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分类号：：密级，ＵＤＣ；编号：安徽医科大学学位论文胃壁弹力纤维分布的特点及其病理学意义Ｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｓｔｒｉｃｅｌａｓｔｉｃｆｉｂｅｒｓａｎｄｉｔｓａｔｈｏｌｏｉｃａｌｇｐｇｓｉｎｉｆｉｃａｎｃｅｇ闫恩慧指导教师姓名孟刚教授安徽医科大学基础医学院申请学位级别硕士专业名称病理学与病理生理学提交论文口期２０１８．０３论文答辩日期２０１８．０５．１８学位授予单位和日期安徽医科大学２０１８．０６答辩委员会主席陶仪声教授评阅人＾２０１８年０５月 安徽医科大学ANHUIMEDICALUNIVERSITY硕士学位论文胃壁弹力纤维分布的特点及其病理学意义Thedistributionofgastricelasticfibersanditspathologicalsignificance作者姓名闫恩慧指导教师孟刚教授学科专业病理学与病理生理学研究方向肿瘤病理论文工作时间2016年3月--2018年5月2018年05月 学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和羡谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名：暧褒曰期用：学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构适交论文的电子版和纸质版有权免许论文进入学校，图书馆被豐阅，有权将学位论文的内ｆ４扁入有关数据库进翁检索有权将学位论文的标，题和摘要汇编出駿。愿意将本人的学位论文提交《占国博士学位论文全文敷据库》《白、国优秀硕士学位论文全文数据库》和《：学国学位论文全文数据库》中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，在《中国博硕二学位论文评价数据库》中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：厂Ｉ导师签名？ｊ 目录英文缩略词表............................................................................................1中文摘要....................................................................................................2英文摘要....................................................................................................4前言............................................................................................................7材料和方法................................................................................................10结果............................................................................................................18讨论............................................................................................................34结论............................................................................................................40参考文献....................................................................................................40附录............................................................................................................45致谢............................................................................................................46综述............................................................................................................47 安徽医科大学硕士学位论文英文缩略词表（Abbreviation）英文缩写英文全称中文全称AJCCAmericanJointCommitteeon美国癌症联合委Cancer员会EFsElasticFibers弹力纤维ELElasticLamina弹力纤维层HEHematoxylin-Eosinstaining苏木素-伊红染色LPILocalPeritonealInvolvement局部浆膜侵犯OSOverallSurvival总生存期PELPeritonealElasticLamina浆膜弹力纤维层1 安徽医科大学硕士学位论文胃壁弹力纤维分布的特点及其病理学意义中文摘要目的：观察胃壁弹力纤维（ElasticFibers,EFs）分布的特点及探究浆膜弹力纤维层（PeritonealElasticLamina，PEL）在胃癌pTNM分期及预后判断中的价值。方法：取正常胃组织60块，pT3期胃腺癌组织75例观察正常及胃癌时胃壁EFs分布特点，重点观察PEL的分布；对于75例pT3期胃腺癌，选择肿瘤浸润深度最深并有部分浆膜或全部浆膜覆盖的的一个蜡块进行制片。所有蜡块均行常规HE染色及弹力纤维染色，对染色结果进行观察分析。同期30例pT4a期胃癌作为生存对照。结果：（1）正常胃壁含有丰富的EFs，主要有四个弹力纤维层（ElasticLamina,EL），分别在黏膜肌层，固有肌层与粘膜下层交界区，固有肌层与浆膜下组织交界区及浆膜下近浆膜处；粘膜固有层、粘膜下层、固有肌层的结缔组织、固有肌层中央及胃壁的血管也有EFs分布。胃壁浆膜下层无脂肪组织的区域浆膜下EFs几乎充满其全层，这些区域固有肌层外侧的EL与PEL分界不清或合并为一个EL。不同部位EFs的含量不同，从贲门到幽门，粘膜肌层内的EFs分布较规律，含量无明显变化；固有肌层两侧处的EFs，贲门、胃底、胃体部位含量较多，胃窦及幽门含量少；PEL较薄。不同部位EFs的粗细及染色深浅不同，四个EL分布区的EFs较粗，颜色较深，而固有肌层中央的平滑肌间EFs纤细、淡染，血管壁上的EFs则随管壁的增粗而变粗深染，层数增多。（2）胃癌时肿瘤内部无EFs，肿瘤间质内见少量EFs。PEL会因肿瘤引起的炎症反应及纤维增生等移位、断裂。胃癌组织内血管壁增厚，内弹力膜增厚，颜色加深，外膜EFs含量增多。胃癌肿瘤细胞与PEL有两种位置关系：未突破及突破。75例胃癌中有43例（57.3%）肿瘤未突破PEL（pT3a），24例（32.0%）肿瘤突破PEL（pT3b），8例（10.7%）浆膜层未见明显PEL，PEL识别率为89.3%（67/75）。（3）对随访资料完善的79例患者进行临床病理资料对比和生存分析显示：pT3b期胃癌区域淋巴结转移个数比pT3a2 安徽医科大学硕士学位论文期胃癌多（p=0.02），淋巴脉管侵犯率比pT3a期胃癌高（p=0.04），在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、检及淋巴结总数及N分期上无统计学差异（p>0.05），前者3年生存率比后者高（76.7%VS42.8%），OS比后者高（p<0.05），COX多因素分析发现PEL受侵及淋巴脉管受侵是影响pT3期胃癌患者生存的独立影响因素；pT3b组与pT4a组患者相比，区域淋巴结转移个数、淋巴脉管侵犯率、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、检及淋巴结总数及N分期均无统计学差异（p>0.05），前者3年生存率比后者高（42.8%VS30.0%），OS与后者无统计学差异（p>0.05），COX多因素分析发现年龄是影响胃癌患者生存的独立影响因素；pT3组与pT4a组患者相比，区域淋巴结转移个数、淋巴脉管侵犯率、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、检及淋巴结总数及N分期均无统计学差异（p>0.05），前者3年生存率比后者高（64.3%VS30.0%），OS比后者高（p<0.05），单因素分析发现浆膜侵犯、肿瘤大小及淋巴脉管受侵是胃癌不良预后因素。COX多因素分析发现浆膜侵犯影响患者生存的独立影响因素。三组的生存分析均显示N分期是影响胃癌患者预后的独立影响因素。结论：（1）胃是一个肌性弹力纤维囊，胃壁含有丰富的EFs，主要有四个弹力纤维层，这些EFs维持胃的弹性并参与其扩张；（2）PEL在胃癌中识别率高，EFs染色可以帮助判断肿瘤浸润深度，进而评估肿瘤与浆膜的位置关系，PEL可对pT3期进行亚分类；（3）突破PEL是严重影响pT3期胃癌预后的不良因素，可用于划分胃癌高危人群，突破PEL的患者可按pT4a期胃癌患者对待。因此，当肿瘤浸润深度超过固有肌层时，为了增加病理报告的规范性、准确性及对临床医生的提示性，EFs染色有必要作为常规染色方法，肿瘤与PEL的位置关系也有必要做出说明。