吉林省白城市奶牛隐性乳腺炎流行病学调查及致病菌的耐药分析

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分类号：S856.5单位代码：10183研究生学号：2016854018密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）吉林省白城市奶牛隐性乳腺炎流行病学调查及致病菌的耐药分析TheepidemiologicalinvestigationofcattlerecessivemastitisanddrugresistanceanalysisofpathogensinBaichengCity,JilinProvince作者姓名：王雯卿类别：兽医硕士领域（方向）：兽医内科学指导教师：张乃生教授培养单位：动物医学学院2018年6月 吉林省白城市奶牛隐性乳腺炎流行病学调查及致病菌的耐药分析TheepidemiologicalinvestigationofcattlerecessivemastitisanddrugresistanceanalysisofpathogensinBaichengCity,JilinProvince作者姓名：王雯卿领域（方向）：兽医内科学指导教师：张乃生教授类别：兽医硕士答辩日期：2018年6月4日 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行＼出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体。，均己在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：曰期：年＜月／曰 中文摘要吉林省白城市奶牛隐性乳腺炎流行病学调查及致病菌的耐药分析奶牛乳腺炎作为奶牛养殖场发生最频繁、最常见的疾病之一，对于乳品业的发展，造成了严重的阻碍，给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。在奶牛乳腺炎的治疗过程中，抗生素作为主要的治疗药物，不仅造成细菌的耐药性，更可造成牛奶中的抗生素残留，从而带来公共卫生健康的隐患。因此，亟待有新的有效的方法来治疗奶牛乳腺炎。中草药治疗奶牛乳腺炎在我国具有悠久的历史。同时，近年来，通过分离中草药中的天然成分来防治疾病，越来越受到关注。中药作为中华文明的瑰宝，已经传承了上千年，以其具有毒副作用小、成本低、治疗靶点多等优点，有着巨大的研究和发展潜力。本课题通过对白城市隐性乳腺炎流行病学调查和主要致病菌耐药性分析两个方面来展开研究。首先，对吉林省白城市奶牛患隐性乳腺炎的发病情况进行流行病学调查。挑选了四个具有代表性的奶牛养殖场，利用CMT方法对乳腺炎进行诊断，并且分析该地区乳腺炎的发病规律及主要原因。结果显示：该地区奶牛隐性乳腺炎全年平均发病率为38.17%，夏季为高发期，发病率均超过40%，表明奶牛隐性乳腺炎发病与季节有关；四个奶牛场全年发病率分别为30.96%，36.54%，38.91%和46.27%，有卧床设施或采用TMR饲喂均能减少隐性乳腺炎发病率，表明不同奶牛养殖场的饲养管理水平不同导致隐性乳腺炎发病率不同；奶牛胎次从头胎至七胎及以上隐性乳腺炎发病率分别为32.58%，36.72%，43.43%，47.52%，54.98%，67.89%和73.44%，表明奶牛隐性乳腺炎发病率是随着胎次增加而升高，呈正相关关系。其次，了解该地区患奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌情况。从收集的乳样中随机挑取50个样品，通过PCR的方法对病原菌进行分离鉴定。结果显示：感染奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌，各占54%，26%，34%，2%和14%，表明金黄色葡萄球菌为该地区最常见的致病菌。I 然后，进一步了解主要致病菌金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性。对分离出的金黄色葡萄球菌进行药敏试验，以便分析该地区在治疗过程中抗生素的使用情况，指导今后用药。结果显示：金葡菌对青霉素和氨苄西林完全耐药，对红霉素、链霉素、克林霉素、卡那霉素高度耐药，而对多西环素、四环素、万古霉素、新生霉素、利福平高度敏感，提示今后在治疗奶牛乳腺炎的过程中应避免使用青霉素、红霉素和氨苄西林，可以合理的使用多西环素、四环素、新生霉素等抑菌效果较好的抗生素。最后，了解小檗碱、大黄素、黄芩苷三种中药对该地区金葡菌的抑菌效果。通过体外抑菌试验，得出最小抑菌浓度来判断抑菌性，旨在为今后应用于治疗奶牛隐性乳腺炎的药剂提供理论基础和参考价值。结果显示：小檗碱最小抑菌浓度在0.16mg/ml-2.5mg/ml的范围内，平均MIC值为0.795且62.96%的样品MIC为0.16mg/ml，大黄素和黄芩苷的平均MIC分别为2.164mg/ml和4.676mg/ml，抑菌效果均不如小檗碱，表明小檗碱是三种单体之中对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的单体。综上所述，该地区奶牛隐性乳腺炎多发于夏季，发病率随胎次增加而升高，卧床设施或TMR饲喂能减少隐性乳腺炎发病率。金黄色葡萄球菌作为引起该地区奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌，已经对青霉素、氨苄西林等抗生素严重耐药，在今后的治疗应尽量选用敏感性较强的四环素、多西环素、新生霉素等抗生素。中药中的小檗碱具有良好的抑菌效果，可以为今后研制中药组方提供参考，减少抗生素滥用的情况，对公共健康具有重要意义。关键词：隐性乳腺炎，流行病学调查，PCR，金黄色葡萄球菌，药敏试验，中药，最小抑菌浓度II AbstractTheepidemiologicalinvestigationofcattlerecessivemastitisanddrugresistanceanalysisofpathogensinBaichengCity,JilinProvinceDairymastitisisoneofthemostfrequentandcommondiseasesinthefarms,whichseriouslyhindersthedevelopmentofdairyindustryandcauseshugefinancialloss.Duringtheperiodofmastitistreatment,antibioticsasmainmedicinenotonlymakepathogenicmicroorganismresistant,butalsocausesantibioticresiduesinmilkandbringabouthiddendangerinthepublichealth.Thus,theneweffectivetreatmentisurgenttoproduce.Chinseherbmedicineusedtothecattlemastitishasalonghistoryinourcountry.Inrecentyears,preventingdiseasesviaseparationofnaturalingredientsinChineseherbshasbeenreceivedmoreandmoreattention.AsatreasureofChinesecivilization,traditionalChinesemedicinehasbeenhandeddownforthousandsofyearsandhasgreatpotentialforresearchanddevelopmentduetoitsadvantagesofsmalltoxicsideeffects,lowcostandmanytherapeutictargets.ThisstudyisbasedontheepidemiologicalinvestigationofrecessivemastitisinBaichengCityandtheanalysisofdrugresistanceofmajorpathogenicbacteria.Firstly,wedidtheepidemiologicalinvestigationoftheincidenceofcattlesubclinicalmastitisinBaichengCity,JilinProvince.WeselectedrepresentativefourdairyfarmsusingCMTmethod,andanalyzedtheincidencerulesandmaincausesofsubclinicalmastitisinthisarea.Astheresultsshown,theaverageincidenceofdairysubclinicalmastitisinthisregionwas38.17%.Insummer,alloftheincidencerateswereover40%.Thus,thecattlesubclinicalmastitiswasrelatedtoseasons.Theincidenceof4dairyfarmswere30.96%,36.54%,38.91%,46.27%,respectively.BedfacilitiesorTMR-fedmanagementcandeclinetheincidencerateofcattlerecessivemastitis.Thus,thedifferentfeedingandmanagementlevelsofdifferentdairyfarmscanalsoleadtodifferentratesofrecessivemastitis.Theincidenceofrecessivemastitisfromthefirstborntotheseventhbornormorewere32.58%,36.72%,43.43%,47.52%,54.98%,67.89%and73.44%,respectively.Thus,followingtheparityandageincreasing,theincidenceofsubclinicalmastitisalsoraisedwithpositivelycorrelated.III Then,werandomlychose50milksamplescollectedtoisolateandidentifythepathogenicmicroorganismviaPCR,inordertounderstandthemainpathogensleadingtothesubclinicalmastitisinthisarea.Astheresultsshown,therewereStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Streptococcusagalactiae,StreptococcusdysgalactiaeandStreptococcusuberis,accountingfor54%,26%,34%,2%,14%,respectively.Thus,themostcommonpathogeninthisareaisStaphylococcusaureus.Subsequently,theisolatedStaphylococcusaureusweredonesusceptibilitytesttoknowtheresistanceofmainstreamantibiotics,andanalyzetheantibioticsuseintreatmentprocessinthisregion,whichcouldguidefuturemedication.Astheresultsshown,S.aureusiscompletelyresistanttopenicillinandampicillin,highlyresistanttoerythromycin,streptomycin,clindamycinandkanamycin,buthighlysensitivetodoxycycline,tetracycline,vancomycinandnovobiocinrifampin.Itissuggestedthatpenicillinandampicillinshouldbeavoidedduringthetreatmentofmastitisindairycows,andthatantibioticswithbetterantibacterialeffectssuchasdoxycycline,tetracyclineandnovobiocincanbeusedrationally.Finally,forStaphylococcusaureus,berberine,emodinandbaicalinwereusedasinvitroantibacterialteststodeterminethebacteriostaticeffectofthesethreeherbsagainstthepathogenicbacteriainthisregion.Inthefuture,itwillprovidetheoreticalbasisandreferencevalueforthetreatmentofcattlesubclinicalmastitis.Astheresultsshown,berberineminimuminhibitoryconcentrationwasfrom0.16mg/mlto2.5mg/ml,averageMICwas0.795mg/mland62.96%samplesMICwas0.16mg/ml,TheaverageMICofemodinandbaicalinwere2.164mg/mland4.676mg/ml,respectively,whichantibacterialeffectswerenotasgoodasberberine.Thus,berberineamongthethreemonomershadthebestantibacterialeffectonS.aureus.Tosumup,cattlerecessivemastitisinthisareamostlypresentsinsummer,andtheincidenceincreaseswithrisingparity.Farmingmanagementwithbed-basedfacilitiescanreducetheincidenceofrecessivemastitis.S.aureusasthemainfactorthatcausescattlerecessivemastitisinthisregionhasbeenseverelyresistanttoIV