2S2小鼠中坐骨神经结扎数为2，此小组为中等程度的神经疼痛小鼠，相较于N1S3，损伤程度增加。图4-8A和C中展示的大大视野图片及量化结果可见，随着损伤后时间的延长，疼痛同侧的小神经胶质细胞的单位体积细胞数量明显成上升趋势，且在损伤后第五天开始出现显著性变化，相比疼痛损伤前增加了54%。接着，随着疼痛损伤后时间的延长，小神经胶质细胞的密度继续增加，且至第14天时，疼痛同侧相较于其对侧的单位体积细胞数量，增加了44%，有显著性差异。比较疼痛同侧及对侧的柱状图随损伤后时间的波动情况可见，对侧也出现了一定程度的波动，但变化不如同侧明显。另外，从图4-8B中可见，这一程度的疼痛小鼠中，CCI损伤前后的小神经胶质细胞的形态发生了明显的改变，出现了胞体增大的细胞形态预示着其活化程度的改变。92 华中科技大学博士学位论文图4-8小神经胶质细胞在N2S2神经病理性疼痛发展不同时间点的3D分布。A，不同时间点的脊髓L5段大视野图像，比例尺，100µm，黄色虚线为血管，血管两侧对应区域左侧为疼痛对侧，右侧为疼痛同侧；B，疼痛发展前后的小神经胶质细胞典型形态，比例尺，10µm；C，小神经胶质细胞单位体积细胞数量变化的量化分析，所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。**表示P<0.01，***表示P<0.001。Figure4-8Three-dimensionaldistributionofM/MsindifferenttimeofneuropathicpaindevelopmentinN2S2group.A,LargescaleimageofL5spinalcordindifferenttimepoint,scalebar,100µm,yellowdottetlinerepresenteddorsalvessel,regionintheleftofvesselreferredtocontralateralsidewhileipsilateralsideofCCIinjuryintheright.B,TypicalmorphologyofM/MsbeforeandafterCCIinjury,scalebar,10µm.C,QuantitativeanalysisforvolumedensityofM/Mschange.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.**P<0.01,***P<0.001.93 华中科技大学博士学位论文图4-9展示的是疼痛程度为N3S1的小鼠小神经胶质细胞分布情况。从图4-9A的大视野分布的结果及图4-9C的量化分析结果可见，小神经胶质细胞的分布明显增加，在CCI损伤后的第二天，就有显著性地升高，至第五天时，已增至损伤前的1.58倍，33到损伤后第八天时，达到其分布的单位体积细胞数量最大均值，为2.7×10cell/mm。除此之外，相比疼痛损伤同侧的小神经胶质细胞在损伤后第二天就开始出现显著性增长的单位体积细胞数量这一情况而言，其对侧的变化则增长的比较缓慢，虽然统计学分析并未检测到显著性的差异，但至第十四天时，损伤同侧的小神经胶质细胞的单位体积细胞数量较损伤对侧并无显著性差异。这些结果说明，在疼痛程度为N3S1的小鼠脊髓内，小神经胶质细胞的体积分布在损伤同侧的增长明显增加，但对侧增长的相对缓慢，但至CCI损伤后的第十四天，脊髓两侧的差异并不明显，暗示对侧小神经胶质细胞受同侧的细胞所处环境影响且也许会有信息的交流，造成其单位体积细胞数量缓慢的升高，从而出现两侧差异不明显的现象。另外，同样的，在本组中我们也观察到小神经胶质细胞胞体变形、细胞突起末端膨大等展示其活化状态改变的形态变化。94 华中科技大学博士学位论文图4-9小神经胶质细胞在N3S1神经病理性疼痛发展不同时间点的3D分布。A，不同时间点的脊髓L5段大视野图像，比例尺,100µm，黄色虚线为血管，血管两侧对应区域左侧为疼痛对侧，右侧为疼痛同侧；B，疼痛发展前后的小神经胶质细胞典型形态，比例尺，10µm；C，小神经胶质细胞单位体积细胞数量变化的量化分析，所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。*表示P<0.05，**表示P<0.01。Figure4-9Three-dimensionaldistributionofM/MsindifferenttimeofneuropathicpaindevelopmentinN3S1group.A,LargescaleimageofL5spinalcordindifferenttimepoint,scalebar,100µm,yellowdottetlinerepresenteddorsalvessel,regionintheleftofvesselreferredtocontralateralsidewhileipsilateralsideofCCIinjuryintheright.B,TypicalmorphologyofM/MsbeforeandafterCCIinjury,scalebar,10µm.C,QuantitativeanalysisforvolumedensityofM/Mschange.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.*P<0.05,**P<0.01.95 华中科技大学博士学位论文图4-10小神经胶质细胞在N4S0神经病理性疼痛发展不同时间点的3D分布。