《心功能不全合并糖尿病大鼠模型建立及代谢组学研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：R654.2学校代码：10062密级：学号：2013602422硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：心功能不全合并糖尿病大鼠模型建立及代谢组学研究TITLEEstablishmentandmetabolicresearchofratmodelofcardiacinsufficiencycomplicatedwithdiabetesmellitus一级学科：临床医学二级学科：外科学胸心外科论文作者：李田乐指导教师：李彤天津医科大学研究生院二〇一六年五月 分类号：R654.2学校代码：10062密级：学号：2013602422学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：心功能不全合并糖尿病大鼠模型建立及代谢组学研究TITLEEstablishmentandmetabolicresearchofratmodelofcardiacinsufficiencycomplicatedwithdiabetesmellitus一级学科：临床医学二级学科：外科学胸心外科论文作者：李田乐指导教师：李彤导师组成员：胡晓旻天津医科大学研究生院二〇一六年五月 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日 天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的构建一种高稳定性心功能不全合并糖尿病大鼠模型，并借助超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）代谢组学研究平台，对其血清及心肌组织代谢轮廓变化进行分析，从而筛选出差异显著的特征性内源性代谢物，进一步分析其所涉及的代谢通路以及与疾病发生发展的内在联系，以期指导临床相关疾病的早期诊断、干预与治疗。方法取清洁级雄性Wistar大鼠70只，随机分为4组，正常组（Normal），糖尿病组（DM），心功能不全组（AAC），心功能不全合并糖尿病组（AAC+DM），首先将DM组大鼠随机分为5个亚组：DM1~5，分别采用单次腹腔注射40、45、50、55、60mg/kg链脲佐菌素（STZ）的方法构建糖尿病模型，同期对心功能不全组、心功能不全合并糖尿病组大鼠采用腹主动脉缩窄的方法构建心功能不全模型，缩窄2个月后，对心功能不全合并糖尿病组大鼠采用上述糖尿病造模方法构建心功能不全合并糖尿病大鼠模型。实验过程中动态观察大鼠一般状况及体质量改变，监测链脲佐菌素注射后72小时、4周大鼠随机血糖水平，并于链脲佐菌素注射后1个月，对各组大鼠进行心脏超声及心肌病理改变评价，然后收集各组大鼠血清及心肌组织标本，利用代谢组学超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）平台，采用SIMCA-P+12.0.1.0的模式识别方法构建主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型对其代谢轮廓进行初步分析，根据变量投影重要性（VIP）值及变量投影重要性置信区间筛选出潜在的内源性差异性离子，然后利用统计学工具（SPSS17.0,USA）对所得变量进行非参数检验，排除P>0.05的变量进而筛选出潜在特征离子，并对最终离子进行鉴定，最后对差异性代谢物的变化趋势、代谢通路及其临床应用价值进行分析和探讨。结果对比不同剂量，链脲佐菌素为45mg/kg时，构建心功能不全合并糖尿病模型稳定性高且成模大鼠一般状况、血糖水平、心脏超声、心肌组织镜下形态学较正常组发生明显变化，符合心功能不全合并糖尿病改变。同时利用代谢组学平台，成功构建了大鼠血清（R2X=53.5%,Q2=6.2%）及心肌组织（R2X=40.4%,Q2=8.9%）的主成分分析及血清（R2X=44.7%,R2Y=73.2%,Q2=36.3%）和组织（R2X=35.1%,R2Y=32.5%,Q2=13.3%）的正交偏最小二乘代谢轮廓分析模型，该模型能够很好地区分正常组、糖尿病组、心功能不全组、心功能不全合并糖尿病组。最终从血清中鉴定出30个差异性特征代谢物，包括溶血性磷脂酰I 天津医科大学硕士学位论文胆碱类（LPC）、溶血性磷脂酸类(LPA)、胆汁酸类、鞘磷脂类等，从心肌组织中鉴定出10个特征代谢物，包括溶血性磷脂酰胆碱类、溶血性磷脂酸类等，经通路分析，血清代谢中鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、戊糖与葡糖醛酸转化代谢路径影响权重较大，为主要代谢通路，而心肌组织代谢中甘油磷脂代谢为主要代谢通路。结论采用腹主动脉缩窄2个月后腹腔单次注射45mg/kg链脲佐菌素的方法诱导心功能不全合并糖尿病动物模型，方法简便可靠，稳定性高。在血清代谢中，心功能不全合并糖尿病组大鼠肾上腺、胆酸类、溶血磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酸类、棕榈酸、前列腺素类、鞘胺醇类、肉碱类等物质含量较正常组明显升高，而D-葡萄糖含量明显降低，差异具有统计学意义（p<0.01）。在组织代谢中，溶血磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酸类、二氢尿嘧啶等含量较正常组降低，肌醇含量较正常组升高，差异具有统计学意义（p<0.01）。然而，溶血磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酸类在心功能不全合并糖尿病大鼠血清和心肌组织代谢中均有涉及，但含量异同，我们推测大量溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸的来源并非心肌本身，而是由其它器官或组织远距离产生，通过血液循环，最终靶向作用于心肌组织。最终我们通过metaboanalist路径分析发现，甘油磷脂代谢、鞘磷脂代谢、葡糖醛酸代谢在心功能不全合并糖尿病的发生发展中发挥重要作用（pathwayimpact>0.20），其中甘油磷脂代谢在血清和心肌组织中均为主要路径，机制主要涉及机体氧化应激、线粒体及细胞膜破坏、能量代谢转移、胰岛素抵抗等多领域。关键词：心功能不全;糖尿病;模型;代谢组学;血清;心肌组织;液相色谱;质谱II 天津医科大学硕士学位论文AbstractObjectiveInordertomeettheclinicaldiagnosis,interventionandtreatmentneedsofrelateddiseases,weestablishedaratmodelofcardiacinsufficiencycomplicatedwithdiabetesmellitusfirstly,thenusetheUPLC-MSplatformtoanalyzethemetabolicprofilesoftheratsserumandmyocardialtissue,thecharacteristicendogenousmetaboliteswereselectedandthentherelatedmetabolicpathwaysandpathologicalmechanismwerediscussed.Methods70maleSpecificPathogenFree(SPF)ratswererandomlydividedintofourgroups:Normal,DM,AACandAAC+DMgroup.First,ratsofDMgroupwererandomlydividedintofivesubgroups:DM1~5andtreatedwithdifferentdosesofSTZrespectively:40,45,50,55,60mg/kg.ThenestablishthemodelofcardiacinsufficiencywithabdominalaorticconstrictioninAACandAAC+DMgroup.Aftertwomonthsofconstriction,thesamemethodslikeDMgroupwereusedinAAC+DMgroup.Observingtherats’dynamicchangesofgeneralconditionandweightchangeduringtheprocessofexperimentandmonitoringtherandombloodglucoselevelsof72hand4weeksafterSTZinjection,evaluatetherats’echocardiographandcardiacpathologychangesafter1monthofSTZinjection.Thencollectedserumandmyocardialtissuesamplesofratsineachgroup,theprincipalcomponentanalysis(PCA)andorthogonalpartialleastsquaresdiscriminateanalysis(OPLS-DA)modelwereconstructed,variableimportanceinprojection(VIP)andVIPconfidencewereusedtoselectpotentialions.Non-parametrictestbySPSS17.0(SPSS，USA)wereusedtoexcludevariableswithp>0.05fromtheseselectedpotentialmetaboliteions,theionswereidentified,thenanalysethetrendandmetabolicpathwaychangesofdifferentmetabolites,anddiscusseditspotentialclinicalvalue.ResultsComparingdifferentdoses,themodelwasmorestablewhenSTZis45mg/kg,andtherats′bloodglucoselevel,echocardiographicfindingsandmyocardialtissuemicroscopicmorphologywerechangedsignificantlywhichinlinewiththechangesofcardiacdysfunctionanddiabetesmellitus.TheOPLS-DAmodelofratserum（R2X=53.5%,Q2=6.2%/R2X=44.7%,R2Y=73.2%,Q2=36.3%）andcardiactissue（R2X=40.4%,Q2=8.9%/R2X=35.1%,R2Y=32.5%,Q2=13.3%）wassuccessfullyconstructedwhichisgoodIII 天津医科大学硕士学位论文enoughtoseparatedifferentststusofdisease.Finally,weidentified30characteristicmetabolitesinserum,includingLPC,LPA,bileacids,sphingomyelin,etcandweidentified10characteristicmetabolitesinmyocardialtissue,includingLPC,LPA,dihydrouracil,andsoon.Throughthepathwayanalisisofserum,wefindthatglycerolphospholipidmetabolism,sphingomyelinmetabolism,glucuronicacidmetabolicpathwaysarethemainpathwaysbutinthemyocardialtissue,themainmetabolicpathwayisglycerolphospholipidmetabolism.ConclusionEstablishingtherat’smodelwiththeabovemethodissimple,reliableandwithhighstability.Atthesametime,throughtheanalysisoftherat’sserumandtissuemetabolicprofile,wearefortunatetofindmanycharacteristicmetabolitescloselyrelatedtotheoccurrenceanddevelopmentofthediease.ComparewithNormalgroup,thesecharacteristicserummetabolitessuchasAdrenicacid,cholicacid,LPC,LPA,palmiticacid,prostaglandins,sphingosine,carnitinewassignificantlyhigherinAAC+DMgroup,butD-glucosehasadeclinewhichshowedasignificantstatisticaldifference(p<0.05).Inmetabolitesofmyocardialtissue,wefoundthatthelevelofLPC,LPA,dihydrouracilwerelowerexcptGalactinolinAAC+DMgroupthanNormalgroup,whichalsoshowedsignificantstatisticaldifference(p<0.05).AlthoughtheLPCandLPAarebothinvolvedinserumandmyocardialtissuemetabolism,theyshoweddifferentcontentlevels,wespeculatethattheLPCandLPAwerenotproducedbymyocardialtissuebutotherorgansortissuewhichplaysabiologicalroleincardiactissuethroughthebloodcirculation.Throughthemetaboanalist,wefindthatglycerolphospholipidmetabolism,sphingomyelinmetabolism,glucuronicacidmetabolicpathwaysplaysaimportantroleinthestatusofcardiacinsufficiencycomplicatedwithdiabetesmellitus.Amongthem,glycerolphospholipidmetabolismisthemainmetabolicpathwayswhichappearedinserumandmyocardialtissuesimultaneouslyandinvolvedavarietyofmechanisms,includingoxidativestress,membranedisruption,shiftofenergymetabolism,insulinresistanceandsoon.Keywords：Cardiacinsufficiency;Diabetesmellitus;Models;Metabolicprofiling;serum;Cardiactissue;Chromatography;MassspectrumIV 天津医科大学硕士学位论文目录中文摘要……………………………………………………………………………ⅠAbstract……………………………………………………………………………Ⅱ缩略语/符号说明…………………………………………………………………Ⅴ前言…………………………………………………………………………………1研究现状、成果…………………………………………………………………1研究目的、方法…………………………………………………………………5一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立…………………………………91.1对象和方法…………………………………………………………………91.1.1动物和试剂……………………………………………………………91.1.2仪器和设备……………………………………………………………101.1.3动物分组………………………………………………………………101.1.4模型构建………………………………………………………………101.1.5糖尿病成模判断标准…………………………………………………111.1.6心脏超声检查…………………………………………………………121.1.7心肌组织病理观察……………………………………………………121.1.8统计分析………………………………………………………………121.2结果…………………………………………………………………………121.2.1大鼠体质量、饮水饮食变化及一般状态观察………………………121.2.2造模前后大鼠血糖水平变化…………………………………………131.2.3大鼠超声心动图检查…………………………………………………141.2.4大鼠心肌组织不同切面病理改变……………………………………151.3讨论…………………………………………………………………………171.3.1小切口腹主动脉缩窄构建心功能不全模型…………………………171.3.2糖尿病大鼠造模机制分析……………………………………………181.3.3链脲佐菌素用药剂量探索……………………………………………191.3.4模型成功率及稳定性观察与分析……………………………………201.4小结…………………………………………………………………………21二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究………………………………222.1对象和方法…………………………………………………………………22V 