antibioticsuchaspenicillinandampicillin.Inthefuturetreatment,tetracycline,doxycycline,novobiocinandotherantibioticswithstrongsensitivityshouldbeusedasfaraspossible.BerberineasakindoftraditionalChineseherbhasgoodantibacterialeffect,whichcanprovidereferenceforfutureclinicaluseofdrugs,reducetheabuseofantibiotics,andhaveagreatsignificancetothepublichealth.Keywords:recessivemastitis,epidemiologicalinvestigation,PCR,Staphylococcusaureus,drugsensitivetest,Chineseherb,MIC.V 目录引言........................................................................................................................1第一篇文献综述........................................................................................................2第一章奶牛乳腺炎的研究概况............................................................................21.1奶牛乳腺炎的概念及危害............................................................................21.2奶牛乳腺炎发病原因及发病机制................................................................41.3奶牛乳腺炎分类及诊断................................................................................91.4奶牛乳腺炎的治疗......................................................................................101.5奶牛乳腺炎的预防......................................................................................15第二篇实验部分......................................................................................................17第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查..................................171.1实验材料......................................................................................................171.2实验方法......................................................................................................171.3结果..............................................................................................................181.4讨论..............................................................................................................231.5小结..............................................................................................................24第二章主要致病菌的分离鉴定..........................................................................252.1实验材料......................................................................................................252.2实验方法......................................................................................................262.3结果..............................................................................................................282.4讨论..............................................................................................................332.5小结..............................................................................................................34第三章金黄色葡萄球菌药敏试验......................................................................353.1实验材料......................................................................................................353.2实验方法......................................................................................................353.3结果..............................................................................................................37I 3.4讨论..............................................................................................................403.5小结..............................................................................................................41第四章小檗碱、大黄素、黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌作用........................424.1实验材料......................................................................................................424.2实验方法......................................................................................................424.3数据处理......................................................................................................434.4结果..............................................................................................................434.5讨论..............................................................................................................454.6小结..............................................................................................................46结论......................................................................................................................47参考文献......................................................................................................................48导师简介......................................................................................................................57作者简介......................................................................................................................58致谢......................................................................................................................59II 英文缩写表英文缩写英文全称中文全称BTBBromothymolblue溴麝香草酚蓝CDClusterofdifferentiation白细胞分化抗原簇CMTCaliforniamastitistest加利福尼亚乳腺炎试验CSFColonystimulatingfactor集落刺激因子DTHDelayedtypehypersensitivity迟发型超敏反应ECMExtracellularmatrix细胞外结合基质E.coliEscherichiacoli大肠杆菌ERKExtracellularsignal-regulatedkinases胞外信号调节激酶IFNInterferon干扰素ILInterleukin白细胞介素iNOSInduciblenitricoxidesynthase诱导型一氧化氮合成酶IRSInsulinreceptorsubstrate胰岛素受体底物JNKc-JunN-terminalkinasec-Jun氨基末端激酶LDHLacticdehydrogenase乳酸脱氢酶LPSLipopolysaccharide脂多糖MφMacrophage巨噬细胞MAPKMitogenactivatedproteinkinases丝裂原激活蛋白激酶MICMinimalinhibitoryconcentration最小抑菌浓度NF-κBNuclearfactor核转录活化B细胞κ轻kappa-light-chain-enhancer-ofActivatedB练增强子cellsNKNaturalkiller自然杀伤细胞ODOpticaldensity光密度值PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PMNPolymorphonuclearneutrophil多形核中性粒细胞I 续表：英文缩写英文全称中文全称PPARPeroxisomeproliferator-activatedreceptor过氧化物酶体增值因子活化受体SARASubacuteruminalacidosis亚急性瘤胃酸中毒S.aureusStaphylococcusaureus金黄色葡萄球菌SCCSomaticcellcount体细胞数T2DMType2diabetesII型糖尿病TNFTumorNecrosisFactor肿瘤坏死因子TrisTrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷II 引言引言作为奶牛养殖业常见的一种疾病，乳腺炎主要诱发因素为病原微生物感染、环境、饲养管理及宿主本身。患病奶牛会导致奶牛乳房发生炎症、奶产量下降、奶品质降低，严重制约了乳品业的发展，从而给畜牧养殖业带来了巨大的经济损失，而且严重制约了乳品业的发展。