A，不同时间点的脊髓L5段大视野图像，比例尺,100µm，黄色虚线为血管，血管两侧对应区域左侧为疼痛对侧，右侧为疼痛同侧；B，疼痛发展前后的小神经胶质细胞典型形态，比例尺，10µm；C，小神经胶质细胞单位体积的细胞数量变化的量化分析，所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。*表示P<0.05，**表示P<0.01。Figure4-10Three-dimensionaldistributionofM/MsindifferenttimeofneuropathicpaindevelopmentinN4S0group.A,LargescaleimageofL5spinalcordindifferenttimepoint,scalebar,100µm,yellowdottetlinerepresenteddorsalvessel,regionintheleftofvesselreferredtocontralateralsidewhileipsilateralsideofCCIinjuryintheright.B,TypicalmorphologyofM/MsbeforeandafterCCIinjury,scalebar,10µm.C,QuantitativeanalysisforvolumedensityofM/Mschange.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.*P<0.05,**P<0.01.96 华中科技大学博士学位论文图4-10展示的是疼痛程度为N4S0的小鼠脊髓CCI损伤后同侧及对侧的小神经胶质细胞单位体积细胞数量及典型形态变化的结果。N4S0组为疼痛程度最严重的一组小鼠，其坐骨神经上铬制肠线结扎数目为4。从图4-10A及C可见，随着CCI损伤后时间的延长，小神经胶质细胞的3D分布的变化与N3S1、N2S2这两组疼痛小鼠的变化比较类似，都是呈随时间延长增长的趋势。在损伤后的第八天，损伤同侧脊髓中的63小神经胶质细胞单位体积细胞数量达到最大均值，为2.86×10cell/mm，是损伤前的1.75倍。虽然随着时间的延长至损伤后的第14天，柱形图显示损伤同侧的细胞单位体积细胞数量有缓慢的降低，但统计学上并无差异，而且与其对侧相比，同侧的小神经胶质细胞的单位体积细胞数量从损伤后第五天开始，就始终保持着与对侧的显著性差异，显示脊髓损伤同侧与对侧小神经胶质细胞的状态不一样。另外，从4-10B图可见小神经胶质细胞的形态也出现与上述其他不同程度的疼痛组小鼠一致的形态变化现象。最后，我们将不同疼痛程度的小鼠脊髓损伤同侧及对侧的小神经胶质细胞单位体积的细胞数量进行相互之间的比较，得到如图4-11所示的结果。图4-11不同小组小神经胶质细胞单位体积的细胞数量变化的统计分析。图中标注con为损伤对侧，ips为损伤同侧。所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。Figure4-11StatisticsforvolumedensityofM/Mschangebetweenindicatedgroups.TheconinlegendsaboverepresentedcontralateralsideofCCIinjury,whileipsreferredtoipsilateralsideofCCIinjury.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(**P<0.01,***P<0.001).从图4-11中的统计结果可见，CCI损伤前小神经胶质细胞在每一组中的体积分布虽然都不一致，但是组与组之间并无显著性差异。在损伤后的第十四天，所有组中的97 华中科技大学博士学位论文对侧、N1S3和N0S4同侧之间的小神经胶质细胞单位体积的细胞数量并无明显差异。另外，疼痛程度较高的N2S2、N3S1、N4S0这三组的小神经胶质细胞单位体积细胞数量在损伤同侧之间无显著性差异，但是相对对照组均有显著性差异。这些组间比较的结果说明，脊髓L5段CCI损伤后同侧的小神经胶质细胞的单位体积的细胞数量在疼痛小鼠中都有着随损伤后时间的延长增加的趋势，但是组间并无显著差异说明小神经胶质细胞的单位体积的细胞数量在一定程度上也许已经达到饱和，因此再检测不到更多的变化，但由于与对照组相比，均有显著性差异，说明这种变化已经足够它们参与神经病理性疼痛的发展。(2)小神经胶质细胞在神经病理性疼痛的发展过程中的形态改变由于小神经胶质细胞的形态变化与其活化状态和功能密切相关，且我们再上述的结果中已展示过其形态的变化，因此，我们使用一个参数形状因子(Formfactor),对小神经胶质细胞的形态变化进行更细致的分析，主要结果如图4-12所示。2形状因子是根据目标形状的周长及其面积定义的，其计算公式为4πA/P，其中A为面积，P为周长，如图4-12B所示。当目标形状更倾向于饱满的圆形时，其形状因子会更倾向于1；当目标形状倾向于不规则的纺锤状时，其形状因子则会倾向于0。由于小神经胶质细胞在监视状态时会呈现出一种规则的分支状，即拥有10µm左右的细胞体和不规则的细、长、曲的细胞突起，因此形状因子会倾向于0。但当小神经胶质细胞被活化后，其形状的改变是巨大的，通常会有多种变形的形状，如图2-8A所示。相较于监视状态，这种活化后的状态会导致其形状因子更倾向于1，因此，我们使用FIJI，随机选择细胞，统计在不同疼痛程度的小鼠脊髓中小神经胶质细胞的周长及面积，获得图4-12A和C展示的结果。