天津医科大学硕士学位论文2.1.1动物及分组……………………………………………………………222.1.2主要试剂………………………………………………………………222.1.3仪器和设备……………………………………………………………232.1.4样本收集及预处理……………………………………………………232.1.5仪器参数设定…………………………………………………………252.1.6样本分析及质控………………………………………………………252.1.7数据前处理……………………………………………………………252.1.8统计分析………………………………………………………………262.1.9物质鉴定………………………………………………………………262.2结果…………………………………………………………………………262.2.1血清及组织样本总离子流图…………………………………………262.2.2代谢轮廓对不同疾病的区分能力……………………………………292.2.3潜在标志物的筛选与鉴定……………………………………………322.2.4代谢序列路径富集分析………………………………………………332.2.5差异性代谢物组间含量比较…………………………………………352.2.6代谢路径影响权重分析………………………………………………362.2.7代谢物来源富集分析…………………………………………………382.3讨论…………………………………………………………………………392.3.1代谢组学概念及标本选择……………………………………………392.3.2心功能不全合并糖尿病大鼠血清及组织代谢………………………402.3.3物质相关代谢通路及机制分析………………………………………412.4小结…………………………………………………………………………48结论…………………………………………………………………………………50参考文献……………………………………………………………………………51发表论文和参加科研情况说明……………………………………………………59综述…………………………………………………………………………………61代谢组学在心血管疾病及糖尿病研究中的应用………………………………61综述参考文献……………………………………………………………………70致谢…………………………………………………………………………………74个人简历……………………………………………………………………………75VI 天津医科大学硕士学位论文缩略语/符号说明缩略语全称中文STZStreptozotocin链脲佐菌素AACConstrictionofabdominalaorta腹主动脉缩窄HRHeartrate心率EFEjectionfraction射血分数FSShorteningfraction短轴缩短率LV-massLeftventricular-mass左室质量IVSDDepthofinterventricularseptumofdiatasis舒张末期室间隔厚度LVdLeftventricularenddiastolicdiameter左室舒张末期内径LVsLeftventricularendsystolicdiameter左室收缩末期内径LVPWTLeftventricularposteriorwallthickness舒张末期左室后壁厚度UPLC-MSUltra-performanceliquid超高效液相色谱与质谱chromatography-massspectrometry联用仪RTRetentiontime保留时间PCAPrinciplecomponentanalysis主成分分析OPLS-DAOrthogonalpartialleast正交偏最小二乘判Square-discriminationanalysis别分析VIPVariableimportanceinprojection变量投影重要性TICTotalionchromatography总离子流图QCQualitycontrol质量控制LPCLysophosphatidylcholine溶血磷脂酰胆碱LPALypalmiticacid溶血磷脂酸MESAMetabolitesetenrichmentanalysis代谢序列富集分析VII 天津医科大学硕士学位论文前言研究现状、成果心血管疾病，又称为循环系统疾病，近年来发病率及病死率逐年增高，且趋向于年轻化，在国内40岁以上人群的死亡原因中，主要因素就是心、脑血管疾病。据不完全统计，全世界每年有高达1500万人死于心脑血管疾病。心力衰竭（heartfailure，HF），作为心血管疾病的最终归宿，是心功能不全的失代偿期表现，研究表明它并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的一个终末阶段。由于医学知识的局限，最早对于心衰的关注点仅仅局限在循环系统，从而治疗方面形成常规的药物“强心利尿扩血管”的模式，直至后来研究者发现心衰患者常常伴有“肾素-血管紧张素-醛固酮系统”等激素水平的变化，才逐渐把它向代谢性疾病靠拢，治疗也逐渐转为以神经内分泌抑制剂为主的长期的、修复性的策略，最终目的是改变衰竭心脏的生物学性质。作为各种心血管疾病的终末阶段—心衰，它的高发病率，高死亡率严重影响着患者的生活质量，同时心血管疾病发病原因不确定，发病过程漫长，发病机制难以确切了解，给疾病的预防和治疗带来更多困难。因此，心血管疾病发病的病理生理过程以及分子机制、药物选择与治疗以及预防等方面一直是近来临床及实验室研究的热点。继肿瘤和心血管疾病之后，糖尿病（diabetesmellitus，DM）作为一组以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病，是危害全人类健康的第三大杀手[1]。高血糖则是由于机体胰腺遭到破坏，胰岛素分泌缺乏或其生物作用减弱、受损，或靶器官胰岛素抵抗等原因所引起。由于以上种种原因造成患者长期存在的高血糖状态，容易导致机体各种组织，包括心脏、血管等的慢性损害，以至于功能障碍。据国际糖尿病联盟（IDF）统计，截止到2007年，全球糖尿病患者约为2.5亿人左右，预计到2025年，全球范围内将有3.8亿人将会遭受糖尿病的困扰[2]。同时，据不完全统计，中国每年由于糖尿病并发症导致死亡的人数大概有130万，居于世界首位[3,4]。而且，随着国家人口老龄化不断加重和居民生活方式及质量的进一步提高与改善，我国的糖尿病患病率继续呈现逐年上升趋势。据国家卫生部调查显示，我国每天新增糖尿病患者约3000例，这样算来，每年约增加120万例糖尿病患者，由此所造成的糖尿病直接医疗支出几乎接近1730多亿元。分析其中原因，我们不难发现，一来由于糖尿病发病隐匿，初期无明显1 天津医科大学硕士学位论文症状，潜伏期很长，且病情进行性发展不可逆转，因此大部分糖尿病患者未能得到及时诊治，一旦发现机体异常，前往医院诊治，往往已经错过了糖尿病最佳干预时期。其次，中国大多数医院门诊仅仅将患者空腹血糖值是否正常作为糖尿病筛选指标，缺乏完善的糖耐量筛查体系。中国心脏病研究调查小组多年前就已经发现：在冠心病急诊患者中，仅将患者空腹血糖值是否正常作为糖尿病的初步筛选指标，将导致80.5％的糖尿病患者被漏诊[5,6]，而目前大多数医院门急诊系统所能做到的也仅仅是空腹和随机血糖的化验，很少能够做到口服葡萄糖耐量检测。再者，患者血糖控制欠佳，引起后续一系列并发症的发生，直接造成机体的进一步损伤和医疗费用的大幅度支出。因此对于糖尿病进行早期临床筛查、早期诊断和早期治疗显得尤为重要，这就迫切需要我们临床工作者或研究者做出更多的努力。作为一名临床医生，给我们印象最深的是：心血管疾病与糖尿病是一组密切相关的疾病，对于大多数糖尿病患者来说，心血管疾病发生将会直接导致其者生存质量的降低以及预期寿命的减少，而糖尿病患者机体本身所特有的物质代谢紊乱、高糖、高脂、高血压、高血粘度等造成血管、心肌受损，罹患缺血性心肌病、血栓性疾病等风险明显增高。欧洲糖尿病研究协会（EASD）多年前就曾指出，患者2-DM发生时就已经存在一级心衰。众所周知，老年糖尿病患者最主要的转归就是初期心肌受损，最终发生心力衰竭。因此，有人就这样指出：“糖尿病合并心衰患者的最终5年生存率与恶性肿瘤生存率相仿”，其潜在的危险性不言而喻。有研究显示糖尿病患者心力衰竭发生率约为14.1%[7]，心衰患者糖尿病发病率更是高于普通人群[8]，对于死亡率而言，心衰合并糖尿病患者明显高出非糖尿病患者4～8倍，所以对于大多数老年患者而言，心衰和糖尿病就是他们最终的归宿，二者始终形影不离。我们知道，糖耐量异常或着说糖尿病是心血管事件的独立危险因素，因此有人就曾指出，血清生化测定中，糖化血红蛋白（HbA1c）的含量每升高1%，患者心衰发生危险度就可增加8%～15%，这样的结果可能需要进一步验证，但它确实提醒我们高血糖增加了机体心功能恶化的风险。随着2013年SAVORTIMI53试验结果在欧洲心脏病学会年会上发布，心衰和糖尿病这两个原本独立的问题再次组成了一个整体，成为科研和临床治疗中密切关注的焦点。从代谢的角度来说，心功能不全是由机体于各种神经-体液因素所致的初始心肌损伤，从而引起后续的心肌超微结构和舒缩功能的变化，进而导致心脏泵2 天津医科大学硕士学位论文血功能低下，最终发生心力衰竭，这个过程通常经历一个心肌肥厚、心脏重塑、心功能从代偿到失代偿的慢性代谢演变。糖尿病作为冠心病的等危症，本身就作为一种高代谢性疾病。而代谢是生物体内在微观层面所发生的一切用于维持机体生命特征的一系列有规则的化学反应，实际上，它不是一个独立的系统，正如心衰与糖尿病的发生，其间必然存在一定的联系，相互促进相互发展，其必然趋势是导致疾病本身的进一步恶化。代谢组学，作为一门新起之秀，它的最初概念来源于代谢组，指的是某一生物机体或细胞在一特定病理生理时间内产生的全部低分子量代谢产物。从某种程度上讲，它继承了传统基因组学、蛋白质组学、转录组学的研究思想，能够对生物体特定时间内所有小分子内源性代谢产物进行定量和定性分析，并且能够寻找差异性代谢物与疾病病理生理改变之间的相对关系。代谢组学的概念最初于上世纪70年代提出[9]：其定义为对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定。1983年，荷兰科学家在国际上首先利用代谢组学中质谱方法对尿中代谢指纹进行了初步研究，开启了指纹图谱的先河。20世纪90年代初,Sauter等科学家首先将代谢组的方法引入植物系统，进行相应的诊断研究。后来Nicholson等人提出metabonomics的概念[10,11]，并在疾病初步机制分析、诊断、药物治疗等方面做了大量的研究工作。作为新兴学科，它与传统基因组学、蛋白质组学、转录组学相比，有着自己独特的优势[12]：①放大效应，基因以及蛋白的生物表达通常是微小水平改变，代谢组学则使得这种微小的变化得以有效放大，从而有利于代谢物的检测；②简化实验，无需建立像基因组及蛋白质组那样的全基因组以及表达序列的特征化数据库。代谢组学可以直接利用标准品比对以及二级质谱扫描结合相应质荷比即可初步得出结果，从而使得研究步骤更加简化；③代谢物种类少，有利于分析。特征代谢物的种类要远远小于基因和蛋白的数目。众所周知，一个个体基因至少有几万甚至几十万个，而目前代谢产物最多不超过数千个；④代谢产物具有通用性、借鉴性，早期的植物代谢同样可以应用到人类；⑤更高的宏观层面分析，基因组学是从基因层面探寻生命的活动，蛋白质组学则从蛋白层面追寻生命的根源，而我们知道，实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如能量传递，细胞信号释放（cellsignaling）、传递，细胞间通信等都是受代谢物调控的，因此，代谢组学涉及到更高的层次。众多代谢研究显示，心血管疾病biomarker的发现和筛选对于心血管疾病的发生发展、机制分析、诊断、治疗、预后发挥着十分重要的作用，目前部分已3 天津医科大学硕士学位论文经成功地应用于临床心血管疾病的早期诊断及晚期心血管不良事件的预测，如心肌酶、BNP、D-dimer等。早在20世纪初，Antti[13]等人就开展了心血管疾病代谢组学方面的研究，他们提出，代谢组学方法不但能够作为技术手段对冠心病作出早期诊断，而且还能通过代谢轮廓对冠心病不同冠脉病变程度进行分类，他们找到的biomarker主要为脂蛋白类物质。英国皇家医学院2011年的一项研究同样显示，利用患者血清代谢组学的生物指纹图谱能够预测患者心脏病变的危险程度，这项研究在“组学”生物-指纹图谱监测患者病情进展、预测危险程度方面，开辟了新领域。实际上，代谢组学技术除了可发现疾病状态下代谢物的特征性改变，从而发现biomarker，用于疾病早期诊断外，还可以实现对特征代谢物轮廓的监测和靶向分析，从而从多种代谢途径（通路）构建机体代谢通路与病理生理改变以及药物靶向治疗之间的内在联系，一来可以明确机体疾病发生的具体分子机制，二来从代谢途径评价这些药物对心血管疾病的作用，包括治疗效果、作用及达峰时间、剂量效应、不良反应等。Kaddurah-Daouk[14]等为了评价他汀类降脂药具体疗效在不同个体间的差异，曾就应用代谢组学分析血浆中的脂质代谢，结果发现基础磷脂代谢产物及胆固醇脂水平与治疗后患者血浆中LDL-C水平明显相关，为高血脂患者的个体化治疗提供了借鉴，同时为2011年欧洲血脂异常管理指南中提出的降脂目标：“1850”提供了有利证据，即：低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降至1.8mmol/L（70mg/dl）以下，或在原有基线上降低50%以上，而不是一味追求参考标准。在糖尿病研究领域，一方面，代谢组学研究技术则可以用来对糖尿病疾病本身发生发展进行代谢分析，从而筛选出标志物，为疾病早期诊断和干预作出参考。Wang[15]等曾就借助代谢组学方法，将糖尿病患者与正常人群作对比，发现糖尿病患者机体脂类物质代谢发生明显改变，指出机体糖尿病的发生与脂质代谢紊乱存在一定必然联系。Zhao[16]等应用代谢组学中指纹图谱技术对早期糖尿病患者血清进行初步轮廓分析，证实了血清中胆汁酸（CA）、尿酸(UA)、脂肪酸(FA)等物质的含量在糖尿病早期临床症状出现前就已经发生了改变，因此为糖尿病早期诊断与干预提供了可能。另一方面，利用代谢组学分析筛选出的差异性特征代谢物质，进一步去联系、分析其所参与的代谢通路及其中间环节，构建药物作用靶标与机体代谢通路及病理生理变化之间的联系，可用于评估降糖药物的代谢与疗效。Cai[17]等研究者曾将代谢组学手段应用于降糖药Mitiglinide治疗糖尿病小鼠当中，研究结果发现实验组小鼠接受药物治疗后血清中枸橼酸4 天津医科大学硕士学位论文盐、肌酐、胆汁酸、苯丙氨酸等物质水平发生明显改变，从而进一步对促泌剂的降糖机制作出了深层次解释。Huo[18]等研究人员利用类似方法发现二甲双胍治疗糖尿病后，患者血清代谢同样发生了明显改变。那么，我们是否可以利用这些变化的血清代谢物去评估机体对药物的敏感度以及疗效呢？在这方面，就曾有学者在进行药物治疗糖尿病的疗效代谢组学研究的同时，对其临床生化指标进行监测，结果发现，糖尿病患者在服用降糖药物后，临床症状出现前，患者尿液中的代谢组分已经发生明显改变。以上众多研究表明，代谢组学技术不仅可以广泛应用于糖尿病早期预防及诊断，还可用于糖尿病治疗药物疗效快速监测和评价。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生发展机制，推动医学发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上存在一定的局限性而且在方法以及伦理道德方面也倍受约束。而借助动物模型进行间接研究，则可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或者不易剔除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病相比较，进而深入地认识人类疾病的发生发展规律，同时进行适当的防治。目前国内外单纯疾病模型的构建方法层出不穷，如心衰、糖尿病、高血压、肺动脉高压模型等，但是混合疾病模型构建不多，尤其是心功能不全合并糖尿病模型构建，更是微乎其微。这对于疾病研究来说，的确是个很大的缺陷。因此本实验希望能够成功构建心功能不全合并糖尿病大鼠模型，后期期望通过对此模型进行血清学及组织学代谢组学研究，从代谢轮廓角度诠释不同疾病状态下机体内小分子内源性物质的改变及其变化趋势，分析这一趋势中所蕴含的内源性代谢信息，筛选出影响代谢的关键离子找到显著差异的特征代谢物质，进而联系、分析这些物质所参与的代谢通路及其中间环节，以进一步于全面深入的了解该疾病发生发展机制，为临床疾病诊断、早期干预及晚期治疗开辟新的思路。研究目的、方法目的1、通过微创外科手术方法（小切口腹主动脉缩窄）构建Wistar大鼠心功能不全模型。2、在构建心功能不全大鼠模型的基础上，通过腹腔单次注射链脲佐菌素选择5 天津医科大学硕士学位论文性破坏大鼠胰腺细胞，构建心功能不全合并糖尿病大鼠模型，并探索造模所需STZ最佳剂量。3、探讨心功能不全合并糖尿病大鼠模型构建顺序、成模情况及其成模后稳定性。4、采集正常组、糖尿病组、心功能不全组、心功能不全合并糖尿病组大鼠血清及心肌组织，通过代谢组学平台，分析其代谢轮廓差异，探讨小分子内源性代谢差异物质所参与的代谢通道以及与混合疾病的发生发展关系，为临床疾病的诊治及药物治疗提供新的思路。方法1.动物模型构建本研究采用传统腹主动脉缩窄[19]和链脲佐菌素[20]破坏胰岛细胞的方法构建动物模型，实验组采用7号注射针头（去尖），缩窄时紧贴于腹主动脉外壁，3-0丝线结扎后，撤出针头即完成对目标缩窄程度的统一，缩窄后腹主动脉外径减少约40%~50%[21]，因此缩窄口近心端血管阻力增加，从而造成心脏后负荷即压力负荷增大，增大的后负荷会逐渐诱发左心室肥厚等心肌代偿性改变，轻则影响心脏正常舒缩功能，造成心功能不全，重则使得心肌向失代偿改变，最终形成心力衰竭。链脲佐菌素（STZ）属于一种氨基葡萄糖-亚硝基脲类物质，是一种DNA烷基化化学试剂，通过GLUT2葡萄糖转运蛋白（GLUT2glucosetrasportprotein）进入胰岛β-细胞，进行选择性破坏，从而减少胰岛素释放的来源，诱发糖尿病的产生。