全世界约有2.2亿头奶牛，而其中约有30%患有不同程度的乳腺炎，对全世界的经济发展造成了巨大的阻碍，大约需要弥补400亿美元的损失。奶牛乳腺炎可以根据临床症状及发病严重程度分为隐性乳腺炎和临床型乳腺炎，隐性乳腺炎较临床型乳腺炎不易被察觉，无显著的临床症状，一般通过乳汁的理化性质来判断，；而临床型乳腺炎一般乳房呈现红、肿、热、痛的典型的炎症反应。奶牛乳腺炎是由多种因素引发的，其中致病菌是引起奶牛乳腺炎最主要的因素，主要致病菌包括链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及一些真菌、支原体等。目前，奶牛乳腺炎的治疗多依靠抗生素，但是抗生素的大量使用一方面会导致病原菌产生耐药性，长此以往，越来越不容易治愈；另一方面又会导致药物残留，残留的抗生素通过乳品或一些乳制品被人类消化吸收，从而危害人体健康。由于近年来回归自然的热潮，中药作为天然草本植物而备受关注。许多中药都具有消炎、抑菌的作用，且成本较为低廉、毒副作用也小，通过层层筛选各种中药，制作出能够治疗奶牛乳腺炎的中药制剂，用来替换替换抗生素，避免产生耐药、变异的致病菌，并且减少药物残留。本研究通过对白城市奶牛养殖场进行隐性乳腺炎流行病学调查，了解该地区隐性乳腺炎的发病情况。并且对主要致病菌进行分离培养、鉴定，以及药敏试验。最后，挑选已被验证对奶牛乳腺炎具有抗炎作用的且具有广谱抗菌性的中药单体小檗碱、大黄素、黄芩苷对主要致病菌进行最小抑菌浓度实验，观察它们的抑菌效果，旨在能为当地乳腺炎的中药治疗提供可参考价值。1 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况1.1奶牛乳腺炎的概念及危害奶牛乳腺炎是由于奶牛的乳腺受到病原微生物、物理、化学等因素的刺激而引起的炎症。乳腺炎会导致乳汁的细胞学、理化性质发生改变，并引起乳腺组织发生病理学变化。据报道，全世界患有乳腺炎的奶牛约占奶牛总数的一半[1]，成为目前困扰全世界奶牛养殖业最普遍的难题。奶牛乳腺炎大致可分为两种类型，即临床乳腺炎和隐形乳腺炎，其中临床型奶牛乳腺炎发病率约占奶牛总发病率的1/5，隐性乳腺炎的发病率则更高。1.1.1经济损失乳腺炎疾病是奶牛养殖场花费最多的疾病。据不完全统计，全世界约有2.2亿头奶牛，约有30%的奶牛患有不同程度的乳腺炎[2]，每年因此造成的经济损失超过350亿美元，约占生殖类疾病总损失的四成[3,4]。资料显示，美国奶牛养殖场中30%-70%的泌乳母牛会患有乳腺炎，牛场每年因奶牛乳腺炎而造成的经济损失高达20亿美元[5]。随着我国奶业的快速发展，奶牛存栏数量急剧增加，至2017底年存栏奶牛数量超过1400万头，而每年因乳腺炎导致的经济损失高达60亿人民币。乳腺炎的花费主要为产奶量下降及劣质牛奶产生、淘汰牛、治疗费以及弃奶等。据有关人士分析，由于患有乳腺炎导致产奶量下降的损失约占七成，提前淘汰奶牛的损失约占14%，治疗费约占8%，弃奶损失约占7%[6]。1.1.2产奶量损失由于奶牛乳腺炎的发生会对乳腺组织产生不同程度的损伤，机体会产生大量的白细胞用于消灭病原微生物和修复受损伤的组织。而大量白细胞的聚集，会导致乳导管阻塞，从而无法正常排出入职，使得部分分泌乳汁的细胞泌乳能力下降，最终引起产奶量下降。根据美国全国乳腺炎委员会（TheNationalMastitisCouncils）发布的相关文件，奶牛四个乳区中任何一个乳区受到轻微的感染，都将导致这头2 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况奶牛的产奶量下降10%-15%，每年则减少产奶量636kg-773kg[7]。1.1.3乳品质下降导致乳品质下降的主要原因是有由于大量中性粒细胞募集用以消灭致病原的同时会导致乳腺组织内的小叶导管变狭窄，乳汁流通不畅，部分滞留于乳腺内的乳汁无法排除而发生变质或营养损失，口味变咸，滋味和气味变差，保质期缩短[8]。奶牛发生乳腺炎后，鲜奶中的成分发生明显改变，其影响详见表1.1：表1.1鲜奶中各成分含量改变对照Tab.1.1Changesinthecontentofvariouscomponentsinfreshmilk正常生鲜乳中含量高体细胞数生鲜乳占正常生鲜乳的生鲜乳成分（g/dL）中含量（g/dL）比例（%）非脂干物质8.98.899脂肪3.53.291总蛋白3.613.5699总酪蛋白2.82.382乳清蛋白0.81.3162乳铁蛋白0.020.07350免疫球蛋白0.10.6600乳糖4.94.490钠0.0570.105184氯0.0910.147161钾0.1730.15791钙0.120.0433当奶牛患有乳腺炎的时候，其乳汁中的蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸六种必需氨基酸以及精氨酸、组氨酸含量明显降低[9]。1.1.4威胁人体健康奶牛乳腺炎主要是通过感染病原微生物引起，由于隐性乳腺炎没有明显的临床症状，常常容易被忽视，当人体摄入含有致病菌的牛奶后，会对人体健康造成严重的影响。其中，结核杆菌和布鲁氏菌能引发结核病与布鲁氏菌病，金黄色葡萄球菌可引起人腹泻、呕吐、脱水、发烧等，化脓性链球菌能引起化脓性扁桃体3 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况炎、咽喉炎、猩红热。当今全世界还是主要使用抗生素来治疗奶牛乳腺炎。但是由于广谱抗生素的长期大量使用，容易导致奶牛乳品及乳制品中也残留抗生素。当人类摄入含有抗生素残留的牛奶，容易使体内的部分细菌产生耐药性，损伤人体的免疫系统，引起过敏反应，严重时可导致过敏性休克[10]。因此，FAO/WHO食品法典委员会明确规定了牛奶中各种常用药物残留量的限定值，而我国于在2001年9月公布的《无公害食品生鲜牛乳》的行业标准明确规定了在生鲜牛乳中不得检出抗生素[11]。1.2奶牛乳腺炎发病原因及发病机制1.2.1病原微生物感染病原微生物感染是引起奶牛乳腺炎的主要原因。能够引起奶牛乳腺炎的致病菌种类多达150种，较为常见的有23种，包括细菌、真菌、病毒及支原体[12]。按来源和传播特点可分为：接触传染性病原微生物和环境性病原微生物。接触传染性病原微生物主要在挤奶过程中，通过工作人员的手、挤奶机器或擦拭乳房的抹布扩散到牛群中，包括金葡菌和无乳链球菌等；环境病原微生物主要来源于牛舍的环境中，例如垫料、泥土、积水、粪便等，通过乳头接触这些污染物，从而使致病菌进入乳腺组织引起乳腺炎，包括大肠杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌等。大多数患奶牛乳腺炎主要是由葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、酵母样菌引起的，其中葡萄球菌和链球菌是临床型奶牛乳腺炎的主要致病菌，约占50%-80%。（1）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为兼性厌氧革兰氏阳性菌，可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气，甲基红反应为阳性，VP反应为弱阳性，大部分菌株凝固酶和触酶实验为阳性，能够分解甘露醇[13]。接种在血平皿的金葡菌会形成周围有透明溶血环的菌落。1880年，在苏格兰患有阿伯丁溃疡的病人脓疮中第一次发现了金葡菌[14]。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌，同时也是可以人畜共患的一种细菌，广泛存在于外界环境、粪便及牛体内[15]，可通过挤奶工作人员的手、擦拭的抹布、挤乳器等传播，多见于泌乳高峰期。金葡菌主要通过皮肤或粘膜，4 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况呼吸系统，手术切口或导管进入位点这三种途径进行感染，蚊虫苍蝇叮咬乳头也可以传播金黄色葡萄球菌。金葡菌会先通过它的表皮蛋白介导粘附上宿主细胞的细胞外结合基质（ECM）[16,17]，细胞外结合基质是构成动物组织的重要部分，用于维持脊椎动物的组织以及器官的结构和功能。然后将宿主的可溶性细胞外结合基质结合到金葡菌的表面，将金葡菌进行伪装从而帮助其逃避免疫系统的识别，利于其在胞内扎根并生长繁殖，产出大量毒素和酶，包括血浆凝固酶、肠毒素、溶血素等，用于破坏乳腺细胞。金葡菌的致病能力便是由这些酶或毒素决定的。阳性的血浆凝固酶是致病株，它可以避免血清当中的具有杀菌性的物质对金葡菌产生作用，同时，它还具有免疫原性，可以刺激机体产生抗体保护细菌感染，而阴性的凝固酶则是不致病的[18]。肠毒素是可溶性蛋白质，具有耐高温的特点，能够不受胰蛋白酶的影响，一般会导致急性肠胃炎[19]。溶血素一般分为四个型，其中α型对人致病，β型对动物致病，金葡菌进入奶牛体中分泌的就是β型溶血素。金葡菌通过这种机制感染奶牛乳腺组织，严重时出现临床的炎症症状，感染轻微时，表现为牛奶中体细胞数增加和乳房纤维化，会大大降低牛奶产量和质量[20]。金葡菌作为导致奶牛乳腺炎主要致病菌中最难治疗的病原菌，治愈率常常低于50%[21]，若治疗不及时，会转变为坏死或是败血症，死亡率通常高达100%[22]。金葡菌不仅能感染奶牛乳腺，也可以通过乳品或乳制品使人患病，严重威胁着人体健康[23]。迄今为止，治疗金黄色葡萄球菌的主要药物还是抗生素，但是这种直接抑制或杀灭细菌的方法会使其易产生抗药性[24]。在20世纪中旬，人们就先后运用了磺胺类药物和青霉素、甲氧西林来治疗由金葡菌感染的疾病，然而不久便表现出了对这些药物的耐药性[25,26]。金葡菌主要是在遗传学水平通过基因水平转化机制或在生理学上通过增厚细胞壁，形成生物被膜，改变表型来产生耐药性[27-29]。（2）大肠杆菌大肠杆菌为革兰氏阴性菌，1885年由Escherich医生从幼儿排泄物中分离出来又名大肠埃希氏菌[30]。大肠杆菌在正常情况下是一种能够在人和动物的肠道存在且不会致病的肠道共栖菌，但是当肠道菌群紊乱或是宿主抵抗力下降时，这些大肠杆菌也有可能致病。作为环境致病菌，它需与乳头接触后经过乳导管进入乳池，才能感染，多发于泌乳高峰期和多产奶牛。大肠杆菌能够在乳房里迅速地大5 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况量繁殖，并被血液吸收，引起急性临床型奶牛乳腺炎，发病急，数日便可死亡。临床表现常为乳房肿胀，乳汁呈水样，并迅速停止泌乳[31]。大肠杆菌是一种易产生耐药性的细菌，可以在不同细菌间互相传播，这便使大肠杆菌的耐药范围会变得越来越大，易衍生出超级细菌。同时，大肠杆菌能够在不发病的情况下存在于动物体内，便于在不同种的动物之间相互传播传播，这样会给我国的畜牧业带来很多潜在的危害。（3）链球菌链球菌感染的奶牛乳腺炎一般为隐性乳腺炎，个别为临床型乳腺炎，一般呈慢性经过，也会出现少数急性、亚急性经过，侵染乳腺底部腺导管及整改乳房，症状严重时可能导致乳腺萎缩或间质增生。链球菌中一般会引发奶牛乳腺炎的主要是无乳链球菌、乳房链球菌和停乳链球菌。无乳链球菌是传染性病原微生物，是乳房的专门寄生菌，在外界环境中很少见。无乳链球菌在挤奶过程中附着于乳腺管壁上，引起慢性乳腺炎，进而减少产奶量。停乳链球菌和乳房链球菌为环境致病菌，常存在于垫料、积水、土壤中。当环境适宜这些细菌生长时，例如高温潮湿的夏季，它们的传播速度加快，乳腺炎发病率也随之增加。（4）支原体近几年来的研究发现，支原体也是引起奶牛乳腺炎的重要病原微生物[32,33]。它在体外很难培养，在乳汁中也较难被检测到[34]。相关报道显示，牛支原体能诱发临床型乳腺炎，病原可能来自于牛的呼吸道[35,36]。由支原体引起的奶牛乳腺炎是具有传染性的，能通过牛奶、粪便、羊水、流产胎儿等传播，牛奶中携带支原体的排泄时间能长达2个多月。支原体能够造成牛群急性地域性乳腺炎，然后渐渐转变为慢性乳腺炎临床表现为突发，受感染的乳区肿胀疼痛，产奶量急剧减少至完全无乳汁分泌，乳汁呈黄褐色的浆液，常常会伴有跛行和呼吸道问题。急性期过后，乳室便会萎缩。1.2.2环境因素奶牛的生活环境与疾病息息相关。当生存环境较差时，例如垫料潮湿，积水，粪便堆积，空气不流通等，都容易滋生各种病原微生物。当奶牛卧下时，乳头会6 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况与这些污染物接触，从而感染环境致病菌，引发乳腺炎。另外，由于四季更替，气温湿度的改变也会带来奶牛乳腺炎发病率的改变。当处在高温闷热、潮湿多雨的夏季时，奶牛食欲减退，热应激，导致抵抗力下降，同时潮湿的环境会给细菌提供一个良好的生长环境，使得致病菌更易侵袭奶牛，从而导致奶牛乳腺炎发病率上升。1.2.3饲养管理不当饲养管理不当主要包括牛舍设计缺陷，挤奶操作不当，饲料搭配不均等。牛舍作为奶牛生活时间最长的地方，当存在地面不平整、踏板台阶过高、门狭窄、等问题，可能导致牛群在日常生活中易发生拥挤、滑倒，增加奶牛患外伤感染的机会，同时保温设施差，饲养密度不合理，也能导致牛群易产生热应激和冷应激，通风达不到应有的效果，导致病原菌易在牛群中蔓延。挤奶过程中，若工作人员缺乏清洁意识，例如挤奶前没有将机器、手进行消毒，病牛和健康牛公用一套工具等，都会增加奶牛患乳腺炎的几率。当日粮中营养供应不充分或不均衡时，会导致奶牛身体机能紊乱，抵抗力下降，患乳腺炎的风险增加。对于高产奶牛投喂过多精饲料时，虽然能提高产奶量，但是会引起瘤胃菌群紊乱，诱发亚临床型瘤胃酸中毒（SARA），在酸性条件下大量细菌死亡释放内毒素（LPS），随着内毒素的大量释放破坏瘤胃上皮屏障功能，进入血引起全身性慢性低度炎症，破坏血乳屏障的完整性，降低PMN跨血乳屏障的阈值，当受到外界刺激时，可引起大量PMN进入乳腺组织，增加奶牛乳腺炎的易感性。同时，LPS进入乳腺可导致PMN免疫耐受，从而使得其吞噬能力下降，这也是造成乳腺炎易感性增加另一原因。[37-39]。饲料中缺乏维生素A、维生素E，还有铁、硒都会导致乳腺炎患病率明显增加[40]。1.2.4自身因素奶牛乳腺炎的发病概率与先天性遗传基因有一定关系，遗传因素对生产能力的影响约占20%左右。大量研究指出，许多疾病的抗性是遗传基因决定的，乳腺炎的抗性在不同品种之间也不完全相同，荷斯坦奶牛的发病率就高于其他品种[41]。一般而言，产奶量越高的奶牛发生乳腺炎的几率也就越高，可能与能量负平衡或者抗性基因有关[42]。随着年龄的增长，奶牛的免疫力呈现下降趋势，在长此以往7 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况的挤奶过程中，乳头遭受挤压、摩擦损伤，使得括约肌变得松弛，无法完全闭合，更容易使病原微生物进入到乳腺中，引发乳腺炎。