从图中统计的结果及分别与图4-6至4-10所展示的形态结果可见，小神经胶质细胞的形状因子在神经病理性疼痛严重的N2S2、N3S1及N4S0三组中，都有显著性的增加，而在N0S4及N1S3这两组中基本无变化，这与上述结果中展示的形态变化是一致的，同时计算出的形状因子也是与预期的结果一致。98 华中科技大学博士学位论文图4-12不同疼痛程度的小鼠脊髓L5段小神经胶质细胞形状因子随时间的变化。A，不同组的小神经胶质细胞形状因子的量化分析；B，形状因子图注解析；C，不同组间小神经胶质细胞形状因子的统计分析。所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure4-12ChangeofM/MsformfactorinthespinalcordofLumbar5fromdifferentmicewithdifferentpaingradealongwiththeCCIinjurytime.A,QuantitativedataofM/Msformfactorindifferentindicatedgroups.B,Diagramoftheparameterformfactor.C,StatisticsofM/Msformfactorbetweendifferentindicatedgroups.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001).小神经胶质细胞由胞体伸出的突起不仅是其形态上特殊的标志同时也是重要的功能组分。细胞突起的伸出和缩回以及左右摆动为实现小神经胶质细胞监视脑组织微环境做出了重要的贡献。我们通过计算不同疼痛程度的小鼠脊髓中小神经胶质细胞突起的平均长度来反应其形状的变化，得到图4-13所示的结果。99 华中科技大学博士学位论文图4-13小神经胶质细胞突起的平均长度随损伤后时间的变化情况。A，不同疼痛程度的小鼠中小神经胶质细胞突起的平均长度的变化；B，不同组中小神经胶质细胞突起的平均长度的统计分析。所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。Figure4-13ChangeofmeanlengthofM/MsprocessesafterCCIinjury.A,ChangeofmeanlengthofM/Msprocessesfrommiceindifferentpaingrade.B,StastaticsofmeanlengthofM/Msprocessesbetweendifferentgroups.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001).从图4-13A的量化结果可见，小神经胶质细胞突起的平均长度在对照组并没有检测到显著性改变，同时，随着疼痛程度的增加，在疼痛同侧的细胞突起长度显著性减少，并随着疼痛程度的增加，其下降的程度越大。但值得注意的是，其对侧也出现一定程度的下降，最终至损伤后第14天时，各组之间的长度差异缩小，并无显著性差异，如图4-13B所示。这些结果证实，小神经胶质细胞在神经病理性疼痛严重（N2S2、100 华中科技大学博士学位论文N3S1及N4S0组）的小鼠的疼痛发展过程中，在形状、面积及细胞突起的平均长度等均发生了显著性的变化，这些形态变化暗示着其功能的变化，且在不同疼痛程度中的差别说明小神经胶质细胞与神经病理性疼痛的发展密切相关。(3)小神经胶质细胞的运动速度随着疼痛程度的增加而降低接着，我们通过对长时程活体显微成像获得的时间序列进行小神经胶质细胞突起运动轨迹的追踪，得到如图4-14所示的细胞突起运动速度的比较。小神经胶质细胞的运动追踪方法如图2-10所示。小神经胶质细胞细胞突起的运动随着疼痛程度的增加而减慢。从图4-14A可见，相比对照组，轻度疼痛N1S3组在CCI损伤后的第二天就能够被检测到显著性的运动速度减缓的情况，由损伤前的1.701µm/min减慢为1.38µm/min，随后直至第十四天，始终保持着这个水平，最终回升至1.603µm/min，并且与其对侧脊髓中的小神经胶质细胞无明显差异。随着疼痛程度的增加，在疼痛程度为N2S2、N3S1及N4S0的小鼠中，也观察到小神经胶质细胞突起运动速度降低的现象，但与轻度疼痛程度的不同的是，这三组疼痛刺激同侧的小神经胶质细胞在损伤后初期开始减缓速度后，会持续减缓，并在损伤后第十四天均达到其最低值，分别由最初的1.914µm/min下降为1.278µm/min，由1.852µm/min下降为1.049µm/min，由2.143µm/min下降为1.133µm/min。另外，在这三组小鼠的疼痛刺激对侧，小神经胶质细胞的细胞突起运动速度有所波动，在重度疼痛的小鼠中，也观察到细胞突起运动速度减弱的情况，因此其与疼痛同侧的差异慢慢减少。这种疼痛同侧与疼痛对侧随着疼痛程度增加，相互影响的效果越强烈的现象不仅出现在细胞运动速度上，同时也出现在上述所有结果中。接着，通过图4-14B中的组件统计分析可见，中重度疼痛小鼠CCI损伤同侧的小神经胶质细胞的细胞突起运动速度在疼痛的发展过程中有明显的下降趋势，且相互之间没有显著性差异，但相对其对照组均有显著性降低。这种小神经胶质细胞突起运动速度降低的现象与这些疼痛组中小神经胶质细胞的形态变化尤其是细胞突起的长度减少有很大关联。另外，在疼痛的小鼠中观察到的小神经胶质细胞细胞突起运动速度减慢的现象也许与疼痛信号传递有关联，即此时小神经胶质细胞已经探测到环境中的变化因此减慢高速动态的突起，从而释放一些促炎因子如TNFα、IL-1β等加剧神经炎症的发生，同时释放一些趋化因子，如CCL2、CX3CL1等加强兴奋性101 华中科技大学博士学位论文突触的传递，从而促进神经病理性疼痛的发展。