资源描述：
《一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
广而学号：２０１０７０００２医科Ａ＃ｖｖＩＢ＾ｙＧｕａｎｇｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ硕士学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析□舍口錢导师姓名：吴原专业名称：神经病学申请学位类型：专业学位答辩委员会主席：钟维章答辩委员会委员：胡才友王进黄文沈岳飞二〇—ｂ年六月 原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含萩得广西医科大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一同工作的同志对本。与我研宂所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字曰期：上４年６月ｉ曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：在校期间论文的知识产权属广西医科大学。学校有权保存论文的电子和纸质１文档，可以借阅或上网公布本论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印或其它手段保存、汇编本论文，学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。同意广西医科大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。保密论文在解密后遵守此规定。学位论文作者签名：ｉｋ导师签字：丨Ｕ｜签字曰期：以，７年月ｉ曰签字曰期：＾１，７年Ｚ月义曰 个人简历基本情况：姓名:吕鑫性别：男民族:汉族出生年月:1991.10籍贯:广西玉林市陆川县政治面貌:共青团员学习工作经历：起止时间所在院校或单位学历学位职称2010.09—2015.07广西医科大学学士学位学生2015.08—2017.06广西医科大学第一附属医院硕士学位学生研究生期间科研经历/临床工作经历：起止时间单位职称2015.08—2017.06广西医科大学第一附属医院研究生实习医师 目录一、论文：一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析...................11、中文摘要....................................................................................................12、英文摘要....................................................................................................33、前言............................................................................................................54、对象与方法................................................................................................65、结果............................................................................................................96、讨论..........................................................................................................137、结论..........................................................................................................198、参考文献..................................................................................................20二、附录：中英文单词缩略词表......................................................................26三、综述：结节性硬化症的临床特点及致病基因突变的研究进展.............271、综述正文..................................................................................................272、参考文献..................................................................................................34四、致谢...............................................................................................................39 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析摘要目的结节性硬化症(TuberousSclerosisComplex，TSC)是一种常染色体显性遗传的神经皮肤综合征,以全身各系统的错构瘤样增生为主要特征，以面部血管纤维瘤、癫痫发作、智能减退为主要临床表现。其致病基因分别为TSC1和TSC2基因,两者均为肿瘤抑制基因，分别编码错构瘤蛋白(hamartin)和马铃薯球蛋白(tuberin)。本研究旨在对一结节性硬化症家系进行基因突变分析,明确其基因突变位点、类型，区分其为家族性还是散发性，为TSC的诊断提供确切依据。方法收集1例临床确诊结节性硬化症患者、其父母及妹妹的临床资料，提取患者及其3名家系成员(父母、妹妹)的外周血DNA，应用聚合酶链反应（PCR）扩增TSC1和TSC2基因所有的外显子编码区，并以Hisq3000高通量测序仪对PCR反应产物测序进行序列分析。结果患者女性，有腰背部斑驳样皮肤改变，腰骶部鲨革斑，伴有色素脱失斑，脑电图提示左枕、左后颞部棘慢、尖慢波发放，颅脑CT发现左枕部钙化，无明显智力障碍，无抽搐发作史。该家系共3名女性受累，均达到TSC临床确诊标准，对患者父母及其妹妹的DNA样本进行基因测序验证。基因测序结果发现2个突变位点，在TSC1基因上发现一个无义突变c.2071C＞T（p.Arg691Ter）；在TSC2基因上发现一个错义突变c.1973A＞C（p.Lys658Thr）。其妹妹及母亲亦携带此两者突变。结论同一家系中，相同基因型患者之间可有不同的临床表型，且随着病程、年龄的增长，其临床表型更趋于严重。基因检测发现该家系中存在两个TSC基因突变位点：c.2071C＞T与c.1973A＞C。c.2071C＞T为致病性突1 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析变，c.1973A＞C临床意义尚不明确，需进一步动物实验及蛋白功能测定证实。本研究中首次发现TSC1基因第17外显子rs118203631位点上的突变病例中存在家族性遗传。关键词结节性硬化症，临床特点，TSC基因，基因突变2 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析CLINICALCHARACTERISTICSANDPATHOGENICMUTATIONSOFAFAMILYOFTUBEROUSSCLEROSISABSTRACTObjectiveTuberousSclerosisisanautosomaldominantgeneticdiseaseinvolvingmultiplesystems,characterizedbydysplasticdysplasiainvarious，tissuesandorgans.Itstypicalclinicalmanifestationsarefacialvascularfibroma，seizuresandmentalretardation.ThepathogenicgenesareTSC1andTSC2genes,respectively,encodinghamartinandtuberin.Theaimofthisstudywastoanalyzethegenemutationinafamilyofnodularsclerosis,todeterminewhetherthegenemutationsite,type,distinguishitisfamilialorsporadic,andprovidetheexactbasisforthediagnosisofTSC.MethodsPeripheralvenousbloodsamplesandclinicaldataofapatientwithtuberoussclerosisand3familymembers(parentsandsister)werecollected.GenomicDNAwasextracted．AllcodingexonsoftheTSClandTSC2genesandtheirflankingintronicsequenceswereamplifiedbypolymerasechainreactionandsubjectedtodirectsequencing．