因此，实验团队进一步考虑利用STZ在心功能不全大鼠的基础上构建糖尿病模型，并探索成模最适药物剂量，在此过程中应用超高分辨率小动物超声对大鼠心率（HR）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、左室质量（LV-mass）心脏舒张末期室间隔厚度（IVSD）、左室舒张末期内径（LVd）和收缩末期内径（LVs）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWD）、及二尖瓣血流频谱E/A等进行测定，每个指标取3个连续心动周期测量的均值，收集大鼠心功能不全证据。同时留取成模大鼠心脏，生理盐水冲洗，10%中性福尔马林固定心肌左室组织，标本石蜡包埋，切片，常规HE染色。光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化，通过病理诊断证实大鼠心功能不全改变。另外，采取以随机血糖≥16.7mmol/L[22,23]作为糖尿病大鼠成模标准，同时结合观察注射STZ后平均进食量、进水量、活动量、体毛松散程度、精神萎靡情况、垫料湿度等，并定期监测血糖和体质量。6 天津医科大学硕士学位论文2．代谢组学研究收集各组大鼠血清及心肌组织样本，并对其进行样本前处理。依据代谢组学研究内容及方法建立如下技术路线：首先对各组大鼠血清及心肌组织样本进行上机前预处理，然后利用UPLC-MS代谢组学平台对各组样本进行检测，对初步得到的数据进行前处理（MZmine2.0软件），再将处理所得次级数据导入到SIMCA-P+12.0.1.0(瑞典Umetrics公司)进行分析处理。通过SIMCA-P+12.0.1.0的模式识别方法构建正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型，根据VIP值（及VIP置信区间）初步筛选出特征性代谢离子，然后对选出的特征代谢物进行独立样本非参数检验（SPSS17.0,USA），并排除P值大于0.05的变量，进而保留有潜在差异的代谢离子，并根据标准品比对和二级质谱扫描等方法进行最终物质鉴定。对比不同组别之间以及血清及心肌组织中这些特征代谢物质的差异及含量变化，进一步分析它们在不同疾病状态下的量比关系，同时结合它们所参与的代谢通路，对疾病发生发展的分子机制作出初步推断，为临床早期干预、诊断及后期治疗作出指导意义。7 天津医科大学硕士学位论文代谢组学研究技术路线正常组糖尿病组心功能不全组心功能不全合并糖尿病组样本前处理（血清及心肌组织）样本分析及质控原始数据MZmine2.0数据前处理PCA&OPLS-DA模型VIP值&VIP置信区间差异性离子筛选非参数检验特征代谢物及其鉴定8 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立选用2月龄健康清洁级Wistar大鼠，采用腹主动脉缩窄2个月后腹腔单次注射45mg/kgSTZ的方法诱导构建心功能不全合并糖尿病动物模型，方法简便可靠，模型稳定性高，为后期临床和实验室疾病机制、药物治疗的研究奠定了动物模型基础。1.1对象和方法1.1.1动物和试剂健康清洁级雄性Wistar大鼠70只，2月龄，体质量（190±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有大鼠饲养于天津市第三中心医院动物实验中心，室温20~23℃，相对湿度55%~70%，自由饮食，分笼饲养。所有操作程序严格遵守国家卫生研究院（NIH）的实验动物饲养和使用手册。试剂生产厂商链脲佐菌素（STZ）美国Sigma柠檬酸、柠檬酸钠国产分析纯试剂，河南戊巴比妥钠美国Sigma0.9%氯化钠注射液中国大冢安尔碘溶液中国大冢脱毛膏上海诗碧液氮天津百思达9 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立1.1.2仪器和设备实验仪器和设备生产厂商手术器械（手术刀柄、手术刀片、综合组织剪、显微组织剪、微型撑开器、蚊式钳、自备动脉夹、精细镊子、7号注射器针头、1ml/2ml注射器）SL-32L高压灭菌锅日本ALPALl04电子天平中国梅特托利多手术放大镜、立式手术灯南京金嘉和单级电凝器武汉春光灭菌手术单、纱布、棉球自备4-0丝线、4-0外科缝线、5-12半弧缝针爱惜康血糖仪、血糖试纸盒江苏鱼跃0.5ml、1.5mlEP管中国大龙200μL移液器中国大龙GIQ400CL彩色超声心动仪GEmedicalsystem，美国-80℃低温冷冻冰箱(702型)Thermo1.1.3动物分组70只雄性Wistar大鼠按随机数表法分为4组：正常组（Normal）10只，糖尿病组（DM）25只，心功能不全组（AAC）10只，心功能不全合并糖尿病组（AAC+DM）25只。1.1.4模型构建DM（糖尿病）组建模：2月龄健康清洁级雄性Wistar大鼠，适应性喂养1周，然后将此组动物按随机数字表法分为5个小组，标号为DM1、DM2、DM3、DM4、DM5，每小组5只，造模前，大鼠禁食17h(不禁水)，采用刺破尾静脉取微量血的方法，测大鼠空腹尾静脉微量血糖。新鲜配制柠檬酸缓冲液(用柠檬酸和柠檬酸三钠按1：1.32配制，调节ph=4.2-4.5)，4～8℃冷藏保存。临用前与STZ配制成STZ溶液（10mg/m1），操作前安尔碘腹腔局部消毒3遍，再进行单10 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立次腹腔注射STZ建立糖尿病模型，STZ剂量分别为40、45、50、55、60mg/kg。注射STZ72h后测定大鼠尾静脉随机血糖，采血后红霉素处理伤口，预防感染，造模成功后间隔2天换垫料1次。AAC（心功能不全）组建模：参照Ma[19]等的方法，大鼠适应性喂养1周，术前禁食水12h，3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，待动物麻醉稳定、角膜发射消失后，固定大鼠四肢于手术台上、用脱毛膏在腹部中间进行常规备皮，暴露手术区域，安尔碘消毒3遍，术者双手消毒，戴无菌手套，铺单，助手送无菌器械上台。沿腹部正中线作1.5cm左右纵行切口，分层打开腹腔，确认无肠管受压后，用撑开器撑开腹部切口，同时用纱布条推开局部肠管，显现腹后壁脂肪组织，暴露手术视野。在左肾上暴露腹主动脉并在双肾动脉上方钝性分离腹主动脉，注意避开下腔静脉，避免破裂大出血。然后观察游离的腹主动脉正常直径，狗头夹夹闭腹主动脉，缺血预适应3次，时间分别为15、30、60s，之后将7号注射针头去尖后平行置于动脉外壁，用4号手术丝线将二者一起扎紧后将针头小心移去，覆盖肠管，1min后观察腹主动脉管腔环形缩窄程度，脏器回位、确认肠管无扭曲、成角、无活动性出血后逐层关腹，用2mL注射器抽气并注入4万单位抗生素，术后复温，禁食水24h后常规饲养。AAC+DM（心功能不全合并糖尿病）组建模：首先参照上述腹主动脉缩窄方法，构建心功能不全动物模型，建模2个月后，将此组动物按随机数字表法分为5个亚组，标号为AAC+DM1、AAC+DM2、AAC+DM3、AAC+DM4、AAC+DM5，每小组5只，然后进行单次腹腔注射STZ建立糖尿病模型，STZ剂量分别为40、45、50、55、60mg/kg。注射STZ72h后测定大鼠尾静脉随机血糖，采血后红霉素处理伤口，预防感染，造模成功后间隔2天换垫料1次。1.1.5糖尿病成模判断标准STZ成功诱导72小时后，各组大鼠尾静脉穿刺，棉签擦拭去第一滴血液，利用血糖仪检测大鼠随机血糖水平。以随机血糖≥16.7mmol/L[22,23]作为糖尿病大鼠成模标准，同时结合观察注射STZ后大鼠平均进食量、进水量、活动量、体11 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立毛松散程度、精神萎靡情况、垫料湿度等，并定期监测血糖和体质量，作为辅助判断指标。1.1.6心脏超声检查心功能不全诱导3个月后（DM组于STZ诱导后1个月）对大鼠行小动物超声心动图检查，实验中超声测定大鼠心率（HR）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、左室质量（LV-mass）心脏舒张末期室间隔厚度（IVSD）、左室舒张末期内径（LVd）和收缩末期内径（LVs）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWD）、及二尖瓣血流频谱E/A等，每个指标取3个连续心动周期测量的均值。具体操作如下：大鼠称重，按照公斤体重抽取3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，待动物麻醉稳定、角膜发射消失后，固定大鼠四肢于超声操作台上，用脱毛膏在胸部进行常规备皮，然后用酒精擦拭多余的脱毛膏，干燥后将超声耦合剂均匀涂在动物前胸，采用超高分辨率超声探头采集超声相关数据，最后通过系统完成相关数据分析，得出最终数据。1.1.7心肌组织病理观察腹主动脉缩窄后3个月，开胸暴露大鼠心脏，经右心室抽取血液标本2ml后迅速摘取心脏，冰生理盐水冲洗，剪除非心肌组织及左右心房，用眼科剪沿室间隔剪取左右心室组织，再次冰生理盐水冲洗，取少量左室心肌组织，10%中性福尔马林固定，标本石蜡包埋，切片，常规HE染色，中性树胶封片。光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化，其余组织及血浆液氮封存。1.1.8统计分析采用SPSS17.0软件分析、处理数据。计量资料用均数±标准差（xs）表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。1.2结果1.2.1大鼠体质量、饮水饮食变化及一般状态观察各组大鼠体质量变化趋势如图1示。4组大鼠初始体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)，缩窄1个月时，由于受手术创伤的影响，AAC、AAC+DM组体12 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立质量较正常组下降，差异有统计学意义（P<0.01），1个月时，DM组由于注射STZ，体质量较Normal、AAC、AAC+DM组均降低，差异有统计学意义（P<0.05），此时DM组大鼠作成模指标验证后处死，留取血清、心肌组织及病理。缩窄2个月时Normal、AAC、AAC+DM组体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。AAC+DM组大鼠注射STZ后（3个月时），大鼠体质量较Normal组、AAC组明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。建模过程中，STZ造模成功大鼠表现出糖尿病典型症状：多饮、多食、活动量减少，体毛松散、潮湿，精神萎靡，垫料呈酸臭味。450400350300Normal组250DM组200AAC组体质量（g）150AAC+DM组1005000123时间（月）图1各组大鼠不同时期体质量变化（g,xs）1.2.2造模前后大鼠血糖水平变化各组大鼠血糖变化如表1所示。各组大鼠基础血糖水平差异无统计学意义（P>0.05），腹主动脉缩窄后2个月，AAC组较Normal组大鼠血糖无明显改变。STZ注射后72h，DM、AAC+DM组大鼠血糖逐步趋向稳定，大部分大鼠随机血糖水平≥16.7mmol/L，较Normal、AAC组升高（P<0.05），且持续至第4周，未见转复。由于DM1、DM2、AAC+DM1、AAC+DM5亚组大鼠仅少量成模，因此，最终对其数据未进行统计学处理。13 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立表1各组大鼠造模前后随机血糖变化（mmol/L,xs）组别N基础血糖72h血糖4周血糖Normal组106.71±0.876.40±0.396.24±0.35DM1组56.60±0.42--DM2组56.46±0.46--DM3组56.70±0.4016.55±1.06ac18.2±0.00acDM4组56.34±0.3022.26±1.08ac24.98±1.26acDM5组56.46±0.4026.78±2.30ac28.63±0.95acAAC组106.59±0.456.32±0.31b6.46±0.49bAAC+DM1组56.42±0.46--AAC+DM2组56.36±0.3323.06±2.51ac22.30±0.41acAAC+DM3组56.58±0.5124.66±3.12ac27.83±0.51scAAC+DM4组56.22±0.3326.84±3.23ac29.20±1.21acAAC+DM5组56.60±0.27--F0.667149.8411188.646P0.6980.0000.000a:与Normal组比较，b:与DM组比较,c:与AAC组比较,P<0.01。1.2.3大鼠超声心动图检查腹主动脉缩窄3个月后，对各组大鼠进行超声检查，根据超声回报结果，DM组共25只，成膜8只，AAC组共10只，成模9只；AAC+DM组大鼠共25只，成模11只。Normal、DM两组间无统计学差异。AAC组LV-mass、IVSD、LVs、LVPWD均较Normal组、DM组升高（P<0.05）；AAC+DM组HR、LV-mass、IVSD、LVs、LVPWD均较Normal组、DM组升高（P<0.05），AAC、AAC+DM组E/A较Normal组、DM组下降（P<0.05），各组EF、FS、LVd的差异无统计学意义，见表2。14 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立表2大鼠心脏超声检查()组别NHR（次/min）EF(%)FS(%)LV-mass(g)Normal组10342.50±26.520.70±0.0349.91±0.940.70±0.08DM组8364.88±24.71ac0.70±0.0349.84±0.710.74±0.09AAC组9349.22±19.64b0.69±0.0350.97±0.640.83±0.06abAAC+DM组11364.00±21.54ac0.68±0.0350.12±0.660.91±0.07abcF2.1850.5470.25715.258P0.1080.6540.8560.000组别nIVSD(mm)LVs(mm)LVd(mm)LVPWD(mm)E/ANormal组101.41±0.112.27±0.194.98±0.131.43±0.061.53±0.08DM组81.43±0.052.27±0.104,93±0.121.45±0.071.52±0.05AAC组91.50±0.05ab2.46±0.09ab5.03±0.081.62±0.10ab1.39±0.05abAAC+DM组111.52±0.04ab2.42±0.11ab5.05±0.091.64±0.10ab1.38±0.05abF6.2955.2762.29016.47818.864P0.0020.040.0960.0000.000a:与Normal组比较，b:与DM组比较,c:与AAC组比较,P<0.01。1.2.4大鼠心肌组织不同切面病理改变Normal组横切及纵切镜下见心肌纤维排列整齐，心肌细胞大小、细胞核、形态无异常，无血管扩张及血管周围细胞浸润等表现。DM组镜下显示心肌细胞排列基本整齐，局部心肌细胞肥大，部分核大深染。AAC组镜下显示心肌纤维排列较前紊乱，局部心肌细胞肥大，心肌细胞间间隙增宽，间质中少量炎症细胞浸润。AAC+DM组镜下显示心肌纤维排列紊乱，血管壁外炎细胞浸润，局部心肌细胞肥大，部分核大深染，心肌细胞间间隙增宽，间质中大量炎症细胞浸润。见图2。15 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立图2.各组大鼠心肌组织不同切面HE染色（×200）16 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立1.3讨论1.3.1小切口腹主动脉缩窄构建心功能不全模型随着临床医学研究的深入以及循证医学的不断发展和人体试验伦理道德的诸方面约束，众多疾病发生、发展机制的研究在某种程度上更加依赖于动物实验。目前全球心血管疾病发病率持续高升，因此，为了满足心血管基础、药理以及临床研究的需要，通过不同手段构建的心功能不全模型也屡见不鲜，总结归纳，主要包括两大类：急性心功能不全模型和慢性心功能不全模型。急性心功能不全模型构建常采用抑制心肌收缩力的药物[24,25]，如维拉帕米、普萘洛尔、阿霉素等，但药物造模，剂量和注射速度等无法准确掌握及控制，而且药物本身对动物肝肾功能产生一定的影响，不利于后期血清学及组织分析。例如，阿霉素注射致心功能不全模型，方法简便可靠，但缺点至少有二：一来剂量、注射速度无法准确控制，二来阿霉素本身就具有心脏毒性，严重影响心肌代谢，不利于后期血清学及组织学生物检测。急性模型构建亦可采用物理方法，如结扎犬冠状动脉前降支后快速右室心内膜起搏的方法[26,27]。冠状动脉结扎或栓塞[28-31]的确可以造成急性心功能不全，但要求梗死面积够大，确实，大面积的梗死有利于急性心功能不全模型的形成，但是不利于动物存活，动物常由于心源性休克大量死亡。慢性心功能不全模型的构建常采用的方法有人工胸主动脉或腹主动脉或肺动脉缩窄[32,33]、腹主动脉-下腔静脉瘘[34,35]等。胸主动脉以及肺动脉缩窄相对来说，建模时间较短，平均1周左右，但动物循环系统容易衰竭，死亡率较高。腹主动脉-下腔静脉造瘘，方法简便，但手术危险程度高且不利于手术后期观察，同时造瘘标准不易统一。因此，本实验采用腹主动脉缩窄构建慢性心功能不全模型。手术方法相对简单，无需呼吸辅助，术后恢复良好。手术采用小切口（1.5cm左右）微创方法进行，辅以精细器械操作，没有常规的将腹腔脏器及肠管托出体外，因此大大减少腹腔感染及肠扭转的机会，同时有利于动物术后恢复。手术采用在左肾上暴露腹主动脉并在双肾动脉上方钝性分离腹主动脉，此时需要注意避开下腔静脉，因为此时腹主动脉与下腔静脉仅隔一层筋膜，很容易大出血，从而导致术后腹腔粘连，如果分离不慎，动静脉破裂出血，应立即停止手术，局部纱布压迫止血，择期干预。术中利用动脉夹夹闭腹主动脉，缺血预适应3次，时间分别为15、30、60s，这样有利于能够激发机体的应急机制，减轻随后更长时间由17 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立于下肢缺血缺氧所造成的局部损伤。术中游离出腹主动脉后需要常规复位，覆盖以肠管，1-2min后观察腹主动脉正常直径，以便选择缩窄针头以及了解缩窄效果。