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分类号：R338.2密级：公开学校代码：11065学号：Y2011130746学术硕士学位论文姜辣素对糖尿病胃轻瘫大鼠ghrelin表达及胃排空的影响作者姓名谢鹏昆指导教师徐珞教授学科病理学与病理生理学培养单位医学部基础医学院答辩日期2017年11月19日 姜辣素对糖尿病胃轻瘫大鼠Ghrelin表达及胃排空的影响摘要目的：糖尿病，是一种常见的伴有高血糖慢性代谢紊乱性疾病，已经成为威胁人类健康的第三大杀手，仅次于肿瘤和心血管疾病。糖尿病患者多伴有消化系统异常，其中最常见的是胃轻瘫。糖尿病胃轻瘫患者胃排空减缓，胃运动下降。目前糖尿病胃轻瘫的治疗主要是以缓解症状为主。有研究发现，30-50%的糖尿病患者受胃轻瘫困扰，糖尿病胃轻瘫的主要发病机制为高血糖引起的自主神经病变、激素水平改变以及肠神经系统功能障碍。姜辣素是生姜提取物，主要成分有姜酚及姜烯酚。有研究发现，姜辣素具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病及心血管疾病的作用[18,19]。慢性高血糖可导致葡萄糖氧化、蛋白质氧化以及脂质氧化，促进自由基产生，从而导致氧化应激[20,21]。目前关于姜辣素的抗氧化作用能否降低血糖，缓解糖尿病胃轻瘫及其机制的研究较少。本研究旨在探讨姜辣素是否能通过抗氧化应激效应改善或缓解链脲佐霉素（STZ）诱导的糖尿病大鼠胃动力障碍及潜在作用机制。方法：制备STZ诱导糖尿病模型大鼠：大鼠给予高脂饮食饲养4周，腹腔注射1%STZ（35mg/kg，溶于0.1M柠檬酸缓冲液中），注射后第8天再次腹腔注射35mg/kg链脲霉素。对照组注射同体积的柠檬酸缓冲液。第2次注射结束72h后进行口服糖耐量测试（3.0g/kg），2h后测量大鼠血糖浓度、血浆胰岛素水平、以及计算胰岛素抵抗（IR）指标。选取血糖值高于200mg/dL的大鼠做为实验组进行后续实验[24]。经检测，正常对照组大鼠血浆胰岛素含量为22.74±4.22μIU/mL，IR为5.1±0.81；实验组大鼠血浆胰岛素含量为21.91±5.62μIU/mL，IR为18.7±1.54。姜辣素（150,300,600mg/kg）从第2次注射STZ后的第8周开始灌胃，给药28天。观察姜辣素对糖尿病大鼠血糖、胃组织超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量改变，以及对血浆和胃组织ghrelin及其mRNA表达和胃排空的影响。结果：STZ诱导的糖尿病大鼠血糖明显升高（P<0.05），胃组织中SOD、CAT和GSH水平较正常大鼠显著降低（P<0.05），而MDA水平显著升高（P<0.05）。与正常大鼠比较，糖尿病大鼠血浆ghrelin和胃内ghrelinmRNA表达水平明显升高（P<0.05），但胃内ghrelin表达显著降低（P<0.05），且糖尿病大鼠的胃排空率显著降低（P<0.05）。糖尿病大鼠经28天的姜辣素灌胃治疗，与糖尿病NS组比较，大鼠血糖明显降低（P<0.05），胃组织中SOD、CAT和GSH水平显著回升，MDA水平显著回降，且呈显著量效依赖关系（P<0.05~0.01）；糖尿病大鼠经姜辣素治疗后，血浆ghrelin和胃内ghrelinmRNA表达降低（P<0.05），而胃组织内ghrelin表达显著增加（P<0.05），I 胃排空率也显著得到改善（P<0.05）。结论：在糖尿病胃动力障碍病理状态下，姜辣素可能通过提高组织抗氧化应激能力，力求维持机体代谢相对平衡，使血糖趋于稳态、改善胃动力，Ghrelin可能也参与了该过程的调控。硕士研究生:谢鹏昆(病理生理学)指导教师:徐珞（教授）关键词：姜辣素；糖尿病胃轻瘫；ghrelin；胃排空；氧化应激II TheEffectofGingerolontheExpressionofGhrelinandGastroparesisinGastricTissuesofStreptozotocin-inducedDiabeticRatsABSTRACTObjective:Diabetesmellitus,acommonmetabolicdisorderwithchronichyperglycemiaresultingfrommultipleetiologies,hasbecomethethirddiseasethatseriouslythreatenspeople'shealthfollowingtheneoplasmandcardiovasculardisease.ThereportshowsthatChinahasbeenthesecondcountrywiththelargestnumberofpeoplesufferingfromdiabetesmellitus.Digestiveabnormalityisfrequentinpatientswithdiabetesmellitus.However,oneofthemostcommondigestiveinvolvementsindiabetesmellitusisgastroparesis.Diabeticgastroparesisischaracterizedbydelayedgastricemptyingandgastricmotilitydysfunctionintheabsenceofmechanicalobstructionofthestomachandmayleadtosymptomsofnausea,vomiting,earlysatietyandabdominaldiscomfortandpai.Currently,treatmentofdiabeticgastroparesismainlycontrolssymptomsandimprovesdelayedgastricemptyingbasedonsymptomseverityandrelief,whichrangesfromdietarytopharmaceuticalintervention.Itisreportedthat,diabeticgastroparesisaffects30–50%ofthediabeticpopulationanditsunderlyingpathologicalmechanismsaremainlyassociatedwithhyperglycemiaandautonomicneuropathy,hormonelevelsandentericnervoussystemdysfunctioncausedbyhyperglycemia.Aimtoinvestigatetheeffectofgingerolongastrointestinalfunctioninstreptozotocin-induceddiabeticrats.Gingerolisgingerextract,themainingredientsaregingerolandshogaol.Astudyfoundthatgingeroleoresinhasanti-inflammatory,anti-oxidant,anti-diabetesandcardiovasculardisease.Chronichyperglycemiacanleadtoglucoseoxidation,proteinoxidationandlipidoxidation,andpromotefreeradicalproduction,resultinginoxidativestress.Theanti-oxidanteffectofgingerolcanreducebloodsugar,alleviateondiabeticgastroparesisanditsmechanismisless.ThepurposeofthisstudywastoinvestigatewhethergingerolcanimproveorrelievegastricmotilitydisorderinSTZinduceddiabeticratthroughtheanti-stresseffectandtoinvestigatetheunderlyingmechanisms.Methods:PreparationofSTZinduceddiabeticratmodel.Ratswerewasfedahighfatdietfor4weeks,andwasreceivedanintraperitonealinjectionofafreshlypreparedsolutionof1%streptozotocin(35mg/kg,dissolvedin0.1Mcitricacidbuffer).Theratswereinjectedwith35mg/kgSTZagainonthe8thdayafterthefirstinjection.Thecontrolgroupwasinjectedwiththesamevolumeofcitricacidbuffer.Theratsunderwentanoralglucosetolerancetest(glucose,3.0g/kgbodyweight)at72hafterthelastinjectionofSTZ.After2h,bloodglucoseconcentration,plasmainsulinlevel,andinsulinresistance(IR)indexweremeasured.Theanimalswereconsideredasdiabeticiftheirbloodglucosevalueswereabove200mg/dl2hpostglucoseintakeandselectedforfurthersubsequentIII studies.Aftertesting,theplasmainsulinofcontrolgroupwas22.74+4.22IU/mL,andIRwas5.1+0.81.Theplasmainsulinoftheexperimentalgroupwas21.91+5.62IU/mL,andtheIRwas18.7+1.54.Gingerolwasadministratedintragastricallyatadoseof150,300and600mg/kg/daytodiabeticrats.After28dayst,assayedtheactivityofsuperoxidedismutase(SOD),catalase(CAT),thecontentofreducedglutathione(GSH),malondialdehyde(MDA)ingastricmucosaandgastricemptying.Results:ThebloodglucoseandthelevelofMDAindiabeticratsinducedbySTZwassignificantlyincreased(P<0.05),andthelevelsofSOD,CATandGSHingastrictissuesweresignificantlylowerthanthoseinnormalrats(P<0.05).Comparedwithnormalrats,theexpressionofplasmaghrelinandstomachghrelinmRNAwassignificantlyincreasedindiabeticrats(P<0.05),buttheexpressionofghrelininstomachdecreasedsignificantly(P<0.05),andgastricemptyingindiabeticratswasdecreased(P<0.05).After28daysofgingerolgavagetreatment,comparedwithdiabeticNSgroup,thebloodglucoseofratsdecreasedsignificantly(P<0.05).ThelevelsofSOD,CATandGSHweresignificantlyincreasedingastrictissues,ThelevelofMDAdecreasedsignificantly,andtherewasasignificantdosedependentrelationship(P<0.05~0.01);Afterthegingerolgavagetreatment,plasmaghrelinandgastricghrelinmRNAexpressiondecreased(P<0.05),Theexpressionofghreliningastrictissuewassignificantlyincreased(P<0.05),andthegastricemptyingratewasalsosignificantlyimproved(P<0.05).Conclusion:Thestateofpathologyofdiabeticgastroparesis,gingerolcouldenhancetheanti-oxidativecapacityoftheorganization,inordertomaintaintherelativebalanceofmetabolismandbloodglucose,tendstoimprovegastricmotilityandghrelinmaybeinvolvedintheregulationoftheprocess.Doctorstudent:XiePengkun(pathophysiology)Directedby:Prof.XuLuoKeywords:Gingerol;Diabeticgastroparesis;Ghrelin;Gastricemptying;OxidativestressIV 目录引言·······································································································································1材料与方法···························································································································21实验动物····························································································································22糖尿病模型制备················································································································23实验药品与试剂················································································································23.1主要试剂配制············································································································23.2实验药品····················································································································33.3主要实验仪器············································································································44实验设计····························································································································44.1姜辣素对大鼠胃组织ghrelin表达的影响····························································44.2姜辣素灌胃对大鼠胃排空率的影响········································································55过氧化物歧化酶（SOD）活性测定··················································································56过氧化氢酶（CAT）活性测定··························································································67还原型谷胱甘肽（GSH）测定··························································································78丙二醛（MDA）MDA测定·································································································79Ghrelin蛋白及ghrelinmRNA检测··············································································89.1放射免疫法（RIA）测定血浆和胃组织ghrelin含量·········································89.2RT-PCR测定胃组织ghrelinmRNA表达································································910荧光免疫组织化学实验································································································1111统计学分析···················································································································12实验结果·····························································································································131姜辣素灌胃对糖尿病大鼠血糖的影响·········································································132姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃组织SOD、GSH、CAT和MDA水平影响·························143姜辣素灌胃对糖尿病大鼠ghrelin及其ghrelinmRNA水平的影响·······················164姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃排空的影响·····································································18讨论·····································································································································20结论·····································································································································23参考文献·····························································································································24综述······································································································································271 综述参考文献······················································································································38攻读学位期间的研究成果··································································································43致谢······································································································································44学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明······················································452 引言引言糖尿病是一种常见的伴有高血糖慢性代谢紊乱性疾病，已经成为威胁人类健康的第三大杀手，仅次于肿瘤和心血管疾病[1]。糖尿病患者多伴有消化系统异常[2]，其中最常见的是胃轻瘫[3-5]。糖尿病胃轻瘫患者胃排空减缓，胃运动下降[6,7]。目前糖尿病胃轻瘫的治疗主要是以缓解症状为主[8]。有研究发现，30-50%的糖尿病患者受胃轻瘫困扰[9]，糖尿病胃轻瘫的主要发病机制为高血糖引起的自主神经病变、激素水平改变以及肠神经系统功能障碍。Ghrelin是1999年由Kojimaetal.[10]从大鼠胃黏膜分离纯化后发现的一种生长素促分泌素受体(growthhormonesecretagoguereceptor,GHS-R)的内源性配体。