基于高通量测序技术的贵州省地中海贫血分子流行病学特征分析

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中图法分类号：R725学校代码：10661学号：2015195密级：公开硕士学位论文（专业型学位）基于高通量测序技术的贵州省地中海贫血分子流行病学特征分析EpidemiologicalAnalysisofThalassemiainGuizhouProvincebyNext-generationsequencing姓名：杨宇航专业：儿科学研究方向：血液肿瘤导师：陈艳培养单位：遵义医学院2018年05月 遵义医学院硕士学位论文杨宇航 遵义医学院硕士学位论文杨宇航目录论文基于高通量测序技术的贵州省地中海贫血分子流行病学特征分析中英缩略词对照表…………………………………………1中文摘要……………………………………………………2英文摘要……………………………………………………5第一部分贵州省地中海贫血基因携带率调查……………8前言…………………………………………………………8材料与方法…………………………………………………9结果…………………………………………………………10讨论…………………………………………………………18结论…………………………………………………………22第二部分高通量测序与传统地贫检测方法的比较及地贫基因携带人群血液学特征分析…………………………………23前言…………………………………………………………23材料与方法…………………………………………………24结果…………………………………………………………26讨论…………………………………………………………33结论………………………………………………………36 遵义医学院硕士学位论文杨宇航全文总结……………………………………………………37参考文献……………………………………………………38综述……………………………………………………………43致谢……………………………………………………………52作者简介………………………………………………………53 遵义医学院硕士学位论文杨宇航中英文缩略词表缩略词英文全称中文全称EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EPOErythropoietin促红细胞生成素Gap-PCRGappolymerasechainreaction跨越断裂点PCRHbHemoglobin血红蛋白HbAHemoglobinA血红蛋白AHbA2HemoglobinA2血红蛋白A2HbFHemoglobinF血红蛋白FIVSInterveningsequences插入序列（内含子）MCVMeancellhemoglobin平均红细胞体积MeancorpuscularhemoglobinMCH平均红细胞血红蛋白量concentrationNGSNext-generationsequencing高通量测序技术RBCRedbloodcellcount红细胞计数RDBReversedotblot反向点杂交法1 遵义医学院硕士学位论文杨宇航基于高通量测序技术的贵州省地中海贫血分子流行病学特征分析中文摘要目的：了解地中海贫血在贵州范围内的基因携带率、突变类型及其频率，构建出较详细的贵州省珠蛋基因簇图谱，该举措可以为降低贵州省珠蛋白生成障碍性贫血（也称为地中海贫血）症患儿的出生率提供理论依据。方法：研究采用随机的方式从贵州省8个区域中，每个区域分别随机选取1-2个有代表性的县（市）进行地中海贫血流行病学调查。收集受试者的相关资料（籍贯、民族、年龄以及性别等）。并对参与调查研究的对象进行采血取样（外周静脉血6-7ml，EDTA抗凝）。采集的样本进行血常规、血红蛋白电泳分析。通过高通量测序技术进行地贫基因检测并与传统地贫筛检法进行比较。所有数据资料经整理后，数据处理采用SPSS18.0软件进行统计分析。对采集来的数据进行处理之后，对于其中的计量资料以最大值、最小值以及均数±标准差（）等表示；计数资料用频数分布、构成比、相对比及率等来描述，并采用χ2检验来进行率的比较。以非参数检验法或单因素方差分析法来进行样本均数间的比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。结果：1.来自贵州省8个地区的7866例受检者中,包括汉族、侗族、苗族、布依族、水族、土家族、瑶族、仡佬族、壮族等14个民族，检出地贫基因携带者868例（占11.03%）；其中α-地中海贫血583例（占7.41%）,β-地中海贫血254例（占3.23%），α复合β地中海贫血31例（占0.39%）。2.各地区中，遵义地区基因携带率为7.56%（162/2144），六盘水地区基因携带率为7.46%（51/684），黔东南地区基因携带率为13.60%（449/3301），黔南地区基因携带率为18.56%（90/485），铜仁地区基因携带率为8.56%（65/759），黔西南地区基因携带率为10.33%（28/271），贵阳地区基因携带率为8.33%（9/108），毕节地区基因携带率为12.28%（14/114）。2 遵义医学院硕士学位论文杨宇航3.在各民族中，布依族地贫基因携带率为18.47%，苗族基因携带率为15.73%，水族的基因携带率为11.21%，瑶族的基因携带率为16.88%，仡佬族的基因携带率为14.86%，壮族的基因携带率为17.82%，土家族的基因携带率为11.74%，侗族的基因携带率为13.56%，汉族的基因携带率为8.31%。4.583例α-地贫中缺失型425例，占72.90%；非缺失型78例，占13.38%；缺失型合并非缺失型6例，占1.03%；缺失型中以--SEA/αα，-α3.7/αα，-α4.2/αα三种基因型常见，构成比分别为38.09%、21.78%、10.98%，而非缺失型基因型中以HbCS、HbWestmead常见；少见的基因型包括c.95+9C>T/N、c.96-9T>C/N等，另外还检测出74例α-三联体，占所有α-地贫的12.69%。β-地中海贫血中共检出11种突变类型,最多见的4种基因型是：CD41-42、CD17、IVS-2-654、-28，此4种突变型占全部β突变基因的91.36%。α复合β型地中海贫血中αα/-α3.7合并CD41-42最为多见，占α复合β地贫的29.03%。5.与高通量测序技术相比较，传统筛检法可检测出地贫704例，其检出率为8.95%（704/7866），漏诊率为2.08%（164/7866）；在583例α-地贫中，传统方法可检出其中437例，漏诊25.04％（146/583），而285例β-地贫及α复合β地贫中，传统方法可检出其中267例，漏诊6.32%（18/285）。结论：1.贵州省地中海贫血基因的携带率是11.03%，其中α-地贫的基因携带率是7.41%，β-地贫的基因携带率为3.23%，α复合β地贫基因携带率为0.39%。2.α-地贫中以缺失型较为多见，其中最常见的基因型为--SEA/αα；β-地贫中最常见基因型为CD41-42（-TCTT）；α复合β地贫以αα/-α3.7合并CD41-42(-CTTT)杂合较为多见。3.汉族的地贫基因携带率低于少数民族，而少数民族中以壮族、苗族、瑶族及布依族基因携带率较高。4.黔南及黔东南地区的地贫基因携带率较高；而遵义、铜仁及六盘水地区的地贫基因携带率较低。5.贵州地区人群α-三联体的携带率为0.94%，主要包括αααanti4.2和αααanti3.7两种类型。3 遵义医学院硕士学位论文杨宇航6.传统的地贫筛检方法漏诊率为2.08%，直接通过高通量测序技术进行地贫检测可减少地贫的漏诊率。7.贵州地区地贫基因携带者血液学参数并不完全符合小细胞低色素性。关键词：地中海贫血；高通量测序技术；携带率；贵州省4 遵义医学院硕士学位论文杨宇航EpidemiologicalAnalysisofThalassemiainGuizhouProvincebyNext-generationsequencingAbstractObjective：Understandingthegenecarryingrate,typesofmutationsandfrequencyofthalassemiainGuizhou,andconstructingamoredetailedmapofgeneclustersinGuizhouprovince,thismeasurecanbeusedtoreduceglobinproductionanemia(alsoknownasMediterraneantype)inGuizhouProvince.Thebirthrateofchildrenwithanemiahasprovidedatheoreticalbasis.Methods：Thestudyrandomlyselected1-2representativecounties(cities)fromeightregionsofGuizhouProvinceforepidemiologicalinvestigationofthalassemiainGuizhouProvince.Collecttherelevantinformationofthesubject(originality,ethnicity,age,gender,etc.).Bloodsamplingwasperformedonsubjectswhoparticipatedinthestudy(6-7mlofperipheralvenousbloodandEDTAanticoagulation).Thecollectedsampleswereanalyzedbybloodroutineandhemoglobinelectrophoresis.ThalassemiagenedetectionwasperformedbyNext-generationsequencingtechnologyandcomparedwithtraditionalindipinescreeningmethods.Afterallthedatadatawascompiled,dataprocessingwasperformedusingSPSS18.0softwareforstatisticalanalysis.Afterthecollecteddataisprocessed,themeasurementdataisrepresentedbythemaximumvalue,theminimumvalue,andthemean±standarddeviation(),etc.;thecountdataisbasedonthefrequencydistribution,compositionratio,relativeratio,andrate,etc.Describeanduseχ2testtocomparerates.Non-parametrictestorone-wayanalysisofvariancewasusedtocomparethemeanofthesamples.ThedifferencewasstatisticallysignificantatP<0.05.Results：5 