图4-14小神经胶质细胞突起的运动速度在神经病理性疼痛发展中的变化。A，不同程度疼痛发展过程中小神经胶质细胞突起运动速度的变化；B，不同组中小神经胶质细胞突起运动速度的统计分析。所有数据来自三次独立实验，每组6只小鼠。每一个点代表一个细胞胞体或者突起，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure4-14VelocitychangeofM/Msprocessesduringthedevelopmentofneuropathicpain.A,VelocitychangeofM/Msprocessesduringthepaindevelopmentofmicefromfifferentpaingrades.B,StatisticsofvelocitychangeofM/Msprocessesbetweenindicatedgroups.Datawerepooledfrom6miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Everydotrepresentsonesomataorprocesses.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001).由于在神经病理性疼痛的发展过程中及不同程度的神经疼痛中，小神经胶质细胞的形态、运动等行为表现发生了显著性的改变，因此，我们使用传统免疫荧光的方法对小神经胶质细胞的活化状态进行了分析，如图4-15所示。102 华中科技大学博士学位论文图4-15不同疼痛程度的小鼠脊髓中小神经胶质细胞F4/80的表达。A，不同组中小神经胶质细胞的F4/80表达情况。三角形所指为表达F4/80的小神经胶质细胞，比例尺，20µm。Figure4-15F4/80expressionomM/Msinspinalcordofmicefromdifferentpaingrade.A,F4/80expressiononM/Msindifferentindicatedgroups.TrianglepointedtothecellthatexpressedF4/80.Scalebar,20µm.小神经胶质细胞作为CNS中主要的巨噬细胞，也极易受外界环境或内部因素的调节被活化成不同的状态。F4/80作为主要的巨噬细胞活化标记物，也能表征小神经胶质细胞的活化状态。从图4-15A所示的免疫荧光结果可见，小神经胶质细胞的F4/80的表达随着疼痛程度的增加有增加的趋势。在对照组N0S0（无铬制肠线空白对照）中很难观察到表达F4/80的小神经胶质细胞，但在N2S2及N3S1组中均能检测到表达F4/80的小神经胶质细胞，在疼痛最严重小组N4S0组中，观察到大量的表达F4/80的小神经胶质细胞，且荧光强度也比另外几组更高，因此猜测其表达量更高，如图上三角形所指细胞处。另外，需要强调的是，活化的小神经胶质细胞参与了神经病理性疼痛的发展，但如何发挥具体的作用还有待进一步研究。103 华中科技大学博士学位论文4.4讨论针对本课题的研究目的以及方法，我们选择CCI损伤方式获得神经病理性疼痛模型。CCI损伤的神经病理性疼痛模型的造模关键点在于铬制肠线的结扎处理上。线圈结扎时不可太紧或过松，否则会引起后肢运动异常或不能诱发神经病理性疼痛。铬制肠线中的铬释放，会引起小鼠具有与人类类似的炎性疼痛相关的感觉。因此，使用铬制肠线进行的CCI损伤模型同时具有结扎后水肿造成的坐骨神经束缚性损伤以及化学元素释放产生的炎性损伤，与病人的真实情况更为接近。CCI损伤后的小鼠，疼痛长度会持续几周，这种长期的疼痛发展过程也为我们后续研究疼痛发展过程中的小神经胶质细胞的作用提供保障。为了实现对缺少肋骨支撑、且弯曲度很高的腰椎L5段脊髓小神经胶质细胞的脊髓活体显微成像，我们设计并改良了脊髓窗及成像台装置使其适用于广泛使用的蔡司双飞秒激光器多光子显微系统。另外，我们改良后的脊髓窗，不仅能满足没有支撑的腰椎脊髓的成像，同时也能实现其他脊髓段如胸椎段的成像。小神经胶质细胞在神经病理性疼痛的发展中扮演着重要的作用。尽管一些传统的免疫学手段或多或少地提供了小神经胶质细胞参与其中的证据，如分泌细胞因子促进炎症，表达趋化因子促进兴奋性冲动地传输等等，但小神经胶质细胞是何时参与整个疼痛的过程目前还不是很清楚。因此，通过活体显微成像实时动态地观察小神经胶质细胞在整个过程中的形态和行为变化，为揭示其何时开始参与神经病理性疼痛的发展，并在此过程中作用多久，提供更直观的信息。小神经胶质细胞作为一种固有免疫细胞，能够非常快速地做出反应，因此，我们对CCI损伤前后的两个星期内进行密集时间点成像，包括损伤之前的Pre，损伤后的day2、day3、day4、day5、day6、day7、day8、day9、day10、day14时间点。长时间连续地显微成像观察到小神经胶质细胞行为的显著性变化。CCI损伤作为神经病理性疼痛中最常见的一种模型，在制作时只对一侧大腿的坐骨神经进行铬制肠线结扎，因此另一侧脊髓L5段可以作为内置的对照存在，用于更精准地分析小神经胶质细胞的作用。另外，尽管我们通过活体显微成像观察到脊髓段不同侧中小神经胶质细胞的变化，我们仍然需要对这些小神经胶104 华中科技大学博士学位论文质细胞的表型及疼痛传递相关信号分子进行进一步分析，用于更准确地判断小神经胶质细胞所处状态及功能。