ResultsThefemalepatienthaslowerbackmottledrash,lumbosacralsharkstains,accompaniedbypigmentloss,EEGpromptedleftpillow,lefttemporalspikeslowandsharpslowwaverelease.Neuroimagingexaminationnotedleftoccipitalnodularcalcification.Noobviousmentalretardation,nohistoryof3 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析convulsions.Thepatientshadfamilyhistory,3femalepatientsintotal.Genesequencingresultsrevealedtwomutations.Genesequencingresultsrevealedtwomutations.Anonsensemutationc.2071C>T(p.Arg691Ter)wasfoundontheTSC1geneasaheterozygousmutationsite.Amissensemutationc.1973A>C(p.Lys658Thr)wasfoundontheTSC2geneasaheterozygousmutationsite.Andthemutationswereinheritedfromhersisterandmother.ConclusionsThesamegenotypepatientscanhavedifferentclinicalphenotypeInthefamily,andwiththecourseofdisease,age,theclinicalphenotypeismoreserious.GeneticanalysisrevealedthatthereweretwoTSCmutationsinthefamily:c.2071C>Tandc.1973A>C.C.2071C>Tisapathogenicmutation,c.1973A>Cmaybepathogenicmutations,needtobefurtheranimalexperimentsandproteinfunctiondeterminationtoconfirm.Inthisstudy,wefoundthattherewerefamilialinheritanceinmutationsinthers118203631locusofexon17ofTSC1gene.KEYWORDSTuberoussclerosis,Clinicalfeatures,TSCgene,Genemutation4 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析前言[1]结节性硬化症（TSC）于1880年由法国医生Bourneville首次报道，其是一种常染色体显性遗传性疾病，结节性硬化症的成人发病率大约为1/8[2]000，新生儿的发病率大约是1/6000，无性别差异，本病多为新生突变的[3]散发病例，约1/3具有家族性，典型的临床表现为癫痫发作、智能减退及面部血管纤维瘤,是与脑，心脏，肺，眼睛或肾脏中的错构瘤或良性肿瘤生[4]长相关的多系统疾病。TSC的致病基因为TSC1和TSC2基因,二者同属于肿瘤抑制基因。TSC1基因位于9q34.3，包含了23个外显子。TSC1基因的第3-23外显子为编码区，而第1、2外显子却并不具备任何编码功能，转录产物是长度约为8.6kb的信使RNA（mRNA），编码、翻译的最终产物为由1164个氨[5]基酸组成的相对分子质量为130000的错构瘤蛋白（hamartin）。而TSC2基因位于16p13.3，包含了41个具有编码功能的外显子和1个非编码功能的先导外显子，转录产物是长度约为5.4kb的mRNA，编码、翻译的最终产物为1807[6]个氨基酸组成的相对分子质量约为198000的马铃薯球蛋白（tuberin）。Tuberin与hamartin蛋白在细胞内可以形成蛋白复合物，且该复合物通过tuberin蛋白对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体（mTOR）信号转导通路的影[7,8]响，来实现对细胞代谢，细胞生长，细胞周期和增殖的调控。TSC1或TSC2基因一旦发生突变，可引起哺乳动物雷帕霉素蛋白复合体功能减弱甚至丧[9]失，造成了mTOR信号转导通路持续性的异常活化，进而导致了TSC的发生。本研究中，我们通过对一结节性硬化症家系进行基因突变分析，明确其基因突变位点、类型，区分其为散发型还是家族性，为TSC的诊断提供确切依据。5 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析对象与方法1.1对象（先证者）患者，女，11岁。发作性视物模糊数年，每次持续数秒，无抽搐发作，共发作4次，查体可见腰背部斑驳样皮疹、色素脱失斑及腰骶部鲨革斑（图1），无只能减退；脑电图可见左枕、左后颞部棘波、尖波、棘慢、尖慢波发放，头颅CT提示右侧脑室旁、基底节区及左枕叶斑点状钙化灶（图2）。家族史：该家系共10名，其中3名女性受累，均达到临床确诊的标准，该3名患者分别为先证者、其妹妹及其母亲。因此，在征得患者父母的同意下，采集患者、其妹妹及其父母的外周静脉血2ml送第三方检验机构行基因测序验证。图1先证者皮肤改变：色素脱失、斑驳样皮肤及腰骶部鲨革斑（红色箭头所示）Figure1Theproband'sskinchangesincludepigmentloss,mottledskinandlumbosacralsharkspot(indicatedbytheredarrows)图2先证者颅脑CT表现：右侧侧脑室旁、基底节区及左枕部斑点状钙化灶（红色箭头所示）Figure2Theproband'sbrainCTsuggeststhattherearearightlateralventricle,basalgangliaandleftoccipitalspottedcalcification(indicatedbytheredarrows)6 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析1.2实验试剂和耗材美国illumina公司的：TruSeq®DNALTSamplePrepKitv2、TruSeqPEClusterKit-cBot–HS3000、TruSeqSBSKit-HS(300-cycles)；Roche公司的NimblegenExomeKitV4；德国Qiagen公司QIAampDNABloodMaxiKit；美国Beckman公司的AmpureBeads；美国life公司的Quant-iT™PicoGreen®dsDNAAssayKit；美国Axygen公司的枪头与离心管；纯水及其它生化试剂。1.3实验仪器美国Illumina公司的CBOT簇生成仪及Hisq3000高通量测序仪；美国Scanspeed公司的冷冻离心机；美国Thermo公司的Nanodrop、浓缩仪、-80超低温冰箱及常温离心机；美国Life公司的普通PCR仪；美国Invitrogen公司的Qubit；美国SI公司的漩涡混合仪vortex-genie2；德国eppendrof公司的移液器；中国天能公司的电泳仪及成像系统；比利时Biorupter的波破碎仪；中国智城公司的摇床及磁力架；中国海尔公司的4度冰箱。1.4实验方法1.4.1DNA抽提（血液）在征得患者父母的同意下，采集患者外周血2ml，采用德国QIGEN公司生产的QIAampDNABloodMaxiKitDNA试剂盒，按照其使用说明的步骤进行DNA提取。1.4.2DNA质检以美国Thermo公司生产的qubit仪器进行定量，根据定量结果，以1%琼脂糖进行电泳检测，最后生成并分析质检报告。1.4.3DNA文库构建用Biorupter超声破碎仪将DNA打断，并加illuminaEndrepairbuffer混匀，然后离心，经过PCR仪扩增，并采用上述提供的引物及试剂进行实7 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析时PCR检测，最后以Qubit定量DNA文库。1.4.4外显子捕获经过杂交，DNA洗脱，然后以PCR进行扩增，纯化PCR产物，得到TSC全部外显子序列模板。1.4.5簇生成以美国Illumina公司生产的CBOT簇生成仪对经过文库定量、稀释、杂交后的产物进行簇生成。1.4.6IlluminaHiseq3000测序将上一步骤中的生成产物以Hisq3000高通量测序仪进行测序。8 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析结果1.1临床分析结果根据患者父母、妹妹的临床资料，发现患者母亲及其妹妹均达到TSC的临床确诊标准。母亲：33岁，有20余年癫痫发作病史，发作类型为全面强直阵挛，平均1次/周，频繁时一天数次，且经多种抗癫痫药物治疗，癫痫发作均未得到有效控制，且有明显智能减退；查体可见面部皮脂腺瘤、腰骶部鲨革斑、左上肢色素脱失；颅脑CT提示额叶、右侧基底节区、两侧室管膜下及脑室周围见散在斑点状、斑片状钙化灶（如图3）；脑电图、心电图、腹部超声等未见明显异常。妹妹：6岁，无癫痫发作史，未见智能减退，查体可见左下肢色素脱失斑及腰骶部鲨革斑；颅脑CT提示两侧室管膜下及脑室周围见散在斑点状、斑片状钙化灶（如图4）；脑电图、心电图、腹部超声等未见明显异常。家系图谱见图5。图3先证者母亲的临床特征：面部脂粒、色素脱失、鲨革斑，颅脑CT可见室管膜下结节（红色箭头所示）Figure3Theclinicalcharacteristicsoftheproband'smother:faciallipids,pigmentloss,sharkandsubventricularnodules(indicatedbytheredarrows)9 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析图4先证者妹妹的临床特征：色素脱失、鲨革斑及室管膜下结节（红色箭头所示）Figure4Theclinicalcharacteristicsoftheproband'ssister:pigmentloss,sharkandsubventricularnodules(indicatedbytheredarrows)正常男性正常女性患病女性先证者图5结节性硬化症家系图谱Figure5PedigreeofTSCfamily10 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析1.2基因检测结果该家系中共有三名临床确诊TSC患者，以先证者的DNA样本进行sanger测序，测序结果发现患者存在2个突变位点，在TSC1基因第17外显子基因位点rs118203631存在c.2071C＞T（p.Arg691Ter）无义突变，该突变引起第2071位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，使其翻译的第691位氨基酸即精氨酸密码子处变为终止密码子，导致其翻译的蛋白产物形成无功能的截断蛋白。