遵义医学院硕士学位论文杨宇航1.Amongthe7866subjectsfrom8regionsofGuizhouProvince,14ethnicgroups,includingHan,Yi,Miao,Buyi,Shui,Tujia,Yao,Yi,Zhuang,etc.868cases(11.03%)ofthalassemia;583cases(7.41%)ofα-thalassemia,254cases(3.23%)ofβ-thalassemia,and31cases(0.39%)ofαcomplexβthalassemia.2.Ineachregion,thegenecarryingrateinZunyiareawas7.56%(162/2144),thegenecarryingrateinLiupanshuiareawas7.46%(51/684),andthegenecarryingrateinsoutheasternYunnanwas13.60%(449/3301).Thegenecarryingratewas18.56%(90/485)inthesouthernregion,8.56%(65/759)intheTongrenregion,10.33%(28/271)inthesouthwestGuizhou,and8.33intheGuiyangregion.%(9/108),thegenecarryingrateinBijiePrefecturewas12.28%(14/114).3.Amongtheethnicgroups,thegeneticcarryingrateoftheBuyiis18.47%,thegenecarryingrateoftheMiaois15.73%,thegeneticcarryingrateoftheShuiis11.21%,thecarryingrateoftheYaois16.88%,andthegenecarryingrateoftheYiisFor14.86%,thegeneticcarryingrateoftheZhuangis17.82%,thecarryingrateoftheTujiasis11.74%,thecarryingrateoftheYiis13.56%,andthecarryingrateoftheHanis8.31%.4.Amongthe583casesofα-thalassemia,425weredeletions,accountingfor72.90%;78werenon-deletions,accountingfor13.38%;6weredeletionsandnon-deletions,accountingfor1.03%;and-SEA/ααwereabsent.,-α3.7/αα,-α4.2/ααthreegenotypeswerecommon,thecompositionratiowas38.09%,21.78%,10.88%,respectively,whilenon-deletedgenotypeswerecommonwithHbCS,HbWestmead;rareGenotypesincludedc.95+9C>T/N,c.96-9T>C/N,and74casesofα-triplexes,accountingfor12.69%ofallα-thalassemia.Therewere11typesofmutationsdetectedinβ-thalassemia,andthemostcommon4typeswere:CD41-42,CD17,IVS-2-654,and-28,andthese4mutationsaccountedfor91.36%ofallβmutations.αα/-α3.7complexCD41-42werethemostcommoninαcomplexβ-thalassemia,accountingfor29.03%ofα-complexβ-thalassemia.5.ComparedwithNext-generationsequencingtechnology,thetraditionalscreeningmethodcandetect704casesofthalassemia,thedetectionrateis8.95%(704/7866),themisseddiagnosisrateis2.08%(164/7866);in583casesInthecaseofα-thalassemia,437casesweredetectedbythetraditionalmethod,andmisseddiagnosiswas25.04%(146/583).6 遵义医学院硕士学位论文杨宇航Ofthe285casesofβ-thalassemiaandαcomplexβ-thalassaemia,267casesweredetectedbytraditionalmethods,and6.32weremissed.%(18/285).Conclusion：1.ThecarrierrateofthalassemiageneinGuizhouProvinceis11.03%,ofwhichthegenecarrierrateofα-thalassemiais7.41%,thegenecarrierrateofβ-thalassaemiais3.23%,andthecarrierrateofαcomplexβ-thalassemiais0.39%..2.Deletiontypeismorecommoninα-thalassemia,themostcommongenotypeis--SEA/αα;themostcommongenotypeβ-thalassaemiaisCD41-42(-TCTT);αcomplexβ-thalassaemiaThecombinationofCD41-42(-CTTT)withαα/-α3.7ismorecommon.3.ThegenecarryingrateofthethalassemiaoftheHannationalityislowerthanthatofethnicminorities,whilethegenecarryingrateoftheZhuang,Miao,YaoandBuyigroupsisrelativelyhigh.4.ThecarryingrateofthethalassemiageneisrelativelyhighinsouthernFujianandsoutheasternGuizhou,whilethegeneticcarryingrateofthalassaemiaislowinZunyi,TongrenandLiupanshui.5.Thecarryingrateofα-triplexinthepopulationinGuizhouis0.94%,mainlyincludingtwotypesofαααanti4.2andαααanti3.7.6.Therateofmisseddiagnosisofthetraditionalmethodofscreeningforthepooris2.08%.DirectdetectionofthalassaemiabyNext-generationsequencingtechnologycanreducetherateofmisseddiagnosisofthalassemia.7.ThehematologicalparametersofthethalassemiagenecarriersinGuizhouarenotcompletelyconsistentwiththehypochromicityofsmallcells.Keywords:Thalassemia;Next-generationsequencingtechnology;carryingrate;GuizhouProvince7 遵义医学院硕士学位论文杨宇航第一部分贵州省地中海贫血基因携带率调查前言地中海贫血是遗传性血液系统疾病的一种，是由于患者体内所应该具有的珠蛋白基因存在异常（缺失或突变），使得患者体内血红蛋白链的合成失衡，其生成的红细胞不稳定，发生破坏而最终导致的慢性溶血性贫血。根据珠蛋白基因缺失或点突变的不同而导致肽链合成障碍的不同，通常将地中海贫血分为α、β、δβ、γ等几种类型，其中以α-地中海贫血和β-地中海贫血较为常见。此病的根本病理（生物学原因）是由于患有该病的病人基因中珠蛋白序列异常，造成珠蛋白肽链合成量比例失衡,可引起红细胞形态改变,导致红细胞破坏加速,主要表现为红细胞体积较小和寿命缩短。该疾病中，由于具体不同肽链的基因缺陷不同，分成几个不同的类型，而不同类型的基因缺陷导致患者不同的临床表现，并影响其治疗效果及预后[1-2]，其中重型地中海贫血严重影响患者的生活质量甚至生命，给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。但是如今仍然缺乏行之有效的治疗手段。主要依靠规范性长期输血和去铁治疗,输血联合铁螯合剂的治疗是目前国际上达成共识的治疗手段[3-4]。而根治地贫目前最要效的方法就是造血干细胞移植。但是由于移植物抗宿主病和其他的感染因素，部分患者依然受到死亡的威胁[5]。患者仍会受到术前骨髓预处理不彻底、术后自身免疫所引起的排斥反应等方面的风险。同时移植时间也有很大的局限性，错过了2-6岁的佳移植期将无法获得较好的长期存活率[5]。虽然可以根治地贫，但是其巨大的风险与巨额的治疗费用还是让许多患者望而却步。