关键词：胃弹力纤维弹力纤维染色浆膜弹力纤维层胃癌pTNM分期预后3 安徽医科大学硕士学位论文TheDistributionofGastricElasticFibersanditsPathologicalSignificanceAbstractObjective:ToobservethedistributioncharacteristicsofElasticFibers(EFs)inthestomachwallandtoexplorethevalueofPeritonealElasticLamina(PEL)inthepTNMstageandprognosisofgastriccancer.Methods:60normalgastrictissuesand75casesofpT3gastricadenocarcinomawereusedtoobservethedistributionofEFsinthestomachwallduringnormalandgastriccancer.FocusonthedistributionofPEL.For75casesofpT3gastriccancer,onesectioncontainingthedeepesttumorinvasionpartiallyorentirelycoveredwiththeperitoneumandthecorrespondingparaffinblockwereselected.AllparaffinwaxblocksweredoneroutineHEstainingandelasticstaining.Thestainingresultswereobservedandanalyzed.30casesofpT4agastricadenocarcinomaresectedduringthesameperiodwereexaminedforsurvivalcomparison.Results:(1)ThenormalgastricwallwasrichinEFsandmainlyconsistedoffourElasticLamina(EL),whichwerelocatedinthemuscularismucosa,thejunctionbetweenthemuscularispropriaandthesubmucosa,thejunctionbetweenthemuscularispropriaandthesubserosaltissueandthesubserosalserosarespectively;thelaminapropriaofthemucosa,thesubmucosa,theconnectivetissueofthemuscularispropria,theveinsofthemuscularispropriaandthebloodvesselsalsohaveEFsdistribution.ThesubserosalEFsintheareawherehadnoadiposetissuecoveredinthestomachwallfilledalmosttheentiresubserosallayer.TheELbetweentheouterlaminapropriaandthePELwasunclearormergeintooneELinthesearea.ThecontentsofEFsindifferent4 安徽医科大学硕士学位论文partsweredifferent.Fromthecardiatothepylorus,thedistributionofEFsinthemuscularlayerofthemucosahadaregularpatternwithnosignificantchanges.AstotheEFsbesidesthemuscularispropria,cardiac,gastricfundus,andbodypartsweremore,butpyloruswasless,PELwasthinner.ThethicknessandstainingcolourofEFsindifferentpartsweredifferent,atthefourELpartsEFswerethicker,colorweredarker,buttheEFsinthecentreofmuscularispropriawereslender,andlightlystained.AstotheEFsinthevessel,withthethicknessofthewall,thethicknessandthenumberoftheEFswereincreased.(2)TherewerenoEFsinthetumorsingastriccancerandasmallamountofEFsinthetumorstroma.PELcouldbedisplacedorrupturedduetotumor-inducedinflammationandfibrosis.Thebloodvesselwallwasthickened,theinnerelasticmembranewasthicker,thecolorwasdeeper,andtheoutermembraneEFscontentincreased.ThereweretwokindsofrelationshipbetweenthetumorcellsofgastriccancerandthePEL:nobreakthroughandbreakthrough.Amongthe75casesofpT3gastriccancer,43cases(57.3%)didnotbreakthroughthePEL(pT3a),24cases(32.0%)brokethroughthePEL(pT3b),andthePELwasunidentifiedin8cases(10.7%).(3)Theclinicopathologicaldataandsurvivalanalysisof79patientswithfollow-updatashowedthatthenumberofregionallymphnodemetastasesinpT3bgastriccancerwashigherthanthatinpT3agastriccancer(p=0.02),andthelymphovascularinvasionratewashigherthanpT3agastriccancer(p=0.04),however,nosignificantdifferencewasfoundingender,age,tumorsize,tumorlocation,pathologicaltype,totallymphnodecountandNstaging(p>0.05).Theformerhadahigher3-yearsurvivalratethanthelatter(76.7%vs42.8%),andOSwashigherthanthelatter(p<0.05).COXmultivariateanalysisfoundthatPELinvasionandlymphovascularinvasionwereindependentprognosisfactorsinthepT3gastriccancerpatients.Therewasnosignificantdifferenceinthenumberofregionallymphnodemetastasis,lymphovascularinvasion,gender,age,tumorsize,tumorlocation,pathologicaltype,totalnumberoflymphnodesandNstagingbetweenpT3bgroupandpT4agroup(p>0.05).Theformerhadahigher3-year5 安徽医科大学硕士学位论文survivalratethanthelatter(42.8%vs30.0%),andtherewasnostatisticaldifferenceinOS(p>0.05).COXmultivariateanalysisfoundthatagewasanindependentprognosisfactor.Therewasnosignificantdifferencesinthenumberoflymphnodemetastasis,lymphovascularinvasion,gender,age,tumorsize,tumorlocation,pathologicaltype,totalnumberoflymphnodesandNstagingbetweenpT3andpT4agroups(p>0.05).Theformerhada3-yearsurvivalratehigherthanthelatter(64.3%vs30.0%)andOSwashigherthanthelatter(p<0.05).Univariateanalysisrevealedthatserosalinvasion,tumorsizeandlymphovascularinvasionwerepoorprognosticfactorsingastriccancer.COXmultivariateanalysisfoundthatserosalinvasionwasanindependentprognosisfactor.SurvivalanalysisofthethreegroupsallshowedthatNstagewasanindependentprognosisfactor.Conclusions:(1)Thestomachisamuscularelasticfibercapsule.ThestomachwallisrichinEFsandmainlyhasfourEL.TheseEFsmaintaintheelasticityofthestomachandparticipateintheirexpansion.(2)PELhasahighrecognitionrateingastriccancer,EFsstainingcanhelpdeterminethedepthoftumorinvasion,andthenassessthelocationofthetumorandserosa,pT3stagecanbesub-categorizedbyPEL.