在TSC2基因第19外显子基因位点rs397515223存在c.1973A＞C（p.Lys658Thr）错义突变，该突变引起第1973位碱基由腺嘌呤（A）突变为胞嘧啶（C），使其翻译的第658位氨基酸由赖氨酸变成苏氨酸。对患者父母及其妹妹的DNA样本进行基因测序验证后，发现其父亲为正常表型，而其母亲及妹妹亦携带上述两者突变（图6、7）。经检索，二者突变在LOVD数据库（http://www.lovd.nl/CHROMIUM）均有报道，且二者突变均属于杂合型突变，其中c.2071C＞T属于致病性突变，而c.1973A＞C临床意义尚不明确。11 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析图6结节性硬化症家系TSC1基因互补链测序结果（箭头示突变位点）Figure6SequencingsequencingofTSC2geneinfamilieswithtuberoussclerosis(arrowsshowedthemutation)图7结节性硬化症家系TSC2基因模板链测序结果（箭头示突变位点）Figure7SequencingsequencingofTSC2geneinfamilieswithtuberoussclerosis(arrowsshowedthemutation)12 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析讨论结节性硬化症（TSC）是一种常染色体显性遗传的神经皮肤综合征，以多器官缺陷和错构瘤为主要特征，几乎可累及所有器官，典型表现为皮肤[10]改变、癫痫发作及智能减退，其主要与TSC1及TSC2基因突变相关。TSC从被报道至今，其诊断标准经过多次修订，首先提出TSC诊断标准的是[11]Gomez，限于当时国际上对TSC的认识不够，仅仅把临床特征作为确诊依[3]据，后有学者于1998年在国际TSC临床共识会议上对该标准进行了修订，但随着近年来医学影像学和高通量基因测序技术的发展，人们对于TSC的认[12]识不再仅仅局限于临床特征上的改变，2012年Northrup等修订了新的TSC诊断标准（见表1）。虽然TSC诊断标准经过多次修订，但是临床特征仍然是TSC确诊的主要方法，最主要的改变是基因检测结果作为独立的诊断标准，一经检测到TSC1/TSC2的基因突变即可确诊，因此基因检测目前作为TSC诊断的重要手段之一。而TSC基因诊断的意义主要在于对临床特征未达到确诊标准时的协助诊断、临床诊断时的确认，还有TSC基因突变类型的鉴定，以及明确家庭成员是否受累、区分其突变属于家族性还是散发性。13 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析［12］NorthrupH等学者2013年发表在Pediatricneurology上的一篇研究中统计了TSC患者各脏器病变的发生几率，其中皮肤改变:：色素脱失斑最高，达87%-100%，面部血管纤维瘤次之，达75%-90%，其次分别是甲周纤维瘤约为20%-88%、鲨革斑约为50%、斑驳样皮肤改变约为3%-58%；而中枢神经系统：室管膜下结节发生几率最高，达到70%-80%，其次是室管膜下巨细胞星形细胞瘤（subependymalgiantcellastrocytomas，SEGAs）5%-20%；其他系统：如视网膜病变约为40%；心脏横纹肌瘤约为47%-67%；肺淋巴管肌瘤病多见于女性患者，且占了30%-40%；肾血管平滑肌瘤（angiomyolipoma，AML）约为80%，肾脏囊肿约为20%。基因检测结果显示该TSC家系三名患者均具有相同基因型，但其临床表表型不同。三名患者皮肤异常改变均在14岁以前，其中先证者存在色素脱失斑、鲨革斑及背部斑驳样皮肤改变，脑电图可见左枕、左后颞部棘慢波，颅脑CT提示右侧脑室旁、基底节区及左枕叶斑点状钙化灶，但既往无抽搐发作病史，无智能减退；其妹妹亦存在色素脱失斑及腰骶部鲨革斑，颅脑CT可见两侧室管膜下及脑室周围见散在斑点状、斑片状钙化灶，无癫痫发作史及智能减退；其母亲存在色素脱失斑、鲨革斑及面部血管纤维瘤，额叶、右侧基底节区、两侧室管膜下及脑室周围见散在斑点状、斑片状钙化灶，有明显的智能减退，且20余年癫痫抽搐发作病史，且经多种抗癫痫药物治疗，均未得到有效控制，符合药物难治性癫痫的诊断；按照2012年修订的TSC诊断标准，该家系中三名患者均达到结节性硬化症临床确诊标准。[13]Fryer等在1987年首先发现及报道了TSC的第一个致病基因，并把该[14]致病基因命名为TSC1基因，该基因位点位于9q34.3；而随之，Kandt等在1992年发现并报道了TSC的第二个致病基因,并把该致病基因命名为[15]TSC2基因，该基因位点位于16p13.3。TSC1基因于1997年被Van等克隆，[16]而TSC2基因于1993年被克隆出。自TSC1/TSC2突变基因报道，截至2017年3月，LOVD突变数据库总共收录了871个TSC1和2473个TSC2基因突变位14 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析点（chromium.lovd.nl/LOVD2/TSC/）。数据库收录突变比例及相关文献报[2,17-20]道，TSC1基因突变约占31%，TSC2基因突变约占69%。基因检测方法有多种，而由于检测方法不同，测序结果往往也会有差[21][22]异。在以往的研究中，Au等及Hung等报道TSC患者TSC1/TSC2基因突变的检出阳性率仅为60%-85%。有学者认为，这是由于突变可能位于低级体[23]细胞镶嵌性或者身份不明的基因位点，如TSC3基因，亦或者其他类型基[24]因突变，如遗传变异和马赛克突变等。近年来随着新一代高通量测序(nextgenerationsequencing，NGS)技术的发展，NGS已越来越多的应用于遗传病的诊断中，并体现出相对于传统测序来说，更快速、准确、低成本、高覆盖度等众多优势。目前NGS在遗传病诊断应用中主要有全基因组测序(wholegenomesequencing，WGS)、全外显子测序(wholeexonsequencing，WES)及靶向基因测序几种。NGS技术通过加深测序深度，不仅可以发现低比例的细胞嵌合突变，同时也对很多的非编码区进行同步检测，因而NGS技术不仅可以检测点突变、微小插入或缺失，也可以通过算法得到大片段重复、缺失的结果。此外NGS尚可将TSC1、TSC2两个基因的所有外显子通过高通量测[25]序一次得到全部检测结果，并且可以将多个样本同时进行检测。这些都大大提高TSC突变基因的阳性检出率。本研究中，我们通过对一结节性硬化症家系进行靶向捕获+高通量基因测序，明确其基因突变位点、类型，为TSC的诊断提供分子水平上的确切证据。TSC基因突变的类型主要包含错义突变、无义突变、剪接位点突变、移码突变，少数大片段缺失和插入突变等。据报道，TSCl突变类型主要以点突变（如无义突变、错义突变、剪接突变、移码突变等）、小片段的缺失[22,26-28]及小片段的插入为主，而TSC2基因的突变大多数是错义、无义突变，[22，26]其次是小片段缺失，大片段缺失和剪接突变，且常有基因重组。根据LOVD数据库显示，在已报道突变中，TSC2突变明显多于TSC1突变，比例约为7:3。有研究表明，在不同的种族人群TSC2/TSC1基因突变比例不同，欧15 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析[29]美国家为2.8-3.5，而波兰及台湾地区是欧美国家的2倍左右。台湾地区[22]报道的84例对于TSC基因突变患者的研究，结果显示TSC2/TSC1突变比例约为6，与Józwiak等的研究结果一致，但就TSC2/TSC1突变比例是否存在种族差异这一问题而言，由于尚无各种族的大量样本研究数据，目前尚存在争议。[30]有文献报道TSC患者癫痫发作的发生几率为73%-90%，而其中有1/3以上的TSC相关性癫痫为药物难治性癫痫，且其中以TSC2基因突变者多见[31-32][21]，且其TSC的癫痫发作与皮质及皮质下结节部位有关。Au等报道，[33]TSC2基因突变患者中以皮肤色素脱失斑和智能下降多见，而在Jansen等的研究表明中发现，TSC2基因突变者癫痫首发年龄更小、智商更低、结节更多。在该TSC家系中，先证者母亲有癫痫发作及智能减退的临床表现，且其皮层及皮层下结节部位、数量较其他两名患者多，兼之其携带有TSC2的[34]基因突变，这与以上研究结果相符合。而张林妹等在研究中发现，TSC2基因突变较TSC1基因突变，在群体层面上，TSC2基因突变者具有更严重的临床特征，这可能与TSC2基因编码的蛋白结构和功能十分复杂密切相关。[35]但由于TSC1/TSC2基因突变的临床表型间存在交叉现象，各种临床综合症在两者突变中均有报道，因而在特定的个体，根据TSC1或TSC2突变并不[34，36]能预测特征的严重性，但就总体趋势而言，TSC2基因突变患者者临床表型更严重。因此较TSC1基因突变患者而言，TSC2基因突变患者可能具有更严重的临床表型并需要更多的医疗干预来预防及改善预后。本研究中发现该家系中三名TSC患者均存在相同的2个突变位点，TSC1基因的c.2071C＞T（p.Arg691Ter）突变为无义突变，该突变引起第2071位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，导致其在翻译第691位氨基酸即精氨酸蛋白产物时提前终止，形成无功能的截断蛋白，影响tuberin和Hamartin-tuberin复合物功能，导致了TSC的发生，据文献报道及数据库资料显示，此突变位点为致病性突变，在SNP数据库登记号为：rs118203631：16 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析NM_001162426.1:c.2071C>T（p.Arg691Ter）。TSC2基因的c.1973A＞C（p.Lys658Thr）突变为错义突变，该突变引起第1973位碱基由腺嘌呤突变为胞嘧啶，导致其在翻译第658位的氨基酸由赖氨酸转变成苏氨酸，在SNP数据库的登记号为：rs397515223：NM_001114382.2：c.1973A＞C（p.Lys658Thr）。