因此，有必要开展高发地区地中海贫血的筛查工作，为国家或地区制定地贫的防治政策提供科学依据，降低重型地中海贫血患儿的出生率。我国在20世纪80年曾进行了一次大范围的地中海贫血筛查工作，当时针对60万人（分属于20多个不同的省及自治区）开展此项调查工作。当时的调查结果显示该病的患病率为3.62％，而其中α-地贫与β-地贫的检出率分别为2.95％和0.67％[6]，根据此次调查结果发现南方的几个省市是该病的多发区，如：海南、重庆、湖南、江西及广东、广西等省市。另外，各地报道的地中海贫血基因缺陷率为2.5％～20％[7-11]，具有较大的地域性。其中以广东、广西发病率最高，分别为10%和20%。贵州地区在地理上与云南、广西、湖南等我国地中海贫血高发区相隔较近，并且聚居着瑶族、8 遵义医学院硕士学位论文杨宇航苗族、布依族、侗族、土家族等多个少数民族，是我国地贫发病率较高的地区之一[12]。一项30年前的流行病学调查研究显示，贵州省β-地中海贫血发生率为4.69%，但由于当时医疗技术的限制，所用方法不能检出静止型及标准型α-地贫，所以未能了解α-地贫的基因携带率[13]。近年来我国南方的多个省市地区的流行病学调查分别报道了各地区的地中海贫血流行情况[14-16]。而贵州也有局部地区地中海贫血分子流行病学研究的报道[17-18]，但尚无较大样本的地中海贫血基因突变类型分析。而本研究通过流行病学调查，旨在了解当前贵州省地中海贫血的基因携带人群占当地总人数的比例情况以及其具体的基因类型等，为该地制定地贫的防控策略奠定基础。1.材料和方法1.1研究对象采用随机整群抽样的方法从贵州省8个区域中，每个区域分别随机选取1-2个有代表性的县（市）进行地中海贫血流行病学调查，最终确定遵义市、六盘水市、黔东南州、黔南州、铜仁市、黔西南州8个地区的所有在册人员作为研究的目标群体，然后在此范围内进行抽样选定研究对象。入选标准：年龄不限，男女均可；具有当地户籍且于当地连续居住2年以上或非当地户籍于当地连续居住3年以上。排除标准：非当地户籍于当地居住不满3年者。1.2抽样样本量的估算依照曾经对该地区所进行的地中海贫血的调查研究结果，估计贵州省地贫基因的携带率约为8%。若设α的值为0.05，而容许误差设定为0.01。依照估算总体率的计算公式：n=u2α/2π(1π）/δ2，计算出该地区地贫的最小抽样样本量为2044例。1.3样本采集对被选定人员进行一系列关键信息的采集和录入（籍贯、民族及年龄、性别等等）。并对参与调查研究的对象进行采血取样，静脉血6-7ml，EDTA抗凝，4℃保存。9 遵义医学院硕士学位论文杨宇航1.4血液学检测（1）所有样本均采用xe5000sysmex全自动血细胞生化分析仪检测其血常规，以平均红细胞体积(MCV)<80fl或平均红细胞血红蛋白含量(MCHC)<27pg为地贫筛查血液学阳性指征；（2）采用法国Sebia全自动Hydrasys毛细管电泳仪进行血红蛋白电泳，检测以HbF>2%或HbA2>3.5%或HbA2<2.5%或出现其他种类血红蛋白为地贫筛查血液学蛋白阳性指征。1.5地贫基因检测EDTA抗凝肝素抗凝管抽取2ml外周血送至第三方检验机构（深圳华大基因），采用高通量测序技术进行地贫基因检测。1.6统计分析数据资料釆用计算机软件进行录入和存储，并采用SPSS18.0软件包进行统计处理。计数资料以频数分布及相对比以及构成比来进行描述。率的比较釆用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。2．结果2.1调查人群的一般资料在7866例调查人群中，男性3911例（占49.72%），女性3955例（占50.28%）。调查人群的年龄为10-68岁，平均年龄28岁。其中遵义地区2144人，六盘水地区684人，黔东南地区3301人，黔南地区485人，铜仁地区759人，黔西南地区271人，贵阳地区108人，毕节地区114人；民族包括：汉族、侗族、苗族、布依族、水族、土家族、瑶族、仡佬族、壮族、蒙古族、黎族、穿青族、白族及回族14个民族。10 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.2地中海贫血基因的携带率在受检的7866例贵州人群中，共检出868地中海贫血基因携带者，地贫基因携带率为11.03%；α-地贫者583例，携带率7.41%；β-地贫者254例，占3.23%；α复合β地贫者31例，占0.39%（图1）。在3911例男性受检者中，检出地贫基因携带者418例，地贫基因携带率为10.69%；在3955例女性受检者中，基因携带者450例，其基因携带率为11.38%，贵州人群中地贫基因携带率男女无差异（P＞0.05）（表1）。868例地贫基因携带者中，男性418例，α-地贫279例，β-地贫129例，α复合β地贫10例；女性450例，α-地贫304例，β-地贫125例，α复合β地贫21例（表2、图2），性别间各类型地贫构成差异无统计学意义（P＞0.05）。图1地贫基因携带率图2各类型地贫构成表1贵州地贫基因人群携带情况性别调查人数基因携带者正常者携带率(%)χ2P男3911418349310.69女3955450350511.380.9540.329总计7866868699811.03表2地贫基因携带者性别分布情况性别α-地贫β-地贫α复合β地贫χ2P男27912910女304125213.9710.137总计5832543111 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.3各地区地中海贫血基因的携带率贵州人群地中海贫血基因携带率为11.03%，其中遵义地区基因携带率为7.56%（162/2144），六盘水地区基因携带率为7.46%（51/684），黔东南地区基因携带率为13.60%（449/3301），黔南地区基因携带率为18.56%（90/485），铜仁地区基因携带率为8.56%（65/759），黔西南地区基因携带率为10.33%（28/271），贵阳地区基因携带率为8.33%（10/108），毕节地区基因携带率为12.28%（14/114），地区间地贫基因携带率差异有统计学意义（P＜0.05）（表4、图3）。表4各地区地贫基因携带情况地区α地贫β地贫α复合β地贫正常者总计携带率(%)遵义103545198221447.56六盘水341436336847.46黔东南309128122852330113.60黔南6026439548518.56铜仁461636947598.56黔西南1511224327110.33贵阳621991088.33毕节103110011412.28总计583254316998786611.03注：χ2=91.305，P＜0.001图3贵州各地区地贫基因携带率12 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.4各民族地中海贫血基因携带率在7866例受检者中共包括汉族、侗族、苗族、布依族、水族、土家族、瑶族、仡佬族、壮族等14个民族。其中布依族基因携带率为18.47%；苗族的基因携带率为15.73%；水族的基因携带率为11.21%；瑶族的基因携带率为16.88%；仡佬族的基因携带率为14.86%；壮族的基因携带率为17.82%；土家族的基因携带率为11.74%；侗族的基因携带率为13.56%；汉族的基因携带率最低，为8.31%。民族之间的地贫基因携带率存在差异（P＜0.05）。（表5、图4）表5贵州人群各民族地贫基因携带率民族α地贫β地贫α复合β地贫正常者总计携带率(%)布依族5634240649818.47苗族9421262774415.73水族315129333011.21土家族189221824711.74瑶族1312112815416.88仡佬族146212614814.86壮族2013316620217.82侗族7048477689813.56汉族26410514422846118.31其他*310303411.76总计583254316998786611.03注：χ2=94.499，P＜0.001；*未纳入统计分析。图4贵州各民族地贫基因携带率13 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.5α-地中海贫血基因型检出情况共计检出α-地贫基因携带者583例，人群基因携带率为7.41%（583/7866），占检出地贫的67.17%（583/868）。共计检出12种基因类型，其中--SEA、-α3.7、-α4.2为常见，其构成比分别为36.28%、26.86%、10.49%（表6）。α-地贫基因携带者基因型可分为缺失型、非缺失型、缺失型合并非缺失型及α-三联体4种类型。其中缺失型425例，占72.90%；非缺失型78例，占13.38%；缺失型合并非缺失型6例，占1.03%。常见缺失型基因型为--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα，其构成比分别为38.09%、21.78%、10.98%，共70.85％，以--SEA/αα为最常见的α-地贫缺失型基因型，αα/--THAI为少见的缺失型基因型；而常见的非缺失型基因型为HbConstantSpring、HbWestmead，其构成比分别为9.09%、2.06%，少见的非缺失型基因型包括c.95+9C>T/N、c.96-9T>C/N等；在缺失型合并非缺失型中最多见的基因型为αα/-α3.7,HbConstantSpring杂合，其构成比为0.69%（表7）。在583例α-地贫中还包括α-三联体74例(占12.69%)；其中共包括4种基因型，有αα/αααanti4.238例，αα/αααanti3.719例，-α3.7合并αα/αααanti4.216例以及--SEA/αααanti3.71例，贵州人群α-三联体的携带率为0.94%（表7）。