近几年的研究表明，除了刺激生长素释放外，ghrelin的一个重要生物学作用是刺激食欲，参与体重稳态的长期调节。Ghrelin是迄今发现的第一个能作用于全身各系统的促摄食肽，ghrelin能促进啮齿类动物摄食，并降低其脂肪利用率，从而导致动物体重增加[11]。Ghrelin还可增强人类食欲，并增加摄食量[12]。此外，慢性（肥胖）和急性（摄取能量）正能量平衡状态下，体循环中的Ghrelin水平下降；而空腹状态或有神经厌食症恶病质患者血浆中的Ghrelin水平显著增加[13]。除此之外，ghrelin还有其他多种生理功能，如抗心血管增生、促进慢波睡眠等[14]。Ghrelin由于与胃动素相类似，还曾被命名为“胃动素相关肽”[15]。姜辣素是生姜提取物，主要成分有姜酚及姜烯酚。有研究发现，姜辣素具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病及心血管疾病的作用[16,17]。姜辣素中的6-姜酚（6-ginerol）和姜烯对80%乙醇、0.6%mol/L盐酸、0.2mol/L氢氧化钠和25%生理盐水造成的胃细胞损害有明显保护作用[18]；并且可明显抑制盐酸、乙醇引起的胃损害，对消炎痛、阿斯匹林、利血平、结扎大鼠幽门所致胃溃疡呈显著作用[19]。大鼠姜辣素灌胃3h后胆汁分泌显著增加。经进一步分离表明：姜辣素中的6-姜酚及10-姜酚为主要有效成分，其中6-姜酚的作用更强[20-22]；生姜的辛味成分姜酚及姜醇类对CCl4所致大鼠离体肝细胞损害有明显保护作用[20-22]；对半乳糖胺所致肝损害也呈显著的抑制作用，其中以6-姜酚、7-姜酚和8-姜醇作用最强[20-22]。慢性高血糖可导致葡萄糖氧化、蛋白质氧化以及脂质氧化，促进自由基产生，从而导致氧化应激[23,24]。目前关于姜辣素的抗氧化作用能否降低血糖，缓解糖尿病胃轻瘫及其机制的研究较少。本研究旨在研究姜辣素是否能够作用于STZ诱导糖尿病大鼠，减少氧化应激，缓解胃轻瘫，增加ghrelin表达，促进胃排空。1 材料与方法材料与方法1实验动物雄性Wistar大鼠，250±20g，室温22±2℃，12/12循环光照，饮食自由，所有动物实验均符合《青岛大学实验动物保护和使用管理办法》。2糖尿病模型制备参考已有文献制备糖尿病大鼠模型[25,26]。实验组大鼠给予高脂饮食饲养4周[32]，对照组大鼠给予正常饲料，所有大鼠均自由饮水。高脂饮食饲养4周后，实验组大鼠禁食12小时，腹腔注射1%链佐脲霉素（STZ）（35mg/kg，溶于0.1M柠檬酸缓冲液中），注射后第8天再次腹腔注射35mg/kg链脲霉素。对照组注射方式和时间与实验组大鼠相同，仅注射同体积的柠檬酸缓冲液。注射72h后，大鼠禁食12h，进行口服糖耐量测试（葡萄糖，3.0g/kg）。2h后测量大鼠血糖浓度、血浆胰岛素水平、以及计算胰岛素抵抗（IR）指标。选取血糖值高于200mg/dL的大鼠做为实验组进行后续实验[27]。经检测，正常对照组大鼠血浆胰岛素含量为22.74±4.22μIU/mL，血糖为5.05±1.24mmol/L，IR为5.1±0.81；实验组大鼠血浆胰岛素含量为21.91±5.62μIU/mL，血糖为19.21±4.71mmol/L，IR为18.7±1.54。姜辣素从第二次注射链霉素后第八周开始灌胃，给药28天。胰岛素抵抗（IR）[28]=空腹胰岛素水平（μIU/mL）×空腹血糖水平（mmol/L）/22.5。3药品、试剂和仪器3.1实验药品(1)双氧水：江西德成制药有限公司门产品。(2)多聚甲醛：北京中杉生物技术有限公司，用0.1M，pH7.4磷酸盐缓冲液配制为4%溶液，用于大鼠脑灌注固定。(3)多聚赖氨酸：北京中杉生物技术公司产品。(4)水合氯醛：青岛宇龙海藻有限公司。(5)链脲佐霉素（STZ）：美国Sigma公司产品。2 青岛大学硕士学位论文(6)FITC交联的羊抗鼠IgG：美国JacksonImmunoresearch公司产品。(7)无水乙醇为国产分析纯。(8)抗荧光衰退封片剂：英国Citifluor公司产品。(9)包埋剂：美国Sakura公司产品。(10)磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）、磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）、氯化钠（NaCl）：上海国药化学试剂有限公司产品。3.2主要试剂配制(1)0.01M磷酸缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS）(pH7.2-7.4)Na2HPO4•12H2O2.9gNaH2PO4•2H2O0.3gNaCl8.8g加双蒸水定容至1000ml4˚C保存备用。(2)0.1M磷酸缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS）(pH7.2-7.4)Na2HPO4•12H2O29gNaH2PO4•2H2O3gNaCl8.8g加双蒸水定容至1000ml4˚C保存备用(3)4％多聚甲醛多聚甲醛40g加0.1MPBS定容至1000ml60˚C溶解后过滤，4℃避光保存备用。(4)30%蔗糖3 材料与方法蔗糖30g加0.1MPBS定容至100ml4˚C保存备用(5)10%水合氯醛水合氯醛10g加双蒸水定容至100ml4˚C保存备用(6)2.0%滂胺天蓝(PH=7.7)醋酸钠6.804g滂胺天蓝2.00g加蒸馏水定容至100ml用于玻璃微电极尖端定位(7)柠檬酸修复液（0.01M）柠檬酸二钠3g柠檬酸0.4g加蒸馏水定容至1000ml现配现用3.3主要实验仪器(1)荧光显微镜：日本Olympus公司产品(2)低温冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品(3)Leica-1401型冰冻切片机：德国Leica公司产品(4)超低温冰箱：日本Sanyo公司产品(5)纯水净化系统(Mili-Q)：法国Milipore公司产品(6)玻璃微电极：南京市教学实验器械厂4 青岛大学硕士学位论文(7)恒温摇床：天津市欧诺仪器仪表有限公司产品(8)电子天平：上海精密科学仪器有限公司(9)磁力搅拌器：上海南汇电讯器材厂(10)载玻片、盖玻片：宁波市明珠工仪玻璃厂4实验设计4.1姜辣素对大鼠胃组织ghrelin表达的影响56只大鼠随机分为7组（n=8）：（1）正常大鼠生理盐水（NS）对照组，正常大鼠NS灌胃；（2）糖尿病大鼠NS对照组，糖尿病大鼠NS灌胃；（3）糖尿病大鼠低剂量姜辣素灌胃组，给糖尿病大鼠150mg/kg姜辣素灌胃；（4）糖尿病大鼠中剂量姜辣素灌胃组，给糖尿病大鼠300mg/kg姜辣素灌胃；（5）糖尿病大鼠高剂量姜辣素灌胃组，给糖尿病大鼠600mg/kg姜辣素灌胃；（6）正常大鼠姜辣素灌胃组，给正常大鼠300mg/kg姜辣素灌胃；（7）正常大鼠罗格列酮灌胃组，给正常大鼠罗格列酮2mg/kg灌胃。大鼠灌胃28天，乙醚麻醉后断头处死、取胃，沿胃大弯剪开胃，生理盐水冲洗，液氮速冻后冻存于-80℃，用于日后生物化学或放射免疫检测分析。4.2姜辣素灌胃对大鼠胃排空率的影响56只大鼠随机分为7组（n=8）：（1）正常大鼠NS对照组，正常大鼠NS灌胃；（2）糖尿病大鼠NS对照组，糖尿病大鼠NS灌胃；（3）糖尿病大鼠低剂量姜辣素灌胃组，给糖尿病大鼠150mg/kg姜辣素灌胃；（4）糖尿病大鼠中剂量姜辣素灌胃组，给糖尿病大鼠300mg/kg姜辣素灌胃；（5）糖尿病大鼠高剂量姜辣素灌胃组，给糖尿病大鼠600mg/kg姜辣素灌胃；（6）正常大鼠姜辣素灌胃组，给正常大鼠300mg/kg姜辣素灌胃；（7）正常大鼠罗格列酮灌胃组，给正常大鼠罗格列酮2mg/kg灌胃。大鼠经28天给药后参照文献[29]测量胃排空。即：蒸馏水加热至80℃后加入甲基纤维素，配制成1.5%甲基纤维素溶液。溶液降温至37℃后调整PH至7.2，加入苯酚红（1mg/mL）做为标准溶液。实验开始前大鼠禁食18h，随后大鼠经口灌胃1.5mL甲基纤维素溶液，30min后乙醚麻醉，断头处死大鼠。开腹，结扎胃幽门和贲门，沿胃大弯剪开胃，收集胃内容物。用0.1NNaOH定容至100mL，室温静置1小时。取5mL上清液，加0.5mL20%三氯乙酸，1007g离心15min，上清液加4ml0.5NNaOH，测量560nm处吸光度，计算胃排空率。5 材料与方法胃排空率%=(酚红标准品吸光度-待测样本吸光度/酚红标准品吸光度)x100%5过氧化物歧化酶活性测定采用ELISA分析方法，参考文献[30]，检测和分析过氧化物歧化酶（SOD）活性。实验中严格按试剂盒说明书操作。（1）胃组织用匀浆液匀浆，600g离心20min（4℃），取上清液待测。（2）用BCA蛋白测定试剂盒测定上清液内蛋白浓度。10-20µg蛋白的组织匀浆液样品中的SOD平均活力约1个活力单位。（3）配制WST-8/酶工作液：按照每个反应160μl的体积配置适量的WST-8/酶工作液。均匀混合151μlSOD检测缓冲液、8μlWST-8和1μl酶溶液，配置成160μlWST-8/酶工作液。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存。（4）配制反应启动工作液：将试剂盒中反应启动液(40X)融解后混匀，按照每1μl反应启动液(40X)加入39μlSOD检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。配制好的反应启动工作液4℃或冰浴保存。（5）SOD标准品：用试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下系列浓度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。（6）样品测定：使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔，依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作液后充分混匀。注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，所以本研究在低温下（4℃）操作，以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而导致的误差。（7）37℃孵育30min，在450nm处测定样本吸光度（A）。计算抑制百分率：抑制百分率%＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)]/(A空白对照1－A空白对照2)×100%SOD酶活力单位的定义：在黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(unit)。SOD酶活力即待测样品中SOD酶活力单位，计算公式如下：待测样品中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units6过氧化氢酶活性测定采用ELISA分析方法，参考文献[31]，检测和分析过氧化氢酶（CAT）活性。实验中严格按试剂盒说明书操作。准确称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆，2500转/分离6 青岛大学硕士学位论文心10min，取上清液。按如下步骤操作：对照管测定管组织匀浆(ml)0.05试剂1(37℃预温)(ml)1.01.0试剂2(37℃预温)(ml)0.10.1混匀，37℃准确反应1min试剂3(ml)1.01.0试剂4(ml)0.10.1组织匀浆(ml)0.05混匀，波长405nm，光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。