在LOVD数据库中显示，c.1973A＞C突变仅被报道1次，[37]而在该报道中，Marianne等未就该突变位点的致病性及临床意义进行阐述，在本研究中，c.2071C>T与c.1973A＞C突变共存，c.2071C>T已被报道导致TSC，c.1973A＞C临床意义尚不能确定，Hisq3000高通量测序仪进行的测序结果预测其可能为致病性突变，且该家系中，三名患者均携带此突变，而先证者父亲（正常表型）中未发现此位点突变，因而推断此位点突变为基因多态性的可能性不大，且极有可能为致病性突变，但此突变对蛋白复合物功能的实际影响需要进一步的动物试验及蛋白功能测定以证实。[34]在张林妹等对105例TSC患者的临床特征总结中，发现TSC患者脑皮质结构异常、肾脏病变、皮肤改变（如色素脱失斑、面部皮脂腺瘤、鲨革斑）等多系统病变均随发病年龄的增长，其几率呈现增高的趋势。而在本研究中，该家系三名患者均携带c.2071C>T与c.1973A＞C突变，但其临床表型却不尽相同，呈现出随着年龄增长，发病程度越来越严重的趋势，年龄最小者临床表现上仅有皮肤改变；先证者表现为皮肤的改变及电生理上的痫样放电，但无临床癫痫发作；母亲则是皮肤改变、癫痫发作及智能减退的典型结节性硬化症表现，且其癫痫发作符合药物难治性癫痫的诊断标准。由此推测，随着年龄的增长，该家系中，先证者及其妹妹有疾病进展的可能，因而需要长期定期随访,若有进展趋势或出现新发症状，应及时干预。TSC是一种常染色体显性遗传性疾病，但TSC1/TSC2基因一旦发生致病性突变，大多数会引起严重的临床症状，因而TSC患者更难有机会去组建家庭和生育后代，所以突变基因难以遗传下来。此外，源于TSC1和TSC2基因外显子及碱基对数目较多，故其相对而言有一定的随机突变机率，因17 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析此，综合以上因素，该病虽呈现为常染色体显性遗传性疾病，但其家族性病例比例不高，反而以散发性病例多见。而散发病例中TSC2突变更普遍[38-40]。研究显示，在散发病例中TSC2突变率高达80%，TSC1基因突变约[41-43]10%，而在家族性病例中多见于TSC1突变，TSC2基因突变率仅30%左右[44]。在以往的研究中，发现于TSC1基因位点rs118203631的突变均为散发性[22，45-46]病例，而本研究中发现该结节性硬化症家系中先证者妹妹及母亲均携带此突变，故c.2071C>T突变属于家族性遗传，且在本研究中首次报道。18 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析结论同一家系中，相同基因型患者之间可有不同的临床表型，且随着年龄、病程增长，临床表型更趋于严重。该家系中存在两个TSC基因突变位点：c.2071C＞T与c.1973A＞C。c.2071C＞T为明确的致病性突变，c.1973A＞C临床意义尚不明确，需进一步动物实验及蛋白功能测定证实。本研究中首次发现TSC1基因第17外显子rs118203631位点上的突变病例中存在家族性遗传病例。19 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析参考文献[1]BournevilleDM.Sclerosetubereusedescirconvolutionscerebrales:idiotieetepilepsiehemiplegique[J].ArchNeurol(Paris),1880,1:81-91.[2]DiMarioFJ,SahinM,Ebrahimi-FakhariD.Tuberoussclerosiscomplex[J].PediatricClinicsofNorthAmerica,2015,62(3):633-648.[3]RoachES,GomezMR,NorthrupH.Tuberoussclerosiscomplexconsensusconference:revisedclinicaldiagnosticcriteria[J].Journalofchildneurology,1998,13(12):624-628.[4]O'callaghanFJK,ShiellAW,OsborneJP,etal.Prevalenceoftuberoussclerosisestimatedbycapture-recaptureanalysis[J].TheLancet,1998,351(9114):1490.[5]NapolioniV,CuratoloP.Geneticsandmolecularbiologyoftuberoussclerosiscomplex[J].Currentgenomics,2008,9(7):475-487.[6]CheadleJP,ReeveMP,SampsonJR,etal.Moleculargeneticadvancesintuberoussclerosis[J].Humangenetics,2000,107(2):97-114.[7]LimaAJS,Hoogeveen-WesterveldM,NakashimaA,etal.IdentificationofregionscriticalfortheintegrityoftheTSC1-TSC2-TBC1D7complex[J].PloSone,2014,9(4):e93940.[8]HuangJ,ManningBD.TheTSC1–TSC2complex:amolecularswitchboardcontrollingcellgrowth[J].BiochemicalJournal,2008,412(2):179-190.[9]CrinoP,NathansonK,PetriE.Thetuberoussclerosiscomplex[J].NEngJMed,2007,356:92-94.[10]IsmailNFD,MalikNMANA,MohseniJ,etal.TwonovelgrossdeletionsofTSC2inMalaysianpatientswithtuberoussclerosiscomplex20 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析andTSC2/PKD1contiguousdeletionsyndrome[J].Japanesejournalofclinicaloncology,2014,44(5):506-511.[11]GomezMR.Criteriafordiagnosis[M]//Tuberoussclerosis.RavenPress,NewYork,1988:9-19.[12]NorthrupH,KruegerDA,InternationalTuberousSclerosisComplexConsensusGroup.Tuberoussclerosiscomplexdiagnosticcriteriaupdate:recommendationsofthe2012InternationalTuberousSclerosisComplexConsensusConference[J].Pediatricneurology,2013,49(4):243-254.[13]FryerAE,ConnorJM,PoveyS,etal.Evidencethatthegenefortuberoussclerosisisonchromosome9[J].TheLancet,1987,329(8534):659-661.[14]KandtRS,HainesJL,SmithM,etal.Linkageofanimportantgenelocusfortuberoussclerosistoachromosome16markerforpolycystickidneydisease[J].Naturegenetics,1992,2(1):37-41.[15]VanSlegtenhorstM,DeHoogtR,HermansC,etal.IdentificationofthetuberoussclerosisgeneTSC1onchromosome9q34[J].Science,1997,277(5327):805-808.[16]EuropeanChromosome16TuberousSclerosisConsortium.Identificationandcharacterizationofthetuberoussclerosisgeneonchromosome16[J].Cell,1993,75(7):1305-1315.[17]NiidaY,WakisakaA,TsujiT,etal.MutationalanalysisofTSC1andTSC2inJapanesepatientswithtuberoussclerosiscomplexrevealedhigherincidenceofTSC1patientsthanpreviouslyreported[J].Journalofhumangenetics,2013,58(4):216-225.[18]WangGX,WangDW,YiCY,etal.MutationalanalysesoftheTSC1andTSC2genesincasesoftuberoussclerosiscomplexinChineseHanchildren[J].GenetMolRes,2013,12:1168-75.21 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析[19]LeeJS,LimBC,ChaeJH,etal.MutationalanalysisofpaediatricpatientswithtuberoussclerosiscomplexinKorea:genotypeandepilepsy[J].EpilepticDisorders,2014,16(4):449-455.[20]NellistM,BrouwerRWW,KockxCEM,etal.TargetedNextGenerationSequencingrevealspreviouslyunidentifiedTSC1andTSC2mutations[J].BMCmedicalgenetics,2015,16(1):10.