表6α-地贫基因构成情况α-地贫基因类型频数构成比（%）--SEA23536.28-α3.717426.86-α4.26810.49HbConstantSpring6510.03αααanti4.2/αα548.33αααanti3.7/αα203.09HbWestmead162.48HbQuongSze91.39c.96-9T>C30.45c.95+9C>T10.15CD13(GCC>TCC)10.15IVS-I-11610.15--THAI10.15总计64810014 遵义医学院硕士学位论文杨宇航表7α-地贫基因型构成情况α-地贫基因型例数构成比（%）缺失型αα/--SEA22238.09αα/-α3.712721.78αα/-α4.26410.98-α3.7/--SEA50.86-α3.7/-α3.750.86-α3.7/-α4.210.17-α4.2/--SEA10.17非缺失型HbConstantSpring杂合539.09HbWestmead杂合122.06HbQuongSze杂合81.37c.95+9C>T/N10.17c.96-9T>C/c.96-9T>C10.17c.96-9T>C/N10.17CD13(GCC>TCC)杂合10.17IVS-I-116A>G杂合10.17缺失型合并非缺失型αα/-α3.7,HbConstantSpring杂合40.69αα/-α4.2,HbConstantSpring杂合10.17αα/--THAI,HbWestmead杂合10.17α-三联体αααanti4.2/αα386.52αααanti3.7/αα193.26αααanti4.2/-α3.7162.74αααanti3.7/--SEA10.17总计583100.0015 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.6β-地中海贫血基因型检出情况本研究共检出β-地贫者254例，其人群基因携带率为3.23%(254/7866)，占所有地贫的29.26%（248/868）。共计发现11种基因型，其中常见的基因突变类型为CD41-42（-TCTT）、CD17（A→T）、IVS-2-654（C→T）、-28（A→G），共占91.36％，其中以CD41-42（-TCTT）突变所占比例最高，其构成比为51.19%，而204kdup、CD43(GAG>TAG)、-29（A＞G）、-50（G＞A）、CD27-28(+C)、CD37(TGG>TAG)是比较少见的基因型（表8）。表8β-地贫基因型β地贫基因型例数构成比CD41-42(-CTTT)杂合13051.19%CD17(AAG>TAG)杂合6726.38%IVS-II-654(C>T)杂合228.67%-28（A＞G）杂合135.12%βE杂合114.33%-50（G＞A）杂合41.57%CD43(GAG>TAG)杂合31.18%204kdup杂合10.39CD27-28(+C)杂合10.39CD37(TGG>TAG)杂合10.39-29（A＞G）杂合10.39总计254100.00%16 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.7α复合β地贫基因型检出情况在检出的868例地贫中有31例为α复合β地贫基因型，占地贫基因携带者的比例为3.57%（31/868），其人群携带率为0.39%（31/7866）。其中β-地贫基因型主要为CD41-42(-CTTT)杂合和CD17(AAG>TAG)杂合，α-地贫基因主要以缺失型为主，以αα/-α3.7及αα/--SEA常见，这与常见的贵州地区α-地贫及β-地贫的基因型相一致，最常见的α复合β地贫的基因型为CD41-42杂合合并αα/-α3.7，占α复合β地贫基因型的29.02%。另外，本次调查还发现1例α-三联体复合β-地贫，占所有α复合β地贫的3.23%。其基因型为αααanti4.2/αα合并CD17杂合（表8）。表9α复合β地贫基因型α复合β地贫基因型例数构成比(%)CD41-42杂合合并αα/-α3.7929.02CD41-42杂合合并HbConstantSpring杂合619.34CD41-42杂合合并αα/--SEA39.68CD41-42杂合合并HbQuongSze杂合13.23CD41-42杂合合并HbConstantSpring纯合13.23CD17杂合合并αα/--SEA39.68CD17杂合合并HbWestmead杂合39.68CD17杂合合并αα/-α3.739.68CD17杂合合并αα/-α4.213.23CD17杂合合并αααanti4.2/αα13.23总计31100.0017 遵义医学院硕士学位论文杨宇航3.讨论本研究中，针对贵州省区域内的人群以社区或者村为单位进行该病调研前的抽样，选定的8个抽样地区的户籍管理均规范，且有着清晰明确的区域划定。为本研究提供了可靠的整群抽样划分依据；而本次所采用的随机整群抽样法，既可以为以后数据比较提供条件，同时也有利于控制一些其他的混杂因素。本次总样本量为7866例，符合本研究的要求。表明本次调查结果可靠，能够准确反映贵州地贫携带者的情况。本次研究中，调查人数为7866人，其中男性3911，女性3955，男女比例基本相当，性别间地贫基因携带率无差异，共计检出868例地贫基因携带者，贵州省地贫基因携带率为11.03％。30年前贵州的流调结果显示贵州地区β-地中海贫血的基因携带率为4.69%[13]，既往对于贵州α-地贫的大范围调查目前尚未见报道。本研究对贵州地区进行了大范围的流行病学调查，并所有受试者均经行地贫基因检测，得到α-地贫的基因携带率为7.41%，β-地贫的基因携带为3.23%，α复合β地贫的基因携带率为0.39%，阐明了该地区地贫的携带率。在男性和女性之间的地中海贫血基因携带率没有差异。而8个地区中地贫基因携带率从高到低排序依次为黔南、黔东南、毕节、黔西南、铜仁、贵阳以及遵义，最后是六盘水，其基因携带率分别为18.56%、13.60%、12.28%、10.33%、8.56%、8.33%、7.56%、7.16%；而地区间的地贫基因携带率存在的差异可能和经济条件、地理环境以及少数民族聚居等因素相关。如黔西南、黔东南、黔南地区与我国地贫高发地区云南、广西相毗邻，而这3个地区的地贫基因携带率也较高。本研究调查的汉族、侗族、苗族、布依族、水族、土家族、瑶族、仡佬族、壮族9个民族中，布依族的地贫基因携带率最高，为18.47%；汉族的地贫基因携带率最低，为8.31%，且各少数民族人群的地贫基因携带率均高于汉族，其结果显示地中海贫血基因携带率与民族可能存在一定的相关性，其原因可能是与一些民族的群居习惯，以及在少数民族中存在族内通婚的习俗有关，同时可能还与各民族特有的风俗习惯以及对该疾病的认识程度不够有关。而要了解地贫基因携带率与民族的相关性还涉及到的因素有很多，且此次流行病学调查抽样的结果还受到了各个地区少数民族人口分布不均的影响，因此若要了解地贫基因携带率与民族之间的相关性，需要进一步通过相关流行病学设计方案来进行此方面的研究。18 遵义医学院硕士学位论文杨宇航本研究结果显示，在贵州省α-地贫的基因携带率为7.41%，而在上世纪的八十年代中期，我国也开展了一项针对该病的大面积调查研究，最后结果显示在我国人口当中，α-地中海贫血携带者的总体患病率为2.95％[6]，各省之间差异显著。其中该病检出率最高的是广西地区达到了14.95％，而四川该病的检出率只有1.92％[18]。然而由于当时检测手段和方式都较为落后，α-地贫检出率只是通过外周血或脐血中的异常血红蛋白来评估，检测精度较低且一些基因信息没有获取并保存下来。所以当时调查并没有能获得关于α-地贫基因型的详细信息。随着科技水平的发展，对于该病的检测手段和方式越来越高端和精准。分子诊断技术被应用到该病的检测和筛选当中，提高了检测的精准度并且能够将对应类型的基因序列采集并记录下来。α-珠蛋白基因位于16号染色体的短臂上，含包含7个连锁的α类基因或假基因。根据人类地中海贫血资料库至今为止的统计，共发现了197种类型的α-地中海贫血。在世界全部人口当中约有7％（也就是大约有5亿人）的人存在珠蛋白基因变异情况，其中约2.6亿是α-地中海贫血携带者[19]。本研究通过高通量测序技术对贵州人群地贫基因携带率进行检测，不仅能了解贵州人群中α-地贫基因基因携带率，还明确其基因型的构成情况。近年来，Lau等[20]对我国香港地区进行了α-地中海贫血症的筛查工作，发现该型基因的携带率为4.5％。而学者Xu等[21]则开展了针对广东省的地贫筛查工作，最后得出该地区有8.53％的人群携带有α地贫的基因。Xiong等[22]人在广西六个地区筛查了5789人，发现广西人群中携带α-地贫基因的携带率为17.55％。鉴于α-地贫的高发，广东省将其列为出生缺陷干预项目的重点干预项目之一[23]，而在贵州也应该对该病的筛查引起重视，减少重型地贫患儿的出生。由本次调查的数据中可以看出，在贵州的α-地贫基因型中--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα3种基因型所占的比例依次处于前三位，其在566例的α地贫基因突变患者中有216例检出携带有--SEA/αα基因，构成比达38.16％，拥有α-地贫当中最高的检出率。本研究显示，贵州地区α-地贫基因型构成与深圳、福建、广东、广西等地区的基因型构成基本相似[24-25]。可见在中国南方人群中，常见的α地贫基因突变类型为--SEA/、-α3.7/、-α4.2/，不同地区的基因突变趋势相近，而其突变频率有所区别。另外，本次研究还在人群中检测出74例携带α-三联体基因患者，其基因携带率为0.94%，而α-珠蛋白基因的三联体是由于16号染色体在减数分裂时的同源配对期，Z-19 遵义医学院硕士学位论文杨宇航和Y-以及X-几个片段间出现了不等交换而导致的。而αααanti3.7与αααanti4.2是其主要类型。α-珠蛋白基因三联体在人群中并不少见，在多种人群中均有相关报道[27]。在国际上，学者FisherCA及其率领的团队在对斯里兰卡的620位地中海贫血病人进行α-与β-珠蛋白基因研究筛查时发现其所研究的中-重型β-地贫病人中有2%的患者存在合并α-三联体的情况[28]。而学者Giordano等的研究小组在对荷兰的3500名地贫病人研究时发现α-三联体的携带率大约为1.2%[29]。现有的数据显示我国轻型β-地贫合并α-三联体大约为中间型β-地贫患者当中的5.1%[30]。但我国关于α-三联体的人群携带率调查报道较少，有研究报道重庆市儿童α-三联体的携带率为2.37%[31]。本流行病学研究得出的关于贵州省人群α-地贫携带率及基因突变谱的结果，对于该地区此病的防控提供了宝贵的资料。可为制定有效的防控措施提供指导。本研究共检测到254例β-地中海贫血携带者。贵州β-地中海贫血基因携带率为3.23％，共计检出11种基因型，常见的基因型为IVS-2-654（C→T）、CD41-42（-TCTT）、CD17（A→T）和-28（A→G）。