(3)pT3gastriccanceraccompaniedwithPELbrokenthroughisasignificantlyadverseprognosticfactor,itcouldbeusedtodividehigh-riskpopulationsofgastriccancer.pT3bgastriccancercouldbetreatedaspT4agastriccancer.Therefore,whenthedepthoftumorinfiltrationexceedsthemuscularispropria,inordertoincreasethestandardizationandaccuracyofthepathologicalreportandtogivethecliniciansuggestion,elasticstainingisnecessaryasaroutinestainingmethod,andthepositionalrelationshipbetweenthetumorandthePELisalsonecessarymakeanote.Keywords:Stomach/Elasticfibers/Elasticstaining/Peritonealelasticlamina/Gastriccancer/pTNMStaging/Prognosis6 安徽医科大学硕士学位论文胃壁弹力纤维分布的特点及其病理学意义1.前言弹力纤维(ElasticFibers，EFs)是人体内三大纤维之一，其余两种分别为胶原纤维和网状纤维，他们是细胞外基质的重要组成成分。细胞外基质内含有众多的蛋白质及碳水化合物等，它们相互作用，构成机体的内环境，并且维持内环境的稳定。EFs是细胞外基质中一种不可溶解的成分，主要分布在人体的皮肤、血管、肺、韧带、软骨等弹性组织器官。这些弹性组织器官都有强大的伸展性，它们可以伸展回缩而又不受到损伤，这都是细胞外基质中弹力纤维网的作用[1]。EFs较细，直径0.2-1.0μm，新鲜标本上呈黄色，折光性强，有分支，排列散乱，其有两种不同的成分构成：中央丰富的无定形成分和外周的微原纤维。弹性蛋白构成无定形成分，并且维持EFs的弹性[2]。弹性蛋白是EFs中最丰富的蛋白质，约占成熟弹性蛋白结构的90%，它只由一个基因编码，这个基因位于7号染色体11区2带[3]。弹性蛋白是由弹性细胞如成纤维细胞、平滑肌细胞及软骨细胞等以可溶性前体原弹性蛋白的形式分泌。原弹性蛋白是一种不对称分子，其具有两个功能上不同的区域[4]：赋予原弹性蛋白弹性样性质的N端弹性线圈，以及促进细胞粘附的C端细胞相互作用模块。微纤维由几种蛋白质组成，包括原纤维蛋白和微纤维相关的糖蛋白，其中原纤维蛋白是主要构成成分，原纤维蛋白可以调节纤连蛋白介导的细胞粘附和迁移[5]，并且它们被认为在止血[6]和肿瘤侵袭[7]中也起着至关重要的作用。这些蛋白质在原弹性蛋白分泌之前出现并形成支架，随后弹性蛋白移位到这些支架上并在其上沉积。EFs的形成是一个复杂的过程，需要所有相关蛋白质复杂的空间和时间调节。EFs在妊娠中期开始组装，在成人则很少再进行组装合成，因此一旦被破坏，很难再生[8]。多种遗传性疾病及后天获得性疾病都与EFs组成成分形成不良或突变有关[3]。例如，弹性蛋白突变导致主动脉瓣瓣膜狭窄和常染色体显性皮肤松弛症，原纤维蛋白-1突变导致Marfan综合征和Weill-Marchesani综合征，原纤维蛋白-4和原纤维蛋白-5突变导致常染色体隐性皮肤松弛症，而获得性7 安徽医科大学硕士学位论文弹力纤维缺陷包括真皮弹性蛋白病，及炎性损伤导致的一些纤维病变如肺气肿和血管疾病等，所以说EFs对人体的正常发育至关重要，其具有重要的生理学及病理学意义。有关EFs的病理学研究目前主要集中在诊断及鉴别疾病，判断肿瘤的浸润深度及脉管侵犯及与肿瘤患者的预后等方面。在皮肤病中用来鉴别皮肤毛母细胞瘤和基底细胞癌[9]，以及早期黑素瘤和良性黑素细胞痣、Spitz痣[10]；在肺部疾病中，用来鉴别细支气管肺泡癌和肺腺癌[11]以及评估胸膜侵犯[12]。EFs在常规HE染色中呈红色，与胶原纤维难以区分，因此需要特殊染色来把弹力纤维分别出来，有多种染色方法，不同的染色方法呈现出来的颜色也不同[13]。醛品红法呈紫色；间苯二酚碱性品红法呈蓝黑色至紫黑色；维多利亚蓝法呈蓝色至蓝黑色；铁苏木素法呈黑色；地衣红法呈深棕色。胃癌是当前世界范围内严重的健康问题，发病率在全球位列第4位，在肿瘤相关死亡性疾病中全球排名第2位[14]。2012年全球新发胃癌患者共有95.2万例，占全部新发肿瘤的6.8%；全球死于胃癌者共计72.3万人，约占死亡总数的8.8%。胃癌患者主要分布于发展中国家，中国尤甚。2012年中国胃癌发病例数占全球胃癌发病的42.6%，死亡例数占全球胃癌死亡的45.0%[15]。由我国癌症中心统计[16]，2012年胃癌在恶性肿瘤中的发病率位于第2位，死亡率位于第3位，女性少于男性，城市少于农村。胃癌发病以40～70岁最为多见，随着我国经济的高速发展，人们的生活质量和医疗环境也有了很大提高，使得人均寿命不断延长，人口老龄化也不断加重，老年胃癌患病人数逐渐增加，但由于环境污染、生活压力大及遗传等因素的影响，近年来青年人的胃癌发病率也日益增高[17,18]。面对胃癌在全世界范围及我国都有如此高的发病率、死亡率及死亡人数，对胃癌的基础研究及临床病理研究都是急需的。对于胃癌的发病原因，目前多认为是与幽门螺杆菌、EB病毒等病原体感染，遗传及环境因素有关。在胃癌的预后方面，一个可喜的信息是虽然宏观上，胃癌的发病率和死亡率都较高，但早期胃癌患者术后5年生存率可达90%，同时一个不幸的信息是由于早期胃癌症状不明显不足以引起人们重视及胃镜检查普及不足等原因，大多数患者在确诊为胃癌时已处于晚期。在胃癌的治疗方面，虽然手术切除是主要的治疗手段[19]，但单纯手术治疗的患者总生存率只8 安徽医科大学硕士学位论文有20%左右；放化疗及新辅助放化疗等方法产生的生存优势也不够显著；新兴的单克隆抗体治疗、细胞因子治疗、基因治疗、疫苗治疗及免疫毒素治疗等方法尚未成为主干性疗法[20]。面对如此严峻的形势，对胃癌的研究必须更细致，更深入。胃癌的预后与临床分期密切相关[21]，但是临床分期较笼统，没有病理分期精细，病理分期更能反映患者的预后。作为病理工作者，我们应尽力在胃癌的pTNM分期、胃癌病理类型及胃癌的基因突变靶点等方面上研究胃癌。众所周知，在胃肠道肿瘤的pTNM分期上，浆膜侵犯的判断一直是病理诊断中的难点，因为浆膜的间皮细胞层很薄，在手术中、术后的固定处理以及取材中都可能会受到损伤，另外，由于肿瘤的浸润以及其引起的相关炎症反应和纤维组织的增生改变都会破坏正常的浆膜结构[22]，因此，在一些病例中，单用HE染色很难准确的判断出是否有浆膜侵犯。为此，各病理机构统计出来的浆膜侵犯率有很大的差异[23]。关于局部浆膜侵犯（localperitonealinvolvement，LPI），Shepherd等[24]描述了四组模式：第1组LPI被定义为肿瘤非常接近腹膜表面，第2组LPI为肿瘤伴随间皮炎症和（或）增生反应，肿瘤接近但实际上不存在于腹膜表面，第3组LPI为肿瘤存在于腹膜表面，并伴随炎性反应和（或）间皮细胞增生和（或）“溃疡”，第4组LPI为腹膜上有游离的肿瘤细胞并且邻近组织结构有明确的“溃疡”。大家对把后两组作为LPI有绝对的认可，但对前两组是否能作为LPI仍持怀疑态度。鉴于浆膜侵犯诊断的困难之处，有学者建议用EFs染色来辅助诊断浆膜侵犯，因为脏层腹膜下面有一层弹力纤维网（PEL）[25]，离浆膜较近，且不易溶解破坏，是一个不错的替代浆膜的解剖标志。用EFs来辅助判断肿瘤的浸润深度在肺癌和结直肠癌中都有研究，其在肺癌中的作用已得到国际认可。自1970s以来，脏层胸膜侵犯就被作为肺癌pTNM分期pT分期中的一个解剖标志。基于Shimizu等及Osaki等的研究，第七版肺癌TNM分期推荐将胸膜侵犯分为PL0：肿瘤侵犯未超过弹力纤维层；PL1：肿瘤侵犯超过弹力纤维层但未及脏层胸膜；PL2：肿瘤侵犯达脏层胸膜表面；PL3：肿瘤侵犯壁层胸膜。其中PL1和PL2被定义为侵犯脏层胸膜，归入T2期［26]。虽然对PL1能否等同于PL2还存在争议，也有不少研究表明PL2患者比PL1患者预后差，但不可否认，弹力纤维层确实起到了分界9 安徽医科大学硕士学位论文作用，有助于判断肿瘤的浸润深度。在结直肠癌中[23,27-32]，研究者正在呼吁根据肿瘤细胞与浆膜下弹力纤维层的位置关系将pT3期肿瘤进行亚分类，细分为两组，即未突破弹力纤维层组及突破弹力纤维层组。ShintoE等[32]将325例pT3期结直肠癌按照是否超越浆膜处EL分为“pT3-浅”和“pT3-深”两组，结果发现后者术后复发率明显比前者高，生存期比前者短，后者的生存期与pT4期相似，前者的生存期与pT2期相似，因此他认为根据浆膜下EL受侵情况将pT3期结直肠癌进行亚分类对预测患者预后非常有用，鼓励用浆膜下EL划分pT3期。有学者甚至建议将突破弹力纤维层作为T4期肿瘤，并对其按照T4期肿瘤的治疗方法进行处理。但Andrea等[33]对217例pT3、pT4期结直肠癌术后标本行弹力纤维染色，发现pT3期弹力层受侵与未受侵的患者无病生存期无明显差异，统计分析显示弹力层受侵不是影响患者不良预后的因素，另外右半结肠浆膜弹力层的识别率及染色强度均不及左半结肠，针对频繁出现的弹力膜未识别现象，尤其对于右半结肠，作者认为弹力纤维染色对判断结直肠癌预后上作用有限。虽然侵犯弹力层不等同于侵犯浆膜，但不可否认侵犯弹力膜是提示浆膜侵犯的一个有用指标。胃也是消化系统重要的器官，与结直肠有相似的解剖结构，但相关的研究在胃上却少有。关于正常胃壁内EFs分布情况的研究不多，目前只有徐薪等[34]对其进行过报道，但是其选取的正常胃组织是随机的，并未对从贲门到幽门整个胃不同部位EFs的分布情况进行研究。本实验主要是系统性研究正常胃壁内几个关键性解剖位置处EFs的分布情况并探讨胃PEL在胃癌pTNM分期中的价值及与预后的关系。2.材料与方法2.1材料选取安徽医科大学第一附属医院胃溃疡及胃癌手术切除标本，在远离病变≥5㎝的区域取材，取得正常胃组织60块；选取2012年1月-2014年7月行全胃根治手术，病理诊断为pT3期胃腺癌标本75例。收集其临床病理资料，包括性别、发10 安徽医科大学硕士学位论文病年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、检及淋巴结总数、区域淋巴结转移个数、淋巴脉管侵犯情况及预后生存资料。同时期临床病理资料完善的pT4a期胃腺癌标本30例作为生存对照。所有患者术前均未接受放化疗，术后均接受规律化疗，胃癌为单发且原发肿瘤，无远处转移，无其他严重影响患者生存期的疾病。