[21]AuKS,WilliamsAT,RoachES,etal.Genotype/phenotypecorrelationin325individualsreferredforadiagnosisoftuberoussclerosiscomplexintheUnitedStates[J].GeneticsinMedicine,2007,9(2):88-100.[22]HungCC,SuYN,ChienSC,etal.Molecularandclinicalanalysesof84patientswithtuberoussclerosiscomplex[J].BMCmedicalgenetics,2006,7(1):72.[23]QinW,KozlowskiP,TaillonBE,etal.Ultradeepsequencingdetectsalowrateofmosaicmutationsintuberoussclerosiscomplex[J].Humangenetics,2010,127(5):573-582.[24]VerhoefS,BakkerL,TempelaarsAMP,etal.Highrateofmosaicismintuberoussclerosiscomplex[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,1999,64(6):1632-1637.[25]黄昌艳.结节性硬化症TSC1/TSC2基因突变的高通量测序快速诊断[J].细胞与分子免疫学杂志,2016(1):92-95.[26]LangkauN,MartinN,BrandtR,etal.TSC1andTSC2mutationsintuberoussclerosis,theassociatedphenotypesandamodeltoexplainobservedTSC1/TSC2frequencyratios[J].Europeanjournalofpediatrics,2002,161(7):393-402.[27]SancakO,NellistM,GoedbloedM,etal.MutationalanalysisoftheTSC1andTSC2genesinadiagnosticsetting:genotype–phenotypecorrelations22 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析andcomparisonofdiagnosticDNAtechniquesintuberoussclerosiscomplex[J].EuropeanJournalofHumanGenetics,2005,13(6):731-741.[28]KozlowskiP,RobertsP,DaboraS,etal.Identificationof54largedeletions/duplicationsinTSC1andTSC2usingMLPA,andgenotype-phenotypecorrelations[J].Humangenetics,2007,121(3-4):389-400.[29]JóźwiakJ,SontowskaI,PłoskiR.FrequencyofTSC1andTSC2mutationsinAmerican,British,PolishandTaiwanesepopulations[J].Molecularmedicinereports,2013,8(3):909-913.[30]WangS,FallahA.Optimalmanagementofseizuresassociatedwithtuberoussclerosiscomplex:currentandemergingoptions[J].Neuropsychiatricdiseaseandtreatment,2014,10:2021.[31]Chu‐ShoreCJ,MajorP,CamposanoS,etal.Thenaturalhistoryofepilepsyintuberoussclerosiscomplex[J].Epilepsia,2010,51(7):1236-1241.[32]JansenFE,BraamsO,VinckenKL,etal.OverlappingneurologicandcognitivephenotypesinpatientswithTSC1orTSC2mutations[J].Neurology,2008,70(12):908-915.[33]JansenFE,BraamsO,VinckenKL,etal.OverlappingneurologicandcognitivephenotypesinpatientswithTSC1orTSC2mutations[J].Neurology,2008,70(12):908-915.[34]张林妹,周渊峰,柴毅明,等.结节性硬化105例临床特征和基因型分析[J].中国循证儿科杂志,2016,11(3):219-222.[35]VanEeghenAM,BlackME,PulsiferMB,etal.Genotypeandcognitivephenotypeofpatientswithtuberoussclerosiscomplex[J].EuropeanJournalofHumanGenetics,2012,20(5):510-515.23 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析[36]JansenAC,SancakO,D'AgostinoMD,etal.UnusuallymildtuberoussclerosisphenotypeisassociatedwithTSC2R905Qmutation[J].Annalsofneurology,2006,60(5):528-539.[37]Hoogeveen‐WesterveldM,WentinkM,vandenHeuvelD,etal.FunctionalassessmentofvariantsintheTSC1andTSC2genesidentifiedinindividualswithtuberoussclerosiscomplex[J].Humanmutation,2011,32(4):424-435.[38]DaboraSL,JozwiakS,FranzDN,etal.Mutationalanalysisinacohortof224tuberoussclerosispatientsindicatesincreasedseverityofTSC2,comparedwithTSC1,diseaseinmultipleorgans[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,2001,68(1):64-80.[39]JonesAC,ShyamsundarMM,ThomasMW,etal.ComprehensivemutationanalysisofTSC1andTSC2—andphenotypiccorrelationsin150familieswithtuberoussclerosis[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,1999,64(5):1305-1315.[40]ChoiJE,ChaeJH,HwangYS,etal.MutationalanalysisofTSC1andTSC2inKoreanpatientswithtuberoussclerosiscomplex[J].BrainandDevelopment,2006,28(7):440-446.[41]AuKS,RodriguezJA,FinchJL,etal.Germ-linemutationalanalysisoftheTSC2genein90tuberous-sclerosispatients[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,1998,62(2):286-294.[42]方玲,吴志英,王柠,等.结节性硬化症TSC1基因编码外显子全长的突变检测与分析[J].中华神经科杂志,2005,38(2):108-111.[43]冯建华,丁美萍,杨翠微.应用聚合酶链反应—单链构象多态性技术分析结节性硬化症基因突变[J].中华儿科杂志,2003,41(3):223-226.[44]EhningerD,DeVriesPJ,SilvaAJ.FrommTORtocognition:molecular24 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析andcellularmechanismsofcognitiveimpairmentsintuberoussclerosis[J].JournalofIntellectualDisabilityResearch,2009,53(10):838-851.[45]NiidaY,Lawrence-SmithN,BanwellA,etal.AnalysisofbothTSC1andTSC2forgermlinemutationsin126unrelatedpatientswithtuberoussclerosis[J].Humanmutation,1999,14(5):412.[46]vanSlegtenhorstM,VerhoefS,TempelaarsA,etal.MutationalspectrumoftheTSC1geneinacohortof225tuberoussclerosiscomplexpatients:noevidenceforgenotype-phenotypecorrelation[J].Journalofmedicalgenetics,1999,36(4):285-289.25 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析附录中英文单词缩略词表缩写英文全称中文全称TSCTuberousSclerosisComplex结节性硬化症PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应mTORmammalianTargetofRapamycin哺乳动物雷帕霉素靶蛋白ArgArginine精氨酸TerTerminatethepassword终止密码子LysLysine赖氨酸ThrThreonine苏氨酸SEGAssubependymalgiantcellastrocytomas室管膜下巨细胞星形细胞瘤AMLangiomyolipoma肾血管平滑肌瘤NGSnextgenerationsequencing新一代高通量测序WGSwholegenomesequencing全基因组测序WESwholeexonsequencing全外显子测序26 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析综述结节性硬化症的临床特点及致病基因突变的研究进展摘要结节性硬化症(TuberousSclerosisComplex，TSC)是一种常染色体显性遗传的神经皮肤综合征,以全身各系统的错构瘤样增生为主要特征，以面部血管纤维瘤、癫痫发作、智能减退为主要临床表现。