因为在动脉分离的过程中，过度牵拉和机械刺激，均会造成血管痉挛，口径明显小于实际，如果按照此时标准选择缩窄针头，往往造成血管80%以上缩窄，动物由于循环系统障碍、下肢血管缺血，极其容易死亡。术后注意脏器回位、确认肠管无扭曲、成角、无活动性出血后逐层关腹，局部按摩，并用2mL注射器腹腔抽气同时注入4万单位抗生素，减少术后感染机会。本实验最终通过术后3个月的超声心动图检测及病理切片证实，手术造模成功，效果满意。1.3.2糖尿病大鼠造模机制分析糖尿病是一组以高血糖为主要特征的综合性代谢性疾病。临床上常分为胰岛素依赖性糖尿病（1型糖尿病）和非胰岛素依赖型糖尿病（2型糖尿病）。无论是科研需要还是临床疾病诊疗，糖尿病动物实验模型的成功构建十分必要。总结目前，糖尿病动物模型构建主要分3大类：药物诱发性糖尿病动物模型、自发遗传性糖尿病动物模型和转基因或基因敲除糖尿病动物模型。其他常见糖尿病建模方法还有胰腺切除法构建糖尿病动物模型、高能饮食诱导构建糖尿病模型、病毒诱导构建糖尿病模型等。化学药物诱发糖尿病动物模型[36]主要是指选择性应用特定化学药物损伤胰岛β细胞导致机体胰岛素分泌缺乏而引起实验性糖尿病。这种方法构建糖尿病模型具有造模简单、造模时间短、发病率高、模型构建时间及病情统一等优点，主要选择性化学试剂有四氧嘧啶、链脲佐菌素以及肾上腺素等。自发性糖尿病动物模型[37,38]是利用自然条件下或基因突变而产生与人类糖尿病类似的表现，由于其发生率低且动物长期饲养成本高，限制了其在科研和临床中的应用和大规模普及。转基因或基因敲除糖尿病动物模型[39-42]常由于实验室硬件及实验技术条件限制以及动物成本过高等因素，很难被大多数实验者及科研机构所接受。由于链脲佐菌素对动物机体组织毒性相对较小，有利于后期血清及组织学研究，且造模容易，模型稳定，后期动物存活率高，因此本实验最终考虑采用常规化学试剂-链脲佐菌素构建Wistar大鼠糖尿病模型。就目前而言，有关链脲佐菌素选择性杀伤胰岛β细胞的特异性机制还不是十分明确，总结国内外文献，可能机制概括为以下几点[43]：（1）氧化机制介导：STZ通过诱导NO和氧自由基的形成，增强对胰岛β细胞的氧化损伤，致使胰岛素分泌减少；（2）细胞凋亡及免疫机制介导：STZ特异性破坏胰岛β细胞致使细胞凋亡的同时，凋亡细胞作为自身抗原，部分被巨噬细胞吞噬，部分由抗原呈18 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立递细胞处理，进一步放大细胞损伤效应，产生相应的细胞因子及介质，从而损伤固有胰岛细胞，减少胰岛素的分泌来源。（3）化学特性介导：链脲佐菌素实际上是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲类物质，属于一种DNA烷基化试剂，首先其对胰岛β细胞上特定DNA碱基特殊位点进行烷基化，进而作用于ADP核糖体合成酶，导致ADP-核糖基化激活，最终ATP耗尽，产生大量反应性氧簇，损伤胰岛β细胞。不同药物诱导模型的构建常采用不同的给药方式，常见的有注射给药（如皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射等）、经口给药（如口服、灌胃）、呼吸道给药、皮肤给药等。总结国内外相关文献，目前糖尿病大鼠造模常规给药途径有两种[44]，一种是腹腔注射，一种是尾静脉注射。综合分析上述两种方法，首先，经腹腔注射，优点是方法简便、易行，可操作性相对较高，缺点是腹腔注射要求STZ剂量大，成本高且对注射要求稍高，需要成功避开肠管，避免肠腔内药物注射，引起局部感染与坏死。其次，经尾静脉注射，优点在于所需STZ剂量相对于腹腔注射少，成本低，缺点是对操作者要求较高，需要成功穿刺尾静脉，方能注射，且血管炎发生率较高。综上，相比较而言，腹腔注射法易于操作和掌握，尾静脉注射有很大的技术要求和难度，一般者很难在短期内掌握。尤其需要注意的是在静脉注射STZ时还要注意控制用药的剂量和注射速度，以免动物在静脉注射STZ的过程中因药物剂量过多或注射速度过快而导致心衰死亡。国内的大多数研究实验主要还是采用腹腔注射的方法。1.3.3链脲佐菌素用药剂量探索1型或者2型传统糖尿病大鼠模型的制备与STZ给药方式及剂量密切相关。国内外文献报道不一，对于1型糖尿病的构建，常采用单次大剂量STZ注射，直接破坏胰岛β细胞，导致胰岛素分泌直接减少。国外一般采用剂量大于60mg/kg，国内常规剂量控制在50-60mg/kg左右，小剂量STZ多次注射，所得到的迟发型糖尿病动物模型则更大程度上与细胞介导的β细胞缓慢不断破坏有关，这样建立的糖尿病模型与人类IDDM更为接近[45]。大鼠高脂、高糖饲养1～2个月，再加小剂量单次腹腔STZ注射，从疾病发生发展的角度来讲，构建的糖尿病模型更加接近于2型糖尿病。而相对于相同模型的构建，国内外包括不同实验组、不同实验人员所提出的STZ剂量不尽相同，总结相关原因，可能与动物种类、实验条件、缓冲液性质、注射部位及动物耐受性不同有关[46]。而对于在心功能不全的基础上构建大鼠糖尿病模型，所需STZ剂量鲜见相关文献报道，因此本研究力求探索，实验中所用STZ剂量分别为40、45、50、55、60mg/kg。19 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立结果发现：对于大鼠单纯STZ注射糖尿病造模，通常选取55mg/kg剂量即可，而对于在心功能不全的基础上进行糖尿病造模，则所需STZ剂量较正常显著降低，仅需45mg/kg剂量即可达到造模目的。1.3.4模型成功率及稳定性观察与分析实验过程中，采用单次腹腔注射不同剂量STZ，从注射后3h开始测定实验组与对照组血糖，每周一次，持续4周，数据分析发现，未进行缩窄大鼠腹腔注射40、45mg/kgSTZ时，动态血糖未见明显变化，推测小剂量的STZ未能对大鼠胰腺进行局部破坏或者是少量的破坏同时，机体予以适时代偿。对于注射剂量为50、55、60mg/kg时，在3h和72h时大鼠空腹血糖值明显上升,与相同时间段对照组大鼠的空腹血糖值相比较差异有统计学意义(P<0.01)，但是对于剂量为50mg/kg组，随着观察时间的延长，血糖呈现下降趋势，可能因STZ剂量太少，仅破坏少量胰岛细胞，后来随着时间的延长，受损胰岛细胞功能被正常胰岛细胞代偿，使血糖值下降，恢复正常水平。相对于剂量为60mg/kg组，建模3h后大鼠血糖明显上升，72h后大鼠血糖水平部分超出血糖仪检测范围，大鼠日渐消瘦、并发症和死亡率明显升高。对于腹主动脉缩窄动物而言，在注射剂量为40mg/kg时，仅部分大鼠血糖出现升高，随着时间延长，大部分大鼠血糖呈现下降趋势，表明糖尿病建模不成功。当STZ注射剂量为45~50mg/kg时，所构建的大鼠模型成功率高，死亡率低,并发症少且后期血糖水平稳定，大鼠整体表现良好。综上，结合相关成膜率及STZ成本，推荐优先考虑STZ剂量为55mg/kg作为单独糖尿病模型构建最适剂量，45mg/kg剂量作为心功能不全合并糖尿病大鼠模型最佳实验剂量。无论哪种模型，当STZ剂量过低时，即便造模初期动物能够出现高血糖状态，但是随着机体的代偿，后期血糖水平终会恢复正常。当STZ剂量过高时，动物后期血糖一直处于高水平且无下降趋势，大鼠日渐消瘦、并发症和死亡率明显升高，考虑原因为大剂量STZ导致大鼠胰腺大量破坏，最终糖、脂以及电解质代谢发生严重紊乱，最终死亡。对于模型构建的顺序问题，预实验亦曾作出尝试，即先行构建糖尿病动物模型，然后在此模型基础上进行腹主动脉缩窄构建心功能不全模型，但是结果是：总体死亡率高。考虑主要原因是糖尿病动物，机体血糖值高，对手术耐受性差，术后易感染，并发症多等，故后续实验没有进行考虑。20 天津医科大学硕士学位论文一、心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立1.4小结1．本研究成功利用小切口腹主动脉缩窄构建心功能不全模型，为后期临床疾病发生发展机制研究及相关诊疗奠定了动物实验基础。2．实验表明，对于单纯糖尿病造模，STZ为55mg/kg时为最佳腹腔单次注射剂量，此时造模成本低且模型稳定性高。3．采用腹主动脉缩窄2个月后腹腔单次注射45mg/kgSTZ的方法诱导心功能不全合并糖尿病动物模型，方法简便可靠，稳定性高，并发症少。综上，本研究成功探索出心功能不全合并糖尿病大鼠模型构建方法，为后期实验研究奠定了基础，同时为临床疾病研究提供新方法及新思路。21 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究成功建立心功能不全合并糖尿病大鼠模型后，结合代谢组学平台，利用SIMCA-P+12.0.1.0的模式识别方法构建正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型，对其代谢轮廓进行初步分析，筛选出差异性特征代谢物，并从内源性代谢通路对混合疾病的发生发展进行分析，深层次了解心功能不全合并糖尿病发病的分子机制，为临床相关疾病的诊疗提供新的思路。2.1对象和方法2.1.1动物及分组选取前述模型构建较理想大鼠，共20只，其中正常组（Normal）4只，糖尿病组（DM）4只，心功能不全组（AAC）5只，心功能不全合并糖尿病组（AAC+DM）7只。2.1.2主要试剂试剂生产厂商超纯水Millipore，USAmilli-Q系统乙腈(HPLC纯)MerckKGaA，Germany甲酸(HPLC纯)MerckKGaA，Germany标准品：CholicacidGlycocholicacidGlycoursodeoxycholicacidSigmarAldrichCo.USADeoxycholicacidChenodeoxycholicacidsulfateLysoPC(15/16/17:0)Sphingosine22 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究2.1.3仪器和设备仪器设备生产厂商Accela超高效液相色谱系统，Thermo,USALTQOrbitrapXL质谱系统Thermo,USA匀质器(SilentcrusherM型)Heidolph,GermanyThermoHypersilGOLD色谱柱Thermo,USA恒温水箱(HAAke83)Thermo,USA-80℃低温冷冻冰箱(702型)Thermo,USA低温冰箱(BCD．256KZL)Haier恒温摇床(MAXQ．4450)Thermo,USA低温高速离心机(MultifugeX1R型)Thermo,USA振荡器(REAXcontrol)Heidolph,Germany微型漩涡混合器(QL-901型)其林贝尔,江苏超纯水系统(Mill-QII型)Milipore,USA超声波清洗器(Elma-E120H型)Elmasonic,Germany0.22μm微孔滤膜Milipore,USA2.1.4样本收集及预处理实验分析前30min从-80℃低温冷冻冰箱取出各组大鼠血清及心肌组织样本，室温下解冻。（1）对于血清标本：完全解冻后，按照血清与乙腈比为1:3的比例加入乙腈，剧烈震荡30s以充分混合，静置5min，然后4℃，10000r/min充分离心15分钟。取上清液后4℃静置5min，必要时再次4℃，10000r充分离心15分钟。将得到的上清液通过0.22μm微孔滤膜滤过，此时得到待测样品，备用。（2）对于心肌组织标本：心肌组织充分解冻后，准确称取0.3g，组织剪均匀剪碎后加入质量比l：3的超纯水在含冰水容器中低温水浴研磨获得组织匀浆，避免研磨产生的局部高温，从而对组织结构造成破坏。对得到的组织匀浆用超声破碎仪进一步低温水浴破碎（超声功率130W，工作时间l0秒间隔10秒），观察匀浆状态并注意超声23 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究噪音（噪音大小与匀浆颗粒大小成正比），从而决定超声次数，避免组织烧糊。充分超匀后，取超声过的组织匀浆400μL，在4℃下10000r离心30min，提取100μL上清液加入甲醇300lμL，沉淀其中蛋白得到混合液，4℃下10000r离心30min去除蛋白，再次提取上清液，将最终得到的上清液通过0.22μm微孔滤膜滤过，滤过后液体经过4h真空离心，非加热蒸干得到干粉。实验前，将得到的干粉复溶于200μL体积比为5：95的溶液（乙腈：水），后于4℃，10000r离心30min，提取上清液即可得到待测样品。具体操作步骤及流程如下：-80℃冻存血-80℃冻存组待测样品清标本织标本解解过冻冻滤1:3的比例加称取0.3g4℃,10000r30入乙腈分钟震剪离荡碎心4℃静置5min加入质量比l：复溶（乙腈：3的超纯水水=5:95体积）离研干心磨粉4℃,10000r15组织匀浆低温真空浓缩分钟蒸干上破上清碎清4℃静置5min上清4℃,10000r30分钟过离离滤心心待测样品4℃,10000r30加入300lμl甲上清分钟醇(1:3)，震荡24 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究2.1.5仪器参数设定表3.高效液相色谱-质谱仪性能及条件ItemRequirementsTypeofLCThermoAccelaUPLCTypeofMSThermoLTQOrbitrapXLTypeofColumnThermoHypersilGOLDPhaseA0.1%formicacidaqueoussolutionPhaseB0.1%formicacidACNsolutionChromatographicseparationtime15mintheinjectionvolumeofsample10uLtheflowrate200µL/minScanModeCentroidScopeofdatacollectionm/z50-1000Resolution100000(FWHM)thesamplemanagertemperature4°CThecolumnoventemperature20 °Cpositiveionmodewithionspray4.8kVcapillaryvoltage30VConevoltage150Vdesolvationtemperature350°Csheathgasflow30arbAssistantgas(99.999%nitrogen)flow5arb2.1.6样本分析及质控样本分析具体前后顺序，由Excel自带函数随机产生，期间为了避免样本交叉污染，空白标本需要相应插入每个样本（包括质控）之后。质控液由各实验组待检测标本相同容积混合制备而成。实验过程中共分析30个质控溶液，样本上机前连续检测15个，以利于观察仪器运行稳定与否，剩余15个随机插入待测标本中。在整个样本转移至仪器分析池中时，注意避免气泡的产生。2.1.7数据前处理利用MZmine2.0软件，对超效能代谢色谱-质谱平台分析系统所得到的初步数据进行预处理，其中包括：峰的检测、峰的比对、峰的标准化。这样以来，一个ij二维峰表便可以呈现，每一行（i）反应一个样本，每一列(j)反应一个参数,即一个质荷比（m/z）,其数值通过离子峰强度则来反应。在进行数据分析时，采用以下规则对峰进行识别、匹配及统一化处理：S/N(色谱峰强度信噪25 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究比)>30；RT(保留时间)≤±0.1min；±m/z≤±0.02。2.1.8统计分析首先，利用SIMCA-P+12.0.1.0对前处理所得到的数据进行进一步分析，然后利用其模式识别方法构建代谢组学PCA（主成分分析）及OPLS-DA（正交偏最小二乘判别法分析）模型[47]，最终根据VIP值及VIP置信区间初步筛选出特征代谢离子，然后应用SPSS17.0（USA）统计软件对所得数据进行非参数检验，并排除P值大于0.05的变量，进而保留有潜在差异的代谢离子。2.1.9物质鉴定最终差异性离子的物质鉴定，总体大致分两种类型：比对和非比对。有标准品进行比对（表格中相应物质以“#”标出）的特征代谢离子，直接经过标准品色、质谱峰的相互比对，即可得到鉴定结果，这类物质的鉴定迅速、方便、快捷而且准确。而对于部分没有既定标准品进行色谱峰与质谱峰比对的代谢离子，我们按照实验室要求，初步可采用条件查找和二级质谱扫描两种方法进行鉴定：1.按照m/z值及以下几点要求查找人类代谢数据库（HMDB）(http://hmdb.ca/)数据库a):m/z≤0.01b):精确电荷数c):与最终实验条件相一致的电离方式,进行查询，并对检索结果进行比对，得出物质鉴定结果。2.进行二级质谱扫描，按照特征离子的二级质谱质荷比（m/z值）与理论碎片比对偏差≤20％的原则进行模拟鉴定。2.2结果2.2.1采用UPLC-MS平台获得的血清及组织样本总离子流图26 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究图3.四组血清及组织样本总离子流图（TIC）Normal：正常组；AAC：心功能不全组；DM：糖尿病组；AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；RT：保留时间；serum：血清样本；tissue：心肌组织样本。27 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究从上述TIC图中我们不难看出，无论对于血清样本还是组织样本，各组色谱峰分布之间存在一定差异。通过数据前处理，我们在血清样本中提取出538个代谢物离子，在组织中提取出239个代谢物离子。在血清代谢总离子流图中，心功能不全合并糖尿病组色谱峰分布较其它三组有明显差异，不难发现此疾病状态下，体内小分子代谢物质发生了质和量的改变，尤其在RT值为6.04min左右时，心功能不全合并糖尿病组有明显色谱峰，而正常组、糖尿病组、心功能不全组无明显色谱峰，说明该色谱峰所代表的物质在混合疾病状态下大量产生，我们可以从两方面去推测，一是由于机体的代偿，心功能不全合并糖尿病大鼠为了适应心脏高后负荷或者高血糖的刺激，大量产生代偿性物质，缓解机体应激状态。二是由于机体的失代偿，大量的此类物质产生，对心血管系统及胰腺造成更大程度上的破坏，从而造成病情的恶化。从某种程度上讲，组织代谢物在更大程度上能反映机体本身代谢变化，它不受或很少受到外界因素干扰，比如血液等。在做组织代谢总离子流图时，我们发现大多数代谢物在心功能不全合并糖尿病组离子峰明显降低，说明这些物质的合成代谢受阻或者分解代谢加速，最终导致含量较其它三组有所降低。