而目前，全球共发现180多种β-地中海贫血突变，国内报道的β-地中海贫血突变类型中，主要的六种β-地中海贫血突变分别为CD41-42（-TCTT）、IVS-2-654（C→T）、CD17（A→T）、-28（A→G），CD71-72(+A)、CD26（G→A）[34]。贵州人群中最常见的β-地中海贫血突变类型为CD41-42（-TCTT），这与广西、重庆和珠海地区所报道的基因型构成基本一致[9,16-17]，但与国内其他地区相关报道不完全一致。如在广东、福建以及台湾地区，IVS-2-654（C→T）是最常见的β-地贫突变类型[15,21,36]，而江西又以CD17最常见[37]。这说明即使在国内，不同地区人群的β-地中海贫血基因突变情况也不尽相同。而人所具有的β-珠蛋白基因位于第11号染色体短臂。β-地中海贫血发病的主因是患者的基因序列中存在缺失和突变[31]。根据其突变和缺失的不同，临床表现也不同，可分为轻型、中间型和重型3类，轻型多无症状或有轻度贫血，重型常见重度贫血，伴有黄、肝脾肿大等临床症状。中间型介于轻和重之间[33]。根据孟德尔遗传定律，当夫妻二人都是β-地中海贫血的携带者情况下，其后代大约1/4的几率成为纯合子或者是双重杂合子，即重型的β-地中海贫血。虽然我们可以对此病进行前期诊断，但是至今仍然没有针对该病很好的治疗方法。因此，对高危夫妇的后代在孕前进行选择性妊娠，在孕中进行羊水筛查是防止有重型地贫患儿出生并提高人群质量的有效措施[34]。本研究结果表明，β-地贫在贵州地区的发20 遵义医学院硕士学位论文杨宇航病率较高，且了解了贵州地区β-地贫常见的突变类型和基因突变的频率。由于重型β-地中海贫血主要危及人体健康，病死率高，给家庭和社会带来巨大的经济负担。因此，对于地贫筛选阳性的患者进一步检测地中海贫血基因，特别是开展无症状携带者的筛查，实施基因诊断和产前诊断高危夫妇，对减少重症β-地中海贫血患儿的出生，改善人群健康状况质量，提高人口素质有着积极和现实的重要意义。本次调查中，α复合β地贫的人群检出率为0.39%。共检出10种α复合β地贫基因型，其中最常见的α-地贫基因型为αα/-α3.7，β-地贫基因型为CD41-42(-CTTT)杂合。在地中海贫血中，α-地贫和β-地贫是主要的类型。假如患有相同类型地中海贫血病的男女组建成为家庭并且生育子女后代的话，则有大约1/4的几率成为纯合子或者是双重杂合子，也就是中度到重度的地贫。若是不同类型地中海贫血病的男女生育子女后代的话，虽然没有生出重型地贫婴儿的风险，但却有大约1/4的几率成为α复合β型地贫，虽然这些后代出生以后临床表现较轻，然而我们必须认识到，不管这一类型的患儿中不管是与α-地贫还是β-地贫患者之间结婚并生育子女，其后代患有该病重型的风险率均为1/4。因此,提高α复合β型地贫疾病的检出率,对于指导这些病者以后的婚姻家庭组建进而防止重型地贫患儿的出生，特别是减少重症地中海贫血患儿的出生，对改善人口健康状况质量，提高该地区的人口素质以及对于整个人类族群的繁衍和发展有着积极的意义。综上所述，本流行病学调查绘制了贵州省人群地中海贫血基因携带率及基因突变谱，为本地区进行地中海贫血的遗传咨询、婚配指导及重型地贫预防计划等奠定基础。未来贵州地区地贫防控的重点需要加强高发地区的地贫宣教，使人们能及时就诊并主动避免相同类型地贫患者婚配，从而降低重型地贫患儿的出生率，做到早发现、早诊断，这将有利于良好的地贫控制，进而减轻地贫所带来的疾病负担。21 遵义医学院硕士学位论文杨宇航4.结论1.贵州省地中海贫血基因的携带率为11.03%，其中α-地贫的基因携带率为7.41%，β-地贫的基因携带率为3.23%，α复合β地贫基因携带率为0.39%。2.α-地贫中以缺失型较为多见，其中以-SEA/αα最为常见；β-地贫常见的基因型有CD41-42（-TCTT）、CD17（A→T）、IVS-2-654（C→T）、-28（A→G）；而α复合β地贫以αα/-α3.7合并CD41-42(-CTTT)杂合较为多见。3.汉族地贫基因携带率低于少数民族；少数民族中以壮族、苗族、瑶族及布依族基因携带率较高。4.地区中黔南、的黔东南地区的地贫基因携带率较高；而遵义、铜仁及六盘水地区的地贫基因携带率较低。5.贵州地区人群α-三联体的携带率为0.94%，主要包括αααanti4.2和αααanti3.7两种类型。22 遵义医学院硕士学位论文杨宇航第二部分高通量测序与传统地贫检测方法的比较以及地贫基因携带人群血液学特征分析前言地中海贫血是人类单基因遗传病当中患病人数最多的一种[39-41]，约占总人口的2%，主要见于地中海沿岸国家、中非和东南亚各国。每年约有60万重型地中海贫血患儿出生[42]。对于地贫的诊断，通常依据国际地贫协会推荐的断截断值（MCV＜80fL，MCH＜27pg）进行筛查诊断，如MCV＜80fl，HbA2≤2.5%者疑为α-地贫；MCV＜80fl，HbA2＞3.5%或同时HbF＞2%者疑为β-地贫或α复合β型地贫。对于MCV<80fL或/和MCH<27pg或/和HbA2≤2.5%或≥3.5%或/和HbF≥2%或检测到异常Hb条带者进一步送检基因检测进行确诊。总的来说，这种传统筛查方法通常采用血红蛋白及血常规电泳来检查进行初筛，对于其结果异常者才会进一步送检，而该病的确诊仍依赖于基因分析，但常规基因检测主要是通过跨越断裂点的PCR技术（GAP-PCR)、反向斑点杂交PCR技术（PCR-RDB）等进行，这些检测方法只能检测已知基因位点的突变，不能检测未知突变及大片段缺失，会造成一定量的漏诊、误诊[43]。因此，准确有效、简单实用的分子诊断技术是实施人群筛查诊断的关键与前提。现高通量测序技术（NGS）在产前唐氏筛查[44]以及HLA高分辨率基因分型[45]方面被广泛应用。且该方法在美国被明确写入了临床指南当中（2013年）。在我们的前期研究中，对63例已明确诊断的地贫患者采用高通量测序技术进行地贫检测。发现采用该技术所获得的结果无论从特异性还是灵敏度方面都非常准确，我们进一步应用高通量测序技术对206例新生儿足底血进行筛查发现，该技术不仅能有效地检出地中海贫血的基因类型，而且还可发现新的基因突变[46]。这说明使用NGS技术对地贫基因检测是可靠、可行的。如今在基因测序技术领域中高通量测序在灵敏度及通量以及准确性方面有明显优势；能够把以往基因测序检测中的漏检问题以及筛查通量低等问题尽可能的解决。在本研究中，将高通量测序技术与传统的血常规和血红蛋白电泳的地贫筛查方法进行比较，并各基因的地贫携带者的血液学参数进行分析。这不仅有利于增进对此类疾病的认识，而且还有助于提高医务人员对地贫的诊治能力。23 遵义医学院硕士学位论文杨宇航1．材料与方法1.1研究对象贵州省人群地贫流行病学调查中所发现的地贫基因携带人群。1.2样本采集：具体详见第一部分材料与方法内容。1.3血液学检测具体详见第一部分材料与方法内容。1.4地贫基因检测具体详见第一部分材料与方法内容。1.5统计分析所有数据资料釆用计算机软件录入和存储，以SPSS18.0软件包进行统计学处理。计量资料采用最大值、最小值、均数±标准差（）描述；计数资料以率、构成比、相对比及频数分布等表示。率的比较釆用χ2检验。样本均数间的比较采用单因素方差分析或非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。24 遵义医学院硕士学位论文杨宇航1.6高通量测序技术与传统地贫筛查方法受检者传统地贫筛查方法直接通过高通量测序技术检测的方法血常规/血红蛋白电泳改变阳性者（MCV＜80fL或/和MCH<27pg或/和HbA2≤2.5%或≥3.5%或/和HbF≥2%或检测到异常Hb条带）上述两项或一项异常者进一步所有受检者均用高通量行基因检测（GAP-PCR、测序进行地贫基因检测PCR-RBD等）。统计分析比较两种方法的地贫携带率25 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.结果2.1传统地贫筛检方法和高通量测序的比较在7866例受调查者中，若按照传统方法进行地贫筛查，可发现疑似地贫基因携带（MCV<80fL或/和MCH<27pg或/和HbA2≤2.5%或≥3.5%或/和HbF≥2%或检测到异常Hb条带）者2734例，通过基因检测发现地贫基因携带者704例，2030例未检出地贫基因，传统方法得出的地贫基因携带率为8.95%（704/7866）；而直接通过高通量测序技术检出从868例地贫基因携带者，其基因携带率为11.03%（868/7866）。传统方法与高通量测序方法相比差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。传统方法漏诊了164例地贫基因携带者，其漏诊率为2.08%（164/7866）（图1）。另外，在868例地贫基因携带者中，583例为α-地贫中，有血常规指标（MCV＜80fl、MCH＜27pg）或血红蛋白电泳指标（HbA2≤2.5%）改变的有437例。即与高通量测序技术相比较，通过传统筛检法能检测出其中74.96％（437/583）的α-地贫携带者；二者相比，传统方法遗漏了25.04％（146/583）的α-地中海贫血携带者（图2.a）；同样的，在285例β-地贫携带者及α-复合β-地贫携带者中，有血常规指标（MCV＜80fl、MCH＜27pg）或血红蛋白电泳指标（HbA2≥3.5%或/和HbF≥2%）改变的有267例，通过传统方筛检法可以检出93.68%（267/285）的β-地贫或α复合β地贫基因携带者，遗漏了6.32%（18/285）（图2.b）。表1传统地贫筛查方法与高通量测序技术的比较传统方法地贫者正常者总计χ2P高通量测序地贫者7041648686233.709＜0.001正常者069986998总计7047162786626 遵义医学院硕士学位论文杨宇航图1人群中传统地贫筛查方法与高通量测序技术的比较a.b.图注：a为α-地贫；b为β-地贫和α复合β地贫；RBTorH=血常规改变或血红蛋白电泳异常者；NGS=高通量测序检出者。图2地贫基因携带者中传统筛检方法与高通量测序检测的比较2.2地贫基因携带者血常规改变情况2.2.1α-地贫的血常规改变情况研究选择αα/--SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.2、HbCS杂合、HbWestmead杂合5种例数较多的基因型进行比较，αα/--SEA与其他4组相比较其RBC升高，而Hb、MCV、27 遵义医学院硕士学位论文杨宇航MCH均降低，其差异存在统计学意义（P＜0.05）；αα/-α3.7、αα/-α4.2与HbCS杂合、HbWestmead杂合比较，其MCH降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。