另外，当奶牛患某些疾病后，例如难产、子宫内膜炎、胎衣不下、产后败血症等，容易诱发或继发乳腺炎[43]。1.2.5发病机制（1）病原菌入侵乳房乳头、乳池、乳导管和乳腺泡四部分构成了乳腺[44]。乳头作为乳腺的第一道防线，乳导管内的角蛋白层形成的生化屏障用来抵御细菌入侵[45]。在正常状态下应该是闭合的，但是在以下四种情况下，病原菌会通过乳导管进入到乳腺中：①挤奶的间隙，乳头括约肌由于挤奶而变得松弛，致病菌便可以通过在乳导管增殖进入乳池中；②由于机器挤奶依靠真空波动，当乳导管口产生的微量的牛奶中携带致病菌，牛奶被吸入的过程的病原菌也随之进入了乳房；③当注射抗生素的时候，致病菌可以随着注射器头部伸入乳导管的空隙进入，并在角质层大量增殖；④奶牛走动时，乳头受到机械压力也会使致病菌有可乘之机进入乳房[46]。（2）病原菌感染乳房感染多发生在病原菌逃避天然防御机制之后由乳导管进入乳腺，再次逃避乳腺组织中体液免疫和细胞免疫后引发乳腺炎[47]。体液免疫中含有补体、溶菌酶、免疫球蛋白等对乳腺起着保护作用，例如补体C5a可以诱导乳腺腺泡间隙中的的中性粒细胞转移入腺泡中以增强其吞噬作用[48,49]，溶菌酶能够协同补体、免疫球蛋白、乳铁蛋白等杀菌能力[50]。细胞免疫中有巨噬细胞（Mφ）、自然杀伤细胞（NK）、多核中性粒细胞（PMNs）等先天免疫细胞在其中起防御作用，其中巨噬细胞具有吞噬、抗原提呈细胞功能，是炎症开始的标志[51,52]，自然杀伤细胞受到炎性因子IL-2刺激能释放出皂角苷样杀菌蛋白来杀死金葡菌[53]，至于中性粒细胞在乳腺炎保护作用还尚在探究中[54]，不过有研究表明中性粒细胞可能会使乳腺功能紊乱。另外，还有B细胞、树突状细胞、CD4+、CD8+共同参与免疫调节。（3）炎症反应此时，白细胞会进入感染区，形成炎症反应。致病菌从乳头乳池、乳导管内皮组织进入到泌乳区，在乳腺腺泡上增殖，通过释放内毒素破坏组织，引起泌乳细胞水肿甚至死亡。为消灭致病菌，大量白细胞进入感染区，释放大量炎性因子，8 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况例如肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）、干扰素（IFN）等，破坏泌乳细胞。同时，乳汁中的体细胞数会持续升高，进而更加严重地破坏乳腺组织，血乳屏障遭到破坏，细胞外液将进入乳腺中与乳汁混合，乳房表现红肿发硬，有异样的浆液分泌物。这可能导致乳汁合成减少，因此造成产奶量下降[55]。1.3奶牛乳腺炎分类及诊断1.3.1临床型乳腺炎临床性乳腺炎具有较为明显的临床症状，它具有炎症典型的“红、肿、热、痛”的症状，其发病率明显低于隐性乳腺炎。轻度临床型乳腺炎一般无明显异常，在乳汁中常常能看见凝块。重度临床型乳腺炎临床症状为乳房肿胀发热，触摸坚硬，乳汁呈水样或带血，还有絮状物或者凝集团块，往往伴有体温升高、精神沉郁、食欲减退、脱水等全身症状。1.3.2隐性乳腺炎隐性乳腺炎又名亚临床型乳腺炎，一般无法通过肉眼观察到临床症状，但是若不加治疗则可演变为临床型乳腺炎。尽管无法通过肉眼观察出是否患有隐性乳腺炎，但是可以通过实验室检测乳汁，通过与正常指标比较来判断患病情况。确诊患乳腺炎的最主要的指标便是体细胞数（SCC）增加，可以通过体细胞直接计数法或者加利福尼亚乳腺炎试验法（CMT）[56]，国际奶牛联合会宣布乳汁中测得体细胞数大于5×105的判定为阳性[57]。由于血乳屏障被破坏，渗透性也随之改变，钠离子和氯离子进入乳汁，使得乳汁的电导率提高，这也是检测隐性乳腺炎的临床指标之一[58]。有研究表明，患乳腺炎的奶牛的乳汁为碱性，pH值越高，炎症越严重，主要是由于血管的渗透性增加，使大量白细胞渗出，体细胞快速增加，逐渐乳汁与血液的pH差值减少，患病奶牛的乳汁pH值接近于血液pH值7.4，一般使用乳腺炎试纸法或者溴麝香草酚蓝试验（BTB）。其他还可以检测乳汁中乳酸脱氢酶（LDH）和乳清蛋白量来鉴定乳腺炎，炎症越严重，乳酸脱氢酶活性越强，乳清蛋白量越多。此外，病原菌的分离鉴定不仅是检测乳腺炎的标准方法，而且可以通过分离出细菌的种类来推测牛场在饲养管理、环境等因素上存在的问题。9 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况1.4奶牛乳腺炎的治疗治疗乳腺炎秉持“杀灭病原，控制感染，减轻和消除炎症，改善奶牛全身状况，防治败血症”的基本原则，在治疗过程中应注意早发现早治疗，根据乳腺炎发病病因不同采取不同的治疗方法，将局部治疗与全身治疗、对症治疗与对因治疗相结合，即时淘汰患有慢性乳腺炎的奶牛。1.4.1化学疗法奶牛乳腺炎主要由病原微生物引起，因此消灭病原菌是主要目的，目前，抗生素仍然是治疗奶牛乳腺炎的主要药物。用于治疗奶牛乳腺炎的抗生素主要有青霉素、氨苄西林、庆大霉素、红霉素、链霉素等，可以采取局部乳房灌注法或全身疗法，当情况严重时，应给予静脉注射[59]。经过确诊后，需由兽医开药并在其指导下用药。在使用抗生素时，应根据药敏试验选择药物，避免盲目用药，耐药的抗生素已经不具有杀菌作用，并且需要根据奶牛自身的情况计算用药剂量，避免滥用抗生素导致药物残留[60]。1.4.2物理疗法物理疗法可以通过激光、红外线、紫外线照射，热敷、冷敷，按摩乳房，乳房送风来减少炎性渗出，消炎止痛，其中按摩乳房有利于通经活络、开通闭塞、消散淤肿，使组织产生乙酰胆碱和组织胺，增加体液循环，加快新陈代谢，增强组织再生能力，配合挤奶次数增加，有利于排出已经变质的牛奶和病原菌[61,62]；激光疗法能促进血液循环，加强体液和细胞免疫的作用，激活肥大细胞产生组胺、内啡肽等活性物质；乳房送风则是通过将风吹入乳房以增强乳房内压强来压迫毛细血管达到止血的目的。1.4.3生物疗法生物疗法主要包括细胞因子疗法和溶菌酶疗法。细胞因子主要有肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）等，它们主要是由免疫系统和造血系统产生，能够调节细胞分化、增强免疫功能、促进组织修复、促进造血、抗肿瘤等。溶菌酶是一种碱性水解酶，能够水解细胞壁上的10 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况N-乙酰氨基葡萄与乙酰胞壁酸之间的糖苷键，使细胞壁的不溶性多糖分解成为可溶性糖肽[63]。溶菌酶对乳腺炎的主要致病菌金葡菌、链球菌、大肠杆菌都具有较强的杀菌能力，对于一些对抗生素已经产生耐药的细菌也具有很强的抑制作用，并且对人体和环境没有危害。孙怀昌教授研制出人溶菌酶基因重组质粒用来治疗患乳腺炎的奶牛，有效率高达83%，相较于抗生素而言，治疗效果相近但是不易产生耐药性[64]。1.4.4中药疗法中药是我国传承千年的文化瑰宝，它具有丰富的资源、低廉的价格、毒副作用小、无残留等优点，针对奶牛乳腺炎的主要发病机制，通过促进血液循环来消除淤肿，改善局部血液循环，清热解毒，祛除病原微生物，调节免疫，补充气血，治愈疾病。中药中的活性单体包括生物碱类、苷类、酚类、酸类等具有抑菌杀菌能力，中药组方例如血竭、当归、生地、丹参、桃仁川芎具有消除瘀滞乳汁和血液、改善微循环、疏通乳导管、促进血液再生、加速乳汁转化的功效[65]，并且能对免疫系统产生刺激，用来调节非特异性抗菌因子，利于细胞因子生长，提高机体免疫能力[66]。虽然中药在治疗奶牛乳腺炎方面具有许多优点，但在应用方面仍存在许多问题，例如究竟是何种物质在中草药制剂中起关键作用，如何达到治疗效果，如何使中草药制剂标准化等。因此，筛选出具有治疗作用的中药，分离、纯化它的有效成分，研究其作用机理，制定合理的剂型是亟待解决的问题。（1）小檗碱小檗碱（Berberine）又名黄连素，是从黄柏、黄连中提取出来的。黄连具有抗菌、抗炎、清热解毒、止泻、抗心律不齐等作用。小檗碱的化学式为C20H18CINO4，它是一种常见的异喹啉生物碱，是一种羟基化合物，呈黄色粉末状，溶于水，难溶于乙醇、乙醚和氯仿。它的药理作用包括降压，抗心律失常，降低血糖，保护由缺血引起的脑组织损伤，保肝，抗肿瘤，抗菌，抗炎等[67,68]。11 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况小檗碱具有广谱抗菌的功效，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒、线虫、原虫等都具有抑制或消杀作用[69]，对于细菌性腹泻，就常常使用小檗碱来治疗。有研究证明，小檗碱的抑菌效果是通过抑制细菌丙酮酸氧化脱羧和核酸合成的方式[70]。Freile等通过给小鼠腹腔注射大肠杆菌建立大肠杆菌病的模型，观察临床症状和病理学变化，发现小檗碱对大肠杆菌引起的疾病有较好的治疗效果[71,72]。杨勇等通过研究小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马亭的抑菌效果发现这四种黄连生物碱对革兰氏阳性菌的抑菌效果相较于革兰氏阴性菌的而言则是更加好，并且小檗碱的抑菌效果最好[73]。华国强等通过最小抑菌浓度试验发现小檗碱对金葡菌的MIC值在0.15-0.3mg/ml[74]。Quan等研究发现小檗碱与氟康唑联合用药具有较好的协同效果，虽然小檗碱自身抗真菌的效果一般，但是和咪吡、咪唑类药物联合使用，能有效地抑制真菌，甚至对已经耐药的真菌也起到较好的作用[75]。近几年来，小檗碱被越来越多的研究报告指出具有抗炎作用，对于溃疡型结肠炎、自身免疫性肾小管间质肾炎、迟发型超敏反应（DTH）等都具有抑制作用。姜昕等研究发现小檗碱通过ERK蛋白信号转导对外周血单核细胞COX-2mRNA具有抑制作用，但是对p38MAPK活性不具有明显的抑制效果[76]。张昊晴等通过建立肺损伤小鼠模型来研究小檗碱对由脂多糖（LPS）引发的急性肺损伤的作用机制，发现小檗碱能够抑制cPLA2的磷酸化来防治内毒素引起的肺损伤[77]。吴阳阳等发现了小檗碱对内毒素（LPS）和白介素-4（IL-4）诱导的RAW264.7细胞分泌的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）的作用，发现小檗碱能抑制TNF-α和IL-10的分泌，可能小檗碱能调节巨噬细胞的极化过程[78]。二十世纪八十年代起，小檗碱就用于治疗II型糖尿病（T2DM），它能改善糖代谢，增加胰岛素敏感性，提高胰岛素抵抗能力[79-81]。TNF-α通过胰岛素受体底物-1（IRS-1）丝氨酸残基磷酸化破坏胰岛素信号转导通路，氧化物酶体活化受体-γ（PPAR-γ）参与脂肪细胞分化及糖代谢，白介素-6（IL-6）通过抑制表达PPAR-γ转录因子来降低外周组织对胰岛素的敏感性，最终导致胰岛素抵抗[82,83]。小檗碱能够降低脂肪组织内细胞因子的表达，抑制NF-κB蛋白通路，以便改善葡萄糖耐受和胰岛素抵抗的情况。12 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况（2）大黄素大黄素（Emodin）又名朱砂莲甲素，是从蓼科植物虎杖和大黄中提取的活性物质。大黄素是羟基蒽醌化合物，分子式为C15H10O5，呈橙黄色，不溶于水，可溶于乙醇和碱性溶剂。大黄素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝等作用[84,85]。大黄素作为广谱抗菌药，对链球菌、肺炎双球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌等都具有抑菌效果[86]。周磊等研究发现大黄素可以破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性抑制细菌体内蛋白质合成，减弱琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性以达到杀菌的目的。黄晓敏等发现大黄素对厌氧菌的抑菌作用是通过改变厌氧菌细胞膜通透性和干扰细胞壁形成，大多数厌氧菌在8μg/L的大黄素溶液中就停止生长了，抑菌效果或许比头孢甲噻吩强[87,88]。有研究显示，大黄素可以破坏幽门螺旋杆菌的DNA一起到抑制的作用[89,90]。朱珠构建了患布鲁菌的小鼠模型，通过体内体外实验发现大黄素对布鲁杆菌其抑制作用，主要是通过增强IFN-γ、TNF-α和IL-6分泌量来起到作用的[91]。由于引起炎症的信号通路主要为NF-κB，而大黄素能够显著抑制NF-κB转导，减少炎性因子分泌水平，下调VCAM-1、ICAM-1和ELAM-1蛋白表达，从而达到抗炎的作用[92]。曾欢欢等研究发现大黄素能保护急性脊髓损伤后的神经元，减弱炎症反应和氧化应激，可能与激活Nrf2-ARE蛋白通路，增强GFAP、NF2表达水平，减少TNF-α、IL-1β和IL-6分泌有关[93]。兰景彬等通过建立LPS诱导的肺转移小鼠模型发现大黄素能抑制结肠癌细胞SW480的增殖、迁移、侵袭进而阻止LPS诱导的结肠癌细胞向肺部进行转移[94]。大黄素还可以抑制Cox-2和iNOS蛋白表达来达到减轻炎症反应[95]。近期研究指出，大黄素可以通过抑制肿瘤细胞繁殖，促进肿瘤细胞凋亡以及抗生成新血管等多个方式来抑制胃癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤疾病。PoojaT等研究发现大黄素能阻止Wnt蛋白信号通路激活，降低TCF/LEF转录活性，下调靶点TCF-712、snail、vimentin、c-Myc、β-catenin、MMP-2、MMP-9、以及cyclinD1，还能抑制Wnt共激活物P300，增强抑制物HNP1的表达，另外，还与活性13 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况氧簇（ROS）有关[96]。LiWY研究发现大黄素可以调节有关凋亡的基因表达程度来促进癌细胞凋亡[97,98]。JiaX等研究发现大黄素抑制肿瘤细胞迁移是通过下调转录激活因子6（STAT6）来抑制M2巨噬细胞募集和极化[99]。YangZ等研究发现大黄素可抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-6（IL-6），iNOS和COX-2的表达，同时还可以抑制LPS诱导的NF-κB活化，IκBα降解，ERK，JNK和P38的磷酸化。