切片组织结果由两位主治医师判读并达到一致的结果。2.2实验主要试剂2.2.1组织处理试剂（1）10%中性福尔马林溶液：福尔马林(40%的甲醛溶液)100ml，蒸馏水900ml，充分混匀，配置成1000ml固定液，pH值为7.2～7.4；（2）甲醛：购买自国药集团化学试剂有限公司；（3）无水乙醇：购买自上海苏懿化学试剂有限公司；（4）75%乙醇：购买自合肥天帆医药科技有限公司；（5）二甲苯：购买自上海苏懿化学试剂有限公司；（6）石蜡（58℃-60℃）：购买自福建启盛实验设备科技有限公司；（7）中性树脂（显微镜用FMP100g）：购买自国药集团化学试剂有限公司。2.2.2苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosinstaining，HE染色）试剂（1）苏木素染液（Harris）：购买自珠海贝索（Baso）生物技术有限公司；（2）伊红染液（水溶性）：购买自珠海贝索（Baso）生物技术有限公司；（3）1%盐酸乙醇：99ml75%酒精与1ml浓盐酸充分混匀配置；（4）1%碳酸锂水溶液：1g碳酸锂充分溶解于100ml蒸馏水中配置。2.2.3弹力纤维染色试剂11 安徽医科大学硕士学位论文购买自珠海贝索（Baso）生物技术有限公司。染色结果为弹力纤维呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维与红细胞呈黄色。试剂组成为（1）高锰酸钾溶液，主要成分为高锰酸钾；（2）草酸溶液，主要成分为草酸；（3）Elastin染液，主要成分为维多利亚蓝及间二苯酚；（4）VanGieson染液，主要成分为酸性品红及苦味酸。2.3实验主要仪器设备（1）TSJ型生物组织自动脱水机，购买自常州市中威电子仪器有限公司；（2）BM-1型病理组织包埋机，购买自安徽省电子科学研究所；（3）BMJ-B型病理组织冷冻台，购买自常州市中威电子仪器有限公司；（4）LeicaRM2235轮转式切片机，购买自德国Leica公司；（5）PHY-III型病理漂烘仪，购买自常州市中威电子仪器有限公司；（6）光学显微镜LeicaDM2500，购买自德国Leica公司；（7）Leica显微摄像系统，购买自德国Leica公司。2.4实验方法2.4.1正常组织的获取及处理（1）选取胃溃疡及胃癌手术切除标本，在远离病变≥5㎝的区域用新刀片对胃组织贲门、胃底、胃体前后壁、胃窦及幽门六个部位进行纵横两切面取材（纵切面为与外层纵行平滑肌平行的切面，横切面为与纵切面垂直的切面）；（2）10%中性缓冲福尔马林固定8-12h；（3）流水冲洗1h,（4）放入自动脱水机，标本依次经过10%中性甲醛液120min，75%乙醇90min,85%12 安徽医科大学硕士学位论文乙醇90min,95%乙醇90min,95%乙醇70min，无水乙醇60min，无水乙醇60min，二甲苯45min，二甲苯45min，蜡60min，蜡60min，蜡180min；（5）石蜡包埋；（6）所有石蜡标本行HE染色；（7）挑选正常胃组织行EVG弹力纤维染色（挑选标准见2.5.1）。2.4.2胃癌组织的获得及处理（1）病理档案室查阅并调取所需病例；（2）每个病例都借出所有切片；（3）选出肿瘤浸润深度最深且有浆膜存在的切片并借出其对应的蜡块；（4）所有蜡块标本均行常规HE染色及改良EVG弹力纤维染色。2.4.3HE染色（1）石蜡切片，厚度3μm；（2）将切片置于90℃烤箱中烘烤15-20min；（3）切片经过二甲苯I、II各15min；（4）切片依次经过100%、95%、75%的乙醇溶液，各1min；（5）自来水冲洗5-10min；（6）Harris苏木素染液5min，自来水冲洗0.5-1min；（7）1%盐酸酒精溶液分化2-3s，自来水冲洗15-30s；（8）1%碳酸锂水溶液返蓝3-5s,自来水冲洗4-6min；（9）伊红溶液10-20s,自来水冲洗2-3s；（10）依次经过75%、90%、100%、100%的乙醇溶液，各5-10s；（11）二甲苯I、II各5min进行透明；（12）中性树胶封片。13 安徽医科大学硕士学位论文2.4.4EVG弹力纤维染色（1）石蜡切片，厚度3μm；（2）组织片常规脱蜡至水；（3）高锰酸钾溶液氧化5min，稍水洗；（4）草酸溶液漂白2-3min，至标本无色为止，细流水冲洗3-5min；（5）95%乙醇溶液洗2-3s，浸入Elsatin染液中常温作用8-24h（加盖，避免染液挥发）；（6）95%乙醇溶液分化，至无多余染液脱下（必要时镜下控制，避免脱色过度）；（7）细流水冲洗3-5min；（8）用VanGieson染液染1min，倾去染液，不可经水洗；（9）95%乙醇溶液快速分化2-3s，无水乙醇脱水5-10s；（10）二甲苯I、II各5min进行透明；（11）中性树胶封片。2.4.5改良EVG弹力纤维染色（1）从石蜡切片到用VanGieson染液染1min，步骤同EVG弹力纤维染色步骤（1）-（8）；（2）95%乙醇溶液快速分化2-3s，浸入Harris苏木素染液5min，自来水冲洗0.5-1min；（3）1%盐酸酒精溶液分化2-3s，自来水冲洗15-30s；（4）1%碳酸锂水溶液返蓝3-5s,自来水冲洗4-6min；（5）伊红溶液10-20s,自来水冲洗2-3s；（6）依次经过75%、90%、100%、100%的乙醇溶液，各5s；（7）二甲苯I、II各5min进行透明；14 安徽医科大学硕士学位论文（8）中性树胶封片。2.5结果判读2.5.1正常胃组织的判定针对从胃溃疡及胃癌标本上选取的正常胃壁组织，HE染色结果若没有见到溃疡、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变及癌成分则视为正常胃壁组织。2.5.2胃腺癌浆膜侵犯的判定针对前言中提到的Shepherd等对局部浆膜侵犯（LPI）描述的四种模式。本实验将第3组及第4组作为浆膜侵犯的依据。第3组为肿瘤存在于腹膜表面，并伴随炎性反应和（或）间皮细胞增生和（或）“溃疡”，第4组LPI为腹膜上有游离的肿瘤细胞并且邻近组织结构有明确的“溃疡”。2.5.3第七版和第八版胃癌分期标准根据美国癌症联合委员会（AmericanJointCommitteeonCancer,AJCC）癌症分期手册，结合肿瘤浸润深度、淋巴结转移及远处转移三项指标，对胃癌进行病理分期（表1-3）。15 安徽医科大学硕士学位论文表1胃癌pTNM分期Tab1pTNMclassificationofthegastriccancer原发肿瘤的定义（T)TX原发肿瘤无法评估T0尚未发现原发肿瘤的任何证据Tis原位癌：上皮内肿瘤未侵犯固有层，高度不典型增生T1肿瘤侵犯固有层，黏膜肌层，粘膜下层T1a肿瘤侵犯固有层或黏膜肌层T1b肿瘤侵犯粘膜下层T2肿瘤浸润超过粘膜下层，但局限于固有肌层T3肿瘤浸润超过固有肌层，但局限于浆膜下组织T4肿瘤侵犯浆膜（脏层腹膜）或邻近组织结构T4a肿瘤侵犯浆膜（脏层腹膜）T4b肿瘤侵犯邻近组织结构或器官区域淋巴结的定义（N）NX区域淋巴结无法评估N0区域淋巴结无转移N1区域淋巴结转移1-2个N2区域淋巴结转移3-6个N3区域淋巴结转移≥7个N3a区域淋巴结转移7-15个N3b区域淋巴结转移≥16个远处转移的定义（M）M0无远处转移M1有远处转移16 安徽医科大学硕士学位论文表2第七版胃癌pTNM分期系统Tab2The7thpTNMstagingsystemofgastriccancerN0N1N2N3a,N3bT1IAIBIIAIIBT2IBIIAIIBIIIAT3IIAIIBIIIAIIIBT4aIIBIIIAIIIBIIICT4bIIIAIIIBIIIBIIICM1（任何他，任何N）IVIVIVIV表3第八版胃癌pTNM分期系统Tab3The8thpTNMstagingsystemofgastriccancerN0N1N2N3aN3bT1IAIBIIAIIBIIIBT2IBIIAIIBIIIAIIIBT3IIAIIBIIIAIIIBIIICT4aIIBIIIAIIIAIIIBIIICT4bIIIAIIIBIIIBIIICIIICM1（任何他，任何N）IVIVIVIVIV2.6病例分组根据肿瘤细胞与PEL的位置关系，将pT3期胃癌分为两组，即未突破PEL组和突破PEL组。我们将这两组分别定义为T3a组和T3b组。肿瘤细胞突破PEL最外层的EFs视为突破PEL，否则视为未突破PEL。对于粘液腺癌，粘液湖超过PEL17 安徽医科大学硕士学位论文视为突破，未超越视为未突破。2.7随访通过查阅病人住院病历及电话询问两种方式对患者进行随访，记录患者总生存期（overallsurvival,OS）。随访从手术当天开始，到患者死亡截止，截止日期为2017年7月31日。OS为手术当天到患者死亡或最后一次随访时间。2.8统计学处理采用SPASS16.0软件进行数据统计分析。不同分组之间临床病理资料的比较采用独立样本t检验、卡方检验及Fisher确切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier法。Log-rank检验比较生存曲线。多元回归分析采用COX回归模型。所用检验均以α=0.05为检验水准，p<0.05为差异有统计学意义。3.结果3.1正常胃壁EFs分布情况正常胃壁主要有四个EL，依次在黏膜肌层，固有肌层与粘膜下层交界区，固有肌层与浆膜下组织交界区及浆膜下近浆膜处（图1）；胃壁浆膜下组织无脂肪组织的区域浆膜下EFs几乎充满其全层，这些区域固有肌层外侧的EL与PEL分界不清或两者合为一个EL（图2，图3B）。浆膜下组织EL主体方向与外侧纵行平滑肌走向平行（图2B）。不同部位EFs的含量不同，从贲门到幽门，粘膜肌层内的EFs分布较规律，含量无明显变化；固有肌层两侧处的EFs，贲门、胃底、胃体部位含量较多（图1），胃窦及幽门含量少（图3），PEL较薄，紧邻浆膜（图1B）；粘膜固有层、粘膜下层及固有肌层的结缔组织内也有散在分布的EFs。上述部位的18 安徽医科大学硕士学位论文EFs较粗，颜色深染，固有肌层中间部分的平滑肌间可见纤细、淡然的EFs，胃壁的血管壁上EFs染色深，内弹力膜明显（图4）。