为了更加直观反映出各组之间代谢轮廓总体差异，接下来利用SIMCA-P+12.0.1.0模式识别方法，对各组样本进行轮廓分析。2.2.2代谢轮廓对不同疾病的区分能力28 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究图4.四组血清样本主成分分析（PCA）模型打分图Normal：正常组；AAC：心功能不全组；DM：糖尿病组；AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；serum：血清样本。图5.四组组织样本主成分分析（PCA）模型打分图Normal：正常组；AAC：心功能；DM：糖尿病组；AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；tissue：心肌组织样本。29 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究图6.四组血清样本正交偏最小二乘(OPLS-DA)模型打分图Normal：正常组；AAC：心功能不全组；DM：糖尿病组；AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；serum：血清样本。图7.四组组织样本正交偏最小二乘(OPLS-DA)模型打分图Normal：正常组；AAC：心功能不全组；DM：糖尿病组；AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；tissue：心肌组织样本。30 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究图8.AAC+DM组和Normal组血清样本正交偏最小二乘(OPLS-DA)模型打分图Normal：正常组；AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；serum：血清样本。图9.AAC+DM组和Normal组组织样本正交偏最小二乘(OPLS-DA)模型打分图Normal：正常组；AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；tissue：心肌组织样本。31 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究将前处理后得到的血清学数据导入软件（SIMCA-P+12.0.1.0），进行，构建的PCA模型拥有4个主成分(R2X=53.5%,Q2=6.2%)，其前两个主成分(t[1]/t[2])上的打分图见图4。从血清PCA模型图中可以看出各组血清样本具有一定的聚类趋势，在第一预测主成分(t[1])方向，心功能不全合并糖尿病组代谢轮廓较其它三组有明显差别，心功能不全组、糖尿病组介于两者之间，从一定程度上表明了疾病的发生发展差异。同样的方法对组织学进行主成分分析，构建的组织PCA模型拥有3个主成分(R2X=40.4%,Q2=8.9%)，其前两个主成分(t[1]/t[2])上的打分图见图5。从组织PCA模型图中可以看出，心功能不全合并糖尿病组具有很好的聚类趋势，但是正常组、心功能不全组、糖尿病不太明显，但是能够从一定程度上表明疾病严重程度是造成这一聚类趋势的最主要因素。本研究同时构建了血清（R2X=44.7%,R2Y=73.2%,Q2=36.3%）及组织（R2X=35.1%,R2Y=32.5%,Q2=13.3%），样本正交偏最小二乘(OPLS-DA)模型，各组间有明显的聚类趋势。四组模型（正常组、心功能不全组、糖尿病组、心功能不全合并糖尿病组）代表四种不同疾病状态，研究重点在于探求心功能不全合并糖尿病与正常组代谢差异，因此除了常规构建四组OPLS-DA模型外，还组合构建了血清（R2X=45.3%,R2Y=98.9%,Q2=87.1%）及组织（87.4%,R2Y=100%,Q2=97.5%）“AAC+DM-Normal组”的OPLS-DA模型，结果同样呈现出良好的聚类趋势，可见其区分度良好。2.2.3潜在标志物的筛选与鉴定对于潜在标志物的筛选，大致过程如下：首先分别构建血清及组织“正常组-心功能不全组-糖尿病组-心功能不全合并糖尿病组”及“正常组-心功能不全合并糖尿病组”OPLS-DA模型，对聚类趋势影响大的代谢离子被从相应模型区提取出，再根据每个模型所对应的变量投影重要性值及变量投影重要性置信区间初步筛选出对应变量（提取模型评分VIP值>l且置信区间≠零的变量），从而进一步对筛选出的离子进行非参数检验，排除P值大于0.05的变量，进而在血清中筛选出30个特征性代谢离子，在心肌组织中筛选出10个特征性代谢离子。潜在特征差异性代谢物鉴定主要采用标准品比对、条件查找、二级质谱扫描三种方式：首先重新设定仪器参数以适应筛选出的变量，对于有标准品进行比对的特征代谢离子，通常采取标准品色、质谱峰的相互比对，从而进行最终鉴定。而对于那些没有确切标准品进行色谱峰与质谱峰比对的代谢离子，可采用以下两种方式方法进行鉴定：1.按照最终离子准确的质荷比，即m/z值及以下32 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究几点要求查找人类代谢数据库（HMDB，http://hmdb.ca/)。要求如下：a):m/z≤0.01；b):精确电荷数；c):与最终实验条件相一致的电离方式,进行查询，并对检索结果进行比对，得出物质鉴定结果。2.进行二级质谱扫描，按照特征离子的二级质谱质荷比（m/z值）与理论碎片比对偏差≤20％的原则进行模拟鉴定。最终，在血清样本中筛选出30个特征离子鉴定结果如下，包括：Adrenicacid、Cervonoylethanolamide、Cholicacid、Glycocholicacid、Deoxycholicacid、Deoxycholicacid3-glucuronide、1b-Hydroxycholicacid、Chenodeoxycholicacidsulfate、LysoPC(20:1(11Z))、LysoPC(P-18:0)、LysoPC(18:1(9Z))、LysoPC(P-18:1(9Z))、LysoPC(17:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(15:0)、LPA(0:0/18:2(9Z,12Z))、LPA(0:0/18:0)、Tetracosahexaenoicacid、Palmiticacid、Palmiticamide、5,6-DihydroxyprostaglandinF1a、Sphinganine、Sphingosine、Phytosphingosine、Sphingosine1-phosphate、N,N-Dimethylsphingosine、Hydroxyprolyl-Leucine、Glycyl-Hydroxyproline、Stearoylcarnitine、D-Glucose。在心肌组织样本中鉴定出10个差异性特征代谢物，分别是：Threonicacid、2,5-Dichloro-4-oxohex-2-enedioate、2-Thiothiazolidine-4-carboxylicacid、Galactinol、L-Aspartyl-4-phosphate、LysoPC(16:0)、L-HypoglycinA、LPA(18:1(9Z)/0:0)、Dihydrouracil、LysoPC(18:1(9Z))。2.2.4代谢序列路径富集分析众所周知，基因序列富集分析与传统的基因分析相比，具有自己独特的优势，因此广泛应用于基因分析领域。而代谢序列富集分析（MESA），是继基因序列富集分析后的一个代谢版本，它拥有自己的代谢序列库。传统的代谢分析方法常常是首先基于显著性检验水平去筛选实验组与对照组差异性物质，然后联系研究目的去探索疾病通路及机制，而代谢序列富集分析方法则无需进行代谢物差异性筛选，直接分析功能相关的代谢物，以便能够观察代谢物细微但持续的改变。因此，我们把初步鉴定的血清及心肌组织代谢物利用metaboanalist软件进行MESA分析处理。从图10、11中不难发现，血清中鉴定出的物质在鞘脂代谢、胰岛素信号通路等中大量富集，心肌组织中鉴定出的物质在β-丙氨酸代谢、磷脂代谢等中大量富集。33 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究图10.血清代谢序列路径富集分析图11.心肌组织代谢序列路径富集分析34 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究2.2.5差异性代谢物组间含量比较表4.血清代谢物组间含量比较质荷比保留特征代谢物电离方式AAC+DM/AAC+DM/AAC+DM/(m/z)时间AACDMNormal355.2676.047肾上腺素M+Na+UP*UP**UP*373.2686.048羰基乙醇胺M+H+UP*UP**UP*431.2696.052胆酸#M+Na+UP*UP**UP*488.2925.627甘氨酸算M+Na+UP*UP**415.2775.967脱氧胆酸M+Na+UP*UP**UP*591.3115.9273-葡糖苷酸脱氧胆酸M+Na+UP*UP*UP**447.2715.5031b-羟基胆酸M+Na+UP*UP**UP*473.2617.927鹅去氧胆酸硫酸盐M+H+UP*UP*550.3838.772LysoPC(20:1(11Z))M+Na+UP**UP*508.3737.988LysoPC(P-18:0)M+H+UP*UP*522.3537.634LysoPC(18:1(9Z))M+H+UP*506.3578.524LysoPC(P-18:1(9Z))M+H+UP**UP**510.3527.927LysoPC(17:0)#M+H+UP*UP*991.6667.482LysoPC(16:0)#M+H+UP*UP**UP**482.3217.082LysoPC(15:0)#M+H+UP*UP*UP*457.2316.939LPA(0:0/18:2(9Z,12Z))M+Na+UP*UP**461.2618.169LPA(0:0/18:0)M+Na+UP*UP**357.2746.771二十四碳六烯酸M+H+UP*UP*274.2726.186棕榈酸M+NH4+UP*UP**UP*256.2626.213棕榈酰胺M+H+UP*UP*UP*389.2615.7665,6-二羟前列腺素F1aM+H+UP*UP*UP*302.3036.737二氢鞘胺醇M+H+UP*UP*300.2886.240神经鞘氨醇M+H+UP*UP*UP*340.2796.216植物鞘胺醇M+Na+UP*UP*UP*402.2346.6981-磷酸鞘胺醇M+Na+UP*UP**UP*328.3196.783N,N-二甲基鞘氨醇M+H+UP*UP**245.1505.965羟脯氨酰亮氨酸M+H+UP*UP**UP*189.0844.524甘氨酰基羟脯氨酸M+H+UP*428.3728.079硬脂酰肉毒碱M+H+UP*UP**203.0510.729D-葡萄糖M+Na+DOWN*“#”:通过标准品比对鉴定。AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；AAC：心功能不全组；DM：糖尿病组；Normal：正常组；AAC+DM/AAC：心功能不全合并糖尿病组与心功能不全组比较；AAC+DM/DM：心功能不全合并糖尿病组与糖尿病35 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究组比较；AAC+DM/Normal：心功能不全合并糖尿病组与正常组比较；LPC：溶血磷脂酰胆碱；LPA：溶血磷脂酸；UP：升高；DOWN：降低；*P<0.05，**P<0.01。表5.心肌组织代谢物组间含量比较质荷比保留特征代谢物电离方AAC+DM/AAC+DM/AAC+DM/(m/z)时间式AACDMNormal137.0470.866苏糖酸M+H+UP*UP*UP*226.9530.5942,5-二氯-4-氧代-2-烯己二M+H+DOWN**DOWN*DOWN**酸185.9610.655四氢噻唑-2-硫酮-4-羧酸M+Na+UP**365.1070.672肌醇M+H+UP**UP*UP*214.0080.666L-门冬氨酰-4-磷酸盐M+H+DOWN*DOWN*DOWN*518.3267.514LysoPC(16:0)#M+H+DOWN*142.0870.892L-次甘氨酸AM+H+UP*459.2527.510LPA(18:1(9Z)/0:0)DOWN*115.0501.776二氢尿嘧啶M+H+DOWN*544.3417.557LysoPC(18:1(9Z))M+Na+DOWN*“#”:通过标准品比对鉴定。AAC+DM：心功能不全合并糖尿病组；AAC：心功能不全组；DM：糖尿病组；Normal：正常组；AAC+DM/AAC：心功能不全合并糖尿病组与心功能不全组比较；AAC+DM/DM：心功能不全合并糖尿病组与糖尿病组比较；AAC+DM/Normal：心功能不全合并糖尿病组与正常组比较；LPC：溶血磷脂酰胆碱；LPA：溶血磷脂酸；UP：升高；DOWN：降低；*P<0.05，**P<0.01。2.2.6代谢路径影响权重分析代谢路径分析将强大的路径富集分析与路径拓扑分析有力结合，能够协助研究者发现疾病最相关代谢途径。因此，我们的实验采用metaboanalist软件，对鉴定出的血清及心肌组织代谢物进行相应分析，结果如图12、13所示。通过metaboanalyst路径分析发现：在血清中，鞘磷脂代谢、甘油磷脂代谢以及戊糖与葡糖醛酸转换代谢影响权重较大（0.20~0.25），而在心肌组织中，甘油磷脂代谢路径影响权重较大（0.25）。因此，在血清及心肌组织代谢中，涉及的共同代谢通路为甘油磷脂代谢。36 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究SphingolipidmetabolismGlycerophospholipidmetabolismPentoseandglucuronate图12.血清代谢物相关路径分析Glycerophospholipidmetabolism图13.心肌组织代谢物相关路径分析37 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究2.2.7代谢物来源富集分析从上述代谢通路影响权重分析中，我们不难发现甘油磷脂代谢在血清及心肌组织中均为主要路径，但组间统计学分析发现，参与甘油磷脂代谢的物质，如溶血磷脂酰胆碱（LPC）、溶血磷脂酸（LPA），在心功能不全合并糖尿病大鼠血清及心肌组织中含量存在明显差异：在血清中，疾病组较正常组LPC、LPA含量明显升高，而在组织中含量明显降低。因此，我们利用metananlist代谢库对筛选出的代谢物进行物质来源富集分析，结果如14、15所示。我们发现血清代谢物的来源主要包括：甲状腺、血小板、红细胞、小肠、骨骼肌、内质网、胆囊、肝脏、肾脏组织等，而组织代谢物主要来源于细胞核、肾脏、肝脏组织等。因此，我们初步推测血清中大量LPC、LPA的来源并非心肌本身，而是由其它器官或组织远距离产生，通过血液循环，最终靶向作用于心肌组织。图13.血清代谢物序列来源富集分析38 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究图14.心肌组织代谢物序列来源富集分析2.3讨论本研究是利用系统生物医学的分支―代谢组学(metabonomics/metabolomics)的方法对心功能不全合并糖尿病大鼠血清及心肌组织进行研究。从某种程度上讲代谢轮廓能够从更加直观的角度诠释不同疾病状态下机体内小分子内源性物质层面的代谢变化趋势，分析这一趋势中所蕴含的内源性代谢信息，筛选出影响代谢的关键因子即找到显著差异的特征代谢物质，进而联系、分析这些物质所参与的代谢通路及其中间环节，这将更加有利于全面深入的了解心功能不全合并糖尿病的发生发展机制，为临床相关疾病诊断及治疗开辟新的思路。2.3.1代谢组学概念及标本选择代谢组学从研究者角度讲，是继传统基因组学、蛋白质组学、转录组学后的新兴“组学”，它是通过定量分析生物体内所有内源性小分子代谢物（MW<1000），从而寻找这些代谢物与疾病生理病理变化的相对关系的研究方式[48,49]。严格的讲，蛋白质组学和基因组学分别从蛋白质和基因层面阐释生命的活动，而实际上细胞内大多数生命活动更多是发生在小分子代谢物质层面的，如39 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究激素调控、细胞间信号释放，递质、能量传递，炎性介质产生等微观上都是受代谢调控的。因此有人认为，“基因组学和蛋白质组学能够告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。”对于代谢组学研究的标本类型，目前主要是血浆或血清、尿液、唾液等生物体液[50,51]，亦包括细胞和组织的提取液，但是现阶段往往由于临床实际工作中生物体液获得方式相对简单，对机体的损伤小，安全可靠，容易被患者所接受，所以目前代谢组学研究常采用尿液、血液等生物体液样品，但是血清或尿液样本在很大程度上受到其它脏器代谢的影响，尤其我们在做特定脏器代谢研究时，明显受到限制。同时绝大多数疾病引起的代谢通路及代谢物质改变在一定情况下可能只有在局部微环境下才可以检测得到[52]，或者疾病初期，仅仅具有组织或细胞内代谢微改变，血清或尿液根本无法直接反应代谢变化，此时组织代谢组学可能是最佳的选择，它能更直接地反映出机体靶器官代谢改变。因此，本研究在选择血液样本进行代谢组学轮廓研究的同时，相应的选择靶目标心肌组织进行代谢研究，从而可以从不同的角度对疾病发生机制进行诠释。