4.5本章小结在本章中，我们使用CCI坐骨神经损伤的方式获得了神经病理性疼痛模型，并使用Von-Frey测试套件对其疼痛反应进行了测试，对疼痛效果进行评价。同时，我们详尽地阐述了小鼠脊髓窗的制作方法及其中的要点，并展示了这种窗口的设计图及实物图。通过不断的测试和改良，我们实现了对神经病理性疼痛小鼠腰椎L5段脊髓的长时程多时间点的显微成像观察，为揭示小神经胶质细胞在其中的作用提供可能。通过活体长时程显微成像对CCI损伤前后脊髓L5段损伤两侧的小神经胶质细胞的形态和行为进行监测，我们观察到，小神经胶质细胞在损伤后第2天就开始了显著的形态变化，而至疼痛损伤后的第14天，它们始终保持着此活化状态。在中度及重度疼痛小鼠中，它们由分支状转变为短细胞突起的变形虫样的活化状态；同时，小神经胶质细胞在单位体积的细胞数量也有所增加；另外这些细胞的细胞突起的运动速度相比对照组都有显著减弱的趋势。这些长时程活体显微成像观察到的小神经胶质细胞在不同程度疼痛的小鼠中的形态和行为变化，暗示着在中度及重度疼痛小鼠中，小神经胶质细胞已被活化，并正在进行信息物质的交流，因此出现细胞突起速度减少的现象。通过体外免疫荧光的结果，我们进一步确定在重度疼痛的小鼠脊髓L5段内，小神经胶质细胞能够被选择性地活化并参与疼痛的发展。这些结果同时揭示了小神经胶质细胞持续的活化状态与漫长的神经病理性疼痛发展密切相关，从而为疼痛的治疗和缓解提供新思路。105 华中科技大学博士学位论文5小鼠S1HL皮层中血红蛋白分布与神经病理性疼痛的关系5.1引言神经病理性疼痛的发生和发展涉及到刺激、外周神经的兴奋性传递、大脑后肢感觉皮层的感觉控制及最终产生痛觉整个过程。其中，大脑后肢感觉皮层S1HL的控制对于疼痛的发展至关重要。由于细胞的活动依赖于各种物质和能量的交换，而其中最重要的物料即氧气的输送和交换。因此，目标区域的血氧饱和度的情况，能反映此处的细胞活动的强弱。本章充分利用无无需标记的、高分辨的光声显微成像系统，对神经病理性疼痛小鼠大脑后肢感觉皮层的血氧饱和度进行活体监测，观察并比较不同疼痛程度的小鼠皮层中血氧饱和度的变化。通过同时扫描后肢感觉皮层区域两侧，并比较小鼠皮层两侧微血管血氧饱和度的分布是否有差别和规律，揭示后肢感觉皮层的细胞活动是否参与神经病理性疼痛的发展，为更完整地了解神经病理性疼痛提供新视野和新方向。5.2实验材料和方法5.2.1实验仪器光学分辨光声显微成像系统自制其他仪器参见4.2.15.2.2实验材料已完成脊髓窗安装并恢复一周的小鼠；CCI损伤手术所需材料参见4.2.2；成像装置参见第四章。5.2.3实验方法(1)后肢感觉皮层活体显微光声成像a)待成像的小鼠麻醉后，需要按照3.2.3所述的颅窗制备方法进行前序步骤，在暴露出完整颅骨后，对照脑图谱找到位于Bregma-0.22-1.62及Lateral1.12106 华中科技大学博士学位论文-1.92的后只感觉皮层区域，使用记号笔做标记；b)标记好后，使用颅钻开始对标记区域进行磨薄处理。磨薄处理时需要注意避免在一个位置进行长时间的打磨，及时使用PBS清理打磨下来的碎屑并降温，来回反复打磨至颅骨成完全透明时即可（判定方法：在颅骨干燥时未看到白色点状颅骨残留，滴加PBS或生理盐水能见到清晰血管区域）；c)磨薄后的小鼠使用颅骨固定装置固定好后，即可使用实验室自制的光学分辨光声显微成像系统进行成像，分别进行单波长的血管信息的收集及三波长的血氧饱和度信息的收集，此部分成像操作由宋贤林主导，魏剑霜协助完成；d)完成后的原始数据导出后，使用Matlab进行数据的处理，主要操作方法：随机选择目标区域中直径约15µm左右的血管，并计算随机区域中的均值进行后续统计分析。5.3实验结果5.3.1活体光声显微成像监测疼痛小鼠S1HL皮层中总血红蛋白的分布在CCI损伤后的小鼠中，随着坐骨神经上铬制肠线结扎的数目增多、时间加长等，外周神经向大脑皮层冲动的传递都会因此受到影响，最终产生小鼠的不同的痛觉，即反应在后爪对不同刺激的敏感程度上。血管中血氧蛋白的分布和含量能够反应所处环境的活跃情况，基于此，我们使用光声显微成像系统对不同疼痛程度的小鼠后肢感觉皮层S1HL进行血红蛋白的成像，分析血氧蛋白的分布与疼痛程度的关系，从而更清楚地了解神经病理性疼痛的机制。首先，我们使用单波长激发目标区域，获得总血红蛋白的浓度，得到血管的信息，如图5-1所示。107 华中科技大学博士学位论文图5-1不同程度疼痛的小鼠后肢感觉皮层双侧血管的血红蛋白信号。A，不同疼痛程度的小鼠后肢感觉皮层双侧血管的血红蛋白信号及放大图，比例尺,20µm和2µm。Ipsilateral为坐骨神经结扎同侧，contralateral为坐骨神经结扎对侧。Figure5-1HemoglobinsignalofvesselsinSIHLcortexfrommicewithdifferentpaingrade.A,HemoglobinofmicrovesselinSIHLcortexfrommicewithdifferentpaingradeandmagnification.Scalebar,20µmand2µm.IpsilateralrepresentedthesideCCIinjuried,contralateralreferredtotheotherside.理论上，小鼠外周神经至大脑皮层的投射是交叉的，因此在小鼠神经刺激的同侧应在皮层的对侧产生投射，但皮层之间也不是绝对独立的。从图5-1大图所示的结果可见，在对照及轻度损伤的N0S4及N1S3组中，无论是损伤同侧或是对侧的皮层毛细血管中，血红蛋白的信号均很弱；但在中重度疼痛N2S2、N4S0组中，血管中血红蛋白明显更强，且从肉眼可见，在N4S0小组中，血管的信号最强。