图1AEL分布：粘膜肌层和固有肌层与粘膜下层交界区，EVG染色X50Fig1AELdistribution：muscularismucosaandthejunctionofthemuscularispropriaandsubmucosa,EVGstainingX50图1BEL分布：固有肌层与浆膜下组织交界区和浆膜下近浆膜处,EVG染色X100Fig1BELdistribution：thejunctionofthemuscularispropriaandsubserosalandthesubserosalneartheserosa,EVGstainingX10019 安徽医科大学硕士学位论文图2A胃体后壁横切面浆膜层EFs分布情况，EVG染色X400Fig2AThedistributionoftheEFsinthetransversesectionoftheposteriorwallofthestomachbody,EVGstainingX400图2B胃体后壁纵切面浆膜层EFs分布情况,EVG染色X400Fig2BThedistributionoftheEFsinthelongitudinalsectionoftheposteriorwallofthestomachbody,EVGstainingX40020 安徽医科大学硕士学位论文图3A胃幽门处EFs分布情况:粘膜面到浅肌层，EVG染色X50Fig3AGastricpyloricEFsdistribution:mucosalsurfacetothesuperficialmuscularispropria,EVGstainingX50图3B胃幽门处EFs分布情况：深肌层到浆膜，EVG染色X400Fig3BGastricpyloricEFsdistribution:deepmuscularispropriatotheserosa,EVGstainingX40021 安徽医科大学硕士学位论文图4正常胃壁血管EFs分布，EVG染色X50Fig4EFsdistributionofnormalgastricbloodvessel,EVGstainingX503.2胃癌胃壁EFs分布情况及PEL识别率及PEL与肿瘤的位置关系胃癌时肿瘤内部无EFs，肿瘤间质内仅见少量EFs。PEL会因肿瘤引起的炎症反应及纤维增生等移位、断裂（图5）。胃癌组织内血管内皮细胞增生明显，血管壁增厚，内弹力膜增厚，颜色加深，外膜EFs含量增多（图6）。75例胃癌PEL识别率为89.3%（67/75），肿瘤与PEL有两种位置关系：未突破（图5A）及突破（图5B），有43例（57.3%）肿瘤未突破PEL（pT3a），24例（32.0%）肿瘤突破PEL（pT3b），8例（10.7%）浆膜层未见明显PEL。22 安徽医科大学硕士学位论文图5A肿瘤未突破PEL，改良EVG染色X50注释：黑色箭头所指为PEL，T为肿瘤区，S代表浆膜面Fig5AThetumordidnotbreakthroughPEL,modifiedEVGstainingX50Note:TheblackarrowreferstothePEL,Treferstotumor,Sreferstoserosalsurface图5B肿瘤突破PEL，改良EVG染色X50注释：黑色箭头所指为PEL，T为肿瘤区，S代表浆膜面Fig5BThetumorbrokethroughPEL,modifiedEVGstainingX50Note:TheblackarrowreferstothePEL,Treferstotumor,Sreferstoserosalsurface23 安徽医科大学硕士学位论文图6胃癌胃壁血管EFs分布，改良EVG染色X50Fig6EFsdistributionofgastriccancerbloodvessel,modifiedEVGstainingX503.3随访信息随访时间为5-67个月，中位随访时间为44个月，获得52例患者的生存信息，其中包括31例T3a患者，18例T3b患者，3例未见明显PEL患者。因未见明显PEL者例数过少，故不对其进行生存分析。3.4T3a胃癌组与T3b胃癌组临床病理资料的关系及预后统计分析发现，pT3b期胃癌区域淋巴结转移个数比pT3a期胃癌多（p<0.05），淋巴脉管侵犯率比pT3a期胃癌高（p<0.05），但在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、检及淋巴结总数及N分期上均无统计学差异（p>0.05）（表4）。T3a胃癌与T3b胃癌的3年生存率分别为76.7%和42.8%，前者比后者高。将分组（突破PEL与否）、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、N分期及淋巴脉管受侵情况等作为因素变量纳入分析。单因素分析发现分组、N分期及淋巴脉管受侵是影响pT3期胃癌患者预后的影响因素，T3b患者OS比T3a患者低24 安徽医科大学硕士学位论文（2=9.523，p=0.002）（图7）。COX多因素分析发现PEL受侵、N分期和淋巴脉管受侵是pT3期胃癌患者不良预后的独立影响因素（表5）。表4T3a患者和T3b患者临床病理资料Tab4ClinicalpathologicalcharacteristicsoftheT3apatientsandtheT3bpatients观察指标T3a患者T3b患者总数P数量（%）31（63.3）18（36.7）49（100.0）性别（%）0.83男18（58.0）11（61.1）29（59.2）女13（42.0）7（38.9）20（40.8）年龄（%）0.99＜60岁12（38.7）7（38.9）19（38.8）≥60岁19（61.3）11（61.1）30（61.2）大小（%）0.99＜5㎝12（38.7）5（27.8）17（34.7）≥5㎝19（61.3）13（72.2）32（65.3）主要部位（%）0.08贲门和胃底20（64.5）10（55.6）30（61.2）胃体11（35.5）5（27.8）16（32.7）胃窦和幽门0（0.0）3（16.6）3（6.1）病理类型（%）0.08中分化腺癌14（45.2）3（16.7）17（34.7）低分化腺癌12（38.7）13（72.2）25（51.0）粘液成分腺癌5（16.1）2（11.1）7（14.3）检及淋巴结个数（平均数）18.618.20.8625 安徽医科大学硕士学位论文区域淋巴结转移个数（平均数）47.60.02*N分期（%）0.20N010（32.3）1（5.6）11（22.4）N15（16.1）4（22.2）9（18.4）N28（25.8）5（27.8）13（26.5）N3a6（19.4）7（38.8）13（26.5）N3b2（6.4）1（5.6）3（6.2）淋巴脉管侵犯（%）0.04*无28（90.3）11（61.1）39（79.6）有3（9.7）7（38.9）10（20.4）*P<0.05图7PEL受侵与患者预后的关系Fig7AKaplan-MeiersurvivalcurveforoverallsurvivaldependingonthelocationofthetumorandthePEL.26 安徽医科大学硕士学位论文表5COX回归分析结果Tab5ResultsoftheCOXregressionanalysis变量风险比（HR)95%置信区间P值分组2.6101.055-6.4550.038*淋巴脉管侵犯3.1651.187-8.4400.021*N分期1.9241.312-2.8210.001**P<0.053.5pT3b胃癌组与pT4a胃癌组临床病理资料的关系及预后统计分析发现，pT3b胃癌与pT4a胃癌在区域淋巴结转移个数、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、检及淋巴结总数、N分期及淋巴脉管侵犯上均无统计学差异（p>0.05）（表6）。两者的3年生存率分别为42.8%和30.0%，前者比后者高。将分组（突破浆膜与否）、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、N分期及淋巴脉管侵犯等作为因素变量纳入分析。单因素分析发现年龄、N分期及淋巴脉管侵犯是此类胃癌患者不良预后的影响因素，分组与患者OS无关，pT3b患者OS与pT4a患者OS无统计学差异（2=0.618，p=0.432）（图8）。将分组（侵犯胃浆膜与否）、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、N分期及淋巴脉管侵犯等作为因素变量纳入分析。单因素分析发现年龄、N分期及淋巴脉管侵犯是影响这些胃癌患者预后的影响因素，年龄≥60岁的胃癌患者生存时间明显缩短，具有统计学差异（p<0.05）（图9），而是否侵犯浆膜对这些胃癌患者的总生存期无影响（p>0.05）。COX多因素分析发现患者年龄和N分期是影响这些胃癌患者预后的独立影响因素（表7）。27 安徽医科大学硕士学位论文表6T3b患者和T4a患者临床病理资料Tab6ClinicalpathologicalcharacteristicsoftheT3bpatientsandtheT4apatients观察指标T3b患者T4a患者总数P数量（%）18（37.5）30（62.5）48（100.0）性别（%）0.38男11（61.1）22（73.3）33（68.8）女7（38.9）8（26.7）15（31.2）年龄（%）0.76＜60岁7（38.9）13（43.3）20（41.7）≥60岁11（61.1）17（56.7）28（58.3）大小（%）0.74＜5㎝5（27.8）7（23.3）12（25.0）≥5㎝13（72.2）23（76.7）36（75.0）主要部位（%）0.93贲门和胃底10（55.6）14（46.7）24（50.0）胃体5（27.8）9(30.0)14（29.2）胃窦和幽门3（16.6）7（23.3）10（20.8）病理类型（%）0.30中分化腺癌3（16.7）4（13.3）7（14.6）低分化腺癌13（72.2）17（56.7）30（62.5）粘液成分腺癌2（11.1）9（30.0）11（22.9）检及淋巴结个数（平均数）18.219.70.43区域淋巴结转移个数（平均数）7.67.70.98N分期（%）0.8028 安徽医科大学硕士学位论文N01（5.6）3（10.0）4（8.3）N14（22.2）6（20.0）10（20.8）N25（27.8）8（26.7）13（27.1）N3a7（38.8）8（26.7）15（31.3）N3b1（5.6）5（16.6）6（12.5）淋巴脉管侵犯（%）0.94无11（61.1）18（60.0）29（60.4）有7（38.9）12（40.0）19（39.6）*P<0.05图8浆膜受侵与患者预后的关系Fig8AKaplan-Meiersurvivalcurveforoverallsurvivaldependingontheserosainvasion.29 安徽医科大学硕士学位论文图9年龄与患者预后的关系Fig9AKaplan-Meiersurvivalcurveforoverallsurvivaldependingontheageofpatients.