2.3.2心功能不全合并糖尿病血清及组织代谢本研究采用代谢组学中常用的超高效液相色谱-质谱联用技术平台对不同疾病代谢模型（正常、糖尿病、心功能不全、心功能不全合并糖尿病）血清及组织样本进行轮廓分析，然后利用SIMCA-P+12.0.1.0模式识别方法构建代谢组学PCA（主成分分析）及OPLS-DA（正交偏最小二乘判别法分析）模型，最终根据VIP值及VIP置信区间初步筛选出差异性特征代谢物，应用SPSS17.0（USA）统计软件对所得数据进行非参数检验，排除P值大于0.05的变量，进而在血清中筛选出30个特征性代谢离子，最终鉴定出与疾病密切联系的代谢标志物有：肾上腺素、羰基乙醇胺、胆酸、甘氨胆酸、脱氧胆酸、3-葡糖苷酸脱氧胆酸、1b-羟基胆酸、鹅去氧胆酸硫酸盐、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、二十四碳六烯酸、棕榈酸、棕榈酰胺、5,6-二羟前列腺素F1a、二氢鞘胺醇、神经鞘胺醇、植物鞘胺醇、1-磷酸鞘胺醇、N,N-二甲基鞘氨醇、羟脯氨酰亮氨酸、甘氨酰基羟脯氨酸、硬脂酰肉毒碱、D-葡萄糖。在心肌组织中筛选出10个特征性代谢离子，最终鉴定出与疾病密切联系的代谢标志物有：肌醇、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、二氢尿嘧啶。2.3.3物质相关代谢通路及机制分析Adrenicacid[53]，肾上腺酸（廿二碳四烯酸），早期研究表明它属于一种脂肪40 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究酸，在人类大脑富含最多。目前医学界普遍认为它可能是一种潜在的环前列腺素抑制剂，生物学效应上表现出一定的凝血作用。本研究结果显示心功能不全合并糖尿病组大鼠肾上腺酸的含量较其它三组明显升高，这与临床工作中心衰合并糖尿病患者常常容易处于高凝状态、血栓类心血管事件发生率明显升高确切相符，因此临床工作中，Adrenicacid有望成为一个凝血指标，作为心血管疾病合并糖尿病患者高凝状态筛查，以进一步指导临床疾病诊治及抗凝用药。Cholicacid，Glycocholicacid，Deoxycholicacid，Deoxycholicacid3-glucuronide，1b-Hydroxycholicacid，Chenodeoxycholicacidsulfate，均属于胆酸及其衍生物。胆酸，是原发性胆汁酸中的一种，通常与甘氨酸和牛氨酸共轭形成甘氨胆酸和牛黄胆酸，它们是是人类的主要胆汁酸。同时，胆酸作为固醇类的一种，是人类四种主要胆汁酸中含量最为丰富的一种。它最初在肝脏组织中合成，然后分泌，作为消化液的重要组成部分，到十二指肠后它参与机体代谢，促进机体对脂类物质的消化和吸收。而胆汁酸，作为胆固醇代谢的最终产物，一方面它能够促进胆固醇大量排泄以及脂肪充分吸收，另一方面它能够调节调节胆固醇在体内的动态平衡[54]，这主要是通过调节胆固醇代谢过程中的关键酶来实现。众所周知，胆固醇主要依赖于血清脂蛋白而存在，而脂蛋白有多重生物学存在形式：高密度脂蛋白胆固醇（HDL--C）、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)几种，临床工作中，高密度脂蛋白普遍被认为是一种抗动脉粥样硬化蛋白，是冠心病的保护因子，被广大患者理解为“好密度脂蛋白”，而LDL则因携带的胆固醇容易沉积在动脉壁上，容易引起动脉硬化，因此被患者称之为“坏的胆固醇”，是心血管疾病危险发生的征兆。曾有研究显示机体大量的胆酸聚集后，能够对细胞膜产生一定的破坏作用[55]，即所谓的毒性效应，这可能成为大量胆汁酸蓄积导致细胞凋亡和坏死作出了最好的诠释。在大鼠模型研究证实摄入，能够间接地通过棕色脂肪组织来调节机体膳食摄入时ATP的消耗，从而在一定程度上减少高糖高脂饮食引起的机体肥胖，改善机体及组织胰岛素抵抗状态，减少糖尿病的发生[56]。国外近期一项研究发现：机体血清葡萄糖含量的动态平衡与胆汁酸代谢水平密切相关[57]，实验人员采用OGTT检查提示正常的人群，给与同样条件饮食，一定时间后检测机体血清中胆酸及其衍生物的含量，结果发现其含量明显升高，推测中间机制可能为机体胆固醇7α-羟化酶mRNA的表达以及进食后机体胆囊收缩增强密切相关，两者共同促进机体胆汁酸连续分泌。Kondo等通过研究也发现，胆汁酸在某41 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究种意义上具有降糖作用，研究者通过给2-DM患者胆汁酸治疗后，发现患者BG和GHb均有所减低[68]。对于我们的研究，结果显示心功能不全合并糖尿病组大鼠胆酸分泌量较其它三组明显升高，一方面在于，高浓度的胆酸能够一定程度上降低糖尿病大鼠血糖水平，改善胰岛素抵抗状态，不利的方面在于胆酸的高浓度蓄积对机体心肌组织的细胞及线粒体膜造成一定的破坏，最终导致心肌细胞凋亡和坏死，同时对大鼠肝脏细胞造成损伤，削弱了机体对脂质的代谢，而目前普遍认为脂质代谢异常所导致的脂肪异常分布，过度堆积是胰岛素抵抗的主要原因。同时。胆汁酸作为胆固醇在肝脏分解代谢的产物，其含量的增加间接提示机体处于高胆固醇状态，因此患者动脉粥样硬化、血栓形成的风险大大增加。LPC,溶血磷脂类，磷脂质的一种，亦称溶血磷脂酰胆碱（lysoph-osphatidylcholine），在肝脏微粒体的酰基CoA转移酶的作用，与酰基CoA进行反应生成卵磷脂，主要参与甘油磷脂代谢。通过MESA及路径影响权重分析分析，该物质的产生与疾病发生发展密切相关。在血浆中，机体脂肪酸（FA）被胆固醇酰基转移酶（LCAT）[59]初步水解，形成游离胆固醇，这些游离胆固醇进一步水解，最终形成溶血卵磷脂类物质。溶血磷脂在脂质信号通路上，扮演着脂蛋白酯酶受体的角色，而脂蛋白酯酶受体属于G蛋白家族成员之一，能够参与众多细胞间信号转导。相关研究显示，ox-LDL(氧化低密度脂蛋白)的核心成分就是LPC，它是导致机体动脉粥样硬化(AS)和血管内皮损伤的重要物质[60]，这主要是通过调节机体血管的紧张程度从而来引起内皮细胞的功能紊乱[61]，最终达到损伤内皮细胞的目的，这就为血栓事件的发生提供了时机。同时，LPC能够活化NF-kB，增强基质金属蛋白酶的表达，而高表达的基质金属蛋白酶在动脉粥样斑块不稳定性中发挥着不可或缺的作用[62]，最终会导致高的卒中和心血管死亡风险。在细胞通透性改变方面，LPC能够破坏细胞膜磷脂，从而改变细胞的形态和破坏细胞膜的完整性，破坏细胞的整体结构，引起机体组织细胞的逐步凋亡、坏死。同时，LPC还可以通过氧化酶途径和血管内蛋白激酶C的活化参与机体氧化应激的过程，而在机体动脉粥样硬化（AS）、心力衰竭(HF)、心肌肥厚，缺血/缺氧再损伤等方面，氧化应激过程发挥着至关重要的作用。本研究显示，心功能不全合并糖尿病大鼠血清代谢物中LysoPC(16:0)、LysoPC(15:0)较正常组、心功能不全组、糖尿病组明显升高，一方面，它们通过改变细胞的形态和破坏血管内皮细胞膜的完整性，引起血管内皮功能紊乱和内皮损伤，致使血栓的形成，另一方面，他们可以通过磷脂代谢途径，进一步促进相关动脉粥样硬化的发生，42 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究同时，同时通过氧化和蛋白激酶途径，增强机体氧自由基产生，进一步对大鼠心肌和胰腺细胞造成破坏，促进了疾病的发生发展，严重影响疾病的预后，对于LysoPC(P-18:0)、LysoPC(17:0)，AAC+DM组较AAC组、Normal组明显升高，但与DM组比较，无明显差异，从一定程度上反应它们的产生与糖尿病密切相关，而最终它们作用的范围和器官不仅仅局限于胰腺，可能涉及心肌等全身脏器和组织，对于LysoPC(20:1(11Z))、LysoPC(P-18:1(9Z))，AAC+DM组较DM组、Normal组明显升高，但与AAC组比较，无明显差异，考虑它们的产生与AAC更加密切相关。相对于组织代谢而言，AAC+DM较正常组LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1(9Z))的产生明显减少，可能源于心肌组织本身很少甚至几乎不产生LPC，更多的是受血液循环中LPC含量的影响，因此，从某种意义上讲，降低心功能不全合并糖尿病患者循环血液中LPC的含量，在一定程度上能够对心肌组织产生一定的保护作用，减轻动脉粥样硬化产生的同时减少机体氧化应激，最终抑制终末期心衰的发生。Palmiticacid、Palmiticamide，棕榈酸及其衍生物。棕榈酸属于一种饱和高级脂肪酸，血清中其含量过高常常是导致血胆固醇（TC）、三酰甘油(TG)等升高的罪魁祸首，胆固醇（TC）、三酰甘油(TG)等升高会导致脂质在血管内的蓄积，继发引起血管管腔狭窄，引起动脉粥样硬化的发生，增加冠心病的发病风险。实质上，机体游离脂肪酸主要通过β氧化和酯化作用途径进行代谢，降低机体FFA，能在一定程度上抑制机体脂肪酸的氧化，提高心肌组织对葡萄糖的分解利用，这样以来能够帮助保护2型DM患者减轻血清高血糖负荷，使得患者的心脏舒缩功能得到有效的保护[63]。本代谢实验研究结果显示：心功能不全合并糖尿病组大鼠Palmiticacid、Palmiticamide等饱和脂肪酸含量较其它组明显增高，一来可能与机体脂酰辅酶A的大量合成密切相关。在心肌缺血状态下，大鼠心肌增加利用α磷酸甘油和脂酰COA合成三酰甘油，间接导致脂肪酸合成增加。二来可能是由于大鼠自身肝内的脂肪酸β氧化受损导致肝中一些饱和脂肪酸的代谢障碍，从而形成蓄积。既往研究表明[64]，机体脂肪酸和葡萄糖氧化代谢相互调节，在机体脂肪酸氧化代谢受损的同时葡萄糖的氧化分解明显增强：①脂肪酸氧化能力降低，乙酰辅酶A的水平含量降低，丙酮酸脱氢酶活性增强，葡萄糖酵解能力增强；②脂肪酸氧化减少，柠檬酸的产生随之减少，磷酸果糖激酶的活性增强，葡萄糖酵解增强。因此，心功能不全合并糖尿病大鼠机体像棕榈酸这类脂肪酸类物质大量产生，不难作出如下两种推断：一来是由于大鼠心43 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究缺血，脂肪酸合成增加，那么棕榈酸类物质则可以作为心肌缺血的筛查指标；二来是由于脂肪酸的代谢障碍，从而形成蓄积，那么此时大鼠机体可能处于一个代偿性降血糖的过程，这是一种机体自我调节保护从而应对高血糖状态的表现。5,6-DihydroxyprostaglandinF1a，5,6-二羟前列腺素F1a，前列腺素类物质，是类花生酸一种，存在于动物和人体中，通常由不饱和脂肪酸组成，同时具有多重生理作用。研究证明全身多种组织细胞均可产生，普通激素通常是通过体液循环影响远距离靶组织或靶器官，而它并非这样，它通常是在局部组织或细胞分泌和释放，仅仅对细胞本身或邻近组织细胞发生生理调节作用。对于它的功能，一来由于参与G蛋白介导的受体信号通路，所以能够参与机体促炎作用，二来，因为其具有对血管平滑肌松弛作用，因此能够减小血管外周阻力[65]，降低心脏负荷。本研究认为性对腹主动脉进行缩窄，增加外周血管阻力的同时，增加了心脏后负荷，机体为了适应性代偿，产生大量前列腺素类物质予以拮抗，不失为机体自适应的外在表现。同时类花生酸类物质的大量产生与蓄积，在一定程度上能够介导糖尿病病理生理，并参与相关糖尿病并发症的发生。所以说，在一定情况下，也就是疾病初期或者代偿期，机体往往处于一种适应的过程，但是随着病程的续延，机体代谢逐渐紊乱，在疾病失代偿趋向恶化的同时，并发症随之产生，甚者多脏器衰竭。这与我们的研究结果高度吻合，临床心衰合并糖尿病治疗过程中，往往前期单发疾病未能够引起患者重视，但是一旦合并疾病发生，治疗效果往往较差，顾此失彼，损失不可估量。鞘磷脂作为磷脂类物质另一重要分支，在本研究中亦有发现。Sphinganine、Sphingosine、Phytosphingosine、Sphingosine1-phosphate、N,N-Dimethylsphingosine，鞘氨醇及其代谢物，属于鞘脂类，组成细胞膜的重要成分。鞘氨醇是TNF-α在心肌损伤时的信号转导因子[66]，心肌细胞合成、分泌TNF-α的水平和心功能损害及心肌细胞坏死程度呈密切正相关。鞘氨醇在心肌细胞中大量产生，作为TNF-α的介导物质，在一定程度上它能够降低心肌收缩力，阻碍心肌细胞钙离子的转运，引起钙超载，导致心肌损伤。Phytosphingosin（植物鞘氨醇），具有多种生理活性，虽然具有一定免疫活性，对心肌细胞具有一定保护作用[67]，但更多研究结果显示，大量Phytosphingosin的产生，能够诱导细胞凋亡的发生[68]。Sphingosine1-phosphate（S1P），磷酸鞘脂类代谢物，由鞘氨醇激酶和神经酰胺激酶催化下被磷酸化产生，S1P是一种有力的信号脂类分子，同时控制着细44 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究胞许多生理效应，包括细胞生存和炎症反应，S1P包含在cyclooxygenase-2induction(COX-2)体系之内，因此能够调节炎症介质类花生酸的产生[69]。通常它的功能主要通过G蛋白偶联受体实现，同时它在钙离子信号通路中发挥着一定的生物学效应。N,N-Dimethylsphingosine（DMS），鞘氨醇的代谢物，鞘氨醇激酶抑制剂，研究表明它是慢性疼痛的诱导物质[70]；能够抑制炎症的发生[71]；同时在低剂量时它具有心脏保护作用，高剂量的蓄积则促进心肌细胞的凋亡，加速心肌损伤[72]。我们知道，鞘磷脂作为细胞膜的重要组成部分，它可以被鞘磷脂酶水解，生成神经酰胺等一系列生物活性物质，而神经酰胺[73]可以作为细胞第二信使，在心血管系统产生许多重要生物学作用：（1）诱导心肌细胞凋亡（2）调节免疫及炎症反应（3）参与氧化应激等。同时它在胰岛素抵抗过程中也发挥着重要的作用：（1）大量蓄积的神经酰胺能够导致降低胰岛素的敏感性。（2）诱导糖尿病大鼠胰岛β细胞、脂肪细胞的凋亡。（3）大量神经酰胺的积累能够抑制胰岛素的合成。因此，机体在心功能不全合并糖尿病状态下，形成大量鞘磷脂及其代谢物的蓄积，不仅对心血管系统造成严重损伤，同时胰腺遭到破坏，机体对胰岛素发生抵抗，处于高血糖状态，这样形成恶性循环，最终使得病情恶化，形成全身系统并发症。大量研究结果证实，心血管疾病的发生同时往往伴随糖耐量改变，而糖尿病的发生常伴随出现高血脂血症等症状，因此，科研工作者逐渐意识到脂代谢紊乱可能是糖代谢异常的一个重要危险和始发因素，最终脂质蓄积、糖代谢紊乱，对心血管系统造成极大威胁，血栓、心梗接踵而至。甚至有人就曾指出脂代谢紊乱是糖代谢异常的本质根源，甚至将二型糖尿病称之为“糖脂病”。我们的研究结果显示，Sphingosine、Phytosphingosine、Sphingosine1-phosphate在心功能不全合并糖尿病组大鼠大量产生，与其它三组比较，差异具有显著性（P<0.01）。而对于Sphinganine、N,N-Dimethylsphingosine、Stearoylcarnitine三种物质，AAC+DM组较AAC组、Normal组明显升高，但与DM组比较，无明显差异，表明这些物质的产生更大程度上依赖于糖尿病这种疾病状态，而其作用的靶组织更多偏向于心肌。因此，我们推测机体血清中鞘磷脂的含量在一定程度上能够反应心功能不全合并糖尿病的疾病严重程度，在临床中是否能够成为心功能不全合并糖尿病的预后的指标，还得有待于进一步研究。Stearoylcarnitine，硬脂酰肉碱，肉碱的衍生物。肉碱(carnitine)，是一种类氨基酸，在体内与脂肪代谢有关。L-肉碱（左旋肉碱，有活性）是一种广泛分布45 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究于肝脏中的氨基酸，尤以心肌及骨骼肌中含量最高。在肝脏中，它能够与长链的脂肪酸结合，从而形成长链酰基肉碱，最终对脂肪酸的β氧化起到催化剂作用[74]，因此它常被用来作为评价和监测代谢障碍性疾病（如胰岛素抵抗、冠心病等）的指标[75]。同时它还能够促进碳水化合物和氨基酸的利用；提高机体耐受力、防止乳酸积累；作为心脏保护剂；延缓衰老、抗氧化；降血胆固醇和三酰甘油；减轻体重等众多功能。我们的组学研究结果显示，心功能不全大鼠注射STZ后，硬脂酰肉毒碱的产量较AAC组及Normal组明显升高，与DM组比较无明显差异，说明大鼠机体在糖尿病状态下能够大量产生该类物质，而在单独心功能受损时几乎不产生。对此我们作出如下分析：一来大鼠机体产生大量的硬脂酰肉毒碱，加速肪酸的β氧化的同时抑制糖的酵解，最终导致机体血糖的升高，从这方面考虑，我们推测未来硬脂酰肉毒碱能否类似于GHb，作为血糖长期控制与否的筛查指标。二来糖尿病大鼠机体通常处于“高糖脂”状态，为了能够更好适应血清高脂质代谢的需求，机体产生大量该物质。再者，大量硬脂酰肉毒碱的产生能够增强心功能不全合并糖尿病大鼠对高糖的耐受，减少机体乳酸堆积，有效预防了机体酸中毒，从而提供了心肌保护作用，所以另一方面来讲，硬脂酰肉碱还有望成为心功能不全合并糖尿病的预后指标，通过检测血清中硬脂酰肉碱的含量，有助于我们了解机体应对高脂高糖的代谢能力，如果机体尚处于代偿期，那么推测该物质的含量有可能进一步升高，从而达到提高机体耐受的目的。LPA，溶血磷脂酸,生物磷脂类，是一种内源性的活性信号分子，它主要来源于血液中激活的血小板[76]，亦有报道显示它可来源于成纤维细胞、脂肪细胞等，它主要参与甘油磷脂代谢。通过MESA及路径影响权重分析分析，该物质的产生与疾病发生发展密切相关。根于文献介绍，LPA的产生依赖于：（1）磷脂酶A2(PLA2)的催化PA直接生成溶血磷脂酸，（2）溶血磷脂酰胆碱（LPC）在lyso-PLD的催化下直接生成LPA。G蛋白耦联受体（EDG/LP受体家族）通常位于细胞表面，LPA主要通过它来发挥广泛的类似于激素样的生物学效应，故有人称它是一种多功能的“磷脂信使”。同时LPA有不同的亚型，LPA1-6型，实验表明部分亚型的LPA受体（LPA-R）可能参与了心室重构的发生[77]，主要涉及以下这两种方式：调节局部心肌细胞肥大和调节成纤维细胞增殖。而且，LPA能激活BNP的启动子，这种启动子与人的心肌肥厚、心衰发生密切相关。除了促进心肌结构改变和心衰发生，它还可以导致AS及局部血管血栓的形成，46 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究机制可能包括以下几点：①LPA能够促进平滑肌细胞增殖[78]、成纤维细胞增生、炎性细胞活化[79]。②诱导血管内皮功能障碍，改变其通透性，促进泡沫细胞聚集形成[78]。③LPA与LDL-C结合，活化血小板，介导AS发生[80]。④增加血管舒缩性，降低斑块稳定性[81]，增加细胞粘附和血小板聚集。因此，根据LPA含量多少，在一定程度上可以对心衰及血栓事件形成的风险作出初步评估。同时阜外心血管病医院的一项研究表明，LPA可能能够通过激活LPA3受体，抑制线粒体依赖的细胞凋亡途径，保护缺氧/复氧诱导的心肌细胞免受损伤[82]。