此外，大黄素可激活PPAR-γ，大黄素的抗炎作用可被PPAR-γ的特异性拮抗剂GW9662逆转，从而减弱LPS诱导的炎症反应[100]。除此之外，大黄素还能抗病毒，包括乙肝病毒、冠状病毒等[101]，还能通过抑制脂质过氧化和超氧自由基生产来抗氧化，还能通过减慢肝纤维化和促进肝细胞生长起到保肝作用等[102,103]。（3）黄芩苷黄芩苷（Baicalin）又名黄芩甙，是从黄芩中提取的活性成分。黄芩具有清热解毒、安胎、止血、保肝利胆的作用。黄芩苷作为黄酮类化合物，分子式是C12H18O11，呈淡黄色粉状，不溶于水、苯、乙醚、氯仿，可溶于碳酸氢钠等碱性溶液中，易溶于二甲基酰胺溶液中。黄芩苷具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗变态、保肝等作用。黄芩苷作为广谱抗菌药，能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌等致病菌，与抗生素联用具有协同作用。有研究发现，黄芩苷与苯唑西林共同作用于金黄色葡萄球菌时，不仅能增强药物杀菌能力，还能使金葡菌不易耐受，降低它的抗药性[104]。熊英等通过研究黄芩苷对白念珠菌的保护机制发现黄芩苷是抑制了白念珠菌基因和蛋白质合成，造成细菌死亡而起到灭菌作用[105]。黄芩苷主要是通过抑制释放组胺、白三烯、5-羟色胺等介质，降低血管通透性，减少肥大细胞脱颗粒起到抗炎的作用，发生急性炎症时，它能明显减少炎症介质的含量[106,107]。吴琼等通过建立由LPS诱导的脓毒血症小鼠模型来探究黄芩苷对肠道损伤的作用机制，发现黄芩苷是通过改善肠黏膜结构，加强肠黏膜功能，以避免肠上皮细胞受氧自由基损伤[108]。于丰彦等研究发现黄芩苷能够显著抑制14 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况IL23R和RORC表达，减少IL-5、IL-6和IFN-γ等细胞因子分泌量，提高IL-4、IL-10和TGF-β1水平，调节免疫平衡，减轻溃疡性结肠炎反应[109]。对于逐年增长的癌症发病率，黄芩苷可以诱导癌细胞凋亡，阻止癌细胞分裂增殖，起到抗肿瘤的作用。陈玉凤等发现黄芩苷能够通过抑制BGC-823和MGC-803细胞增殖，促进细胞凋亡，提高这两种细胞内caspase3、caspase8、TRAIL、FAS、FASL的表达水平，与死亡受体通路有一定的联系[110]。白惠茹等进行体内体外实验证明黄芩苷能抑制结肠癌HCT116细胞增殖，诱导其细胞凋亡，减少cyclinB1和cyclinD1表达量使HCT116细胞停留在G1期，因此具有显著的抗癌作用。还有研究发现，黄芩苷能够抑制乳腺癌细胞基质金属蛋白酶抑制酶2表达，减少癌细胞增殖，通过减弱癌细胞端粒酶活性达到抗癌的效果[111]。另外，黄芩苷对肝脏、心脑、牙周等都具有保护作用。黄芩苷能提升谷胱甘肽，减少血清脂质过氧化物丙二醛含量，阻止肝脏细胞变性坏死[112,113]；增强心肌功能，调节血脂及动脉粥样硬化，抗心律不齐[114]；减少因脑缺血而造成的梗死灶，保护脑组织[115]。1.5奶牛乳腺炎的预防奶牛患乳腺炎有许多种因素，包括季节变换，牛舍设计不合理、卫生清洁不到位，挤奶过程不注意消毒，饲养管理缺乏经验、水平低，病原微生物侵袭，自身条件、遗传基因等，其中一种或多种同时有问题时，都会造成奶牛乳腺炎。当中有一些因素是不可控的，例如季节变化，年龄、胎次增加，遗传基因等，所以只能通过改善人力可控的因素来减少奶牛乳腺炎的发病率，其中饲养管理是最为关键的一环，它直接影响奶牛泌乳性能和对疾病的抵抗力，进而决定了牛场能获得经济效益。1.5.1饲养原则饲料需要精粗混合、科学搭配和加工，保证满足奶牛所需的各种营养。在变换饲料的过程中需要循序渐进，防止突然改变饲料引起奶牛应激，以免损伤奶牛健康，减少产奶量。高产奶牛与低产奶牛应分开饲养，采用不同的饲料配方和饲养量，以防低产奶牛摄入过多精饲料变得肥胖，易造成不孕不育。工作人员在投15 第一篇文献综述第一章奶牛乳腺炎的研究概况喂饲料时，应该轻手轻脚，避免大声说话，影响奶牛进食。平时需要满足奶牛能够自由饮水，但是投喂时间应该统一，避免影响奶牛泌乳，且应控制奶牛摄食后为八九分饱。1.5.2管理原则注重卫生，保持牛舍牛床清爽干净，防止积水、粪便堆积，定期消毒，减少环境中的病原微生物和接触病原菌的机会。提高工作人员的卫生意识，在挤奶过程中，充分做好手、手套、乳房、抹布、机器的消毒工作，防止病原菌感染奶牛并在牛群中传播。注重牛体的清洁，包括被毛、蹄部等，坚持每日刷拭。保持牛舍安静，给予奶牛充足的休息时间，同时，每天的放牧运动也必不可少，这能保证奶牛照射到太阳，促进钙的吸收，增强体质，提高配种成功率。平时注意通风换气，保证牛舍空气干净，天气转凉要及时做好保暖措施。值班的工作人员要每天记录好牛群的情况，进行定期的检测，若有突发情况发生要及时报备，能够及早做出防范措施，减少经济损失。16 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查白城市位于吉林省西北部，是全国农业四大开发区之一，2016年农林牧渔业的总产值达223.1亿元，其中畜牧业的产值为64.4亿元，占总产值的24%。由于乳制品工业的迅速发展，奶牛养殖业也蓬勃发展起来，2016年白城市牛奶产量为16.8万吨。目前全市主要有大型奶牛场和个体私营奶牛两种养殖模式。随着硬件条件的发展，管理水平显得更为重要，它的高低决定了奶牛养殖场的利润，而隐性乳腺炎作为评判奶牛养殖场综合管理水平的一个重要指标，对它的调查显得尤为重要。由于隐性乳腺炎的临床症状不明显，危害大且发病率高，必须引起奶牛养殖者重视。为了准确掌握白城市奶牛隐性乳房炎的发病情况，从2016年12月至2017年12月挑选了4个具有代表性的奶牛养殖场进行了为期1年的调查，旨在为今后该地区奶牛隐性乳腺炎的防治提供参考价值。1.1实验材料1.1.1实验对象挑选白城市具有代表性的四个奶牛场的泌乳奶牛，有卧床设施且应用全混合日粮饲喂的牧场记为A组，无卧床设施且应用全混合日粮饲喂的牧场记为B组，无卧床设施且应用全混合日粮饲喂牧场化管理小区记为C组，无卧床设施且没有应用全混合日粮饲喂的普通奶牛小区记为D组。1.1.2试剂及药品CMT诊断液、诊断盘均购自上海聚益畜牧科技有限公司；新洁尔灭；医用酒精棉球1.2实验方法（1）样品采集：分别在每个月1号进行采样检测，连续测定12个月。17 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查（2）采集和检测方法：在采集牛奶样本之前先用0.1%的新洁尔灭消毒液将整个乳房进行擦拭消毒，再用75%的医用酒精棉球擦拭乳头及周围部分。采样者采样时，先弃去前三把奶，再用高压灭菌过的试管收集少量乳样，冻存于-80℃冰箱以作后期的检测。随后分别汲取四个乳区的乳样2ml以顺时针的方向收集到各自的诊断盘中，接着加入CMT诊断液2ml，均匀地水平转动，待乳样与CMT诊断液充分混匀后，等待10秒，判定结果。（3）判定标准，详见表1.1：表1.1CMT诊断液判断标准Tab.1.1ThestandardofCMTdiagnosticfluid乳汁反应情况结果判定表达符号混合物为液体，呈紫红色，盘底无沉淀。阴性－混合物呈淡紫色，盘底有微量的沉淀，稍微摇动后可疑±沉淀即消失。盘底可见少量的紫色的具有稀薄粘附性的沉淀，流弱阳性+动性较大，晃动时沉淀可在盘底呈散布状。盘底有较多且较为粘稠的紫色沉淀，有凝集现象。当诊断盘倾斜时，沉淀物无移动现象，旋转时，则阳性++向中心聚集。混合物呈胶装，大部分凝集在一起，粘于盘底，呈强阳性+++深紫色。旋转诊断盘时，沉淀散不开。1.3结果1.3.1白城市奶牛隐性乳腺炎发病率与季节的关系根据气候统计学规定，3-5月为春季，6-8月为夏季，9-11月为秋季，12-次年2月为冬季。经χ2检验，3-5月分别与6-8月、9-11月、12-2月间差异显著（χ2=71.00，χ2=26.25，χ2=16.75，且P＜0.05）,6-8月分别与9-11月、12-2月间差异显著（χ2=11.40，χ2=159.24，且P＜0.05），9-11月与12-2月间差异显著（χ2=87.06，且P＜0.05）。因此，奶牛隐性乳腺炎发病率与季节具有相关性。如表1.2，1.3和图1.1所示，从1至5月以及11月、12月由于当地气温较低，牛群患隐性乳腺炎较少，每个月发病率均低于40%，但是随着温度升高，隐18 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查性乳腺炎发病率迎来高峰期，6-8月正值夏季高温潮湿的时候，发病率显著增加，在8月份达到峰值48.68%。表1.2全年隐性乳腺炎的发病情况Tab.1.2MorbidityofsubclinicalmastitisthroughouttheyearA组B组C组D组阳性头数被检头数阳性率%阳性头数被检头数阳性率%阳性头数被检头数阳性率%阳性头数被检头数阳性率%1月14565022.2410636928.765419128.335214236.802月15160425.0611439728.727525130.044512835.033月14755026.6810631433.796921232.476215440.124月17760829.0912435834.7110429235.466213645.825月19361831.1811530637.539725338.536412750.076月17258829.3312029440.957918841.766211753.137月23665935.8413629745.7810821450.398614658.778月29070641.0214830848.168216948.456611657.109月25463340.2013632142.5211123846.715310152.9610月24865038.0912234435.4910024341.255411945.7411月14653227.4011937831.4311429738.475412941.5612月15460525.439330330.639928435.005714838.18表1.3全年隐性乳腺炎发病率Table.1.3IncidenceofsubclinicalmastitisthroughouttheyearA组B组C组D组平均阳性率%1月22.2428.7628.3336.8029.032月25.0628.7230.0435.0329.713月26.6833.7932.4740.1233.274月29.0934.7135.4645.8236.275月31.1837.5338.5350.0739.336月29.3340.9541.7653.1341.297月35.8445.7850.3958.7747.708月41.0248.1648.4557.1048.689月40.2042.5246.7152.9645.6010月38.0935.4941.2545.7440.1411月27.4031.4338.4741.5634.7212月25.4330.6335.0038.1832.3119 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查不同月份隐性乳腺炎发病率60.0047.7048.6850.0045.6039.3341.2940.1440.0036.2734.7233.2732.3129.0329.7130.0020.00隐性乳腺炎发病率10.000.00123456789101112月份图1.1不同月份隐性乳腺炎发病率Fig.1.1Incidenceofsubclinicalmastitisindifferentmonths1.4.2白城市奶牛隐性乳腺炎发病率与饲养管理的关系经χ2检验，A组与B组，A组与C组，A组与D组，B组与C组，B组与D组，C组与D组间均差异显著（χ2=27.16，χ2=49.05，χ2=122.79，χ2=4.28，χ2=44.99，χ2=21.95，且P＜0.05）。因此，奶牛隐性乳腺炎发病率与饲养管理具有相关性。如表1.4和图1.2所示，不同奶牛场隐性乳腺炎发病率之间存在较大的差异，D组发病率最高，达46.27%，而A组发病率最低，为30.96%，B组和C组分别为36.54%和38.91%。在牧场管理模式下，有卧床设施的A组比无卧床设施的B组隐性乳腺炎发病率低；在小区管理模式下，采用全混合日粮饲喂的C组比未采用全混合日粮饲喂的D组隐性乳腺炎发病率低。20 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查表1.4不同奶牛场隐性乳腺炎发病率Tab.1.4IncidenceofsubclinicalmastitisindifferentdairyfarmsA组B组C组D组1月22.2428.7628.3336.802月25.0628.7230.0435.033月26.6833.7932.4740.124月29.0934.7135.4645.825月31.1837.5338.5350.076月29.3340.9541.7653.137月35.8445.7850.3958.778月41.0248.1648.4557.109月40.2042.5246.7152.9610月38.0935.4941.2545.7411月27.4031.4338.4741.5612月25.4330.6335.0038.18平均阳性率%30.9636.5438.9146.27不同奶牛场隐性乳腺炎发病率5046.274538.914036.543530.9630252015隐性乳腺炎发病率1050A组B组C组D组奶牛场分组图1.2不同奶牛场隐性乳腺炎发病率Fig.1.2Incidenceofsubclinicalmastitisindifferentdairyfarms21 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查1.4.3白城市奶牛隐性乳腺炎发病率与胎次的关系经χ2检验，头胎与2胎，2胎与3胎，3胎与4胎，4胎与5胎，6胎与7胎及以上间差异不显著（χ2=0.83，χ2=1.73，χ2=0.46，χ2=1.85，χ2=0.67，且P＞0.05），5胎与6胎之间差异显著（χ2=4.23，且P＜0.05），其他组合差异均显著，P＜0.05。因此，奶牛隐性乳腺炎发病率与胎次具有相关性。如表1.5和图1.3所示，随着生产胎次增加，奶牛患隐性乳腺炎的概率也发生规律性的变化，发病率随之增加。