表7COX回归分析结果Tab7ResultsoftheCOXregressionanalysis变量风险比（HR)95%置信区间P值年龄2.2001.073-4.5120.031*淋巴脉管侵犯1.9250.952-3.8920.068N分期1.8821.327-2.6680.000**P<0.0530 安徽医科大学硕士学位论文3.6pT3胃癌组与pT4a胃癌组临床病理资料的关系及预后统计分析发现，pT3患者与pT4a患者在区域淋巴结转移个数、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、检及淋巴结总数、N分期及淋巴脉管侵犯上均无统计学差异（p>0.05）（表8）。将分组（侵犯胃浆膜与否）、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、N分期及淋巴脉管侵犯等作为因素变量纳入分析。单因素分析发现分组、肿瘤大小、N分期及淋巴脉管侵犯是这些胃癌患者预后的影响因素。pT3期胃癌3年生存率为64.3%，比pT4a期胃癌30.0%的3年生存率高，而且前者OS比后者OS高（2=9.902，p=0.002）（图10）。肿瘤最大径≥5cm的胃癌患者比<5㎝的胃癌患者OS明显缩短，具有统计学差异（p=0.029）（图11）。COX多因素分析发现分组和N分期是这些胃癌患者生存的独立影响因素（表9）。表8T3患者和T4a患者临床病理资料Tab8ClinicalpathologicalcharacteristicsoftheT3patientsandtheT4apatients观察指标T3患者T4a患者总数P数量（%）49（62.0）30（38.0）79（100）性别（%）0.20男29（59.2）22（73.3）51（64.6）女20（40.8）8（26.7）28（35.4）年龄（%）0.69＜60岁19（38.8）13（43.3）32（40.5）≥60岁30（61.2）17（56.7）47（59.5）大小（%）0.29＜5㎝17（34.7）7（23.3）24（30.4）≥5㎝32（65.3）23（76.7）55（69.6）31 安徽医科大学硕士学位论文主要部位（%）0.08贲门和胃底30（61.2）14（46.7）44（55.7）胃体16（32.7）9（30.0）25（31.6）胃窦和幽门3（6.1）7（23.3）10（12.7）病理类型（%）0.06中分化腺癌17（34.7）4（13.3）21（26.6）低分化腺癌25（51.0）17（56.7）42（53.2）粘液成分腺癌7（14.3）9（30.0）16（20.2）检及淋巴结个数（平均数）18.519.70.66区域淋巴结转移个数（平均数）5.37.70.21N分期（%）0.45N011（22.4）3（10.0）14（17.7）N19（18.4）6（20.0）15（19.0）N213（26.5）8（26.7）21（26.6）N3a13（26.5）8（26.7）21（26.6）N3b3（6.1）5（16.6）8（10.1）淋巴脉管侵犯（%）0.06无39（79.6）18（60.0）57（72.2）有10（20.4）12（40.0）22（27.8）*P<0.0532 安徽医科大学硕士学位论文图10浆膜受侵与患者预后的关系Fig10AKaplan-Meiersurvivalcurveforoverallsurvivaldependingontheserosalinvasion.图11肿瘤大小与胃癌患者预后的关系Fig11AKaplan-Meiersurvivalcurveforoverallsurvivaldependingonthetumorsize33 安徽医科大学硕士学位论文表9COX回归分析结果Tab9ResultsoftheCOXregressionanalysis变量风险比（HR)95%置信区间P值分组1.9851.053-3.7420.034*肿瘤大小1.2840.606-2.7230.514淋巴脉管侵犯1.2410.638-2.4150.525N分期1.7321.326-2.2630.000**P<0.054.讨论胃壁内存在广泛的EFs分布，KnudsenPJ[25]曾对PLE进行观察，其中包括对胃浆膜层EL的观察，他发现胃浆膜层有大量弹性组织，在有脂肪组织或结缔组织将固有肌层与浆膜分开的区域浆膜处有与PEL一致的EL,但在浆膜直接靠近肌层的区域，浆膜处的EL难以辨别，这与本研究的观察结果一致。关维等[34]对正常胃组织内EFs分布规律进行观察，指出胃壁内EFs呈规律性分布，主要在粘膜肌层，肌层临近粘膜下层侧狭窄区域及个别肌层平滑肌束间的结缔组织中分布，这与本研究的部分结果一致，除此之外，我们还发现在浆膜下层也分布着数量显著的EFs。本实验第一次系统全面的研究从粘膜层到浆膜层,从贲门到幽门胃壁全层EFs的分布情况，以期大家对此有更深的认识。实验发现从贲门到幽门，粘膜肌层内的EFs分布较规律，几乎覆盖粘膜肌全层，含量无明显变化，这可能与维持胃粘膜皱襞的功能相关；固有肌层两侧处的EFs，贲门、胃底、胃体部位含量较多，这可能与胃底及胃体强大的伸展性相关，而胃窦及幽门含量少，这可能与胃窦及幽门处胃壁活动度相对较小，且其固有肌层较厚，平滑肌的作用即可维持其收缩及舒张有关。EFs在病理和临床工作中的意义都很大，它不仅可用于多种疾病的诊断及鉴别34 安徽医科大学硕士学位论文诊断[3，25]，也可用于判断肿瘤的浸润深度，即肿瘤的pT分期。如前言中所述，肺癌细胞侵犯超过胸膜处的EL就可作为侵犯脏层胸膜，这对于HE染色镜下诊断胸膜侵犯有困难的病例是非常有帮助的。赵兰香等[35]对肉眼观察癌组织均紧贴胸膜的200例标本进行HE及EFs染色结果，结果发现有28例HE染色对癌组织是否侵犯脏层胸膜无法判断或判断不清，最终经EFs染色得出结论。罗海军等[36]回顾性研究100例肿瘤临近胸膜的肺癌标本，发现HE染色只能判断出57例侵犯脏层胸膜，26例没有侵及胸膜，而17例则判断不清或者无法判断，通过EFs染色诊断，26例没有侵犯脏层胸膜，74例侵犯了脏层胸膜（χ2=14.23，P<0.05），因此他们认为EFs染色与HE染色比较，前者更为清晰，更能准确判断出肺癌肿瘤细胞与胸膜的位置关系。在结直肠癌中[27-32]，除了ShintoE等[32]建议利用PEL对pT3期结直肠癌进行亚分类，并利用其预测患者预后外，KojimaM等[31]对564例pT3和pT4a期结直肠癌术后标本进行弹力纤维染色，并对其进行临床病理学分析，得到了与ShintoE等相似的结果，认为PEL是判断肿瘤浸润深度的有用解剖学标志，也是预测结肠癌预后的有力指标。这也是病理学们推荐用PEL划分结直肠癌pTNM分期的原因。胃的解剖结构与结直肠的解剖结构相似，而且本研究及前人的研究都证明胃浆膜层具有PEL，但PEL在胃癌中的病理学意义研究尚不清楚，因此我们就探索PEL对胃癌pTNM分期的价值，尤其是针对pT3期和pT4a期，以及其对胃癌预后的影响。其实在判读胃癌的浸润深度时，不少病理医生看到肿瘤细胞超过固有肌层就诊断为侵犯全层，而不说明具体的pT分期，但超过固有肌层的肿瘤有pT3和pT4这两种情况，临床医生看到“侵犯全层”这样的报告也极易认为是pT4期肿瘤。这样的报告目前似乎对临床治疗影响不大，因为第八版AJCC胃癌cTNM分期中pT3和pT4a对应的分期相同，pTNM分期中只有当区域淋巴结转移个数≤2即N0和N1时T3和T4a对应的分期不同，N2、N3a和N3b时T3和T4a对应的分期相同[37]（表3）。两者对应的病理分期及临床分期如此相似，使得一些病理诊断医生在诊断中认为“侵犯全层”这样的报告对患者影响不大，临床医生也没有足够的重视。但是，不能因为这样的分期就让我们忽视对胃癌分期的进一步研究。近来的一项研35 安徽医科大学硕士学位论文究[38]就指出PEL受侵是影响pT3期胃癌患者生存的独立影响因素，侵犯PEL的患者预后比未侵犯PEL的患者差，但与pT4a期患者无统计学差异。随着精准医疗越来越受到重视和提倡，能否根据PEL将pT3期进行亚分类也是一个值得重视和研究的课题。本研究选择的75例pT3期胃癌经改良EVG染色发现，有43例（57.3%）肿瘤细胞未突破PEL，可以肯定这43例患者肿瘤侵犯深度处于pT3期；有24例（32.0%）肿瘤细胞突破PEL，这部分患者按第8版AJCC胃癌pTNM分期标准也应归入pT3期，但是鉴于在肺癌中，肿瘤细胞突破胸膜EL即可认为是侵犯胸膜，这24例胃癌应归入pT3期还是pT4期，还是将pT3期按照肿瘤细胞是否突破PEL划分为pT3a和pT3b，把这24例胃癌归入pT3b，这是值得考虑和研究的一个问题。本研究PEL识别率高达89.3%（67/75），与LeiG等得到的PEL识别率（87.2%）相仿，因此PEL可以应用于划分胃癌pT分期。PEL与肿瘤的位置关系可推测胃癌患者预后。通过对这些胃癌患者临床病理资料的对比和预后生存分析发现，对于pT3期胃癌，突破PEL的胃癌患者更容易出现区域淋巴结转移，其3年生存率较未突破PEL者低，中位生存期短。肿瘤细胞突破PEL不仅是影响其生存的不良因素，而且是独立影响因素。对于pT3b胃癌组和pT4a胃癌组，虽然前者3年生存率及中位生存时间均比后者高，但两组的总生存期无统计学差异。这说明突破PEL的pT3期胃癌预后与pT4a期胃癌预后相似，pT3b胃癌可按照pT4a期胃癌对待，采取更积极的治疗。胃癌浆膜侵犯依然是影响患者生存的重要不良影响因素。对pT3胃癌组和pT4a胃癌组的预后分析发现，对于这些患者，浆膜侵犯是其生存的独立影响因素。第八版胃癌cTNM分期及pTNM分期似乎弱化了浆膜侵犯对这两组患者生存期的影响，这可能与各研究机构对浆膜侵犯的定义不同有关。众所周知，有浆膜侵犯的胃癌患者更易出现局部复发和腹腔种植转移，而且浆膜侵犯是胃癌术后行腹腔热灌注化疗的一个指征[39]，所以浆膜侵犯的准确判断对胃癌患者意义重大。三组患者均将其N分期按照N0、N1、N2、N3a和N3b纳入生存分析，结果发现N分期都是影响胃癌患者生存的独立影响因素。