因此说明，后肢感觉皮层的两侧可能在疼痛的调控中有某种程度的相互联系，而不是完全独立的。接着，我们从大图中随机选择十五个如图5-1中方框放大位置所示的毛细血管进行血红蛋白信号强度的量化分析，得到如图5-2所示的结果。108 华中科技大学博士学位论文图5-2疼痛小鼠后肢感觉皮层的血红蛋白统计分析。PAamplitude，血红蛋白信号。所有数据来自三次独立实验，每组3-5只小鼠。每一个点代表微血管中的一个小区域，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，**表示P<0.01，****表示P<0.0001。Figure5-2StasticsofhemoglobininmicrovesselofSIHLcortexfrompainmice.PAamplitude,signalfromhemoglobin.Datawerepooledfrom3-5miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Everydotrepresentsoneregioninmicrovessel.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(**P<0.01,****P<0.0001).通过统计学分析可见，小鼠后肢感觉皮层两侧的血管血红蛋白信号随着疼痛程度的增加的变化并无显著性差别。如图5-12所示，在轻度疼痛小鼠SIHL皮层的毛细血管血红蛋白信号与对照组并无显著性差别，随着小鼠疼痛程度的增加，皮层毛细血管血红蛋白的型号有增强的趋势，到重度疼痛小鼠中，皮层毛细血管血红蛋白信号达到最大值，是对照组的2.27倍。由于毛细血管网络是物质交换的重要场所，养料和氧气在这里得到供给，二氧化碳和代谢废物也通过毛细血管网络进行回收。在疼痛的小鼠皮层毛细血管中观察到的强的血红蛋白信号暗示了，此时的微环境中的细胞活动非常活跃，因此需要大量的物质交换进行支撑。5.3.2活体光声显微成像监测疼痛小鼠S1HL皮层中血氧饱和度的分布由于上述图5-1和5-2的结果是来源于单波长激发的全血血红蛋白的结果，只展示了血管的信息，并未反应血红蛋白的含氧情况，因此还不能更真实地反应此时血管周围环境所进行的活动，为此，我们使用三种波长的光激发，以期获得血氧饱和度的值，从而更准确地描述S1HL皮层中血氧饱和度与疼痛的关系，得到的结果如图5-3及5-4所示。109 华中科技大学博士学位论文图5-3不同疼痛小鼠后肢感觉皮层血管血氧饱和度的分布。A，不同疼痛小鼠双侧后肢感觉皮层血管血氧饱和度的分布，比例尺，3µm。Ipsilateral为坐骨神经结扎同侧，contralateral为坐骨神经结扎对侧。Figure5-3DistributionofoxygensaturationinS1HLcortexofmicewithdifferentgradepain.A，DistributionofoxygensaturationinbilateralS1HLcortexofmicewithdifferentgradepain.IpsilateralrepresentedthesideCCIinjuried,contralateralreferredtotheotherside.图5-3展示的是疼痛小鼠后肢感觉皮层的血氧饱和度的分布。从结果中可见在对照组N0S4中，单根血管中有明显的高血氧饱和度区域及低血氧饱和度区域，最高为1.2左右；随着疼痛程度的增加，到N2S2组的时候可见，双侧后肢感觉皮层的血管血氧饱和度明显增高，且不少区域已达到饱和；至N4S0组的时候可见，在疼痛损伤同侧皮层的血管中，血氧饱和度的分布与对照组很类似，但在对侧的皮层血管中，可见明显高于同侧及对照组的血管血氧饱和度。接着，我们进一步对上图的结果进行量化分析，得到如图5-4所示的结果。110 华中科技大学博士学位论文图5-4疼痛小鼠后肢感觉皮层血管血氧饱和度的统计分析。所有数据来自三次独立实验，每组3只小鼠。每一个点代表血管中的一个小区域，数据展示为平均值±标准误。图中星标，NS表示P>0.05，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Figure5-4StatisticsofoxygensaturationinS1HLcortexofmicewithdifferentgradepain.Datawerepooledfrom3miceineachgroupfromthreeindependentexperiments.Everydotrepresentsoneregioninmicrovessel.Statisticaldatawerepresentedwithmean±SEM.Pvalueslessthan0.05wereconsideredasstatisticallysignificant(***P<0.001,****P<0.0001).从图5-4所示的统计结果可见，后肢感觉皮层的血氧饱和度随着疼痛程度的增加有一定的增加，在N2S2组中，血氧饱和度明显升高，且在疼痛刺激同侧与对侧中没有差别，说明在这一组中，小鼠后肢感觉皮层两侧的细胞可能均正在进行耗氧量多的活动，参与疼痛的调控；而在N4S0组中，疼痛刺激对侧的后肢感觉皮层血管中的血氧饱和度相比同侧明显更高，且与N2S2组对侧无差异，说明在该组中，疼痛对侧的细胞活动更活跃，且控制着疼痛的发生。