经产奶牛生育头胎后患隐性乳腺炎的概率为32.58%，比其他胎次的发病率均低，且与第3胎、4胎、5胎、6胎及7胎及以上有相关性。表1.5不同胎次奶牛隐性乳腺炎发病情况Tab.1.5Morbidityofsubclinicalmastitisindifferentparities7胎及胎数头胎2胎3胎4胎5胎6胎以上阳性头数84868696877990检测头数259234198203158116122阳性率%32.5836.7243.4347.5254.9867.8973.44不同胎次隐性乳腺炎发病率8073.4467.89706054.9847.525043.4336.724032.5830隐形乳腺炎发病率20100头胎2胎3胎4胎5胎6胎7胎及以上图1.3不同胎次奶牛隐性乳腺炎发病率Fig.1.3Incidenceofsubclinicalmastitisindifferentparities22 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查1.4讨论随着中国步入新时代，经济进入新常态，人们对生活质量有了更大的追求，促进了乳品业的飞速发展，也带动了奶牛养殖业的兴起。同时，一带一路促进了中外交流，引入了国外一些先进的科学技术和成熟的管理模式，有利于我国奶牛养殖场硬件设施和饲养管理的进步。近年来，大量养殖场都已经应用机械化设施，在硬件设施条件相差不大的基础下，人工管理的水平决定了奶牛场的经济效益。隐性乳腺炎作为检验奶牛养殖场综合管理水平的重要指标需要紧密关注，所以本实验挑选了4个具有代表性的奶牛养殖场，分别为有卧床设施且应用全混合日粮饲喂的牧场A，无卧床设施且应用全混合日粮饲喂的牧场B，无卧床设施且应用全混合日粮饲喂牧场化管理小区C，无卧床设施且没有应用全混合日粮饲喂的普通奶牛小区D，对它们进行了奶牛隐性乳腺炎流行病学调查。从调查内容可以得知，这四个奶牛场全年隐性乳腺炎平均发病率为38.17%。2014年，郝景峰等人对吉林省进行了奶牛乳腺炎流行病学调查，发现长春、吉林、通化、四平、延吉、辽源、白山市7市奶牛隐性乳腺炎的平均发病率为47.30%，其中四平市最低为39.78%，通化市最高为64.69%[116]。对比这组数据可以看出，白城市的奶牛隐性乳腺炎发病率明显低于吉林省奶牛隐性乳腺炎平均发病率。由于白城市奶牛养殖场在挤奶程序、饲养管理等方面注重奶牛乳腺炎的综合防控，因此白城市奶牛患隐性乳腺炎的概率低于吉林省隐性乳腺炎平均发病率，这样不仅提高了养殖场的经济效益，更有利于投入资本进行更好的管理，形成了一个良好的产业循环。根据调查发现，白城市从1至5月以及11月、12月是隐性乳腺炎的低发期，但是随着温度升高，隐性乳腺炎发病率迎来高峰期，夏季发病率均高于40%且在8月达到峰值48.68%。白城市位于吉林省西北部，位于大兴安岭山脉东麓平原，属于温带大陆性季风气候，光照充足，四季分明，夏季高温高湿，冬季寒冷干燥。由于荷斯坦奶牛不惧寒冷的生理特性以及病原微生物在干燥低温的环境下不易繁殖传染，可能会使得发病率呈明显下降的趋势。同时，在夏季潮湿的环境下，更容易滋生病原微生物，奶牛在高热的情况下，食欲不振，免疫力下降，更容易受到病原微生物的侵害引起乳腺炎。根据调查发现，白城市不同奶牛场全年平均隐性乳腺炎发病率差异显著。进23 第二篇实验部分第一章吉林省白城市奶牛场隐性乳腺炎流行病学调查一步调查发现，这与奶牛场的饲养方式有关。A组与B组均属于牧场饲养管理，区别在于有无卧床设施，有卧床设施的A组发病率低于无卧床设施的B组发病率，说明卧床设施对减少奶牛乳腺炎的发病具有一定作用，可能是由于卧床能够隔离奶牛乳房与粪便，从而减少了和致病菌的接触，并且能够提高奶牛休息的舒适度。C组和D组均属于小区饲养管理，区别在于C组采用的是TMR饲喂方式的牧场化模式，TMR全混合日粮饲喂能够有效促进奶牛的采食量，并尽可能满足瘤胃内微生物的需求，提高奶牛免疫力，有利于抵御外界因素造成的乳腺炎。根据调查发现，随着奶牛胎次增加，年龄增长，奶牛的免疫力下降，在长此以往的挤奶过程中，乳头遭受挤压、摩擦损伤，使得括约肌变得松弛，无法完全闭合，更容易使病原微生物进入到乳腺中，引发乳腺炎。另外，当奶牛患某些疾病后，例如难产、子宫内膜炎、胎衣不下、产后败血症等，容易诱发或继发乳腺炎。综上所述，诱发奶牛乳腺炎的因素有多种，不论是环境因素还是饲养管理因素都不容小觑，应该要从以下几个方面把握：（1）增加卧床等设施，提高奶牛生活的舒适度，将奶牛乳房与粪便、积水有效隔离，减少与病原微生物的接触机会；（2）注重卫生，保持牛舍牛床清爽干净，防止积水、粪便堆积，定期消毒，减少环境中的病原微生物；（3）科学搭配饲料，采用TMR全混合日粮饲喂，保证供给营养全面，有利于提高奶牛免疫力，增强抵御致病菌侵袭的能力；（4）提高工作人员的卫生意识，在挤奶过程中，充分做好手、手套、乳房、抹布、机器的消毒工作，防止病原菌感染奶牛并在牛群中传播；（5）保证日照和运动时间，做好牛舍通风处理；（6）做好定期检查的记录，做好发生突发状况的准备。1.5小结1.5.1白城市奶牛隐性乳腺炎发病率与季节相关，夏季发病率最高，其中8月发病率达到顶峰48.68%，而其他季节发病率则较低。1.5.2奶牛隐性乳腺炎发病率与饲养管理水平相关，采用TMR技术饲喂和卧床设施可以降低乳腺炎发病率。1.5.3奶牛隐性乳腺炎发病率与胎次相关，生产胎数越多，隐性乳腺炎发病率越高。24 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定第二章主要致病菌的分离鉴定引起奶牛乳腺炎的主要原因是病原微生物感染，致病菌种类多达150种，较为常见的有23种，包括细菌、真菌、病毒及支原体。大多数患奶牛乳腺炎主要是由葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、酵母样菌引起的，其中葡萄球菌和链球菌是临床型奶牛乳腺炎的主要致病菌，约占50%-80%。随着科技进步，进化出越来越多操作简洁、耗时少、结果精确的实验技术。PCR技术的成熟便于大批量鉴定细菌种类，相较于生化试验节约了更多的人力、时间且结果也更为准确、清晰。所以本实验选择应用PCR技术鉴定挑选出的50个乳汁样品，主要鉴定的病原菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌。2.1实验材料2.1.1实验对象在奶牛场收集到的冻存于-80℃冰箱中的乳样中随机挑选的50个乳样2.1.2试剂及药品普通肉汤培养基、BP培养基、麦康凯培养基、THB培养基均购自于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；溶菌酶、50×TAE、DL2000DNALadder均购自Solarbio；基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）购自北京天根生物科技有限公司；引物购自上海生工有限公司；2×M5TaqPCRMix、灭菌dd水、EB染色液均购自北京聚合美生物科技有限公司；琼脂糖购自Biowest。2.1.3仪器设备温度梯度PCR东胜创新生物科技有限公司台式高速冷冻离心机德国effendof公司DYCP-31BN琼脂糖电泳仪北京六一仪器设备公司电子天平东联进出口有限公司电子分析天平赛多利斯科学仪器有限公司25 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定凝胶成像系统MolecularImager压力蒸汽灭菌锅上海精密仪器有限公司超净工作台美国Airtech集团公司-80℃冰箱美国NBS公司恒温培养箱三洋电器集团恒温摇床东联进出口有限公司电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司2.1.4配制溶剂（1）普通肉汤培养基：每1000ml蒸馏水中加入本品30g，121℃高压20min灭菌。（2）BP培养基：每950ml蒸馏水中加入本品63g，121℃高压20min灭菌，待溶液冷却至50℃后，加入50ml卵黄亚碲酸钾增菌剂。（3）THB培养基：每1000ml蒸馏水中加入本品36.4g，121℃高压20min灭菌，待溶液冷却至50℃后，加入10mg多粘菌素E和15mg萘啶酮酸。（4）麦康凯培养基：每1000ml蒸馏水中加入本品52g，121℃高压20min灭菌。2.2实验方法（1）将存放于-80℃冰箱的乳样取出，随机选取50个样品置于37℃恒温水浴锅解冻。在超净台中，将溶解后的乳样用棉签分别涂抹于各筛选培养基上，分别为专门生长金黄色葡萄球菌的BP培养基，专门生长肠杆菌的麦康凯培养基以及专门生长链球菌的THB培养基。然后放置在37℃恒温培养箱中培养24h。（2）24h后，取出培养基，观察菌落生长情况，在每种相同的菌落形态中挑取单个菌落，将挑出的单个菌落分别再分区划线，进行纯化培养24h后，挑出单个菌落放入装有普通肉汤培养基的试管中，置于37℃摇床培养24h.（3）24h后，将培养好的菌液各取出1ml于高压灭菌过的离心管，10000rpm高速离心1min，尽量吸取上清，然后加入180ul溶菌酶，37℃处理30min以上。26 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定（4）按照细菌DNA提取盒说明书提取DNA。（5）根据参考文献[117]或利用PrimerPremier5.0自行设计分别合成金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌的引物（如表2.1）。表2.1主要致病菌的引物序列Tab.2.1Majorpathogensprimersequence名称序列（5’-3’）Bp大小退火温度TCGTGTCGTGAGATGTTG19055金黄色葡萄球菌CGCTGCCCTTTGTATTGTGTGGGGAGCAAACAGGAT36055大肠杆菌TGGCAACAAAGGATAAGGTTTGGTGTTTACACTAGACTG12160无乳链球菌TGTGTTAATTACTCTTATGCGTCGCGGTATTGAAAAAGCAACAT40060乳房链球菌TGCAATAATGAGAAGGGGACGACGGGAGTGGAAAATCCACCAT57260停乳链球菌AAGGGAAAGCCTATCTCTAGACC（6）设置PCR反应条件：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌：94℃5min预变性；94℃0.5min变性，55℃0.5min退火，72℃0.5min延伸，30个循环；72℃10min延伸；4℃保温放置。链球菌：94℃5min预变性；94℃0.5min变性，60℃0.5min退火，72℃0.5min延伸，30个循环；72℃10min延伸；4℃保温放置。（7）将50×TAE稀释为1×TAE，加入琼脂糖，高温加热充分溶解后加入EB染色液，制成1.5%的琼脂糖凝胶。取反应结束后的PCR扩增产物10μl进行琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarkerDL2000为参照，用GelDocXR+凝胶成像系统观察结果。（8）将确定的细菌进行冻存，以1:1的比例分别加入菌液和灭菌甘油，放置于-80℃冰箱保存备用。27 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定2.3结果2.3.1主要致病菌分离结果如表2.2，2.3和图2.1，2.3-2.7所示，50个样品中感染金黄色葡萄球菌的数量最多，分离出27株，占样品总量的54%；感染无乳链球菌的数量次多，有17株，占34%；随之是感染大肠杆菌的数量占26%，有13株；乳房链球菌和停乳链球菌的感染较少，感染这两种细菌的总数不足1/5。金黄色葡萄球菌和无乳链球菌作为接触性传染的病原菌，占了很大的比重，说明该地区引起隐性乳腺炎的方式主要是通过接触感染致病菌。表2.2样品中分离到的主要致病菌的情况（+表示检测出病原菌，-表示未检测出病原菌）Tab.2.2Theconditionofthemajorpathogenicbacteriaisolatedfromthesamples(+representspositive,-representsnegative)金葡菌大肠杆菌无乳链球菌停乳链球菌乳房链球菌1-----2--+--3++---4+-+--5--+--6+---+7-----8+-+-+9++---10--+--11-----12+----13--+--14+----15+++--16----+17+----18----+19--++-20++---28 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定续表2.2样品中分离到的主要致病菌的情况（+表示检测出病原菌，-表示未检测出病原菌）续Tab.2.2Theconditionofthemajorpathogenicbacteriaisolatedfromthesamples(+representspositive,-representsnegative)金葡菌大肠杆菌无乳链球菌停乳链球菌乳房链球菌21--+--22-----23+---+24++---25--+--26++---27-----28-----29++---30--+--31+----32+----33+----34+----35-----36++---37--+--38+++-+39+----40++---41++---42-----43--+--44--+-+45+----46+----47++---48+++--49-----50--+--29 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定表2.3样品中分离到主要致病菌的数量Tab.2.3Thenumberofthemajorpathogenicbacteriaisolatedfromthesamples名称所得菌株数所占比例金黄色葡萄球菌2754%大肠杆菌1326%无乳链球菌1734%乳房链球菌714%停乳链球菌12%感染主要致病菌比例60%54%50%40%34%26%30%20%14%感染的比例10%2%0%病原菌分类图2.1各致病菌在样品中的比例Fig.2.1Theproportionofpathogenicbacteriainthesamples2.3.2混合感染病原菌的分离结果如表2.4,2.5和图2.2所示，在15个混合感染两种致病菌的组合中，金葡菌和大肠杆菌的组合数量最多，有10个样品；在3个混合感染三种致病菌组合中，金葡菌和大肠杆菌和无乳链球菌的组合数量较多，有2个，另外1个则是金葡菌和无乳链球菌和乳房链球菌的组合；在1个混合感染四种致病菌的组合中，仅有金葡菌和大肠杆菌和无乳链球菌和乳房链球菌的组合。