每毫克组织蛋白每秒种分解1umol的H2O2的量为一个活力单位。CAT活力（U/mgprot）=（对照OD值—测定OD值）×271*/待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）注：*271为斜率的倒数7还原型谷胱甘肽测定采用ELISA分析方法，参考文献[32]，检测和分析还原型谷胱甘肽（GSH）。实验中严格按试剂盒说明书操作。按下面步骤依次操作：测定管空白管组织上清液（ml）0.1/试剂1（ml）0.70.7双蒸水（ml）/0.1试剂3（ml）0.20.2迅速混匀上述液体，于412nm测各管吸光值，并记录第60s的OD值。GSH含量计算：GSH标准曲线公式：y=0.0015x+0.0818（x为GSH浓度，y为吸光值）GSH（µmol/gmass）=[（OD测定管-OD空白管）-0.0818]/0.0015×样品稀释倍数/样品质量（g）7 材料与方法8丙二醛测定采用ELISA分析方法，检测和分析丙二醛（MDA）含量。实验中严格按试剂盒说明书操作。准确称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆，4℃8000转/分离心10min，取上清液。按如下步骤操作：准确吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2mL样本，混匀。90℃水浴中保温30min后（盖紧，防止水分散失），置于冰浴中冷却，10000g常温离心10min。吸取上清液于1mL玻璃比色皿中，测定各样品在532nm和600nm处的吸光度记为A532和A600。MDA含量计算：MDA含量（nmol/g鲜重）＝[(A532-A600)×V反总÷(ε×d)×109]÷（W×V样÷V样总）＝25.8×(A532-A600)÷WV反总：反应体系总体积，0.8×10-3L；ε：丙二醛摩尔消光系数，155×103mol/L/cm；d:比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。W：样品质量，g9Ghrelin蛋白及ghrelinmRNA检测9.1放射免疫法（RIA）测定血浆和胃组织ghrelin含量实验结束后大鼠断头取血，置于含有EDTA和抑肽酶的试管，4℃离心，取上清液。胃组织样本，将胃用PBS清洗2次，在生理盐水中加热5min，使用滤纸吸干水分。剥离粘膜，称重，加入1N冷盐酸溶液，匀浆。室温孵育2h，加入等体积1NNaOH，4℃下1790g离心20min，取上清液冻存于-70℃备用。采用RIA法检测ghrelin水平：取一定量样本或标准液，加入ghrelin抗体，4℃孵育24h，加入125I-ghrelin后再4℃孵育24h，加入20mg活性炭，用以沉淀抗原抗体复合物。室温静置45min，1790g离心20min/4℃，取上清液，测定cpm。9.2RT-PCR测定胃组织ghrelinmRNA表达8 青岛大学硕士学位论文（1）总RNA提取：取适量胃组织，加1mlTRK裂解液匀浆。14,000g离心5min（室温），转移上清液至1.5ml离心管。加入等体积70%乙醇至裂解液，抽打或涡旋混匀。将柱子套在收集管中，转移混合液至柱子中。10000g离心60s（室温），弃去滤液。把柱套放入新收集管中，加入300µlRNAWashBufferI至柱子上，按以上条件离心，弃去滤液。把柱套放回收集管中。DNase消化:配制DNASE消化液(DigestionBuffer,73.5µul;RNase-FreeDNaseI,1.5ul)，混匀,将消化液转移至柱子膜的正中央，室温静置15min。加500µlRNAWashBufferI至柱子，按以上条件离心，弃滤液。把柱套放回收集管，加500µlRNAWashBufferII至柱子上，按以上条件离心，弃滤液。把柱套放回新收集管，加500µlRNAWashBufferII至柱子上，按以上条件离心，弃滤液。把柱套放回收集管，10,000g离心空柱2min，以甩干柱子基质。把柱子装在1.5ml离心管上，加入100µlDEPCWater柱子基质上，室温静置2min。10,000g离心1min，洗脱出RNA。RNA浓度测定：吸取lµl上述抽提的总RNA，用DEPC水稀释10倍．在Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260／OD280比值。（2）反转录：所有反应液的配制都在冰上操作。在预冷的RNasefree的反应管内加入以下试剂至总体积13μl。试剂组分体积终浓度TotalRNA1μg60μMOligo（dT）181μL2.4μMDEPC水至总体积13μl将上述混合液混匀，进行短暂离心，65℃变性10min，立即放置冰上。配制反转录反应液：在RNA-PrimerMix反应管内加入以下试剂至总体积25μl。试剂组分体积终浓度RNA-PrimerMix13μl9 材料与方法5×RTReactionBuffer5μl1×25mMdNTP1μl1mM25U/μlRNaseInhibitor1μl1U/μl200U/μlM-MLVRTase1μl8U/μlDEPC水4μl总体积25μl混匀上述反应液，短暂离心，42℃孵育1h。反应结束后，85℃灭活5min，-20℃保存反转录产物。（3）Realtime-PCR采用染料法（SYBRGreenI）进行相对定量分析，实验步骤如下：PCRreactionmix的制备(在冰上操作)试剂用量终浓度2XAllinOneTMQ—PCRMix10μl1×ddH2O1μlPCRForwardPrimer（4μM）2μl0.4μM5’-GCAGAGAAAGGAACCTAAG-3’PCRReversePrimer（4μM）5’-GGGTTTCTTCGGCTTCTTC-3’2μl0.4μMcDNA5μl总体积20μlPCR反应：循环数步骤温度时间1预变性95℃10min40变性95℃10sec退火57℃20secOff延伸72℃15secOn在PCR反应后．采用以下的程序进行熔解曲线分析10 青岛大学硕士学位论文温度温度间隔时间检测72℃~95℃0.5℃6sec/eachOn30℃30secoffReal-timePCR结果分析采用ΔCt值表示，即检测待测基因cDNA进入PCR指数增长期的起始点即循环阈值(cyclethreshold，Ct)，以同一样本中MTL和看家基因GAPDH之间的Ct差值(ΔCt)，即ΔCt=Ctghrelin—CtGAPDH进行组间资料的t检验(Prism3.0统计学软件)。P<0.05为差异有显著统计学意义。10荧光免疫组织化学染色灌注固定：实验结束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3ml/100g麻醉。将麻醉大鼠仰卧固定于鼠板上，在剑突下心脏搏动最明显位置剪开胸腔，暴露心脏。采用自制钝头针，在左心室心尖搏动最强的地方刺破心脏，直至主动脉，动脉夹固定钝头针。首先给予200ml0.9%的生理盐水快速灌注，灌注过程中可观察到大鼠失去血色，之后用200ml4%的多聚甲醛进行灌注固定，先快后慢，固定过程中大鼠出现四肢抽动，逐渐变得僵硬。开腹，取出胃组织，并浸泡于4%多聚甲醛中后固定4-6h，然后置于30%蔗糖溶液2-3天，使胃组织彻底脱水。组织冰冻切片：将上述脱水的胃组织用包埋剂包埋，置于冰冻切片机（-20°C）冻存10min，之后连续切片15µm，将所需部位的切片小心放于涂胶载片上，展平，晾干。所有切片放于-20°C冰箱避光冻存，以备下一步做免疫组织化学染色。荧光免疫组织化学染色：从-20˚C冰箱中取出冰冻切片，放于玻片架上过夜晾干。于生理盐水溶液中洗涤3次，每次5min，进一步在0.01molPBS溶液中洗涤3次，每次5min。组织切片浸于柠檬酸缓冲液中进行微波修复，使抗原充分暴露。修复后将胃切片组织上滴加30-50μl，正常山羊血清封闭液，封闭非特异性抗原，避光操作，室温孵育1h。随后滴加50μl一抗（ghrelin多克隆抗体，1:300稀释），滴加正常兔血清作为阴性对照。将加好一抗的标本置于湿盒中，4˚C过夜(避光)。用0.01molPBS溶液洗涤3次，每次5min。微量移液器滴加荧光素Cy3标记的二抗(1:500稀释)50μl，室温孵育2h(避光操作)。随后用0.01molPBS溶液中洗涤3次，每次5min，滴加防淬灭荧光封片剂(Citifluor，UK)，盖玻片封片。荧光显微镜下观察结果。11 材料与方法11统计学分析-数据以X±SD表示，采用Prism5.0软件进行统计学分析。两组间均数比较采用t检验，双因素方差分析(ANOVA)进行组间两两比较，P<0.05为有统计学意义。12 实验结果实验结果1姜辣素灌胃对糖尿病大鼠血糖的影响与正常大鼠相比，STZ诱导的糖尿病大鼠血糖显著升高（P<0.01，表1，图1）。糖尿病大鼠经姜辣素灌胃28天，与NS灌胃的糖尿病大鼠相比，大鼠血糖显著降低，并呈显著剂量依赖关系（P＜0.05~0.01，表1，图1）。正常大鼠给予姜辣素灌胃28天，血糖未发生明显变化（P＞0.05，表1，图1）。与糖尿病NS组大鼠相比，使用罗格列酮治疗后，糖尿病大鼠血糖明显下降（P＜0.01，表1，图1），并且罗格列酮对血糖的降低作用显著强于150mg/kg和300mg/kg姜辣素组（P＜0.05~0.01，表1，图1）。但姜辣素灌胃对正常大鼠血糖无显著影响（P>0.05,表1，图1）。表1姜辣素灌胃对糖尿病大鼠血糖的影响分组Day0Day28正常大鼠NS81.47±21.3585.39±19.54糖尿病大鼠NS319.52±39.24**338.27±43.27**##△糖尿病大鼠150mg/kg姜辣素300.37±37.19237.45±41.36#△糖尿病大鼠300mg/kg姜辣素310.42±45.27218.36±39.71△△糖尿病大鼠600mg/kg姜辣素289.36±41.34151.64±38.24正常大鼠300mg/kg姜辣素82.13±17.2679.65±11.46△△糖尿病大鼠2mg/kg罗格列酮297.23±42.18132.92±36.59**P＜0.01，与正常大鼠NS组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与糖尿病大鼠罗格列酮组比较；△P△△＜0.05，P＜0.01，与糖尿病大鼠NS组比较13 青岛大学硕士学位论文正常大鼠+NS糖尿病大鼠+NS糖尿病大鼠+150mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+300mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+600mg/kg姜辣素400**正常大鼠+200mg/kg姜辣素**糖尿病大鼠+2mg/kg罗格列酮)300###△mg/dl(200△△△△血糖1000Day0Day28图1姜辣素灌胃对糖尿病大鼠血糖的影响**P＜0.01，与正常大鼠NS组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与糖尿病大鼠罗格列酮组比较；△P△△＜0.05，P＜0.01，与糖尿病大鼠NS组比较Fig1Effectofgingerolonthebloodglucoselevels**P＜0.01vs.Normalrat+NS,#P＜0.05，##P＜0.01vs.Diabetic+rosiglitazone,△P＜0.05，△△P＜0.01vs.Diabetic+NS2姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃组织SOD，GSH，CAT和MDA水平影响与正常大鼠NS组大鼠相比，与糖尿病NS组大鼠胃粘膜组织中SOD、CAT及GSH水平显著降低（P<0.05，表2，图2），MDA水平显著升高（P<0.05，表2，图2）。