随着疼痛程度的增加，血管中血红蛋白的信号会增加，除此之外，血氧饱和度的分布结果说明，在疼痛小鼠中后肢感觉皮层的血氧饱和度更高，暗示着其活跃的生理活动参与了神经病理性疼痛的调控。综上所述，总血红蛋白的光声成像结果能够提供血管的信息，从信号强度能比较出血管中血红蛋白的含量差别，但只有结合三波长激发的血氧饱和度的成像，才能更准确的区分含氧血红蛋白的比例，因此更有生物学价值。111 华中科技大学博士学位论文5.4讨论通过无需标记的光声显微成像系统，我们能轻松实现血管血红蛋白的成像。毛细血管网作为重要的物质交换、氧料转运的场所，为神经元之间信号传递、小神经胶质细胞信息传递等提供物质基础和结构基础。血管中血红蛋白尤其是含氧血红蛋白的比例能够为判断此血管周边微环境中的活动情况作出参考。神经病理性疼痛的感觉主要是经外周神经投射到大脑皮层中后肢感觉皮层后产生的，因此，通过监测不同疼痛程度的小鼠后肢感觉皮层中血氧饱和度，能够比较出后肢感觉皮层活动与神经病理性的疼痛程度之间的关系，为更深入地了解神经病理性疼痛整个过程提供新思路。另外，由于外周神经向大脑皮层上的投射是交叉的，因此，我们通过比较CCI损伤同侧及对侧的后肢感觉皮层中血氧饱和度的变化能跟真实地反应其中的可能事件。5.5本章小节本章通过活体光声显微成像对神经病理性疼痛小鼠后肢感觉皮层血红蛋白的信号进行探测，通过比较小鼠后肢感觉皮层两侧及不同疼痛程度的小鼠皮层发现，疼痛小鼠的皮层微血管血氧饱和度更高。这种皮层中血氧饱和度的变化与疼痛程度的严重性成一定正相关的现象暗示，在疼痛小鼠后肢感觉皮层周围正在进行活跃的细胞活动或信号传递等需要大量氧分的运动，为产生相应的痛觉进行调控。112 华中科技大学博士学位论文6总结与展望6.1主要研究结果小神经胶质细胞作为主要的免疫细胞在CNS中发挥着多重作用，它们的形态和动态行为是其在不同生理条件下行使不同功能的直观反映。当大脑受到恶性程度高的黑色素瘤细胞侵入或机体产生神经病理性疼痛时，以及在整个疾病的漫长发展过程中，小神经胶质细胞在其中的分化状态和功能并不清楚。因此本文主要通过活体显微成像的方法分别对在黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛的发展过程中的小神经胶质细胞进行监测，从而描述其在活体内行为的动态变化规律，并结合其他方法揭示其在这两种疾病中的作用。本文的主要研究成果如下所示：(1)成功建立了黑色素瘤脑转移模型，并通过双侧颅窗长时程活体显微成像监测到小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移发展过程中活化的动态变化，且至黑色素瘤接种后的第21天，活化程度最高。随着黑色素瘤脑转移的发展，转移灶周围浸润了大量的小神经胶质细胞，这些细胞的形态由典型的分支状转变为变形虫样，并表现出一种快速但受限的运动状态。(2)通过一系列传统生物学方法，并结合活体显微成像的数据，我们发现小神经胶质细胞表达的MMP3在促进黑色素瘤脑转移灶的发展中具有重要作用。随着黑色素瘤脑转移的发展，小神经胶质细胞表达的MMP3持续增加，不仅影响其自身的活化状态，同时影响紧密连接蛋白ZO-1表达的下调，导致BBB完整性的破坏。因此，活化的小神经胶质细胞通过表达MMP3，促进了黑色素瘤脑转移的发展。(3)使用坐骨神经CCI损伤模拟不同疼痛程度的小鼠，并通过自制的脊髓窗窗口，对小鼠L5段脊髓进行长时程活体显微成像，监测小神经胶质细胞在其中的动态变化，成功观察到小鼠在中度及重度疼痛损伤前后，脊髓中小神经胶质细胞能够快速地发生分布、形态及行为等的改变，并持续保持着此活化状态，说明小神经胶质细胞快速并长久地参与了不同程度神经病理性疼痛的发展。113 华中科技大学博士学位论文(4)另外，通过活体显微光声成像监测后肢感觉皮层中微血管血氧饱和度的变化，检测到，随着疼痛程度的加剧，后肢感觉皮层中血管的血氧饱和度明显更高，这些结果说明后肢感觉皮层周围的细胞正在进行活跃的物质交换或者信息传递，并以此参与疼痛感觉的传递和调控。6.2主要创新点本文的创新点主要有两点：(1)小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移中所扮演的角色并不清晰，针对这一有争议的问题，通过长时程活体显微成像与传统生物学方法相结合，揭示了小神经胶质细胞在黑色素瘤脑转移中的作用，并对其发挥功能的机制做了一定程度的探索。我们发现，小神经胶质细胞表达的MMP3不仅可以影响自身的活化状态（形态、运动及分布），而且能够破坏血脑屏障的完整性，从而促进黑色素瘤脑转移的发展。(2)为了探究小神经胶质细胞是何时参与神经病理性疼痛的调控，且是否参与了不同程度的疼痛发展，使用长时程活体脊髓显微成像我们发现，中重度疼痛小鼠中，脊髓中的小神经胶质细胞在疼痛刺激后第2天就被大量活化，同时表现出一定的形态、运动及分布规律，持续的活化状态伴随着疼痛的长期发展。此外，我们还发现，小鼠后肢感觉皮层的血氧饱和度与疼痛程度成正相关。6.3展望本论文主要以小神经胶质细胞为研究对象，通过活体显微光学成像，探究其在黑色素瘤脑转移及神经病理性疼痛过程中的作用。在黑色素瘤脑转移的发展过程中，小神经胶质细胞通过分泌MMP3，影响其活化状态包括形态、运动和分布的动态变化，同时影响脑组织中紧密连接蛋白的表达，从而促进黑色素瘤脑转移的发展。在神经病理性疼痛的发展过程中，小神经胶质细胞在疼痛损伤后2天已开始活化，且在损伤后的14天，持续保持着此活化状态。另外，通过活体光声显微成像发现，小鼠后肢感觉皮层的细胞活动影响了疼痛的发展。