30 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定表2.4分离出不同数量病原菌的样品比例Tab.2.4Theproportionofsamplesinfectedwithdifferentnumbersofpathogenicbacteria样品数量所占比例未分离出病原菌918%分离出1种病原菌2244%分离出2种病原菌1530%分离出3种病原菌36%分离出4种病原菌12%分离出5种病原菌00表2.5混合感染组合情况Tab.2.5Theconditionofmixedinfectioncombination混合感染组合编号数量3，9，20，24，26，29，36，金葡菌+大肠杆菌1040，41，47混合2种病金葡菌+无乳链球菌41原菌金葡菌+乳房链球菌6，232无乳链球菌+停乳链球菌191无乳链球菌+乳房链球菌441金葡菌+大肠杆菌+无乳15，482混合3种病链球菌原菌金葡菌+无乳链球菌+乳81房链球菌混合4种病金葡菌+大肠杆菌+无乳381原菌链球菌+乳房链球菌31 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定混合感染组合情况12101086各组数量4222111110组合类别图2.2混合感染组合情况Fig.2.2Theconditionofmixedinfectioncombination200010003468912141517202324262931323334363875050019025010020001000750500394041454647482502419010020242020图2.3金黄色葡萄球菌PCR结果Fig.2.3StaphylococcusaureusPCRresults32 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定20001000750391520242629363840414748500250360100图2.4大肠杆菌PCR结果Fig.2.4EscherichiacoliPCRresults20001000750500245810131519212530373843444850250121100图2.5无乳链球菌PCR结果Fig.2.5StreptococcusagalactiaePCRresults200020001000100019750681618233844750572500400500250250100100图2.6乳房链球菌PCR结果图2.7停乳链球菌PCR结果Fig.2.6StreptococcusuberisPCRresultsFig.2.7StreptococcusdysgalactiaePCRresults2.4讨论聚合酶链式反应，简称为PCR（PolymeraseChainReaction），是通过引物的指导，酶的催化，对特定模板进行扩增的反应。PCR是模拟体内DNA复制的过程，在体外进行特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应33 第二篇实验部分第二章主要致病菌的分离鉴定用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。PCR作为一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，通过高温变性、低温退火以及适温延伸等反应组成一个周期并循环进行的这种方法，能够使DNA片段迅速地扩增，因此具有节省时间、操作简洁、特异性强、灵敏度高的优点。而传统的检测例如生化实验、细菌培养、免疫学诊断等，所需人力物力较为繁杂，试验周期长。所以本实验选择PCR鉴别病原微生物。从分离鉴定的结果可以看出，白城市奶牛养殖场导致奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌是金黄色葡萄球菌，占54%，并且大多数患乳腺炎都不止一种病原菌的感染。在检测的五种致病菌中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌作为接触传染型致病菌，说明奶牛在日常生活中易接触到这些细菌，主要应该体现在挤奶等卫生清洁方面可能存在较大的问题，例如工作人员在平时挤奶过程中不注意手、手套以及机器的清洁消毒，或者与患病的奶牛共用一套设备，这些举措都会导致奶牛乳腺接触到这些病原菌，并且挤奶过程中，乳头经过挤压，括约肌松弛，不易闭合，这样就更加易于使病原菌侵袭进入乳腺中。当然，也不可忽视环境致病菌的侵袭，牛舍的打扫清洁也是十分重要的。2.5小结2.5.1从样品中分离到的主要致病菌中，感染金黄色葡萄球菌的最多，占54%，接下来依次是无乳链球菌、大肠杆菌、乳房链球菌和停乳链球菌。金葡菌和无乳链球菌作为接触性传染病原菌占了很大比重，说明该地区主要通过接触传染引起隐性乳腺炎。2.5.2在两种病原菌混合感染的情况下，金葡菌和大肠杆菌的组合是最多，有10个样品；在三种病原菌混合感染的情况下，仅有两种组合，金葡菌和大肠杆菌和无乳链球菌的组合较多；四种病原菌混合感染的组合仅一种，不含停乳链球菌。34 第二篇实验部分第三章金黄色葡萄球菌药敏试验第三章金黄色葡萄球菌药敏试验药敏试验是检验药物敏感性的一个试验手段，能够有利于有效的使用药物进行治疗。抗生素能够对细菌引起的疾病起到良好的控制作用，但是养殖过程中长期大量地使用抗生素便会使细菌产生耐药性，这种境况下没有针对的治疗不仅浪费药物，而且会延误病情，造成更大的损失。本实验通过纸片扩散法对主要致病菌金黄色葡萄球菌进行药敏试验，旨在了解该地区抗生素的使用情况，指导今后治疗用药。3.1实验材料3.1.1实验对象实验二中分离出的27株金黄色葡萄球菌3.1.2试剂及药品药敏片：青霉素（10μg/片）、苯唑西林（1μg/片）、氨苄西林（10μg/片）、头孢呋肟（30μg/片）、头孢噻肟（30μg/片）、庆大霉素（10μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、链霉素（10μg/片）、四环素（30μg/片）、多西环素（30μg/片）、红霉素（15μg/片）、万古霉素（30μg/片）、新生霉素（30μg/片）、利福平（5μg/片）、克林霉素（2μg/片）、头孢噻吩（30μg/片）、奥格门丁（20μg/片），购自杭州为生物试剂有限公司；普通肉汤培养基、细菌琼脂粉均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；麦氏比浊管购自于康泰生物有限公司。3.1.3仪器设备游标卡尺桂林广陆数字测控股份有限公司恒温培养箱三洋电器集团3.2实验方法（1）将实验二中冻存于-80℃的金黄色葡萄球菌的菌株放于常温中解冻后，接种于普通肉汤培养基中，37℃培养12h，将其与麦氏比浊管进行比较，调整菌35 第二篇实验部分第三章金黄色葡萄球菌药敏试验液的浑浊度，使之与0.5麦氏标准管浊度一致，此标准管浊度相当于1.5×108CFU/ml。（2）用高压灭菌过的棉签蘸取菌液并挤去多余的菌液，均匀的涂布在普通肉汤琼脂平板上。待平板表面稍稍干燥后，将药敏片按划定区域贴于平板上，置于37℃恒温培养箱培养24h后，用游标卡尺测量各抑菌圈的直径。（3）根据药敏试验判断标准（表3.1）确定敏感性。表3.1药敏片判断标准Tab.3.1Thejudgmentstandardofdrugsensitivitytablets纸片含量抑菌圈直径（mm）名称（μg/片）耐药R中介I敏感S青霉素10≤28—≥29苯唑西林1≤1011-12≥13氨苄西林10≤28—≥29头孢呋肟30≤1415-22≥23头孢噻肟30≤1415-22≥23庆大霉素10≤1213-14≥15卡那霉素30≤1314-17≥18链霉素10≤1112-14≥15四环素30≤1415-18≥19多西环素30≤1213-15≥16红霉素15≤1314-22≥23万古霉素30≤910-11≥12新生霉素30≤1213-16≥17利福平5≤1617-19≥20克林霉素2≤1415-20≥21头孢噻吩30≤1415-17≥18奥格门丁20≤19—≥2036 第二篇实验部分第三章金黄色葡萄球菌药敏试验3.3结果3.3.1金黄色葡萄球菌药敏试验结果如表3.2,3.3和图3.1所示，金黄色葡萄球菌作为该地区感染最为严重的病原微生物，已经对青霉素、氨苄西林完全耐药，大部分金葡菌对于红霉素、链霉素、克林霉素、卡那霉素产生耐药性，敏感菌株所占比例均不超过20%，而对于四环素、多西环素、万古霉素、新生霉素、利福平这些抗生素普遍较为敏感，敏感菌株所占比例均超过80%，其中多西环素、万古霉素、新生霉素的敏感菌株比甚至超过90%。表3.2金黄色葡萄球菌药敏试验结果Tab.3.2TheresultsofStaphylococcusaureusdrugsusceptibilitytest奥格门丁头孢噻吩克林霉素利福平新生霉素万古霉素红霉素多西环素四环素链霉素卡那霉素庆大霉素头孢噻肟头孢呋肟氨苄西林苯挫西林青霉素SSIRSRISSRRRIIRRR3IRRRRSISSRRRRRRRR4RSISSSRSSSRISSRSR6RIRSSSRSSRRIIIRIR8RSSSSSISSRISISRSR9RSISISRSSRRRISRIR12RRRRSSRSIRRRRRRRR14RIRSSSRSIRRIISRSR15SSISSSISSRISIIRIR17RSISSSRIRSSSSSRSR20RSIRSSRRRSRRIIRRR23SIIRSSISSIRSRRRRR24RSISSSRSSRRIISRSR26ISISSSISSRRRRIRRR29RRRRRRRRRRRRSIRRR31SIISSSRSSRRRRRRRR3237 第二篇实验部分第三章金黄色葡萄球菌药敏试验RRRRIRRRRRRRRRRSR33RRRRIRRRRRRRIIRRR34RIISSSRSSRRIISRSR36RSSSSSRSSRISSSRSR38RSISSSISSRISIIRRR39SSSSSISSSISSSSRSR40RSRSSSRSSRRISSRSR41SSSSSSRSSRSSSSRSR45RSISSSISSISSISRIR46RSISSSRSSIRIISRSR47RIISSSRSSIIISSRSR48表3.3金黄色葡萄球菌对各种抗生素敏感情况Tab.3.3Staphylococcusaureussensitivetovariousantibiotics青霉素苯唑西林氨苄西林头孢呋肟头孢噻肟庆大霉素敏感菌株01301489比例048.14%051.85%29.63%33.33%卡那霉素链霉素四环素多西环素红霉素万古霉素敏感菌株432325125比例14.81%11.11%85.19%92.59%3.70%92.59%新生霉素利福平克林霉素头孢噻吩奥格门丁敏感菌株25244166比例92.59%88.89%14.81%59.26%22.22%38 第二篇实验部分第三章金黄色葡萄球菌药敏试验金黄色葡萄球菌对各种抗生素的敏感情况100.0092.5992.5992.5988.8985.1990.0080.0070.0059.2660.0051.8548.1450.0040.0029.6333.3330.0022.22敏感菌株比例14.8114.8120.0011.1110.000.000.003.700.00各种抗生素图3.1金黄色葡萄球菌对各种抗生素的敏感情况Fig.3.1Staphylococcusaureussensitivetovariousantibiotics3.3.2金黄色葡萄球菌对抗生素敏感性结果如表3.4和图3.2所示，每个样品对抗生素的敏感性不同。情况最好的是编号40、41的菌种，只对两种抗生素耐药；而最多的已经对15种抗生素产生耐药性，例如编号31、33、45的菌株。表3.4各株金葡菌对抗生素耐药数量的情况Tab.3.4ThestrainsofStaphylococcusaureusresistanttoantibiotics编号3468912141517耐药种类数量81257471373编号202324262931323334耐药种类数量5107671591514编号363839404145464748耐药种类数量6552215146539 第二篇实验部分第三章金黄色葡萄球菌药敏试验各株金葡菌对抗生素耐药种类数量的情况161515151414141312121010988777776666555554耐药抗生素数量4322203468912141517202324262931323334363839404145464748金葡菌菌株编号图3.2各株金葡菌对抗生素耐药种类数量的情况ThestrainsofStaphylococcusaureusresistanttoantibiotics3.4讨论通过药敏试验可以看出从该地区采集到的奶样中分离出的金黄色葡萄球菌已经产生了较强的耐药性。样品中的金葡菌已经对青霉素和氨苄西林完全耐药，80%以上对卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素耐药，这些结果表明上述抗生素已经对该地区的奶牛乳腺炎的治疗效果不佳。由于该地区引起隐性乳腺炎的主要致病菌为金葡菌，金葡菌的药敏试验结果可以指导在今后治疗奶牛乳腺炎的时候应避免使用青霉素和氨苄西林这两种抗生素，防止拖延病情以及抗生素残留等问题。不过普遍对四环素、多西环素、万古霉素、新生霉素、利福平比较敏感，虽然提示可以在今后的治疗乳腺炎过程中使用这些抗生素，若不注意在使用过程中的用量及频率，很容易造成这些抗生素也失去抑菌价值，结果会导致以后再发生乳腺炎将无抗生素可用的后果。目前国内外对于奶牛乳腺炎主要还是使用抗生素治疗，但是由于牛场长期的大量的使用抗生素，使得病原菌对抗生素产生了一定的耐药性，因此对奶牛乳腺炎的治疗效果越来越差。同时，由于滥用抗生素，导致牛奶中抗生素含量超标，当被人体摄入后会导致人体内细菌产生耐药性，严重威胁人类的身体健康。