其致病基因分别为TSC1和TSC2基因,两者均为肿瘤抑制基因，分别编码错构瘤蛋白(hamartin)和马铃薯球蛋白(tuberin)，hamartin与Tuberin蛋白在细胞内形成蛋白复合物，TSC1或TSC2基因突变均可使该蛋白复合体功能受到影响，从而引起mTOR信号转导通路活化增强，导致TSC的发生。本文就结节性硬化症的临床特点及致病基因突变的研究进展作一简要综述,以期能提高对TSC的认识，并为临床中TSC患者的治疗方案的选择提供指导。关键词结节性硬化症，临床特点，TSC基因，基因突变[1]结节性硬化症（TSC）由法国医生Bourneville于1880年首次报道而受到人们的关注，其是一种常染色体显性遗传的神经皮肤综合征，以多器官缺陷和错构瘤为主要特征，几乎可累及所有器官，以皮肤改变、癫痫发作[2]及智能减退为典型临床表现，是目前少数几个仅靠临床表现就能确诊的常见遗传病之一。结节性硬化症的成人发病率大约为1/8000，新生儿的发病[3]率大约是1/6000，无性别差异，TSC基因突变病例多数为新生突变的散[4]发病例，约1/3具有家族性遗传。TSC的致病基因为TSC1和TSC2基因,二者同属于肿瘤抑制基因。TSC1基因的第3-23外显子为编码区，而第1、2外显子却并不具备任何编码功能，转录产物是长度约为8.6kb的信使RNA（mRNA），编码、翻译的最终产物为由1164个氨基酸组成的相对分子质量[5]为130000的错构瘤蛋白（hamartin）。而TSC2基因位于16p13.3，包含了27 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析41个具有编码功能的外显子和1个非编码功能的先导外显子，转录产物是长度约为5.4kb的mRNA，编码、翻译的最终产物为1807个氨基酸组成的相对分[6]子质量约为198000的马铃薯球蛋白（tuberin）。Tuberin与hamartin蛋白在细胞内可以形成蛋白复合物，且该复合物通过tuberin蛋白对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体（mTOR）信号转导通路的影响，来实现对细胞代谢，细胞[2,7]生长，细胞周期和增殖的调控。TSC1或TSC2基因一旦发生突变，可引起哺乳动物雷帕霉素蛋白复合体功能减弱甚至丧失，造成了mTOR信号转导[8]通路活化增强，进而导致了TSC的发生。结节性硬化症累及多系统，其临床表现多种多样，当患者仅表现为一个系统的症状，如只有皮肤损害或者癫痫发作，临床医师常常无法做出准确的临床判断，容易造成误诊或漏诊。自TSC致病基因TSC1/TSC2发现以来，且近年来随着基因测序技术的发展，TSC致病基因位点的突变被广泛报道，为TSC的临床诊断提供了确切的分子水平上的诊断依据，并通过基因筛查，大幅度的降低了TSC的误诊、漏诊率。本文将对TSC的临床特点及致病基因的研究现状进行简要综述。1.TSC的诊断标准TSC从被报道至今，其诊断标准经过多次修订，首先提出TSC诊断标[9]准的是Gomez，限于当时国际上对TSC的认识不够，仅仅把临床特征作[4]为确诊依据，后有学者于1998年在国际TSC临床共识会议上对该标准进行了修订，但随着近年来医学影像学和高通量基因测序技术的发展，人们对于TSC的认识不再仅仅局限于临床特征上的改变，2012年NorthrupH等[10]修订了新的TSC诊断标准。虽然TSC诊断标准经过多次修订，但是临床特征仍然是TSC确诊的主要方法，而最主要的改变是将基因检测结果作为独立的诊断标准，一经检测到TSC1/TSC2的基因突变即可确诊，因此基因检测目前作为TSC诊断的重要手段之一。而TSC基因诊断的意义主要在于对临床特征未达到确诊标准时的协助诊断、临床诊断时的确认，还有TSC28 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析基因突变类型的鉴定，以及明确家庭成员是否受累、区分其突变属于家族性还是散发性。2.TSC的临床表现TSC的典型临床表现主要为皮肤损害、癫痫发作、智能减退及其他各［10］系统的错构瘤。Northrup等学者2013年表在Pediatricneurology上的一篇研究中统计了TSC患者各脏器病变的发生几率，其中皮肤改变:：色素脱失斑最高，达87%-100%，面部血管纤维瘤次之，达75%-90%，其次分别是甲周纤维瘤约为20%-88%、鲨革斑约为50%、斑驳样皮肤改变约为3%-58%；而中枢神经系统：室管膜下结节发生几率最高，达到70%-80%，其次是室管膜下巨细胞星形细胞瘤（subependymalgiantcellastrocytomas，SEGAs）5%-20%；其他系统：如视网膜病变约为40%；心脏横纹肌瘤约为47%-67%；肺淋巴管肌瘤病多见于女性患者，且占了30%-40%；肾血管平滑肌瘤（angiomyolipoma，AML）约为80%，肾脏囊肿约为20%。有文献报道TSC[11]患者癫痫发作的发生几率为73%-90%，且普遍认为TSC的癫痫发作与皮[12]质及皮质下结节密切相关。据Van等在一项225例的大样本研究中报道，约20%-47%的TSC患者存在智能减退，而TSC患者的智能减退往往被认为是由皮层及皮层下、室管膜下结节、星形胶质细胞瘤或者反复癫痫发作引起的神经细胞损伤所致。3.TSC的致病基因TSC是常染色体显性遗传性疾病，与TSC1/TSC2基因密切相关。Fryer[13]等在1987年首先发现及报道了TSC的第一个致病基因，并把该致病基因命[14]名为TSC1基因，该基因位点位于9q34.3；而随之，Kandt等在1992年发现并报道了TSC的第二个致病基因,并把该致病基因命名为TSC2基因，该基因位点位于16p13.3。TSC1基因于1997年被Van等[15]克隆，而TSC2基因于[16]1993年被克隆出。TSC1基因的第3-23外显子为编码区，而第1、2外显子29 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析却并不具备任何编码功能，转录产物是长度约为8.6kb的信使RNA（mRNA），编码、翻译的最终产物为由1164个氨基酸组成的相对分子质量为130000的错构瘤蛋白（hamartin）。而TSC2基因位于16p13.3，包含了41个具有编码功能的外显子和1个非编码功能的先导外显子，转录产物是长度约为5.4kb的mRNA，编码、翻译的最终产物为1807个氨基酸组成的相对分子质量约为198000的马铃薯球蛋白（tuberin）。Tuberin与hamartin蛋白在细胞内可以形成蛋白复合物，且该复合物通过tuberin蛋白对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体（mTOR）信号转导通路的影响，来实现对细胞代谢，细胞生长，细胞周期和增殖的调控。TSC1或TSC2基因一旦发生突变，可引起哺乳动物雷帕霉素蛋白复合体功能减弱甚至丧失，造成了mTOR信号转导通路活化增强，进而导致了TSC的发生。4.TSC1/TSC2基因突变的检测及特性[10]NorthrupH等在2012年修订的新的TSC诊断标准中，将基因检测结果作为独立的诊断标准，即只要检测出存在TSC1/TSC2致病性基因，即可诊断TSC，因此，基因检测的手段对于TSC的诊断尤为重要。而由于检测方法[17][18]不同，测序结果往往也会有差异。在以往的研究中，Au等及Hung等报道TSC患者TSC1/TSC2基因突变的检出阳性率仅为60%-85%，有学者认为，这是由于突变可能位于低级体细胞镶嵌性或者身份不明的基因位点，如[19][20]TSC3基因，亦或者其他类型基因突变，如遗传变异和马赛克突变等。自TSC被证实与TSC1/TSC2基因突变相关以来，近年来随着基因检测技术的发展，截至2017年3月为止，欧洲LOVD突变数据库共收录了871个TSC1和2473个TSC2基因突变位点（chromium.lovd.nl/LOVD2/TSC/）。数据库收录突变比例及相关文献报道，TSC1基因突变约占31%，TSC2基因突变约[3,21-24]占69%。TSC基因突变的类型主要包含错义突变、无义突变、剪接位点突变、移码突变，少数大片段缺失和插入突变等。据报道，TSCl突变类型30 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析主要以点突变（如无义突变、错义突变、移码突变等）、小片段的缺失及[18,25-27]小片段的插入为主，而TSC2基因的突变则大多数是错义/无义突变，[18，25]其次是小片段缺失，大片段缺失和剪接突变，且常有基因重组。根据LOVD数据库显示，在已报道突变中，TSC2突变明显多于TSC1突变，比例约为7:3。目前的研究尚未发现TSC1和TSC2基因有突变热点。但有学者提出TSC1基因突变最常见的突变位点位于第15号外显子，可能因15号外显子较[28]长，碱基对较多，故其突变所占比例最大。黄国强等对160例中国TSC患者进行分析，发现TSC1的基因突变大多数发生在第15、2l、18号外显子，而TSC2基因突变则大多数发生在第37、40、33号外显子。结节性硬化症为常染色体显性遗传性疾病，但TSC1/TSC2基因一旦发生致病性突变，大多数会引起严重的临床症状，因而TSC患者更难有机会去组建家庭和生育后代，所以突变基因难以遗传下来。此外，源于TSC1和TSC2基因外显子及碱基对数目较多，故其相对而言有一定的随机突变率，因此，综合以上因素，该病虽呈现常染色体显性遗传性疾病，但其家族性病例比[29-31]例不高，反而以散发性病例多见。而散发病例中TSC2突变更普遍。研[32-34]究显示，在散发病例中TSC2突变率高达80%，TSC1基因突变约10%，而[35]在家族性病例中多见于TSC1突变，TSC2基因突变率仅30%左右。