八版胃癌pTNM分期将N3期细分成N3a期和N3b期,并将它们分别出来进行分期（七版胃癌pTNM分期虽将N3期细分成N3a期和N3b期，但36 安徽医科大学硕士学位论文分期时并未将其分开，见表2），使得新版的分期更加精确,并且更能反应胃癌真实的预后情况，并对患者术后选择合理的治疗方案有重要的指导意义[40]。其实TNM分期系统是根据肿瘤患者的临床病理变化不断更新改进的，本研究的结果发现pT3期胃癌，根据肿瘤细胞是否突破浆PEL有两种完全不同的预后，所以我们建议利用PEL将胃癌pT3期进行亚分类，以便使TNM分期系统更完善，对病人的术后治疗及预后判断有更好的指导意义。至于突破PEL能否等同于侵犯浆膜，尚需要更大样本的研究去证实。另外，实验还发现对于pT3期和pT4a期胃癌患者，肿瘤大小是影响患者生存的重要因素。魏晟宏等[41]对753例行D2根治术的胃癌患者进行肿瘤大小和预后关系分析，应用COX比例风险模型得到肿瘤大小的最佳截点是5㎝，分析发现肿瘤大小是影响胃癌患者预后的独立影响因素。本研究也以5㎝为肿瘤大小分界，只得到其是影响胃癌患者预后的重要因素。HosodaK等[42]收集350例BorrmannIII型胃癌患者，调查其总生存期，COX比例风险模型得到肿瘤大小的最佳截点是5.3㎝，并且证实术前肿瘤大小是BorrmannIII型胃癌患者生存的独立预后因素，并提出术前肿瘤大小可能是提示新辅助化疗的有用指标。无论如何，这都表明肿瘤大小对胃癌患者预后是有影响的。关于肿瘤大小对胃癌预后影响的相关研究还有很多。虽然肿瘤大小一直未纳入TNM分期系统，但其很可能可作为TNM分期系统的补充，所以尚需要更多及更大样本的研究来验证肿瘤大小与胃癌患者预后的关系。对于pT3b期胃癌和pT4a期胃癌，生存分析发现年龄是影响其生存的独立影响因素。柳珂等[17]的研究发现年龄是影响进展期胃癌预后的独立影响因素，他们回顾性研究669例胃癌患者的临床病理资料，并根据年龄分为三组，分别为≤30岁组，31-70岁组和＞70岁组。统计分析发现，不同年龄胃癌组之间在组织类型、浸润深度、淋巴结转移以及组织分化程度上均存在差异，≤30岁组的患者肿瘤分化差、恶性度高、侵袭力强、进展快，其总生存率及预后是最差的，其次为＞70岁组的胃癌患者，31-70岁组胃癌患者预后相对较好。YamashitaK等[43]的研究也证明年龄是影响进展期胃癌预后的独立影响因素。所以临床医生应对患者的年龄重视起来,因为各年龄段有不同的病理类型及胃癌发展特征，尤其是对青37 安徽医科大学硕士学位论文年胃癌患者，其胃癌多进展快、恶性度高、死亡率也高。实验中我们也发现一些问题，当HE染色在固有肌层外侧看到肿瘤细胞，但未见浆膜或浆膜不明显时，有的诊断医生认为是肿瘤细胞侵犯到全层更有甚者认为是侵犯到了浆膜外脂肪组织，而这些脂肪组织极可能只是浆膜下组织的脂肪组织。此时通过EFs染色，浆膜侧如果未见PEL，此张切片组织的深度极可能只在浆膜下组织层，未达浆膜；如果见PEL，就应该根据肿瘤细胞与PEL的位置关系来判断肿瘤的浸润深度，肿瘤细胞未突破PEL，就可判读为pT3期，肿瘤细胞突破了PEL，就要慎重考虑其pT分期，必要时建议补取，因此处理大体标本时对脏层腹膜的充分取材及仔细评估对诊断至关重要。HE染色未见浆膜层的情况多见于胃癌发生于胃壁脂肪组织较多的部位，主要是大小网膜覆盖的部位，取材时极易破坏其表面的腹膜，胃癌pT分期的解释中提到肿瘤浸润到大小网膜，但未突破覆盖在大小网膜上的腹膜时定义为pT3期，如果突破则为pT4期，然而网膜脂肪组织较多，皱褶较多，且根据间皮层薄且容易受到破坏的自身特点，很难判断浆膜的受损是来自肿瘤本身还是人为。因此，寻找一个稳定且不易受到损伤的替代的解剖学标志来辅助划分pT3期和pT4期势在必行,PEL就是一个不错的选择。本实验75例胃癌中只有8例浆膜下未见明显PEL，PEL未识别率为10.7%。因仅随访到3例患者的生存情况，故未对其进行生存分析和比较。而LeiG等[38]的研究中，94例pT3期胃癌患者中有12例浆膜下未见明显PEL，未识别率将近12.8%，比本实验的未识别率略高。对其进行生存分析发现，浆膜下未见明显PEL的患者5年无病生期率及总生存率比侵犯PEL的患者低，但总生存期无统计学差异。本实验随访到的3例患者至随访结束时都在世，且总生存期都超过了三年，因此对于这些浆膜下未见明显PEL的患者，尚需要大样本的数据来分析其预后。另外也需要探究PEL未识别的原因，是由于肿瘤的破坏还是由于切面及染色方法的问题。实验中发现胃癌时胃壁内的血管明显增厚，血管内皮增生，内弹力膜也变厚且颜色深染，外膜EFs的层数也明显增加，这可能是机体的自我防御来抵抗肿瘤的侵犯。另外多项研究[44-46]表明，EFs染色有助于发现HE染色观察不到的脉管侵38 安徽医科大学硕士学位论文犯。本实验仅选择肿瘤浸润深度最深且有浆膜存在的一个蜡块进行EFs染色，但有研究每个病例用多个蜡块进行实验，为了得到更高的PEL识别率，关于用PEL来判断分期该用多少蜡块进行EFs染色这个问题，目前尚没有统一的标准。为了保证本实验染色效果最接近真实情况，关于EVG弹力纤维染色步骤中需要注意的问题，做出以下说明。一、必须用高锰酸钾氧化，草酸还原，不可省略这两个步骤，这样容易出现背景染色；二、Elastin染液容易挥发，且染色时间长达8-24h，所以必须采用封闭容器浸染；三、Elastin染液染色后应先用95%酒精分化，而不经水洗，以免难分化；四、95%酒精分化时最好单张分化，每张分化2-3s，分化液从玻片背面冲下，然后用流水冲洗，显微镜下观察分化程度，以血管壁内弹力膜完整、无断续、明显为宜；五、Elastin染液可多次重复使用，但随着使用次数的增加应相应增加其染色时间，且染液应置于阴凉避光的密闭容器内；六、VanGieson染液染色后不可水洗，因为其为水溶性，水洗后染上的颜色会减弱甚至洗脱；七、注意保质期，在产品的有效期内使用。目前EFs的研究多集中在二维平面的水平，我们建议以后加大对EFs三维平面的研究，从而从空间层面更多的了解胃内EFs的分布情况及胃癌时肿瘤与EFs及各个EL的关系，另外有报道称EFs与肿瘤的微环境相关，EFs与肿瘤的浸润转移等相关[30]，EFs作为细胞外基质中重要的一份子，其与肿瘤发生发展的关系及其在肿瘤进程中所起的作用尚需要更多的研究来验证。相信随着染色方法的不断改良及其在病理应用中的深入研究，在不久的未来EFs染色这种特殊染色方法在病理及医学研究中会有更普遍的应用。综上所述，胃壁内含有丰富的EFs，胃壁各层都有不同程度的EFs分布，这些EFs提供并维持胃的弹性及伸展性。胃浆膜下层确实存在PEL,EFs染色可以帮助判断肿瘤细胞浸润深度，进而评估肿瘤与浆膜的位置关系，帮助判断胃癌pT分期，尤其是pT3与pT4期胃癌，另一方面，根据PEL的受侵情况可推测患者预后，肿瘤突破PEL者预后明显不良，对于此类患者需要给与更积极的治疗措施，甚至可以按照pT4a期患者进行处理。最后，EFs染色也有助于识别脉管侵犯。因此当肿39 安徽医科大学硕士学位论文瘤浸润深度超过固有肌层时，为了患者的精准治疗及病理报告的规范严谨性，EFs染色有必要作为常规染色方法，肿瘤细胞与PEL的位置关系也有必要做出说明。5.结论（1）胃是一个肌性弹力纤维囊，胃壁含有丰富的弹力纤维，主要有四个弹力纤维层，依次在黏膜肌层，固有肌层与粘膜下层交界区，固有肌层与浆膜下组织交界区及浆膜下近浆膜处，这些EFs维持胃的弹性并参与其扩张；（2）PEL在胃癌中识别率高，EFs染色可以帮助判断肿瘤细胞浸润深度，进而评估肿瘤与浆膜的位置关系，PEL可对pT3期进行亚分类；（3）肿瘤突破PEL是严重影响pT3期胃癌预后的不良因素，可用于划分胃癌高危人群，突破PEL的患者可按pT4a期胃癌患者对待。6.参考文献1.MidwoodKS,SchwarzbauerJE.Elasticfibers:buildingbridgesbetweencellsandtheirmatrix[J].CurrBiol,2002,12(8):279-281.2.RosenbloomJ,AbramsWR,MechamR.Extracellularmatrix4:theelasticfiber[J].FASEBJ,1993,7(13):1208-1218.3.BaldwinAK,SimpsonA,SteerR,etal.Elasticfibresinhealthanddisease[J].ExpertRevMolMed,2013,15(8):1-30.4.BaldockC,OberhauserAF,MaL,etal.Shapeoftropoelastin,thehighlyextensibleproteinthatcontrolshumantissueelasticity[J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(11):4322-4327.5.TwalWO,CzirokA,HegedusB,etal.Fibulin-1suppressionoffibronectin-regulatedcelladhesionandmotility[J].JCellSci,2001,114(Pt24):4587-4598.40 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安徽医科大学硕士学位论文附录1.基本情况姓名：闫恩慧性别：女出生年月：1991年1月籍贯：河南省叶县民族：汉政治面貌：共青团员2.个人履历2007年9月-2010年7月叶县一高（高中）2010年9月-2015年7月新乡医学院临床医学专业（本科）2015年9月-至今安徽医科大学病理学与病理生理学专业（科学型硕士）3.在读期间所获奖励1）2017年9月获得安徽医科大学二等学业奖学金2）2017年5月获得“五四大合唱”三等奖3）2016年9月获得安徽医科大学一等学业奖学金4）2016年1月获得元旦晚会《映上红》节目一等奖5）2015年9月获得安徽医科大学二等学业奖学金4.读研期间参加的学术会议1）2017年12月安徽省病理学学术年会2）2016年11月全国病理学学术年会45 安徽医科大学硕士学位论文致谢时光如白驹过隙，三年研究生生涯即将画上句号，现在竟可以以天来计算在校的时间了。在这个安静的下午，回想三年的学习经历，往事一点一滴逐渐涌上心头，有太多的感触，也有太多的感谢。首先，我要衷心的感谢我的导师-孟刚教授。