我们的研究结果显示：AAC+DM组血浆中LPA(0:0/18:2(9Z,12Z))、LPA(0:0/18:0)的含量较Normal组及AAC组明显升高，而与DM组比较没有明显差异，提示可能是糖尿病诱导了机体溶血磷脂酸的产生，最终作用于心血管系统，导致心肌受累疾患，而心功能不全本身并不产生或者极少产生该类物质，这在我们的组织学代谢研究中得到进一步证实：组织中溶血磷脂酸的含量跟血清恰恰相反，心功能不全合并糖尿病组较Normal组明显降低。上述LPA含量的改变与临床上糖尿病加重心功能不全或者心衰以及血栓的发生的现象密切相符。结合组织来源富集分析，我们不难推测，LPC、LPA的来源并非心肌本身，而是由其它器官（肝脏，胰腺等）在糖尿病诱导情况下，远距离产生，最后靶向作用于心肌组织。从上述研究分析，我们不难发现，溶血磷脂酸通过多种途径参与机制动脉粥样硬化、血栓、心肌重塑的发生，因此，如何进一步抑制LPA的产生，减少循环血液中LPA的含量，从而避免心血管系统受累，接下来可能会成为医学界研究的热点。肌醇，是动物的生长因子，最早从心肌和肝脏中分离得到，在细胞中主要以磷脂的形式存在，所以又称为肌醇磷脂。研究显示它能够降低血液中胆固醇含量，从而预防动脉粥样硬化的发生，同时，肌醇类物质具有一定的降糖作用。本研究在心肌组织代谢中发现心功能不全合并糖尿病组大鼠心肌肌醇含量较其它三组明显升高，这可能与压力超负荷性心肌肥厚大鼠心肌组织中存在肌醇磷脂途径过度激活[83]以及机体高脂高糖状态密切相关，因此，提示肌醇磷脂途径有可能在信号传导水平，成为阻断或逆转心肌肥厚、降低机体血糖血脂的一个新的作用靶点。2.4小结1.代谢组学的核心概念认为机体的代谢轮廓能够非常紧密地反应其健康状47 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究态，因此利用代谢组学平台筛选出的特征代谢物或特征代谢物谱，在一定程度上可以准确表示和区分机体不同的生理病理状态。通过数据预处理，我们在血清样本中提取出538个代谢物离子，在组织中提取出239个代谢物离子（见TIC图）。2.利用代谢组学平台，借助于SIMCA-P+12.0.1.0软件分析，成功构建血清(4个主成分，R2X=53.5%,Q2=6.2%)和心肌组织PCA模型（3个主成分，R2X=40.4%,Q2=8.9%）且各组具有良好聚类趋势，没有界外值，说明在整个实验的过程中UPLC-MS检测结果稳定，重复性好，可信度高。3.成功构建血清（R2X=44.7%,R2Y=73.2%,Q2=36.3%）及心肌组织（R2X=35.1%,R2Y=32.5%,Q2=13.3%）“AAC+DM-AAC-DM-Normal组”正交偏最小二乘代谢轮廓分析模型，同时，为了更好反应混合疾病组代谢特点，我们成功构建了血清（R2X=45.3%,R2Y=98.9%,Q2=87.1%）及心肌组织（R2X=87.4%,R2Y=100%,Q2=97.5%）“AAC+DM-Normal组”正交偏最小二乘代谢轮廓分析模型。并且经过非参数检验，最终在血清中筛选并鉴定出30个特征性代谢物，在心肌组织中筛选并鉴定出10个特征性代谢物。通过深入研究分析发现，利用上述代谢轮廓分析方法所找到的这些血清、组织特征代谢物具有很好的疾病区分能力，可以在临床领域作为潜在的疾病诊断标志物以及新治疗靶点做进一步深入研究。4.对最终鉴定出来的代谢物进行分析，结果表明：心功能不全合并糖尿病组大鼠代谢产物肾上腺素、羰基乙醇胺、胆酸、脱氧胆酸、3-葡糖苷酸脱氧胆酸、1b-羟基胆酸、LysoPC(16:0)、LysoPC(15:0)、棕榈酸、棕榈酰胺、5,6-二羟前列腺素F1a、神经鞘胺醇、植物鞘胺醇、1-磷酸鞘胺醇、羟脯氨酰亮氨酸较其它三组（正常组、糖尿病组、心功能不全组）明显升高，提示这些物质可能作为心功能不全合并糖尿病（AAC+DM组）这种混合模型的特征代谢标志物。而对于甘氨胆酸、鹅去氧胆酸硫酸盐、LysoPC(P-18:0)、LysoPC(17:0)、LPA(0:0/18:2(9Z,12Z))、LPA(0:0/18:0)、二十四碳六烯酸、二氢鞘胺醇、N,N-二甲基鞘氨醇、硬脂酰肉碱，AAC+DM组较AAC组、Normal组明显升高，但与DM组比较，无明显差异，表明这些物质的产生更大程度上依赖于糖尿病这种疾病状态，对于心肌组织而言，可能只是代谢物远距离发挥生物学作用而矣，因此某种程度上可以视为糖尿病的特征代谢产物，在调节机体血糖代谢的同时，参与心肌代谢的调节。对于LysoPC(20:1(11Z))、LysoPC(P-18:1(9Z))，AAC+DM组较DM组、Normal48 天津医科大学硕士学位论文二、心功能不全合并糖尿病大鼠代谢组学研究组明显升高，但与AAC组比较，无明显差异，推测这些物质的产生与心功能不全密切相关，而与糖尿病没有明显相关性，或许未来可以作为心功能不全的特征代谢物应用于临床。对于LysoPC(18:1(9Z))、甘氨酰基羟脯氨酸、D-葡萄糖而言，AAC+DM组较Normal组明显升高，与其它组比较，差异不明显，由此推测这些物质在机体心功能不全和糖尿病状态均有可能产生。心肌组织代谢组学则从器官代谢角度对生物体内源性物质代谢改变作出诠释，本研究结果鉴定出有差异性的物质包括苏糖酸、肌醇、2,5-二氯-4-氧代-2-烯己二酸、L-门冬氨酰-4-磷酸盐、LysoPC(16:0)、LPA(18:1(9Z)/0:0)、二氢尿嘧啶、LysoPC(18:1(9Z))、四氢噻唑-2-硫酮-4-羧酸、L-次甘氨酸A。我们不难发现，心肌组织代谢与血清代谢存在明显差异，溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸在组织中含量较血清明显减少，结合物质来源富集分析，推测原因可能源于心肌组织本身很少甚至几乎不产生，更多的是受血液循环中溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸含量的影响。5.通过代谢物富集分析及路径影响权重分析分析，影响疾病代谢的主要路径为甘油磷脂代谢通路、鞘磷脂通路等，涉及物质主要包括溶血磷脂酰胆碱（LPC）、溶血磷脂酸（LPA）、1-磷酸鞘胺醇（S1P）、N,N-二甲基鞘胺醇（DMS）等。机制涉及机体氧化应激、线粒体及细胞膜破坏、能量代谢转移、胰岛素抵抗等多方面。总之，上述代谢产物在不同疾病状态下，含量存在明显差异，它们作为起始物、产物或衍生物涉及并参与机体甘油磷脂、鞘磷脂、胆汁酸、脂肪酸等多种代谢通路，最终对疾病的发生发展起到了关键作用。49 天津医科大学硕士学位论文结论结论1．采用腹主动脉缩窄2个月后腹腔单次注射45mg/kgSTZ的方法诱导心功能不全合并糖尿病动物模型，方法简便可靠，稳定性高。模型的成功构建，为后期实验研究奠定了基础，同时为临床疾病研究提供新方法及新思路。2．本研究采用代谢组学中常用的超高效液相色谱-质谱联用技术平台对不同疾病代谢模型（正常、糖尿病、心功能不全、心功能不全合并糖尿病）血清及心肌组织样本进行检测，利用SIMCA-P+12.0.1.0模式识别方法成功构建PCA（主成分分析）及OPLS-DA（正交偏最小二乘判别法分析）模型，最终在血清中筛选并鉴定出30个特征性代谢物，主要包括：肾上腺素、胆酸类、溶血磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酸类、棕榈酸、前列腺素类、鞘胺醇类、肉碱类、D-葡萄糖等，除D-葡萄糖（降低）外，其它物质均较正常组明显升高（p<0.01）。在组织中筛选并鉴定出10个特征性代谢物，其中有意义代谢物主要包括：溶血磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酸类、肌醇、二氢尿嘧啶，除肌醇（升高）外，其它物质均较正常组明显降低（p<0.01）。3．通过初步代谢序列富集分析发现：差异性代谢物主要在鞘磷脂代谢、胰岛素信号、胆汁酸生物合成、甘油磷脂代谢中大量富集。4通过metaboanalyst路径分析发现：在血清中，鞘磷脂代谢、甘油磷脂代谢以及戊糖与葡糖醛酸转换代谢影响权重较大（0.20~0.25），而在心肌组织中，甘油磷脂代谢路径影响权重较大（0.25）。两者共同涉及代谢通路为甘油磷脂代谢路径。其中的机制包括：机体氧化应激、线粒体及细胞膜破坏、能量代谢转移、胰岛素抵抗等多种。5.在心功能不全合并糖尿病大鼠血清及心肌组织代谢中，甘油磷脂代谢路径均有涉及，但具体物质（LPC、LPA）含量异同。我们推测大量LPC、LPA的来源并非心肌本身，而是由其它器官或组织远距离产生，通过血液循环，最终靶向作用于心肌组织。总之，本研究通过对不同疾病状态下大鼠血清及组织代谢轮廓的研究，发现了与心功能不全合并糖尿病发病高度相关的特征代谢物，这些特性代谢物在相关疾病的早期预防、诊断、治疗及预后等方面具有潜在的应用价值，同时对这些特征代谢物所涉及代谢途径的深入研究，进一步解释了疾病发生发展的机制，同时为它们的治疗提供了新的靶点。50 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天津医科大学硕士学位论文综述综述代谢组学在心血管疾病及糖尿病研究中的应用1.代谢组学概述代谢组学的概念起初来源于代谢组，代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物，代谢组学，作为一门新兴学科，它沿袭了传统基因组和蛋白质组学的重要研究思想，针对生物体在一特定生理时期内所有代谢产物进行定性和定量分析，最终筛选出与疾病发生发展密切相关的代谢物质。它的概念源于上世纪70年代，由Devaux等人提出[1]，1983年荷兰科学家在国际上首先利用代谢组学方法中所包含的质谱方法对尿中代谢指纹进行初步研究，20世纪90年代初,Sauter等学者首先将代谢组分析引入植物系统诊断领域,后来Nicholson等科学家提出metabonomics的最终概念[2,3]，并在疾病机制分析、初步诊断、后期治疗等方面做了大量的显著工作。实际上，代谢组学方法的研究基础是组群指标分析，它的目标是信息建模与系统得整合，对象大多是相对分子质量1000以内的小分子内源性物质。因此，根据它的最终的研究对象和研究目的的不同，OliverFiehnnl[4]等研究者曾经将对生物机体的代谢产物分析大致分为以下四个不同领域：①代谢物靶标分析(metabolitetargetanalysis)：对某些目标既定组分进行具体分析；②代谢轮廓分析(metabolicprofiling)：对某一类具体化合物（它们结构、性质高度相关）或某一（多）条具体代谢途径的中间产物或者标志性组分进行定量分析；③代谢组学：定性和定量分析一定条件下生物样品中（体液、组织等）所有代谢产物；④代谢物指纹分析(metabolicfingerprinting)：比较代谢物指纹图谱，对样品进行快速初步分类，不要求分离鉴定具体单一组分。因此，我们常规所说的包括本研究所涉及的分析方法通常是第三个层次，即先对特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量分析，筛选并鉴定潜在的差异性代谢物，然后根据所鉴定出的组分推导其所参与的代谢途径，进行疾病机制分析。日前，随着检验及仪器技术的发展，代谢组学的研究技术手段从先前的质谱（MS），色谱（HPLC，GC），核磁共振（NMR），发展到目前的色谱质谱联用技术，可谓上了一个更高的台阶。通常，研究者首先通过检测一系列血清、组织或提取物等样品的NMR谱图，再结合模式识别方法，便可找出与之相关的生物标志物及其代谢途径，以初步推测出机体的病61 天津医科大学硕士学位论文综述理生理状态，并有可能更大程度上为相关预警信号提供一个提前预知平台，便于疾病早期诊断与干预，从而改善临床疾病预后；其次通过对内源性特征性代谢物及代谢途径进行联系、分析、推导，可进一步明确疾病发生发展的关系及内在分子机制，为临床疾病治疗提供新的靶点。科研工作中，代谢组学的研究样品[5,6]主要是尿液、血浆或血清、唾液等生物体液以及细胞或组织的研磨提取液。不同的样品有着各自独特的反应优势，同样有着自己的弊端。首先，生物体液（尿液、血浆或血清、唾液）中的代谢物质与机体细胞、组织整体代谢水平及状态密切相关，而且其获取方式相对简单，对机体基本没有创伤，患者容易配合理解，所以现阶段最常用于临床及实验室研究。可是很多疾病引起的代谢物质或通路改变可能只有在局部微环境（组织）下才可以检测得到，所以这时候组织代谢在某种程度上更加能够直接反应机体代谢状态。但是它也有自身缺陷，一来，缺乏尿液或血液样本研究的实时监控性，组织一旦被提取，观测对象完整性即遭到破坏或被迫停止，二来，临床组织标本提取有时候存在很大难度和危险性，而且不容易被患者所接受。再者，在进行动物组织代谢组学研究时可能需要大量动物，这样就扩大了动物间的个体差异[7]，实验结果可信度明显降低。实验过程可能是任何一项研究的骨架。对于代谢组学而言，它的研究步骤大体可归纳为五大部分：样本获取、样本预处理、分离代谢产物、检测与鉴定、数据分析与模型建立。这样的过程首先涉及样品提取及预处理，然后样本上机，对原始谱图的数据进行提取、峰对齐、去噪等技术处理，然后通过系统自带的模式识别技术对预处理数据进行初步分析，获取有用的信息。其中的方法主要有两种[8,9]，一种是有非监督模式，另一种是有监督模式。非监督模式方法主要包括主成分分析(PCA)、非线性映射(NLM)和聚类分析(HCA)，即按样本本身所持有的特性对原始数据进行分类，最终会把具有类似特性的数据归为一组，用相应的可视化技术表达，分析过程不掺入人为因素。有监督模式方法主要有偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法判别分析法(PLS-DA)、人工神经网络(ANN)和正交信号校正法(OSC)，即已经具有现成的样本信息储备，然后在这样的基础上构建信息组，紧接着利用所构建的信息组对未知数据进行分类、识别及预测。任何一种方法，最终都会殊途同归：达到良好的组群区分。我们的实验研究采用的就是上述主成分分析方法（PCA）和正偏最小二乘法判别分析法(OPLS-DA)。代谢组学从研究者角度讲，是继传统基因组学、蛋白质组学、转录组学后62 天津医科大学硕士学位论文综述的新兴“组学”，但与传统基因组学、蛋白质组学、转录组学相比，它具有自己独特的优势[10]：①放大效应，基因以及蛋白的生物表达通常是微小变化，组学则使得这种微小的变化得以有效放大，从而有利于代谢物的检测；②简化实验，无需建立全基因组以及表达序列的特征化数据库。代谢组学可以直接利用标准品比对以及二级质谱扫描结合相应质荷比即可初步得出结果，从而使得研究步骤更加简化；③代谢物种类少，有利于分析。特征代谢物的种类要远远小于基因和蛋白的数目。众所周知，一个个体基因至少有几万甚至几十万个，而目前代谢产物最多不超过数千个；④代谢产物具有通用性、借鉴性；⑤更高的宏观层面分析，基因组学是从基因层面探寻生命的活动，蛋白质组学则从蛋白层面追寻生命的根源，而我们知道，实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如能量传递，细胞信号释放（cellsignaling）、传递，细胞间通信等都是受代谢物调控的。因此，很久前代谢组学在药物毒性和机理、微生物和植物研究所取得的成果在现如今疾病诊断、基因功能、中药安全性评价、毒性基因组学、营养基因组、整合药物代谢和系统毒理学等研究领域同样能够获得了较广泛地应用，而且取得了新的突破和新进展。对于代谢组学来讲，可以说是基础上的成功跳跃，打破了传统基因组学、蛋白质组学、转录组学思想，实现了质的飞越。在很多情况下，机体大多数代谢通路与其他代谢路径交互影响，而不是孤立存在的。因此某种疾病的发生在一定程度上会导局部组织乃至全身多种代谢产物的改变。随着机体病理进一步恶化，其代谢产物也会产生相应的改变。对这些代谢产物的变化进行动态数据采集、分析，寻找疾病相关的biomarker，有助于临床对疾病的早期诊断及分型，便于疾病早期干预治疗，从而最大程度上改善患者的预后。相对于基因组学、蛋白质组学、转录组学来讲，代谢组学应用起步较晚，尤其对于临床疾病诊断的应用，最近几年刚刚兴起，因为起初仅仅是植物的应用性研究，但与传统研究方法相比，代谢组学很快已显示出它的强大优势，且发展越来越迅速，因为有人说过“代谢组学不仅能够告诉你机体发生了什么，而且能够告诉你它是如何发生的！”。因此，代谢组学在临床及疾病动物模型研究中的应用前景十分广阔。2.代谢组学在心血管疾病研究中的应用心血管疾病，又称为循环系统疾病，主要涉及心脏、动脉、静脉、微血管等领域。近年来，心血管疾病的发病率及病死率逐年增高，且年龄趋向于低龄63 天津医科大学硕士学位论文综述化，在国内40岁以上人群的死亡原因中，主要是心、脑血管疾病。心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段，高发病率，高死亡率严重影响着病人的生活质量，同时大多心血管疾病发病隐蔽，机制有待进一步发现。因此，心血管疾病发病的病理生理过程及分子机制、药物选择及干预一直是近来临床及实验室研究的热点。对于机体而言，任何一种疾病的病理生理改变，首先会引起它的基础和能量代谢产生对应变化，进而引起细胞或组织内内源性小分子代谢物种类或含量发生对应改变，最终与正常个体或组织之间代谢轮廓发生显著差异，这种差异往往可能先于临床症状出现，更大程度上为疾病相关预警信号提供一个提前预知平台，临床就能够早期进行必要的干预与治疗。因此，利用代谢组学平台监测或者寻找这些差异，找到与疾病发生发展密切相关的biomarker，是实现临床疾病早期诊断的一个简单、可行、无创的方法。虽然代谢组学应用于临床心血管疾病诊断较其它诊断学方法起步晚，但与传统医学诊断方法相比，它很快已经显示出强大优势，且作为后起之秀，发展颇为迅速。2.1在心血管疾病诊断中的应用随着双源高分辨率CT的问世，冠心病的诊断发生也不再专一化，但是由于其检查费用昂贵，不是完全真实显示冠脉内在情况且不能实时对病变血管进行干预，因此到目前为止，冠状动脉造影术以其独特的优越性，仍然是冠心病诊断的主要方法，是金标准。它的确诊率高，但是也有内在缺点：风险高、创伤性较大、造影剂对患者肾功能要求及影响较大等。因此，对心血管疾病拥有更加廉价、安全、有效地诊断方法提出了挑战。心血管疾病biomarker的发现和筛选对于心血管疾病的发生发展、机制分析、诊断、治疗、预后发挥着十分重要的作用，目前部分已经成功地应用于临床心血管疾病的早期诊断及晚期心血管不良事件的预测，如心肌酶、BNP、D-dimer等。