其它基因型因例数不超过10例，故未纳入统计分析。表2α-地贫血液学参数变化情况（）血液学参数基因型例数RBC(×1012/L)HB(g/L)MCV(fL)MCH(pg)αα/--SEA2225.43±0.40108.7±9.162.5±2.220.3±0.8αα/-α3.7*1274.85±0.13121.4±8.278.1±3.525.6±1.2αα/-α4.2*644.59±0.26120.8±7.778.8±2.525.5±1.1HbCS杂合534.35±0.15117.4±8.879.3±3.526.3±1.1HbWestmead杂合124.42±0.29118.8±6.178.2±1.626.5±1.6F210.93554.536958.130837.175P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001注：*表示与HbCS杂合、HbWestmead杂合组的MCH比较，P＜0.05。2.2.2α-三联体的血常规改变情况74例α-三联体中，25例出现MCV和（或）MCH下降，14例出现了Hb的轻度降低。3种基因型中，αααanti4.2/-α3.7与其他两组间比较，其HB降低，其差异有统计学意义（P＜0.05）；而αααanti3.7/αα和αααanti4.2/αα比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。各组间RBC、MCV、MCH的差异无统计学意义（P＞0.05），由于αααanti3.7/--SEA例数少，只有1例，故未纳入统计分析。表3α-三联体血液学参数变化情况（）血液学参数基因型例数RBC(×1012/L)HB(g/L)MCV(fL)MCH(pg)αααanti3.7/αα194.91±0.61126.3±6.693.5±3.432.8±2.8αααanti4.2/-α3.7*，**164.56±0.44116.6±8.290.5±12.828.3±3.5αααanti4.2/αα384.98±0.67125.2±5.793.6±3.331.1±3.3F2.97812.4431.2860.284P0.058＜0.0010.2830.752注：*表示与αααanti3.7/αα组的Hb比较，P＜0.05；**表示与αααanti4.2/αα组的Hb比较，P＜0.0528 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.2.3β-地贫的血常规改变情况254例β-地中海贫血基因携带者中，169例MCV下降，179例MCH下降，而MCH和MCV均下降者147例。在常见的4种β-地贫基因型中，CD17与CD41-42、IVS-Ⅱ-654的Hb、MCV比较，其Hb及MCV更低，差异存在统计学意义(P＜0.05)；CD17较CD41-42的MCH更低，差异存在统计学意义(P＜0.05)（表4）。由于-50（G＞A）、CD43(GAG>TAG)、204kdup、CD27-28(+C)等6种基因型检出人数少，故未纳入进行统计分析。表4β-地贫血液学参数变化情况（）血液学参数基因型例数RBC(×1012/L)HB(g/L)MCV(fL)MCH(pg)CD41-42杂合1305.00±0.73128.0±12.781.6±10.827.6±5.3CD17杂合*，**675.06±0.82120.2±16.371.3±11.423.8±5.6IVS-II-654杂合224.93±0.81130.1±12.387.4±11.226.6±3.8-28杂合134.64±0.24122.4±10.981.0±9.924.8±2.9F1.1935.64217.2998.122P0.313＜0.001＜0.001＜0.001注:*表示与IVS-II-654杂合组的Hb、MCV比较，P＜0.05；**表现与CD41-42杂合组的Hb、MCV、MCH比较，P＜0.05。2.2.4α复合β地贫的血常规改变情况31例α复合β地贫的血常规结果显示,此类患者多表现为小细胞、低色素,MCV降低(59.9-90.1fl)，MCH降低(18.2-32.9pg),而Hb检测结果显示其贫血表现从轻度到正常均有。其中包括1例α-三联体复合β-地贫，其基因型为αααanti4.2/αα合并CD17(AAG>TAG)杂合，其血常规结果显示，RBC、Hb、MCH均在正常值范围内，而MCV稍升高。29 遵义医学院硕士学位论文杨宇航表5α复合β地贫血液学变化情况（）血液学参数基因型例数RBC(×1012/L)HB(g/L)MCV(fL)MCH(pg)CD41-42合并αα/-α3.794.64±0.24122.4±10.981.0±9.924.8±2.9CD41-42合并HbCS65.00±0.73128.0±12.781.6±10.827.6±5.3CD41-42合并αα/--SEA34.93±0.81130.1±12.387.4±11.226.6±3.8CD17合并HbWS35.06±0.82120.2±16.371.3±11.423.8±5.6CD17合并αα/-α3.734.93±0.57131.5±12.387.6±4.327.9±1.6CD17合并αα/--SEA34.97±0.65132.3±10.385.4±10.426.4±3.32.3地贫基因携带者血红蛋白电泳变化情2.3.1α-地贫的血红蛋白电泳变化情况在583例α-地贫基因携带者中，各种基因型之间其HbA、HbA2、HbF含量的差异无统计学意义（P＞0.05）（表6）。但是在53例HbCS地贫基因携带者中，有17例血红蛋白电泳中检测异常血红蛋白HbCS，占所有HbCS地贫基因携带者的3.21%；而其他类型的α-地贫未检测出异常血红蛋白条带。表6α-地贫血红蛋白电泳变化情况（）血红蛋白电泳基因型例数HbA(%)HbA2(%)HbF(%)αα/--SEA22297.2±1.02.7±0.80.7±0.6αα/-α3.712797.1±0.82.9±0.90.7±0.2αα/-α4.26497.0±0.52.9±0.30.6±0.2HbCS杂合5396.9±0.42.9±0.40.8±0.5HbWestmead杂合1297.0±0.43.0±0.40.8±0.4F1.7692.2591.447P0.1340.0620.21830 遵义医学院硕士学位论文杨宇航2.3.2α-三联体的血红蛋白电泳变化情况在发现的74例α-三联体中，有57例单纯α-三联体，其中16例HbA2降低，而HbF均正常。各组间血红蛋白电泳变化情况差异无统计学意义（P＞0.05）。（表7）表7α-三联体血红蛋白电泳变化情况（）血红蛋白电泳基因型例数HbA(%)HbA2(%)HbF(%)αααanti3.7/αα1997.3±1.02.1±0.10.7±0.2αααanti4.2/-α3.71696.9±1.02.3±0.70.7±0.2αααanti4.2/αα3897.2±0.92.0±0.70.8±0.2F0.8761.4192.215P0.4210.2490.1172.3.3β-地贫的血红蛋白电泳变化情况254例β-地贫基因携带者中，156例HbA2＞3.5%，137例HbF＞2%，其中79例HbA2和HbF均升高，77例HbA2升高但HbF正常，58例HbF升高而HbA2正常。另外，在11例βE基因型中，5例出现异常血红蛋白HbE。对常见的4种β-地贫基因型血红蛋白变化情况进行统计分析，其各组间血红蛋白变化差异无统计学意义（P＞0.05）。（表8）31 遵义医学院硕士学位论文杨宇航表8β-地贫血红蛋白电泳变化情况（）血红蛋白电泳基因型例数HbA(%)HbA2(%)HbF(%)CD41-42(-CTTT)杂合13095.3±2.24.1±1.61.4±1.0CD17(AAG>TAG)杂合6794.7±2.04.2±1.41.2±0.8IVS-II-654(C>T)杂合2295.5±2.03.7±1.21.4±1.0-28（A＞G）杂合1394.7±1.64.6±1.40.8±0.2F1.5831.0602.118P0.1940.3670.0992.3.4α复合β地贫的血红蛋白电泳变化情况31例α复合β地贫的血红蛋白电泳均表现为HbA2升高(HbA2为2.2-5.4%),血红蛋白F（HbF）基本正常,与单纯β-地中海贫血杂合子的血红蛋白电泳改变情况类似。由于各基因型例数较少，故各组间未进行统计分析。另外，发现的1例α-三联体合并β-地中海贫血中，基因型为αααanti4.2/αα合并CD17(AAG>TAG)杂合，血红蛋白电泳显示HbA、HbA2、HbF含量基本正常。表8α复合β地贫血红蛋白电泳变化情况（）血红蛋白电泳基因型例数HbA(%)HbA2(%)HbF(%)CD41-42杂合合并αα/-α3.7996.5±1.23.4±1.30.5±0.5CD41-42杂合合并HbCS杂合697.3±1.02.7±0.51.2±1.5CD41-42杂合合并αα/--SEA396.0±1.44.0±1.40.8±0.2CD17杂合合并HbWestmead397.2±1.42.8±1.21.4±1.0CD17杂合合并αα/-α3.7396.6±0.83.2±0.70.6±0.4CD17杂合合并αα/--SEA396.4±0.73.0±0.60.8±0.432 遵义医学院硕士学位论文杨宇航3.讨论地中海贫血属于小细胞低色素性贫血，通常传统地贫的筛查方法是先对怀疑地贫患者进行血常规及血红蛋白电泳检测，对于其中MCV<80fL或/和MCH<27pg或/和HbA2≤2.5%或≥3.5%或/和HbF≥2%或检测到异常Hb条带者考虑疑似地贫，才进一步送检基因检测，且基因检测多采用Gap-PCR、PCR-RBD等方法进行。本研究通过对比传统地贫筛检方法与直接通过高通量测序技术检测出的地贫携带者，发现若用传统方法进行筛查，可检出地贫基因携带者704例，其地贫基因携带率为8.95%；直接通过高通量测序技术检出地贫868例，其地贫基因检出率为11.03%。与高通量测序技术相比较，传统方法漏检了2.08%的地贫基因携带者。