与糖尿病NS组相比，中、高剂量姜辣素灌胃，糖尿病大鼠胃粘膜组织中SOD、CAT及GSH水平显著升高，且呈显著量效依赖关系（P＜0.05~0.01，表2,图2），而MDA水平显著降低，呈显著量效依赖关系（P＜0.05-0.01，表2，图2）。与糖尿病NS组大鼠相比，经罗格列酮治疗的糖尿病大鼠，胃组织中SOD、CAT、GSH或MDA水平均无明显改变（P＞0.05，表2，图2）。正常大鼠姜辣素灌胃，胃组织中SOD、CAT、GSH或MDA水平也无明显变化（P＞0.05，表2，图2）。14 实验结果表2姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃组织SOD，GSH，CAT和MDA水平影响分组SODGSHCATMDA正常大鼠NS6.29±1.031091.27±170.0927.43±5.279.79±2.41糖尿病大鼠NS3.52±1.21*685.07±75.24*10.52±2.37*46.38±12.59*150mg/kg糖尿病大鼠4.36±1.01896.73±108.1815.27±4.5934.61±9.27姜辣素300mg/kg糖尿病大鼠5.62±1.18#949.03±98.24#19.29±5.42#28.01±8.34#姜辣素600mg/kg糖尿病大鼠7.05±1.48##984.03±127.02##23.79±6.35##19.17±5.19##姜辣素300mg/kg正常大鼠6.48±1.821091.18±179.2828.17±8.499.43±2.14姜辣素2mg/kg糖尿病大鼠3.51±1.04718.51±98.0511.29±3.9439.43±12.59罗格列酮注：*P＜0.05，与正常大鼠NS组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与糖尿病大鼠NS组比较15 青岛大学硕士学位论文正常大鼠+NS糖尿病大鼠+NS糖尿病大鼠+150mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+300mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+600mg/kg姜辣素正常大鼠+200mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+2mg/kg罗格列酮9##4087###306#protein)protein)5*2043*SOD(U/mg2GSH(U/mg101001400701200##60*#100050wettissue)800*wettissue)40#/g/g60030##nmolnmol40020CAT(200MDA(1000图2姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃组织SOD、GSH、CAT和MDA水平影响*P＜0.05，与正常大鼠NS组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与糖尿病大鼠NS组比较Fig2EffectsofgingerolonenzymaticantioxidantactivityandGSHandMDAcontentsinstomachsofnormalandSTZinduceddiabeticrats*P＜0.05vs.Normalrat+NSgroup,#P＜0.05,##P＜0.01vs.Diabeticrat+NSgroup3姜辣素灌胃对糖尿病大鼠ghrelin及其ghrelinmRNA水平的影响与正常大鼠相比，糖尿病大鼠胃组织中ghrelin水平明显降低（P＜0.01，表3，图3和图4），但血浆ghrelin水平显著升高（P＜0.05，表3，图4）。与糖尿病NS组大鼠相比，糖尿病大鼠经中、高剂量姜辣素灌胃后，血浆和胃内ghrelin水平显著升高（P＜0.05~0.01，表3，图3和图4）。16 实验结果表3姜辣素灌胃对糖尿病大鼠ghrelin及其ghrelinmRNA水平的影响胃ghrelin血浆ghrelin胃Ghrelin分组pg/mgpg/mlmRNAΔCt正常大鼠NS381.26±94.3776.86±21.814.21±1.17糖尿病大鼠NS195.07±57.42**108.83±27.75*1.63±0.37**糖尿病大鼠150mg/kg姜辣素206.71±43.57126.42±41.291.82±0.28糖尿病大鼠300mg/kg姜辣素301.43±81.24#141.37±37.46#2.19±0.87糖尿病大鼠600mg/kg姜辣素328.93±76.59##163.64±51.64##2.83±0.74#正常大鼠300mg/kg姜辣素382.16±112.4881.94±19.253.96±1.02糖尿病大鼠2mg/kg罗格列酮223.27±64.76127.46±24.431.68±0.49*P＜0.05，与正常大鼠NS组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与糖尿病大鼠NS组比较ABCDEFG图3姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃ghrelin水平的影响A：正常大鼠NS灌胃；B：正常大鼠300mg/kg姜辣素灌胃；C：糖尿病大鼠2mg/kg罗格列酮灌胃；D：糖尿病大鼠150mg/kg姜辣素灌胃；E：糖尿病大鼠NS灌胃；F：糖尿病大鼠300mg/kg姜辣素灌胃；G：糖尿病大鼠600mg/kg姜辣素灌胃Fig3EffectofgingerolonstomachghrelinofstomachinSTZ-induceddiabeticratsA,NormalratgingerolNS;B,Normalratgingerol300mg/kg;C,Diabeticratgingerolrosiglitanone2mg/kg;D,Diabeticratgingerol150mg/kg;E,DiabeticratgingerolNS;F,Diabeticratgingerol300mg/kg;G,Diabeticratgingerol600mg/kg17 青岛大学硕士学位论文与正常大鼠相比，糖尿病大鼠胃组织内ghrelinmRNA表达明显升高（P＜0.01，表3，图4）。与糖尿病NS组大鼠相比，经600mg/kg姜辣素灌胃的糖尿病大鼠，胃内ghrelinmRNA表达显著减少（P＜0.05，表3，图4）。与正常大鼠NS组相比，正常大鼠给予姜辣素灌胃，胃组织内ghrelinmRNA表达无显著改变（P＞0.05，表3，图4）；与糖尿病NS组大鼠相比，糖尿病大鼠经罗格列酮治疗后，胃内ghrelinmRNA表达也无显著变化（P＞0.05，表3，图4）。500250####400#200#/ml)/mgtissue)300pg(150***pg(200100ghrelinghrelin100血浆50胃00△Ct6正常大鼠+NS4#糖尿病大鼠+NS糖尿病大鼠+150mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+300mg/kg姜辣素2**ghrelinmRNA糖尿病大鼠+600mg/kg姜辣素正常大鼠+200mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+2mg/kg罗格列酮0图4姜辣素灌胃对糖尿病大鼠ghrelin及其ghrelinmRNA表达的影响*P＜0.05，**P＜0.01，与正常大鼠NS组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与糖尿病大鼠NS组比较Fig4Effectofgingerolonplasmaghrelin,stomachghrelinandghrelinmRNAofstomachinSTZ-induceddiabeticrats*P＜0.05，**P＜0.01vs.NormalratNSgroup,#P＜0.05,##P＜0.01vs.DiabeticratNSgroup4姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃排空的影响与正常NS组大鼠相比，糖尿病NS组大鼠胃的排空率明显减少（P＜0.01，表4，图5）。与糖尿病NS组大鼠相比，给予糖尿病大鼠姜辣素灌胃后，大鼠胃的排空率显著增加，呈明显量效依赖关系（P＜0.05~0.01，表4，图5）。但与糖尿病NS组大18 实验结果鼠相比，给予罗格列酮治疗后，糖尿病大鼠胃排空率无明显改变（P＞0.05，表4，图5）。与正常NS组大鼠相比，正常大鼠姜辣素灌胃后，大鼠胃排空率也无明显改变（P＞0.05，表4，图5）。表4姜辣素灌胃糖尿病大鼠胃排空的影响分组胃排空率（%）正常大鼠NS82.24±19.74糖尿病大鼠NS45.37±11.23**糖尿病大鼠150mg/kg姜辣素52.43±15.42糖尿病大鼠300mg/kg姜辣素49.89±9.84#糖尿病大鼠600mg/kg姜辣素74.39±20.79##正常大鼠300mg/kg姜辣素80.19±26.48糖尿病大鼠2mg/kg罗格列酮51.86±13.84**P＜0.01vs.Normalrat+NSgroup,#P＜0.05，##P＜0.01vs.Diabetic+NSgroup120正常大鼠+NS100##糖尿病大鼠+NS80糖尿病大鼠+150mg/kg姜辣素(%)#糖尿病大鼠+300mg/kg姜辣素60**糖尿病大鼠+600mg/kg姜辣素胃排空率40正常大鼠+200mg/kg姜辣素糖尿病大鼠+2mg/kg罗格列酮200图5姜辣素灌胃对糖尿病大鼠胃排空率的影响**P＜0.01，与正常大鼠NS组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与糖尿病大鼠NS组比较Fig.5EffectofgingerolongastricemptyingrateinSTZ-induceddiabeticrats**P＜0.01vs.NormalratNSgroup,#P＜0.05，##P＜0.01vs.DiabeticratNSgroup19 讨论讨论本研究发现，STZ诱导的糖尿病大鼠血糖明显升高，胃组织中SOD、CAT和GSH水平显著低于正常大鼠，而MDA水平显著高于正常大鼠。本研究结果还显示，糖尿病大鼠血浆ghrelin和胃内ghrelinmRNA水平明显高于正常大鼠，但胃内ghrelin表达显著低于正常大鼠，且糖尿病大鼠的胃排空率显著降低。糖尿病大鼠经28天的姜辣素灌胃治疗，血糖明显降低，且胃组织中SOD、CAT和GSH水平显著回升，MDA水平显著回降，且呈显著量效依赖关系；糖尿病大鼠经姜辣素治疗后，胃组织内ghrelin表达也显著增加，胃排空率也显著改善。有文献报道，STZ能促进氧自由基（ROS）生成，抑制氧自由基防御系统，从而损伤胰岛β细胞[33-35]。已知，氧化应激反应是人体重要的防御系统，机体通过该系统调控可清除过多的氧自由基，维持代谢平衡。在病理条件下，如动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、糖尿病以及癌症等，可生成大量氧自由基，此时机体的抗氧化反应受到抑制。过氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD)，别名肝蛋白、简称：SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC1.15.1.1,SOD）是1938年首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。过氧化氢酶（CAT），是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。谷胱甘肽(glutathione,r-glutamylcysteingl+glycine,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故常简写为G-SH），易与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属）等结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。有研究表明，氧化应激参与糖尿病及其并发症的发生和发展[36,37]。氧自由基可通过使生物膜脂质过氧化，继而引起细胞内蛋白质变性、酶活性降低和DNA损伤，最终导致细胞凋亡[38]。酶促抗氧化反应是机体第一道抗氧化防御系统，保护机体免受自由基攻击[39]。本研究发现，糖尿病大鼠位组织内抗氧化酶，如SOD、CAT以及20 青岛大学硕士学位论文GSH水平明显低于正常大鼠，即糖尿病大鼠随活性氧代谢产物的水平的升高，机体抗氧化作用受抑制，产生大量的H2-2O2、0及脂质过氧化物，进而造成组织产生损伤[40]。但本研究发现，经姜辣素治疗的糖尿病大鼠表现出SOD、CAT以及GSH增多，提示，姜辣素能通过清除自由基，保护细胞对抗氧化应激，该发现与他人研究结果相吻合[41,42]。本研究发现，与正常大鼠相比，糖尿病大鼠脂质过氧化产物MDA水平明显增高。推断，糖尿病大鼠体内抗氧化物可能减少。细胞膜脂质过氧化反应增强可导致大量脂质氢过氧化物的形成，进而导致细胞膜结构破坏和功能损伤[43]。本研究发现，糖尿病大鼠经姜辣素治疗后，组织内MDA水平显著回降[42]。提示，姜辣素可提高糖尿病大鼠抗氧化能力。糖尿病是血糖显著升高的一种代谢性疾病，如果不经规范治疗，长期的高血糖会导致各种并发症。糖尿病胃轻瘫即属于糖尿病的一种常见并发症，且发病率呈逐年升高趋势。研究显示，约有50%的糖尿病患者伴发糖尿病胃轻瘫病症。糖尿病胃轻瘫的发病机制非常复杂，至今还不明确。研究表明糖尿病胃轻瘫的发生与多种因素相关，包括高血糖、遗传因素、自主神经病变等。本研究还发现，糖尿病大鼠经姜辣素治疗后胃内ghrelin水平显著升高；血浆ghrelin水平明显下降，但依然高于正常大鼠。提示，姜辣素可能具有促进糖尿病大鼠胃组织ghrelin的合成及释放效应。有趣的是，本研究还发现，糖尿病大鼠，胃内ghrelinmRNA表达明显增加，大鼠经姜辣素灌胃治疗后，其胃内ghrelinmRNA表达水平明显减少，这与胃内ghrelin蛋白表达结果不一致。推测，可能在糖尿病时，机体为了维持能量平衡，代偿性地增加ghrelinmRNA表达；随后虽然经过28天的姜辣素灌胃治疗，但此时机体处于负能量平衡状态，胃ghrelinmRNA表达可能受到抑制。但目前研究并不能完全解释ghrelin及ghrelinmRNA间的表达差异，这有待于将来进一步探讨。Ghrelin是1999年由Kojimaetal.[10]从大鼠胃黏膜分离纯化后发现的一种生长素促分泌素受体(growthhormonesecretagoguereceptor,GHS-R)的内源性配体。Ghrelin在中枢分布较为广泛，如下丘脑外侧区（LHA）、Arc、下丘脑腹内侧核（VMH）、以及边缘系统的杏仁核、隔核、海马等均有分布。近几年的研究表明，除了刺激生长素释放外，ghrelin的一个重要生物学作用是刺激食欲和胃动力，参与体重稳态的长期调节。有文献报道，ghrelin可促进麻醉大鼠在体胃肠收缩[31]，加速清醒大鼠胃的排空，并促进小肠推进运动，有助于缓解术后肠梗阻[12]，静脉注射ghrelin，可增加糖尿病胃轻瘫患者胃的排空率[44]。Ghrelin是一种促生长激素分泌素，在人类以及大鼠胃均21 讨论有ghrelin表达[45]。且在人及啮齿类动物，ghrelin均可刺激生长激素释放，促进摄食[44]和胃排空[46]。在饥饿、恶病质或厌食症等机体负能量平衡状态下，血浆ghrelin水平升高[47-51]。有研究显示，胃底A样细胞能分泌ghrelin[52]。本研究结果显示，糖尿病大鼠胃排空率降低，经姜辣素灌胃治疗，糖尿病大鼠胃排空率显著增强。同时发现，STZ诱导糖尿病大鼠血浆ghrelin水平以及胃ghrelinmRNA表达水平升高，但胃内ghrelin含量降低。糖尿病大鼠血浆ghrelin水平上升，而胃ghrelin水平下降，可能是由于胃内ghrelin大量释放至血所致。综上所述，姜辣素可以通过抑制氧化损伤，改善STZ诱导的糖尿病大鼠胃肠功能，ghrelin可能参与该过程调控。未来仍需要深入研究姜辣素的抗氧化作用机制，以便为治疗糖尿病及其并发症提供新的研究策略。22 结论结论1.STZ诱导的糖尿病大鼠血糖升高，姜辣素灌胃可使糖尿病大鼠血糖显著回降；2.糖尿病大鼠胃组织SOD、CAT和GSH水平显著降低，而MDA水平显著升高，且呈显著量效依赖关系。姜辣素灌胃可使糖尿病大鼠位组织内SOD、CAT、GSH和MDA水平反转。提示，在糖尿病中姜辣素可能具有抗氧化应激效应。3.糖尿病大鼠血浆ghrelin水平明显升高，胃ghrelin含量明显降低；姜辣素灌胃可使糖尿病大鼠血浆和胃内ghrelin水平反转。Ghrelin可能参与了糖尿病的发病过程。4.糖尿病大鼠胃排空率显著降低；姜辣素灌胃可显著提高糖尿病大鼠胃的排空率。上述结果提示，在糖尿病病理状态下，姜辣素可能通过提高组织抗氧化应激能力，力求维持机体代谢相对平衡，使血糖趋于稳态、改善胃动力障碍。Ghrelin可能也参与了该过程的调控。23 参考文献参考文献[1]KingH,AubertRE,HermanWH.Globalburdenofdiabetes,1995-2025:prevalence,numericalestimates,andprojections[J].DiabetesCare,1998,21(9):1414-1431.[2]BytzerP,TalleyNJ,LeemonM,etal.Prevalenceofgastrointestinalsymptomsassociatedwithdiabetesmellitus:apopulation-basedsurveyof15,000adults[J].ArchInternMed,2001,161(16):1989-1996.[3]MohammadMK,PepperDJ,KedarA,etal.MeasuresofAutonomicDysfunctioninDiabeticandIdiopathicGastroparesis[J].GastroenterologyRes,2016,9(4-5):65-69.[4]ScheinbergN,SalbuRL,GoswamiG,etal.TreatmentofDiabeticAutonomicNeuropathyinOlderAdultswithDiabetesMellitus[J].ConsultPharm,2016,31(11):633-645.[5]WalkD.UsingRandomForestMethodstoIdentifyFactorsAssociatedwithDiabeticNeuropathy:ANovelApproach[J].PainMed,2017,18(1):1-2.[6]CrimminsS,SmileyR,PrestonK,etal.IncreasedExpressionofPyloricERβIsAssociatedWithDiabeticGastroparesisinStreptozotocin-InducedMaleDiabeticRats[J].GastroenterologyRes,2016,9(2-3):39-46.[7]BharuchaAE,DaleySL,LowPA,etal.Effectsofheminonhemeoxygenase-1,gastricemptying,andsymptomsindiabeticgastroparesis[J].NeurogastroenterolMotil,2016,28(11):1731-1740.[8]LacyBE,CrowellMD,MathisC,etal.Gastroparesis:QualityofLifeandHealthCareUtilization[J].JClinGastroenterol,2016[Epubaheadofprint][9]LinG,ZhangJ,LiL,etal.EffectofelectroacupunctureongastricinterstitialcellsofCajalinaratmodelofdiabeticgastroparesis[J].ExpTherMed,2016,1(6):2489-2494.[10]KojimaM,HosodaH,DateY,etal.Ghrelinisagrowth-hormone-releasingacylatedpeptidefromstomach[J].Nature,1999,402(6762):656–660.[11]ChoiEM,JungN,ShimYJ,etal.ShortstatureandgrowthhormonedeficiencyinagirlwithencephalocraniocutaneouslipomatosisandJaffe-Campanaccisyndrome:acasereport[J].AnnPediatrEndocrinolMetab,2016,21(4):240-244.[12]MarsilioS,GlanemannB,MartinL,etal.Leptinandghrelinconcentrationinhyperthyroidcatsbeforeandafterradioactiveiodinetherapycomparedtoeuthyroidcontrolcats[J].TierarztlPraxAusgKKleintiereHeimtiere,2017,45(2)[Epubaheadofprint][13]GoymannW,LupiS,KaiyaH,etal.Ghrelinaffectsstopoverdecisionsandfoodintakeinalong-distancemigrant[J].ProcNatlAcadSciUSA,2017,114(8):1946-1951.[14]McGovern-GoochKR,MahajaniNS,GaragozzoA,etal.SyntheticTriterpenoidInhibitionofHumanGhrelinO-Acyltransferase:TheInvolvementofaFunctionallyRequiredCysteineProvidesMechanisticInsightintoGhrelinAcylation[J].Biochemistry,2017,56(7):919-931.[15]SaghebMM,AzarpiraN,MokhtaryM.TheeffectofghrelinonKiss-1andKissRgenetranscriptionandinsulinsecretioninratisletsofLangerhansandCRI-D2cellline[J].IranJBasicMedSci,2017,20(1):36-40.