据相关文献报道，在不同的种族人群TSC2/TSC1基因突变比例不同，[36]欧美国家的比例约为3.4-5.6，台湾地区报道的84例对于TSC基因突变患[18]者的研究中，发现台湾地区TSC2/TSC1突变比例约为6，是欧美国家的2倍，但就TSC2/TSC1突变比例是否存在种族差异这一问题而言，由于尚无[18]各种族的大量样本研究数据，目前尚存在争议。Au等报道，TSC2基因突[37]变患者中以皮肤色素脱失斑和智能下降多见，而在Jansen等的研究中发现，TSC2基因突变者癫痫首发年龄更小、智商更低、结节更多。而张林妹[38]等在研究中发现，在群体层面上，TSC2基因突变者具有更严重的临床特征，这可能与TSC2基因编码的蛋白结构和功能十分复杂密切相关。但由于31 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析[39]TSC1/TSC2基因突变的临床表型间存在交叉现象，各种临床综合症在两者突变中均有报道，因而在特定的个体，根据TSC1或TSC2突变并不能预测[38,40]特征的严重性，但在总体趋势上，TSC2基因突变患者者临床表型更严重。5.TSC1/TSC2基因突变的致病原因及治疗以往的研究表明，TSC的致病原因主要是由于TSC1/TSC2基因突变，引起蛋白复合体功能减弱或消失，mTOR信号转导通路持续性的活化增强，而mTOR信号转导通路对细胞的代谢，细胞生长，细胞周期和增殖起着重要的调控作用，mTOR信号转导通路活性增强导致蛋白质合成增加，使细胞异[41]常增生，从而导致多系统错构瘤的发生。有学者发现，基于mTOR通路对TSC的影响，mTOR通路的抑制剂雷帕霉素及其衍生物如依维莫司、西罗莫司，对TSC的皮肤改变、癫痫和各系统的错构瘤，如心脏横纹肌瘤、肾血管平滑肌瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、肺淋巴管瘤等，均有明确的疗效。美国食品和药品管理局（FDA）批准依维莫司用于治疗不能手术的伴有肾血管平滑肌脂肪瘤（angiomyolipoma，AML）或室管膜下巨细胞星形细胞[42]瘤（subependymalgiantcellastrocytomas，SEGAs）的TSC患者。Kingswood[43]等研究结果显示，依维莫司和西罗莫司可减少AML的体积，对于保护肾功[44]能以及长期治疗有一定的安全性，同时对于肾细胞癌也具有确切的疗效。[38]张林妹等对105例TSC患者进行分析，发现TSC患者脑皮质结构异常、肾脏病变、皮肤改变（如色素脱失斑、面部皮脂腺瘤、鲨革斑）等多系统病变均随发病年龄的增长，其几率呈现增高的趋势，故有学者认为，应考虑[43]早期启动mTOR抑制剂治疗AML，防止未来严重的并发症并改善预后。32 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析6.展望TSC累及多系统，临床症状不尽相同，以往误诊、漏诊病例不在少数，但随着基因检测技术的发展，目前人们对TSC的致病基因TSC1和TSC2的研究越来越深，大大降低了误诊、漏诊率，且对TSC的早期诊断、并发症的预防及预后的改善都有相当大的帮助；同时，已有报道mTOR抑制剂对TSC的有确切的疗效，目前正处于临床试验阶段，相信随着基因检测技术的发展、分子生物学的进步及靶向药物的研发，无论是药物治疗还是基因治疗，人类终将能达到治愈TSC的目标。33 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析参考文献[1]BournevilleDM.Sclerosetubereusedescirconvolutionscerebrales:idiotieetepilepsiehemiplegique[J].ArchNeurol(Paris),1880,1:81-91.[2]HuangJ,ManningBD.TheTSC1–TSC2complex:amolecularswitchboardcontrollingcellgrowth[J].BiochemicalJournal,2008,412(2):179-190.[3]DiMarioFJ,SahinM,Ebrahimi-FakhariD.Tuberoussclerosiscomplex[J].PediatricClinicsofNorthAmerica,2015,62(3):633-648.[4]RoachES,GomezMR,NorthrupH.Tuberoussclerosiscomplexconsensusconference:revisedclinicaldiagnosticcriteria[J].Journalofchildneurology,1998,13(12):624-628.[5]NapolioniV,CuratoloP.Geneticsandmolecularbiologyoftuberoussclerosiscomplex[J].Currentgenomics,2008,9(7):475-487.[6]CheadleJP,ReeveMP,SampsonJR,etal.Moleculargeneticadvancesintuberoussclerosis[J].Humangenetics,2000,107(2):97-114.[7]LimaAJS,Hoogeveen-WesterveldM,NakashimaA,etal.IdentificationofregionscriticalfortheintegrityoftheTSC1-TSC2-TBC1D7complex[J].PloSone,2014,9(4):e93940.[8]CrinoPB,NathansonKL,HenskeEP.Thetuberoussclerosiscomplex.NEnglJMed,2006,355(13):1345-56.[9]GomezMR.Criteriafordiagnosis[M]//Tuberoussclerosis.RavenPress,NewYork,1988:9-19.[10]NorthrupH,KruegerDA,InternationalTuberousSclerosisComplexConsensusGroup.Tuberoussclerosiscomplexdiagnosticcriteriaupdate:recommendationsofthe2012InternationalTuberousSclerosisComplex34 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析ConsensusConference[J].Pediatricneurology,2013,49(4):243-254.[11]WangS,FallahA.Optimalmanagementofseizuresassociatedwithtuberoussclerosiscomplex:currentandemergingoptions[J].Neuropsychiatricdiseaseandtreatment,2014,10:2021.[12]vanSlegtenhorstM,VerhoefS,TempelaarsA,etal.MutationalspectrumoftheTSC1geneinacohortof225tuberoussclerosiscomplexpatients:noevidenceforgenotype-phenotypecorrelation[J].Journalofmedicalgenetics,1999,36(4):285-289.[13]FryerAE,ConnorJM,PoveyS,etal.Evidencethatthegenefortuberoussclerosisisonchromosome9[J].TheLancet,1987,329(8534):659-661.[14]KandtRS,HainesJL,SmithM,etal.Linkageofanimportantgenelocusfortuberoussclerosistoachromosome16markerforpolycystickidneydisease[J].Naturegenetics,1992,2(1):37-41.[15]VanSlegtenhorstM,DeHoogtR,HermansC,etal.IdentificationofthetuberoussclerosisgeneTSC1onchromosome9q34[J].Science,1997,277(5327):805-808.[16]EuropeanChromosome16TuberousSclerosisConsortium.Identificationandcharacterizationofthetuberoussclerosisgeneonchromosome16[J].Cell,1993,75(7):1305-1315.[17]AuKS,WilliamsAT,RoachES,etal.Genotype/phenotypecorrelationin325individualsreferredforadiagnosisoftuberoussclerosiscomplexintheUnitedStates[J].GeneticsinMedicine,2007,9(2):88-100.[18]HungCC,SuYN,ChienSC,etal.Molecularandclinicalanalysesof84patientswithtuberoussclerosiscomplex[J].BMCmedicalgenetics,2006,7(1):72.[19]QinW,KozlowskiP,TaillonBE,etal.Ultradeepsequencingdetectsa35 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析lowrateofmosaicmutationsintuberoussclerosiscomplex[J].Humangenetics,2010,127(5):573-582.[20]VerhoefS,BakkerL,TempelaarsAMP,etal.Highrateofmosaicismintuberoussclerosiscomplex[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,1999,64(6):1632-1637.