还记得第一次见到孟老师的时候，他是那么的和蔼可亲，平易近人，顿时让我的心里很温暖，也坚定了我的选择。在日后的相处中，我发现孟老师是那么的博学，他的科研理念、做事理念、工作理念及做人理念都深深的让我折服，我为能做这样一位伟大、智慧、无私、奉献的老师的学生感到深深的荣幸。对于我的研究课题，孟老师更是在选题、实验设计及论文撰写上给我悉心指导，使得实验能够顺利进行。孟老师总以“感恩、进取、团结、实干”这样的训诲督促我们，他是我终身学习的榜样。其次，我要感谢所有对我研究课题有帮助的人。王岳君师姐、杨苗苗师姐、万阳师兄、王源师姐在阅片上，章俊生老师、韩彪老师和王娜娜老师在实验操作和技术上，病理教研室的陈向红老师在我对课题材料的收集上，都给予我很大的帮助和指导，而师弟师妹及一些学弟学妹们在我对课题材料的收集和处理上都热心的帮助我。再次，我要感谢我的小伙伴们，2015级所有病理专业研究生及我的室友，三年中我们在一起分享自己的学习和生活，成为彼此的帮助。最后，感谢我的父母和两位挚友，你们对我的爱、鼓励和支持是我研究生生涯中前进的动力。向百忙中抽出时间来参加我的论文答辩的各位专家老师致以深深的谢意！46 安徽医科大学硕士学位论文课题综述弹力纤维在恶性肿瘤中的病理学意义摘要：弹力纤维广泛分布于身体各处，其与多种疾病的发生发展，都有密切的关系[1]，因此弹力纤维染色被广泛应用于病理诊断中。本综述着重介绍弹力纤维在肿瘤的鉴别，肿瘤的浸润深度及肿瘤的脉管侵犯中的病理学意义。1弹力纤维的构成及功能弹力纤维是人体三大纤维之一，是细胞外基质的重要组成成分，主要由中央的无定形弹性蛋白和外周的微原纤维构成[2]，另外原纤维蛋白，衰老关键蛋白，纤连蛋白，赖氨酰氧化酶等辅助蛋白也是不可或缺的成分[3]；直径约0.2-1μm，纤维分支，交织成网；分布于全身各处，但主要位于皮肤、肺、血管壁及腹膜。弹力纤维对组织的弹力和弹性是至关重要的。它们在正常器官发育过程中发挥重要作用[4]，并且是保证成人组织如心脏瓣膜和血管的正常功能的重要结构成分[5,6]。2弹力纤维常用染色方法及改良弹力纤维在HE染色切片中呈红色，与胶原纤维难以区分，但通过特殊染色可将两者染成不同的染色区分出来。目前最常用的染色方法有醛品红法（Gomori法），间苯二酚碱性品红法（Weigert法）和维多利亚蓝法[7]。熊红梅等[8]对Gomori法进行４种改良，与传统法相比，4种改良法不仅使染色质量变佳，而且简化了染色步骤，作者认为，对皮肤组织的弹力纤维染色时，选用改良的酸性高锰酸钾法、高锰酸钾法及2%过碘酸法较好，对浆膜、血管组织的弹力纤维染色，选用改良的４种方法均可，但是酸性高锰酸钾是值得推荐的最好的方法。王志东等[9]对醛品红法47 安徽医科大学硕士学位论文的改良则是在传统染色的基础上对细胞核进行苏木素复染，以显示出细胞核。陈书媛等[10]对EVG弹力纤维染色方法（维多利亚蓝法）进行改良，在VG染液衬染，快速用95%乙醇分化数秒后放入苏木素染液，进行常规HE染色，改良后弹力纤维染色结果无明显变化，但会使传统染色后未显示的细胞核呈蓝色，故其认为此改良的EVG染色法因能显示细胞核的颜色，使得更能显现弹力纤维、肿瘤细胞、血管及浆膜之间的关系，比传统的EVG弹力纤维染色定位更准确，值得推广。3弹力纤维的病理学意义3.1弹力纤维在肿瘤鉴别中的作用3.1.1皮肤疾病皮肤基底细胞癌和毛母细胞瘤均起源于皮肤的基底样生发层细胞，镜下形态相似，又都好发于头面部，但两者的手术方式及术后的治疗以及预后不同，两者的鉴别诊断难度大，容易误诊。陈昕等[11]对应用醛品红染色法检测皮肤毛母细胞瘤和基底细胞癌中弹力纤维的分布及数量，结果发现皮肤毛母细胞瘤组弹力纤维数量显著高于皮肤基底细胞癌组（p<0.05）。早期恶性黑色素瘤的临床和组织学改变与良性黑色素细胞痣、Spitz痣难以鉴别，常规的免疫组织化学及分子生物学检查不能很好的将良恶性黑色素细胞肿瘤鉴别出来。邵雪宝等[12]研究发现恶性黑色素瘤组肿瘤细胞团块中弹力纤维缺失，而黑色素细胞痣组与Spitz痣组中含有大量的弹力纤维，弹力纤维在皮肤黑色素瘤中的表达明显低于黑色素痣组与Spitz痣组，差异有统计学意义(P<0.05)。，Basko-Plluska等[13]通过荧光显微镜检查发现黑色素细胞痣中的弹力纤维含量多，而黑色素瘤肿瘤区域弹力纤维缺失。3.1.2肺部疾病48 安徽医科大学硕士学位论文细支气管肺泡癌是来源于细支气管或肺泡上皮的原发性肺癌，具有独特的生物学特性和预后[14]。因此，有学者主张从WHO肺癌的肺腺癌分类中将其分出来，使其作为肺癌中一种独立的类型。徐薪等[15]对细支气管肺泡癌和肺腺癌的弹力纤维进行观察，发现前者肺泡壁上仍然存在大量的弹力纤维并且部分呈现增生的趋势，弹力纤维排列较整齐，与正常肺泡壁上的相似，但比正常肺泡壁上的纤维粗，分布密集，而后者肿瘤间质内仅可见零星散在分布的弹力纤维碎片，大部分区域弹力纤维染色阴性，无法看到正常的肺泡结构。所以，通过弹力纤维染色可以将细支气管肺泡癌与肺腺癌鉴别出来。艾中伟[16]的研究也得到了相同的结论。3.2弹力纤维在肿瘤浸润深度中的作用3.2.1肺癌脏层胸膜侵犯自20世纪70年代以来，脏层胸膜侵犯被作为肺癌TNM分期中T分期的一个解剖标志[17]。基于Shimizu等[18]及Osaki等[19]的研究，第七版肺癌TNM分期推荐将胸膜侵犯分为PL0：肿瘤侵犯未超过弹力纤维层；PL1：肿瘤侵犯超过弹力纤维层但未及脏层胸膜；PL2：肿瘤侵犯达脏层胸膜表面；PL3：肿瘤侵犯壁层胸膜。其中PL1和PL2被定义为侵犯脏层胸膜，归入T2期。虽然对PL1能否等同于PL2还存在争议，也有不少研究表明PL2患者比PL1患者预后差[20,21]，但不可否认，弹力纤维层确实起到了分界作用，有助于判断肿瘤的浸润深度。3.2.2胃肠道恶性肿瘤浆膜侵犯胃肠道恶性肿瘤浆膜受侵是其不良预后的重要因素，在最新版TNM分期中，侵犯浆膜被定义为T4期。但是因为浆膜的间皮细胞层很薄，在手术中、术后的固定处理以及取材中都可能会受到损伤，另外，由于肿瘤的浸润以及其引起的相关炎症反应和纤维组织的增生改变都会破坏正常的浆膜结构，因此浆膜侵犯一直是49 安徽医科大学硕士学位论文病理诊断中的难点[22]。病理报道的浆膜侵犯率也有很大差异[23]。因此细胞学，弹力纤维染色及免疫组织化学等被用来辅助诊断判断不清的切片[22]。浆膜下组织紧邻浆膜表面处有弹力纤维层[24]，弹力纤维层被用来辅助判断浆膜侵犯。ShintoE等[25]对325例pT3期结直肠癌按照是否超越浆膜处EL分为“pT3-浅”和“pT3-深”两组，结果发现后者术后复发率明显比前者高，生存期比前者短，后者的生存期与pT4期相似，前者的生存期与pT2期相似，因此他认为浆膜下EL是将pT3期结直肠癌进行亚分类的一个很好的解剖标志，并且根据EL受侵情况对预测患者预后非常有用，鼓励用浆膜下EL划分pT3期。KojimaM等[26]对564例pT3和pT4a期结直肠癌术后标本进行弹力纤维染色，并对其进行临床病理学分析，认为腹膜弹力纤维层是判断肿瘤浸润深度的有用标志，也是预测结肠癌预后的有力指标。LeiG等[27]对94例无淋巴结转移，术前未进行放化疗且术后也未进行放化疗的pT3期胃癌术后标本行弹力纤维染色，发现有12例未见明显弹力膜，故将其分为三组，结果弹力层受侵组的患者预后比其余两组差，但与pT4a期患者无统计学差异，因此作者认为弹力纤维染色有助于判断肿瘤浆膜侵犯深度，并可有效预测患者预后。但是，Andrea等［28]对217例pT3、pT4期结直肠癌术后标本行弹力纤维染色，发现pT3期弹力层受侵与未受侵的患者无病生存期无明显差异，统计分析显示弹力层受侵不是影响患者不良预后的因素，另外右半结肠浆膜弹力层的识别率及染色强度均不及左半结肠，针对频繁出现的弹力膜未识别现象，尤其对于右半结肠，作者认为弹力纤维染色对判断结直肠癌预后上作用有限。虽然侵犯弹力层不等同于侵犯浆膜，但侵犯弹力膜是提示浆膜侵犯的一个有用指标。3.3弹力纤维在肿瘤脉管侵犯中的作用众所周知，血管壁上含有丰富的弹力纤维，通过弹力纤维染色能很好的显示血管。脉管侵犯是患者预后不良，复发及转移的重要影响因素。因此提高脉管侵犯的检出率是病理诊断的一个重点。CastonguayMC等[29]对103例原始报告为静脉侵犯阴性的食管腺癌切除标本进行HE染色和弹力纤维染色，结果HE染色发现8例有静脉侵犯，弹力纤维染色发现有74例有静脉侵犯，故其认为弹力纤维染色能50 安徽医科大学硕士学位论文显著提高静脉侵犯的检出率。另外多项研究[30,31]表明，弹力纤维染色有助于发现HE染色观察不到的脉管侵犯。所以钟志玖等[32]认为应将EFs染色作为肿瘤诊断中识别脉管侵犯的一个常规染色方法。4展望虽然弹力纤维染色在肿瘤鉴别、肿瘤侵犯深度及脉管侵犯上有很大的价值，但目前弹力纤维染色的应用并未得到普及，雷光[33]等对此问题做出了解释，包括几种弹力纤维染色的不足及弹力纤维识别率的差异等，并提出了相关展望，认为弹力纤维的病理应用尚需要大量的研究，包括能否直接将侵犯弹力膜的pT3结直肠癌定义为pT4，能否将弹力膜受侵作为Ⅱ期肠癌行辅助化疗的高危因素，以及运用弹力纤维染色识别卵巢癌的腹膜种植转移等。对于识别率的问题也给出相关的探索方向。鉴于目前弹力纤维的研究多集中在二维平面的水平，我们建议以后加大对弹力纤维三维平面的研究，从而从空间层面更多的了解肿瘤与弹力纤维的关系；另外有报道称弹力纤维与肿瘤的微环境相关[34]，弹力纤维与肿瘤的浸润转移等相关，因此需要更多的研究来验证弹力纤维与肿瘤发生发展的关系及其在肿瘤发生发展中所起的作用。相信随着染色方法的不断改良及其在病理应用中的深入研究，在不久的未来弹力纤维染色这种特殊染色方法在病理及诸多医学研究上会有更普遍的应用。参考文献1.BaldwinAK,SimpsonA,SteerR,etal.Elasticfibresinhealthanddisease[J].ExpertRevMolMed,2013,15(8):1-30．2.RosenbloomJ,AbramsWR,MechamR.Extracellularmatrix4:theelasticfiber[J].FASEBJ,1993,7(13):1208-1218.3.WagenseilJE.Newinsightsintoelasticfiberassembly[J].BirthDefectsResCEmbryoToday,2007,81(4):229-240.51 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