[16]NataleJJ.Reviewingcurrentandemergingantiemeticsforchemotherapy-inducednauseaandvomitingprophylaxis[J].HospPract(1995),2015,43(4):226-234.[17]YangY1,KinoshitaK,KoyamaK,eral.Structure-antiemetic-activityofsomediarylheptanoidsandtheiranalogues[J].Phytomedicine,2002,9(2):146-152.[18]包力.生姜国外研究进展[J].新疆中医药,1993,(02):52-53.[19]黄启荣.生姜的辛味成分[6]-姜酚对胃黏膜损伤的作用[M].国外医学—中医中药分册，24 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综述胃排空及其影响因素综述胃肠疾病专家所做的典型的运动性研究，均需要在胃肠道内放置一个以电子管或导管为基础的探头，以便于测量压力、电信号或pH值。但是目前，我们已经引入了一种微创技术，即无线胶囊[1]。自首次以一种放射性食物来描述所测量的胃排空（GE）起，以放射性核素研究胃肠动力的优势就长盛不衰[2]。与探测方法相比，闪烁造影可以达到无创，并且不扰乱正常生理，能够准确地量化在胃肠道内的放射性固体或液体食物的大量转运过程。与射线照相方法相比，闪烁法属于低辐射照射，这种方法可以量化，并且通常使用的是日常摄入的食物，而不是钡或不透明的标记物。本文将探讨胃肠道显像适用于胃动力方面的研究。胃肠动力障碍的临床症状胃肠动力障碍病人的临床表现为：疼痛，恶心，呕吐，腹胀，腹泻，便秘等，而且各种症状往往叠加。这些症状究竟是由于结构异常、组织异常还是功能性的问题，目前仍存在异义[3]。这些临床症状与摄入的膳食也有关系。为了便于临床治疗，我们将功能性胃肠道疾病症状进行了分类（表1）[4]。表1功能性胃肠道疾病症状成年人婴幼儿儿童/青少年A：食管G1：婴幼儿反流H1：呕吐和吞气症A1：胃灼热G2：婴幼儿反刍H1a:反刍A2：胸痛G3：周期性呕吐H1b:周期性呕吐A3：吞咽困难G4：婴幼儿急腹痛H1c:吞气症A4：癔球症G5：功能性腹泻H2：腹痛B：胃与十二指肠G6：婴幼儿便秘H2a：消化不良B1：消化不良G7：功能性便秘H2b：肠易激B2：嗳气H2c：腹型偏头痛B3：恶心/呕吐H2d：儿童腹痛B4：反刍H3：便秘和失禁C：肠H3a:功能性便秘27 青岛大学硕士学位论文C1：肠易激H3b:非持续性大便失禁C2：胀气C3：便秘C4：腹泻C5：未指明的D：功能性腹痛E：胆汁F：肛门直肠胃肠动力成像检测我们通常用平面γ相机来研究胃肠道运动的成像。目前研究中偏向于使用大视野的现代化相机，这是为了更明确地查看从嘴部到胃区的研究区域，包括食管以及整个腹部的研究。中等能量瞄准仪利用图像的111In（172和247keV）和99mTc（140keV）来进行固体和液体混合物的双同位素研究，。低能量瞄准仪能够满足单同位素99mTc方面的研究。胃肠道传输研究中最常用的放射性同位素是同位素99mTc和111In。其中放射性同位素的最终形式取决于要进行的研究。对于上消化道转运这方面的实验研究，99mTc实验通常采用口服99mTc-硫胶体的方式，99mTc-硫胶体的半衰期较短，仅为6小时，适当烹煮会与某些食物有一定的物理反应。因为它不能在胃肠道内被吸收，所以只会导致低辐射暴露[5]。具有较长半衰期为67h的111InDTPA可用于图像胃肠传输，需要2–3天，如结肠运输。它通常是用口服方式，悬浮在液体中，而且也不能被吸收。67Ga复合物也用于需延长几日的胃肠道转运研究中[6]。2007年之前，关于诊断胃肠道转运的研究没有标准化的共同指南。因此，在执行和报告这些研究方面缺乏一致性[7,8]。最近关于胃排空（GE）[9]和小肠和结肠运输的研究[10]已经提出了最新的指南，这就为执行和解释这些研究的技术细节提供了指导。本文将会涉及这个指南的许多细节。也会突出强调他们正确解释这种指南所需的生理和临床知识。胃排空胃排空（GE）的研究通常要求确认或排除胃轻瘫（延迟性胃排空）是否是造成病人症状的原因。胃轻瘫患者通常有上消化道症状，包括恶心（92%的患者）、呕吐28 综述（84%）、腹痛或腹胀、早饱（75%）或早期即出现的饱腹感（60%）[11]。病因包括糖尿病性胃轻瘫；感染；神经、免疫、结缔组织疾病；肿瘤；术后后遗症或特发性胃轻瘫。糖尿病胃轻瘫患者常伴有视网膜病变、神经病变以及肾病[9]。患者往往没有明确定义的胃肠道症状，或是出现消化不良的主诉（或症状，我们认为这起源于上消化道）。消化不良可以被定义为上腹部的任何疼痛或不适。50%的消化不良患者未明确其发病原因。消化不良可分为特发性、必要性或功能性消化不良（FD）[12]。III号分类表（表1）可以进一步将消化不良和胃十二指肠症状分为餐后饱胀、早饱、上腹痛、或上腹烧灼[13]。延迟诊断胃排空的治疗目标是确定一种促胃动力药物或其他治疗方式可以缓解患者的症状。胃排空研究表明，一个疑似胃轻瘫或者消化不良的患者只有在解剖之后才能排除其症状原因。胃排空（GE）研究也表明一些病人缺乏胃部症状，这指的是那些需要进行检查才能确定弥漫胃肠道运动障碍的患者。用一种放射性的食物进行的胃排空闪烁成像，这种检验方法仍然是黄金标准，因为一旦这顿饭呈放射性，γ相机测量的计数与胃里的食物量直接成正比，与任何几何假设都没有关系。正如目前大多数研究中心所做的，胃排空闪烁技术仅限于测量固体放射物的排空过程中的延迟或加速。然而许多研究表明，患者的症状和总胃排空测量的结果之间的相关性较弱。有几项研究，甚至包括对总共868名患者进行的17项研究的单次大型元分析均显示，在有症状的病人中，胃排空延迟的发生率只有40%[14,15]。由于胃排空的测量和症状之间的相关性较弱，现阶段更多的研究集中于确定症状和其他因素（不只是胃排空总量）之间是否有关系，甚至还包括胃排空显像评价（图1）。餐后痛、嗳气、体重减轻等症状与内脏胃扩张反应有关[16]，受损的胃底和早期饱腹感有关[17]，饱胀感与晚期胃底食物滞留有关。而胃排空率受反馈机制影响，例如反馈机制协调胃窦收缩幽门松弛。营养素受体（葡萄糖和渗透液）在十二指肠进一步控制营养流入近端小肠[19]的速度。在解释胃排空的研究中，人们需要了解影响胃排空的多个因素，特别是对胃底和胃窦的独立作用。所以针对胃固体食物早期分布的视觉检测已经越来越重要。液体迅速分散在整个胃部，但是固体最初通常主要集中在胃底，直到胃底持续收缩而缓慢流到胃窦。在固体食物胃排空研究的初始图像(图2)中，这种早期的固体优先性在胃底(调节反应)明显地显现出来，我们可以观察到一个持续的横带，将胃底从窦中区分出来。出现测量计数增加，这表示固体从位于胃底的后方到达位于前部的胃窦区，因为当固体定位于病人前面时更靠近γ相机，计数就更高。利用几何平均29 青岛大学硕士学位论文值进行深度相关的衰减校正：（前计数×后计数）½。这种修正只会引起通常遇到的深度的3%-4%的误差[20]。如果需要使用前后视图的几何平均数据集合，也不需要双头相机系统。因为胃的计数不会在1分钟内显著改变，使用单头相机时，可以简单地让病人先面对摄像机镜头，每次都有1分钟的胃图像。如果病人不能站立完成前和后视图，左前斜视图也可以替代用于衰减校正[21]。图1胃排空示意图与胃排空相关的多种因素是解释消化不良病人症状的重要因素。目前正在研究的三个主要因素是胃排空总量、基底调节受损和内脏超敏反应。窦—十二指肠协调和十二指肠胃反馈机制也很重要，但其特征并不明显[63]。固体进入胃窦后蠕动收缩的过程称为研磨混合，大型固体打磨为小的颗粒，从而进入胃消化液中。固体必须减少到1–2毫米粒子之后，才能通过幽门。胃窦的收缩活动是由位于胃底与胃窦交界处的较大曲率的起搏器控制的。因为需要完成研磨使固体颗粒足够小，这就使得胃排空的时间相应延长，这被称为相位滞后。一旦捣碎了食物，小的固体颗粒悬浮在胃内的液体中，在胃中则以和液体相同的速率排空[22]。液体的排空是由胃底所产生的持续压力梯度控制的。液体不需要研磨，他们排空（见图5）比固体更迅速，而且没有滞后相位。先前大家都持有的信念是，液体胃排空不会增加功能性消化不良患者的临床评估量[23,24]。人们认为，由于液体不需要研磨，所以在胃轻瘫处于高级阶段之前，液体胃排空一直保持正常，因此利用液体对早期胃轻瘫的检测不那么敏感[25]。不过一项早期的研究发现，24%的糖尿病患30 综述者[26]出现了液体排空延迟，但固体排空正常。图2固—液胃排空这些图像显示液体在胃的早期快速分布在0分钟，液体排空曲线是单指数的。相比之下，固体显示出早期的基底定位（双箭头）。随着时间的推移，固体进入到窦腔(三箭头)。固体排空曲线是由于固体的早期滞后阶段而形成的。随着时间的推移，人们可以观察到固体和液体的小肠转运，在末端回肠活动增加（椭圆形）。近年来，人们越来越关注液体胃排空的研究，以补充固体食物的胃排空研究。有协会报道了固体，液体胃轻瘫的延迟和餐后饱胀、恶心和呕吐的症状的关系。多变量分析表明，餐后的饱腹感和早期的饱腹感与液体胃排空的延迟有关[27]。有关液体胃排空的研究也已在临床上使用，因为富含营养液的液体的快速排空可能与早期倾倒综合征中的早饱、恶心或呕吐有关[24]。在双同位素固体和液相结合的膳食中（99mTc标记的鸡蛋和111In-二乙烯三胺五乙酸标记的水），固体胃排空正常时液体胃排空会出现异常。通过一项对476例患者的研究发现，当固体胃排空正常[25]时，迟发性液体胃排空的发生率只有5%[25]。然而在另一项研究中，研究人员发现26%的患者固体胃排空是正常的，但是存在液体胃排31 青岛大学硕士学位论文空延迟[28]。固体胃排空的异常，可能与轻度恶心、呕吐、食欲不振、早饱、饭后饱胀感有关。胃轻瘫液体排空的异常与早饱、食欲减退有关。Ziessman及其研究团队报告了一种非营养的、独立于固体食物的液体胃排空的回顾性及前瞻性研究[29]。液体食物包括500毫升的自来水混合99mTc-硫胶体。对固体和液体的研究进行回顾性分析，然后依次进行（在一项前瞻性研究中，液体餐后30分钟，固体餐为4小时）。在回顾性研究中，21例患者中有17例有正常的固体胃排空，其中13例（76%）有延迟性液体胃排空。在前瞻性研究中，10例（33%）正常的固体胃排空伴随液体胃排空的延迟。在第二次更大规模的研究中，101例患者在同一天接受固体和液体餐的同一个实验研究，其中36%的液体研究和16%的固体研究可以发现胃排空延迟。对正常固体排空的患者，32%例有液体延迟排空。在这些研究结果的基础上，作者认为非营养、液体胃排空的研究可帮助我们发现胃底胃动力障碍，有助于改善功能性消化不良患者胃动力障碍的检出率[30]。这些最近的研究进一步表明了液体胃排空研究的作用，但我们的研究还未深入涉及FD患者的非营养液、液体食物的生理效应。当给定一种确定的营养餐后，我们已证明水负荷能够抑制胃运动，并且使健康受试者胆囊收缩素的释放增加。从理论上讲，增加胆囊收缩素是脂肪食糜进入十二指肠的流入反应，随着结果的反馈减慢食物进入十二指肠。这种相互作用被称为十二指肠破裂[31]。此外，还需要进一步研究非营养性水-液体食物的生理和临床意义。直到目前为止，进行胃排空显像还是没有公认的标准。这个问题引发了关于继续接受胃排空显像的不一致的方法问题[8]。因此，在2007年，核医学和分子成像学会胃肠委员会和美国神经胃肠病学和运动社会共同发表了一份共识建议[9]。共识小组建议固体事物的胃排空测试“使用现成的技术和规范性数据，可以为临床医生提供标准化的结果”。核医学和分子成像学会采纳了这一共识[32]，并被列在美国放射学会/儿科放射学会和核医学和分子成像学会的联合实践指南中。常规值不仅来源于膳食，而且也用于获取和处理图像的方法。