[21]NellistM,BrouwerRWW,KockxCEM,etal.TargetedNextGenerationSequencingrevealspreviouslyunidentifiedTSC1andTSC2mutations[J].BMCmedicalgenetics,2015,16(1):10.[22]NiidaY,WakisakaA,TsujiT,etal.MutationalanalysisofTSC1andTSC2inJapanesepatientswithtuberoussclerosiscomplexrevealedhigherincidenceofTSC1patientsthanpreviouslyreported[J].Journalofhumangenetics,2013,58(4):216-225.[23]WangGX,WangDW,YiCY,etal.MutationalanalysesoftheTSC1andTSC2genesincasesoftuberoussclerosiscomplexinChineseHanchildren[J].GenetMolRes,2013,12:1168-75.[24]LeeJS,LimBC,ChaeJH,etal.MutationalanalysisofpaediatricpatientswithtuberoussclerosiscomplexinKorea:genotypeandepilepsy[J].EpilepticDisorders,2014,16(4):449-455.[25]LangkauN,MartinN,BrandtR,etal.TSC1andTSC2mutationsintuberoussclerosis,theassociatedphenotypesandamodeltoexplainobservedTSC1/TSC2frequencyratios[J].Europeanjournalofpediatrics,2002,161(7):393-402.[26]SancakO,NellistM,GoedbloedM,etal.MutationalanalysisoftheTSC1andTSC2genesinadiagnosticsetting:genotype–phenotypecorrelationsandcomparisonofdiagnosticDNAtechniquesintuberoussclerosiscomplex[J].EuropeanJournalofHumanGenetics,2005,13(6):731-741.36 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析[27]KozlowskiP,RobertsP,DaboraS,etal.Identificationof54largedeletions/duplicationsinTSC1andTSC2usingMLPA,andgenotype-phenotypecorrelations[J].Humangenetics,2007,121(3-4):389-400.[28]黄国强,翟琼香,汤志鸿,等.国内结节性硬化症基因突变与临床表型综合分析[J].中国现代神经疾病杂志,2015,4:023.[29]DaboraSL,JozwiakS,FranzDN,etal.Mutationalanalysisinacohortof224tuberoussclerosispatientsindicatesincreasedseverityofTSC2,comparedwithTSC1,diseaseinmultipleorgans[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,2001,68(1):64-80.[30]JonesAC,ShyamsundarMM,ThomasMW,etal.ComprehensivemutationanalysisofTSC1andTSC2—andphenotypiccorrelationsin150familieswithtuberoussclerosis[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,1999,64(5):1305-1315.[31]ChoiJE,ChaeJH,HwangYS,etal.MutationalanalysisofTSC1andTSC2inKoreanpatientswithtuberoussclerosiscomplex[J].BrainandDevelopment,2006,28(7):440-446.[32]AuKS,RodriguezJA,FinchJL,etal.Germ-linemutationalanalysisoftheTSC2genein90tuberous-sclerosispatients[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,1998,62(2):286-294.[33]方玲,吴志英,王柠,等.结节性硬化症TSC1基因编码外显子全长的突变检测与分析[J].中华神经科杂志,2005,38(2):108-111.[34]冯建华,丁美萍,杨翠微.应用聚合酶链反应—单链构象多态性技术分析结节性硬化症基因突变[J].中华儿科杂志,2003,41(3):223-226.[35]EhningerD,DeVriesPJ,SilvaAJ.FrommTORtocognition:molecularandcellularmechanismsofcognitiveimpairmentsintuberoussclerosis[J].JournalofIntellectualDisabilityResearch,2009,53(10):838-851.37 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析[36]JóźwiakJ,SontowskaI,PłoskiR.FrequencyofTSC1andTSC2mutationsinAmerican,British,PolishandTaiwanesepopulations[J].Molecularmedicinereports,2013,8(3):909-913.[37]JansenFE,BraamsO,VinckenKL,etal.OverlappingneurologicandcognitivephenotypesinpatientswithTSC1orTSC2mutations[J].Neurology,2008,70(12):908-915.[38]张林妹,周渊峰,柴毅明,等.结节性硬化105例临床特征和基因型分析[J].中国循证儿科杂志,2016,11(3):219-222.[39]VanEeghenAM,BlackME,PulsiferMB,etal.Genotypeandcognitivephenotypeofpatientswithtuberoussclerosiscomplex[J].EuropeanJournalofHumanGenetics,2012,20(5):510-515.[40]JansenAC,SancakO,D'AgostinoMD,etal.UnusuallymildtuberoussclerosisphenotypeisassociatedwithTSC2R905Qmutation[J].Annalsofneurology,2006,60(5):528-539.[41]DüvelK,YeciesJL,MenonS,etal.ActivationofametabolicgeneregulatorynetworkdownstreamofmTORcomplex1[J].Molecularcell,2010,39(2):171-183.[42]MoaveroR,ConiglioA,GaraciF,etal.IsmTORinhibitionasystemictreatmentfortuberoussclerosis?[J].Italianjournalofpediatrics,2013,39(1):57.[43]KingswoodJC,BisslerJJ,BuddeK,etal.ReviewoftheTuberousSclerosisRenalGuidelinesfromthe2012ConsensusConference:CurrentDataandFutureStudy[J].Nephron,2016,134(2):51-58.[44]Wataya-KanedaM.Mammaliantargetofrapamycinandtuberoussclerosiscomplex[J].Journalofdermatologicalscience,2015,79(2):93-100.38 硕士研究生学位论文一结节性硬化症家系临床特点及致病基因突变分析致谢七年的大学生活转瞬即逝，在论文完成之际，谨向所有在我研究生学习期间给予培养教育，关心我、爱护我、帮助我的老师、同学、好友和亲人表示最诚挚的谢意！首先，我衷心的感谢我的导师吴原教授！恩师渊博的学识、严谨的治学态度、精益求精的科研精神、精湛的医术以及高尚的行医准则使我受益终生，无微不至的关怀让我倍感亲切！本研究及学位论文正是在她亲切关怀和悉心指导下完成的。师恩如海，衔草难报。在此谨向尊敬的导师吴原教授致以最诚挚的感谢。特别感谢黄琪师兄在本科研中所给予无私的指导和帮助，使我顺利完成了课题研究。感谢苏迎、韦兴、马美刚、陈相任、梅育嘉等师兄、师姐及黄逸青、蒙有石、廖宇晗、廖亚运、王秀秀等同门对我科研课题、临床学习等方面的鼓励、支持与帮助。感谢广西医科大学第一附属医院神经内科全体老师，以及全体护士在临床实践过程中给予我的谆谆教导和无私的帮助！感谢广西医科大学对我的培养和教育，感谢广西医科大学第一附属医院的各科室医护老师在我轮转期间的悉心教导和耐心传授。感谢我的父母，是你们的爱护、包容与理解让我能够无所畏惧更加勇敢的继续走下去，并且更加坚定在医生这条道路上走的更好！最后，感谢在百忙之中抽出宝贵时间对本论文进行审阅的各位专家，衷心感谢参加本论文答辩的答辩委员会主席及各位委员，感谢您们对我毕业论文提出的宝贵意见和建议，我会更加努力，不断完善自己，争取更大的进步！39