尽管已获得了以上结果，但是其中仍然有一些问题值得进一步探讨：114 华中科技大学博士学位论文(1)小神经胶质细胞作为CNS中的巨噬细胞，可塑性极强。因此，在黑色素瘤发展的不同阶段，所发挥的作用也不尽相同，如在黑色素瘤细胞刚入侵阶段，可能会对肿瘤细胞进行杀伤从而发挥着保护脑组织的作用，但随着时间的延长和微环境的改变，它们会相应的活化，并发挥促进肿瘤生长的作用。因此为了更清楚小神经胶质细胞在其中的功能，有必要对其在黑色素瘤转移发展的不同时期中发生的各种变化进行更详尽的研究。(2)小神经胶质细胞MMP3表达的机制是如何，在此处并未进行证实，这对更深入地了解其机理有重要作用。另外，由于MMP的抑制是通过广谱抑制实现的，如果能够使用转基因鼠或基因敲除的方法更直接地研究小神经胶质细胞分泌的MMP3在黑色素瘤脑转移形成中的作用，那么对黑色素瘤脑转移的治疗有很重大的参考价值。(3)在神经病理性疼痛的发展过程中，尽管观察到小神经胶质细胞一系列的行为变化，但是探究这些成像所观察到的变化是否具有一定的生物学意义，如是否能与在神经病理性疼痛发展中其对应的功能或正在进行的某个事件相结合，才能更深入地揭示小神经胶质细胞在其中的作用。(4)最后，尽管通过光声显微成像观察到了一些现象，但如进一步通过活体显微成像，并结合一些分子的标记，更详尽地展示皮层中正在发生的细胞活动，则更能展示小神经胶质细胞在皮层控制神经病理性疼痛中的作用。115 华中科技大学博士学位论文致谢又是一年栀子花开，转眼间，我已经来实验室7个年头了。在这不多不少奋斗的年岁里，我的人生也逐渐丰满。如果说博士生涯的结束是另一段生命旅程的开始，我想在这即将开始的下段旅程之前，真诚地感谢这些年出现在我生命的每一个人。首先，我要感谢我的导师张智红教授。对于我来说，张老师是一位可亲可敬的好老师。作为一位老师，无论是灯火阑珊的夜晚亦或是阖家欢乐的节假日，如果没有意外，你总能在实验室的某个角落看到她孜孜不倦的身影，她的勤奋和努力永远是我的榜样。作为一位母亲，尽管工作辛苦，时间紧迫，但从她只言片语的分享中可以看到，她教育的孩子会比她更优秀更值得人尊敬，这为同样是女性的我提供了一个很好的工作生活两不误的范本。作为一名导师，即使精力有限，但她还是能做到关心组内每一个人的课题进展和走向，同时作为一名长辈，经常将她的经历和感悟分享给我们，让我们少走弯路。感谢张老师对我的指导和帮助，我相信在未来的某个日子里，这种感谢会忽然更加猛烈而不可名状的袭来。接着，我要感谢骆清铭教授、曾绍群教授和龚辉教授，正是他们的带领，为我们创造了实验室优越的实验条件和活跃的科研氛围。尽管我没有接受他们直接的指导，但他们严谨、专注、一丝不苟的工作作风让我受益匪浅。另外，我要感谢实验室的朱丹教授、付玲教授，这两位集美貌与才能于一身的女老师，让我不可望其项背；我还要感谢实验室的施华老师，她周全的处事态度和方法也让我受益良多。最后，我还要感谢实验室其他各位老师，感谢他们对我学习和生活的指导和帮助。感谢动物房的顾阿姨、陈阿姨等各位叔叔阿姨，感谢生化平台的冯姐，感谢成像平台的杨林芳老师，感谢平台管理者刘秀丽老师，正是他们的默默付出和辛勤劳作，才能保证我们实验的顺利进行。感谢已经毕业的郑英师姐、骆美洁师姐、刘顺师兄、杨飞师兄和黄川师兄，感谢他们对我生活和科研的关心和帮助，让我收获实验技能的同时体会到师兄师姐们的关爱。感谢周丽丽同学的出现，让我收获一枚挚友，希望余生多多指教。感谢周展飞老师对实验室各种事务的管理，为我们创造了更多便利。感116 华中科技大学博士学位论文谢林巧雅师姐，你动听的歌声和专业的科研水平，也让我惊讶和感叹。感谢祁淑红师姐，你的果敢和付出让实验室变得井然有序。感谢许国强同志，让我在今后每一次歌唱同桌的你时，就会想起你，你超强的人际网和忍耐力让我折服。感谢与我并肩前行的同窗们，善良而又固执的刘磊、和气而又自信的卢利森和文艺而成熟的刘征，正是你们的陪伴，让我一路走来欢声笑语，不曾孤单。感谢戴艳峰，跟我们一起熬夜做实验；感谢余祥、韩晨露对细胞间的管理，感谢小组长代博雷和郑好，感谢胡佳红师妹接了我的盘，感谢李瑞雪师妹陪我一起吃啊吃，感谢黄松林、邓得强、范展、陈璐、魏剑霜、徐梦丽、陈宇宙、伍柳娟、包硕桢等师弟师妹对我的帮助。我还要感谢李浩红老师组的崔玉婷、黄鹏程，杨孝全老师组的宋贤林，感谢你们对我实验上的协助；感谢朱丹老师组的俞婷婷和赵延洁，感谢曾绍群老师组的王小俊，感谢龚辉老师组的龙犇、任淼和周灿，感谢付玲老师组的王家福，感谢张玉慧老师组的孙佩、韩玉冰，感谢实验室所有的同学们，认识你们我很高兴。另外，还要感谢澳大利亚阿德莱德大学的MarkHutchinson教授和VickyStaikopoulos，感谢你们对我科研的指导和帮助。我还要感谢我的家人，感谢我的父母对我的养育之恩，谢谢他们始终支持我的选择，并永远站在我的角度替我考虑问题，感谢我的公公婆婆，感谢他们这几年对我的关爱，给我做各种好吃的，满足我这个“好吃懒做”的媳妇，我希望未来的日子你们都能少点担忧，好好享受生活，我们都长大了，以后便是你们的依靠。最后，我要感谢我的队友、朋友、恋人、丈夫，钱源同志，感谢你这么多年对我的鼓励、关心和宠爱，让我即使头顶午夜的寂寥和黑暗，也无所畏惧，迎接即将而来的破晓，希望我们能不忘初心，就这样一直走下去。最后的最后，我要感谢所有出现在我生命中的每一个个体，每一种情绪，每一回挫折，每一次欣喜，每一个小幸运，我真心地喜欢并享受着这一切。乔莎2018年4月9日于武汉光电国家实验室G304117 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