早在20世纪初，Brindle[11]等人就开展了心血管疾病代谢组学方面的研究，他们提出，代谢组学方法不但能够作为技术手段对冠心病作出早期诊断，而且还能通过代谢轮廓对冠心病不同冠脉病变程度进行分类，他们找到的biomarker主要为脂蛋白类物质。后来Nicholson等同样也采用类似的代谢组学的方法实现了对冠心病及其严重程度的诊断。2011年英国皇家医学院开辟了用“组学”生物指纹图谱方法监测患者病情进展、预测危险程度的新领域，他们成功采用患者血清代谢组学中生物指纹图谱的方法对冠心病患者心脏病变的危险程度进行了评估，同样，Sabatine[12]采用64 天津医科大学硕士学位论文综述代谢组学方法，选取心肌缺血患者作为研究对象，利用质谱-色谱技术分析了运动负荷试验前后患者血液中的代谢产物，结果中有6个代谢产物含量较正常组发生明显改变，恰好这6个代谢产物参与了柠檬酸循环，因此，推荐这些指标可以对心肌缺血进行诊断。Barba[13]等亦做过类似研究，选取疑有劳力型心绞痛(无MI)的患者，其中22名经PET-CT显示有心肌灌注损伤的患者作为实验组，9名正常者作为对照组，运动负荷试验后对各组血清样本进行代谢组学分析，发现绝大多数的患者可以被模型正确区分，差异性物质主要集中在葡萄糖，乳酸盐，长链氨基酸等。Lewis[14]等以接受乙醇局部注射治疗肥厚梗阻型心肌病的患者为研究对象，采集治疗前后不同时点的血液标本，对照组设置为心导管检测结果为阴性的患者，MI患者作为阳性对照（验证组），进行代谢组学研究，结果发现在治疗10min后，参与三大途径(嘧啶代谢、三羧酸循环代谢和磷酸戊糖途径)相关代谢产物即可以初步检测到变化。Kang[15]等选取缺血性心力衰竭患者为研究对象，利用代谢组学方法分析其尿液代谢物，尝试联系心衰代谢通路，寻找特征性标记物，结果显示，心力衰竭组患者能量代谢发生明显改变，同时伴有醋酸盐、丙酮等水平的改变。Zha[16]等选取仓鼠作为实验对象，高脂饮食喂养建模，然后利用代谢组学平台构建PCA和PLS-DA模型，分析其血清代谢物，结果提示：机体从最初的正常到高脂血症再到动脉粥样硬化（AS），是一个缓慢的连续进展过程，且具有一定循序渐进性，实验最终筛选并鉴定出21个特征离子作为AS的代谢标志物，为临床高脂血症及AS的诊治提供了参考。除了大量小型临床研究外，代谢组学平台在大型队列研究中也得到了很好的应用。Zheng[17]等进行的一项长期血压随访研究，发现患者基线血液中4-羟基马尿酸乙酯代谢含量与随后患者患上高血压风险呈明显正相关，提示该物质或许可以在临床常规作为高血压的预防和筛查。Shah[18]等同样应用代谢组学分析方法对冠心病患者进行为期多年的大规模随访研究，发现支链氨基酸的水平（含量）可以作为冠状动脉患者不良心血管事件预测因素，提前监测事件发生，指导临床早期干预。2.2在心血管疾病药物治疗中的应用代谢组学技术除了可发现疾病状态下代谢物的特征性改变，从而发现biomarker，用于疾病早期诊断外，还可以实现对特征代谢物轮廓的监测和靶向分析，从而从多种代谢途径（通路）构建机体代谢路径及病理生理改变与药物65 天津医科大学硕士学位论文综述靶向治疗之间的内在联系，一来明确机体疾病发病的分子机制，二来从代谢途径评价这些药物对心血管疾病的作用，包括治疗效果、作用及达峰时间、剂量效应、不良反应等。众所周知，临床中降低心血管疾病风险更大程度上在于改善血管状况，因此高酯患者降脂治疗刻不容缓。目前最普遍的是调脂他汀类药物，包括最常应用的可定、立普妥等。Kaddurah-Daouk[14]等为了评价他汀类药物具体疗效在不同个体间的差异，曾就应用代谢组学分析血浆中的脂质代谢，结果发现对他汀类药物响应者代谢较正常组异常复杂，其中基础磷脂代谢产物及胆固醇脂水平与治疗后血浆中LDL-C水平明显相关，为高血脂患者的个体化治疗提供了借鉴，这为2011年欧洲血脂异常管理指南中提出的降脂目标：“1850”提供了有利证据，即：低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降至1.8mmol/L（70mg/dl）以下，或在原有基线上降低50%以上。因此，代谢组学作为一门新兴学科，一项新技术，一个新的诊断方法，在心血管疾病的诊断、治疗、预后等领域发挥着越来越重要的作用，相信在不久的未来，代谢组学平台将遍及每一个三甲医院及科研机构，为临床和实验室心血管疾病研究作出不可磨灭的贡献。3.代谢组学在糖尿病研究中的应用糖尿病（DM）是一组以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病，是继肿瘤、心血管疾病之后危害全人类健康的第三大杀手[20]。据国际糖尿病联盟（IDF）统计，截止2007年，全球糖尿病患者约为2.46亿人，预计到2025年，全球将有3.8亿人受到糖尿病的困扰[21]。每年死于糖尿病并发症的人数约有130万，居于世界首位[22,23]。人口老龄化和居民生活方式的改善使得我国的糖尿病患病率呈现逐年上升趋势。据国家卫生部调查显示，我国每天约新增3000例糖尿病患者，每年约增加120万例。据不完全统计，我国每年有糖尿病造成的直接医疗支出已经接近1730多亿元。由于糖尿病发病隐匿，初期无明显症状，潜伏期很长，且病情进行性发展不可逆转，因此我国大约有75%的糖尿病患者未能得到及时诊治。多年中国心脏病调查组就曾发现：在冠心病急诊患者中，仅将患者空腹血糖值是否正常作为糖尿病筛选指标，将导致80.5％的糖尿病患者被漏诊[24,25]，而大多数医院做到的往往是这一点。由于不能及时得到有效的干预、诊断及治疗，因此临床上超过30%的新诊断糖尿病患者往往已经存在各种潜在并发症，这对于后期的治疗明显不利。因此对于糖尿病进行早期临床筛查、早期诊断和66 天津医科大学硕士学位论文综述早期治疗显得尤为重要。3.1代谢组学在糖尿病诊断中的应用对于人类基因组测序工作而言，目前基本已经完成，但是结果并不是我们想象的那么美好，即能够通过对基因的检测而诊断所有疾病，事实并非如此，因为基因表达调控与机体的整体功能之间的关系仍不是很清楚。所以近年来科学家的研究热点从起初的基因组学扩展到了蛋白组学、代谢组学等各种“组学"。因此，代谢组学研究技术的出诞生是生命科学研究的必然，代谢产物水平或含量是由机体代谢途径中所有酶的种类、活性及底物共同决定的，与机体的生理、病理状态密切相关。因此，代谢组学能从疾病诊断的角度为临床和实验室研究提供新的思路。近年来，在糖尿病研究领域，资料显示代谢组学不失为一个好的研究方法，作为一门高通量研究技术，它可以用来对糖尿病及其并发症的所有代谢进行初步分析，从而筛选出差异性代谢物，为疾病发生发展的分子机制及诊断作出参考。Wang[26]等借助代谢组学平台，对糖尿病患者血清进行代谢轮廓分析，发现脂类物质代谢水平发生明显改变，说明糖尿病患者糖代谢异常的同时伴随脂质代谢的紊乱，从而为其诊断及治疗提供了新的思路。糖尿病发病通常是一个隐匿的过程，很多不被患者所知晓，因此，曾有学者[27]提出利用代谢组学寻找到预防糖尿病发生的有效方法，实验选取糖耐量受损患者和正常受试者作为代谢研究对象，采用靶向代谢组学方法采集受试者血液及尿液代谢指纹图谱，研究发现糖耐量受损者胆汁酸（CA）、溶血磷脂胆碱（LPC）、脂肪酸(FA)、色氨酸(Try)、尿酸(Uricacid)含量发生明显变化，差异具有统计学意义且能完整区分开糖耐量受损患者和正常受试者，因此，被提示作为2型糖尿病（2-DM）的特征性差异性代谢物质，为如何鉴定早期无症状2型糖尿病提供了一种行之有效的方法，同时为糖尿病早期诊断与干预提供了可能。糖尿病早期，临床实验室检测所能发现的可能仅仅是患者的空腹血糖受损，而其具体代谢变化不为所知，Zhao[28]为我们提供了初步解释，他们对空腹血糖受损患者（血浆和尿液）进行了代谢分析，结果发现：较正常组，空腹血糖受损患者血清及尿液中马尿酸等物质含量明显减少，提示我们如果临床患者检测到这些物质的含量降低，糖尿病患病风险将会明显升高。同样，Wang-SattlerR[29]等人也对空腹血糖受损和正常血糖者的血清样本进行代谢组学研究，最终筛选并鉴定出140个代谢产物，为早期67 天津医科大学硕士学位论文综述预防和诊断2型糖尿病提供了新的参考与手段。临床中对于糖尿病患者的鉴定往往依靠的是口服葡萄糖试验（OGTT），而如何从代谢角度去分析糖尿病患者与正常者的异同，Wang[30]等人给我们提供了依据，他们应用代谢组学方法对糖尿病患者磷脂代谢图谱进行研究，结合多变量分析，成功对糖尿病患者和正常者进行了区分，筛选出了潜在区分二者的标志物，对糖尿病早期诊断和预防有着重大意义。众所周知，糖尿病作为一个代谢性疾病，可能涉及到的不仅仅是糖代谢的异常，也会有脂质代谢的紊乱。因此，Xu[31]等人对血糖值<7mmol和>7mmol的受试者血浆中脂肪酸进行了代谢色谱分析，结果表明脂肪酸C16：0等可能作为高血糖的生物标志物。Liu[32]等人曾对三组患者（餐后血糖超标、2-DM、正常组）血清中的脂肪酸进行代谢组学分析，提示棕榈酸，硬脂酸等是重要的biomarker。众所周知，临床上糖尿病的可怕之处并不完全在于高血糖本身，而是一系列的器官及微血管并发症，由此造成的致死率及致残率比糖尿病本身高出很多，同时给家庭及社会医疗带来巨大负担。因此，糖尿病发展初期的病情监测及机制研究将会是未来研究领域的热点和重点话题。Yi[33]等采用GC-MS对DM患者、DM+CHD患者中血浆进行代谢分析，成功地应用代谢谱对二者进行了区别。Zhang[34]等收集了正常人、DM患者、糖尿病肾病患者的血清，并进行了代谢产物分析,发现了氨基酸代谢和磷酸代谢途径的异常，推测这两种代谢途径有可能参与糖尿病并发症的发生。因此，代谢组学技术在糖尿病诊断中得到了广泛的应用3.2代谢组学在糖尿病治疗中的应用代谢组学从某种程度上讲代谢轮廓能够从更加直观的角度诠释不同疾病状态下机体内小分子内源性物质层面的代谢变化趋势，分析这一趋势中所蕴含的内源性代谢信息，筛选出影响代谢的关键因子即找到显著差异的特征代谢物质，进而联系、分析这些物质所参与的代谢通路及其中间环节，构建药物与机体之间代谢路径及病理生理变化之间的联系，可用于评价降糖药物对糖尿病治疗的效果。Cai[35]等应用药物代谢组学手段，对米格列奈用于治疗STZ诱导的糖尿病小鼠进行了初步研究，结果发现枸橼酸盐、肌酐、胆汁酸、苯丙氨酸等物质水平发生显著改变，这样以来就进一步对促泌剂的降糖机制作出了深层次解释。同样，Huo[36]等研究人员发现二甲双胍治疗糖尿病后，患者血清代谢发生了明显改变。同时亦有研究对口服降糖药疗效进行代谢组学研究同时，对患者临床血68 天津医科大学硕士学位论文综述清生化指标进行监测，结果发现，在患者糖尿病临床症状出现前，尿液中的代谢组分已经发生明显改变，从而说明代谢组学可用于降糖药疗效快速监测和评价。在中医学领域，代谢组学应用更加普遍。Gua[37]等研究揭示给予小檗碱治疗后，机体13种游离脂肪酸水平发生明显改变，较正常组含量明显减少，因此推测小檗碱能够干预糖尿病患者的脂肪酸调节机制，从而达到降糖目的。Niu[38]等人采用尿液代谢组学，对人参多糖在小鼠体内的降血糖机制进行深入研究，发现人参多糖治疗2型糖尿病的机制与机体核酸代谢、脂质代谢、葡萄糖代谢密切相关，从而使得我们对疾病的药物治疗有了更深层次的认识。4.前景与展望目前代谢组学正处于青壮年时期，属于快速发展阶段，起初仅仅是植物的应用性研究，而如今，它在临床疾病的研究应用上初步呈现了一定的优势和成果，且发展越来越迅速。相信未来伴随着检验仪器的更高通量、高灵敏度检测手段和更高效的数据分析方法的跟进，以及与基因组学、转录组学、蛋白质组学等各种“组学”技术的联用，有关人类疾病机制的研究将更加科学、合理和完善，到时候它的的应用也会更加广泛，从而为人类健康事业做出巨大贡献。当前国内外对心血管疾病及糖尿病的代谢研究大多局限于某类内源性小分子代谢物（biomarker）的发现，数据分析、处理技术的进一步改良，具体内在代谢通路的探寻。而始终没有对整体代谢网络进行构建，缺乏有效的统一。因此，在今后的科研工作中，需要更多的研究者、专家通过整合相关代谢产物信息，结合计算机处理，构建代谢组学整体网络。同时组学研究，结果的可靠性主要取决于高通量仪器及其质控、标准品的制备、实验室条件的归一，而就目前来说，国内外文献人云亦云，哪怕是同一种疾病，最终的代谢结果差异甚是显著，可信度明显降低，因此，在未来的研究过程中，不同实验室的标准需要进一步统一。相信在不久的将来，代谢组学作为一门新兴的“组学”技术—将成为临床心血管疾病及糖尿病诊断最有力最可靠的工具，从而为全人类的健康作出巨大的贡献。69 天津医科大学硕士学位论文综述综述参考文献[1]OttKH,AranibarN,SinghB,eta1.Metabonomicsclassifiespathwaysaffectedbybioactivecompounds.ArtificialneuralnetworkclassificationofNMRspectraofplantextracts[J].Phytochemistry,2003,62(6):971-985.[2]NicholsonJK,LindonJC,HolmesE,eta1.Metabonomics:understandingthemetabolicresponsesoflivingsystemstopathophysiologicalstimuliviamultivariatestatisticalanalysisofbiologicalNMRspectroscopicdata[J].Xenobiotica,1999,29(11):1181-1189.[3]ContiF,ManganaroM,MiccheliA,eta1.Metabolomicsandmedicalpractice[J].ClinTer,2006,157(6):549-552.[4]FiehnO.Combininggenomics,metabolomeanalysis,andbiochemicalmodellingtounderstandmetabolicnetworks[J].CompandFunctGenomics,2001,2,155-168.[5]Liu,Y;HuangR;LiuL,eta1.MetabonomicsstudyofurinefromSprague～DawleyratsexposedtoHuang-yao-ziusing1HNMRspectroscopy[J].JPharmBiomedAnal,2010,52(1):136-141.[6]ShenQ,LiX,SuM,eta1.Metabonomicandmetallomicprofilingintheamnioticfluidofmalnourishedpregnantrats[J].JProteomeRes,2008,7(5):2151-2157.[7]PriceKE,LunteCE,LariveCK,eta1.Developmentoftissue~targetedmetabonomics.Part1.Analyticalconsiderations[J].JPharmBiomedAnal,2008,46(4):737-747.[8]WeckwerthW,MorgenthalK.Metabolomics:frompatternrecognitiontobiologicalinterpretation[J].DrugDiscover2005,10(22):1551-1558.[9]LiJ,WuXJ,LiuCX,eta1.Applicationofnewmethodfordataprocessinginmetabonomicstudies[J].YaoXueXueBao,2006,41(1):47-53.[10]TaylorJ,KingRD,AhmannT,eta1.Applicationofmetabolomicstoplantgenotypediscriminationusingstatisticsandmachinelearning[J].Bioinfomutics,2002,18(suppI2):241-248.[11]BrindleJT,AnttiH,HolmesE,eta1.Rapidandnoninvasivediagnosisofthepresenceandseverityofcoronaryheartdiseaseusing1H-NMR-based70 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天津医科大学硕士学位论文致谢在硕士研究生生涯即将结束之际，向三年来给予我关心帮助的老师、同学和家人表示最诚挚的谢意！首先，衷心的感谢我的导师李彤教授。感谢您生活中给予我的悉心关怀，学业上给我的精心指导，临床、科研中对我的严格要求。三年来，我的每一点进步都来自您的精心指导，每一点成长都凝聚着您的心血。毕业论文无论从选题、设计、实施、还是最终的撰写、修改、定稿都离不开您的悉心指导。导师渊博的知识、精湛的外科手术技术、严谨的治学态度深深感染了我，让我获益匪浅。在这篇论文完成之际，学生向您致以最真挚的谢意和最真诚的祝福，祝您身体健康，桃李满天下！衷心感谢心脏中心胡晓旻、段大为、刘迎午、刘博江主任医师在临床学习过程中对我真诚、耐心的教导和无私的帮助；同时感谢6病区吴鹏、王赟赟主治医师，稂与恒、高文卿、宁萌在临床带教过程中给我提供的照顾与关心。衷心感谢天津市第三中心医院动物实验室李老师、检验科张磊、肝研所高英唐、杨斌等老师在实验过程中给我提供的支持和帮助。衷心感谢我的同门巫菲、师兄马群兴、师姐杨玲等同学在实验设计、实施，论文撰写、修改等过程中给我提供的宝贵意见。三年幸福而快乐的相处是缘分也是荣幸，感谢你们的陪伴。衷心感谢我的室友刘建山、田昊、高静达、邢晨在生活上给予的关心和帮助，三年的相处充满了无尽的欢乐，让身在他乡的我们彼此感到家的温暖，无论将来身在何处，愿你们幸福。最后，感谢给予我无私关爱的爸爸妈妈，你们的理解、支持和鼓励是我完成学业和不断成长的最大动力。随着时间的流逝，我渐渐长大了，你们也渐渐老了，但是唯独不变的是子女的这颗心，这颗感恩的心。74 天津医科大学硕士学位论文姓名：李田乐性别：男出生年月：1990年7月籍贯：安徽省主要学习和工作经历：2009年9月-2013年6月安徽理工大学医学检验专业，获理学学士学位2013年9月-2016年6月天津医科大学胸心外科专业，攻读医学硕士学位75
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