传统方法出现漏诊的原因可能是，影响MCV、MCH的因素较多，导致地贫基因携带者的血常规改变不一定完全符合小细胞低色素型，传统方法是先通过血常规及血红蛋白电泳进行初筛，然后再行基因检测，就会使得血液学参数改变阴性的这部分地贫基因携带者被漏诊。在我们的一项对新生儿的地贫基因研究中显示，应用高通量测序技术在地贫基因的检测中，不仅可以有效、准确的检测出地贫基因以及发现未知的突变类型[46]。而本次研究中也显示，通过传统方法对人群地贫筛查存在较高的漏诊率，因此在临床检测、婚检和产前等检查中,联合应用高通量测序技术进行地贫基因的检测，可一定程度上减少漏诊。在α-地贫中，通过传统方法会漏掉25.04%（146/583）的α-地贫，β-地贫和α复合β地贫通过传统方法会漏掉6.32%（18/285），说明直接通过高通量测序技术进行地贫筛查具有明显的优势，能够发现传统筛查方法不能检出的地贫基因携带者。α-地贫的漏诊率高于β-地贫及α复合β地贫，其可能的原因是由于静止型α-地中海贫血相对较高的检出率，其基因型包括-α3.7/αα，-α4.2/αα，HbConstantSpring杂合、HbWestmead杂合等，通常这类α-地贫中MCV，MCH和HbA2呈正常值[47]，在通过传统方法不易被检出。因此，在一些地贫高发地区进行地贫筛查以及地贫的产前诊断时，不能仅仅依靠血常规参数以及血红蛋白电泳的结果进行筛查，这仍会使得部分地贫基因携带者，特别是α-地贫基因携带者出现漏诊，当这类人群相互间进行婚配时仍然有机会生出重型地贫的患儿，给家庭及社会带来沉重的负担。33 遵义医学院硕士学位论文杨宇航本次调查中检测到的大多数α-三联体携带者血液学参数基本正常，部分患者出现轻度的Hb、MCV及MCH的降低，而血红蛋白电泳图谱与α-地中海贫血基本相同，与文献报道一致[48]。目前，α-三联体的作用机制尚不清楚。其中就有学者认为在α-三联体复合β-地中海贫血中，α-三联体对β-地中海贫血表型影响不大[49,50]。在此次研究中筛查出一例α-三联体合并β-地中海贫血，其基因型为αααanti4.2/αα合并CD17杂合，其血液学参数表现为RBC、Hb、MCH正常，MCV轻度升高；而血红蛋白电泳显示HbA、HbA2、HbF含量基本正常。但也有学者认为，当轻型β-地中海贫血合并α-三联体时，可增加珠蛋白失衡[29]，当轻型β-地贫合并α-三联体时可表现为中间型β-地中海贫血。但遗憾的是本次调查中检出的α-三联体合并β-地贫基因的例数较少，不能准确反映出此类型地贫的表型形式。然而，考虑到α-三联体对β-地中海贫血可能会加重其表型的影响以及α-和β-珠蛋白基因位于不同染色体上，当双亲为α-三联体及β-地贫时，生育的孩子有可能会出现α-三联体合并β-地贫，这可能使得患儿的β-地贫基因表型加重。所以我们认为在人群中筛查α-三联体，对于降低中间型及重型β-地贫患儿的出生可能具有重要意义。有研究发现，轻型β-地贫的病人临床表现很轻微，而且该型的红细胞形态较多且不规则，有靶形和环形等等。因此，血常规检查只能作为筛查的辅助项目。在本研究中，254例基因携带者的血液常规分析结果显示，147例携带者的MCV和MCH降低，但红细胞总数和血红蛋白水平基本处于正常水平。而出现这种情况有可能是由于病者的EPO(即促红细胞生成素)出现了增长，致使体内造血功能较强，然而虽然红细胞数量正常，却无法发挥其应有的输送氧能力。此外，本研究结果显示的248例β-地贫基因携带者中，HbF升高的例数仅为49例，占19.76%，同样提示不能在确诊型地贫时单一采用HbF增加作为标准，但是仍有报道以HbF升高为主的β-地贫[51]。在本研究中发现的α复合β型地贫中血液学参数变化轻微，只有一部分血红蛋白电泳显示HbA2升高，类似于轻型β-地中海贫血。在复合型地中海贫血病症当中失活的α珠蛋白基因的数量直接决定了该病的表现严重度。通常，一个α基因的失活对β地中海贫血的表现没有显着影响[52]。地中海贫血患者临床症状的严重程度主要取决于两种肽链之间的失衡程度，但复合型地贫的α、β链的合成都有所降低，一定程度上减少了两种肽链的不平衡状态，所以没有出现表型加重的现象[36]。34 遵义医学院硕士学位论文杨宇航在地中海贫血筛查方法中，血常规及血红蛋白电泳是较为简单、方便、快捷的筛查方法[53,54]。但是本次研究发现部分地贫携带者的血常规MCV、MCH正常，甚至出现MCV的升高，其原因可能是作为衡量小细胞低色素性的重要指标，MCV和MCH的异常，除了地中海贫血原因导致外，还有其他多种原因的影响。且血常规MCV、MCH的降低与否可能和其基因型有关，如有大多数轻型β-地贫和静止型α-地贫可以表现为Hb、MCV、MCH的正常，而重型β-地贫及HBH病多表现为Hb、MCV、MCH的降低，少部分患者中其MCV、MCH可以正常。其MCV、MCH升高的原因目前尚不明确，可能是地贫患者本身合并如叶酸或维生素B12缺乏等其他疾病导致MCV、MCH增大，有文献报道，当地贫患者合并G-6-PD缺乏时可能引起MCV、MCH明显高于同类型无合并G-6-PD缺陷症者的地贫患者，这可能是因为病人的自身溶血刺激了骨髓造血机制出现增生，致使患者体内产生了大量的新生红细胞，而这种新生红细胞相较于常规红细胞MCH和MCV更大[55,56]，因此对于地贫中MCV、MCH高于正常的原因还需要做进一步研究。综上所述，由于影响MCV、MCH等血液学指标的因素较多，除了地中海贫血原因导致外，还有其他多种原因也有可能产生，这就导致了地贫患者的血液学改变并不完全符合小细胞低色素性。使得在传统的地贫筛查方法中，先通过血常规及血红蛋白电泳检测进行筛查会漏诊掉部分地贫基因携带者。而GAP-PCR和PCR-RBD等技术主要检测的是中国人群地中海贫血基因突变的热点，并不能覆盖所有地中海贫血所有突变位点。这样，就存在临床地中海贫血漏筛的风险，导致地中海贫血高危儿的出生，给家庭和社会均带来严重负担[57-63]。通过高通量测技术直接进行地贫基因检测，能有效减少血液学改变阴性的这部分地贫患者的漏诊。提示在临床工作中，为提高地中海贫血的检出率，避免漏诊的发生，应考虑将有关技术应用到具体临床中。35 遵义医学院硕士学位论文杨宇航4.结论1.在贵州地区，传统的地贫筛检方法进行筛查有较高的漏诊率（α-地贫漏诊率为25.04％，β-地贫和α复合β地贫漏诊率为6.32%），高通量测序技术进行地贫检测可以有效减少地贫的漏诊率。2.贵州地区地贫基因携带者血液学参数并不完全符合小细胞低色素性。36 遵义医学院硕士学位论文杨宇航全文总结1.贵州省地中海贫血基因的携带率是11.03%，其中α-地贫的基因携带率是7.41%，β-地贫的基因携带率为3.23%，α复合β地贫基因携带率为0.39%。2.α-地贫中以缺失型较为多见，其中最常见的基因型为--SEA/αα；β-地贫中最常见基因型为CD41-42（-TCTT）；α复合β地贫以αα/-α3.7合并CD41-42(-CTTT)杂合较为多见。3.汉族的地贫基因携带率低于少数民族，而少数民族中以壮族、苗族、瑶族及布依族基因携带率较高。4.黔南、黔东南地区的地贫基因携带率较高；而遵义、铜仁及六盘水地区的地贫基因携带率较低。5.贵州地区人群α-三联体的携带率为0.94%，主要包括αααanti4.2和αααanti3.7两种类型。6.传统的地贫筛检方法漏诊率为2.08%，直接通过高通量测序技术进行地贫检测可减少地贫的漏诊率。7.贵州地区地贫基因携带者血液学参数并不完全符合小细胞低色素性。37 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遵义医学院硕士学位论文杨宇航综述重型地中海贫血的治疗进展杨宇航综述陈艳审校地中海贫血是遗传性血液系统疾病的一种，是由于患者体内所应该具有的珠蛋白基因存在异常（缺失或突变）而因此使得其血液溶血特性弱化而最终导致的贫血，在该类贫血疾病当中α型和β型是临床较为常见的2大类，它同时是我国南方单基因遗传病当中较为常见的一种。此病的根本病理（生物学原因）是由于患有该病的病人基因中在珠蛋白序列有异常，致使病人的血液在合成珠蛋白肽链时难以满足机体的正常需要，最终造成血液当中红细胞机能和性状出现减退。目前输血、除铁以及造血干细胞移植等是重型地贫的主要治疗方法，而近年来基因治疗对于地贫的治疗有了长足的进步，本文围绕重型地中海贫血的治疗进展进行阐述。1.输血、袪铁治疗目前临床常采用输血并配合祛铁剂的方法治疗地贫。由于地贫患者血红蛋白合成受阻，致使病人的血液在合成珠蛋白肽链时难以满足机体的正常需要，最终造成红细胞数量严重不足，通过输血治疗可以使患者体内血红蛋白维持一定的水平，提高红细胞水平，减少并发症的发生[1]。重型地中海贫血及部分中间型地中海贫血的病人经确诊后即需进行长期、规律的输血，维持其HGB在100～120g/L之间[2]，而输血量需根据其生长发育及发病情况等及时调整。由于患者多次输血、长期的慢性溶血等使会造成体内各脏器中铁浓度增加，铁负荷过重，从而导致患者心、肝、肾等脏器受损，严重者会影响患者的生存甚至危及生命[3]。由于上述原因，因此，输血联合铁螯合剂的治疗是目前国际上达成共识的治疗手段。输血治疗配合铁螯合剂的联合使用治疗可以提高患者的存活质量，减轻输血所带来的痛苦，延长患者寿命。在祛铁治疗中祛铁胺是使用最广和效果较好的一种去铁剂，其治疗可显著降低铁蛋白水平和肝脏中铁的含量，预防心脏和内分泌系统并发症[4-6]。但因其只能采用持续皮下注射或静脉输注治疗，易导致患者治疗依从性差[7]。去铁酮和地拉罗司是口服的祛铁药物，有临床研究表明，去铁酮治疗重型β－地贫的疗效要优于去铁胺[8]。但需注意有可能造成的不良反应[9]。使用去铁酮的主要不良反应包括恶心、呕吐等胃肠道反应、丙氨酸氨基转移酶水平增高、粒细胞缺乏症、关节痛等。多数不良反应为暂时性的，停药后即可消43 遵义医学院硕士学位论文杨宇航失，而其中的粒细胞缺乏症属于比较严重不良反应，因此，在使用去铁酮治疗期间需要定期进行血常规检测，来了解粒细胞的水平，防止粒细胞过低所带来的一系列不良后果。而地拉罗司是一种比较新的口服铁螯合剂，就使用上来说，较去铁酮和去铁胺更为方便。近年来有研究显示，地拉罗司可以有效的使血清铁蛋白水平和肝脏组织中铁浓度显着降低，而且β-地中海贫血患者在经地拉罗司治疗后具有改善的肝功能的作用[10]。地拉罗司的主要副作用包括恶心、呕吐、腹泻及腹痛等胃肠道反应以及皮疹等，少数病人可能发生机体内肌酐和丙氨酸转氨酶水平的升高。