40 第二篇实验部分第三章金黄色葡萄球菌药敏试验抗生素治疗奶牛乳腺炎所带来的一系列比较严重的影响亟待解决，不仅需要牛场工作人员在治疗给药过程中注意抗生素的用量和耐药性，更需要寻找到一种不会产生耐药性且不含药物残料的治疗药物。中药作为我国传统文化的瑰宝已经流行了上千年，它是大自然天然的产物，毒副作用小且不易残留在体内，大量文献与史料也记载着多种中药对乳腺炎具有治疗效果，它将有可能成为未来治疗奶牛乳腺炎的主要方法。3.5小结3.5.1对分离出的金黄色葡萄球菌完全耐药的抗生素是青霉素和氨苄西林，高度耐药的抗生素是链霉素、红霉素、卡那霉素、克林霉素，高度敏感的抗生素是四环素、多西环素、万古霉素、新生霉素、利福平。可以指导牛场在今后治疗乳腺炎用药时，避免使用已经耐药的抗生素，建议合理使用对病原菌敏感的抗生素。3.5.2不同样品分离出的金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性不同。41 第二篇实验部分第四章小檗碱、大黄素、黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌作用第四章小檗碱、大黄素、黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌作用小檗碱、大黄素、黄芩苷这三种中药已经有文献验证它们对奶牛乳腺炎具有保护作用，且它们作为广谱抗生素都具有一定的抑菌作用，本实验通过该最小抑菌浓度实验希望了解它们对奶牛乳腺炎主要致病菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果，以便为今后研制中药组方提供可参考数据。4.1实验材料4.1.1实验对象实验二中分离出的27株金黄色葡萄球菌4.1.2试剂及药品小檗碱、大黄素、黄芩苷均购自成都曼斯特生物有限公司；普通肉汤培养基、细菌琼脂粉均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；DMSO购自Sigma-Aldrich；生理盐水；麦氏比浊管购自康泰生物有限公司。4.1.3仪器设备紫外分光光度仪北京普析通用仪器有限责任公司4.2实验方法（1）将实验二中冻存于-80℃的金黄色葡萄球菌的菌株放于常温中解冻后，接种于普通肉汤培养基中，37℃培养12h，将其与麦氏比浊管进行比较，调整菌液的浑浊度，使之与0.5麦氏标准管浊度一致，此标准管浊度相当于1.5×108CFU/ml。（2）向小檗碱、大黄素、黄芩苷中各加入400ul的DMSO溶解，再加入生理盐水将它们分别倍比稀释成5mg/ml，2.5mg/ml，1.25mg/ml，0.625mg/ml，0.31mg/ml，0.16mg/ml的浓度梯度。（3）最小抑菌浓度实验是根据国家临床实验室标准委员会制定的肉汤稀释42 第二篇实验部分第四章小檗碱、大黄素、黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌作用法实施的。试验组：每个试管中先分别加入1ml普通肉汤培养基，然后再加入金黄色葡萄球菌菌液，使得最初接种液为107CFU/ml,再加入1ml药液，混匀；对照组：每个试管中先分别加入1ml普通肉汤，然后加入和菌液等量的普通肉汤培养基，再加入1ml药液，混匀。所有试管均置于37℃摇床中培养24h，然后在OD600吸光度测试，与对照组相比较，试验组的OD值是否增长，OD值不改变的最小浓度即为药物对该金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。4.3数据处理实验数据采用方差分析，数据差异采用one-wayANOVA进行检验分析，P<0.05代表差异显著，P<0.01代表差异极显著。4.4结果如表4.1,4.2和图4.1所示，小檗碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度在0.16mg/ml-2.5mg/ml，平均MIC为0.795mg/ml，62.96%的小檗碱MIC为0.16mg/ml；大黄素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围≥0.31mg/ml，平均MIC为2.164mg/ml，40.74%的大黄素MIC为2.5mg/ml；黄芩苷对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围≥1.25mg/ml，平均MIC为4.676mg/ml，74.07%的黄芩苷MIC＞5mg/ml。所以，小檗碱是这三种药中对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的一种药，大黄素次之，黄芩苷最弱。43 第二篇实验部分第四章小檗碱、大黄素、黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌作用表4.1金葡菌对小檗碱、大黄素、黄芩苷的最小抑菌浓度Tab.4.1MICofberberine,emodinandbaicalininS.aureus小檗碱最小抑菌大黄素最小抑菌黄芩苷最小抑菌浓度（mg/ml）浓度（mg/ml）浓度（mg/ml）32.52.5＞542.55＞561.252.5＞580.162.5＞590.165＞5122.5＞5＞5142.55＞5151.252.5＞5171.252.5＞5200.162.5＞5231.252.5＞5240.160.311.25260.160.625＞5291.252.5＞5310.161.255320.160.625＞5332.52.5＞5340.161.252.5360.161.25＞5380.161.255390.161.252.5400.160.6255410.160.625＞5450.160.6255460.162.5＞5470.161.25＞5480.162.5＞5Means0.7952.1644.676MIC44 第二篇实验部分第四章小檗碱、大黄素、黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌作用表4.2小檗碱、大黄素、黄芩苷各最小抑菌浓度占比Tab.4.2TheproportionofMICofberberine,emodinandbaicalin最小抑菌浓度（mg/ml）0.160.310.6251.252.55＞5株数17005500小檗碱所占比例62.96%0018.52%18.52%00株数01561131大黄素所占比例03.70%18.52%22.22%40.74%11.11%3.70%株数00012420黄芩苷所占比例0003.70%7.41%14.81%74.07%三种中药各最小抑菌浓度比例80.00%74.07%70.00%62.96%60.00%50.00%40.74%40.00%所占比例30.00%18.52%18.52%22.22%18.52%14.81%20.00%11.11%7.41%10.00%3.70%3.70%3.70%000000000.00%0.160.310.6251.252.55＞5最小抑菌浓度（mg/ml)小檗碱大黄素黄芩苷图4.1小檗碱、大黄素、黄芩苷各最小抑菌浓度占比Fig.4.1TheproportionofMICofberberine,emodinandbaicalin4.5讨论如今治疗奶牛乳腺炎的主要手段还是抗生素给药，但是随着长期大量的使用抗生素，这些导致奶牛乳腺炎的致病菌已经拥有耐药性，治疗效果大不如前。并且奶牛体内残存的抗生素会通过乳品或乳制品的交易流通被人类摄入，严重威胁着人类的身体健康。因此，寻找一种天然、绿色、健康且治疗效果好的药物显得极为迫切，而传承千年的中药恰恰好拥有着这些优点，在疾病治疗上被给予厚望。本实验挑选了三种具有广谱抗菌效果的中药单体进行试验，在此之前，已经有文45 第二篇实验部分第四章小檗碱、大黄素、黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌作用献证明这三种中药单体对LPS诱导的小鼠乳腺炎模型具有治疗、保护的作用。通过三种广谱抗菌中药单体小檗碱、大黄素、黄芩苷对该批样品分离出的金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度实验可以得出，小檗碱对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，62.96%的MIC为0.16mg/ml，其中37.04%的样品MIC大于0.16mg/ml，有两种猜想：①分离出来的金黄色葡萄球菌并不是同一株，可能存在其他不同株的金黄色葡萄球菌，想要确定这个猜想需要接下来进行测序来验证；②可能是同样的金葡菌，但是由于可能生存的环境不同，导致耐药性也会产生一定的差异。从上述实验结果可以得出，小檗碱主要是通过抑菌抗炎对奶牛乳腺炎起作用，但是黄芩苷作为中药组方中也时常出现的黄芩的主要活性物质，在抑菌效果方面好像不尽如人意，74.07%的最小抑菌浓度大于5mg/ml。可以猜想，黄芩苷在治疗乳腺炎的过程中，可能不是通过抑菌来实现，或许是对奶牛进行整个身体的调节，改善肠道菌群，提高免疫力等环节来治疗奶牛乳腺炎的，对这些猜想可以在以后进行更深入的研究探索。4.6小结小檗碱是三种中药单体中对该地区的金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的中药。46 结论结论1.吉林省白城市奶牛隐性乳腺炎发病率与季节有关，在夏季多发；与胎次有关，随着奶牛胎次增加，发病率也随之升高；与饲养管理水平有关，卧床设施和全混合日粮饲喂均能减少隐性乳腺炎发生。2.引起吉林省白城市奶牛隐性乳腺炎的主要因素是金黄色葡萄球菌，且已经对青霉素和氨苄西林完全耐药，在今后治疗过程中应避免使用这两种抗生素，可以科学合理地使用四环素、多西环素、新生霉素等敏感性较强的抗生素。3.小檗碱对吉林省白城市奶牛隐性乳腺炎中分离到的金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，可以对今后用于研制中药组方治疗奶牛乳腺炎起参考作用。47 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导师简介导师简介个人简介：张乃生，1961年6月生，男，汉族；中共党员，博士生导师教授；本科毕业于原解放军兽医大学，现任吉林大学动物科技实验教学示范中心主任，兼任中国畜牧兽医学会内科学分会常务理事及中国兽医协会动物诊疗分会理事长等职务。受教育经历：1978/09-1982/07，解放军兽医大学，兽医78队本科生学员，本科1984/09-1987/07，解放军兽医大学，兽医84研究生队学员，硕士任职经历：1982/07-1984/09，解放军兽医大学，兽医学院临床兽医学系，助教1988/09-1996/09，解放军农牧大学，兽医学院临床兽医学系，讲师1996/09-1999/12，解放军农牧大学，兽医学院临床兽医学系，副教授，主任1999/12-2002/06，解放军军需大学，兽医学院临床兽医学系，副教授，主任2002/07-2004/05，解放军军需大学，兽医学院临床兽医学系，教授，主任2005/04-2012/12，吉林大学，畜牧兽医学院临床兽医学系，教授，院长学术著作：《兽医临床症状鉴别诊断学》、《草食动物胃肠弛缓》、《猫病学》等著作8部，发表国内外学术论文80余篇。科研成果：国家科技进步三等奖1项军队科技项目二等奖4项、三等奖2项河南省科技进步二等奖1项57 作者简介作者简介作者姓名：王雯卿籍贯：江苏常州性别：女政治面貌：团员民族：汉族电子邮箱：出身日期：1994.09.19教育背景：2012.09-2016.06扬州大学动物医学（实验动物）农学硕士2016.09-至今吉林大学动物医学硕士在读个人在读期间发表的科研成果：1.ShihuiQu1,WenqingWang1,DepengLi,ShuminLi,LikeZhang,YunheFu⁎,NaishengZhang⁎.MangiferininhibitsmastitisinducedbyLPSviasuppressingNF-ĸBandNLRP3signalingpathways[J].InternationalImmunopharmacology,2017,43:85–90.2.WenqingWang,XiaoyuHu,PengShen,NaishengZhang,YunheFu*.SodiumhouttuyfonateinhibitsLPS-inducedinflammatoryresponseviasuppressingTLR4NF-kBsignalingpathwayinbovinemammaryepithelialcells[J].MicrobialPathogenesis,2017,107:12-16.58 致谢致谢两年时间不知不觉就过去了，研究生生涯也即将结束，想到两年前刚刚入学的自己，感慨良多。那时候，还处在大学毕业后的迷茫阶段，没有明确的人生目标，对步入社会也望之却步。可是，在这里两年的生活使我成长了不少，也使我明确了自己的目标与梦想，心之所向，一往无前。首先，我要感谢的就是我的父母，感谢他们给予我健康的身体，温馨的家庭氛围，无需担忧的生活条件以及自由的空间。尽管学校离家较远，半年才会回去一次，从来没有离家这么远这么久过，可是父母还是支持我的选择，也相信不在他们身边的我能够照顾好自己，离开父母的羽翼能够成长的更出色，我也确实做到了。然后，我要感谢的是我的导师——张乃生老师，他像是一座坐落在被雾霭层层包围的海滩上的灯塔，通过一束光指引着在海上漂泊的浪子找到彼岸的方向。与老师的聊天过程都很愉快，不仅是因为他和蔼的态度，还有快乐至上的信念也影响着我，让我觉得学习、实验、生活都可以是快乐的事情。老师经常鼓励我做一些美好的梦，因为有梦，才有拼搏前进的动力，而通往美好的梦的过程即使辛苦，但也让人甘之若饴。当然，我还要感谢419实验室，这里是我飞速成长的一个地方。感谢的人很多，曹永国老师、付云贺师兄、张文龙师兄、胡晓宇师兄、路晓杰师兄、金雪敏师兄、张泽财师兄、沈鹏师兄、刘久茜、李艳欣、郭建师弟、谢旭峰师弟、李炎燚师弟、曹红阳师妹、赵才军师弟等，他们不仅在学业上给予我指导，在生活中也关照着我，我们就像一个相亲相爱的大家庭，每个人都是缺一不可的，同时还会有新的血液的注入。另外，还要感谢我的室友吕俊婷，还有相邻实验室的师兄弟姐妹同学的关爱。很幸运，能在青春的岁月里遇见这么多有趣的灵魂，让我觉得不虚此行，希望在未来的道路上还是多多指教。59