确定胃排空还需要规范身体姿势、吸烟、月经周期以及每天进行的测试时间等方面[33-35]。如前列腺素、抗分泌药物、胃酸抑制剂和麻醉剂等药物对胃排空都有影响。要求患者在夜间禁食，并停止任何可能影响胃排空的药物。促动力药，可加速胃排空的发生，如甲氧氯普胺（灭吐灵；百特制药），替加色罗（泽马可；诺华制药），红霉素，多潘立酮（吗丁啉；杨森制药），这些药在测试前至少停用两天。可延缓胃排空的药物也需要在测试前停药两天，如阿片类药物（杜冷丁；赛诺菲-安万特）、可待因、吗啡、羟考酮（奥施康定；普度制药）和抗胆碱解痉剂双氯胺，颠茄，苯巴比妥，莨菪碱，32 综述格隆溴铵。患者可以在测试的早晨服用少量的水以服用其他药物，但是要求患者从早上开始测试到4小时内成像期间禁止吸烟。强调糖尿病患者的血糖控制十分重要。糖尿病患者在试验开始前应检查空腹血糖水平。如果血糖水平是275毫克/升或更高，可能会在餐前要求患者注射小剂量的短效胰岛素，然后对病人进行监测，直到血糖水平低于275毫克/升。指导糖尿病患者随身携带胰岛素，如果血糖水平低于275毫克/分升，那么就需要每天注射大约标准剂量一半的胰岛素，因为他们在接下来的4小时内不会进食。共识小组建议使用一种基于大型多中心研究的标准数据的低脂肪膳食[36]。这顿饭包括120克（4盎司）的鸡蛋或一种普通的液体蛋清，混合18.5–37MBq（0.5–1mCi）99mTc硫胶体，2片白面包，30克草莓果酱和120毫升的水。膳食的总能量为255千卡（72%碳水化合物，24%的蛋白质，2%的脂肪和2%的纤维）。在烹饪过程中，99mTc硫胶体与蛋清结合。最近的一项研究表明，这种液体蛋清甚至可以用煎锅或微波烹饪，只要它被煮成牢固的固态，稠度达到要求即可[37]。要求病人在10分钟内进食。进食后，病人立即在站立时成像，必要时仰卧。在整个研究中应避免仰卧位定位，因为这种体位会显著减慢固体的胃排空[38]。推荐的获得胃排空显像图像的时间点是在餐后0，60，120，180，和240分钟。如果是快速胃轻瘫或者胃底容纳受损的情况下，30分钟的图像比较有用。人工定义需要注意的相应胃区，目的是分析胃的总计数。通过计算每个时间点，来统计衰减和深度（衰减）校正的总胃数。据报道，胃中残留的活动占总胃计数的100%。采用一致推荐的固体膳食，如果患者胃潴留2小时的比例超过60%，或4小时的比例超过10%，我们就认为胃排空延迟。由于快速胃排空的症状可以模仿延迟胃排空的症状，因此，该共识也定义了快速胃排空的值，即在30分钟内滞留不超过70%，在1小时内滞留在30%以下。我们用其他辅助方法分析胃排空数据，包括餐后胃排空50%的时间。建议在4小时内进行胃排空闪烁造影，因为研究显示胃潴留对检测异常胃排空的敏感性更强[39]，并且最具可重复性[40]。如果在2小时内有不正常的胃潴留，这项研究可能就要终止了，因为胃排空已经推迟了。调查人员已经公布了在2小时提前终止的标准。虽然早期的终止可以减少一些患者的总成像时间，但还是会有很小的敏感性损失[41]。由于胃底和胃窦的个人特异性，一些患者可能表现出在2小时内胃排空异常和在4小时胃排空正常。另一些情况是，胃排空可能在2小时内是正常的，而在4小时内是异常的。这个结果并不意外，因为固体胃排空研究的早期阶段（0–2h）主要反映了胃底功能，后期阶段（2–4h）主要反映胃研磨和饭菜推进到十二指肠的功能。33 青岛大学硕士学位论文因此未来的治疗方法可能需要分别针对胃底和胃窦。胃排空共识小组也提出了关于在胃排空研究报告中的重要辅助问题的建议。所有的报告都应该涉及由专家所估计的膳食总量的摄入。因为胃排空的正常值是基于摄入整个标准餐，如果只有一小部分膳食摄入，就不能认为这项研究可以确诊。如果病人没有摄入全餐，报告应该加以说明，该结果可能高估了胃排空的速率。胃排空的报告也需要陈述是否观察到任何偶然的异常发现，包括食管滞留或食物反流，食管裂孔疝、胃底包裹或胃底容纳不足。共识小组也意识到了胃排空的复杂性以及他们的建议的局限性。他们承认，许多项目需要进一步澄清，其中包括优化图像时间，需要其他替代膳食的规范性数据，对糖尿病患者血糖控制的作用，在研究期间监测症状的价值，一个评估胃排空延迟的严重程度对的量表，常规手术后胃参考资料，分析胃底、胃窦功能的临床作用，以及其他的定量方法（定量曲线拟合、相位滞后，腹部总计数）。出现呕吐、腹痛或早期饱腹感的婴儿也可能患有胃排空延迟。但是这些共识建议只是针对成年人。非常遗憾，我们目前还没有足够的标准来衡量儿童的胃排空。对婴儿来说，胃排空显像通常与胃食管反流评估有关。这项研究可以通过在孩子的牛奶或配方中添加99mTc硫胶体进行。我们尚不清楚儿童在不同餐后的胃排空的正常值。但据报道1小时内胃潴留的范围为40%-70%胃功能辅助实验通过一个显著地、但数量有限的（30%-70%）糖尿病或功能性消化不良症状患者群体，我们发现了胃排空延迟现象[42]。越来越多的人认识到，要全面评估胃功能，就需要对胃排空进行更细致的研究。在未来，胃排空分析可能包括针对胃底和胃运动功能的独立研究、胃底松弛（调节反应），内脏感觉过敏，十二指肠运动协调，以及胃电节律紊乱[27,43–44]。其他的胃功能的测量作为胃排空闪烁的一部分，但目前并不是常规的表现。有关相位滞后的分析大量的研究证实固体存在早期滞后(研磨)阶段，在随后阶段中，胃会以典型速度将固体颗粒清空[45–47]。为了完全表明胃排空的这些阶段，最好将数据与一个改进功率指数的数学函数相匹配[22]，即y(t)=1-[1-exp(-kt)]β。其中y（t）是t时刻胃活动的百分比，k是曲线的指数部分的斜率，β是y轴截取。滞后相位（ln（β/k））对应于在胃窦高峰值活动时间，在物理上对应的胃窦最大灌装之前以同液体相同的速率（k）充分捣碎的小而悬浮的固体颗粒。因为只在0，1，2，和4小时成像，所以没有足够的曲线拟合分析。研究滞后相位分析还需要更早、更频繁的时34 综述间点。然而常规的延迟期临床分析很少有数据支持。在最近的研究中，Bonta及其团队发现滞后阶段并不能预测延迟的胃排空[41]。胃底容量和胃内分布的研究胃底松弛（容纳）是一个既定的生理反应，使胃内容积不增加而胃内压增加[59]。早期的饱腹感是与较差的容纳反应相关的主要症状。研究表明，消化不良症状与超敏性和深胀性以及功能障碍之间存在相关性[48,49]。胃气压器测试测量了一个胃气球在给定的压力下膨胀的体积，并测量了胃气球的顺应性。有内脏超敏性的病人在低水平的扩张中有症状。尽管气压测试是对胃低容纳最直接的测量，但有研究学者批评该测试为侵入性测试[50]。也有研究人员用微创水负荷试验来研究受损调节和消化不良症状的相关性。在大约50%的功能性消化不良患者中，水负荷和营养液体食物都可以用来评估容量和产生的症状[51]。SPECT胃容受性研究利用了静脉注射后胃粘膜积累99mTc的事实。然后对胃外壁进行三维的SPECT体积成像。我们已证实SPECT是一种测量胃容积的非侵入性方法[52,53]。也可以同时评估液体或固体食物排空和胃调节的关系。这样的研究表明，胃容积的最大变化(平均值，185%)在进食后立即发生，尽管食物相对快速的排空，但胃容积增大仍然存在[54]。对气囊气压器与SPECT之间的胃餐后空腹容积比的直接比较，表现出了对健康和术后患者的适应能力的准确测量[51]。在对大量消化不良症患者的回顾研究中，证实了SPECT测量的附加临床效用。回顾性分析214例患者中，47%例消化不良患者和25%例正常胃排空患者的胃调节功能受损[55]。一项与SPECT胃容积水-饮料负荷试验比较的研究发现，功能性消化不良患者空腹胃容量明显高于对照组。在水负荷试验后，功能性消化不良的患者摄入的水要少得多，胃远端也有损伤。然而，腹胀、疼痛和饱腹的症状是由近端而非远端胃容积决定的[56]。异常胃内分布也与消化不良症状相关。在一项使用SPECT的研究中，早期近端胃排空较低，而当SPECT胃调节功能受损时，近端胃的排空时间延长了一半[57]。在另一项容量反应的研究中，胃被简单地分为近端和远端部分。早期的饱腹感与早期的食物的远端再分配有关，而饱胀感与后期的近端滞留有关[18]。因为在常规平面胃排空图像上可以观察到异常的胃底调节，所以最近关于胃排空的共识建议，评估这些图像是否存在异常的容纳反应[9]。固体食物摄入后的第一组的图像（在0分钟时间点），是观察正常胃底容纳反应的最佳时期。一般来说，大部分的固体食物都在胃的上半部分。另一个重要发现是，缺乏正常胃底功能可以解释病人症状，尤其是当胃排空正常的时候（图3）。35 青岛大学硕士学位论文图3胃底容纳受损第一次餐后摄取图像(0min)显示缺乏正常的胃底调节，大部分的食物都是在远端胃而不是在胃底(箭头)中看到的。总的来说，胃排空是正常的，42%的食物保留120分钟，8%保留240分钟。有一些相互矛盾的报告称，胃底容纳受损导致胃排空加快。从手术入胃、胃束带和气囊置放术中，胃食道功能受损，可促进固体转移到远端胃，并可能导致快速的胃排空。在针对功能性消化不良和低胃调节患者的研究中，13%的患者存在迅速的胃排空和28%例的胃排空正常[55]。相比之下，camilleri及其研究团队通过研究低量餐后患者的胃底容纳，发现近端胃排空减少，但这些患者的整体胃排空是正常的[57]。他们认为，尽管近端胃排空延迟，但是相应的补偿机制加快了。双隔室（底–窦）胃排空闪烁显像很容易分析胃底和胃窦之间的试验餐的胃内分布分析，这是测量区域和总量的理想方法。研究表明，近端胃潴留与恶心，早饱、腹胀、反酸相关联，而呕吐更多地是与胃排空的延迟有关。在图像中胃底和胃窦的胃排空和区域各量化可以帮助解释的消化不良症状的检查，尤其是当胃排空是正常的时候[18,58]。胃窦收缩显像我们已开发出测量胃窦收缩的频率和振幅的方法。胃窦收缩的频率通常是以每分钟3次的频率。测量胃窦收缩的频率和强度可以帮助我们增强对正常和异常的胃排空的理解。糖尿病胃轻瘫、胃排空不仅因其在胃底的食物潴留而延迟，而且在较高的频率下也会被减弱的窦性收缩所耽误[59]。大多数胃轻瘫患者都是女性，在一项大型研究中占82%的优势[60]。正常男性和女性胃排空的差异是由于收缩的幅度而不是频率。不过，当用闪烁测量法来测量胃窦收缩的幅度时，我们发现女性的振幅收缩与月经周期的相位不相关[61]。36 综述PET中子活化虽然与常规的胃排空成像没有联系，在未来，PET脑成像评估大脑-内脏轴及其与胃功能的关系也许可以帮助我们了解消化不良患者。大脑的PET显示出特定的神经激活通路，与真菌的扩张和消化不良的症状有关[62]。展望我们已经对胃排空闪烁术进行了必要的标准化。针对固体和液体的研究在评估上消化道症状的患者中发挥了重要作用。因为简单的胃排空测量往往不足以解释病人的症状，有必要对胃排空的闪烁造影术进行分析，包括对基底和胃窦的单独作用，以及胃与其他器官系统的复杂的相互作用。37 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攻读学位期间研究成果攻读学位期间研究成果[1]谢鹏昆，栾晓，柳洋，郭菲菲，孙向荣，徐珞.姜辣素对链霉素诱导糖尿病大鼠ghrelin表达及胃轻瘫的影响[J].现代生物医学进展，2018，18(6):1067-1072.43 致谢致谢衷心感谢我的导师徐珞教授对我的悉心关怀和深切教诲。本论文自始至终都是在导师的精心指导下完成。导师严谨的治学态度、不断进取的科研精神，忘我敬业的工作作风，为我树立了做人和做事的榜样，将使我终生受益。感谢孙向荣副教授、郭菲菲老师、高胜利老师对我实验的指导和无私的帮助。感谢病理生理学教研室师姐，师妹们对我的关心和支持。感谢我的父母这么多年来对我学业的一贯支持，你们一直是我求学之路的坚强后盾，没有你们的关心和支持就没有我今天的成就。最后，感谢在百忙之中前来参加我论文的评审与答辩工作的专家教授们！你们宝贵意见将是我人生中一笔宝贵的财富。44 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明45