大多数患者可以耐受其不良反应，当减量或者停药可恢复正常。在上述的3种去铁剂中，疗效均得到了肯定，但由此引起的各种不良反应受到重视。祛铁剂所造成的不良反应呈剂量依赖性，联合用药可减少种药物的用量，从而减少不良反应。有研究显示，去铁胺与去铁酮联合治疗的祛铁效果要明显优于二者的单独治疗[11]。而Grady等[12]在对重型地贫患者的治疗研究中发现，地拉罗司与去铁胺具有协同作用，可以有效的减少患者体内的铁负荷。此外，也有研究报道，地拉罗司-去铁胺的序贯治疗可有效改善铁过载患者的肝功，其疗效明显的优于地拉罗司或去铁胺的单独治疗，同时也减轻了这两种药单药治疗所带来的不良反应[13]。2.造血干细胞移植治疗造血干细胞移植是目前根治重型地贫的重要方法，其中包括骨髓移植、脐血移植、外周血造血干细胞移植等。要对患者进行移植前需要注意以下问题:1)对患者病情以及移植的风险评估;2)对患者的移植时机的选择;3)对患者进行移植预处理;4)移植后预防移植物抗宿主反应[14]。根据Pesaro及其团队的研究经验，对小于17岁患者使用完全相同的预处理方案进行同胞骨髓移植结果进行多因素分析后，其结果显示:肝大2cm、肝纤维化以及不规则的去铁为3个不良预后因素[15]。可将地贫患者分为3个危险等级:一级为无上述3种危险因素；二级有1-2种危险因素;三级有3种危险因素。意大利Pesaro移植中心在这方面进行了大量临床研究，移植成功率达80%～91%，其中一、二和三级地贫的无病生存率分别达91%、84%和80%[16]。另外有研究显示首次进行造血干细胞移植的β-地贫患者存活15年以上的人数占到了移植总数的86.8%，治愈的占到了69.4%[17]。但由于我国计划生育政策的影响，HLA全相合的同胞骨髓来源显得比较困难。因此不得不尝试应用其他来源的造血干细胞进行移植。44 遵义医学院硕士学位论文杨宇航目前，非亲缘移植治疗效果已经达到同胞移植的疗效水平，非亲缘外周干细胞较非亲缘骨髓移植的植入率更高、疗效更好。可见移植作为根治地贫的重要的技术手段，取得了长足的发展。但是由于移植物抗宿主病和其他的感染因素，大部分患者依然受到死亡的威胁[15]，经调查研究这些死亡原因大多归因于二级至四级移植物抗宿主疾病或移植物衰竭[18-20]。同时移植时间也有很大的局限性，错过了2-6岁的佳移植期将无法获得较好的长期存活率[15-16]。虽然造血干细胞移植能够根治地贫，但是其巨大的风险与巨额的治疗费用还是让许多患者难以承受。3.基因治疗基因治疗是一种生物医学技术，旨在通过将具有治疗效果的基因或人类正常基因以某种方式导入到人类靶细胞中来治疗疾病，从而纠正缺陷基因或发挥治疗效果。基因治疗通常包括基因修饰，基因置换，基因修正，基因失活等。地中海贫血作为单基因缺陷的遗传性疾病，在理论上是基因治疗最理想模型。基因治疗因为具有特异性强，无痛，无毒副作用等特点，逐渐成为治疗地中海贫血的热点研究对象。Huo等[21]在用人珠蛋白基因取代小鼠胚胎干细胞中的珠蛋白基因，建立了人类地中海贫血的动物模型，为研究地中海贫血的发病机理和基因治疗提供了模型。由于α-地贫主要是由α珠蛋白基因缺失突变造成的，对其基因的修复具有很大的难度，所以目前治疗α珠蛋白基因的报道较少见。有研究者对α珠蛋白基因进行诱导，采用反义核苷酸技术及小RNA干扰技术，以此来调控α珠蛋白基因的表达，以此来治疗β地贫并起到了一定的疗效。在体外部分纠正了β地贫患者肽链合成的不平衡［22-23］。对于β地贫主要是β-珠蛋白基因点突变造成的，与α地贫相比较，其采用基因治疗更为理想。据报道，有研究者将含有人β-珠蛋白启动子和增强子的人β-珠蛋白基因导入慢病毒载体并转染到鼠骨髓细胞中，以使人珠蛋白基因准确地整合到宿主DNA中得以有效表达和合成正常血红蛋白。对β-地中海贫血的几种动物模型的研究已经证明，使用编码重组人β珠蛋白基因的慢病毒载体可以纠正贫血。慢病毒载体成功纠正β-地中海贫血模型贫血及其在转染的人造血细胞中的有效转导和表达为疾病基因治疗的首次临床试验提供了充分的条件[24]。现就有学者成功地进行了地中海贫血患者的基因治疗，并取得了一定的治疗效果。他们首先从患者的骨髓中收集了功能是造血的45 遵义医学院硕士学位论文杨宇航干细胞，并用慢病毒载体在体外应用一系列的方法进行转染。然后他们成功地将正常的人类基因导入患者的造血干细胞。再对患者进行化疗，清除患者体内的自身β-珠蛋白基因表达。最后成功利用自体造血干细胞移植将正常人体基因体外整合造血干细胞植入患者体内，重新建立β-珠蛋白基因表达，使患者的HbA合成增加，使患者告别［25］长期输血。此外，有报道诱导性多能干细胞的应用为地中海贫血基因治疗带来了良好的前景[26]。目前已成功完成了成纤维细胞，羊水细胞和绒毛膜细胞的诱导[27-28]，并用基因编辑技术补偿或替换缺陷基因，然后分化为具有表达的珠蛋白的造血干细胞[29]。Wang等人通过iPSCs诱导技术成功将重型β地中海贫血患者的成纤维细胞重编程为具有自我更新能力和多向分化潜能的iPSCs。通过使用基因打靶和同源重组技术，将突变基因在修复成功后，将修复的造血祖细胞移植到小鼠内，最终能产生正常的人β血红蛋白[30]。此项技术的发展主要得益于新型基因打靶技术的发展。新型打靶技术主要解决了传统技术效率低以及实验重复性差的缺点[31-32]。新出现的3种新型基因打靶技术包括锌指核酸酶(Zincfingernuclease，ZFN)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技术和规律成簇间隔短回文重复CRISPR相关核酸酶(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats，CRISPR/Cas)技术[33]。ZFN是通过锌指蛋白识别目标序列并通过连接的限制性内切酶FOK．1在目标位置产生双键断裂，然后通过提供要插入的基因序列作为模板以同源重组方式修复，从而完成精确定点修饰和修复致病基因的目的[34]。Chang及其研究团队[27]以一个胎儿水肿综合征的iPSCs细胞为对象利用锌指介导，修正后iPSCs细胞分化得到的红细胞的珠蛋白平衡得到了完全恢复。目前，有研究人员利用ZFNs成功修复了β地中海贫血诱导的多能干细胞的Ivs-654和CD41-42突变位点，诱导的多能干细胞的红细胞表达显着增加[35]。TALEN技术其原理与ZFN基本相似。但是ZFN存在脱靶的问题[36]。TALEN在编辑效率相同的情况下具有较低的脱靶水平[37]。Ma等[38]通过此项技术建立了地中海贫血特异性诱导多能干细胞系，并成功修复了β-球蛋白上的致病突变基因，诱导的多能干细胞在修复后保持多能性，且诱导的多能干细胞分化成β-珠蛋白可以表达正常红系。CRISPR/Cas系统以与限制性内切核酸酶类似的方式工作并且允许DNA的特异性切割。最初，这种技术被广泛用于建立动物模型[39]。近46 遵义医学院硕士学位论文杨宇航来，有研究人员使用CRISPR/Cas9技术来修复诱导多能干细胞中引起β-地中海贫血疾病的特异性突变基因。然后将突变的基因修正后的多能干细胞诱导分化为红细胞，发现这些红细胞β-珠蛋白RNA的水平已显着提高[40]。然而，由CRISPR/Cas系统配对的短碱基序列会降低CRISPR/Cas系统的切割特异性并导致脱靶效应，因此需要进一步完善和改进[41]。4药物治疗有许多报道称使用某些药物治疗地中海贫血已经取得了良好的效果。例如，在长期使用羟基脲的某些β地中海贫血患者中红细胞显着改善[42]。丁酸盐可以通过抑制Hb转化过程刺激患者的HbF合成，在治疗β地中海贫血方面取得了良好效果。近来，还发现地西他滨可以有效改善轻型和中间型地中海贫血的Hb含量，且副作用较小。Olivieri等[43]在5例β地中海贫血患者中给予规律地西他滨治疗，患者的Hb从（78.8±8.8）g/L增加到（90.4±7.7）g/L，HbF从（36.4±11.3）g/L升至（42.9±11.3）g/L，贫血症状明显改善。它唯一的副作用是无症状的血小板减少症。然而，由于其非特异性DNA甲基化酶抑制作用，其长期应用可能会增加患者患癌症的风险，其进一步推广需要进一步研究。目前这些药物主要用于轻型以及中间型地中海贫血的治疗，而对于治疗重型地中海贫血的效果尚未见报道，目前治疗重型地中海贫血主要依靠定期输血和铁剂或造血干细胞移植，对于这些药物进行治疗重度地中海贫血需要更多的临床研究。综上所述，长期规律的输血联合祛铁治疗目前仍是重型地贫的常规治疗方法，而基因治疗目前还具有局限性，多用于治疗β地贫。且基因治疗技术尚不成熟，未广泛用于临床，如以地中海贫血患者来源的诱导多能干细胞为靶细胞，通过新型基因打靶及同源重组技术对基因进行纠正，完成对致病基因的治疗。该技术介导修饰的人诱导多能干细胞中突变基因的修复，同时保持分化成造血干细胞的可能性和进一步形成通常表达β珠蛋白的红细胞。这对于诱导多能干细胞在未来在β地中海贫血的治疗的临床应用中具有重要意义。然而，基因治疗给地中海贫血的治疗带来了巨大的新希望的同时，距离临床广泛应用还有一段路程要走。47 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遵义医学院硕士学位论文杨宇航致谢衷心感谢我的导师陈艳教授这三年来对我的辛勤教育和无私关怀！导师严谨的治学态度、崇高的敬业精神、勤勉的工作作风和以诚待人的做人美德深深感动着我，让我受益终身，值得我永远学习。对于我的学习、生活和工作始终给予着最无私的帮助和关怀。本研究是在导师的悉心指导下完成的。导师从课题设计、实施直到论文定稿都倾注了大量的心血和精力。衷心感谢遵义医学院附属医学儿科的束晓梅、王昌义、路健、干毅、李娟、彭昌主任、易雪岚、李祥丽、郭义敏、徐洪波、田茂强、黄美颖、谢新星主治等各位老师以及各位师兄、师姐等全体医护人员在临床实践中给予的热心指导和无私帮助。同时感谢所有轮转科室的老师对我的指导与帮助。感谢研究生期间吴柳松老师，田润梅、容颖师姐，罗茜、苏琼、史良、黄成双师妹们所给予我的关心及帮助!感谢评阅论文各位专家和教授，谢谢你们对我论文给予的意见与建议，谢谢您们的辛勤工作!此外，向所有关心和帮助我的老师、同学、朋友和家人表示深深的谢意！52 遵义医学院硕士学位论文杨宇航作者简介姓名：杨宇航性别：男出生日期：1991.10.17籍贯：重庆最后学历（学位）：本科毕业院校：重庆医科大学工作经历：于2015.11-2018.07在遵义医学院附属医院参加儿科住院医师规范化培训33个月。在学期间参加的研究项目：无53